JPH0761272B2 - エイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法 - Google Patents

エイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法

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JPH0761272B2
JPH0761272B2 JP62325335A JP32533587A JPH0761272B2 JP H0761272 B2 JPH0761272 B2 JP H0761272B2 JP 62325335 A JP62325335 A JP 62325335A JP 32533587 A JP32533587 A JP 32533587A JP H0761272 B2 JPH0761272 B2 JP H0761272B2
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【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はエイコサペンタエン酸（以下EPAという）含有
脂質の発酵法による製造方法に関する。
〔従来の技術〕
EPAに代表される多価不飽和脂肪酸は、生体膜の構成成
分として重要な役割を担っている。またこれまでに知ら
れているEPAの薬理作用には、以下のものが知られてい
る。血小板凝集抑制作用（血栓溶解作用）血液中の
中性脂肪低下作用血液中のVLDL−コレステロール、LD
L−コレステロール低下作用、HDL−コレステロール増加
作用（抗動脈硬化作用）血液粘度低下作用血圧降下
作用抗炎症作用抗腫瘍作用。さらに、プロスタグラ
ンジン一族の生成に際し基質となり、ヒトを含む高等ほ
乳動物の体内で必須的な機能を発揮する。特にEPAはタ
イプ３のプロスタグランジンの生成の際の基質として重
要であって、血小板の凝集抑制作用があり、血栓症の治
療及び予防剤としての応用が検討されている。さらにEP
Aは、血漿コレステロールレベルの低下に寄与する多価
不飽和脂肪酸の中でも特に活性が高く、通常の植物油に
含まれるリノール酸などよりも遥かに有効である。また
魚類等の必須栄養素としても知られている。
このように、EPAがその血栓防止作用あるいは脂質低下
作用に基づく健康食品あるいは医薬品としての可能性が
デンマークのダイヤーベルグ（Am.J.Clin.Nutr.,28,95
8,1975）の疫学調査により明らかにされているが、その
化学構造から明らかなように化学合成することは、極め
て困難である。このようなことから我が国においてもEP
Aを多く含有するイワシ、サバ、サンマ等の青背魚の摂
食が推奨されるようになってきた。
今日、健康食品として市販されているEPAは、そのほと
んどが煮取法によって得られた魚油の分別物であって、
そのEPA含量は10〜30％程度である。煮取法によって抽
出される魚油は構成脂肪酸として多種類の脂肪酸を含む
混合グリセリドであって、各成分を単離精製することが
困難であるばかりでなく、EPAはすべてシス形の二重結
合を５個有する炭素数20の直鎖の多価不飽和脂肪酸であ
る為に、極めて酸化され易い不安定な脂肪酸であり、魚
油からEPAを濃縮する場合には酸素・光・熱等を避けて
行なう必要がある。さらに、これら魚油EPAの分別に使
用された各種の有機溶剤は通常減圧下に除去されるが、
その完全除去は技術的及びコスト的に問題点が多い。
医薬品としてのEPAは、様々な方法によって抽出された
魚油を酵素的にもしくはアルカリ条件下で処理して遊離
脂肪酸まで加水分解するか又は該遊離酸をメチルもしく
はエチルエステルに変じた後、これらを低温分別結晶
法、尿素付加法、減圧蒸留法又は、逆相クロマト法等に
より更に精製してEPA濃度を90％以上としたものが多
い。
しかし、これらの方法を用いて得られたEPA濃縮物は、
工程中に各種の有機溶剤が使用されたりまたは、200℃
近い高熱を加えられたりするため、有機溶剤の残留やEP
Aの重合、異性化あるいは酸化等による変質の懸念をは
らんでいる。更に、魚油等をEPAの原料として用いた場
合、心臓疾患の原因の一つとして疑われているドコセン
酸等の除去が困難であるため、健康食品、医薬品等に利
用する上で問題点を残している。
一方、最近、不完全な精製・濃縮では、魚臭が残るなど
の欠点を有した魚油からの抽出法を改善することを目的
として、クロレラ、単細胞藻類モノダス、ユーグレナあ
るいはけい藻等微生物を用いたEPAの生産方法が散見さ
れる様になり、微生物を利用したEPA生産が注目されて
きている。最近では、ゲラーマンとシュレンク（J.L.Ge
llerman and H.Schlenk,BBA,573,23,1979）及び、山田
等（昭和61年度日本醗酵工学会大会、1986）の発表で、
EPAを生産するかび（糸状菌）についての報告がなされ
た。これら微生物によるEPA生産は、その脂肪酸組成か
ら、分離精製が比較的容易なこと、また培養制御によ
り、EPA生産をコントロールしやすい等の長所がある。
しかしながらバクテリア等に比較して、培養時間が長く
（７日〜１ケ月程度）、生産性の向上が大きな問題点と
して残っている。
〔本発明の解決しようとする問題点〕
以上述べて来た様に、健康食品または、医薬品として考
えられているEPAの、魚油からの抽出生産、あるいは、
藻類かび等の培養による生産には、いくつかの問題点が
有る。これらのことから、本発明の目的は、精製が容易
で純度の高いものが得られ、かつ培養時間が短く培養制
御が容易な、バクテリアを利用したEPA含有脂質の醗酵
生産方法を見出す事にある。
〔問題点を解決するための手段〕
本発明者等は、EPA産生能を有するバクテリアを広く海
洋に求めて鋭意研究を行った結果、シュードモナス（Ps
eudomonas）属、アルテロモナス属又はシーワネラ属に
属するバクテリアがEPAを生産することを見出し、この
知見に基いて本発明を完成した。
従って、本発明は、シュードモナス属、アルテロモナス
属又はシーワネラ属に属し、エイコサペンタエン酸含有
脂質を生産することができる微生物を培養することによ
ってエイコサペンタエン酸含有脂質を生成蓄積せしめ、
そしてエイコサペンタエン酸含有脂質を単離することを
特徴とするエイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法を
提供するものである。
〔具体的な説明〕
（１）微生物 本発明において使用する微生物はシュードモナス属、ア
ルテロモナス属、又はシーワネラ属に属し、EPA又はこ
れを含有する脂質を生産することができるものであれば
よく、このような微生物は自然界から新たに分離し、又
は保存菌から選択することができる。
シュードモナスに属する微生物の例として、シュードモ
ナス・ピュートリファシエンス（Pseudo-monas putref
aciens）を挙げることができ、新菌株として本発明者等
が分離したシュードモナス・ピュートリファシエンスSC
RC−2181,SCRC−2201,SCRC−2271,SCRC−2341,SCRC−24
51,SCRC−2642,SCRC−2792,SCRC−2878,SCRC−3011,SCR
C−3022を挙げることができる。
アルテロモナスに属する微生物の例として、アルテロモ
ナス・ピュートリファシエンス（Altero-monas putref
aciens）を挙げる事が出来、新菌株として本発明者等が
分離した、アルテロモナス・ピュートリファシエンスSC
RC−2871、及びアルテロモナス・ピュートリファシエン
ス・サブスピーシズ・サガミファシエンス（Alteromona
s putre-faciens subspecies sagamifaciens）SCRC−1
162、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Alter
omonas putrefaciens SCRC−2871等を挙げる事ができ
る。一方、この種に属する保存菌として例えばアルテロ
モナス・ピュートリファシエンス IAM−1510及びアルテ
ロモナス・ピュートリファシエンスIAM−12425を挙げる
事が出来、これらの保存株はそれぞれの寄託番号のもと
にIAMから自由に入手する事が出来る。
アルテロモナスに属する微生物の例として、さらにアル
テロモナス・ハネダイ（Alteromonas hanedai）を挙げ
る事が出来る。この種に属する保存菌として例えばアル
テロモナス・ハネダイIAM−12641を挙げる事が出来、こ
の保存菌はその寄託番号のもとにIAMからの自由に入手
する事が出来る。
アルテロモナスに属する微生物の例として、さらにEPA
産生能を持つ微生物として、本発明者等が新たに分離
し、アルテロモナス・ルーメンサス（Alteromonas lum
ensas）と同定・命名したSCRC−6444、及びアルテロモ
ナス・キシローサス（Alteromonas xylosus）と同定・
命名したSCRC−2517を挙げる事が出来る。
シーワネラに属する微生物の例として、シーワネラ・ピ
ュートリファシエンス（Shewanella putrefaciens）を
挙げる事が出来、新菌株として本発明者等が分離した、
シーワネラ・ピュートリファシエンスSCRC−2874を挙げ
る事が出来る。
またこの種に属する保存菌株としてシーワネラ・ピュー
トリファシエンスIAM−1510、シーワネラ・ピュートリ
ファシエンスIAM−12425等がEPA産生能を持っている。
前記の新菌株は次のようにして分離した。次の第１表に
示す組成の培地を調製した。
第１表 肉エキス １％ ペプトン １％ NaCl 0.5％ 寒天 1.5％ 水道水 pH7.0 この寒天平板培地に各地の海洋より採取した海洋性生物
体サンプルを滅菌した生理食塩水で適度に希釈したもの
を接種し、25℃で１〜２日間培養した。この寒天平板培
地に出現したコロニーを同じ培地組成の斜面培地に釣菌
した。
このようにして各地の海洋より採取した海洋性生物体サ
ンプルから多数の菌株を分離した。次に、表の培地より
寒天をぬいたものを試験管に5mlずつ分注し、同様に滅
菌した。それぞれの菌株をこの培地で25℃、１〜２日間
培養した。得られた培養液より、後記の方法によりEPA
産生能を検定した。このようにして、EPAを顕著に生産
する下記の株を得た。これらの菌株の分離源は次表の通
りであった。
これらの菌株はそれぞれ次の第３表に示す菌学的性質を
有する。
上記の菌学的性質に基き、これらの菌株を、バージイズ
・マニュアル・オブ・ディターミナティブ・バクテリオ
ロジー（Bergey′s Manual of Determinative Bacterio
logy）第８版、1974年〔参照文献１〕；マニュアル・オ
ブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Manual of Cl
inical Micro−biology）第３版、1980年〔参照文献
２〕；バージイズ・マニュアル・オブ・システマティク
・バクテリオロジー（Bergey′s Manual of Systematic
Bacteriology）第１巻、352頁、1984年〔参照文献
３〕；並びにジャーナル・オブ・ゼネラル・マイクロバ
イオロジー（Journal of General Micro−biology）12
9,3057−3074（1983）〔参照文献４〕に従って次のよう
に同定した。
SCRC−2181,SCRC−2201,SCRC−2271,SCRC−2341,SCRC−
2451,SCRC−2642,SCRC−2792,SCRC−2878,SCRC−3011,
及びSCRC−3022は、いずれも、好気性で運動性及び１本
の極鞭毛を有し、またカタラーゼ、オキシダーゼ活性を
有するグラム陰性の桿菌であることから、参照文献１及
び２に従えばシュードモナス属に属する。シュードモナ
ス属の種としてシュードモナス・ピュートリファシエン
スが知られており、前記性質の文献記載のそれとほぼ一
致するので、前記10株はシュードモナス・ピュートリフ
ァシエンスであると同定される。なお、糖からの酸およ
びガスの生成テストの項目の中には必ずしも、文献記載
のそれと一致しない項目があるが、これらは分類学上さ
ほど重要な項目ではなく、同一種でも一般的によく変化
するものであり、これらの記載に必ずしも規定されるも
のではない。
なお、参照文献４には、シュードモナス・ピュートリフ
ァシエンスはDNAのＧ＋Ｃ含量による分類からアルテロ
モナス（Alteromonas）属に近いことより、アルテロモ
ナス・ピュートリファシエンス（Alteromonas putrefa
ciens）として記載されている。またこのことは、前記
参照文献３に於いても記載されている。
さらに近年システマティック・アンド・アプライド・マ
イクロバイオロジー（Systematic and Applied Microbi
ology）６,171−182（1985）（参照文献５）に於いて、
新たにシーワネラ（Shewanella）属が提唱され、上記菌
種をシーワネラ・ピュートリファシエンス（Shewanella
putrefaciens）とすることが提唱されている。
SCRC−2871は、好気性で運動性及び１本の極鞭毛を有
し、またカタラーゼ、オキシターゼ活性を有するグラム
陰性のかん菌であり、かつDNAのＧ＋Ｃ含量が47.1％で
ある事から、前記文献1,2,3、及び４に従って、アルテ
ロモナス属に属する。アルテロモナス属の種としてアル
テロモナス・ピュートリファシエンスが知られて居り、
前記性質が文献記載のそれとほぼ一致するので、この菌
株はアルテロモナス・ピュートリファシエンスであると
同定される。
SCRC−2874は、好気性で運動性及び１本の極鞭毛を有
し、またカタラーゼ、オキシターゼ活性を有するグラム
陰性のかん菌であり、前記の表に示す菌学的性質を示す
ことから、前記文献１、及び２の分類基準に従えばシュ
ードモナス・ピュートリファシエンスに属する。しかし
ながら、シュードモナス・ピュートリファシエンスは前
記参照文献４においては、DNAのＧ＋Ｃ含量による分類
からアルテロモナス（Alteromonas）属に近いことよ
り、アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Altero
monas putrefaciens）として記載されており、またこ
のことは前記文献３にも記載されている。さらに、前記
文献５においては、5S rRNAの塩基配列により新たにシ
ーワネラ（Shewanella）属を提唱し、上記菌種をシーワ
ネラ・ピュートリファシエンス（Shewanella putrefac
iens）とすることを提唱している。以上の事から、この
菌株はシーワネラ属に属しシーワネラ・ピュートリファ
シエンスであると同定される。
SCRC−1162は下記の特徴を有する。
グラム陰性 運動性を持つ 非胞子形成の好気性かん菌 Ｏ−Ｆテスト陰性 カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 硝酸塩還元能を持つ 硫化水素産生能を持つ ゼラチン・DNA分解能を持つ グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生（−） キノン型；ユビキノン７と８、メナキノン、メチル
メナキノン 周毛性鞭毛を持つ Na+要求性 このような諸性質を有する本菌株SCRC−1162株の分類学
的な位置は、前記の参照文献1,2,3、及び４に従えば次
の様に同定される。上記からまでの項目により、ア
ルテロモナス・ピュートリファシエンス（Alteromonas
putrefaciens）に類縁の菌株であると考えられる。し
かしながら、電子顕微鏡レベルでの形態から、周毛生の
鞭毛を持ち、またオルニチン分解能を持たず、Na+要求
性であることから、本菌株をアルテロモナス・ピュート
リファシエンス・サブスピーシズ・サガミファシエンス
（Alteromonas putrefaciens subspecies sagamifacie
ns）と同定、命名した。
SCR−6444及びSCR−2517は下記の主たる性質を有する。
グラム陰性 運動性を持つ 非胞子形成の好気性かん菌 Ｏ−Ｆテスト陰性 カタラーゼ、オキシダーゼ陽性 ウレアーゼ陰性 ゼラチン、DNA分解能を持つ グルコースからの酸産生（＋）、ガス産生（−） NaClまたは海水要求性 Ｇ＋Ｃ含量:SCRC−6444;41.4％、 SCRC−2517;41.1％、 このような諸性質を有する本菌株SCRC−6444及びSCRC−
2517株の分類学的な位置は、前記文献1,2,3、及び４の
分類基準に従えば次の様に同定される。上記からま
での項目により、アルテロモナス・ピュートリファシエ
ンス（Alteromonas putrefaciens）またはアルテロモ
ナス・オーランティア（Alteromonas aurantia）に類
縁の菌株であると考えられる。しかしながら、SCRC−64
44は、硝酸塩還元能及びＤ−マンノース利用能を持ち、
またオルニチン分解能を持たないことから、従来のどの
種にも属さず、本菌株をアルテロモナス・ルーメンサス
（Alteromonas lumensas）と同定・命名した。
一方SCRC−2517は、硝酸塩還元能及びＤ−マンノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース利用能を持ち、また
オルニチン分解能及び硫化水素性能を持たず、さらに電
子顕微鏡レベルでの形態から両極毛の鞭毛を持つ事か
ら、従来のどの種にも属さず、本菌株をアルテロモナス
・キシローサス（Alteromonas xylosus）と同定・命名
した。
以上記載した本発明の新菌株の内下記の株が工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託され、さらにブタペプト条
約に基く国際寄託に移管された。
シュードモナス・ピュートリファシエンス（Pseudomona
s putrefacience）SCRC−2878 昭和61年12月26日寄託 微工研菌寄第9114号（FERM P−9114） 昭和62年12月17日国際寄託に移管 微工研条寄第1623号（FERM BP−1623） アルテロモナス・ピュートリファシエンス（Alteromona
s putrefacience）SCRC−2871 昭和62年１月28日寄託 微工研菌寄第9158号（FERM P−9158） 昭和62年12月17日国際寄託に移管 微工研条寄第1624号（FERM BP−1624） シーワネラ・ピュートリファシエンス（Shewa-nella p
utrefacience）SCRC−2874 昭和62年１月28日寄託 微工研菌寄第9159号（FERM P−9159） 昭和62年12月17日国際寄託に移管 微工研条寄第1625号（FERM BP−1625） アルテロモナス・ピュートリファシエンス・サブスピー
シズ・サガミファシエンス（Alteromonas putrefacien
s subspecies sagamifaciens）SCRC−1162 昭和62年２月20日寄託 微工研菌寄第9210号（FERM P−9210） 昭和62年12月17日国際寄託に移管 微工研条寄第1626号（FERM BP−1626） アルテロモナス・ルーメンサス（Alteromonas lumensa
s）SCRC−6444 昭和62年10月20日寄託 微工研菌寄第9667号（FERM P−9667） アルテロモナス・キシローサス（Alteromonas xylosu
s）SCRC−2517 昭和62年10月20日寄託 微工研菌寄第9668号（FERM P−9668） 以上、自然界から分離した菌株について詳細に記載した
が、これらの菌に差異を生じさせて一層生産性の高い菌
株を得ることもできる。
この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント培地上で、又は凍結乾燥法により保
存することができる。寒天スラント培地としてシュード
モナス属細菌の保存に常用されている培地、例えば菌の
分離に関して前記した培地を使用することができる。ま
た、凍結乾燥保存も常法に従って行うことができる。
（２）EPA及びEPA含有脂質の製造方法 前期の微生物を培養して本発明のEPAを製造しようとす
る場合、基礎栄養培地として、この発明の微生物が増殖
し得るものであればいずれを使用してもよい。この培地
は、窒素源として例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキ
ス等の１種類又は複数種類を含有する。また、この培地
には必要に応じて炭素源として各種の糖類を加えること
ができる。この培地には、塩化ナトリウム、もしくは天
然海水や人工海水を加えることが好ましい。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、目的とするEPAを多量に得るためには、液体培
地を用い、静置培養もしくは振とう培養、通気・攪拌培
養等により好気的条件下で培養を行うのが好ましい。培
養温度は菌が生育し、EPAが生産される温度範囲内であ
ればいずれの温度でも良く、好ましくは５〜30℃であ
り、より好ましくは15〜25℃である。pHは６〜９、好ま
しくは７〜８の範囲である。培養時間は採取し得る量の
EPA含有脂質が生産される時間を選べば良く好ましくは
８〜48時間である。
次に得られた培養物から本発明のEPAが採取される。精
製法として通常の脂質精製法を用いることが出来る。例
えば、培養液から延遠心離、濾過等の常用の集菌手段に
よって菌体を集める。次に、この菌体を所望により水、
食塩水、又は緩衝液、例えば酸緩衝液等により洗浄した
後、これらの液中に再懸濁する。この懸濁液を、脂質の
抽出のために常用されている溶剤、例えばクロロホルム
／メタノール混合物により抽出し、相分離してクロロホ
ルム相を得る。このクロロホルム相を蒸発除去すること
によりEPA含有脂質を含む材料が得られる。常法により
これをけん化することにより遊離のEPA、又はその塩を
得ることができる。
かくして、本発明によれば上記のバクテリアを使用して
発酵生産することにより、精製が容易でかつ短時間で多
量にEPA含有脂質及びEPAを得ることができる。
次に本発明のEPA含有脂質の製造方法の具体的な例を実
施例に示す。
実施例1.シュードモナス・ピュートリファシエンスSCRC
−2878からのEPA含有脂質及びEPAの生産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地20lを121℃、15分間加熱殺菌した
後、シュードモナス・ピュートリファシエンスSCRC−28
78（微工研菌寄第9114号）を接種し、25℃で24時間好気
的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重
量約150g（乾燥重量で16.5g）の菌体を得た。菌体を0.8
5％の食塩水で１回洗浄した後、１に懸濁した。この
菌体懸濁液を１のクロロホルム−メタノール溶液（2:
1v/v）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホ
ルム相を得た。さらに水相及び菌体をクロロホルム600m
lで振とう抽出した後遠心分離し、クロロホルム相を得
た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質
画分は、1.16g（乾燥菌体当り7.03％）であった。この
脂質画分にはEPAが含まれる。この画分を0.3N NaOHを含
有する95％エタノール中で80℃にて１時間けん化し、EP
Aのナトリウム塩を含む生成物を得た。これを6N HClに
より中和し、遊離のEPAを含む生成物を得た。次に、ジ
アゾメタン等によりメチルエステル化した後、ガスクロ
マトグラフにて分析してその含有率を測定したところ、
0.114g（脂質画分の9.8％、乾燥菌体の0.69％）のEPAが
含まれていることがわかった。
実施例2.アルテロモナス・ピュートリファシエンスSCRC
−2871からのEPA含有脂質及びEPAの生産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地20lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、アルテロモナス・ピュートリファシエンスSCRC−28
71（微工研菌寄第9158号）を接種し、25℃で24時間好気
的に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重
量約135g（乾燥重量で15.0g）の菌体を得た。菌体を0.8
5％の食塩水で１回洗浄した後、１に懸濁した。この
菌体懸濁液を１のクロロホルム−メタノール溶液（2:
1v/v）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホ
ルム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホルム600ml
で振とう抽出したのち遠心分離し、クロロホルム相を得
た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質
画分は、1.05g（乾燥菌体当たり7.00％）であった。こ
の脂質画分にはEPAが含まれる。この画分を0.3N−NaOH
を含有する95％エタノール中で80℃にて１時間鹸化し、
EPAのナトリウム塩を含む生成物を得た。これを6N−HCl
により中和し、遊離のEPAを含む生成物を得た。次に、
この生成物の一部をジアゾメタンによりメチルエステル
化した後、ガスクロマトグラフにて分析してその含有率
を測定した所全生成物中に0.111g（脂質画分の10.6％、
乾燥菌体の0.74％）のEPAが含まれていることが分かっ
た。
前記遊離EPAを含有する生成物をシリカゲルクロマトグ
ラフィー〔溶出剤:n−ヘキサン／エチルエーテル（9:
1）〕により精製してEPAのみを含む画分を得、これを蒸
発乾燥することにより0.10gのEPAを得た。
実施例3.シーワネラ・ピュートリファシエンスSCRC−28
74からのEPA含有脂質及びEPAの生産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地20lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、シーワネラ・ピュートリファシエンスSCRC−2874
（微工研菌寄第9159号）を接種し、25℃で24時間好気的
に培養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量
約200g（乾燥重量で22.5g）の菌体を得た。菌体を0.85
％の食塩水で１回洗浄した後、１に懸濁した。この菌
体懸濁液を１のクロロホルム−メタノール溶液（2:1v
/v）で良く振とう抽出した後、遠心分離し、クロロホル
ム相を得た。更に水相及び菌体をクロロホルム600mlで
振とう抽出したのち遠心分離し、クロロホルム相を得
た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質
画分は、1.78g（乾燥菌体当り7.91％）であった。この
脂質画分にはEPAが含まれる。この画分を0.3N−NaOHを
含有する95％エタノール中で80℃にて１時間鹸化し、EP
Aのナトリウム塩を含む生成物を得た。これを6N−HClに
より中和し、遊離のEPAを含む生成物を得た。次に、こ
の生成物の一部をジアゾメタンによりメチルエステル化
した後、ガスクロマトグラフにて分析してその含有率を
測定した所全生成物中に0.241g（脂質画分の13.5％、乾
燥菌体の1.07％）のEPAが含まれていることが分かっ
た。
前記遊離EPAを含む生成物をシリカゲルカラムクロマト
グラフィー〔溶出剤:n−ヘキサン／エチルエーテル（9:
1）〕により精製してEPAのみを含む画分を得、これを蒸
発乾燥することにより0.22gのEPAを得た。
実施例4.アルテロモナス・ピュートリファシエンス・サ
ブスピーシズ・サガミファシエンスSCRC−1162からのEP
A含有脂質及びEPAの生産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地30lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、アルテロモナス・ピュートリファシエンス・サブス
ピーシズ・サガミファシエンスSCRC−1162（微工研菌寄
第9210号）を接種し、25℃で24時間好気的に培養した。
培養後、遠心分離機で菌体を採取し湿重量約205g（乾燥
重量で25.6g）の菌体を得た。菌体を0.85％の食塩水で
１回洗浄した後、1.5lに懸濁した。この菌体懸濁液を1.
5lのクロロホルム−メタノール溶液（2:1v/v）で良く振
とう抽出した後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。
更に水相及び菌体をクロロホルム900mlで振とう抽出し
たのち、遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホ
ルム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は、2.13
g（乾燥菌体当たり8.32％）であった。この画分を0.3N
−NaOHを含有する95％エタノール中で80℃にて１時間鹸
化し、これを6N−HClにより中和し、遊離のEPAを含む生
成物を得た。
次に、ジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析して、測定した所0.205g（脂
質画分の9.6％、乾燥菌体の0.80％）のEPAが含まれてい
ることが分かった。このEPAを含む遊離脂質酸混合物を
シリカゲルカラムを用い、メタノールを溶出液としてカ
ラム逆相分配クロマトグラフィーを行なうことにより精
製されたEPA0.185gを得た。
実施例5.アルテロモナス・ハネダイIAM−12641からのEP
A含有脂質及びEPAの生産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地20lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、アルテロモナス・ハネダイIAM−12641を接種し、15
℃で24時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌
体を採取し湿重量約150g（乾燥重量で14.9g）の菌体を
得た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、１に
懸濁した。この菌体懸濁液を１のクロロホルム−メタ
ノール溶液（2:1v/v）で良く振とう抽出した後、遠心分
離し、クロロホルム相を得た。更に水相及び菌体をクロ
ロホルム600mlで振とう抽出したのち遠心分離し、クロ
ロホルム相を得た。クロロホルム抽出画分を濃縮乾固し
て得られた脂質画分は、1.18g（乾燥菌体当たり7.92
％）であった。この画分を0.3N−NaOHを含有する95％エ
タノール中で80℃にて１時間鹸化し、これを6N−HClに
より中和し、遊離のEPAを含む生成物を得た。次にジア
ゾメタンによりメチルエステル化した後、ガスクロマト
グラフにて分析して、測定した所0.145g（脂質画分の1
2.3％、乾燥菌体の0.97％）のEPAが含まれていることが
分かった。このEPAを含む遊離脂質酸混合物をシリカゲ
ルカラムを用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相
分配クロマトグラフィーを行なうことにより精製された
EPA0.126gを得た。
実施例6.アルテロモナス・ルーメンサス（Alte−romona
s lumensas）SCRC−6444からのEPA含有脂質及びEPAの生
産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地10lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、アルテロモナス・ルーメンサス（Alteromonas lum
ensas）SCRC−6444（微工研菌寄第9667号）を接種し、2
5℃で24時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で
菌体を採取し湿重量約160g（乾燥重量で20.4g）の菌体
を得た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.5l
の同食塩水に懸濁した。この菌体懸濁液を0.5lのクロロ
ホルム−メタノール溶液（2:1v/v）で良く振とう抽出し
た後、遠心分離し、クロロホルム相を得た。更に水相及
び菌体をクロロホルム300mlで振とう抽出したのち、遠
心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホルム抽出画
分を濃縮乾固して得られた脂質画分は1.05g（乾燥菌体
当たり5.13％）であった。この画分を0.3N−NaOHを含有
する95％エタノール中で80℃にて１時間鹸化し、これを
6N−HClにより中和し、遊離のEPAを含む生成物を得た。
次に、ジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析して、測定した所0.198g（脂
質画分の18.9％、乾燥菌体の0.97％）のEPAが含まれて
いることが分かった。
このEPAを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラムを
用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロマ
トグラフィーを行なうことにより精製されたEPA0.177g
を得た。
実施例7.アルテロモナス・キシローサス（Alte−romona
s xylosus）SCRC−2517からのEPA含有脂質及びEPAの生
産 肉エキス1.0％、ペプトン1.0％、NaCl0.5％を含有し、p
H7.0に調整した培地10lを121℃、15分間加熱殺菌したの
ち、アルテロモナス・キシローサス（Alteromonas xyl
osus）SCRC−2517（微工研菌寄第9668号）を接種し、25
℃で24時間好気的に培養した。培養後、遠心分離機で菌
体を採取し湿重量約145g（乾燥重量で19.6g）の菌体を
得た。菌体を0.85％の食塩水で１回洗浄した後、0.5lの
同食塩水に懸濁した。この菌体懸濁液を0.5lのクロロホ
ルム−メタノール溶液（2:1v/v）で良く振とう抽出した
のち、遠心分離し、クロロホルム相を得た。クロロホル
ム抽出画分を濃縮乾固して得られた脂質画分は、1.01g
（乾燥菌体当たり5.15％）であった。この画分を0.3N−
NaOHを含有する95％エタノール中で80℃にて１時間鹸化
し、これを6N−HClにより中和し、遊離のEPAを含む生成
物を得た。
次に、ジアゾメタンによりメチルエステル化した後、ガ
スクロマトグラフにて分析して、測定した所0.173g（脂
質画分の17.1％、乾燥菌体の0.88％）のEPAが含まれて
いることが分かった。
このEPAを含む遊離脂肪酸混合物をシリカゲルカラムを
用い、メタノールを溶出液としてカラム逆相分配クロマ
トグラフィーを行なうことにより精製されたEPA0.159g
を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願昭62−79806 (32)優先日 昭62(1987)４月２日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (31)優先権主張番号 特願昭62−273200 (32)優先日 昭62(1987)10月30日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９６６７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−９６６８ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２３ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２４ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２５ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１６２６ (72)発明者 沼尾 長徳 神奈川県相模原市南台１―９―２ (72)発明者 近藤 聖 神奈川県大和市中央林間５―16―４

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】シュードモナス（Pseudomonas）属、アル
    テロモナス（Alteromonas）属又はシーワネラ（Shewane
    lla）属に属し、エイコサペンタエン酸含有脂質を生産
    することができる微生物を培養することによってエイコ
    サペンタエン酸含有脂質を生成蓄積せしめ、そしてエイ
    コサペンタエン酸含有脂質を採取することを特徴とする
    エイコサペンタエン酸含有脂質の製造方法。
  2. 【請求項２】前記シュードモナス属微生物がシュードモ
    ナス・ピュートリファシエンス（Pseudomonas putrefac
    iens）である請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】前記アルテロモナス属微生物がアルテロモ
    ナス・ピュートリファシエンス（Alteromonas putrefac
    iens）、アルテロモナス・ルーメンサス（Alteromonas
    lumensas）、又はアルテロモナス・キシローサス（Alte
    romonas xylosus）である請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記シーワネラ属微生物がシーワネラ・ピ
    ュートリファシエンス（Shewanella putrefaciens）で
    ある請求項１に記載の方法。
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JP7980687 1987-04-02
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JP62-20510 1987-10-30
JP62-273200 1987-10-30
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EP0913473A4 (en) * 1996-07-10 2000-12-06 Sagami Chem Res PROCESS FOR PRODUCING ICOSAPENTAENOIC ACID BY GENE RECOMBINATION

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