JPH0438397B2

JPH0438397B2 -

Info

Publication number: JPH0438397B2
Application number: JP58196068A
Authority: JP
Priority date: 1983-10-21
Filing date: 1983-10-21
Publication date: 1992-06-24
Also published as: JPS6087798A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は淡水産単細胞藻類を用いたエイコサペ
ンタエン酸（以後EPAという）の新規な生産方
法に関する。さらに詳しくは本発明はEPAを多量に含有す
る脂肪を産生する淡水産単細胞藻類を光合成条件
下、無機液体培地で培養し、培養の途中より窒素
欠乏状態となし、EPA含有脂肪を藻体内に多量
に蓄積させるEPAの生産方法に関する。一般に、EPAは血栓形成抑制作用があり、ま
た、コレステロール含量を低下させる作用も有す
ることはよく知られている。近年になつて、この血栓形成抑制作用とコレス
テロール低下作用を有するEPAが健康食品およ
び医薬品の素材として注目されるようになつて来
た。 EPAはイワシ，サバなどの魚油に10％程度、
また、ある種の大型海藻の脂肪に20％程度含まれ
ていることが知られているが、食品，医薬品の素
材として使うには市販の魚油より得るのが一般的
である。しかしながら、魚油中のEPAの含量は
低く、精製、濃縮などの操作を経なければ食品へ
の使用可能濃度（20〜30％）に達しないこと、ま
た不完全な精製、濃縮では魚臭が残るなどの欠点
を有している。本発明者らは、魚油以外の給源からEPAを求
めるべく鋭意研究した結果、淡水産単細胞藻類に
EPAを多量に含有する脂肪を生産する株が存在
することを知つたのである。また、更に研究の結
果、このEPA多量含有脂肪生産株は藻類培養途
中で窒素欠乏状態にすることによつてEPA多量
含有脂肪を多量蓄積できることも分つたのであ
る。本発明は、これら知見から完成されたもので、
エイコサペンタエン酸を多量に含有する脂肪を産
生する淡水産単細胞藻類を光照射と炭酸ガス通気
下、無機液体培地で培養するに際し、窒素源を添
加した培地での約６〜10日間の１次培養と実質的
に窒素源を含まない培地での約10〜15日間の２次
培養を行い、エイコサペンタエン酸高含有脂肪を
藻体内に多量に蓄積させることを特徴とするエイ
コサペンタエン酸の生産方法である。本発明に使用する藻類の株としては、光合成条
件下で培養し、細胞内にある脂肪中に30％程度は
EPAを含有し、かつ、そのEPA含有脂肪を多量
細胞内に蓄積するものが選択される。この基準に
もとずいて、湖沼，河川，水田などの水と各種の
土壌から分離した藻株と保存株を探索した結果、
モノダス属に属する単細胞藻類中に上記条件を満
足しうる藻株が存在することが確認される。本発明で使用される寄託藻株の具体例としてモ
ノダス・サブテラネウス（Monodus
subterraneus）ATCC 30593，モノダス・サブテ
ラネウスCTCC848／Ｉ（Cambridge type
Culture Collect−ion）などがあげられる。本発明において、EPA高含有脂肪の蓄積は次
の操作によつて達成される。すなわち、硝酸ナト
リウム，リン酸−カリウム，硝酸メグネシウム，
塩化カルシウム，くえん酸鉄，硼素，マンガン，
モリブデン，コバルト，銅，亜鉛を含む無機液体
培地に藻株を接種し、20〜30℃、好ましくは25℃
で、４〜10キロルツクス、好ましくは６〜７キロ
ルツクスの光照射下、炭酸ガス５％を含む空気を
通気しつつ細胞数が培地１当り4.5〜5.0×10¹¹
になるまで培養する。この場合、培養容器は扁平
形が好ましく、光源は白色光、または昼色光の蛍
光灯，白熱灯，太陽のいずれでもよい。培養日数
は６〜10日間程度である。この１次培養で、EPAを30％程度含有する脂
肪が藻細胞内に10〜20％産生されるが、この脂肪
の含量をさらに増加させるために次の２次培養に
移される。即ち、１次培養物を無菌的遠心分離に
より藻体を分別し、これを前記無機液体培地中の
硝酸ナトリウムを除いた培地にて洗浄、洗浄藻体
を同培地に再懸濁して遠心分離直前の細胞数とな
し、遠心分離前の培養条件にて藻体の窒素含量が
藻体乾物に対して２％程度に減少するまで培養す
る。この培養に要する日数は約10〜15日間程度で
あり、この２次培養によつて、前記EPA含有脂
肪が藻細胞内で含有率30％以上にも高められるこ
とになる。上述したのは１次培養、２次培養と培養を２段
階に分けて行う方法であるが、特に２段階に培養
を分けて行なわずに、藻細胞数が4.5〜5.0×
10¹¹／に達すると硝酸ナトリウムが消費しつく
されるように該塩類を減量した上記無機液体培地
にて本藻株を連続培養することによつてもEPA
高含有脂肪の蓄積を行なわせることができる。連
続培養の場合の培養日数は前培養が６〜10日間、
後培養が10〜15日間で、計16〜25日間程度の培養
となる。培養藻体は遠心分離して採取し、十分水洗し、
乾燥される。乾燥は凍結乾燥，風乾等によつて行
なわれる。乾燥された藻体は、そのまま栄養料として服用
に供してもよく、また、食品の加工原料として使
用され、更には、抽出原料として使用される。乾燥藻体は窒素気流下で有機溶媒によつて抽出
処理される。有機溶媒としてはメタノール，エタ
ノール，石油エーテル等があるが、メタノールと
石油エーテルの交互抽出によつて良好に抽出され
る。抽出物は減圧下に有機溶媒を留去すれば、約30
％のEPAを含有した脂肪が得られる。得られた脂肪は魚臭などの不快臭はなく、しか
も約30％のEPAを含有しているので、濃縮等の
操作を要することなく、そのまま健康食品に使用
することができるものである。また、乾燥藻体をそのまま服用したり、食品の
加工原料として使用する場合は、細胞自体が
EPAを保護し、酸素に対してかなり安定である
というすぐれた効果を有するものである。次に本発明の実施例を示す。実施例１硝酸ナトリウム2.1ｇ／，りん酸ーカリウム
0.2ｇ／，硫酸マグネシウム0.2ｇ／，塩化カ
ルシウム0.09ｇ／，くえん酸鉄0.005ｇ／，
硼素0.2mg／，マンガン0.2mg／，モリブデン
0.2mg／，コバルト0.02mg／，銅0.02mg／，
亜鉛0.02mg／を含む無機液体培地（PH6.0〜6.2）
２を調製し、巾20cm、高さ45cm、厚さ３cmのガ
ラス製扁平フラスコに入れて121℃、15分の加熱
滅菌をした。この培地にモノダス・サブテラネウス
ATCC30593を1.1×10¹¹／の割合で接種、フラ
スコ表面で6.5キロルツクスを示すように白色蛍
光灯を照射し、25℃で炭酸ガス５％を含む空気を
毎分２通気しつつ８日間培養して5.2×10¹¹／
の細胞数（トーマの血球盤で測定）を含むモノ
ダス培養物を得た。得られた培養物を滅菌遠心管にとり、
5000rpm、30分の遠心分離により藻体を分別し、
上記培地の硝酸ナトリウムを除いた培地に懸濁、
5000rpm、30分の遠心分離により、再び藻体を分
別（前記洗浄操作）、藻体を同培地1.8に再懸濁
して5.2×10¹¹／の細胞数が得られるようにし、
遠心前の培養条件にて培養、藻体乾物中の総窒素
量がミクロケルダール法で2.2％を示す２次培養
日数12日間で培養を終了した。この培養物を10000rpm、30分の遠心分離にか
けて藻体を分別し、これを蒸溜水に懸濁、遠心操
作（10000rpm、30分）による洗浄を２回繰返し
た後、洗浄藻体を凍結乾燥し、乾燥物4.7ｇを得
た。得られた乾燥藻体4.7ｇを窒素気流下、メタノ
ールと石油エーテルの交互抽出によつて魚臭のな
い粗脂肪1.7ｇを得た。これは藻体乾物に対して
36.2％の蓄積量であつた。次に、この粗脂肪をメ
チル化したのちガスクロマトグラフイーによつて
脂肪酸組成を解析した結果、第１表のように
EPAが30.6％と目標値に達した脂肪酸組成を得
た。これらの値より、EPAの蓄積量を求めると
乾燥藻体中11.1％とマイワシのそれの約３倍の値
を得た。

【表】

【表】実施例２実施例１の培地にモノダス・サブテラネウス
CTCC848／Ｉを1.2×10¹¹／接種、同実施例と
同じ条件にて培養し、培養開始後８日目に4.8×
10¹¹／の培養物を得た。これを前例と同様な処
理を施してさらに培養、二次培養開始後13日目に
藻体の窒素含有量が2.3％になつたことから、藻
体を採取、水洗後凍結乾燥して粗脂肪を抽出、そ
の量と脂肪酸組成を検討した。その結果、乾燥藻体4.3ｇより粗脂肪1.4ｇが得
られて32.6％の蓄積量を示し、また、脂肪中の
EPAの含量は31.2％で、EPAの蓄積量は10.2％で
あつた。実施例３藻細胞数が5.0×10¹¹／に達すると硝酸ナト
リウムが消費しつくされるように該塩類を0.9
ｇ／に減量した前記無機液体培地２を調製し
て滅菌、これにモノダス・サブテラネウス
ATCC30593を1.4×10¹¹／に接種して実施例１
と同一培養条件にて培養，培養開始後10日目に
4.9×10¹¹／の培養物が得られた。以後、その
まゝ培養を続行し、培養開始後23日目に乾燥藻体
の窒素含量が2.3％を示したことから藻体を採取、
水洗後凍結乾燥して粗脂肪を抽出、その量と脂肪
酸組成を検討した。その結果、乾燥藻体4.4ｇより粗脂肪1.5ｇが得
られて34.1％の蓄積量を示し、また、脂肪中の
EPAの含量は30.2％、EPAの蓄積量は10.3％であ
つた。

Claims

【特許請求の範囲】１エイコサペンタエン酸を多量に含有する脂肪
を産生する淡水産単細胞藻類を光照射と炭酸ガス
通気下、無機液体培地で培養するに際し、窒素源
を添加した培地での約６〜10日間の１次培養と実
質的に窒素源を含まない培地での約10〜15日間の
２次培養を行い、エイコサペンタエン酸高含有脂
肪を藻体内に多量に蓄積させることを特徴とする
エイコサペンタエン酸の生産方法。２淡水産単細胞藻類がモノダス属に属する藻類
である特許請求の範囲第１項記載のエイコサペン
タエン酸の生産方法。