JPH0527384B2

JPH0527384B2 -

Info

Publication number: JPH0527384B2
Application number: JP60097618A
Authority: JP
Inventors: Masakazu Okumura; Shigeru Ii; Hisao Araki; Yoshiki Tani
Original assignee: Harima Chemical Inc
Current assignee: Harima Chemical Inc
Priority date: 1985-05-07
Filing date: 1985-05-07
Publication date: 1993-04-21
Also published as: JPS61254193A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、原生動物ユーグレナ（Euglena、ミ
ドリムシ）を培養することにより、不飽和ワツク
スエステルを高収量に製造する方法に関するもの
である。ワツクスエステルは、化学的には、高級脂肪族
アルコールと高級脂肪酸とのエステルであつて、
動植物の表皮保護、湿潤維持、熱損失の防止等の
作用があり、また産業的には、潤滑剤、艶出し
剤、撥水剤、化粧品の原料等として、多量に使用
されている。従来不飽和ワツクスエステルは、ほとんどは動
植物に起因する天然物から製造されており、その
供給は必ずしも安定しているとは言えなかつた。
特にマツコウ鯨油からは良質の潤滑油として適す
るワツクスエステルが得られているが、近年捕鯨
禁止に端を発する供給不安により、代替原料の必
要にせまられている。マツコウ鯨油は、炭素数がそれぞれ14〜18の長
鎖脂肪酸と長鎖アルコールとからなる直鎖状エス
テルであつて、その脂肪酸及びアルコールは、そ
れぞれ飽和又は、二重結合を一個有する不飽和の
ものである。このマツコウ鯨油の代替原料として、深海魚オ
レンジラフイー（Hoplostethus atlanticus）油
や、植物ホホバ（Simmondsia chinensis）油が
注目されている。オレンジラフイー油は、炭素数
がそれぞれ16〜22であり、飽和又は二重結合を一
個有する不飽和の、長鎖脂肪酸と長鎖アルコール
とのエステルを主成分とするものであり、またホ
ホバ油は、炭素数がそれぞれ20及び22で、それぞ
れ二重結合一個を有する不飽和長鎖脂肪酸と不飽
和長鎖アルコールとのエステルを主成分とするも
のである。これらはマツコウ鯨油に類似の構造を
有しており、マツコウ鯨油の代替原料となり得る
ものであるが、前者では漁獲制限や魚臭の問題が
あり、また後者では播種から収穫に至るまでに長
期間を要するものであつて、充分に安定した供給
源とは言えなかつた。また微生物学的にワツクスエステルを生産する
方法が知られている。この方法は、微生物の成育
が速く、生産性の調整が容易であつて、優れた方
法である。従来の技術而して従来微生物学的にワツクスエステルを得
る方法として、Micrococcus cerificansを用いて
ヘキサデカンからパルミチン酸セチルを生産する
方法（米国特許3409506号）、原生動物ユーグレナ
により、炭素数が26〜30の飽和直鎖ワツクスエス
テルを生産する方法（特開昭59−118090号）、
Nocardia属放線菌を用いてヘキサデカンからパ
ルミチン酸セチルを生産する方法（Adv.Appl.
Microbiol.14巻（1971年）93頁）、Acinetobacter
属細菌等を使用して飽和炭化水素からマツコウ鯨
油やホホバ油に類似の化学構造を有するワツクス
エステルを得る方法（米国特許第4404283号）等
が知られている。発明が解決しようとする問題点しかしながら前三者の方法で得られるものは、
すべて飽和のワツクスエステルであつた。マツコ
ウ鯨油は前述のように潤滑油として優れている
が、潤滑油としては耐圧性、耐老化性を満足する
必要があり、そのためには、ワツクスエステルを
構成する脂肪酸及びアルコールの炭素数がそれぞ
れ14以上であり、脂肪酸及びアルコールの少なく
とも一方に不飽和二重結合を有していることが必
要であると考えられている。従つて、前述のよう
な飽和ワツクスエステルは、マツコウ鯨油の代替
原料としては適当でない。また前述の従来の方法のうち米国特許4404283
号の方法によれば、不飽和のワツクスエステルが
得られるが、その生産性は低く好ましい方法とは
言えない。本発明はかかる事情に鑑みなされたものであつ
て、原生動物ユーグレナを培養することにより、
潤滑油等として優れたマツコウ鯨油の代替原料と
して適当な不飽和のワツクスエステルを、高収量
に生産する方法を提供することを目的とするもの
である。問題点を解決する手段而して本発明は、培地に原生動物ユーグレナを
好気的に培養し、該培地に不飽和脂肪酸を添加し
た後、培地を嫌気状態に移行することを特徴とす
るものである。本発明において使用するユーグレナは、動物学
の分類上ユーグレナ属（ミドリムシ属）に属する
原生動物であつて、この属に属する種、変種、変
異株を含むものである。代表的なものとしてユー
グレナ・グラシリス・Ｚ株（Euglena gracilis
Ｚ）、ユーグレナ・グラシリス・バシラリス変株
（Euglena gracilis bacillaris）、ユーグレナ・ビ
リデイス（（Euglena viridis）、アスタシア・ロ
ンガ（Astasia longa）等を挙げることができ
る。またユーグレナは、池や沼等の天然水系にも自
然に生息しており、これらを採取して利用するこ
とも可能である。またこれらを紫外線処理、熱処
理、抗生物質処理、ニトロソグアニジン処理等の
公知の方法で処理した各種の変異株も使用するこ
とができる。ユーグレナの培養に使用する培地は、コーレ
ン・ハツトナー培地（ジヤーナルオブプロトゾオ
ロジー（Journal of Protozoology）14巻（1967
年）増補17頁記載）や、ハツトナー培地（ジヤー
ナルオブプロトゾオロジー６巻（1959年）23頁記
載）等の公知の培地を使用することができる。また、炭素源としてグルコース、澱粉水解物、
糖蜜水解物、グルタミン酸、酢酸、エタノール等
を使用し、窒素源として硝酸アンモニウム、第二
燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等のような
無機窒素源、グルタミン酸、アスパラギン酸等の
アミノ酸又は、ペプトン、カザミノ酸、酵母エキ
ス、コーンスチープリカー等の有機窒素源を、適
宜組合わせ、これにカルシウム、マグネシウム、
マンガン、鉄等の無機塩と、ビタミンB₁及びB₁₂
を微量加えたような培地を使用することもでき
る。また炭素源を使用せず、ユーグレナの光合成
によることもできる。ユーグレナの培養温度は20〜33℃が適当であ
り、初発PHは3.0〜7.0が適当である。培養は光照
射下又は暗黒下のいずれで行つても良い。また培
養時には、１分間当り50〜250回の振盪、又は適
度の通気撹拌を行うことが好ましい。このような好気条件下で培養することにより、
ユーグレナは約３〜６日で成長の定常期に達し、
細胞の収量は、培養液１当りの乾燥重量として
10〜20ｇとなる。本発明において培地に添加する不飽和脂肪酸と
しては、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、
オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレ
ン酸、ガドレイン酸、ゴンドレイン酸、セトレイ
ン酸、エルカ酸等が挙げられるが、目的とするワ
ツクスエステルの化学組成に応じた各種脂肪酸及
び、これらの各種アミノ塩、金属塩を使用するこ
とができる。不飽和脂肪酸の添加量は、培地に対して0.1〜
５％程度であり、特に0.5〜２％程度が適当であ
る。培養の初期に添加する場合には、高濃度に添
加するとユーグレナの成育を阻害するので、１％
以下、さらに好ましくは、0.2〜0.5％とするのが
良い。これらの不飽和脂肪酸の培地への添加時期は、
培地開始後いかなる時期でも良い。培地に最初か
ら添加しておいてもよいのであるが、培養の初期
に高濃度の脂肪酸があると菌の成育を遅らせるの
で、菌がある程度成育した後に添加するのが好ま
しい。また、後の工程において培地を嫌気状態に移行
する際には、添加した不飽和脂肪酸がすでに細胞
内に取込まれていることが望ましいので、嫌気状
態に移行する１〜２日前に添加するのが最も好ま
しい。培地の嫌気状態への移行は、培地中に窒素を通
じることにより行う。移行の時期は、ユーグレナ
の成長の定常期付近が好ましい。培地を嫌気状態
に移行した後、１〜５日間その状態に保持するこ
とにより、細胞中に不飽和ワツクスエステルが蓄
積される。このようにして細胞内にワツクスエステルが蓄
積されたならば、遠心分離等の方法で培養液から
菌体を分離し、常法によつて脂質を抽出し、続い
て該脂質からワツクスエステルを分離する。脂質
の抽出は、湿菌体をクロロホルム／メタノール混
液を用いて抽出処理することにより行うことがで
き、またこの脂質からシリカゲルを使用したカラ
ムクロマトグラフイー等でワツクスエステルを分
離する。作用ユーグレナは細菌や酵母等に比べればかなり大
きい単細胞の原生動物であるが、これらの微生物
と同様にして培養することができ、大量に生産す
ることができる。またユーグレナを好気的に培養
した後嫌気条件下に保持するとワツクスエステル
を生成することは前記特開昭59−118090により知
られており、その生成量は乾燥菌体重量の50％に
も達するものであつて、極めて生産性の高いもの
である。ユーグレナによる嫌気条件下におけるワツクス
エステルの生成機構は、次のようなものであると
考えられている。すなわち、好気条件下に培養されたユーグレナ
を嫌気条件下に置くと、好気条件下で貯蔵された
多糖であるパラミロンが、グルコース単位に分解
され、解糖系を経てピルビン酸になる。生成した
ピルビン酸は、アセチルコエンザイムＡになり、
さらにアセチルコエンザイムＡから脂肪酸が合成
される。このような過程を経て合成された脂肪酸は、炭
素数14を中心として11〜17の飽和の直鎖脂肪酸で
あるが、その一部はほゞ同様の炭素数分布を持つ
アルコールに還元され、その両成分の間でエステ
ル化反応が生じ、ワツクスエステルが生成するの
である。従つて、通常の培地による培養において
は、脂肪酸もアルコールもいずれも飽和のもので
あり、これらから得られるワツクスエステルも飽
和のもののみである。而してこのユーグレナによる嫌気状態における
ワツクスエステル生成過程において、細胞内に培
地から取込んだ不飽和脂肪酸が存在すると、その
一部はグルコースに由来する飽和長鎖アルコール
との間にエステル結合を形成して、不飽和脂肪酸
と飽和アルコールとのエステルを生じ、また他の
一部は不飽和長鎖アルコールに還元された後、グ
ルコース由来の飽和脂肪酸及び培地から取り込ん
だ不飽和脂肪酸との間にエステル結合を形成する
のである。発明の効果本発明によれば、このようにしてユーグレナの
通常の嫌気状態下での培養による飽和ワツクスエ
ステルに加えて、培地に添加した不飽和脂肪酸に
由来する不飽和ワツクスエステルを効率良く生成
させることができるのである。而して本発明により得られたワツクスエステル
は、その成分中に高率で不飽和二重結合を有して
おり、マツコウ鯨油に類似の化学構造を有し、そ
の代替原料として潤滑剤等の用途に広く使用する
ことができる。しかもユーグレナは極めて入手の容易な原生動
物であり、それを培養することによつて、大量に
且つ安定して不飽和ワツクスエステルを供給する
ことができるのである。また細胞内の蓄積パラミロン量、培地からのグ
ルコース等のアセチルコエンザイムＡ供給源の供
給量及び、培地に添加する不飽和脂肪酸の種類と
その供給量を調節することにより、生成するワツ
クスエステルの組成を変化させることが可能であ
る。実施例以下本発明の実施例について説明する。実施例１グルコース２ｇ、ポリペプトン0.5ｇ、硫酸ア
ンモニウム25mg、炭酸水素アンモニウム25mg、第
二燐酸アンモニウム25mg、炭酸マグネシウム60
mg、炭酸カルシウム12mg、モール塩５mg、硫酸マ
ンガン−水和物1.8mg、硫酸亜鉛七水和物2.5mg、
ビタミンB₁0.25mg及びビタミンB₁₂0.0005mgを、
脱イオン水100mlに溶解し、PHを4.5に調整した。
これを500ml容の長頚振盪フラスコに入れて培地
とし、ここにユーグレナ・グラシリス・Ｚ株を接
種し、１分間に120回振盪しながら暗黒下に28℃
で３日間培養した。然る後日本油脂株式会社製オレイン酸（オレイ
ン酸93.5％、リノール酸1.7％、ステアリン酸2.4
％）を１ｇ添加し、さらに１日培養を継続した。次いでフラスコ内容物を全て200ml容三つ口丸
底フラスコに移し、PHを6.5に調整し、20℃でゆ
るやかに撹拌しながら、室内光の下で窒素ガスを
通気しながら、さらに５日間培養を継続した。次に遠心分離により菌体を集め、0.85％食塩水
で２回洗浄した後、その菌体をクロロホルム／メ
タノール（１：１）混液に浸漬し、超音波でホモ
ジナイズして菌体を破砕すると共に、脂質を抽出
した。抽出した脂質はシリカゲルカラムに負荷
し、ヘキサン／酢酸エチル（10：0.5）混液で溶
出し、純粋のワツクスエステル画分を得た。ワツ
クスエステルの収量は、培養液100ml当り約0.85
ｇであつた。分離したワツクスエステルを常法に従い、アル
カリで鹸化して脂肪酸成分とアルコール成分とに
分け、脂肪酸成分をメチルエステル化した後、そ
れぞれガスクロマトグラフイーによる分析を行
い、構成成分の組成を検討した。その結果を表−
１に示す。

【表】実施例２ユーグレナ・グラシリス・Ｚ株の野生株を、
500ml容の長頚振盪フラスコ中の１％グルコース
を主炭素源とするコーレン・ハツトナー培地100
mlに接種し、初発PH3.5で１分間に120回振盪しな
がら、暗黒下、28℃で培養した。４日間培養した
後、遠心分離によつて細胞を集め、１ｇのオレイ
ン酸（実施例１と同じ）を含む100mlのコーレ
ン・ハツトナー培地（PH7.0）に再懸濁し、実施
例１におけると同様に、撹拌しながら室温（10〜
15℃）で窒素ガスを通じて５日間培養した。然る後実施例１に述べたと同様に操作して菌体
を集め、脂質を抽出し、ワツクスエステルを分離
した。ワツクスエステルの収量は、培地100ml当
り、約0.40ｇであつた。またそのワツクスエステ
ルの構成成分の組成は、表−２の通りであつた。

【表】

【表】実施例３培地に添加する不飽和脂肪酸として、和光純薬
工業株式会社製のリノール酸（リノール酸88.7
％、オレイン酸9.8％、α−リノレン酸0.5％、パ
ルチミン酸0.6％）を１ｇ使用した外は、実施例
２と同様にしてワツクスエステルを得た。収量
は培地100ml当り約0.80ｇであり、その構成成分
の組成は、表−３の通りであつた。

【表】実施例４培地に添加する不飽和脂肪酸として、半井化学
薬品工業株式会社のα−リノレン酸（α−リノレ
ン酸72.7％、リノール酸19.7％、オレイン酸7.1
％）１ｇを使用した外は、実施例２と同様にして
ワツクスエステルを得た。ワツクスエステルの収
量は培地100ml当り約0.91ｇであり、その構成成
分の組成は、表−４の通りであつた。

【表】以上の実施例から、培地からユーグレナの細胞
内に取込まれた不飽和脂肪酸及び、該不飽和脂肪
酸がユーグレナが持つ長鎖脂肪酸還元酵素系によ
り還元された不飽和長鎖アルコールを、それぞれ
構成成分として有する不飽和ワツクスエステルが
効率よく生成していることが理解できる。また、実施例１のように、培地に不飽和脂肪酸
を添加した後ただちに嫌気状態に移行せず、好気
的培養を経た場合には、菌体内に取り込まれた不
飽和脂肪酸がβ酸化を受けたことに起因すると考
えられる、鎖長の減成した不飽和脂肪酸、及びそ
れが還元されたことに起因すると考えられる鎖長
の減成した不飽和アルコールも、一部生成してい
る。

Claims

【特許請求の範囲】

１培地に原生動物ユーグレナを好気的に培養
し、該培地に不飽和脂肪酸を添加した後、培地を
嫌気状態に移行することを特徴とする、不飽和ワ
ツクスエステルの製造方法。