CN103805644A - 含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂及其制备和应用。该油脂中含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，其中二十二碳六烯酸与油脂的质量百分比为35%-45%，二十碳五烯酸与油脂的质量百分比为1%-7%。在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中培养裂壶藻CGMCCNo.3636；培养结束后收集藻细胞并从中提取回收所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂。上述含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂主要用于制备食品添加剂、功能食品、保健品、治疗心血管系统疾病和精神性疾病及抗炎药物。本发明解决了现有技术中存在的含量不稳定等问题，具有DHA及EPA含量稳定，无异味，工业化开发前景广阔等优点。

Description

含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂及其制备和应用。

背景技术

长链脂肪酸是有机体生物膜的重要组成成份，可调节细胞构型、动态平衡、相转变及细胞膜的渗透性，同时还调节与膜有关的生理过程，因此可以影响细胞的化学组成、信号传递、免疫和冷适应性，以及与此有关疾病的发生。长链脂肪酸可用于合成调节人体某些生理功能的代谢产物，它们同激素一样，在组织中存在量很少，但是具有很强的调节功能。在长链脂肪酸中比较重要的n-3多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。

二十二碳六烯酸（DHA,22:6-△4,7,10,13,16,19）和二十碳五烯酸（EPA,20:5-△5,8,11,14,17）共同构成n-3多不饱和脂肪酸的主要营养成分。DHA和EPA具有极其重要的生物医学功能，已成为医药和营养学研究的热点。DHA/EPA的作用机制归纳为：调节细胞膜的结构、功能和流动性；对脂质代谢，神经和突触的生长发育、分化，炎症反应和氧化反应起调节作用；作为合成炎症因子的前体，对炎症反应起抑制作用;对心血管疾病、自身免疫性疾病和炎症、糖尿病、癌症和精神方面的疾病都有治疗作用。通过大量科学研究发现EPA和DHA的医疗保健功能也有所区别。

1、DHA的功能

DHA主要存在于大脑、神经和视神经细胞中，能促进婴幼儿脑部和视力的机能发育，有利于智力、学习和记忆能力的提高，还能提高婴幼儿视觉的敏锐度、促进婴幼儿的生长发育、提高婴幼儿认知和行为能力、降低婴幼儿患过敏症的危险。孕妇补充DHA后能提高产后婴幼儿抗感染能力，及减少婴幼儿肥胖症的发生。

DHA在降血压、降血脂、降胆固醇的功效方面也已经有很明确的报道。Mori等指出DHA可以调节人体内血脂和脂蛋白的正常代谢，增加高密度脂蛋白含量，降低血液粘度和血液中胆固醇水平。DHA可有效减少血栓的形成，防止心血管疾病的发生。此外，DHA在延缓衰老、预防精神性疾病（如老年痴呆、躁郁症等）、抗癌和抑制肿瘤、预防骨质疏松、预防糖尿病、抗炎症等方面也有明显的作用。

2、EPA的功能

EPA在人体中的分布与DHA不同，其在大脑和神经组织中的含量较低，但在机体的其他方面具有与DHA相同的作用，主要体现在抗炎、抗心血管病、抗抑郁症、降血脂、抗肿瘤等方面。

EPA在体内发挥抗炎、减轻炎症损伤的作用。先天性心脏病的婴儿进行开胸心脏手术后补充EPA可降低炎症反应，增强了术后婴儿的康复。

EPA具有舒张血管的作用，可作为血管舒张药物和抗动脉粥样硬化药物用于抗心律失常、抗动脉粥样硬化、抗高血压、减少冠心病发病率和保护心脏。EPA可降低细胞膜上胆固醇的含量，增加血液流动性，降低血液粘度。研究发现心源性脑栓塞病人和大动脉粥样硬化病人体内的EPA含量低于正常人，服用EPA可降低高胆固醇病人中风的发病机率及愈后的复发率。美国每年有70万人受到中风的影响，每年用于治疗中风的医疗费用达536亿美元，服用EPA可大大减少医疗消费。

EPA与DHA一样发挥抗肿瘤和降血脂的作用。EPA和DHA有抑制乳腺癌、胃癌、膀胱癌、直肠癌及子宫癌等癌症增殖和迁移的作用。因此，以EPA和DHA在癌症的预防及治疗工作中具有重要的意义。

3.EPA和DHA的互补协同作用

虽然EPA与DHA在某些方面具有相同的功能，但其作用机制存在很大区别，使得它们在抗病的功效上有所不同，有些情况下同时使用EPA和DHA可增强治疗作用。大量临床及实验证据表明EPA和DHA均可降低体内血脂的水平，EPA比DHA更有效的促进PPARα的表达而促进脂肪酸的氧化，相反，DHA比EPA更有效降低SREBP的活性而降低脂肪的合成，两者共同作用能更有效降低血脂。

EPA和DHA都具有抗炎的作用，它们通过改变炎症细胞的膜结构和抑制炎症因子表达的信号转导途径来降低炎症反应。有研究表明，EPA具有比DHA更强的抗炎作用，因为EPA除了作为信号分子抑制信号转导途径外，还是AA的竞争性底物。AA通过环氧酶COX-2和脂氧酶5-LOX合成促炎因子如前列腺素PGE2、血栓素A2和白三烯LTB4，而EPA可竞争性结合COX-2和5-LOX合成无活性的细胞因子，发挥快速抗炎作用。相反，DHA不是这两个酶的底物。

DHA和EPA在预防精神性疾病方面（如老年痴呆、躁郁症等）发挥明显的作用。流行病学统计显示食用富含EPA和DHA食物的抑郁症患者病症得到减轻。另外，EPA和DHA共同使用可作为降血压的药物。

基于DHA和EPA的生理作用，以及它们之间的互补协同作用，同时含有EPA和DHA的产品具有更强的疾病预防作用，也具有极大的市场需求空间。

但人类不能直接从植物油脂获取EPA和DHA，因为高等植物中一般缺少n-3PUFAs的合成途径。对动物和人而言，自身不能从头合成EPA和DHA，但可以在酶的作用下将亚麻酸（C18:3，ALA）逐步转化为EPA和DHA。但由于人体内这些酶的活性较低，而且随着年龄的增长及疾病的出现，酶活性逐渐降低，导致ALA的转化效率很低。动物实验表明，在人体中所进食的ALA只有不到1%被转化为EPA和DHA，所以通过进食ALA只能补充人体所需0.7%-2%的EPA/DHA，EPA和DHA容易合成不足而低于正常的生理水平。然而，当人体缺乏EPA和DHA时一些疾病的发病风险将大大提高，比如，心血管疾病、动脉粥样硬化、癌症、精神分裂症、阿尔茨海默病和炎症反应等等。所以直接补充外源EPA和DHA显得非常重要。

EPA和DHA的补充剂量已有很多研究报道，通常来讲具有营养效果的DHA/EPA补充剂量为250-500mg/d，美国心脏协会（AHA）推荐正常人应每天补充，对于高脂血症患者应当每天补充2-4g。目前，尚无高剂量EPA/DHA导致副反应的报道。然而在日常生活中，人们进食EPA和DHA的机会较少，远低于这些推荐值，往往不能满足人体的生理需求，容易造成ω-6/3PUFA的比例失调，导致心血管疾病、肿瘤、糖尿病、自身免疫等疾病的发病风险提高。

EPA和DHA以其良好的疗效和较小副作用的优点，已成为一种新型的营养品、保健品、疗效食品或药物。但是目前市售的EPA和DHA产品主要生产来源是海产鱼油，或是高度浓缩的鱼油乙酯。鱼油中EPA和DHA的含量并不稳定，大约在4%-40%之间，主要受鱼的品种、季节及产地的影响。鱼油中脂肪酸成分复杂，存在分离纯化困难、生产工艺复杂等问题。其次，鱼油还存在严重的海洋污染问题，如汞及其他重金属。重金属容易通过食物链富集于鱼类体内，进食被重金属污染的鱼可以造成孕妇流产或对婴幼儿造成不可逆转的身体缺陷。除重金属外，鱼油中还含有持续性有机污染物（POPs），如滴滴涕（DDT）、化学杀虫剂、二恶英等。处在哺乳期的妇女可将100%的持续性有机污染物通过母乳排出，而又100%的通过母乳被婴儿吸收。

另外，鱼油稳定性差，较易被氧化，还有鱼腥味，如果用添加鱼油的饲料喂哺水产品，鱼油的氧化产物容易造成水产品肌肉组织软化，并使肌肉组织发出腥味。更严重的，鱼油的氧化产物在人体内容易诱导程序式细胞凋亡，从而引致许多慢性疾病的发生，如癌症和神经衰退症等。此外脂肪酸的乙酯和甲酯形式在体内的吸收效率较低。

海洋微藻是合成DHA和EPA的最初源头，但是这些微藻多数为光合自养型的藻种，他们在工业化生产中会存在一些问题：（1）在开放水体中培养微藻容易受到细菌的污染和原生动物的掠食；（2）其产量受到季节，特别是光照的限制；（3）生物量低而使得采收成本相对较高。

而能利用有机碳作为唯一碳源和能源进行生长的微藻更容易通过生物反应器进行异养培养生产所需油脂，具有更大潜力成为EPA和DHA油脂的新资源。因为这些单细胞生物具有较高的生长速率，全部生产过程是在相对密封的系统中进行，可以完全消除来自外界的污染，使微藻油脂更加安全可靠。

破囊壶菌科（Thraustochytriaceae）的裂壶藻（Schizochytrium）为单细胞生物，生长速度快，可以在短期内达到较高的生物量，并可积累二十二碳六烯酸（DHA），达到总脂的35%-45%，脂肪酸组成简单，容易分离纯化，没有鱼腥味。通过对大鼠和兔子发育的毒性实验、大鼠的亚急性毒性实验、大鼠的诱变实验、大鼠生殖影响的实验以及对猪发育的安全性评价，裂壶藻均未发现任何毒副作用，能用于医药、食品以及饲料等系列产品的开发。但利用裂壶藻（Schizochytrium），在异养培养条件下通过搅拌式生物反应器同时生产双长链n-3多不饱和脂肪酸尚未有报道。

发明目的

本发明的目的在于提供一种含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂及其制备和应用。该油脂可以用于制备食品添加剂、功能食品、保健品以及治疗心血管系统及精神性疾病的药物。

本发明的整体技术构思是：

一种含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂，该油脂中含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，其中二十二碳六烯酸与油脂的质量百分比为35%-45%，二十碳五烯酸与油脂的质量百分比为1%-7%。

含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，包括如下工艺步骤：

A、在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中培养裂壶藻CGMCCNo.3636；

B、培养结束后收集藻细胞，从所述的藻细胞中提取回收所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂。

本发明中所采用的裂壶藻（Schizochytrium sp.）CGMCCNo.3636已于2010年3月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，该保藏机构位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

作为含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂主要包含但不局限于如下的应用：

含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备食品添加剂中的应用，制备具有改善心血管功能的保健品中的应用，在制备功能食品中的应用，在制备治疗精神性疾病药品中的应用，在制备治疗抗炎药品中的应用。

上述药品含有所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂，用于口服或注射给药，是药理上可以接受的。据报道具有营养效果的EPA和DHA的补充剂量为250-500mg/d。在食品、保健品和功能食品的添加剂量上应遵循这一指标。对于高血脂症患者等一些特殊疾患人群每天补充量可达到2-4g。

本发明总脂的测定采用传统的溶剂浸提法，根据经典的Bligh-Dyer脂肪酸提取及酯化方法，称取一定量的冻干细胞，与甲醇:氯仿:水=1:2:0.8的混合液一起搅拌30分钟，离心后收集上清液，反复清洗数次后合并上清液，用氮气吹干溶剂得到藻细胞的脂，称重，测得总脂含量。取适量油脂按一定比例加入KOH-甲醇溶液及一定量17烷酸的内标物与三氟化硼-乙醚，由此进行甲酯化，从而得到多不饱和脂肪酸甲酯，进行气相色谱测定。

本发明的具体技术构思还有：

为便于实现人工培养以及标准化的生产，优选的技术方案是，所述的发酵培养基是以有机碳为碳源，以低于碳源浓度的氮源，维生素，无机盐，微量元素或其混合物为补充营养物质配制而成。

所述的碳源的质量百分比浓度为1%-6%，氮源浓度为碳源浓度的0.05-1倍。

所述的步骤A中的培养温度为20-30℃，通气量0.5-1.5vvm，搅拌转速100-600rpm。

当采用连续培养方式时所述的培养连续向通气发酵罐中补给发酵培养基,维持碳源浓度5-20g/L。

所述的培养在间歇发酵方式下当碳源浓度降低至5g/L时补加碳源。

为进一步缩短工业生产中的周期，优选且较为常见的技术方案是，所述的步骤A中的培养是将裂壶藻CGMCCNo.3636原始藻种经活化、扩大培养后制成种子液，将种子液接种至发酵培养基中进行培养。

所述的活化是将固体培养基上保藏的藻种接种至装有培养基的摇瓶中，在温度20-30℃、转速为100-200rpm下培养16-72h进行。

所述的扩大培养是将活化的藻种按2%-10%的接种量接种到摇瓶扩培培养基中，在温度20-30℃，转速为100-200rpm的条件下培养16-72h后制成种子液。

所述的活化传代培养基采用如下组分组成：

葡萄糖5-15g/L，甘油5-15g/L，胰蛋白胨1-5g/L，酵母提取物1-5g/L,氯化钠15-25g/L,硫酸镁1-5g/L,磷酸二氢钾0.5-5g/L,酒石酸铵0.5-2g/L，氯化钾0.1-1g/L,氯化钙0.01-0.6g/L,硫酸铵0.5-3g/L，碳酸氢钠0.01-0.05g/L，乙二胺四乙酸二钠盐10-60mg/L,氰钴胺素5-50mg/L,硼酸10-35mg/L，氯化锰0.01-1mg/L，三氯化铁0.5-3mg/L，氯化锌0.1-1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5-10mg/L,氯化钴0.01-0.1mg/L，硫酸铜0.01-0.15mg/L，六水合硫酸镍0.1-0.8mg/L，余量为水，pH=6-7。

所述的扩培和发酵培养基采用如下组分组成：

葡萄糖20-40g/L，甘油10-30g/L，酵母提取物1-5g/L,大豆蛋白胨1-5g/L，玉米浆1-15g/L，氯化钠15-25g/L,硫酸镁1-5g/L,苹果酸1-5g/L，磷酸二氢钾0.5-5g/L,酒石酸铵0.5-2g/L，氯化钾0.1-1g/L,氯化钙0.01-0.6g/L,硫酸铵0.5-3g/L，碳酸氢钠0.01-0.05g/L，对甲苯甲酸20-200mg/L,乙二胺四乙酸二钠盐10-60mg/L,氰钴胺素5-50mg/L,硼酸10-35mg/L，泛酸0.1-2mg/L，生物素0.1-1mg/L,氯化锰0.01-1mg/L，三氯化铁0.5-3mg/L，氯化锌0.1-1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5-10mg/L,氯化钴0.01-0.1mg/L，硫酸铜0.01-0.15mg/L，六水合硫酸镍0.1-0.8mg/L，余量为水，pH=6-7。

含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗心血管系统疾病药物中的应用，所述的药品用于口服或注射给药，是药理上可以接受的。所述的药品用来每天提供200mg-5000mg的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂。

所述的心血管系统疾病是指高血压、高血脂、高胆固醇、血栓、心率失常、冠心病以及动脉粥样硬化中的一种或其结合。含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗精神性疾病药品中的应用，所述的精神性疾病是指老年痴呆、躁郁症、抑郁症。

含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗抗炎药品中的应用。

含有DHA和EPA的油脂在药理上的作用已经得到证实，并且在国外已有临床处方药面世。由英国葛兰素史克制药公司推出的Omacor处方药已经在挪威用于临床，作为心肌梗塞的辅助治疗药物以及高甘油三酯血症的治疗，此处方药在美国以Lovaza的名称在临床上用于辅助治疗严重的高甘油三脂血症。Omacor或Lovaza都是以鱼油中提取并乙酯化的DHA和EPA的混合油脂为原料制得。在日本，以含量为98%的乙酯型EPA为原料制得处方药Epadel，用于治疗高甘油三脂血症和闭塞性动脉硬化症。国外学者对EPA和DHA混合油脂对小儿多动症的影响进行了临床试验，并取得积极成果；在加拿大，将含有鱼油DHA和EPA的静脉注射乳剂处方药-力保加（lipoplus，MLF541）用于婴儿开胸手术后的抗炎临床试验，取得积极效果。

本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：

1、本发明通过选用合适的微藻，在优化的培养基和培养条件下，获得了富含EPA和DHA的藻油。经检测，微藻细胞中DHA占总脂的比例为35%-45%，；EPA占总脂的比例为1%-7%，上述富含EPA的DHA的藻油具有较好的工业化开发前景。

2、本发明所制备的油脂克服了鱼油DHA和EPA含量不稳定、稳定性差和异味的缺点，经提纯浓缩后可作为食品、保健品、功能食品以及药品原材料使用，具有极为广阔的工业开发及应用前景。

本发明中所采用的裂壶藻（Schizochytrium sp.）CGMCCNo.3636已于2010年3月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。

实施例1

本实施例中所采用的裂壶藻（Schizochytrium sp.）CGMCCNo.3636已于2010年3月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏。

所述的活化传代培养基采用如下组分组成：

葡萄糖5g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨1g/L，酵母提取物1g/L,氯化钠15g/L,硫酸镁1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钾0.1g/L,氯化钙0.01g/L,硫酸铵0.5g/L，碳酸氢钠0.01g/L，乙二胺四乙酸二钠盐10mg/L,硼酸10mg/L，氯化锰0.01mg/L，三氯化铁0.5mg/L，氰钴胺素5mg/L,氯化锌0.1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5mg/L,氯化钴0.01mg/L，硫酸铜0.01mg/L，六水合硫酸镍0.1mg/L，酒石酸铵0.5g/L，余量为水，pH=6-7。

所述的扩培和发酵培养基采用如下组分组成：

葡萄糖20g/L，甘油10g/L，酵母提取物1g/L,大豆蛋白胨1g/L，玉米浆1g/L，氯化钠15g/L,硫酸镁1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钾0.1g/L,氯化钙0.01g/L,硫酸铵0.5g/L，碳酸氢钠0.01g/L，乙二胺四乙酸二钠盐10mg/L,硼酸10mg/L，氯化锰0.01mg/L，三氯化铁0.5mg/L，氰钴胺素5mg/L,氯化锌0.1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5mg/L,氯化钴0.01mg/L，硫酸铜0.01mg/L，六水合硫酸镍0.1mg/L，酒石酸铵0.5g/L，苹果酸1g/L，泛酸0.1mg/L，生物素0.1mg/L，对甲苯甲酸20mg/L。余量为水，pH=6-7。

本实施例的具体培养步骤如下：将20ml活化传代培养基装于100ml摇瓶中，灭菌冷却后接种固体平板保藏的藻种，于20-30℃，100-200rpm摇床中培养16-72h，获得一级种子液。吸取5ml上述一级种子液接种到装有45ml扩培培养基的250ml摇瓶中，于20-30℃，100-200rpm摇床中培养获得二级种子液。吸取10ml二级种子液接种到90ml发酵培养基，装于500ml摇瓶中，于20-30℃，100-200rpm摇床中培养16-72h，离心收集微藻细胞，用去离子水清洗藻泥2次，经冷冻干燥后获得藻粉。

通过相关指标分析获得：藻粉EPA含量占总脂的1.19%；DHA含量占总脂的36.76%。

经气相色谱测定藻细胞中脂肪酸组成如下：

脂肪酸名称	占总脂比例
		C12:0	0.55%
C12:1	0.85%
		C14:0	8.53%
C16:0	26.94%
		C16:1	1.16%
C18:0	0.84%
		C18:1	0.97%
C22:0	0.44%
		C22:1	0.70%
C23:0	0.88%
		C20:5	1.19%
C22:5	10.81%

C22:6

36.76%

实施例2：

藻种选用、培养过程同实施例1。

所述的活化传代培养基采用如下组分组成：

葡萄糖15g/L，甘油15g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物5g/L,氯化钠25g/L,硫酸镁5g/L,磷酸二氢钾5g/L,氯化钾1g/L,氯化钙0.6g/L,硫酸铵3g/L，碳酸氢钠0.05g/L，乙二胺四乙酸二钠盐60mg/L,硼酸35mg/L，氯化锰1mg/L，三氯化铁3mg/L，氰钴胺素50mg/L,氯化锌1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑10mg/L,氯化钴0.1mg/L，硫酸铜0.15mg/L，六水合硫酸镍0.8mg/L，酒石酸铵2g/L，余量为水，pH=6-7。

所述的扩培和发酵培养基采用如下组分组成：

葡萄糖40g/L，甘油30g/L，酵母提取物5g/L,大豆蛋白胨5g/L，玉米浆15g/L，氯化钠25g/L,硫酸镁5g/L,磷酸二氢钾5g/L,氯化钾1g/L,氯化钙0.6g/L,硫酸铵3g/L，碳酸氢钠0.05g/L，乙二胺四乙酸二钠盐60mg/L,硼酸35mg/L，氯化锰1mg/L，三氯化铁3mg/L，氰钴胺素50mg/L,氯化锌1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑10mg/L,氯化钴0.1mg/L，硫酸铜0.15mg/L，六水合硫酸镍0.8mg/L，酒石酸铵2g/L，苹果酸5g/L，泛酸2mg/L，生物素1mg/L，对甲苯甲酸200mg/L。余量为水，pH=6-7。

通过相关指标分析获得：藻粉EPA含量占总脂的6.79%；DHA含量占总脂的39.19%。

经气相色谱测定藻细胞中脂肪酸组成如下：

脂肪酸名称	占总脂比例
		C12:0	0.44%
C12:1	0.66%
		C14:0	6.37%
C16:0	28.13%
		C16:1	2.16%
C18:0	0.26%
		C18:1	2.48%
C22:0	0.26%
		C22:1	0.18%

C23:0	0.32%
		C20:5	6.79%
C22:5	5.25%
		C22:6	39.19%

实施例3：

藻种选用、培养过程同实施例1。

所述的活化传代培养基采用如下组分组成：

葡萄糖10g/L，甘油10g/L，胰蛋白胨3g/L，酵母提取物3g/L,氯化钠20g/L,硫酸镁4g/L,磷酸二氢钾3g/L,氯化钾0.5g/L,氯化钙0.3g/L,硫酸铵2g/L，碳酸氢钠0.03g/L，乙二胺四乙酸二钠盐30mg/L,硼酸20mg/L，氯化锰0.5mg/L，三氯化铁2mg/L，氰钴胺素20mg/L,氯化锌0.5mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑5mg/L,氯化钴0.05mg/L，硫酸铜0.1mg/L，六水合硫酸镍0.7mg/L，酒石酸铵1g/L，余量为水，pH=6-7。

所述的扩培和发酵培养基采用如下组分组成：

葡萄糖30g/L，甘油20g/L，酵母提取物3g/L,大豆蛋白胨3g/L，玉米浆8g/L，氯化钠20g/L,硫酸镁3g/L,磷酸二氢钾3g/L,氯化钾0.5g/L,氯化钙0.3g/L,硫酸铵2g/L，碳酸氢钠0.03g/L，乙二胺四乙酸二钠盐30mg/L,硼酸20mg/L，氯化锰0.5mg/L，三氯化铁2mg/L，氰钴胺素30mg/L,氯化锌0.5mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑5mg/L,氯化钴0.05mg/L，硫酸铜0.1mg/L，六水合硫酸镍0.4mg/L，酒石酸铵1g/L，苹果酸3g/L，泛酸1mg/L，生物素0.5mg/L，对甲苯甲酸100mg/L。余量为水，pH=6-7。

通过相关指标分析获得：藻粉EPA含量总脂的4.26%；DHA含量占总脂的42.01%。

经气相色谱测定藻细胞中脂肪酸组成如下：

脂肪酸名称	占总脂比例
		C12:0	0.29%
C12:1	1.16%
		C14:0	5.57%
C16:0	26.28%

C16:1	1.11%
		C18:0	0.64%
C18:1	2.86%
		C22:0	0.46%
C22:1	0.68%
		C23:0	0.14%
C20:5	4.26%
		C22:5	6.13%
C22:6	42.01%

实施例4：

活化传代培养基采用如下组分组成：

葡萄糖15g/L，甘油5g/L，胰蛋白胨5g/L，酵母提取物1g/L,氯化钠25g/L,硫酸镁3g/L,磷酸二氢钾2g/L,氯化钾0.1g/L,氯化钙0.6g/L,硫酸铵1g/L，碳酸氢钠0.01g/L，乙二胺四乙酸二钠盐60mg/L,硼酸18mg/L，氯化锰0.05mg/L，三氯化铁2mg/L，氰钴胺素30mg/L,氯化锌0.1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑10mg/L,氯化钴0.01mg/L，硫酸铜0.01mg/L，六水合硫酸镍0.8mg/L，酒石酸铵0.5g/L，余量为水，pH=6-7。

所述的扩培和发酵培养基采用如下组分组成：

葡萄糖20g/L，甘油30g/L，酵母提取物1g/L,大豆蛋白胨1g/L，玉米浆8g/L，氯化钠25g/L,硫酸镁1g/L,磷酸二氢钾0.5g/L,氯化钾0.1g/L,氯化钙0.01g/L,硫酸铵0.5g/L，碳酸氢钠0.01g/L，乙二胺四乙酸二钠盐10mg/L,硼酸10mg/L，氯化锰1mg/L，三氯化铁3mg/L，氰钴胺素50mg/L,氯化锌1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5mg/L,氯化钴0.01mg/L，硫酸铜0.15mg/L，六水合硫酸镍0.8mg/L，酒石酸铵0.5g/L，苹果酸1g/L，泛酸2mg/L，生物素0.1mg/L，对甲苯甲酸80mg/L。余量为水，pH=6-7。

本实施例的具体培养步骤如下：藻种选用、种子液培养过程同实施例1。配制1.35L发酵培养基于2L发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后将150ml二级种子液接种到发酵罐中。控制发酵温度25℃、搅拌转速300rpm，通气量为0.8vvm，用氨水和盐酸调节pH使其维持在7.0左右，按需添加适当量的消泡剂,以维持发酵的正常进行。当碳源浓度降至5-20g/L时开始连续补给上述发酵培养基，控制进料速率，维持碳源浓度为5-20g/L，发酵罐外部配置细胞沉降槽用于截留发酵罐出口的流失细胞，截留的细胞被返回发酵罐。细胞浓度达到40g/L左右时收集细胞，冷冻干燥后获得藻粉。

通过相关指标分析获得：藻粉EPA含量占总脂的2.78%%；DHA含量占总脂的44.81%。

经气相色谱测定藻细胞中脂肪酸组成如下：

脂肪酸名称	占总脂比例
		C12:0	0.27%
C12:1	0.60%
		C14:0	4.79%
C16:0	21.11%
		C16:1	3.83%
C18:0	0.58%
		C18:1	1.24%
C22:0	0.51%
		C22:1	0.47%
C23:0	0.84%
		C20:5	2.78%
C22:5	10.47%
		C22:6	44.81%

实施例5：

本实施例所用活化传代培养基，扩培和发酵培养基同实施例4。

本实施例具体培养步骤如下：藻种选用、种子过程同实施例1。配制1.35L发酵培养基于2L发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却后将150ml二级种子液全部接种到发酵罐中。控制发酵温度20℃、搅拌速度350rpm，通气量为0.8vvm、用氨水和盐酸调节pH为7.0左右，按需添加适当量的消泡剂,以维持发酵的正常进行，细胞浓度达到21.8g/L时,收集细胞，冷冻干燥后获得藻粉。

通过相关指标分析获得：藻粉EPA含量占总脂的1.95%；DHA含量占总脂的45.09%。

经气相色谱测定藻细胞中脂肪酸组成如下：

脂肪酸名称	占总脂比例
		C12:0	0.32%
C12:1	0.71%

C14:0	4.57%
		C16:0	22.04%
C16:1	2.71%
		C18:0	0.68%
C18:1	1.01%
		C22:0	0.57%
C22:1	0.56%
		C23:0	0.99%
C20:5	1.95%
		C22:5	10.55%
C22:6	45.09%

实施例6：

本实施例所用活化传代培养基，扩培和发酵培养基同实施例1。

本实施例具体培养步骤如下：藻种选用、种子过程同实施例1。配制7.2L发酵培养基于10L发酵罐中，121℃灭菌20min，冷却，将0.8L二级种子液全部接种到发酵罐中，控制发酵温度25℃、搅拌速度400rpm，通气量0.5vvm、用氨水和盐酸调节pH=7.0，按需添加适当量的消泡剂,以维持发酵的正常进行。当碳源浓度降低至5g/L时，补充碳源至初始浓度，共补充两次碳源，细胞浓度达到40.6g/L，收集细胞，冷冻干燥后获得藻粉。

通过相关指标分析获得：微藻细胞粉EPA含量占总脂的2.04%；DHA含量占总脂的37.46%。

经气相色谱测定藻细胞中脂肪酸组成如下：

脂肪酸名称	占总脂比例
		C12:0	0.49%
C12:1	0.89%
		C14:0	8.05%
C16:0	26.06%
		C16:1	1.85%
C18:0	0.49%
		C18:1	0.66%
C22:0	0.35%
		C22:1	0.52%
C23:0	0.57%
		C20:5	2.04%
C22:5	11.02%
		C22:6	37.46%

实施例7：

双长链多不饱和脂肪酸油脂在食品添加剂中的应用

采用实施例3所述培养基培养微藻，经油脂提取和精炼获得富含双长链多不饱和脂肪酸的成品油脂。经分析测定，成品油脂成分如下：

上述油脂通过传统微胶囊技术进行包埋处理，对制得的微囊粉中油脂含量和成分进行测定，结果如下：

油脂含量	EPA	DHA
			36.92%	1.60%	15.43%

微胶囊粉的应用：

从市场选取某品牌的乳品饮料，将所述微囊粉按1%、2%和3%的比例添加到乳品饮料中，均质，微囊粉分散均匀，口感良好。将所述添加微囊粉的乳品饮料经瞬时高温灭菌，灌装于100ml小瓶中，无菌封存，于室温下储存20天。开封后萃取油脂，测定多不饱和脂肪酸的回收率，结果如下：

	EPA回收率	DHA回收率
			1%添加量	85.8%	87.6%
2%添加量	88.3%	87.2%
			3%添加量	82.5%	80.1%

Claims (21)

1.一种含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂，其特征在于该油脂中含有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，其中二十二碳六烯酸与油脂的质量百分比为35%-45%，二十碳五烯酸与油脂的质量百分比为1%-7%。

2.根据权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于包括如下工艺步骤：

A、在一个含有发酵培养基的通气发酵罐中培养裂壶藻CGMCCNo.3636；

B、培养结束后收集藻细胞，从所述的藻细胞中提取回收所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂。

3.根据权利要求2所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基是以有机碳为碳源，以低于碳源浓度的氮源，维生素，无机盐，微量元素或其混合物为补充营养物质配制而成。

4.根据权利要求3所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的碳源的质量百分比浓度为1%-6%，氮源浓度为碳源浓度的0.05-1倍。

5.根据权利要求2所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的步骤A中的培养温度为20-30℃，通气量0.5-1.5vvm，搅拌转速100-500rpm。

6.根据权利要求2所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于当采用连续培养方式时所述的培养连续向通气发酵罐中补给发酵培养基,维持碳源浓度5-20g/L。

7.根据权利要求2所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的培养在间歇发酵方式下当碳源浓度降低至5g/L时补加碳源。

8.根据权利要求2所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的步骤A中的培养是将裂壶藻CGMCCNo.3636原始藻种经活化、扩大培养后制成种子液，将种子液接种至发酵培养基中进行培养。

9.根据权利要求8所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的活化是将固体培养基上保藏的藻种接种至装有培养基的摇瓶中，在温度20-30℃、转速为100-200rpm下培养16-72h。

10.根据权利要求8所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的扩大培养是将活化的藻种按质量百分比为2%-10%的接种量接种到摇瓶扩培培养基中，在温度20-30℃，转速为100-200rpm的条件下培养16-72h后制成种子液。

11.根据权利要求8或9中任一项所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的活化传代培养基采用如下组分组成：

葡萄糖5-15g/L，甘油5-15g/L，胰蛋白胨1-5g/L，酵母提取物1-5g/L,氯化钠15-25g/L,硫酸镁1-5g/L,磷酸二氢钾0.5-5g/L,酒石酸铵0.5-2g/L，氯化钾0.1-1g/L,氯化钙0.01-0.6g/L,硫酸铵0.5-3g/L，碳酸氢钠0.01-0.05g/L，乙二胺四乙酸二钠盐10-60mg/L,氰钴胺素5-50mg/L,硼酸10-35mg/L，氯化锰0.01-1mg/L，三氯化铁0.5-3mg/L，氯化锌0.1-1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5-10mg/L,氯化钴0.01-0.1mg/L，硫酸铜0.01-0.15mg/L，六水合硫酸镍0.1-0.8mg/L，余量为水，pH=6-7。

12.根据权利要求8所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂的制备方法，其特征在于所述的扩培和发酵培养基采用如下组分组成：

葡萄糖20-40g/L，甘油10-30g/L，酵母提取物1-5g/L,大豆蛋白胨1-5g/L，玉米浆1-15g/L，氯化钠15-25g/L,硫酸镁1-5g/L,苹果酸1-5g/L，磷酸二氢钾0.5-5g/L,酒石酸铵0.5-2g/L，氯化钾0.1-1g/L,氯化钙0.01-0.6g/L,硫酸铵0.5-3g/L，碳酸氢钠0.01-0.05g/L，对甲苯甲酸20-200mg/L,乙二胺四乙酸二钠盐10-60mg/L,氰钴胺素5-50mg/L,硼酸10-35mg/L，泛酸0.1-2mg/L，生物素0.1-1mg/L,氯化锰0.01-1mg/L，三氯化铁0.5-3mg/L，氯化锌0.1-1mg/L，氯化3-[（4-氨基-2-甲基-5-嘧啶基）-甲基]-5-（2-羟基乙基）-4-甲基噻唑0.5-10mg/L,氯化钴0.01-0.1mg/L，硫酸铜0.01-0.15mg/L，六水合硫酸镍0.1-0.8mg/L，余量为水，pH=6-7。

13.根据权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备食品添加剂中的应用。

14.根据权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备具有改善心血管功能的保健品中的应用。

15.根据权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备功能食品中的应用。

16.根据权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗心血管系统疾病药物中的应用，其特征在于所述的药品用于口服或注射给药，是药理上可以接受的。

17.根据权利要求16所述的一种含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗心血管系统疾病药物中的应用，其特征在于所述的心血管系统疾病是指高血压、高血脂、高胆固醇、血栓、心率失常、冠心病以及动脉粥样硬化中的一种或其结合。

18.根据权利要求16-17中任一项所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗心血管系统疾病药品中的应用，其特征在于所述的药品用来每天提供200mg-5000mg的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂。

19.如权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗精神性疾病药品中的应用。

20.根据权利要求19所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗精神性疾病药品中的应用，其特征在于所述的精神性疾病是指老年痴呆、躁郁症、抑郁症。

21.如权利要求1所述的含有双长链多不饱和脂肪酸的油脂在制备治疗抗炎药品中的应用。