KR100977587B1

KR100977587B1 - 스쿠알렌을 생산하는 신규 미생물

Info

Publication number: KR100977587B1
Application number: KR1020080015495A
Authority: KR
Inventors: 김현진; 홍성출; 김윤정
Original assignee: 주식회사 지니스
Priority date: 2008-02-20
Filing date: 2008-02-20
Publication date: 2010-08-23
Also published as: KR20090090184A

Abstract

본 발명은 스쿠알렌을 생산하는 신규 미생물 및 이를 이용하여 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특징은 스쿠알렌을 생산할 수 있는 미생물을 해양으로부터 분리, 동정하고 그 생리적 특징을 조사하여 스쿠알렌의 대량 생산을 위한 균주로 이용하고자 하는 것이다. 본 발명에서 분리한 미생물은 슈도자이마에 속하는 미생물로써 슈도자이마 스피시스 JCC207이라 명명하였다. 슈도자이마 스피시스 JCC207를 이용하여 스쿠알렌을 생산하기 위해 먼저 균주의 생장과 스쿠알렌 생성을 높이는 최적배지를 개발하였고, 이 배지에서 배양한 본 균주의 스쿠알렌 함유량과 생산량은 기존에 스쿠알렌 생산자로 보고된 다른 미생물에 비해 월등히 높은 것을 확인하였다. 또한 본 균주는 효모형태의 생장과 제한된 균사생장을 하므로 생장을 위한 배지 조건이 간단하여 배양에 용이하므로 스쿠알렌의 상업적 생산을 위한 생산자로 적극 활용될 수 있다.

스쿠알렌, 슈도자이마 스피시스, 해양, 미생물, 생화합물, 생물공학

Description

스쿠알렌을 생산하는 신규 미생물 {Novel microorganism producing squalene}

본 발명은 스쿠알렌을 생산할 수 있는 미생물을 해양으로부터 분리, 동정하고 그 생리적 특징을 조사하여 스쿠알렌의 상업적 생산을 위한 균주로 이용하고자 하는 것이다.

스쿠알렌 (Squalene)은 일종의 트리터펜 (triterpene) 계열의 다가불포화지질로 화학식으로는 C₃₀H₅₀이며 다음과 같은 구조를 가진다.

스쿠알렌

스쿠알렌은 항암 효과에 대한 연구결과들이 쌓이면서 우리 인체에 유익한 다가불포화지질성분으로 인식되기 시작하였다. 연구에 의하면 정상인의 하루 평균 스쿠알렌 섭취량은 30 mg/day로 알려져 있으나 이보다 많은 200-400 mg/day 이상을 섭취하면 폐암, 대장암, 피부암 등과 같이 다양한 종류의 암을 통계적으로 유의하게 예방한다고 알려져 있다 [Smith 등:Squalene: potential chemopreventive agent. Expert. Opin. Investig. Drugs 9(8) 1841 (2000)]. 역학조사를 통해 검증된 스쿠알렌의 폐암 및 대장암 등에 대한 항암효과는 설치류 동물을 대상으로 한 실험동물 실험에서도 추가적으로 검증되었다 [Sporn 등:Chemoprevention of cancer. Carcinogenesis. 21(3) 525 (2000)]. 항암효과 이외에도 피부의 글리세리드 (glyceride) 및 왁스 (wax)와 함께 피지층에 주요 성분으로 존재하는 스쿠알렌은 국내 식품의약품안전청의 건강기능식품원료 고시 제1호로 현재 식품, 건강기능식품, 의약품 및 화장품의 원재료로 사용되고 있다 [http://www.portalmarket.com/shark.html].

스쿠알렌은 심해에 서식하는 상어의 간유, 올리브유, 엿기름, 왕겨유, 효모 등에 분포하고 있으나, 현재 스쿠알렌의 상업적 생산은 수심 600-1,000m 이하에서 생활하는 심해상어의 간유에 전적으로 의존하는 상태로, 심해 상어의 간유를 제외한 다른 공급원으로부터 스쿠알렌의 생산은 극히 미미하다 [www.portalmarket.com].

심해상어의 간유에서 추출한 스쿠알렌은 해양 동물자원이라는 특성상 여러 문제점을 가지고 있다. 한정자원인 심해상어의 수는 극히 제한적이어서 심해상어를 스쿠알렌의 계속적인 공급원으로 이용하는 데에는 한계가 있다. 해양환경보존 문제와 높은 공정비용 역시 심해상어가 스쿠알렌 공급원으로서 역할을 하는데 큰 걸림돌이 되고 있다. 그러나 가장 큰 문제는 심각한 해양 중금속오염으로 인해 중금속 함유로 인한 안전성 (Safety) 미비 및 이로 인한 제품의 저품질화이다. 또한 특유의 비린내, 어취 등으로 인해 식품에 첨가물로 활용하기 어렵고, 화장품업계에서도 수요에 비해 그 활용은 매우 제한적으로 이루어지고 있다. 이외에도 유한자원으로부터 추출하는 것이므로 계절적 환경적 요인에 의한 수요공급의 불균형 및 품질의 불균일 문제가 있어왔다.

따라서 동물성 스쿠알렌의 문제점을 해결할 수 있는 식물성 소재인 올리브 오일이 대체소재로 연구되어 왔으나 올리브 오일은 스쿠알렌의 함량이 1% 미만으로 경제성이 매우 낮은 문제가 있다. 따라서 스쿠알렌의 양산에 활용될 수 있는 미생물 소재 발굴 및 생산기술의 개발이 필요하다.

스쿠알렌은 원래 심해상어가 합성하는 것이 아니라 일차생산자인 해양 미생물에서 합성되며 먹이사슬에 의해 어류에 축적되고 최종적으로 심해상어의 간유에 축적된다. 여기에서 얻어낸 어유를 정제한 스쿠알렌이 산업화되고 있는데 스쿠알렌을 만드는 천연 미생물을 발굴하게 되면 중금속오염과 어취문제가 없는 스쿠알렌의 대량 생산이 가능하다. 또한 중금속오염과 어취문제가 없는 스쿠알렌의 경우 안전성이라는 장점 이외에도 고부가가치 소재로써 획기적인 시장성을 가지고 있다.

지금까지 스쿠알렌의 생산자로서 미생물이 보고된 예로는 효모인 사카로마이시스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)와 스키조키트리움 만그로베 (Schizochytrium mangrovei) 그리고 트라우스토카이트리드 (Thraustochytrid ACEM 6063) 등이 있으나 이들로부터 생산된 스쿠알렌의 양은 매우 적은 실정이다. 따라서 심해상어에서 얻어지는 동물성 스쿠알렌과 비교하여 생산단가가 매우 높은 관계로 산업화 자체가 불가능하였다. 중금속과 어취가 없는 미생물 스쿠알렌의 산업화를 위해서는 산업화가 가능한 수준으로 스쿠알렌을 다량 생산할 수 있는 미생물의 개발이 요구된다.

따라서 본 발명의 목적은 식품소재, 화장품 소재 및 의약품 원재료 등 활용성이 우수한 스쿠알렌을 산업적 이용이 가능한 수준으로 생산하는 신규 미생물을 제공하는 데 있다.

미생물을 이용하여 인간에게 유용한 물질을 생산하는 것은 생물공학 산업에서 중요한 자리를 차지하고 있으며 유용 생리활성물질을 생산하는 미생물의 분리 및 개발은 이러한 산업에서 중추적인 역할을 한다고 할 수 있다. 본 발명자들은 해양에 서식하는 어류 등이 인간에게 유익한 많은 고도 불포화 지방산 및 지질 등을 포함하는 것에 착안하여 이들의 먹이가 되는 미생물에 초점을 맞추고 이러한 유용 물질을 생산할 수 있는 미생물을 얻고자 해양으로부터 미생물을 분리하였다. 분리한 미생물 중 많은 양의 스쿠알렌과 일부 유용한 고도 불포화 지방산을 생산하는 본 발명의 균주를 확인하였고, 본 발명자들은 이 균주가 미생물을 이용한 스쿠알렌의 상업적 생산을 위한 균주로 활용될 수 있는 가능성이 높다고 판단하였다. 이에 따라 본 균주를 분리, 동정하고 생리적 특징을 조사하였으며 스쿠알렌 생산을 위한 최적배지를 개발하고 스쿠알렌 생산량을 증가시킴으로써 본 발명을 완성하였다.

스쿠알렌은 고도불포화 지방 탄화수소로 여러 가지의 치료요법과 임상요법에서 그 유용성이 알려져 있다. 스쿠알렌은 활성 산소와 자유 라디칼을 억제하는 항산화 효과가 뛰어나 피부를 보호하고 활성화 시키며 체내의 독성 물질 해독에 도움을 주는 것으로 알려져 있다. 특히 여러 가지 동물 실험에서 스쿠알렌의 항암 효과가 보고되면서 그 효능이 중요시되고 있다. 앞에서 언급한 바와 같이 현재 스쿠알 렌의 상업적 생산은 심해의 상어간유에 의존하고 있으나 이는 심해 상어의 희소성, 환경보존 문제 등의 여러 가지 문제점을 가지고 있다. 따라서 미생물 발효에 의해 스쿠알렌의 상업적 생산은 현재의 스쿠알렌 공급원이 가지는 여러 가지 한계를 극복할 수 있는 좋은 대안이 될 것이다. 이와 아울러 현재 공급원의 부족과 높은 생산 공정비용으로 인한 스쿠알렌의 높은 가격을 낮출 수 있는 효과를 기대 할 수 있다. 미생물을 이용한 유용 생화합물의 생산에 있어서 미생물로부터 화합물의 생산량은 상업적 이용에 매우 중요한 인자가 된다. 기존에 보고된 스쿠알렌을 생산하는 미생물의 경우 매우 적은 양의 스쿠알렌을 생산하는 것에 비해 본 발명의 균주는 10배 이상 많은 양의 스쿠알렌을 생산하므로 미생물을 이용한 스쿠알렌의 상업적 생산에 적극 활용될 수 있으리라 기대된다.

본 발명은 스쿠알렌을 생산하는 신규 미생물 및 그 분리방법과 스쿠알렌을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이와 같은 본 발명을 실시예에 의하여 좀 더 상세하게 설명하면 다음과 같다. 이하 실시예를 통해 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1
균주의 분리 및 동정

해양으로부터 유용물질을 생산하는 미생물을 분리하고자 우리나라 인근해와 태평양을 대상으로 해양 시료를 채취하였다. 이를 위해 해안으로부터 10km 이상 떨어진 바다와 해수면으로부터 100m 이상 깊이의 해수를 채취하였다. 채취된 해수를 여과지로 여과한 후 스트렙토마이신을 포함하는 해양배지(주 1)에 도말하여 25℃에서 7일 동안 배양하였다. 해양배지(주 1)에 자란 여러 가지 콜로니로부터 약 250여종의 미생물을 분리하였고, 이들 미생물의 일부를 가스 크로마토그래피로 분석한 결과 다량의 스쿠알렌을 생산하는 균주를 분리하였다. 기존의 미생물 균주와 본 균주의 스쿠알렌 양의 비교는 표 1에 나타내었다.

[표 1]슈도자이마 스피시스 JCC207과 기존 균주의 스쿠알렌 함유량 비교

균주	Biomass 중 스쿠알렌 함유량
슈도자이마 스피시스 JCC207	13.85 mg/g
사카로마이시스 세레비제	0.04 mg/g
스키조키트리움 만그로베	0.16 mg/g
트라우스토카이트리드	1.50 mg/g

분리한 균주를 동정하고자 균주로부터 DNA를 분리하여 rDNA 일부를 PCR 증폭하여 염기서열을 분석하였다. NCBI의 Blast 검색과 계통발생 분석(Phylogenetic analysis) 결과, 이 균주는 슈도자이마 (Pseudozyma) 속 (Genus)에 속하는 미생물인 것으로 확인되었고 기존의 알려진 다른 종과 매우 유사하나 다른 염기서열을 가지고 있었다. 따라서 이 균주를 슈도자이마 스피시스 JCC207 (Pseudozyma sp. JCC207)이라 명명하고, 농업생명공학연구원에 2007년 4월 10일자로 기탁하여 기탁번호 KACC 91307P를 부여받았다.

본 발명의 균주 슈도자이마 스피시스 JCC207의 형태학적 특성은 다음과 같다.

슈도자이마 스피시스 JCC207는 효모형 생장과 제한된 균사 생장을 겸하는 곰팡이이다. 슈도자이마 스피시스 JCC207의 초기 영양 세포는 타원형 혹은 긴 타원형모양의 효모형 생장을 하며 이분법으로 증식한다. 시간이 지남에 따라 균사생장을 하게 되는데 가지치기 (branching)가 일어나며 격막이 형성되는 광택성의 균사를 생성한 다. 또한 균사를 따라 블라스토코니디아 (blastoconidia) 형태의 포자를 형성한다. YM 배지(주 2)에서, 25℃로 3일 배양 후, 콜로니는 노란빛을 띄는 크림색을 띄며 7일이 지나면 베이지 색을 띄며 주름지고 거친 표면을 보였다.

본 발명의 균주 슈도자이마 스피시스 JCC207의 생리화학적 특성은 다음과 같다 (표 2). 슈도자이마 스피시스 JCC207을 이용하여 여러 가지의 당을 유일한 탄소원으로서 이용하는지의 여부를 실험하였다. 사용된 당의 종류는 D-글루코스(D-Glucose), D-갈락토스(D-Galactose), L-소보스(L-Sorbose), 수크로스(Sucrose), 말토즈(Maltose), 셀로비오즈(Cellobiose), 트레할로즈(Trehalose), 락토즈(Lactose), 멜리비오즈(Melibiose), 라피노즈(Raffinose), 멜레지토즈(Melezitose), 이눌린(Inulin), 가용성녹말(Soluble starch), D-자일로스(D-Xylose), L-아라비노오스(L-Arabinose), D-아라비노스(D-Arabinose), D-리보스(D-Ribose), D-람노스(D-Rhamnose), 에리스리톨(Erythritol), 아도니톨(Adonitol), D-만니톨(D-Mannitol), 이노시톨(Inositol), 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 글리세롤(Glycerol), 갈락티톨(Galactitol), 소르비톨(Sorbitol), D-아라비톨(D-Arabitol), 자일리톨(Xylitol), 숙신산(Succinic acid), DL-젖산(DL-Lactic acid), 말산(Malic acid), 글루쿠론산(Glucuronic acid), D-글루콘산(D-Gluconic acid), 당산(Saccharic acid), 메틸숙시네이트(Methyl-succinate),α-메틸-D-글루코사이드(α-methyl-D-glucoside), 살리신(Salicin), 글루코노-δ-락톤(Glucono-δ-lactone), D-글루코사민(D-Glucosamine), 헥사데칸(Hexadecan), N-아세틸-D-글루코 사민(N-Acetyl-D-glucosamin)이다.

슈도자이마 스피시스 JCC207을 이용하여 여러 가지의 질소원을 유일한 질소원으로서 이용하는지의 여부를 실험하였다. 사용된 질소원의 종류는 질산염(Nitrate), 아질산염(Nitrite), 에틸아민(Ethylamine), 카데바린(Cadevarine), L-라이신(L-Lycin)이다.

슈도자이마 스피시스 JCC207을 이용하여 비타민(Vitamin) 요구성, 50% 글루코스(Glucose), 10% NaCl, 5% 글루코스(Glucose), 30℃, 37℃, 40℃, starch-like compound 분비, DBB 반응, 우레아제(Urease) 반응, 0.01 ppm 시클로헥사미드(Cyclohexamide)와 같은 기타 특징에 대한 균주의 반응을 비교하였다.

[표 2]슈도자이마 스피시스의 생리화학적 특징.

특징	이용도	특징	이용도
탄소원		숙신산(Succinic acid)
D-글루코스(D-Glucose)	+	DL-젖산(DL-Lactic acid)	+
D-갈락토스(D-Galactose	+	말산(Malic acid)	+
L-소보스(L-Sorbose)	s	글루쿠론산(Glucuronic acid)	+
수크로스(Sucrose)	+	D-글루콘산(D-Gluconic acid)	+
말토즈(Maltose)	+	당산(Saccharic acid)	+
셀로비오즈(Cellobiose)	s	메틸숙시네이트(Methyl-succinate)	-
트레할로즈(Trehalose)	+	α-메틸-D-글루코사이드(α-methyl-D-glucoside)	+
락토즈(Lactose)	+	살리신(Salicin)	s
멜리비오즈(Melibiose)	+	글루코노-δ-락톤(Glucono-δ-lactone)	+
라피노즈(Raffinose)	+	D-글루코사민(D-Glucosamine)	+
멜레지토즈(Melezitose)	+	헥사데칸(Hexadecan)	-
이눌린(Inulin)	-	N-아세틸-D-글루코사민(N-Acetyl-D-glucosamine)	+
가용성녹말(Soluble starch)	+	질소원
D-자일로스(D-Xylose)	+	질산염(Nitrate)	+
L-아라비노스(L-Arabinose)	+	아질산염(Nitrite)	+
D-아라비노스(D-Arabinose)	+	에틸아민(Ethylamine)	+
D-리보스(D-Ribose)	+	카데바린(Cadevarine)	+
D-람노스(D-Rhamnose)	+	L-라이신(L-Lycin)	+
에리스리톨(Erythritol)	s	기타 특징
아도니톨(Adonitol)	w	비타민(Vitamin) 요구성	-
D-만니톨(D-Mannitol)	+	50% 글루코스(Glucose)	-
이노시톨(Inositol)	+	10% NaCl, 5% 글루코스(Glucose)	-
메탄올(Methanol)	-	30℃	+
에탄올(Ethanol)	+	37℃	+
글리세롤(Glycerol)	+	40℃	-
갈락티톨(Galactitol)	-	starch-like compound 분비	-
소르비톨(Sorbitol)	+	DBB 반응	+
D-아라비톨(D-Arabitol)	+	우레아제(Urease) 반응	+
자일리톨(Xylitol)	-	0.01ppm 시클로헥사미드(Cyclohexamide)	-

+ : 생육, - : 생육하지 못함, s : 늦게 생육함, w : 약하게 생육함.

(주 1)

해양배지 : 글루코스 0.5%, 이스트이스트랙트 0.1%, 펩톤 0.1%, 해양염 3%.

(주 2)

YM 배지 : 글루코스 1%, 이스트이스트랙트 0.3%, 펩톤 0.5%, 말트이스트랙트 0.3%.

(주 3)

JCC 배지 : 글루코스 0.9%, 이스트이스트랙트 0.2%, 천일염 2.5%.

실시예 2

해양배지에서 균주의 시간에 따른 생장 조사

상기 실시예 1에서 얻은 슈도자이마 스피시스 JCC207 균주를 해양배지에 배양하여 균주의 생장을 조사하였다. 즉, 해양배지(상기 주 1) 25 ml을 100 ml 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후, 본 균주의 단일 콜로니를 접종한다. 종 배양은 25℃에서 48시간동안 150 rpm으로 진탕 배양한다. 해양배지 50 ml을 100 ml 삼각플라스크에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한 후, 종배양의 배양액을 3%가 되게 접종한다. 주 배양은 25℃에서 6일 동안 150 rpm으로 진탕 배양한다.

균주의 시간에 따른 생장은 주기적으로 배양액의 세포 건조 중량을 측정함으로써 조사되었다. 주 배양액 20 ml을 24시간 간격을 두고 오염되지 않도록 채취하여, 채취한 배양액을 3200 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 세포를 수확한다. 수확한 세포에 증류수 20 ml을 첨가하고 교반하여 세포를 세정 한 후, 다시 원심 분리하여 세포를 수확한다. 수확한 세포를 물기를 최대한 제거한 후, 미리 무게를 재어놓은 중량지에 옮겨 80℃의 오븐에서 48시간 동안 말린 후, 무게를 재어 세포 건조 중량을 측정하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.

실시예 3

실시예 2에 있어서 주 배양을 할 때, 250 ml 삼각플라스크에 해양배지(상기 주 1) 100 ml을 담아 배양한 후, 균주의 생장을 조사하여 표 3에 나타내었다.

실시예 4

최적배지에서 균주의 시간에 따른 생장 조사

실시예 2에 있어서 종 배지와 주 배지를 해양배지로부터 최적배지(상기 주 3) 50 ml로 전환하여 배양하였다. 균주의 생장을 조사하여 표 3에 나타내었다.

실시예 5

실시예 3에 있어서 생산 배양을 할 때, 250 ml 삼각플라스크에 최적배지(상기 주 3) 100 ml을 담아 배양한 후, 균주의 생장을 조사하여 표 3에 나타내었다.

[표 3]균주의 시간에 따른 생장 조사.

세포 건조 중량 g/L
배양 시간	해양배지		최적배지
배양 시간	50 ml 배양	100 ml 배양	50 ml 배양	100 ml 배양
24 시간	1.335 ± 0.092	0.810 ± 0.042	1.648 ± 0.329	1.315 ± 0.021
48 시간	2.304 ± 0.089	2.309 ± 0.164	2.893 ± 0.449	2.025 ± 0.014
72 시간	2.268 ± 0.098	2.098 ± 0.205	3.228 ± 0.209	2.948 ± 0.060
96 시간	2.118 ± 0.004	2.113 ± 0.115	3.570 ± 0.078	2.685 ± 0.000
120 시간	2.160 ± 0.049	2.116 ± 0.105	3.440 ± 0.141	3.423 ± 0.004
144 시간	1.988 ± 0.017	1.793 ± 0.011	3.373 ± 0.011	3.533 ± 0.053

표 3의 값은 세 번 조사한 결과의 평균값이고 표준편차와 함께 나타내었다.

해양배지보다 최적배지에서 배양하는 경우, 슈도자이마 스피시스 JCC207의 생장이 향상되는 것을 확인할 수 있다. 본 균주를 해양배지에서 배양할 경우, 생장이 배양 이틀 후에 최대 생장에 이르고 그 이후 조금씩 감소되는 경향을 보인다. 이와 달리 최적배지 50 ml에서 배양할 경우 균주는 배양 96시간에 최고 생장에 도달하는 반면, 최적배지 100 ml 배양의 경우 생장이 계속 증가하여 측정 마지막 날인 6일 후에 최대 생장에 이르게 된다.

실시예 6

해양배지에서 스쿠알렌 생산의 조사

상기 실시예 1에서 얻은 슈도자이마 스피시스 JCC207 균주를 해양배지에 배양하여 스쿠알렌 생산을 조사한다. 즉, 해양배지(상기 주 1) 25 ml을 100 ml 삼각 플라스크에 분주하고 121℃에서 15분간 멸균한 후, 본 균주의 단일 콜로니를 접종한다. 종 배양은 25℃에서 48시간동안 150 rpm으로 진탕 배양한다. 해양배지 50 ml을 100 ml 삼각플라스크에 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한 후, 종 배양의 배양액을 3%가 되게 접종한다. 생산 배양은 25℃에서 6일 동안 150 rpm으로 진탕 배양한다.

스쿠알렌 분석을 위해서 생산 배양액 20 ml을 24시간 간격을 두고 오염되지 않도록 채취한다. 채취한 배양액을 3200 rpm으로 20분 동안 원심 분리하여 세포를 수확한다. 수확한 세포에 2% 황산을 포함하는 메탄올을 첨가하고 잠시 동안 교반하여 세포를 균일화 한 후, 100℃에서 한 시간 동안 반응시킨다. 100℃로 반응시키기 시작한 5분 후에 교반시키고 다시 30분 후에 교반시켜 계속 반응시킨다. 100℃ 반응이 끝난 후, 샘플을 실온으로 식히고, n-헥산(n-hexan) 2 ml과 증류수 2 ml을 첨가한다. 샘플을 1분 동안 격렬하게 교반시킨 후, 잠시 동안 원심 분리하여 상층액을 취 해 새로운 용기에 담아 가스 크로마토그래피 분석에 사용한다.

스쿠알렌의 분석은 가스 크로마토그래피와 질량분석기를 이용하여 수행한다. 기기는 휴렛 팩커드사의 Agilient GC-MS로 모델명 5890의 가스 크로마토그래피와 모델명 5973의 질량 선별 검출기와 이루어져 있다. DB-5로 코팅된 모세관 컬럼을 사용하며 운반 기체로는 헬륨을 이용하고 유속은 1 ml/분으로 한다. 초기 오븐 온도는 70℃로 하여 3분 동안 유지하고 분당 10℃씩 올려 300℃까지 오르게 한 다음 8분을 유지한다. 주입 온도는 280℃, 관 온도는 270℃ 그리고 검출기 온도는 200℃로 한다. 샘플의 주입양은 1 μl이고 확산율은 1:12로 한다. 크로마토그램의 피크로부터 화합물의 정성 분석은 질량 분석기의 데이터베이스 라이브러리에 의하여 이루어진다. 스쿠알렌의 정성분석은 인증된 스쿠알렌을 구입하여 (Sigma S3626) 대조군으로 사용함으로써 더욱 확실히 한다. 화합물의 정량분석은 내부 지표로서 헵타데칸산(Heptadecanoic acid (Sigma H4515))을 사용하여 질량분석기를 통해 이루어진다. 스쿠알렌 생산량과 함유량은 표 4에 나타내었다.

실시예 7

실시예 6에 있어서 생산 배양을 할 때, 250 ml 삼각플라스크에 해양배지(상기 주 1) 100 ml을 담아 배양한 후, 스쿠알렌 생산량과 함유량을 조사하여 표 4에 나타내었다.

실시예 8

최적배지에서 스쿠알렌 생산의 조사

실시예 6에 있어서 종 배지와 생산 배지를 최적배지(상기 주 3)로 전환하여 배양한 후, 스쿠알렌 함유량과 생산량을 조사하여 표 5에 나타내었다.

실시예 9

실시예 8에 있어서 생산 배양을 할 때, 250 ml 삼각플라스크에 최적배지(상기 주 3) 100 ml을 담아 배양한 후, 스쿠알렌 함유량과 생산량을 조사하여 표 5에 나타내었다.

[표 4]해양배지에서 스쿠알렌 생산량과 함유량.

	스쿠알렌 생산량 mg/L		스쿠알렌 함유량 mg/g
배양시간	50 ml 배양	100 ml 배양	50 ml 배양	100 ml 배양
24 시간	0.000	0.000	0.000	0.000
48 시간	13.032 ± 4.711	17.699 ± 0.932	5.755 ± 2.217	7.748 ± 0.590
72 시간	3.586 ± 0.000	4.332 ± 2.040	1.524 ± 0.000	2.075 ± 0.766
96 시간	0.000	0.444 ± 0.628	0.000	0.441 ± 0.000
120 시간	0.000	0.541 ± 0.000	0.000	0.532 ± 0.000
144 시간	0.000	0.000 ± 0.000	0.000	0.000

[표 5]최적배지에서 스쿠알렌 생산량과 함유량.

	스쿠알렌 생산량 mg/L		스쿠알렌 함유량 mg/ml
배양시간	50 ml 배양	100 ml 배양	50 ml 배양	100 ml 배양
24 시간	0.000	0.000	00.000	0.0000
48 시간	19.054 ± 2.831	0.000	6.622 ± 1.415	0.000 ± 0.000
72 시간	30.734 ± 4.274	22.444 ± 2.886	9.051 ± 1.488	7.615 ± 0.979
96 시간	49.349 ± 12.263	3.246 ± 0.000	13.823 ± 3.115	1.209 ± 0.000
120 시간	11.130 ± 2.558	7.409 ± 2.663	3.236 ± 0.744	2.165 ± 0.828
144 시간	5.775 ± 3.429	26.565 ± 8.044	1.701 ± 0.999	7.520 ± 2.277

스쿠알렌 생산량 : 배양액 1 리터당 스쿠알렌의 양 (mg).

스쿠알렌 함유량 : 균주의 세포 건조 중량 1 그램당 스쿠알렌의 양 (mg).

표 4와 5의 값은 두 번 실험한 결과의 평균값이고 표준 편차와 함께 표시하였다.

해양배지에 비해 최적배지에서 배양한 경우, 스쿠알렌의 생산량과 함유량이 크게 증가함을 확인할 수 있다. 또한 해양배지에서 배양하는 경우 스쿠알렌이 50 ml과 100 ml 배양 모두에서 배양 48시간에 가장 많이 생성되었다가 급격하게 감소되어 배양 72시간 이후에는 거의 생성되지 않는 경향을 보이는 반면, 최적 배지에서 배양하는 경우에는 배양 48시간 이후부터 144시간까지 스쿠알렌이 생성되는 것을 확인할 수 있다. 최적배지 50 ml의 경우, 스쿠알렌이 배양 48시간부터 나타나기 시작하여 점점 증가하다가 배양 96시간에 최대에 이르게 되는 반면, 최적배지 100 ml에서 배양할 경우, 배양 72시간에 많은 양의 스쿠알렌이 나타나고 점차 감소하다가 다시 배양 144시간이 되면 72시간과 비슷한 정도의 스쿠알렌이 생성됨을 볼 수 있다. 본 균주로부터 조사된 스쿠알렌의 최대 생산량과 함유량은 49.3 mg/L, 13.8 mg/g이다.

도 1은 스쿠알렌 생산균주인 슈도자이마 스피시스 JCC207를 YM 배지에서 25℃로 24시간 배양하여 위상차현미경으로 관찰한 세포사으로, A는 균주의 영양세포, B는 균주의 균사체, C는 균주의 포자(blastoconidia)이다.

도 2는 스쿠알렌 생산균주인 슈도자이마 스피시스 JCC207의 스쿠알렌과 고도 불포화 지방산의 생성을 나타낸 가스크로마토그램이다 (A: Hexadecanoic acid, B: Heptadecanoic acid (내부지표), C: 9, 12-Octadecadienoic acid, D: 9-Octadecenoic acid, E: Octadecanoic acid).

Claims

스쿠알렌을 생산하는 슈도자이마 스피시스 JCC207(Pseudozyma sp. JCC207, 기탁번호: KACC 91307P).
슈도자이마 스피시스 JCC207(기탁번호: KACC 91307P) 또는 그 배양물로부터 스쿠알렌을 수득하는 것을 포함하는 스쿠알렌의 생산방법.
제2항에 있어서, 글루코스 0.9%, 이스트이스트랙트 0.2%, 및 천일염 2.5%를 포함하는 배지에서 슈도자이마 스피시스 JCC207(기탁번호: KACC 91307P)을 배양하는 것을 포함하는 스쿠알렌의 생산방법.