JPS59118090A - ロウ・エステル、高級脂肪アルコ−ルおよび高級脂肪酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は原生動物ユーグレナ細胞内に蓄積される貯蔵多
糖パラミロンを、単に細胞を嫌気条件下に保持するだけ
で定量的にロウ・エステルに転換せしめるロウ・エステ
ルの製造法、およびこのロウ・エステルをけん化するこ
とによる高級脂肪アルコールおよび高級脂肪酸の製造法
に関する。

ロウ・エステルは化学的［Ｕ高級脂肪アルコールと脂肪
酸とのエステルで、動植物の表皮保護、湿潤維持、熱損
失防止などの作用があり、産業的にはツヤ出し剤、サイ
ジング剤、医薬、香粧材原料として製造されるが、製造
は鯨油ロウ、羊毛ロウ、ミノロウ、綿ロウ、カルナウバ
ロウなど天然産ロウを単離精製することに頼っている。

これら原料はいずれも大量には入手し難く、高価な製品
となる。また高級脂肪アルコールは界面活性剤、医薬、
化粧品などに利用されるが、原理的Ｋｉ−Ｉ中性油脂な
どから容易に得られる高級脂肪酸の化学的還元反応によ
って製造しつるが、高圧下の反応であり必ずしも安価に
製品が得られず、現実にはかｎりの量が天然産ロウ質物
のけん化によって製造畑れている状況である。

このような事態にかんがみ、ロウ・エステルを容易に且
つ安価に得る方法が開発されれば、上記の産業分野に貢
献するところが大きいと思われる本発明者は原生動物ユ
ーグレナが細胞内に蓄積する貯蔵多糖パラミロンを、単
に細胞を嫌気条件下におくだけで、一種の発酵現象によ
って定量的にロウ・エステルに変換することを見出し、
この現象を技術的に開発することによりロウ・エステル
の新規な製造法を考案し、またここにえられろロウ・エ
ステルを公知の方法によってけん化することにより安価
に大量の高級脂肪アルコール及び副生ずる高級脂肪酸を
製造する方法を発明したものである。

ユーグレナは単細胞の原生動物で、細菌、酵母ｌどに比
べると稍大きいが、これら微生物と同様１’Ｃ１−て培
養・増殖せしめることができ、大量の生産に耐える。ユ
ーグレナは多様な培養条件で生育させうるが、常に細胞
内に貯蔵多糖でβ−１，８−グルカンであるパラミロン
を蓄積し、その蓄積量は培養条件によって異なる。本発
明者らの研究によれば好気的に培養したユーグレナ細胞
を窒素気圧下、即ち嫌気条件ＴＩＣ保持すると、速やか
にパラ０　　ミロンが分解し、定量的にロウ・エステル
を生成する。この原理を巧みに利用することにより効率
的に大量のロウ・エステルを安価に製造することができ
、微生物を用いろ技術であるのでエネルギー的にも環境
衛生的にも有益である。

この発明で用いるユーグレナは動物学の分類でユーグレ
ナ属（ミドリムシ属）Ｋ属する原生動物の種、変種、変
異株を指し、代表的なものとしてユーグレナｅグランリ
ス＃２株（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｆｓ２）、ユ
ーグレナ・グランリス・パンラリス・変株（Ｅｕｇｌｅ
ｎａ　ｇｒａｃｉｌｆｓ　ｖａｒ、　ｂａｃｉｌｌａｒ
ｉｓ　）　、ユーグレナ・ビリディス（Ｅｕｇｌｅｎａ
　ｖｉｒｉｄｊｇ　）　、アヌタンア１１０ンガ（Ａｓ
ｔａｓｉａ　ｌｏｎｇａ　）などが挙げられる。ユーグ
レナは池、沼など天然水系にも自然に棲息するので、こ
れらを採取して利用することも可能である。

また紫外線処理、熱処理、抗生物質処理など公知の方法
で得られる、ユーグレナの葉緑体欠損変異株も用いうる
。ユーグレナの培養に用いる培地はコーレンーハットナ
ー（Ｋｏｒｅｎ　ａｎｄ　Ｈｕｔｎｅｒ　；　Ｊ。

Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、　１４　、５ｕｐｐｌｅ、　１７
　（１９６７）　）、ハラトナー（Ｈｕｔｎｅｒ　：　
Ｊ、　Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ、　６　、２３　（１９５９
）　）、クレマ一マイヤー（Ｃｒａｍｅｒ　ａｎｄ　Ｍ
ｙｅｒｓ　：　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ。

１７　、８８４　（１９５２）　　）のような文献記載
のものでもヨく、また炭素源にグルコース、デンプン水
解物、糖蜜水解物、グルタミン酸、酢酸、エタノールな
ど、窒素源にアンモニア、アンモニウム塩、グルタミン
酸、アスパラギン酸などを適宜組合わせ、とｈＫ力ルン
ウム、マグネシウム、マンガン、鉄などの無機塩とビタ
ミンＢ１およびＢ、２　　を微量加えた如何なる培地で
も用いうる。炭素源と窒素源の量比（ＣＡ）　　は４乃
至３ｏが用いられるが、比較的高い値が好都合である。

培養温度は２０　℃乃至３３℃、特［２７℃乃至２９℃
が適当であり、培養の初発ＰＨ１−１＆０乃至？０．Ｗ
Ｋ　１８乃至４５が適当であり、元服）　　　ｔｔ　ｌ
−１４００乃至１００００ルツクスが用いうるが、暗黒
下でもよく、また＠に照射を当てない、室内光による薄
明状態でも良い。培養ＫＶｉＩ分間当り５０−２５０回
の振とぅ又は適度のかく拌を行うことが望ましい。通気
１″１１リットル当り、１分当りα４−２リツトルが適
当である。

このようｌ好気条件での培養によ妙ユーグレナは約４日
乃至７日で生長の定常期に達し、細胞収量は培養液１１
Ｊ　、、　）ル当り乾燥重量として１０　Ｓ’乃至２０
２となり、細胞に含有されるパラミロン量は、培地およ
び培養条件によって大きく変動するが、細胞乾燥重量１
２当り１００■乃至８００　ｒｎｇである。

ロウ・エステルの収量を増加させるためにはユーグレナ
細胞に含まれるパラミロン量ができるだけ多いことが望
ましい。このため細胞として葉緑体を含む野生株よりも
葉緑体欠損株を用い、比較的多量のグルコースを含む培
地中で暗黒Ｔに培養することが有効であった。

パラミロンを含有するユーグレナ細胞を嫌気条件下に保
持するには、培養液より細胞を遠心分離などの操作によ
って単離し、これを適当な緩衝液または水に懸濁し、こ
の混合物に窒素を通じろこＨ とによって達成しうろ。この時鼎は極度に酸性または塩
基性Ｖｃ偵かない限りいくらでも良く、光照射の有無も
ロウ・エステルへの変換に影響しない。

保持温度１−ｉ　２７℃乃至３３℃で３０℃位が適当で
ある。

通常１日乃至８日でパラミロンよりロウ・エステルへの
変換は終り、この時ユーグレナに含まれるパラミロン量
は細胞乾燥重量１２当り１０■乃至２５■（乾燥重量）
に激減し、またロウ・エステル含量は１５０■乃至４０
０■となる。ユーグレナ細胞の嫌気処理は上記のように
細胞を単離したのち再懸濁することなく、培養液その１
まを窒素通気により嫌気条件にすることによってもでき
ろ。いずれの場合も細胞が沈積し、粘質物分泌などをお
こでぬよう軽くかく拌することが望ましい。

ロウ・エステルを充分に含有したユーグレナ細胞からロ
ウ・エステルを単離するには懸濁液または培養液から遠
心分離によって細胞を集め、クロロホルム−メタノール
混液を用いる公知の方法で画 脂質台分を抽出し、この両分より７リカゲル・カラム・
クロマトグラフィによす、ベンゼン−ヘキサン（６：４
）を用いてロウ・エステルを溶出する。溶媒を除去する
とロウ・エステルが固形物として得られろ。またユーグ
レナ細胞を懸濁液中または培養液中超音波などの物理的
力によって破砕し、遠心分離することによりロウ・エス
テルは表層に膜状に回収でれる。これを種々の溶媒を用
いた分別沈殿法で精製することもできる。

ここにえられるロウ・エステルの組成の例は第１表の通
りであって、炭素数２８のロウ・エステルが主成分であ
り、これはミリスチル・ミリステート、すなわち炭素数
１４の脂肪酸と炭素数１４の脂肪アルコールのエステル
である。他にこの前後の炭素数のロウ・エステルが含ま
れ、奇数のものは脂肪酸と脂肪アルコールのいずれかが
奇数の炭素数をもつことを示している。またこの方法で
得られるロウ・エステルの特徴の一つはほとんど飽和の
ロウ・エステルであることであって、不飽和ロウ拳エス
テルは極めて少ない。必要があれば不飽和ロウ・エステ
ルはシリカゲルに硝酸銀を加えることにより分離するこ
とができる。

第１表 ユークレテ・ロウ・エステル　　　　総ロウ・エステル
中の組成（炭素鎖長）　　　　　　チ ２６１７ ２７１７ ２８４２ Ｃ２９１１ Ｃ３０１０ ユーグレナ細胞より単離したロウ・エステルは公知のエ
タノール性水酸化カリウムを用いる化学的方法または適
当な界面活性剤の存在下適当なエステラーゼを用いろ酵
素的方法によってけん化し、等モルの高級脂肪アルコー
ルと高級脂肪酸を得ることができる。両者はけん化混合
液よりヘキサンなどの適当な溶媒によって抽出し、シリ
カゲル・カラム・クロマトグラフィにより、石油エーテ
ル−エーテル−酢′酸（８０：２０：　８　）のような
適当な溶剤によって溶出することにより相互に分離する
ことができる。また種々の公知の逆相クロマトグラフィ
、その他のカラム・クロマトグラフィによっても両者の
分離は達成しうる。

嫌気条件下に保持したユーグレナ細胞より単離したロウ
争エステルおよび高級脂肪アルコールはそれぞれの特有
の目的に利用しうる。高級脂肪酸もしかるべく利用され
るが、ユーグレナ培地に再び加えることにより新しいロ
ウ・エステル合成の素材にもなりうる。

以下実施例によって本発明を更に説明する。

実施例１ ユーグレナ・グランリス・バンラリス・変株の野生株（
緑色株）を　２５００ルツクスの光照射下、クルコース
１％、リン酸アンモニウム０１％、金属塩混合物（前記
Ｋｏｒｅｎ　−Ｈｕｔｎｅｒ文献参照）α０１　％、ビ
タミンＢ１α０００１％、ビタミンＢＩ２αｏｏｏｏｉ
チを含む培地１５〇−中に接種し、２７℃、初発ＰＨａ
５で５％＝酸化炭素を含む空気の通気下（１分間当り０
５　Ｉ＋、トル）、振とう機上（１分間１２０ストロー
ク）に懸濁し、これに１分間当り２０　ｍ７！の割合で
窒素ガスを通じ、この通気が懸濁液のかく拌効果も及ぼ
すようにする。窒素ガス通気ｆｄ　３０℃で室内光下行
なう。４８時間後超音波処理によって細胞を破砕し、ク
ロロホルム−メタノール（１：２）混液ヲ用いて脂質を
抽出し、抽出液を濃縮後ンリカゲル・カラムに負荷し、
ベンゼン−ヘキサン（６：４）混液で溶出し、ロウ・エ
ステル画分を分離し、ついで溶媒を除去して純粋なロウ
・エステル混合物を得る。収ｉｈ培養液１５０ｍ１当り
約（１４ｆであった。

ユーグレナ野生株を用いる時は少量の不飽和ロウ・エス
テルが混在し、これは必要があればンリカゲルφカラム
に硝酸銀を加えることにより分離しつる。ロウ・エステ
ルの使用の目的によっては不飽和ロウ・エステルを特に
分離除去する必要はない。

実施例２ ユーグレナ脅グラシリス・２株の葉緑体欠損株細胞を糖
蜜２％、硫酸アンモニウム０１％、金属塩混合物００１
％、ビタミンＢ、α０００１％、ビタミンＢ１□αｏｏ
ｏｏｉ％　を含む培地２００ｍ／に接種し、暗黒中、通
気（１分間当り２００　ｍＡ　）およびかく押下２７℃
で培養する。５日後細胞濃度１ｄｌ−当！ｌ）　２　Ｘ
　１０７　　個細胞（乾燥重量Ｌ５２）となり、細胞内
パラミロン含量は細胞乾燥重量１１当り７００■であっ
た。この培養液から細胞を谷離することなく、暗黒中２
９℃で窒素ガスを通気し、ゆるいかく拌を（資）時間つ
づける。この操作によりパラミロン含量は細胞乾燥重量
１２当り５０■に減少し、一方ロウ・エステル含量は窒
素ガス通気以前の細胞乾燥重量１２当９１■から４００
〜に増加する。培養液を遠心分離して細胞を集め、実施
例１に記載したようにクロロホルム−メタノール（１：
２）混液で脂質を抽出し、ンリカゲル拳カラム１クロマ
トグラフィによってロウ・エステル約０６２を分離した
。こ＼に得られたロウ・エステルの組成は第１表に示し
たように炭素数２８のものが主成分であった。不飽和ロ
ウ・エステルはほとんど含まれていなかった。

実施例３ ユーグレナ細胞を嫌気処理することにより得たロウ・エ
ステル１２を６係の水酸化カリウムを溶解した９５％エ
タノール１０−ニ加え、１２時間室温にした。抽出液を
濃縮、乾固した後、残渣をりＯＯホルムに溶解し、シリ
カゲル薄層クロマトグラフイニ付し、石油エーテル−エ
チル・エーテル−酢酸（８０：２０：３）の混合溶媒を
用いて脂肪アルコールと脂肪酸を相互に分離し、各分離
画分をクロロホルムで抽出した後遠心分離によってンリ
カゲルを除き、濃縮乾固した。高級脂肪アルコールと高
級脂肪酸の収量はそれぞれ約４２０■で、回収率は約８
５％であった。

実施例４ 実施例１またけ２の方法によってユーグレナを培養後嫌
気処理を行ない、遠心分離によって細胞を集めた。湿重
量１０　ｔの細胞を超音波（１０ＫＣ、５分）により破
砕し、混合物を遠心分離（１５００Ｏｒｐｍ。

３０分）にかけ、表層の脂肪層を分離し、これを１００
−のトリクレンを用いて抽出し、溶媒除去後残渣をエタ
ノールで再結晶すると粗ロウ・エステルが約２ｔの収量
で得られた。これを石油ベンジン２５ｍ１ＶＣ温時溶解
し、冷却して析出する部分をアルミナ・クロマトグラフ
ィに付し、四塩化炭素で溶離することにより約１４Ｆの
精製ロウ・エステルを得た０ これを実施例３に従ってエタノール性水酸化カリウムを
用いてけん化を行ない、脂肪酸混合物をカルンウム塩と
してアセトンで抽出し、ＩＮの塩酸を用いて遊離酸とし
、これを常法によってメチル・エステルに転換した後減
圧蒸留によって各組成脂肪酸エステルに分別する。これ
を酸加水分解によって各鎖長の高級脂肪酸を分別捕集す
る。精製高級脂肪酸の合計収量は　α６２であった。

一方けん化混液より高級脂肪アルコール部分は再びアル
ミナ・クロマトグラフィに付して精製した後、無水酢酸
を用いてアセチル化物とし、これを減圧蒸留によって各
組成アルコールに分別し、後けん化して分別した精製高
級アルコールを合計収量　０５２で得た。

特許出願人　　　　北　岡　正三部

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　原生動物ユーグレナを好気的に培養し、ついで細
   胞を嫌気条件下に保持することにより、貯蔵多糖パラミ
   ロンを定量的にロウ・エステルに転換せしめ、細胞破砕
   または溶媒抽出によりロウ・エステルを単離することを
   特徴とするロウ・エステルの製造法。 ２　原生動物ユーグレナを好気的に培養するにあたり、
   葉緑体欠損株を用い、多量のブドウ糖または、ブドウ糖
   および／または果糖を与える糖質を培地炭素源として用
   い、多量のパラミロンを蓄積せしめた細胞を用いる特許
   請求の範囲第１項記載の培養法。 ａ　原生動物ユーグレナを好気的に培養し、ついで嫌気
   条件下に保持することにより生成せしめたロウ・エステ
   ルを単離し、または細胞内含有のまま、もしくは細胞破
   砕混合体のまま、化学的または酵素的手法によりロウ・
   エステルをけん化し、ついで抽出単離することを特徴と
   する高級脂肪アルコールおよび高級脂肪酸の製造法。