CN112625912B - 一株高山被孢霉菌株xy05201及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，本发明提供一株高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株XY05201 CGMCC NO.20262，其所属物种为高山被孢霉(Mortierella alpina)，该菌株已于2020年8月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.20262，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的菌株XY05201具有生长迅速，易于培养，生产的多不饱和脂肪酸含量高，能生产大量的花生四烯酸。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程发酵技术领域。
背景技术
多不饱和脂肪酸指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸，这些脂肪酸在包括人在内的高等动物体内具有重要的生理功能，例如花生四烯酸(ARA)在大脑免受氧化应激和早期神经发育方面发挥重要作用[1]，同时也是一些重要物质的前体[2]，如：前列腺素，血栓烷，脂类毒素和白三烯等[2]。目前，多不饱和脂肪酸，尤其是C20系列，主要是通过深海鱼类中获得。近年来由于海洋资源的过度开发，越来越多的研究开始关注于利用微生物来生产多不饱和脂肪酸。
高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种丝状真菌，但与其他丝状真菌相比，其能够大量合成长链多不饱和脂肪酸，尤其是二十碳三烯酸(DGLA)、二十碳四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)。但是由于高山被孢霉生长缓慢，而在低温下更适合生产多不饱和脂肪酸，因而有大量的研究聚焦于寻找优良菌株以提高产量[3]。
发明内容
本发明涉及生物工程技术领域，提供一株用于生产多种不饱和脂肪酸的高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株XY05201，该菌株能够合成5种多不饱和脂肪酸，占总脂肪酸的75.5％，分别是亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、二十碳三烯酸(C20:3)、二十碳四烯酸(C20:4)和二十碳五烯酸(C20:5)，且ARA的含量最高，占总脂的45.6％。
本发明提供一株高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株XY05201，其所属物种为高山被孢霉(Mortierella alpina)，该菌株已于2020年8月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCC NO.20262，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明提供的菌株XY05201具有生长迅速，易于培养，生产的多不饱和脂肪酸含量高，能生产大量的花生四烯酸。
附图说明
图1是气相质谱检测脂肪酸成分峰图。
具体实施方式
实施例1
1.菌种的采集、培养、鉴定
菌株分离自土壤样品，2017年8月采集地点为中国西藏自治区察隅县，分离培养基是PDA(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L)，培养温度为20℃。
菌株进行活化之后，无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于Kendrick培养基[4](主要成分是50g/L葡萄糖,2g/L酒石酸胺,7.0g/L KH2P04,2.0g/L Na2HP04,1.5g/LMgS04·7H20,1.5g/L酵母粉,0.1g/L CaCl2.2H20,8mg/L FeCl3·6H20,1mg/L ZnS04·7H20,0.1mg/L CuSO4·5H20,0.1mg/L CO(NO3)2·6H20 and 0.1mg/L MnS04·5H20,pH 6.0。)中，然后在摇床中140rpm，20℃培养7天。
菌种的鉴定：分子生物学鉴定，使用志昂生物试剂盒提取总DNA，之后使用特异性引物扩增序列片段，然后在华大基因进行Sanger测序,得到数据后进行BLAST，确定该菌种为高山被孢霉(Mortierella alpina)，命名为菌株XY05201。
分子生物学使用ITS rDNA序列，设计特异性引物如下：
引物1：5'-GGC TTA ATT TGA CTC AAC ACG G-3'；
引物2：5'-GCT ATC CTG AGG GAA ACT TCG-3'。
ITS rDNA分子条形码序列如序列表1所示。
高山被孢霉(Mortierella alpina)菌株XY05201已于2020年8月27日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株保藏中心登记入册编号为CGMCCNO.20262，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.合成脂肪酸：
菌株XY05201活化：无菌水洗脱孢子，按照5％的接种量接种于Kendrick培养基[4](主要成分是50g/L葡萄糖,2g/L酒石酸胺,7.0g/L KH2P04,2.0g/L Na2HP04,1.5g/L MgS04·7H20,1.5g/L酵母粉,0.1g/L CaCl2.2H20,8mg/L FeCl3·6H20,1mg/L ZnS04·7H20,0.1mg/LCuSO4·5H20,0.1mg/L CO(NO3)2·6H20 and 0.1mg/L MnS04·5H20,pH 6.0。)中，然后在摇床中140r/min，20℃条件下培养7天，得培养基发酵液。
培养完成后，将培养基发酵液进行真空抽滤得到鲜菌体，取出100mg采用气相质谱联用的方法对脂肪酸成分进行鉴定，如下表所示。
表：菌种XY05201脂肪酸成分表
| 脂肪酸成分 | C14:0 | C16:0 | C18:3 | C18:2 | C18:1 | C18:0 | C20:4 | C20:5 | C20:3 | Others |
| 含量占比(％) | 3.22 | 11.96 | 8.78 | 15.41 | 5.98 | 2.54 | 45.57 | 2.39 | 3.40 | 0.76 |
微生物油脂的提取：将上述培养基发酵液抽滤得到鲜菌体，之后使用烘箱70℃干燥至恒重，得到干菌体。取1g干菌体加入6M盐酸5mL，之后沸水浴30min，冷却后加入95％乙醇10mL，之后再加入石油醚和乙醚各5mL，震荡均匀后，5000rpm离心3min，最后蒸发萃取剂得到微生物油脂。
气相色谱样品制备：称取100mg从培养基发酵液中获得的菌株XY05201的鲜菌体，置于5mL的螺口玻璃管中。向样品管中加入1mL试剂I(皂化试剂Saponification Reagent：150mL去离子水、150mL甲醇、45g NaOH)，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出观察试管是否漏气，如有漏气，将样品冷却到室温，转移到新的试管，重新沸水浴5min测试，如无漏气现象，将试管震荡5–10s，继续沸水浴25min，取出试管，用流水冲洗试管壁使其冷却。将冷却的试管打开，加入2mL试剂II(甲基化试剂Methylation Reagent：325mL 6mol·L-1HCl、275mL甲醇)，拧紧盖子，震荡5–10s,迅速放入设定为80℃的水浴锅中加热10min，取出试管用流水快速冷却至室温。向冷却后的试管中加入1.25mL试剂III(萃取试剂Extraction Solvent：200mL甲基叔丁基醚(MTBE)、200mL正己烷)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃10min，用干净的巴斯德吸管将每个试管中的下层水相丢弃。向样品中加入3mL试剂IV(洗涤试剂Base Wash：10.8g NaOH、900mL去离子水)，拧紧螺盖，将试管放在摇床上温和摇晃5min，用干净的巴斯德吸管收集上层有机相的2/3[若液面浑浊，可向试管中加几滴试剂V(饱和NaCl溶液：40gNaCl、100mL去离子水)，减少乳化现象]，装入干净的样品瓶中，用于气相-质谱检测。
脂肪酸甲酯检测：脂肪酸甲酯的测定采用日本岛津的气相质谱联用(GC-MS)系统，壬酸(C9:0)为内标，气相温度从50℃开始，以10℃/min的速度升至300℃，然后保持15分钟。载气氦气以1mL/min的恒定速率流动。质谱仪在250℃的界面温度下运行，并且在0.3s的扫描时间下在m/z 40-500的范围内记录了光谱，如图1所示。
菌株XY05201具有生长迅速，易于培养，生产的多不饱和脂肪酸含量高，能生产大量的花生四烯酸。
1.Hoffman DR,Boettcher JA,Diersen-Schade DA(2009)Toward optimizingvision and cognition in term infants by dietary docosahexaenoic andarachidonic acid supplementation:a review of randomized controlledtrials.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 81(2-3):151-158
2.Bellou S,Triantaphyllidou IE,Aggeli D,Elazzazy AM,Baeshen MN,Aggelis G(2016)Microbial oils as food additives:recent approaches forimproving microbial oil production and its polyunsaturated fatty acidcontent.Current opinion in biotechnology 37:24–35.doi:10.1016/j.copbio.2015.09.005
3.Kosa G,Zimmermann B,Kohler A,Ekeberg D,Afseth NK,Mounier J,ShapavalV(2018)High-throughput screening of Mucoromycota fungi for production of low-and high-value lipids.Biotechnology for biofuels 11:66.doi:10.1186/s13068-018-1070-7
4.Kendrick A,Ratledge C(1992)Desaturation of polyunsaturated fattyacids in Mucor circinelloides and the involvement of a novel membrane-boundmalic enzyme.European journal of biochemistry 209(2):667–673.doi:10.1111/j.1432-1033.1992.tb17334.x
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 一株高山被孢霉菌株XY05201及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 986
<212> DNA
<213> 高山被孢霉(Mortierella alpina)
<400> 1
ctgggctgtc tacttgattt gagatcgagt ttacaaaggc cagccgaagc tgtctctgtg 60
aatcctgcat cagtcagcac aagaactaat ctcctttatg ttagctgcag caaaggtaat 120
aatctgtttt ttaggcagac taaatagata tgcttatagc tcagagaaaa gtccagctgc 180
acctgcattt caagtaaccc gccgcttttc ggtgagaaaa gcgttgggat cactcaagtc 240
cagctcccat ttcaaaaaag aaaggggagt tgaggtgttt actgatactc aaacaagcat 300
gctctccgga ataccagaga gcgcaatatg cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc 360
tgcaattcac attacgtatc gcatttcgct gcgttcttca tcgatgcgag agccaagaga 420
tccgttgttg aaagttgtat tttgaattaa gttattcata atatgtttca gacaaaatca 480
ctaaagttct gagtagatat aaatcccaaa ggtgaccaac ggattgttac agccgtgacc 540
tccagtgaga tgacattgca cacaaggtgg atatggattt ttgaaagtgc cataaaaaca 600
cttgattatg aatgatcctt ccgcaggttc acctacggaa accttgttac gacttttact 660
tcctctaaat gaccaagttt ggataacttt tcagttccaa gctgctgttg ccagctgctc 720
agatccaatc cgaaagcctc actaagccat tcaatcggta gtagcgacgg gcggtgtgta 780
caaagggcag ggacgtaatc aacgcgagct gatgactcac gcttactagg aattcctcgt 840
tgaagtccaa taattgcaat ggactatccc cagcacgatc aagtttcaaa agattaccca 900
gaccttccgg ccaaggttgt aaactcgttg acttgatcag tgtagcgcgc gtgcggccca 960
gaaacatcta aaggcatcac agacct 986
Claims (2)
1.一株高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株XY05201，其保藏编号为 CGMCCNO.20262。
2. 如权利要求1所述的高山被孢霉（Mortierella alpina）菌株XY05201在合成不饱和脂肪酸中的应用；所述不饱和脂肪酸为亚油酸、亚麻酸、二十碳三烯酸、二十碳四烯酸和/或二十碳五烯酸。
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