JP2698052B2 - エイコサペンタエン酸生産性微生物 - Google Patents
エイコサペンタエン酸生産性微生物Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はエイコサペンタエン酸
（以下ＥＰＡという）を生産することができる微生物に
関する。 【０００２】 【従来の技術】ＥＰＡに代表される多価不飽和脂肪酸
は、生体膜の構成成分として重要な役割を担っている。
またこれまでに知られているＥＰＡの薬理作用には、
（１）血小板凝集抑制作用（血栓溶解作用）、（２）血
液中の中性脂肪低下作用、（３）血液中のＶＬＤＬ−コ
レステロール、ＬＤＬ−コレステロール低下作用、ＨＤ
Ｌ−コレステロール増加作用（抗動脈硬化作用）、
（４）血液粘度低下作用、（５）血圧降下作用、（６）
抗炎症作用、（７）抗腫瘍作用が知られている。さら
に、プロスタグランジン一族の生成に際し基質となり、
ヒトを含む高等ほ乳動物の体内で必須的な機能を発揮す
る。 【０００３】特にＥＰＡはタイプ３のプロスタグランジ
ンの生成の際の基質として重要であって、血小板の凝集
抑制作用があり、血栓症の治療及び予防剤としての応用
が検討されている。さらにＥＰＡは、血漿コレステロー
ルレベルの低下に寄与する多価不飽和脂肪酸の中でも特
にその活性が高く、通常の植物油に含まれるリノール酸
などよりも遙かに有効である。また魚類等の必須栄養素
としても知られている。 【０００４】このように、ＥＰＡがその血栓防止作用あ
るいは脂質低下作用に基づく健康食品あるいは医薬品と
しての可能性がデンマークのダイヤーベルグ (Am.J.Cli
n.Nutr., 28, 958, 1975 ）の疫学調査により明らかに
されているが、その化学構造から明らかなように化学合
成することは、極めて困難である。このようなことから
我が国においてもＥＰＡを多く含有するイワシ、サバ、
サンマ等の青背魚の摂食が推奨されるようになってき
た。 【０００５】今日、健康食品として市販されているＥＰ
Ａは、そのほとんどが煮取法によって得られた魚油の分
別物であって、そのＥＰＡ含量は１０〜３０％程度であ
る。煮取法によって抽出される魚油は構成脂肪酸として
多種類の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分
を単離精製することが困難であるばかりでなく、ＥＰＡ
はすべてシス形の二重結合を５個有する炭素数２０の直
鎖の多価不飽和脂肪酸である為に、極めて酸化され易い
不安定な脂肪酸であり、魚油からＥＰＡを濃縮する場合
には酸素・光・熱等を避けて行なう必要がある。さら
に、これら魚油ＥＰＡの分別に使用された各種の有機溶
剤は通常減圧下に除去されるが、その完全除去は技術的
及びコスト的に問題点が多い。 【０００６】医薬品としてのＥＰＡは、様々な方法によ
って抽出された魚油を酵素的にもしくはアルカリ条件下
で処理して遊離脂肪酸まで加水分解するか又は該遊離酸
をメチルもしくはエチルエステルに変じた後、これらを
低温分別結晶法、尿素付加法、減圧蒸留法又は、逆相ク
ロマト法等により更に精製してＥＰＡ濃度を９０％以上
としたものが多い。 【０００７】しかし、これらの方法を用いて得られたＥ
ＰＡ濃縮物は、工程中に各種の有機溶剤が使用されたり
または、２００℃近い高熱を加えられたりするため、有
機溶剤の残留やＥＰＡの重合、異性化あるいは酸化等に
よる変質の懸念をはらんでいる。更に、魚油等をＥＰＡ
の原料として用いた場合、心臓疾患の原因の一つとして
疑われているドコセン酸等の除去が困難であるため、健
康食品、医薬品等に利用する上で問題点を残している。 【０００８】一方、最近、不完全な精製・濃縮では、魚
臭が残るなどの欠点を有した魚油からの抽出法を改善す
ることを目的として、クロレラ、単細胞藻類モノダス、
ユーグレナあるいはけい藻等微生物を用いたＥＰＡの生
産方法が散見される様になり、微生物を利用したＥＰＡ
生産が注目されてきている。最近では、ゲラーマンとシ
ュレンク（J.L.Gellerman and H.Schlenk, BBA, 573 ,
23, 1979）及び、山田等（昭和６１年度日本醗酵工学会
大会、１９８６）の発表で、ＥＰＡを産生するかび（糸
状菌）についての報告がなされた。これら微生物による
ＥＰＡ生産は、その脂肪酸組成から、分離精製が比較的
容易なこと、また培養制御により、ＥＰＡ生産をコント
ロールしやすい等の長所がある。しかしながらバクテリ
ア等に比較して、培養時間が長く（７日〜１ケ月程
度）、生産性の向上が大きな問題点として残っている。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】以上述べて来た様に、
健康食品または、医薬品として考えられているＥＰＡ
の、魚油からの抽出生産、あるいは、藻類やかび等の培
養による生産には、いくつかの問題点が有る。これらの
ことから、本発明の目的は、精製が容易で純度の高いも
のが得られ、かつ培養時間が短く培養制御が容易な、バ
クテリアを利用したＥＰＡ含有脂質の醗酵生産方法を見
出す事にある。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、ＥＰＡ産
生能を有するバクテリアを広く海洋に求めて鋭意研究を
行った結果、シュードモナス (Pseudomonas ）属、アル
テロモナス属又はシーワネラ属に属するバクテリアがＥ
ＰＡを生産することを見出し、この知見に基いて本発明
を完成した。従って、本発明は、エイコサペンタエン酸
を生産することができるシュードモナス属、アルテロモ
ナス属又はシーワネラ属に属する微生物を提供するもの
である。 【００１１】 【具体的な説明】 （１）微生物 本発明の微生物はシュードモナス・ピュートリファシエ
ンス、アルテロモナス・ピュートリファシエンス、アル
テロモナス・ルーメンサス、アルテロモナス・キシロー
サス、又はシーワネラ・ピュートリファシエンスに属
し、ＥＰＡを生産することができるものであればよく、
このような微生物は自然界から新たに分離することがで
きる。 【００１２】シュードモナス・ピュートリファシエンス
（Pseudomonas putrefaciens）に属する微生物の例と
して、新菌株として本発明者等が分離したシュードモナ
ス・ピュートリファシエンスＳＣＲＣ−２１８１，ＳＣ
ＲＣ−２２０１，ＳＣＲＣ−２２７１，ＳＣＲＣ−２３
４１，ＳＣＲＣ−２４５１，ＳＣＲＣ−２６４２，ＳＣ
ＲＣ−２７９２，ＳＣＲＣ−２８７８，ＳＣＲＣ−３０
１１，ＳＣＲＣ−３０２２を挙げることができる。 【００１３】アルテロモナス・ピュートリファシエンス
（Alteromonas putrefaciens）に属する微生物の例と
して、新菌株として本発明者等が分離した、アルテロモ
ナス・ピュートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７１、及
びアルテロモナス・ピュートリファシエンス・サブスピ
ーシズ・サガミファシエンス（Alteromonas putrefac
iens subspecies sagamifaciens ）ＳＣＲＣ−１１６
２、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Altero
monas putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７１を挙げる事
ができる。 【００１４】アルテロモナス・ルーメンサス又はアルテ
ロモナス・キシローサスに属する微生物の例として、本
発明者等が新たに分離し、アルテロモナス・ルーメンサ
ス（Alteromonas lumensas）と同定・命名したＳＣＲ
Ｃ−６４４４、及びアルテロモナス・キシローサス（Al
teromonas xylosus ）と同定・命名したＳＣＲＣ−２
５１７を挙げる事が出来る。 【００１５】シーワネラ・ピュートリファシエンス（Sh
ewanella putrefaciens）に属する微生物の例として、
新菌株として本発明者等が分離した、シーワネラ・ピュ
ートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７４を挙げる事が出
来る。前記の新菌株は次のようにして分離した。次の表
１に示す組成の培地を調製した。 【００１６】 【表１】 【００１７】この寒天平板培地に各地の海洋より採取し
た海洋性生物体サンプルを滅菌した生理食塩水で適度に
希釈したものを接種し、２５℃で１〜２日間培養した。
この寒天平板培地に出現したコロニーを同じ培地組成の
斜面培地に釣菌した。このようにして各地の海洋より採
取した海洋性生物体サンプルから多数の菌株を分離し
た。次に、表の培地より寒天をぬいたものを試験管に５
mLずつ分注し、同様に滅菌した。それぞれの菌株をこの
培地で２５℃、１〜２日間培養した。得られた培養液よ
り、後記の方法によりＥＰＡ産生能を検定した。このよ
うにして、ＥＰＡを顕著に生産する下記の株を得た。こ
れらの菌株の分離源は次表の通りであった。 【００１８】 【表２】 これらの菌株はそれぞれ次の表３〜表１３に示す菌学的
性質を有する。 【００１９】 【表３】【００２０】 【表４】【００２１】 【表５】【００２２】 【表６】【００２３】 【表７】【００２４】 【表８】【００２５】 【表９】【００２６】 【表１０】【００２７】 【表１１】【００２８】 【表１２】【００２９】 【表１３】 【００３０】上記の菌学的性質に基き、これらの菌株
を、バージイズ・マニュアル・オブ・ディターミナティ
ブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determina
tive Bacteriology ）第８版、１９７４年〔参照文献
１〕；マニュアル・オブ・クリニカル・マイクロバイオ
ロジー（Manual of Clinical Microbiology ）第３版、
１９８０年〔参照文献２〕；バージイズ・マニュアル・
オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）第１巻、３５２
頁、１９８４年〔参照文献３〕；並びにジャーナル・オ
ブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Journal of Gen
eral Microbiology ）129 , 3057−3074（1983）〔参照
文献４〕に従って次のように同定した。 【００３１】ＳＣＲＣ−２１８１，ＳＣＲＣ−２２０
１，ＳＣＲＣ−２２７１，ＳＣＲＣ−２３４１，ＳＣＲ
Ｃ−２４５１，ＳＣＲＣ−２６４２，ＳＣＲＣ−２７９
２，ＳＣＲＣ−２８７８，ＳＣＲＣ−３０１１、及びＳ
ＣＲＣ−３０２２は、いずれも、好気性で運動性及び１
本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ活性
を有するグラム陰性の桿菌であることから、参照文献１
及び２に従えばシュードモナス属に属する。 【００３２】シュードモナス属の種としてシュードモナ
ス・ピュートリファシエンスが知られており、前記性質
が文献記載のそれとほぼ一致するので、前記１０株はシ
ュードモナス・ピュートリファシエンスであると同定さ
れる。なお、糖からの酸およびガスの生成テストの項目
の中には必ずしも、文献記載のそれと一致しない項目が
あるが、これらは分類学上さほど重要な項目ではなく、
同一種でも一般的によく変化するものであり、これらの
記載に必ずしも規定されるものではない。 【００３３】なお、参照文献４には、シュードモナス・
ピュートリファシエンスはＤＮＡのＧ＋Ｃ含量による分
類からアルテロモナス（Alteromonas ）属に近いことよ
り、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Altero
monas putrefaciens）として記載されている。またこ
のことは、前記参照文献３に於いても記載されている。 【００３４】さらに近年システマティック・アンド・ア
プライド・マイクロバイオロジー（Systematic and App
lied Microbiology ）６，171-182 (1985)（参照文献
５）に於いて、新たにシーワネラ（Shewanella）属が提
唱され、上記菌種をシーワネラ・ピュートリファシエン
ス（Shewanella putrefaciens）とすることが提唱され
ている。 【００３５】ＳＣＲＣ−２８７１は、好気性で運動性及
び１本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ
活性を有するグラム陰性のかん菌であり、かつＤＮＡの
Ｇ＋Ｃ含量が４７．１％である事から、前記文献１，
２，３、及び４に従って、アルテロモナス属に属する。
アルテロモナス属の種としてアルテロモナス・ピュート
リファシエンスが知られて居り、前記性質が文献記載の
それとほぼ一致するので、この菌株はアルテロモナス・
ピュートリファシエンスであると同定される。 【００３６】ＳＣＲＣ−２８７４は、好気性で運動性及
び１本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ
活性を有するグラム陰性のかん菌であり、前記の表に示
す菌学的性質を示すことから、前記文献１、及び２の分
類基準に従えばシュードモナス・ピュートリファシエン
スに属する。 【００３７】しかしながら、シュードモナス・ピュート
リファシエンスは前記参照文献４においては、ＤＮＡの
Ｇ＋Ｃ含量による分類からアルテロモナス（Alteromona
s ）属に近いことより、アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス（Alteromonas putrefaciens）として記載さ
れており、またこのことは前記文献３にも記載されてい
る。さらに、前記文献５においては、５Ｓ ｒＲＮＡの
塩基配列により新たにシーワネラ（Shewanella）属を提
唱し、上記菌種をシーワネラ・ピュートリファシエンス
（Shewanella putrefaciens) とすることを提唱してい
る。以上の事から、この菌株はシーワネラ属に属しシー
ワネラ・ピュートリファシエンスであると同定される。 【００３８】ＳＣＲＣ−１１６２は下記の特徴を有す
る。 （１）グラム陰性 （２）運動性を持つ （３）非胞子形成の好気性かん菌 （４）Ｏ−Ｆテスト陰性 （５）カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 （６）硝酸塩還元能を持つ （７）硫化水素産生能を持つ （８）ゼラチン・ＤＮＡ分解能を持つ （９）グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生（−） （１０）キノン型；ユビキノン７と８、メナキノン、メ
チルメナキノン （１１）周毛性鞭毛を持つ （１２）Ｎａ+ 要求性 【００３９】このような諸性質を有する本菌株ＳＣＲＣ
−１１６２株の分類学的な位置は、前記の参照文献１，
２，３、及び４に従えば次の様に同定される。上記
（１）から（１０）までの項目により、アルテロモナス
・ピュートリファシエンス（Alteromonas putrefacie
ns）に類縁の菌株であると考えられる。しかしながら、
電子顕微鏡レベルでの形態から、周毛性の鞭毛を持ち、
またオルニチン分類能を持たず、Ｎａ+ 要求性であるこ
とから、本菌株をアルテロモナス・ピュートリファシエ
ンス・サブスピーシズ・サガミファシエンス（Alteromo
nas putrefacienssubspecies sagamifaciens ）と同
定、命名した。 【００４０】ＳＣＲＣ−６４４４及びＳＣＲＣ−２５１
７は下記の主たる性質を有する。 （１）グラム陰性 （２）運動性を持つ （３）非胞子形成の好気性かん菌 （４）Ｏ−Ｆテスト陰性 （５）カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 （６）ウレアーゼ陰性 （７）ゼラチン、ＤＮＡ分解能を持つ （８）グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生（−） （９）ＮａＣｌまたは海水要求性 （１０）Ｇ＋Ｃ含量：ＳＣＲＣ−６４４４；４１．４
％、ＳＣＲＣ−２５１７；４１．１％、 【００４１】このような諸性質を有する本菌株ＳＣＲＣ
−６４４４及びＳＣＲＣ−２５１７株の分類学的な位置
は、前記文献１，２，３、及び４の分類基準に従えば次
の様に同定される。上記（１）から（１０）までの項目
により、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Al
teromonas putrefaciens）またはアルテロモナス・オ
ーランティア（Alteromonas aurantia）に類縁の菌株
であると考えられる。しかしながら、ＳＣＲＣ−６４４
４は、硝酸塩還元能及びＤ−マンノース利用能を持ち、
またオルニチン分解能を持たないことから、従来のどの
種にも属さず、本菌株をアルテロモナス・ルーメンサス
（Alteromonas lumensas）と同定・命名した。 【００４２】一方ＳＣＲＣ−２５１７は、硝酸塩還元能
及びＤ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトー
ス利用能を持ち、またオルニチン分解能及び硫化水素性
能を持たず、さらに電子顕微鏡レベルでの形態から両極
毛の鞭毛を持つ事から、従来のどの種にも属さず、本菌
株をアルテロモナス・キシローサス（Alteromonas xylos
us ）と同定・命名した。以上記載した本発明の新菌株
の内下記の株が工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託され、さらにブタペスト条約に基く国際寄託に移管さ
れた。 【００４３】シュードモナス・ピュートリファシエンス
（Pseudomonas putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７８
（昭和６１年１２月２６日寄託）微工研菌寄第９１１４
号（ＦＥＲＭ Ｐ−９１１４）；（昭和６２年１２月１
７日国際寄託に移管）微工研条寄第１６２３号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１６２３）。アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス（Alteromonas putrefaciens）ＳＣＲＣ−
２８７１（昭和６２年１月２８日寄託）微工研菌寄第９
１５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−９１５８）；（昭和６２年１
２月１７日国際寄託に移管）微工研条寄第１６２４号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２４）。 【００４４】シーワネラ・ピュートリファシエンス（Sh
ewanella putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７４（昭和６
２年１月２８日寄託）微工研菌寄第９１５９号（ＦＥＲ
ＭＰ−９１５９）；（昭和６２年１２月１７日国際寄託
に移管）微工研条寄第１６２５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
６２５）。アルテロモナス・ピュートリファシエンス・
サブスピーシズ・サガミファシエンス（Alteromonas
putrefaciens subspecies sagamifaciens ）ＳＣＲＣ−
１１６２（昭和６２年２月２０日寄託）微工研菌寄第９
２１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−９２１０）；（昭和６２年１
２月１７日国際寄託に移管）微工研条寄第１６２６号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２６号）。 【００４５】アルテロモナス・ルーメンサス（Alteromo
nas lumensas）ＳＣＲＣ−６４４４（昭和６２年１０
月２０日寄託）微工研菌寄第９６６７号（ＦＥＲＭ Ｐ
−９６６７）。アルテロモナス・キシローサス（Altero
monas xylosus ）ＳＣＲＣ−２５１７（昭和６２年１
０月２０日寄託）微工研菌寄第９６６８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−９６６８）。 【００４６】以上、自然界から分離した菌株について詳
細に記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生
産性の高い菌株を得ることもできる。この発明の菌株
は、常法に従って保存することができ、例えば寒天スラ
ント培地上で、又は凍結乾燥法により保存することがで
きる。寒天スラント培地としてシュードモナス属細菌の
保存に常用されている培地、例えば菌の分離に関して前
記した培地を使用することができる。また、凍結乾燥保
存も常法に従って行うことができる。 【００４７】（２）ＥＰＡの製造方法 前記の微生物を培養して本発明のＥＰＡを製造しようと
する場合、基礎栄養培地として、この発明の微生物が増
殖し得るものであればいずれを使用してもよい。この培
地は、窒素源として例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス等の１種類又は複数種類を含有する。また、この培
地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を加えるこ
とができる。この培地には、塩化ナトリウム、もしくは
天然海水や人工海水を加えることが好ましい。 【００４８】培養は固体培地又は液体培地のいずれを用
いて行ってもよいが、目的とするＥＰＡを多量に得るた
めには、液体培地を用い、静置培養もしくは振とう培
養、通気・攪拌培養等により好気的条件下で培養を行う
のが好ましい。培養温度は菌が生育し、ＥＰＡが生産さ
れる温度範囲内であればいずれの温度でも良く、好まし
くは５〜３０℃であり、より好ましくは１５〜２５℃で
ある。pHは６〜９、好ましくは７〜８の範囲である。培
養時間は採取し得る量のＥＰＡ含有脂質が生産される時
間を選べば良く好ましくは８〜４８時間である。 【００４９】次に得られた培養物から本発明のＥＰＡが
採取される。精製法として通常の脂質精製法を用いるこ
とが出来る。例えば、培養液から遠心分離、濾過等の常
用の集菌手段によって菌体を集める。次に、この菌体を
所望により水、食塩水、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝
液等により洗浄した後、これらの液中に再懸濁する。 【００５０】この懸濁液を、脂質の抽出のために常用さ
れている溶剤、例えばクロロホルム／メタノール混合物
により抽出し、相分離してクロロホルム相を得る。次
に、このクロロホルム相を蒸発除去することによりＥＰ
Ａ含有脂質を含む材料が得られる。常法によりこれをけ
ん化することにより遊離のＥＰＡ、又はその塩を得るこ
とができる。かくして、本発明によれば上記のバクテリ
アを使用して発酵生産することにより、精製が容易でか
つ短時間で多量にＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡを得ること
ができる。 【００５１】次に本発明の微生物を用いたＥＰＡ含有脂
質の製造方法の具体的な例を実施例に示す。実施例１ ．シュードモナス・ピュートリファシエンスＳ
ＣＲＣ−２８７８からのＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生
産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地２０Ｌ（リット
ル）を１２１℃、１５分間加熱殺菌した後、シュードモ
ナス・ピュートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７８（微
工研菌寄第９１１４号）を接種し、２５℃で２４時間好
気的に培養した。 【００５２】培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約１５０ｇ（乾燥重量で１６．５ｇ）の菌体を得た。菌
体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１Ｌに懸濁
した。この菌体懸濁液を１Ｌのクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心
分離し、クロロホルム相を得た。さらに水相及び菌体を
クロロホルム６００mLで振とう抽出した後遠心分離し、
クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾
固して得られた脂質画分は、１．１６ｇ（乾燥菌体当り
７．０３％）であった。この脂質画分にはＥＰＡが含ま
れる。 【００５３】この画分を０．３Ｎ ＮａＯＨを含有する
９５％エタノール中で８０℃にて１時間けん化し、ＥＰ
Ａのナトリウム塩を含む生成物を得た。これを６Ｎ Ｈ
Ｃｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。
次に、ジアゾメタン等によりメチルエステル化した後、
ガスクロマトグラフにて分析してその含有率を測定した
ところ、０．１１４ｇ（脂質画分の９．８％、乾燥菌体
の０．６９％）のＥＰＡが含まれていることがわかっ
た。 【００５４】実施例２．アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンスＳＣＲＣ−２８７１からのＥＰＡ含有脂質及
びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地２０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ピュ
ートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７１（微工研菌寄第
９１５８号）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養
した。 【００５５】培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約１３５ｇ（乾燥重量で１５．０ｇ）の菌体を得た。菌
体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１Ｌに懸濁
した。この菌体懸濁液を１Ｌのクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心
分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体をク
ロロホルム６００mLで振とう抽出したのち遠心分離し、
クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾
固して得られた脂質画分は、１．０５ｇ（乾燥菌体当た
り７．００％）であった。 【００５６】この脂質画分にはＥＰＡが含まれる。この
画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール
中で８０℃にて１時間鹸化し、ＥＰＡのナトリウム塩を
含む生成物を得た。これを６Ｎ−ＨＣｌにより中和し、
遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。次に、この生成物の
一部をジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析してその含有率を測定した所
全生成物中に０．１１１ｇ（脂質画分の１０．６％、乾
燥菌体の０．７４％）のＥＰＡが含まれていることが分
かった。前記遊離ＥＰＡを含有する生成物をシリカゲル
クロマトグラフィー〔溶出剤：ｎ−ヘキサン／エチルエ
ーテル（９：１）〕により精製してＥＰＡのみを含む画
分を得、これを蒸発乾燥することにより０．１０ｇのＥ
ＰＡを得た。 【００５７】実施例３．シーワネラ・ピュートリファシ
エンスＳＣＲＣ−２８７４からのＥＰＡ含有脂質及びＥ
ＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地２０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、シーワネラ・ピュート
リファシエンスＳＣＲＣ−２８７４（微工研菌寄第９１
５９号）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養し
た。 【００５８】培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約２００ｇ（乾燥重量で２２．５ｇ）の菌体を得た。菌
体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１Ｌに懸濁
した。この菌体懸濁液を１Ｌのクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心
分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体をク
ロロホルム６００mLで振とう抽出したのち遠心分離し、
クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾
固して得られた脂質画分は、１．７８ｇ（乾燥菌体当り
７．９１％）であった。この脂質画分にはＥＰＡが含ま
れる。 【００５９】この画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する
９５％エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、ＥＰＡ
のナトリウム塩を含む生成物を得た。これを６Ｎ−ＨＣ
ｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。次
に、この生成物の一部をジアゾメタンによりメチルエス
テル化した後、ガスクロマトグラフにて分析してその含
有率を測定した所全生成物中に０．２４１ｇ（脂質画分
の１３．５％、乾燥菌体の１．０７％）のＥＰＡが含ま
れていることが分かった。前記遊離ＥＰＡを含む生成物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔溶出剤：ｎ−
ヘキサン／エチルエーテル（９：１）〕により精製して
ＥＰＡのみを含む画分を得、これを蒸発乾燥することに
より０．２２ｇのＥＰＡを得た。 【００６０】実施例４．アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス・サブスピーシズ・サガミファシエンスＳＣ
ＲＣ−１１６２からのＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地３０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ピュ
ートリファシエンス・サブスピーシズ・サガミファシエ
ンスＳＣＲＣ−１１６２（微工研菌寄第９２１０号）を
接種し、２５℃で２４時間好気的に培養した。培養後、
遠心分離機で菌体を採取し湿重量約２０５ｇ（乾燥重量
で２５．６ｇ）の菌体を得た。菌体を０．８５％の食塩
水で１回洗浄した後、１．５Ｌに懸濁した。 【００６１】この菌体懸濁液を１．５Ｌのクロロホルム
−メタノール溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出し
た後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及
び菌体をクロロホルム９００mLで振とう抽出したのち、
遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出
画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は２．１３ｇ（乾
燥菌体当たり８．３２％）であった。この画分を０．３
Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中で８０℃に
て１時間鹸化し、これを６Ｎ−ＨＣｌにより中和し、遊
離のＥＰＡを含む生成物を得た。 【００６２】次に、このジアゾメタンによりメチルエス
テル化した後、ガスクロマトグラフにて分析して、測定
した所０．２０５ｇ（脂質画分の９．６％、乾燥菌体の
０．８０％）のＥＰＡが含まれていることが分かった。
このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
０．１８５ｇを得た。 【００６３】実施例５．アルテロモナス・ルーメンサス
（Alteromonas lumensas）ＳＣＲＣ−６４４４からのＥ
ＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地１０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ルー
メンサス（Alteromonas lumensas）ＳＣＲＣ−６４４
４（微工研菌寄第９６６７号）を接種し、２５℃で２４
時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採
取し湿重量約１６０ｇ（乾燥重量で２０．４ｇ）の菌体
を得た。 【００６４】菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した
後、０．５Ｌの同食塩水に懸濁した。この菌体懸濁液を
０．５Ｌのクロロホルム−メタノール溶液（２：１ｖ／
ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホル
ム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホルム３００mL
で振とう抽出したのち、遠心分離し、クロロホルム相を
得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂
質画分は１．０５ｇ（乾燥菌体当たり５．１３％）であ
った。この画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％
エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−
ＨＣｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得
た。 【００６５】次に、ジアゾメタンによりメチルエステル
化した後、ガスクロマトグラフにて分析して、測定した
所０．１９８ｇ（脂質画分の１８．９％、乾燥菌体の
０．９７％）のＥＰＡが含まれていることが分かった。
このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
０．１７７ｇを得た。 【００６６】実施例６．アルテロモナス・キシローサス
（Alteromonas xylosus ）ＳＣＲＣ−２５１７からのＥ
ＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地１０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・キシ
ローサス（Alteromonas xylosus ）ＳＣＲＣ−２５１
７（微工研菌寄第９６６８号）を接種し、２５℃で２４
時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採
取し湿重量約１４５ｇ（乾燥重量で１９．６ｇ）の菌体
を得た。 【００６７】菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した
後、０．５Ｌの同食塩水に懸濁した。この菌体懸濁液を
０．５Ｌのクロロホルム−メタノール溶液（２：１ｖ／
ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホル
ム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホルム３００mL
で振とう抽出したのち、遠心分離し、クロロホルム相を
得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂
質画分は１．０１ｇ（乾燥菌体当たり５．１５％）であ
った。この画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％
エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−
ＨＣｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得
た。 【００６８】次に、ジアゾメタンによりメチルエステル
化した後、ガスクロマトグラフにて分析して、測定した
所０．１７３ｇ（脂質画分の１７．１％、乾燥菌体の
０．８８％）のＥＰＡが含まれていることが分かった。
このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
０．１５９ｇを得た。
（以下ＥＰＡという）を生産することができる微生物に
関する。 【０００２】 【従来の技術】ＥＰＡに代表される多価不飽和脂肪酸
は、生体膜の構成成分として重要な役割を担っている。
またこれまでに知られているＥＰＡの薬理作用には、
（１）血小板凝集抑制作用（血栓溶解作用）、（２）血
液中の中性脂肪低下作用、（３）血液中のＶＬＤＬ−コ
レステロール、ＬＤＬ−コレステロール低下作用、ＨＤ
Ｌ−コレステロール増加作用（抗動脈硬化作用）、
（４）血液粘度低下作用、（５）血圧降下作用、（６）
抗炎症作用、（７）抗腫瘍作用が知られている。さら
に、プロスタグランジン一族の生成に際し基質となり、
ヒトを含む高等ほ乳動物の体内で必須的な機能を発揮す
る。 【０００３】特にＥＰＡはタイプ３のプロスタグランジ
ンの生成の際の基質として重要であって、血小板の凝集
抑制作用があり、血栓症の治療及び予防剤としての応用
が検討されている。さらにＥＰＡは、血漿コレステロー
ルレベルの低下に寄与する多価不飽和脂肪酸の中でも特
にその活性が高く、通常の植物油に含まれるリノール酸
などよりも遙かに有効である。また魚類等の必須栄養素
としても知られている。 【０００４】このように、ＥＰＡがその血栓防止作用あ
るいは脂質低下作用に基づく健康食品あるいは医薬品と
しての可能性がデンマークのダイヤーベルグ (Am.J.Cli
n.Nutr., 28, 958, 1975 ）の疫学調査により明らかに
されているが、その化学構造から明らかなように化学合
成することは、極めて困難である。このようなことから
我が国においてもＥＰＡを多く含有するイワシ、サバ、
サンマ等の青背魚の摂食が推奨されるようになってき
た。 【０００５】今日、健康食品として市販されているＥＰ
Ａは、そのほとんどが煮取法によって得られた魚油の分
別物であって、そのＥＰＡ含量は１０〜３０％程度であ
る。煮取法によって抽出される魚油は構成脂肪酸として
多種類の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、各成分
を単離精製することが困難であるばかりでなく、ＥＰＡ
はすべてシス形の二重結合を５個有する炭素数２０の直
鎖の多価不飽和脂肪酸である為に、極めて酸化され易い
不安定な脂肪酸であり、魚油からＥＰＡを濃縮する場合
には酸素・光・熱等を避けて行なう必要がある。さら
に、これら魚油ＥＰＡの分別に使用された各種の有機溶
剤は通常減圧下に除去されるが、その完全除去は技術的
及びコスト的に問題点が多い。 【０００６】医薬品としてのＥＰＡは、様々な方法によ
って抽出された魚油を酵素的にもしくはアルカリ条件下
で処理して遊離脂肪酸まで加水分解するか又は該遊離酸
をメチルもしくはエチルエステルに変じた後、これらを
低温分別結晶法、尿素付加法、減圧蒸留法又は、逆相ク
ロマト法等により更に精製してＥＰＡ濃度を９０％以上
としたものが多い。 【０００７】しかし、これらの方法を用いて得られたＥ
ＰＡ濃縮物は、工程中に各種の有機溶剤が使用されたり
または、２００℃近い高熱を加えられたりするため、有
機溶剤の残留やＥＰＡの重合、異性化あるいは酸化等に
よる変質の懸念をはらんでいる。更に、魚油等をＥＰＡ
の原料として用いた場合、心臓疾患の原因の一つとして
疑われているドコセン酸等の除去が困難であるため、健
康食品、医薬品等に利用する上で問題点を残している。 【０００８】一方、最近、不完全な精製・濃縮では、魚
臭が残るなどの欠点を有した魚油からの抽出法を改善す
ることを目的として、クロレラ、単細胞藻類モノダス、
ユーグレナあるいはけい藻等微生物を用いたＥＰＡの生
産方法が散見される様になり、微生物を利用したＥＰＡ
生産が注目されてきている。最近では、ゲラーマンとシ
ュレンク（J.L.Gellerman and H.Schlenk, BBA, 573 ,
23, 1979）及び、山田等（昭和６１年度日本醗酵工学会
大会、１９８６）の発表で、ＥＰＡを産生するかび（糸
状菌）についての報告がなされた。これら微生物による
ＥＰＡ生産は、その脂肪酸組成から、分離精製が比較的
容易なこと、また培養制御により、ＥＰＡ生産をコント
ロールしやすい等の長所がある。しかしながらバクテリ
ア等に比較して、培養時間が長く（７日〜１ケ月程
度）、生産性の向上が大きな問題点として残っている。 【０００９】 【発明が解決しようとする課題】以上述べて来た様に、
健康食品または、医薬品として考えられているＥＰＡ
の、魚油からの抽出生産、あるいは、藻類やかび等の培
養による生産には、いくつかの問題点が有る。これらの
ことから、本発明の目的は、精製が容易で純度の高いも
のが得られ、かつ培養時間が短く培養制御が容易な、バ
クテリアを利用したＥＰＡ含有脂質の醗酵生産方法を見
出す事にある。 【００１０】 【課題を解決するための手段】本発明者等は、ＥＰＡ産
生能を有するバクテリアを広く海洋に求めて鋭意研究を
行った結果、シュードモナス (Pseudomonas ）属、アル
テロモナス属又はシーワネラ属に属するバクテリアがＥ
ＰＡを生産することを見出し、この知見に基いて本発明
を完成した。従って、本発明は、エイコサペンタエン酸
を生産することができるシュードモナス属、アルテロモ
ナス属又はシーワネラ属に属する微生物を提供するもの
である。 【００１１】 【具体的な説明】 （１）微生物 本発明の微生物はシュードモナス・ピュートリファシエ
ンス、アルテロモナス・ピュートリファシエンス、アル
テロモナス・ルーメンサス、アルテロモナス・キシロー
サス、又はシーワネラ・ピュートリファシエンスに属
し、ＥＰＡを生産することができるものであればよく、
このような微生物は自然界から新たに分離することがで
きる。 【００１２】シュードモナス・ピュートリファシエンス
（Pseudomonas putrefaciens）に属する微生物の例と
して、新菌株として本発明者等が分離したシュードモナ
ス・ピュートリファシエンスＳＣＲＣ−２１８１，ＳＣ
ＲＣ−２２０１，ＳＣＲＣ−２２７１，ＳＣＲＣ−２３
４１，ＳＣＲＣ−２４５１，ＳＣＲＣ−２６４２，ＳＣ
ＲＣ−２７９２，ＳＣＲＣ−２８７８，ＳＣＲＣ−３０
１１，ＳＣＲＣ−３０２２を挙げることができる。 【００１３】アルテロモナス・ピュートリファシエンス
（Alteromonas putrefaciens）に属する微生物の例と
して、新菌株として本発明者等が分離した、アルテロモ
ナス・ピュートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７１、及
びアルテロモナス・ピュートリファシエンス・サブスピ
ーシズ・サガミファシエンス（Alteromonas putrefac
iens subspecies sagamifaciens ）ＳＣＲＣ−１１６
２、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Altero
monas putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７１を挙げる事
ができる。 【００１４】アルテロモナス・ルーメンサス又はアルテ
ロモナス・キシローサスに属する微生物の例として、本
発明者等が新たに分離し、アルテロモナス・ルーメンサ
ス（Alteromonas lumensas）と同定・命名したＳＣＲ
Ｃ−６４４４、及びアルテロモナス・キシローサス（Al
teromonas xylosus ）と同定・命名したＳＣＲＣ−２
５１７を挙げる事が出来る。 【００１５】シーワネラ・ピュートリファシエンス（Sh
ewanella putrefaciens）に属する微生物の例として、
新菌株として本発明者等が分離した、シーワネラ・ピュ
ートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７４を挙げる事が出
来る。前記の新菌株は次のようにして分離した。次の表
１に示す組成の培地を調製した。 【００１６】 【表１】 【００１７】この寒天平板培地に各地の海洋より採取し
た海洋性生物体サンプルを滅菌した生理食塩水で適度に
希釈したものを接種し、２５℃で１〜２日間培養した。
この寒天平板培地に出現したコロニーを同じ培地組成の
斜面培地に釣菌した。このようにして各地の海洋より採
取した海洋性生物体サンプルから多数の菌株を分離し
た。次に、表の培地より寒天をぬいたものを試験管に５
mLずつ分注し、同様に滅菌した。それぞれの菌株をこの
培地で２５℃、１〜２日間培養した。得られた培養液よ
り、後記の方法によりＥＰＡ産生能を検定した。このよ
うにして、ＥＰＡを顕著に生産する下記の株を得た。こ
れらの菌株の分離源は次表の通りであった。 【００１８】 【表２】 これらの菌株はそれぞれ次の表３〜表１３に示す菌学的
性質を有する。 【００１９】 【表３】【００２０】 【表４】【００２１】 【表５】【００２２】 【表６】【００２３】 【表７】【００２４】 【表８】【００２５】 【表９】【００２６】 【表１０】【００２７】 【表１１】【００２８】 【表１２】【００２９】 【表１３】 【００３０】上記の菌学的性質に基き、これらの菌株
を、バージイズ・マニュアル・オブ・ディターミナティ
ブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determina
tive Bacteriology ）第８版、１９７４年〔参照文献
１〕；マニュアル・オブ・クリニカル・マイクロバイオ
ロジー（Manual of Clinical Microbiology ）第３版、
１９８０年〔参照文献２〕；バージイズ・マニュアル・
オブ・システマティク・バクテリオロジー（Bergey's M
anual of Systematic Bacteriology）第１巻、３５２
頁、１９８４年〔参照文献３〕；並びにジャーナル・オ
ブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー（Journal of Gen
eral Microbiology ）129 , 3057−3074（1983）〔参照
文献４〕に従って次のように同定した。 【００３１】ＳＣＲＣ−２１８１，ＳＣＲＣ−２２０
１，ＳＣＲＣ−２２７１，ＳＣＲＣ−２３４１，ＳＣＲ
Ｃ−２４５１，ＳＣＲＣ−２６４２，ＳＣＲＣ−２７９
２，ＳＣＲＣ−２８７８，ＳＣＲＣ−３０１１、及びＳ
ＣＲＣ−３０２２は、いずれも、好気性で運動性及び１
本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ活性
を有するグラム陰性の桿菌であることから、参照文献１
及び２に従えばシュードモナス属に属する。 【００３２】シュードモナス属の種としてシュードモナ
ス・ピュートリファシエンスが知られており、前記性質
が文献記載のそれとほぼ一致するので、前記１０株はシ
ュードモナス・ピュートリファシエンスであると同定さ
れる。なお、糖からの酸およびガスの生成テストの項目
の中には必ずしも、文献記載のそれと一致しない項目が
あるが、これらは分類学上さほど重要な項目ではなく、
同一種でも一般的によく変化するものであり、これらの
記載に必ずしも規定されるものではない。 【００３３】なお、参照文献４には、シュードモナス・
ピュートリファシエンスはＤＮＡのＧ＋Ｃ含量による分
類からアルテロモナス（Alteromonas ）属に近いことよ
り、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Altero
monas putrefaciens）として記載されている。またこ
のことは、前記参照文献３に於いても記載されている。 【００３４】さらに近年システマティック・アンド・ア
プライド・マイクロバイオロジー（Systematic and App
lied Microbiology ）６，171-182 (1985)（参照文献
５）に於いて、新たにシーワネラ（Shewanella）属が提
唱され、上記菌種をシーワネラ・ピュートリファシエン
ス（Shewanella putrefaciens）とすることが提唱され
ている。 【００３５】ＳＣＲＣ−２８７１は、好気性で運動性及
び１本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ
活性を有するグラム陰性のかん菌であり、かつＤＮＡの
Ｇ＋Ｃ含量が４７．１％である事から、前記文献１，
２，３、及び４に従って、アルテロモナス属に属する。
アルテロモナス属の種としてアルテロモナス・ピュート
リファシエンスが知られて居り、前記性質が文献記載の
それとほぼ一致するので、この菌株はアルテロモナス・
ピュートリファシエンスであると同定される。 【００３６】ＳＣＲＣ−２８７４は、好気性で運動性及
び１本の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ
活性を有するグラム陰性のかん菌であり、前記の表に示
す菌学的性質を示すことから、前記文献１、及び２の分
類基準に従えばシュードモナス・ピュートリファシエン
スに属する。 【００３７】しかしながら、シュードモナス・ピュート
リファシエンスは前記参照文献４においては、ＤＮＡの
Ｇ＋Ｃ含量による分類からアルテロモナス（Alteromona
s ）属に近いことより、アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス（Alteromonas putrefaciens）として記載さ
れており、またこのことは前記文献３にも記載されてい
る。さらに、前記文献５においては、５Ｓ ｒＲＮＡの
塩基配列により新たにシーワネラ（Shewanella）属を提
唱し、上記菌種をシーワネラ・ピュートリファシエンス
（Shewanella putrefaciens) とすることを提唱してい
る。以上の事から、この菌株はシーワネラ属に属しシー
ワネラ・ピュートリファシエンスであると同定される。 【００３８】ＳＣＲＣ−１１６２は下記の特徴を有す
る。 （１）グラム陰性 （２）運動性を持つ （３）非胞子形成の好気性かん菌 （４）Ｏ−Ｆテスト陰性 （５）カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 （６）硝酸塩還元能を持つ （７）硫化水素産生能を持つ （８）ゼラチン・ＤＮＡ分解能を持つ （９）グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生（−） （１０）キノン型；ユビキノン７と８、メナキノン、メ
チルメナキノン （１１）周毛性鞭毛を持つ （１２）Ｎａ+ 要求性 【００３９】このような諸性質を有する本菌株ＳＣＲＣ
−１１６２株の分類学的な位置は、前記の参照文献１，
２，３、及び４に従えば次の様に同定される。上記
（１）から（１０）までの項目により、アルテロモナス
・ピュートリファシエンス（Alteromonas putrefacie
ns）に類縁の菌株であると考えられる。しかしながら、
電子顕微鏡レベルでの形態から、周毛性の鞭毛を持ち、
またオルニチン分類能を持たず、Ｎａ+ 要求性であるこ
とから、本菌株をアルテロモナス・ピュートリファシエ
ンス・サブスピーシズ・サガミファシエンス（Alteromo
nas putrefacienssubspecies sagamifaciens ）と同
定、命名した。 【００４０】ＳＣＲＣ−６４４４及びＳＣＲＣ−２５１
７は下記の主たる性質を有する。 （１）グラム陰性 （２）運動性を持つ （３）非胞子形成の好気性かん菌 （４）Ｏ−Ｆテスト陰性 （５）カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 （６）ウレアーゼ陰性 （７）ゼラチン、ＤＮＡ分解能を持つ （８）グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生（−） （９）ＮａＣｌまたは海水要求性 （１０）Ｇ＋Ｃ含量：ＳＣＲＣ−６４４４；４１．４
％、ＳＣＲＣ−２５１７；４１．１％、 【００４１】このような諸性質を有する本菌株ＳＣＲＣ
−６４４４及びＳＣＲＣ−２５１７株の分類学的な位置
は、前記文献１，２，３、及び４の分類基準に従えば次
の様に同定される。上記（１）から（１０）までの項目
により、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Al
teromonas putrefaciens）またはアルテロモナス・オ
ーランティア（Alteromonas aurantia）に類縁の菌株
であると考えられる。しかしながら、ＳＣＲＣ−６４４
４は、硝酸塩還元能及びＤ−マンノース利用能を持ち、
またオルニチン分解能を持たないことから、従来のどの
種にも属さず、本菌株をアルテロモナス・ルーメンサス
（Alteromonas lumensas）と同定・命名した。 【００４２】一方ＳＣＲＣ−２５１７は、硝酸塩還元能
及びＤ−マンノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトー
ス利用能を持ち、またオルニチン分解能及び硫化水素性
能を持たず、さらに電子顕微鏡レベルでの形態から両極
毛の鞭毛を持つ事から、従来のどの種にも属さず、本菌
株をアルテロモナス・キシローサス（Alteromonas xylos
us ）と同定・命名した。以上記載した本発明の新菌株
の内下記の株が工業技術院生命工学工業技術研究所に寄
託され、さらにブタペスト条約に基く国際寄託に移管さ
れた。 【００４３】シュードモナス・ピュートリファシエンス
（Pseudomonas putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７８
（昭和６１年１２月２６日寄託）微工研菌寄第９１１４
号（ＦＥＲＭ Ｐ−９１１４）；（昭和６２年１２月１
７日国際寄託に移管）微工研条寄第１６２３号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１６２３）。アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス（Alteromonas putrefaciens）ＳＣＲＣ−
２８７１（昭和６２年１月２８日寄託）微工研菌寄第９
１５８号（ＦＥＲＭ Ｐ−９１５８）；（昭和６２年１
２月１７日国際寄託に移管）微工研条寄第１６２４号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２４）。 【００４４】シーワネラ・ピュートリファシエンス（Sh
ewanella putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７４（昭和６
２年１月２８日寄託）微工研菌寄第９１５９号（ＦＥＲ
ＭＰ−９１５９）；（昭和６２年１２月１７日国際寄託
に移管）微工研条寄第１６２５号（ＦＥＲＭ ＢＰ−１
６２５）。アルテロモナス・ピュートリファシエンス・
サブスピーシズ・サガミファシエンス（Alteromonas
putrefaciens subspecies sagamifaciens ）ＳＣＲＣ−
１１６２（昭和６２年２月２０日寄託）微工研菌寄第９
２１０号（ＦＥＲＭ Ｐ−９２１０）；（昭和６２年１
２月１７日国際寄託に移管）微工研条寄第１６２６号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２６号）。 【００４５】アルテロモナス・ルーメンサス（Alteromo
nas lumensas）ＳＣＲＣ−６４４４（昭和６２年１０
月２０日寄託）微工研菌寄第９６６７号（ＦＥＲＭ Ｐ
−９６６７）。アルテロモナス・キシローサス（Altero
monas xylosus ）ＳＣＲＣ−２５１７（昭和６２年１
０月２０日寄託）微工研菌寄第９６６８号（ＦＥＲＭ
Ｐ−９６６８）。 【００４６】以上、自然界から分離した菌株について詳
細に記載したが、これらの菌に変異を生じさせて一層生
産性の高い菌株を得ることもできる。この発明の菌株
は、常法に従って保存することができ、例えば寒天スラ
ント培地上で、又は凍結乾燥法により保存することがで
きる。寒天スラント培地としてシュードモナス属細菌の
保存に常用されている培地、例えば菌の分離に関して前
記した培地を使用することができる。また、凍結乾燥保
存も常法に従って行うことができる。 【００４７】（２）ＥＰＡの製造方法 前記の微生物を培養して本発明のＥＰＡを製造しようと
する場合、基礎栄養培地として、この発明の微生物が増
殖し得るものであればいずれを使用してもよい。この培
地は、窒素源として例えば酵母エキス、ペプトン、肉エ
キス等の１種類又は複数種類を含有する。また、この培
地には必要に応じて炭素源として各種の糖類を加えるこ
とができる。この培地には、塩化ナトリウム、もしくは
天然海水や人工海水を加えることが好ましい。 【００４８】培養は固体培地又は液体培地のいずれを用
いて行ってもよいが、目的とするＥＰＡを多量に得るた
めには、液体培地を用い、静置培養もしくは振とう培
養、通気・攪拌培養等により好気的条件下で培養を行う
のが好ましい。培養温度は菌が生育し、ＥＰＡが生産さ
れる温度範囲内であればいずれの温度でも良く、好まし
くは５〜３０℃であり、より好ましくは１５〜２５℃で
ある。pHは６〜９、好ましくは７〜８の範囲である。培
養時間は採取し得る量のＥＰＡ含有脂質が生産される時
間を選べば良く好ましくは８〜４８時間である。 【００４９】次に得られた培養物から本発明のＥＰＡが
採取される。精製法として通常の脂質精製法を用いるこ
とが出来る。例えば、培養液から遠心分離、濾過等の常
用の集菌手段によって菌体を集める。次に、この菌体を
所望により水、食塩水、又は緩衝液、例えばリン酸緩衝
液等により洗浄した後、これらの液中に再懸濁する。 【００５０】この懸濁液を、脂質の抽出のために常用さ
れている溶剤、例えばクロロホルム／メタノール混合物
により抽出し、相分離してクロロホルム相を得る。次
に、このクロロホルム相を蒸発除去することによりＥＰ
Ａ含有脂質を含む材料が得られる。常法によりこれをけ
ん化することにより遊離のＥＰＡ、又はその塩を得るこ
とができる。かくして、本発明によれば上記のバクテリ
アを使用して発酵生産することにより、精製が容易でか
つ短時間で多量にＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡを得ること
ができる。 【００５１】次に本発明の微生物を用いたＥＰＡ含有脂
質の製造方法の具体的な例を実施例に示す。実施例１ ．シュードモナス・ピュートリファシエンスＳ
ＣＲＣ−２８７８からのＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生
産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地２０Ｌ（リット
ル）を１２１℃、１５分間加熱殺菌した後、シュードモ
ナス・ピュートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７８（微
工研菌寄第９１１４号）を接種し、２５℃で２４時間好
気的に培養した。 【００５２】培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約１５０ｇ（乾燥重量で１６．５ｇ）の菌体を得た。菌
体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１Ｌに懸濁
した。この菌体懸濁液を１Ｌのクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心
分離し、クロロホルム相を得た。さらに水相及び菌体を
クロロホルム６００mLで振とう抽出した後遠心分離し、
クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾
固して得られた脂質画分は、１．１６ｇ（乾燥菌体当り
７．０３％）であった。この脂質画分にはＥＰＡが含ま
れる。 【００５３】この画分を０．３Ｎ ＮａＯＨを含有する
９５％エタノール中で８０℃にて１時間けん化し、ＥＰ
Ａのナトリウム塩を含む生成物を得た。これを６Ｎ Ｈ
Ｃｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。
次に、ジアゾメタン等によりメチルエステル化した後、
ガスクロマトグラフにて分析してその含有率を測定した
ところ、０．１１４ｇ（脂質画分の９．８％、乾燥菌体
の０．６９％）のＥＰＡが含まれていることがわかっ
た。 【００５４】実施例２．アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンスＳＣＲＣ−２８７１からのＥＰＡ含有脂質及
びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地２０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ピュ
ートリファシエンスＳＣＲＣ−２８７１（微工研菌寄第
９１５８号）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養
した。 【００５５】培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約１３５ｇ（乾燥重量で１５．０ｇ）の菌体を得た。菌
体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１Ｌに懸濁
した。この菌体懸濁液を１Ｌのクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心
分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体をク
ロロホルム６００mLで振とう抽出したのち遠心分離し、
クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾
固して得られた脂質画分は、１．０５ｇ（乾燥菌体当た
り７．００％）であった。 【００５６】この脂質画分にはＥＰＡが含まれる。この
画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール
中で８０℃にて１時間鹸化し、ＥＰＡのナトリウム塩を
含む生成物を得た。これを６Ｎ−ＨＣｌにより中和し、
遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。次に、この生成物の
一部をジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析してその含有率を測定した所
全生成物中に０．１１１ｇ（脂質画分の１０．６％、乾
燥菌体の０．７４％）のＥＰＡが含まれていることが分
かった。前記遊離ＥＰＡを含有する生成物をシリカゲル
クロマトグラフィー〔溶出剤：ｎ−ヘキサン／エチルエ
ーテル（９：１）〕により精製してＥＰＡのみを含む画
分を得、これを蒸発乾燥することにより０．１０ｇのＥ
ＰＡを得た。 【００５７】実施例３．シーワネラ・ピュートリファシ
エンスＳＣＲＣ−２８７４からのＥＰＡ含有脂質及びＥ
ＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地２０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、シーワネラ・ピュート
リファシエンスＳＣＲＣ−２８７４（微工研菌寄第９１
５９号）を接種し、２５℃で２４時間好気的に培養し
た。 【００５８】培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約２００ｇ（乾燥重量で２２．５ｇ）の菌体を得た。菌
体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した後、１Ｌに懸濁
した。この菌体懸濁液を１Ｌのクロロホルム−メタノー
ル溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心
分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体をク
ロロホルム６００mLで振とう抽出したのち遠心分離し、
クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾
固して得られた脂質画分は、１．７８ｇ（乾燥菌体当り
７．９１％）であった。この脂質画分にはＥＰＡが含ま
れる。 【００５９】この画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する
９５％エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、ＥＰＡ
のナトリウム塩を含む生成物を得た。これを６Ｎ−ＨＣ
ｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得た。次
に、この生成物の一部をジアゾメタンによりメチルエス
テル化した後、ガスクロマトグラフにて分析してその含
有率を測定した所全生成物中に０．２４１ｇ（脂質画分
の１３．５％、乾燥菌体の１．０７％）のＥＰＡが含ま
れていることが分かった。前記遊離ＥＰＡを含む生成物
をシリカゲルカラムクロマトグラフィー〔溶出剤：ｎ−
ヘキサン／エチルエーテル（９：１）〕により精製して
ＥＰＡのみを含む画分を得、これを蒸発乾燥することに
より０．２２ｇのＥＰＡを得た。 【００６０】実施例４．アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス・サブスピーシズ・サガミファシエンスＳＣ
ＲＣ−１１６２からのＥＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地３０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ピュ
ートリファシエンス・サブスピーシズ・サガミファシエ
ンスＳＣＲＣ−１１６２（微工研菌寄第９２１０号）を
接種し、２５℃で２４時間好気的に培養した。培養後、
遠心分離機で菌体を採取し湿重量約２０５ｇ（乾燥重量
で２５．６ｇ）の菌体を得た。菌体を０．８５％の食塩
水で１回洗浄した後、１．５Ｌに懸濁した。 【００６１】この菌体懸濁液を１．５Ｌのクロロホルム
−メタノール溶液（２：１ｖ／ｖ）で良く振とう抽出し
た後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及
び菌体をクロロホルム９００mLで振とう抽出したのち、
遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出
画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は２．１３ｇ（乾
燥菌体当たり８．３２％）であった。この画分を０．３
Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％エタノール中で８０℃に
て１時間鹸化し、これを６Ｎ−ＨＣｌにより中和し、遊
離のＥＰＡを含む生成物を得た。 【００６２】次に、このジアゾメタンによりメチルエス
テル化した後、ガスクロマトグラフにて分析して、測定
した所０．２０５ｇ（脂質画分の９．６％、乾燥菌体の
０．８０％）のＥＰＡが含まれていることが分かった。
このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
０．１８５ｇを得た。 【００６３】実施例５．アルテロモナス・ルーメンサス
（Alteromonas lumensas）ＳＣＲＣ−６４４４からのＥ
ＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地１０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・ルー
メンサス（Alteromonas lumensas）ＳＣＲＣ−６４４
４（微工研菌寄第９６６７号）を接種し、２５℃で２４
時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採
取し湿重量約１６０ｇ（乾燥重量で２０．４ｇ）の菌体
を得た。 【００６４】菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した
後、０．５Ｌの同食塩水に懸濁した。この菌体懸濁液を
０．５Ｌのクロロホルム−メタノール溶液（２：１ｖ／
ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホル
ム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホルム３００mL
で振とう抽出したのち、遠心分離し、クロロホルム相を
得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂
質画分は１．０５ｇ（乾燥菌体当たり５．１３％）であ
った。この画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％
エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−
ＨＣｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得
た。 【００６５】次に、ジアゾメタンによりメチルエステル
化した後、ガスクロマトグラフにて分析して、測定した
所０．１９８ｇ（脂質画分の１８．９％、乾燥菌体の
０．９７％）のＥＰＡが含まれていることが分かった。
このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
０．１７７ｇを得た。 【００６６】実施例６．アルテロモナス・キシローサス
（Alteromonas xylosus ）ＳＣＲＣ−２５１７からのＥ
ＰＡ含有脂質及びＥＰＡの生産 肉エキス１．０％、ペプトン１．０％、ＮａＣｌ ０．
５％を含有し、pH７．０に調整した培地１０Ｌを１２１
℃、１５分間加熱殺菌したのち、アルテロモナス・キシ
ローサス（Alteromonas xylosus ）ＳＣＲＣ−２５１
７（微工研菌寄第９６６８号）を接種し、２５℃で２４
時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採
取し湿重量約１４５ｇ（乾燥重量で１９．６ｇ）の菌体
を得た。 【００６７】菌体を０．８５％の食塩水で１回洗浄した
後、０．５Ｌの同食塩水に懸濁した。この菌体懸濁液を
０．５Ｌのクロロホルム−メタノール溶液（２：１ｖ／
ｖ）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホル
ム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホルム３００mL
で振とう抽出したのち、遠心分離し、クロロホルム相を
得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂
質画分は１．０１ｇ（乾燥菌体当たり５．１５％）であ
った。この画分を０．３Ｎ−ＮａＯＨを含有する９５％
エタノール中で８０℃にて１時間鹸化し、これを６Ｎ−
ＨＣｌにより中和し、遊離のＥＰＡを含む生成物を得
た。 【００６８】次に、ジアゾメタンによりメチルエステル
化した後、ガスクロマトグラフにて分析して、測定した
所０．１７３ｇ（脂質画分の１７．１％、乾燥菌体の
０．８８％）のＥＰＡが含まれていることが分かった。
このＥＰＡを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラム
を用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロ
マトグラフィーを行なうことにより精製されたＥＰＡ
０．１５９ｇを得た。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(Ｃ１２Ｐ 7/64
Ｃ１２Ｒ 1:38）
(Ｃ１２Ｐ 7/64
Ｃ１２Ｒ 1:01）
(31)優先権主張番号 特願昭62−79806
(32)優先日 昭62(1987)４月２日
(33)優先権主張国 日本（ＪＰ）
(31)優先権主張番号 特願昭62−273200
(32)優先日 昭62(1987)10月30日
(33)優先権主張国 日本（ＪＰ）
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９６６７
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９６６８
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２３
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２４
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２５
微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２６
(72)発明者 沼尾 長徳
神奈川県相模原市南台１−９−２
(72)発明者 近藤 聖
神奈川県大和市中央林間５−16−４
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．シュードモナス・ピュートリファシエンス（Pseudo
monas putrefaciens）、アルテロモナス・ピュートリフ
ァシエンス（Alteromonas putrefaciens）、アルテロモ
ナス・ルーメンサス（Alteromonas lumensas)(硝酸塩還
元能及びＤ−マンノース利用能を有し、且つオルニチン
分解能を有しない）、アルテロモナス・キシローサス
（Alteromonas xylosus)（硝酸塩還元能並びにＤ−マン
ノース、Ｄ−キシロース及びＤ−ガラクトース利用能を
有し、オルニチン分解能及び硫化水素産生能を有さず、
且つ電子顕微鏡レベルでの形態において両極毛の鞭毛を
有する）、及びシーワネラ・ピュートリファシエンス
（Shewanella putrefaciens ）、から成る群から選ばれ
た、エイコサペンタエン酸を生産することができる微生
物。 ２．前記シュードモナス・ピュートリファシエンスがシ
ュードモナス・ピュートリファシエンス（Pseudomonas
putrefaciens）ＳＣＲＣ−２１８１，ＳＣＲＣ−２２０
１，ＳＣＲＣ−２２７１，ＳＣＲＣ−２３４１，ＳＣＲ
Ｃ−２４５１，ＳＣＲＣ−２６４２，ＳＣＲＣ−２７９
２，ＳＣＲＣ−２８７８，ＳＣＲＣ−３０１１又はＳＣ
ＲＣ−３０２２である請求項１に記載の微生物。 ３．前記アルテロモナス・ピュートリファシエンスがア
ルテロモナス・ピュートリファシエンス（Al teromonas
putrefaciens）ＳＣＲＣ−２８７１又はアルテロモナ
ス・ピュートリファシエンス・サブスピーシズ・サガミ
ファシエンス（Alteromonas putrefaciens subspecie
s sagamifaciens ）ＳＣＲＣ−１１６２である請求項１
に記載の微生物。 ４．前記アルテロモナス・ルーメンサスがアルテロモナ
ス・ルーメンサス（Alteromonas lumensas）ＳＣＲＣ−
６４４４である請求項１に記載の微生物。 ５．前記アルテロモナス・キシローサスがアルテロモナ
ス・キシローサス（Alteromonas xylosus ）ＳＣＲＣ−
２５１７である請求項１に記載の微生物。 ６．前記シーワネラ・ピュートリファシエンスがシーワ
ネラ・ピュートリファシエンス（Shewanella putrefac
ienc）ＳＣＲＣ−２８７４である請求項１に記載の微生
物。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
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| JP30878486 | 1986-12-26 | ||
| JP2051187 | 1987-02-02 | ||
| JP2051087 | 1987-02-02 | ||
| JP62-49932 | 1987-03-06 | ||
| JP4993287 | 1987-03-06 | ||
| JP62-79806 | 1987-04-02 | ||
| JP7980687 | 1987-04-02 | ||
| JP62-273200 | 1987-10-30 | ||
| JP62-20511 | 1987-10-30 | ||
| JP62-20510 | 1987-10-30 | ||
| JP27320087 | 1987-10-30 | ||
| JP6318106A JP2698052B2 (ja) | 1986-12-26 | 1994-12-21 | エイコサペンタエン酸生産性微生物 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62325335A Division JPH0761272B2 (ja) | 1986-12-26 | 1987-12-24 | エイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289241A JPH07289241A (ja) | 1995-11-07 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6318106A Expired - Lifetime JP2698052B2 (ja) | 1986-12-26 | 1994-12-21 | エイコサペンタエン酸生産性微生物 |
Country Status (1)
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|---|---|
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Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1994
- 1994-12-21 JP JP6318106A patent/JP2698052B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
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|---|---|
| JPH07289241A (ja) | 1995-11-07 |
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