JPS6131092A - エイコサペンタエン酸の酵素的生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明はエイコサペンタエン酸（以下ｒＥＰＡ」と略称
する）の酵素的生産方法、さらに詳述すれば、藻類中の
多不飽和脂肪酸合成酵素によるＥＰＡ前駆体からのＥＰ
Ａの特異的合成活性を利用して、ドコセン酸及びドコサ
ヘキサエン酸夾雑Ｈ，Ｈの少ない高純度のＥＰＡ含有油
脂を酵素的に生Ｊ♀する方法に関する。

（従来技術） ＥＰＡに代表される多不飽和脂肪酸は、生体膜の構成成
分として重要な役割を担っている。また、胆汁酸の分泌
を促進し、中性脂肪の合成を抑制し、血漿コレステロー
ルの低下作用を有する。

さらに５プロスタグランジン−族の生成に際し基質とな
り、ヒトを含む高等哺乳動物の体内で必須的な機能を発
揮する。特にＥＰＡはタイプ３のプロスタグランジンの
生成の際の基質として重要であって、ドコサヘキサエン
酸（以下ｒＤＨＡＪ　と略称する）と共に血小板の凝集
抑制作用があり、血栓症の治療及び予防剤としての応用
が検討されている。ざらにＥＰＡは、血漿コレステロー
ルレベルの低下に寄与する多不飽和脂肪酸の中でも特に
その活性が高く、通常の植物油中に含まれるリノール酸
なとよりも遥に有効である。

このように、ＥＰＡがその血栓防止作用に基づく健康食
品あるいは医薬品としての可能性がデンマークのダイヤ
−ベルブ（Ａ＋ｓ、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｎｕｔｒ、２８　、
９５８真、１９７５年）の疫学的調査により明らかにさ
れて以来、わが国においてもＥＰＡを多く含有するイワ
シ、サバ、サンマ及びイカナゴ等の魚の摂食が推奨され
るようになってきた。

今１）、健康食品として市販されているＥＰＡは１看取
法によって得られた魚油の分別物であって、そのＥＰＡ
含量は１０〜３０％であり、同時に含まれるＤＨＡのそ
れと合計しても４０％を越えるものは少ない１０者数取
法よって抽出されるイｆＩ油は構成脂肪酸として多種類
の脂肪酸を含む混合グリセリドであって、抽出時の熱及
び水との接触雰によりＥ　ＰＡ　、ＤＨＡ等の多不飽和
脂肪酸の変質の恐れや、抽出中に若干量残存する水分に
よる酸化（過酸化）等の不安がある。さらに、これら魚
油ＥＰＡの分別に使用されたアセトン、メチルエチルケ
ト〉′など各種の有機溶剤は通常減圧下に除去されるが
、その完全除去は技術的及びコスト的に問題点が多い。

１））中性脂肪（主としてトリグリセリド）のまま分別
、濃縮してもＥＰＡの含量を３０〜４０％以上に高める
のは理論的に困難であろうと推定される。

医薬品としてのＥＰＡは、様々な方法によって抽出され
た魚油を酵素的に若しくはアルカリ条件トで処理してｌ
ｉ離脂肪酸まで加水分解するか又は、ｔＡ　Ｍ　Ｉ１）
酸をメチル若しくはエチルエステルに変じた後、これら
を低温分別結晶法、尿素付加法、減ハノｈ留法又は逆相
クロマト法等によりさらに精製してＥＰＡ１度を９０％
以上としたものが多い。

しかし、これらの方法を用いて得られたＥＰＡ濃縮物は
、工程中に（アセトンなどの）各種の有機＃奴が使用さ
れたり又は２００℃近い高熱を加えられたりするため、
有機溶媒の残留やＥＰＡの重合、異性化及び／又は酸化
等による変質の懸念をはらんでいる。さらに、魚油等を
ＥＰＡの原料として用いた場合、心臓疾患の原因の一つ
として疑われているドコセン酸（慣用名、エルシンｍ＞
の除去が困難であるため、健康食品、医薬品等に利用す
る１−で問題点を含む。加えて、魚油中に多く含まれて
いるＤＭＡとＥＰＡの相互分離も困難であって、最終商
品中にすらＤＭＡが相当微混在しているのが実情である
。因にＤＨＡの生理学」〕の意、義は、ＥＰＡに類似し
ていると考えられてはいるものの、ＥＰＡそのものを目
的とした商品中に他種類の脂肪酸が多量に混在している
ことは必ずしも望ましいことではない。

（本発明の解決せんとする問題点） 以１−述へてきたように、健康食品又は医薬品とＩ、て
考えられているＥＰＡには幾つかの問題点があることか
ら、本発明者らは残留溶媒や変質の心配のない安全なＥ
ＰＡを高濃度に得る方法を鋭意研究した結果、藻類中に
多く含まれているＥＰＡ合成酵素を利用して、ドコセン
酸、ＤＨＡ等を殆と含まない高純度ＥＰＡを酵素的に生
産するのに成功した。

（問題点を解決するための手段） 本発明は１以上述べた通り、藻類中に多く含まれている
ＥＰＡ合成酵素を利用して酵素反応的に高純＋ａのＥＰ
Ａを生産することを骨子とするものである。ここにｒＥ
ＰＡ合成酵素」とは、後に説ｊｌｌｌ−Ｊるように、各
種のＥＰＡ前駆体を相互変換して最終的にＥＰＡの合成
に至るまでに関与する一切の酵素の集合体を意味する。

一般に、植物による脂肪酸合成酵素活性は動物のｌ／１
００以ドと１、われているが、本発明者の知見によれば
、１外なことに、藻類におけるＥＰＡ合成酵素活性は講
しく高く、充分実用可能であることが判明した。

ところで、藻類中に含まれる脂質含量は、通常乾物巾約
０２〜３０％と少ないが、スサビノリ迂社蛙Ｌａ阻ｚｏ
ｅｎ旦グ、ナラワスサビノリ（ＬＬ組■■朋ム」、アサ
クサノリ卯、シＪ見■ａ等の紅藻類中には、その全脂肪
酸の実に４０〜６０％ものＥＰＡが含まれている。緑藻
類のアオノリ（Ｅｎｔｅ〜ユ柱旦ハ１ｎｔｅｓｔｉｎａ
ｌｉｓや７オサＵ±ｖａ　　Ｌａｃｔｕｃａ）、褐藻類
のコンブ７５ａｃｃｈａ−ｒ　ｉｎａ　）、アイヌワカ
メＵＤ上ｉａ　　ｅｓｃｕ！ｅｎｔａ）　、　　ヒバマ
タ（Ｆｕｃｕｓ祉工１）ｉｓ）及びエソイシゲ仕杉μ佳
」幻すＡ±ｉｃｕ↓１０つ等にも、全脂肪酸中、季節的
及び地域的変化を考慮に入れても、５〜３０％ものＥＰ
Ａか含まれており、いずれもドコセン酸、ＤＮＡ等を殆
ど含んでいない、また、微小藻類、例えはクロレラ５　
　ｍ１ｎｕｔｉｓｓｉ＠ａ　、　Ｃ，阻ｊトｒｉｓ　、
　Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ　ｃｏｃｃｏｉｄｅｓ　Ｎ
ａｕｍａｎ　、カゲヒゲムシ坦■口」」と　辻…　阻旺
利旦り及びユーグレナΩ−Ｌ肌１）ｉｓ）などでは、Ｅ
ＰＡ含品−は全脂肪酸巾約５〜４０％に達する。

従って、ＥＰＡを高純度に含有する藻類から脂質を１ｔ
１接抽出しても、魚油由来のＥＰＡ製品と同塚かそれ以
上の商品価値を有するものが得られる包であるか、元来
天然の藻類中に含まれる脂質含Ｈ，＋そのものが先述の
通り少量であるから、抽出設備、ランニングコスト及び
藻類自体の価格等の要因を１５すれば、ＥＰＡの生産を
目的として藻類中の脂質を抽出することはあまり得策と
は言えない。

とまれ、前述のように、通常の高等植物及び微ノ１物等
にはＥＰＡは全く含まれていないが、単細胞及び多細胞
藻類中には、特異的に多量のＥＰＡを含むものがある。

上述の藻類はいずれも強力な多不飽和脂肪酸合成酵素、
特にＥＰＡ合成合成酵素力するので、本発明に用いる酵
素源として使用できるが、ＥＰＡ合成酵素活性はＥＰＡ
含量の多い藻類程強くなる傾向が認められた。

／ｌｋ近になって脂肪酸の初生合成の機構がよく研究さ
れ、脂肪酸の鎖長延長、不飽和化等の機作についてもか
なり明らかにされてきた。高等植物における脂肪酸合成
は一般にアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、アシル運搬
タンパク質（ＡＣＰ）の関Ｊｊする飽和脂肪酸の合成酵
素及びメチル基側への不飽和化酵素（植物型）によって
行なわれ、主としてオレイン酸からリノール酸及びリノ
レン酸へと変換する。しかし、藻類においては、さらに
リノレン酸からＥＰＡへの変換経路（動物型）が存在す
ると考えられる。

本発明者らはスサビノリを用いて試験管内及び生体内条
件下におけるＥＰＡ合成を研究し、いずれも市販品とし
て入手できる℃ラベルの酢酸、酩酊、ミリスチン酸、パ
ルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレ
イン酸、リノール酸及びリノレン酸中の放射能がＥＰＡ
中に有意的に取り込まれることを確認したが、最も効率
良くＥＰＡ中に取り込まれる基質はリノレン酸であった
。即ち下図に示されるように、ＥＰＡの直接の前駆体は
リノレン酸由来のエイコサテトラエン酸であるので、リ
ノレン酸はＥＰＡ合成のため試験に供した基質中では最
も効率の良い基質といえるが、リノレン酸の前駆体でも
ある酢酸、醋酸、ミリスチン酸、バルミチン酸、パルミ
トオレイン市、ステアリン酸、オレイン酸及びリノール
酸なども最終的に種々の生化学的変換過程を経てリルシ
酸を介してＥＰＡ中に取り込まれる。

ω−３，８，８−オクタデカトリエンｍ（リノレン酸、
ｃ１８：３（、＋３　）（１）−３，６，９，１２−エ
イフサテトラエン酸（Ｃ２０：４ｔ、ｙ３　）従って、
使用する基質はり／レン酸そのものでもよいし、リノレ
ン酸を多く含有する油脂原料。

例えば亜麻仁油などから調製した脂肪酸でもよい、さら
に、本発明における藻類によるＥＰＡ合成のための基質
としては、ＥＰＡ合成の際の中間体となり得るすべての
基質が使用できるので、すルン酸以外に、酢酸、醋酸、
カプロン酸、カプリン酎、ラウリン酸、ミリスチン酸、
パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オ
し・イン酸、リノール酸、オクタデカテトラエン酸、エ
イコサトリエン酸及びエイコサテトラエン酸等の炭素数
２〜２０の範囲の脂肪酸をそのままの形で又はそれらを
含む油脂類の形で基質として使用できる。

これらの基質となる脂肪酸や油脂類は、反応系中にその
まま加えて激しく撹拌しエマルジョンとして用いること
もできるが、望ましくは当該脂肪酸をナトリウム塩又は
カリウム塩などの水溶性の塩として用いた方が取り扱い
易い。

基質添加量は、全亜麻仁油脂肪酸ナトリウムの場合、酵
素タンパク質ｌｆｉ１ｇ当りｏ、ｏｏｉ〜１００ｍｇの
範囲で、さらに望ましくは０１〜ｌｏｉ＋ｇの範囲が適
当である。

本発明ではこれら藻類よりのＥＰＡ合成酵素系の調製は
、例えば以下のようにして行なう。なお原料である藻類
は、新鮮な藻類に限られるものではなく、゛ト年以ｈ−
４０　’Ｃに冷凍保存したもの又はフリーストライ処理
したものも使用できる。

１（１ｊも、原料藻類に対し乾物重量の３０倍量の濾過
７１）８水又は０．０５　Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，５
）を加え、水冷Ｆにおいて組織破砕機によりホモシネ−
１を竹る。一般に、藻類の細胞組織は非常に強靭なセル
ローズ校で包まれているため、通常の方法、例えば、ボ
ッター拳エルウ′エージエム型ホモジナイザーなどの使
用によっては未破砕の細胞組織層ノ４が多く残り、ホモ
ジネートの調製が難しいので、ヒスコトロン（商品名「
目本精密工業株式会ン１」製）のような強力な組織破砕
機の使用が好ましい。また別の方法として、原料藻類を
細胞膜溶解酵素２例えばセルラーゼ処理によって細胞膜
を軟弱にした後、前述のヒスコトロンその他の組織破壊
装置によって機械的に細胞を破砕しホモジネートを調製
することもできる。

以１−の如く細胞を破壊して得られた組織片を含むホモ
ジネートは、そのまま酵素溶液とすることかできる。し
かしながら、ＥＰＡ合成酵素掖の液製には必すしもホモ
ジナイズする必要はないのであって、例えば大型藻類の
場合には、ハサミ、カミソリ等を用いて試料組織を適当
な大きさ、例えば２ｍｍ角（４ｍｍ）程度の大きさに切
断し、得られた組織片をそのまま反応溶液中に加えて使
用できる。さらに理想的には、濃縮されたＥＰＡ合成酵
素を公知の方法によって固定化し、これに基質溶液を潅
流させることにより、連続的にＥＰＡを生産にすること
もできる。

以りの方法において、例えばリノレン酸を基質とした場
合、反応液中に酵素溶液としての海藻ホモジネート及び
基質以外に酢酸を加えても良い。

即ち、リノレン酸からＥＰＡへの酵素的変換は、般に２
回の脱水素反応と２炭素原子の添加によって完了する。

一方、アセチルＣｏＡに変換され得る化合物ならどのよ
なものでも脂肪酸の鎖長延長のための炭素源となり得る
ことから、ω−３゜６．９．１２−オクタデカテトラエ
ン酸からω−３，６，９，１２−エイコサテトラエン酸
への２炭素延艮又はω−３，６，９−リノレン酸からω
−３，６，９−エイコサトリエン酸への鎖長延長のため
の炭素源としては酢酸が有効である。この場合、酢酸の
添加量は、基質として用いたリノレン醇に対して０．０
５〜３００重量％、望ましくはｌＯ〜５０重道％が適当
である。酢酸はそのまま又は＋ｆＪ溶性の塩の形で反応
溶液中に添加される。

反応溶液のＰＨは、アルカリの添加によって３〜ｌＯ５
さらに望ましくは５〜９に調整２義る。アルカリとして
は、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、水酸化ナト
リウム又は水酸化カリウム等のアルカリ金属の塩又は水
酸化物が適当であるが、４ＩＩに炭酸水素ナトリウムの
採用が好ましく、このものは巾なるＰＨの調節に留まら
ず、ＥＰＡ合成を効・（へ化する効果を有する。

本発明において、至ｉ１！ＥＰＡ合成反応温度は２〜４
０°Ｃの広範囲に跨がっているが、合成されたＥＰＡ自
身の酸化防止、酵素タンパク質の変質等の危険を避ける
ため、５〜２５°Ｃの範囲で反応を行なわせるのが望ま
しい。

本発明によるＥＰＡ合成反応は、反応開始から５　Ｂ間
以」−もの間進行する。しかし、合成されたＥＰＡ自体
の変敗及び酵素蛋白質の分解を防ぐため、なるへ〈ｌ〜
２日間以内の反応時間が好ましい。

反応の停止と脂質の抽出は、例えば以下のようにする。

即ち、反応溶液量の３倍量のクロロホルム−メタノール
混液（２：　１）を加えて５分間激しく撹拌し、ヒスコ
トロンで水冷下にこの混液を充分に混合破砕した後、吸
引濾過する。癌液を分液ロートに移し一夜放置すると、
下層に総脂質を含んだクロロホルム層が形成される。こ
のクロロホルム層を分取し、無水硫酸ナトリウム又は無
水硫酸マグネシウムにて脱水し、エバポレーターにより
クロロホルムを減圧下に除去すると、残留物としてＥＰ
Ａを含む全脂質が得られる。

次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが
、例示は勿論説明用のものであって、発明思想の限定を
意図するものではない。

［実施例１］ ■１Ｊ スサビノリ（ＬＬ憇且胆グを試料として、藻類の凍結乾
燥品闇、凍結品Ｂ及び新鮮品口の各ホモジネート間にお
けるリノレン酸からのＥＰＡ合成活性を比較した。

醪亙跋亘豆１） 瀬戸内海沿岸で採集されたスサビノリ１００ｇ（湿重量
）を５倍量の冷癌過海水で３回繰り返し洗浄した後、−
４０℃にて凍結乾燥し、乾燥試＄４９．８　ｇを得た。

これを直ちに一４０℃の冷凍沖中に使用時まで保存した
。

使用直前に試料を冷凍庫より取り出して室温（１５℃）
に戻した後、これに３００１の冷源ｌ１ｉＳＷ＋ｊ水を
加え、１時間水冷下に放置した後、ヒスコトロン（前掲
）で水冷下に昇温を避けながら５〜１０分ホモジナイズ
し、スサビノリホモジネートを得た。このホモジネート
の一部（１０１）を１５ｍ１にメスアップ後、ブランク
として直ちに脂質抽出に供したが、残りはさらに続く酵
素反応のために水冷下で保存した。このホモジネートの
蛋白質含量（フェノール試薬法）は１２．０　ｍｇ／ｍ
ｌ　であった。

−力、これに先立ち６ケ月前に採集し、５倍１ｔの濾過
海水で３回洗浄後、−４０°Ｃにて凍結保存しておいた
同種のスサビノリ１００ｇ　（湿重量）を−晩冷蔵庫中
（４°Ｃ）に放置後、室温（１５°Ｃ）下に放置して徐
々に解凍した後、再ひ５倍量の冷濾過海水で３回洗い、
これに１５０１の冷趨過海水を加え、先述の方法と同様
にヒスコトロンにて破砕しホモジネートとした。

このホモジネートに、必要に応じて濾過海水を加えて稀
釈し、ホモジネート中の蛋白質含量を１２、０　ｍｇ／
ｍｌ　とし、酵素溶液とした。

別に、スサビノリ１００ｇ（湿重量）を、採集後直ちに
５倍量の冷癌過海水で３回洗った後、１５０１の冷癌過
海水を加え、凍結品ホモジネート調整の場合と同様に処
理し、新鮮なスサビノリホモジネートを酵素溶液（蛋白
質含量１２、０　ｍｇ／ａｔ）として得た。

匹工Ｊと鳳ｌ リノレン酸源として亜麻仁油（半井化学薬品株式会社製
）より得た脂肪酸を用いた。

すＩ）麻仁油３０ｇに１０％水酸化ナトリウム（エタノ
ール中）を３００１加え、沸騰水浴」−で３時間還流し
た後、水を１００ｍ１加え１分液漏１に移し、１００＋
Ｉの石油エーテル（沸点４０〜６０℃）で３回抽出して
不鹸化物を除いた。残液を６Ｎ塩酸にてＰＨ１〜２とし
、遊離して来た脂肪酸を１００ｍ１石油エーテルで３回
抽出した。この石油エーテル抽出液を併わせて少Ｈ，Ｈ
の水で数回洗い、石油エーテル層を無水硫酸ナトリウム
で脱水後、石油エーテルをロータリーエバポレーターに
て減圧下に除き、得られた脂肪酸を秤量したところ、２
６５ｇであった。なお、脂肪酸の純度は薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）にて検定したところ９９．９％以Ｉ
−で、トリグリセリド及びリン脂質等は完全に除かれて
いた。この脂肪酸組成を下表−１に７」へす（脂肪酸の
ガスクロマトグラフィーによる分析条件は後述の通りで
ある。）。

表−１基質亜麻仁油脂肪酸の脂肪酸組成バルミチン酸（
＋１３：Ｏ）　　　　　　　　６．１％ステアリン酸（
１Ｂ：０）　　　　　　　　　２．８オレイン酸（１８
：Ｉ）　　　　　　　　　１５．１リノール酸（１８：
２）　　　　　　　　　ｉｓ、。

リノレン＃　（１８：　３　）　　　　　　　　５４．
Ｉａエイコサペンタエン酸（２０：５）　　　　　０．
０その他　　　　　　　　　　　　　　６４３合　　計
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１００．０
駕以上の如くして得た全脂肪酸２．８５ｇに対し、０．
５７％水酸化カリウム溶液１００１を加え、４０℃で１
時間撹拌すると透明な溶液となり、脂肪酸が完全にカリ
ウム塩となったことが確認されたので、この溶液を基質
溶液とした。

醗ｌ返Ｓ スサビノリの凍結乾燥処理、凍結保存品Ｂ及び新鮮品Ｉ
ＣＩの夫々より調製した３種類の酵素溶液を用いて下記
の反応溶液を作った。

反応溶液の組成（ＰＨ７，５） ＾グ素溶液（Ａ　、　Ｂ又はＣ）　　　　　１０ｍ１基
質溶液　　　　　　　　　　　　　１０７１酎１’ｉ！
　　　　　　　　　　　　　　　０．１）１２０％炭酸
水素ナトリウム溶液　　　適当量吐過海水　　　　　　
　　　　　　　　／／合工１（容量）　　　　　　　　
　　　１５．０ｍ１反応溶液の水素イオン濃度を２０％
炭酸水素す）・リウム溶液を用いてｐ１７．５に調整し
た。

賭過海水は反応溶液の合計が１５．０＋ｉｌになるよう
に加えた。

インキュベーション前に各反応溶液より５１ずつ抜き取
ってブランクきし、直ちに脂質抽出に供した。残り１ｏ
ａｆを滅菌法の５０１用共栓イ・１三角フラスコ中に移
し、１５℃にて２４時間＆（気菌にインキュベートした
。

Ａｅ　ｒ後、クロロホルム−メタノール（２・１）＃ｊ
液３０ｍ１を加えて反応を停止させ、以下の通り脂質を
抽出した。

１゛ クロロホルム−メタノール（２・１）Ｒ液の添加によっ
て反応を停止１された各溶液を、ヒスコトロンにて水冷
下に激しく混合、破砕後、吸引濾過した。残液に再びク
ロロホルム−メタ／−ル（２：　ｌ）混液３０１）を加
えヒスコトロンにて混合、破砕を繰り返し、同様に吸引
濾過する操作を５回繰り返して反応溶液中の脂質を抽出
した後、濾液を併せて分液漏斗に移した。

この際、分液漏斗中のクロロホルム−メタノール−水の
比を２：１：０．９（容量比）にした。

−晩放置後、下層（クロロホルム層）を分取し、無水硫
酸ナトリウムで脱水後、ロータリーエバポレーターにて
溶媒を除き、総脂質として秤量した。

各脂質の一部にメタノールを加え、ナトリウムメチラー
トの存在下で加熱還流し、メチルエステルとし、その脂
肪酸組成を常法によりガスクロマトグラフ（Ｇ　Ｃ）を
用いて分析した０分析条件は以下の通りであった。

［分析条件］ カラム充填剤：２０％Ｄ　Ｅ　Ｇ　Ｓ　／８０−１００
メツシユ（西Ｊ−Ｃ丁業株式会ン１製） キャリヤーカス：逃 検出器：ＦＩＤ カラム：長さ２ｍ、内径３■ カラム温度＋１９０℃ 検出器温度＝２４０℃ 柱入温度＝２４０℃ 級１ 空試験（ブランク）として、先述のスサビノリの凍結乾
燥品ホモジネート（基質無添加）中の脂質を分析したと
ころ、総脂肪酸含量０．３６ｍｇ１■１．ＥＰＡ含量は
脂質中５０．０％であった。１表−２に各試験区の反応
前後における総１））Ｔ質量及びＥＰＡ含量（％）を示
す、この結果から、添加した基質の約４０％がＥＰＡに
変換されていることが分る。また、凍結乾燥処理又は凍
結保存したスサビノリのホモジネートにおけるＥＰＡ合
成活性が新鮮なものと比較して変わらないことから、ス
サビノリ中におけるリノレンからのＥＰＡ合成酵素系が
これらの保存処理に対して比較的安定であることを示し
ている。なお、ドコセン酸及びＤＨＡは本条件下では検
出されなかった。

試験区　　　反応溶液中の　　総脂肪酸中の総脂質含量
　　　ＥＰＡ含量 （ｍｇ／＋ｉｌ　）　　　　　　（％）凍結乾燥品聞 中反応前　　　　１．８９７．９ （２１反応後　　　　１．７７　　　　　４１．５凍結
保存品１ ）３）反応前　　　　１．９３　　　　　６．７・４）
反応後　　　　１．９０　　　　　３８．３（続く） 新　　鮮　　品１ｃＩ ・５）反応前　　　　１．８８　　　　　　５．６イ６
）反応後　　　　１．８８　　　　　４２．９［実施例
２］ リノレン酸を含む亜麻仁油からの藻類にょるＥＰＡ合成
に与える酢酸の影響を調べた。

実施例１に示されたものと同様に処理して得たスサｔ”
　／　ＩＪ　（Ｐ、　ｅｚｏｅｎｓｉｓ凍結品のホモジ
ネート（蛋白質含量１２ｍｇ／■１）を用い以下の通り
反応溶液を調装した。

）、（ｆｊ溶液は実施例工に示したものと同一品を用い
た。

反応溶液１５１中より５１をブランクとして除き、残り
ｌｏｇ＋ｌを滅菌済みの５０＋ｍｌ共栓付三角フラスコ
中に移し、１５℃で２４時間インキュベートした後、実
施例１に準拠して反応を停止させ、総脂質を抽出し、抽
出物をメチル化後、ガスクロマトグラフィーにてＥＰＡ
含量を求めた。

反応溶液の組成（ｐＨ７，５） 酵素溶液（ホモジネート）　１０．０＋ｉｌ　　ｌ　Ｏ
，Ｏｉ＋１基質溶液　　　　　　　　１．０ｍｌ　　　
１．０ｍｌ酎酸耐　　　　　　　０１）　− ２０％炭酸水素　　　　　適当量　　適当量ナトリウム
溶液 濾過海水　　　　　　　　　１）　　　　１）合計容量
　　　　　　　１５．０＋１　１５．Ｏｍｌ結果は下表
−３に示される通りである。即ち、酢酸の添加により、
反応終了後の総脂質中に占めるＥＰＡ含最の比が３８．
５％から４３．４％に上昇すると共に、ＥＰＡ自体の絶
対生産量も約２７％１、昇することが分った。なお、ド
コセン酸、ＤＨＡ等はいずれの試験区においても検出さ
れなかった。

（以下余白） 表−３スサビノリホモジネートによるＥＰＡ合試験区　
　　反応溶液中の　　総脂肪酸中の総脂質含量　　　Ｅ
ＰＡ含量 （ｍｇ／＋ｌ　）　　　　　　（％） Ａ・酢酸添加区　　　！、９０　　　　　４３．４Ｂ：
Ｓ酸無添加区　　１．７１　　　　　　３８．５［実施
例３） 酵素源として、スサビノリ（Ｌ　阻規弘旦」、アサクサ
ノリ（Ｐ、　ｔｅｎｅｒａ　）等の紅藻類の他に、コン
ブ（Ｌ、　　５ａｃｃｈａｒｉｎａ）　、アイヌワカメ
（虹旺組圏１（転）等の褐藻類及びアオノリ（Ｅ、　１
ｎｔｅ−ｓｔｉｎａｌｉｓ）　、アオサ（１，７等の緑
藻類並ひに微小藻類としてクロレラ（Ｃ，ｍｉｎｕｔｉ
ｓｓｉｍａ）カケヒゲムシ（旺圧（１）ツＶ吐１）ＥＨ
ＲＥＮＢＥＲＧ）及びユーグレナ（７Ｌ赳旦］）を用い
て。

リノレン酸よりのＥＰＡ合成率を比較した。それぞれの
藻類は、入手後直ちに５倍量の濾過海水にて３回洗った
後、使用直前まで一４０″Ｃに保存した。

実施例１と同様にしてそれぞれの藻類のホモジネートを
調製し、酵素溶液とした。なお、これらの各酵素溶液は
、濾過海水を用いてそれらの蛋白質含量を１２．０　ｍ
ｇ／＋ａｌに統一した。

基質溶液は実施例１に示したのと同様の方法で調製した
。

酵素溶液と基質溶液との合計容量１５．０＋＋＋ｌのう
ち、５．０ｍｌをブランクとしてサンプリングし、直ち
に脂質の抽出に供した。残りの１０．０ｍｌを５０１川
共栓付三角フラスコに移し、１５℃にて２４時間インキ
ュベートした。終了後、クロロホルム−メタノール（２
：　ｌ）混液３０＋ｌを加えて反応を停止させ、以後、
実施例１と同様にして各反応溶液中のＥＰＡ合成率の差
を比較した。

（以下余白） 反応溶液の組成（ＰＨ７，５） 酵素溶液　　　　　　　　　　　　　ｌＯ随１（ホモジ
ネート） ツム質溶液　　　　　　　　　　　　　　２．０ｓｉｌ
酎酸　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍ１２０
％炭酸水素　　　　　　　　　　　適当量ナトリウム溶
液 金工１容量　　　　　　　　　　　　１５．０ｍｌ別に
、ブランクとしてそれぞれの酵素標本ホモ・２ネート（
基質無添加）１０ｍｌを分取しておき。

これを１５ｍ１にメスアップした後、前例と同様に１７
て層脂肪酸を抽出し、ＥＰＡ含量をＧＣにて求め、この
値を内因性のＥＰＡ含量とした。

結果（下表−４）から明らかな如＜、ＥＰＡ含Ｉ１）の
多い海藻類程、リノール酸からＥＰＡへの転換−４１の
高いこと、即ち、紅藻類〉褐藻類〉緑藻類の順であるこ
とか分る。しかし、ＥＰＡ合成率の低い緑藻類のアオノ
リ、７オサなとも確実にＥＰＡ合成酵素を含んでいるか
ら、本発明における酵素源として役立つ。更に、別途実
験の結果から、単細胞藻類のクロレラにも高率のＥＰＡ
合成活性か認められ、本発明における酵素源として利用
可能であることが確認された。

なお、ドコセン酸及びＤＨＡは、どの実験区にも殆ど含
まれていなかった。

試料り　　　　　反応溶液中の　　総脂肪酸中（乾物中
の脂　　　総脂質含量　　　ＥＰＡ含量賀含量１％）　
　　　　（ｍｇ／ｍｌ）　　　　　　（％）紅藻類 スサビノリ＋ａ）　　　　　０．３４　　　　　４８．
０（２，５）　　＋ｂ）ａ、ｅｏ　　　　　　２．８喝
Ｃ）４．１０３９．０ （続く） アサクサノリ（り０．２７　　　　　４１．７（１，８
）　　　、艷　　　３．４０　　　　　　３．８＋＋：
＞　　　　３．６９　　　　　３７．９ン１ｆ）１　類 コンブ　（ｉｉ＋　　　　　　０．３７　　　　２５．
３（１，１）　（ｂ）３，８０　　　　　　１．８喚　
　　　　３．７０　　　　　２３．６アイヌワカメ（相
　　　０．１３　　　　　２］、＋（０４）　　・ゆ　
　　３．４０　　　　　０．９ｑｃ）３．４０　　　　
　１４．８ 緑Ｐｉ類 アオノリ（φ　　　　　０．２０　　　　　　２．３（
０，６）■　　　　　３，５０　　　　　０．１・Ｃ）
３゜１０１９ アオサ　ｉａｉ　　　　　　Ｏ，７３２，１（２２）　
市）　　　　　　　　　　　　４．２０　　　　　　　
　　　　　　０．４１ｅｌ　　　　　　４．５０　　　
　　　１．２（続く） 藻類 クロレラ＋ｊ）　　　　　　０　、９５　　　　　３７
　、３（２，９）　ｌゆ　　　　　５．８０　　　　　
５．５１ψ　　　　　５．１０　　　　３１．９力ゲヒ
ゲムシ（ａ）　　　　０．４０　　　　　１５．４（１
，１）　　　（６＋　　　　４．１ＯＬ、Ｓ晩？＋　　
　　３．９０　　　　　１３．９ユーグレナ（：）　　
　　　０．９６　　　　　３．２（３，５）　　（い　
　　　５．９０　　　　　０．５ｉ（：）６　、００　
　　　　３　、２りＣ）基質添加２４時間後の反応溶液
中の脂質［実施例４］ 酵素源としてスサビノリ（ムｎ至剥旦ｊの組織切片をそ
のまま用いてリノレン酸よりのＥＰＡ合成率をホモジネ
ートの場合と比較した。

瀬戸内海沿岸で採集した新鮮なスサビノリを５（ｎ　Ｉ
＋：の癌過海水で３回洗い、直ちにカミソリの刃で組織
を約４−の大きさに細切し、多量の切片を１）１だ。こ
の切片を約３５１の癌過海水中に浸しておき、そのうち
１０ｍ１を酵素溶液とした。

ハ液は実施例１に準拠してヒスコトロンにてホモジナイ
ズし、そのうち１０１を酵素標品とした。因に、残余の
ホモジネート中の蛋白質含量は８、５　ｍｇ／ｍｌ　、
脂質含量は２．９　ｍｇ／ｌであった。

用いた基質は実施例１で用いたものと同一であった。反
応溶液の組成を下に示す。

インキュベーションは１５℃で２４時間行われた。以後
の操作は実施例１に準じて行った。

反応溶液の組成（ＰＨ７，５） 酵素溶液　　　　　　　　　　　　　１０ｍ１ノ、（質
溶液　　　　　　　　　　　　　　１．０ｉｏｌ州酸　
　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍ１２０％炭醸
水素ナトリウム溶液　　　　適当量合計容量　　　　　
　　　　　　　１５０１ト表−５に示した本実験の結果
から、組織切Ｊ置ホモジネート共にほぼ同等のＥＰＡ合
成活性を有することが分る。従って本発明においては、
ホモジネート以外に均質化前の組織切片そのものを用い
てＥＰＡ生産を行なうことができる。

なお、各区共ドコセン酸及びＤＨＡは認められなかった
。

試験１メ　　　　反応溶液中の　　総脂肪酸中の総脂質
含量　　　ＥＰＡ含量 （ｍｇ／ｍｌ　）　　　　　　（％） 組織ノｉ’２．９４１．５ ホモジネート　　　３．１　　　　　４２．８１Ｓ、ｉ
ｉ出願人　　池田糖化工業株式会社４ｐ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）リノレン酸又はリノレン酸を含む油脂を基質とし
   てエイコサペンタエン酸を含有する藻類中のエイコサペ
   ンタエン酸合成酵素を作用させることを特徴とするエイ
   コサペンタエン酸の酵素的生産方法。
2. （２）酵素反応液中に該リノレン酸の４〜８０重量％量
   の酢酸を加える特許請求の範囲第１項記載のエイコサペ
   ンタエン酸の酵素的生産方法。
3. （３）酵素反応液の最終的な水素イオン濃度をｐＨ３〜
   １０に調整するに当り、ｐＨ調整剤として炭酸水素ナト
   リウムを使用する特許請求の範囲第１項又は第２項記載
   のエイコサペンタエン酸の酵素的生産方法。
4. （４）特許請求の範囲第（１）項記載のリノレン酸を基
   質とする方法において、生産物として得られる総脂質中
   に含まれるドコセン酸及びドコサヘキサエン酸の含有量
   が共に３．０重量％以下であることを特徴とするエイコ
   サペンタエン酸の酵素的生産方法。