CN106754436B - 高山被孢霉ccfm698菌体的制备及其在饲料添加剂中的应用 - Google Patents

高山被孢霉ccfm698菌体的制备及其在饲料添加剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供高山被孢霉在饲料添加剂中应用，所述高山被孢霉是重组高山被孢霉(Mortierella alpina)MA‑oPpFADS17‑4(它同样被命名为CCFM698)。本发明的高山被孢霉干燥菌体的总脂肪酸含量为以干燥菌体重量计30％‑40％，其中EPA含量为以总脂肪酸重量计24％或以上。本发明的干燥菌体在饲料中的用量是基础饲料总重量的0.5‑1.5％，该菌体饲料添加剂的脂肪酸组成合理，EPA含量很高，能用于生产有利于食用者身体健康的高DHA鸡蛋。饲喂含有本发明的饲料添加剂的饲料的蛋鸡，所产鸡蛋DHA含量达到了约120mg/个鸡蛋，显著高于现有技术。

Description

高山被孢霉CCFM698菌体的制备及其在饲料添加剂中的应用
【技术领域】
本发明涉及饲料添加剂，特别涉及一种高总脂肪酸含量、高EPA含量的高山被孢霉菌体，其生产方法及作为饲料添加剂的应用。
【背景技术】
多不饱和脂肪酸可分为ω-3，ω-6和ω-9等系列，ω-3系列PUFAs主要有α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)。EPA具有抗凝血、抗癌、抗炎、防心血管病、降血脂等特殊生理功能，在医药保健品、食品和饲料行业均有较多的应用。EPA的生物来源主要包括海洋鱼类和微生物发酵生产，微生物发酵法生产EPA原料丰富、周期短、价格便宜、占地面积小、不受气候影响等，越来越受关注。目前通过微生物发酵法生产EPA的商业化产品是杜邦公司报道的New HarvestTM EPA oil和
Figure GDA0001227100110000011
salmon，所用菌株是解脂耶氏酵母基因工程菌。高山被孢霉油脂含量丰富，野生型高山被孢霉需在低温下能合成EPA，高山被孢霉MA-oPpFADS17是通过在野生型高山被孢酶中过表达来源于寄生疫霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶，最终得到成功表达候选ω-3脂肪酸脱饱和酶的高 山被孢霉重组菌株。将其发酵条件优化后，使得该菌株在廉价碳氮源的培养基中可以合成大量的EPA，将其制得的菌粉作蛋鸡饲料的添加剂，可以大幅提高蛋黄DHA含量，改善饮食中ω-3和ω-6比例。
高山被孢霉应用于饲料添加剂属于现有技术，例如中国发明专利申请CN104630077A公开的高山被孢霉CCFM442及其在生产菌体饲料添加剂中的应用。其中，根据其说明书的记载，干燥菌体中PUFAs含量占总脂肪酸含量的45.76％，其中AA含量占总脂肪酸含量24.43％，EPA含量占总脂肪酸含量的6.09％。将该菌体饲料添加剂(即干燥菌体)以基础饲料总重量计5％与基础饲料混合造粒饲喂蛋鸡，所产鸡蛋蛋黄中的DHA占总脂肪酸为1.06％，AA占总脂肪酸比例为3.26％，即，AA含量占全蛋0.32％，DHA含量占全蛋0.11％，均高于普通鸡蛋。
然而，仍然期望通过对饲料的改进而进一步提高DNA在鸡蛋中的含量。
【发明内容】
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供一种能够提高鸡蛋中DNA含量的饲料添加剂。
为了实现上述目的，本发明的原理是通过优化高山被孢霉的菌株选择和发酵工艺，实现在常温条件下大量积累EPA的高山被孢霉，以应用于饲料添加剂。
为此，本发明提供高山被孢霉在饲料添加剂中应用，所述高山被孢霉是重组高山被孢霉(Mortierella alpina)MA-oPpFADS17-4(它同样被命名为CCFM698)。
高山被孢霉CCFM698是通过过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶oPpFADS17基因的重组高山被孢霉，根据中国发明专利申请CN 201610184669X(一株过表达来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶的重组高山被孢霉、其构建方法及应用)的记载，该菌株于2016年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.11820。
中国发明专利申请CN 201610184669X所述的高山被孢霉MA-oPpFADS17-4也被命名为高山被孢霉CCFM698。
在本发明中，优选地，所述高山被孢霉是干燥菌体。
在本发明中，所述干燥菌体的总脂肪酸含量为以干燥菌体重量计30％-40％，其中EPA含量为以总脂肪酸重量计24％或以上。
所述干燥菌体在饲料中的用量是基础饲料总重量的0.5-1.5％。
进一步地，本发明还通过改进高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM698的发酵工艺，以实现在常温条件下大量积累EPA。
为此，本发明提供高山被孢霉菌体的生产方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将活化两代的高山被孢霉CCFM698菌株按1％重量的接种量接种到发酵培养基中，然后在温度28℃的条件下，以200rpm的转速发酵7天；
所述发酵培养基组成如下：
Figure GDA0001227100110000021
所述发酵培养基的pH值为6.0-8.0；
所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种；
(2)将步骤(1)中发酵完成的菌体用200目的标准样筛过滤后，清水洗涤，获得湿菌体；
(3)将步骤(2)得到的湿菌体烘干后得到所述干燥菌体。
在本发明中，所述豆粕提取物的制备方法是：以重量计，取豆粕1份，加入5份水，煮沸并保持沸腾10-30min；所得产物用双层纱布过滤，弃去滤渣，所得滤液冷却至室温，即为所述豆粕提取物。
在本发明中，豆粕应当理解为大豆提取豆油后得到的副产品，其呈不规则碎片状，颜色为浅黄色至浅褐色，味道具有烤大豆香味。豆粕是市场上能够购买获得的产品，例如中储粮镇江粮油有限公司销售的豆粕产品。
在本发明中，步骤(3)的烘干可以是在将湿菌体置于50-60℃下5-10小时实现的。
可选地，步骤(3)中，可以以冷冻干燥替代烘干步骤从而得到所述高山被孢霉的冻干菌体；所述的冷冻干燥是用冷冻干燥机实现的，其程序为：将湿菌体至于-40℃下4h；然后在-30℃下冷冻15h；然后在-10℃下冷冻15h；然后在10℃下放置4h；最后在20℃下放置4h，得到所述冻干菌体。
本发明的高山被孢霉(Mortierella alpina)CCFM698菌体饲料添加剂的脂肪酸组成合理，EPA含量很高，能用于生产有利于食用者身体健康的高DHA鸡蛋。该添加剂具有使用安全性高、PUFAs含量高、脂肪酸组成合理等优点，在不降低产蛋性能参数的情况下，使ω-3和ω-6比例维持在合理范围内，对人体健康产生有益作用。
此外，本发明的菌体饲料添加剂安全性高，该菌种的野生型菌株已通过正式安全性评估，其生产安全性得到保证。所得饲料添加剂的EPA含量在常温下可达占总脂24％，总脂肪酸含量达菌体总重40％，是目前文献报道的在常温下EPA产量最高的高山被孢霉菌株。
另一方面，本发明对发酵工艺进行了改进，该菌体饲料添加剂生产所用培养基为廉价葡萄糖和豆粕，二者市场价格较低且容易获得，因此生产成本低，且该菌体饲料添加剂的发酵是在常温而非低温下进行的，发酵成本大大降低。
【附图说明】
图1为实施例7中0.5％高山被孢霉菌体补充喂养期各主要脂肪酸的变化；
图2为实施例7中1％高山被孢霉菌体补充喂养期各主要脂肪酸的变化；
图3为实施例7中1.5％高山被孢霉菌体补充喂养期各主要脂肪酸的变化。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中，如无特殊说明，用于表示浓度的“％”均为重量百分比，或“份”均为重量份。
本发明使用的培养设备是上海知楚仪器有限公司销售的振荡培养箱(型号:ZQZY-70B)。
在本发明中，冷冻干燥步骤是使用LABCONCO公司的冻干机(型号：FreeZone 6)实现的。
实施例1：发酵培养基中葡萄糖浓度的确定
将高山被孢霉CCFM698以1％接种量接种到活化培养基中，在28℃200rpm转速条件下活化36h，活化两代；
基础发酵培养基的组成为：葡萄糖、5g/L酵母提取物(Yeast extract)、10g/L硝酸钾、1g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水合硫酸镁，采用1M HCl和1M NaOH水溶液将pH调节至6.0，再在温度115℃下灭菌20min，得到所述的活化培养基。
将基础发酵培养基中的葡萄糖设置为40g/L、50g/L、60g/L，以野生型高山被孢霉(MA)作为对照，其他条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM698(即高山被孢霉CCFM698)在28℃条件下常温发酵7天，测定发酵培养基的不同葡萄糖浓度对菌体中脂肪酸含量。
所述的脂肪酸测定方法参考文献：
Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genome characterization of the oleaginousfungus Mortierella alpina.Plos One,2011,6(12):e28319.
在总脂肪酸测定之后，对相应脂肪酸含量进行加和后可得所述的多不饱和脂肪酸含量。
表1不同初始葡萄糖浓度对高山被孢霉CCFM698发酵产EPA的影响
Figure GDA0001227100110000041
注：表中数据以平均值±标准差表示，采用SPSS中的Tukey HSD方法进行著性分析。
可见，该菌株在常温即可积累大量的EPA，和野生型菌株相比具有很大优势。此外，通过对比可见，50g/L的葡萄糖浓度最适宜该菌株产EPA。
实施例2：培养基中碳源种类的确定
将基础发酵培养基中的50g/L葡萄糖分别用玉米淀粉、可溶性淀粉、马铃薯淀粉及重量比为1:1的葡萄糖与可溶性淀粉的混合物替代，培养基中的其他组成和培养条件不变，将高山被孢霉CCFM698在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表2不同碳源种类对高山被孢霉CCFM698发酵产EPA的影响
Figure GDA0001227100110000051
从表格中可以看出，高山被孢霉CCFM698可以不同程度利用多种淀粉作底物进行发酵产脂，其中玉米淀粉和葡萄糖的效果最佳，EPA产量最高达到1g/L以上，均显著高于其他碳源。
尽管玉米淀粉、可溶性淀粉和马铃薯淀粉都是淀粉，但马铃薯淀粉和可溶性淀粉相较于葡萄糖则表现出显著降低了总脂肪酸(TFA)和EPA产量的结果，而玉米淀粉和葡萄糖能够一定程度地提高总脂肪酸和EPA产量。
实施例3：有机氮源的确定
在培养基中碳源为50g/L的葡萄糖的前提下，对比酵母萃取物(有机氮源Yeastextract，价格昂贵)与豆粕提取物(廉价)对高山被孢霉产脂的影响，其中酵母萃取物浓度为5g/L，豆粕提取物浓度为50g/L，其他条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM698在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表3不同有机氮源对高山被孢霉CCFM698发酵产EPA的影响
Figure GDA0001227100110000052
结果表明，相比昂贵的酵母萃取物，豆粕提取物作为有机氮源使用时，不仅价格低廉，对菌体生长有较大促进作用，使得EPA的产量进一步得到大幅提高，达到1545mg/L。
然后，进一步设定豆粕汁的不同添加浓度，分别为10g/L、30g/L、50g/L、70g/L，其他条件不变，将实验菌株高山被孢霉CCFM698在28℃条件下常温发酵7天，测定样品中脂肪酸含量。
表4不同豆粕汁浓度对高山被孢霉CCFM698发酵产EPA的影响
Figure GDA0001227100110000061
可以看出，10-70g/L的豆粕提取物对高山被孢霉菌株发酵产EPA均能表现出显著的有利影响，其中以30-50g/L更为突出。50g/L的豆粕提取物浓度适宜该菌株发酵产脂，EPA产量最高，达到1.9g/L。
实施例4：生产本发明的菌体饲料添加剂
(1)发酵罐高密度培养
为获得足够量的菌饲料添加剂，进一步使用发酵罐培养，培养设备是瑞士比欧生物工程公司的65L气升发酵罐(型号：SSTC-2005-11)。与摇瓶培养不同的是，在发酵罐培养中，为了适应发酵罐工艺而提高了接种量，将活化两代的高山被孢霉MA-oPpFADS17菌株按10％的接种量(种子原液)接种到高密度发酵培养基中，维持pH6.0，通气量0.75vvm，在温度28℃的室温条件下发酵7天。
所用的高密度发酵培养基为：50g/L葡萄糖、15g/L豆粕、5g/L硝酸钾、2g/L磷酸二氢钾、0.25g/L七水合硫酸镁。
其中，为了适应工业化生产的需求、降低原料成本和菌体制备成本，在本实施例中，有机氮源选用豆粕而非豆粕提取物，而对湿菌体的后续干燥操作采用常规的菌体烘干法。
(2)菌体收集和饲料添加剂制备
将步骤(1)中发酵完成的菌体，用200目的标准样筛过滤后，清水洗涤直到滤液澄清透明，获得湿菌体，在60℃进行烘干，同时用冻干法制备小样以适应实验室条件，分别测定烘干品和冻干品的效果。
测定所得冻干菌体(试样)与烘干菌体(即饲料添加剂)的指标一致，含水量小于1％(几乎为绝干物料)，测得总脂肪酸的绝对含量达6.17g/L，EPA绝对含量达1.4g/L。
测定菌体饲料添加剂的脂肪酸组成与含量如下：
表7菌体饲料添加剂的脂肪酸组成与含量
Figure GDA0001227100110000071
可见，本发明得到的饲料添加剂中的脂肪酸种类较为丰富，PUFAs(包括C18:2/C18:3/C20:2/C20:3/C22:3/C20:4/C20:5)含量占总脂肪酸含量51.64％，其中具有重要生理功能的EPA含量占总脂肪酸含量达24％左右，显著高于CN104630077A中的6.09％，ω-3和ω-6比例提高到约1:1，也显著优于现有技术。
实施例5：蛋鸡饲喂试验
根据文献记载，普通鸡蛋中的ω-3PUFAs主要为DHA，约占全蛋总重量的0.04％，这与DHA的日推荐摄入量(140-160mg)相比，相差较多。
因此，期望通过改善蛋鸡饲料以提高鸡蛋中DHA含量。
为了更有效地说明该菌体饲料添加剂的实用性，先将菌体饲料添加剂分别以基础饲料总重量计0.5％或1％或1.5％与基础饲料混合，然后采取了一系列动物试验加以验证。以下为动物试验的具体实施方式和结果分析：
(1)菌体饲料的制备
基础饲料由安徽荣达禽业股份有限公司提供(基础饲料的脂肪酸组成见下表)，分别按基础饲料总重计0.5％或1％或1.5％的比例添加实施例6的菌体饲料添加剂，制备得到EPA菌体饲料。
表8基础饲料的脂肪酸组成表
Figure GDA0001227100110000081
(2)试验分组与设计
选取25周鸡龄蛋鸡，共60只，随机分为4组，每组15只蛋鸡，组别分别记为A、B、C、D组。其中A组为对照组，B、C、D组为实验组，并另外购买两组不同来源的市售鸡蛋作为对照。
将实验期分为适应期、试验期、洗脱期。在适应期7d各个组都用基础饲料饲喂。在试验期，A组以基础饲料喂养，B、C、D三组分别为低剂量(以基础饲料重量计0.5％)、中剂量(以基础饲料重量计1％)、高剂量(以基础饲料重量计1.5％)菌体饲料添加剂饲料饲喂，饲喂周期为两个星期。洗脱期10d喂养基础饲料。
(3)饲养管理方法
饲喂试验在安徽荣达禽业股份有限公司进行，对蛋鸡采取圈养方式，光照14h/天(可补充光照)，饲料120g/只/天、水足量。每日在8:00、16:00两次喂料，每日16:00捡蛋并标号。
(4)鸡蛋脂肪酸测定
鸡蛋脂肪酸分析方法参考文献：
Wang L,Chen W,Feng Y,et al.Genome characterization of the oleaginousfungus Mortierella alpina.Plos One,2011,6(12):e28319.
(5)结果及分析
补充期末期各个组别的蛋黄脂肪酸组成如下表所示。
表9蛋黄中脂肪酸含量测定结果
Figure GDA0001227100110000091
从表中数据可以看出，以基础饲料重量计，1.5％添加量的菌体饲料添加剂得到的鸡蛋中蛋黄DHA积累量最大，且与对照相比，含量约为A组的两倍。菌体饲料中EPA大量转化为了蛋黄的DHA，说明蛋黄具有富集DHA的作用。
根据表9记载的鸡蛋中各个脂肪酸指标的绝对含量(单位mg/g)，换算成一个鸡蛋DHA含量约为120mg，远高于CN104630077A中记载的的含量(70mg)。考虑到本发明所采用的A组饲喂的基础饲料中的ALA含量较高(见表8)，因此A组鸡蛋的DHA含量很高，因此另外从市场上随机买了两种鸡蛋作为对照。与市售鸡蛋相比，采用含有本发明的菌体饲料添加剂的基础饲料的蛋鸡的鸡蛋，其DHA含量提高约四倍，效果显著。
此外，如图1-3所示，随着补充喂养的时间增加，不同补充量的组别达到峰值的时间不同。从图1可以看出，0.5％补充喂养组的蛋黄DHA含量在两周的补充期内呈现缓慢的上升趋势，DHA含量增加较少；而在图2中，1％补充喂养组的蛋黄在第十天左右达到峰值，之后有缓慢下降的趋势，DHA含量高于0.5％的补充喂养组；从图3中可以得到1.5％补充喂养组的蛋黄DHA含量的变化情况为，前五天积累较少，第5到9天DHA含量呈现快速上升的趋势，第9到14天上升趋于缓慢，经过两周的补充，蛋黄中DHA含量达到了7.31mg/g，约120mg/个鸡蛋，比市售鸡蛋的DHA含量超出了四倍左右(市售鸡蛋的DHA含量约为30mg)。
其中，每个鸡蛋中DHA含量的计算方法为：DHA(mg/egg)＝蛋黄总脂肪酸含量占重量百分比×蛋黄中DHA占总脂百分比×1000×蛋黄重量
综上所述，本发明的菌体饲料添加剂能用于生产高DHA鸡蛋，且安全性高。所得饲料添加剂的EPA含量在常温下可达占总脂24％，总脂肪酸含量达菌体总重40％。
饲喂含有本发明的饲料添加剂的饲料的蛋鸡，所产鸡蛋DHA含量达到了约120mg/个鸡蛋，显著高于现有技术。

Claims (3)

1.高山被孢霉菌体的生产方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将活化两代的保藏编号为CGMCC No.11820的高山被孢霉CCFM698菌株按1％重量的接种量接种到发酵培养基中，然后在温度28℃的条件下，以200rpm的转速发酵7天；
所述发酵培养基组成如下：
葡萄糖或玉米淀粉50g/L
豆粕提取物30-50g/L
硝酸钾5-10g/L
磷酸盐1g/L
七水合硫酸镁0.25g/L
余量为水；
所述发酵培养基的pH值为6.0；
所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种；
所述豆粕提取物的制备方法为：以重量计，取豆粕1份，加入5份水，煮沸并保持沸腾10-30min；所得产物用双层纱布过滤，弃去滤渣，所得滤液冷却至室温，即为所述豆粕提取物；
(2)将步骤(1)中发酵完成的菌体用200目的标准样筛过滤后，清水洗涤，获得湿菌体；
(3)将步骤(2)得到的湿菌体烘干后得到所述高山被孢霉菌体。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤(3)中，所述烘干是在将湿菌体置于50-60℃下5-10小时实现的。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于在步骤(3)中，以冷冻干燥替代烘干，得到所述高山被孢霉菌体；所述的冷冻干燥是用冷冻干燥机实现的，其程序为：将湿菌体置于-40℃下4h；然后在-30℃下冷冻15h；然后在-10℃下冷冻15h；然后在10℃下放置4h；最后在20℃下放置4h，得到所述冻干菌体。
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