CN1101034A - 培养海洋微藻及用其生产二十二碳六烯酸的方法 - Google Patents
培养海洋微藻及用其生产二十二碳六烯酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1101034A CN1101034A CN94106621A CN94106621A CN1101034A CN 1101034 A CN1101034 A CN 1101034A CN 94106621 A CN94106621 A CN 94106621A CN 94106621 A CN94106621 A CN 94106621A CN 1101034 A CN1101034 A CN 1101034A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- marine microalgae
- dha
- cultured continuously
- frustule
- crypthecodinium cohnii
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 title description 6
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 claims abstract description 92
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 26
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 claims description 34
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 22
- 239000013543 active substance Substances 0.000 claims description 13
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 13
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N Pyruvic acid Chemical compound CC(=O)C(O)=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC=CC(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 229940107700 pyruvic acid Drugs 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N Triolein Natural products O([C@H](OCC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC)C(=O)CCCCCCC/C=C\CCCCCCCC BAECOWNUKCLBPZ-HIUWNOOHSA-N 0.000 claims description 5
- PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N Trioleoylglycerol Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N triolein Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)COC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PHYFQTYBJUILEZ-IUPFWZBJSA-N 0.000 claims description 5
- 229940117972 triolein Drugs 0.000 claims description 5
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 claims description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims 2
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 abstract 5
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 abstract 5
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 abstract 1
- 230000035943 smell Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- -1 muriate Chemical compound 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 6
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 6
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 5
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003925 brain function Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 3
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 3
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 239000000263 2,3-dihydroxypropyl (Z)-octadec-9-enoate Substances 0.000 description 2
- RZRNAYUHWVFMIP-GDCKJWNLSA-N 3-oleoyl-sn-glycerol Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@H](O)CO RZRNAYUHWVFMIP-GDCKJWNLSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000555825 Clupeidae Species 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- 206010013786 Dry skin Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 2
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- RZRNAYUHWVFMIP-UHFFFAOYSA-N monoelaidin Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO RZRNAYUHWVFMIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 2
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-M 9-cis,12-cis-Octadecadienoate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC([O-])=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-M 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000199913 Crypthecodinium Species 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 241001480508 Entomophthora Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- CGBXSWXZXBQCMR-UHFFFAOYSA-N Glycerol 1-hexadecanoate Chemical compound OCC(O)CO.CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O CGBXSWXZXBQCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206759 Haptophyceae Species 0.000 description 1
- 241000003483 Japonochytrium sp. ATCC 28207 Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 1
- 101100496858 Mus musculus Colec12 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001483078 Phyto Species 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical group C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- 206010039966 Senile dementia Diseases 0.000 description 1
- 241001467333 Thraustochytriaceae Species 0.000 description 1
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 description 1
- 101100020289 Xenopus laevis koza gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000011013 aquamarine Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- GLCGEJFIZRSXBL-UHFFFAOYSA-N dodeca-1,3,5,7,9,11-hexaene Chemical compound C=CC=CC=CC=CC=CC=C GLCGEJFIZRSXBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003322 glomus cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 229940049918 linoleate Drugs 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007087 memory ability Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910017464 nitrogen compound Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002830 nitrogen compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 108010027322 single cell proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001732 thrombotic effect Effects 0.000 description 1
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 1
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 1
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 1
- 239000012745 toughening agent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
- C12N1/125—Unicellular algae isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6436—Fatty acid esters
- C12P7/6445—Glycerides
- C12P7/6472—Glycerides containing polyunsaturated fatty acid [PUFA] residues, i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/89—Algae ; Processes using algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种稳定且低成本生产无鱼腥味的
二十二碳六烯酸的生产方法,其中从经连续液体培养
生产的海洋微藻的细胞中提取二十二碳六烯酸,所述
的连续液体培养方法可以有效地以工业上稳定的高
浓度生产二十二碳六烯酸。特别是,提供培养海洋微
藻的方法,包括在通气和搅拌条件下,在液体培养基
中连续培养海洋微藻,由此生产海洋微藻的藻细胞,
以及生产二十二碳六烯酸的方法,包括从经海洋微藻
生产方法生产的藻细胞中提取二十二碳六烯酸。
Description
本发明涉及生产多不饱和脂肪酸,二十二碳六烯酸(下文称之为“DHA”)的方法,该物质具有显著的生理功能,如降低胆固醇作用,抗凝血功效以及抑制癌功效,和其在改善记忆力及认知能力,防止老年性痴呆症及治疗阿尔兹默疾病等方面的与脑代谢相关的功效,并且它是幼鱼生长所必需的一种脂肪酸。特别是,涉及生产DHA的方法,包括连续有效地大量培养海洋微藻(显微镜下可见形式的海洋藻)并稳定地从上述培养的海洋微藻细胞中低成本生产DHA。
更具体地说,本发明涉及生产海洋微藻的方法,包括在通气和搅拌条件下,通过连续培养所述海洋微藻,来生产海洋微藻藻细胞,并涉及生产DHA的方法,包括在通气和搅拌条件下,连续培养海洋微藻,并从得到的藻细胞中提取DHA。
尽管已经知道鱼油中含有具有多种生理活性功能的DHA,但由于很难从鱼油中将其分离提取,所以其实际应用受到阻碍。近几年来,努力完成了阐述DHA生理活性功能及其实际应用方面的研究,在金枪鱼眼眶内脂肪等各种鱼油中存在高浓度DHA的发现及有效的脂肪酸纯化技术的发展促进了上述研究。
有关DHA的纯化及用途,已经公开了大量的报告,如用于防止并治疗血栓形成的试剂(JP-A-57-183716,本文所用的术语“JP-A”是指未审查的公开的日本专利申请),一种分离并纯化多不饱和脂肪酸或其酯的方法(JP-A-61-37752),一种含有多不饱和脂肪酸的抑制癌的组合物(JP-A-63-258816),一种分离和纯化多不饱和脂肪酸烷基酯的方法(JP-A-63-8356),一种含有二十二碳六烯单甘油酯作为活性组分的抑制癌的试剂(JP-A-1-203322),一种含DHA和其酯作为活性成分的脑功能增强剂(JP-A-1-153629)和一种改善脑功能的组合物,一种提高认知能力的试剂,一种提高记忆力的药剂,一种防止痴呆症的试剂,一种治疗痴呆症的试剂或一种具有改善脑功能的生理功能食品(JP-A-2-49723)。
在大多数情况下,从如金枪鱼、沙丁鱼,狐坚等的鱼油中提取DHA或含DHA的油,但缺点是,由于鱼类的迁栖行动,所述油类不能作为稳定的供应源,由于不容易除去鱼油组合物和鱼油特有的恶臭味,所以很难从其它不饱和脂肪酸中分离DHA。至于从鱼油以外的其它物质中生产DHA或含DHA的油,已经设想了几种方法,如一种方法是用被孢霉属的菌株,通过微生物转化生产多不饱和脂肪酸(JP-A-63-185389),一种方法是用能生产花生四烯酸的微生物生产富集多不饱和脂肪酸的油(JP-A-1-304892),一种方法是从海洋微生物中生产含多不饱和脂肪酸的脂(JP-A-2-142486),一种方法是用刺孢囊霉属的菌株生产多不饱和脂肪酸(JP-A-2-23878),一种方法是从横断刺孢囊霉ATCC 16960和18036的培养混合物中得到多不饱和脂肪酸(EP-A-355972)。还有一些其它的已知方法,其中所用的微生物有细菌(DeLong,E.F.&.Yayanos,A.A.Appl.Environ.Micrbiol,vol,51(4),P.730,1986),真菌破囊壶菌(Thraustochytrium)(Haskins,R.H.等人;Can.J.Microbiol.vol.10,p.187,1964),一种虫霉属真菌(Tyrrell;Can.J.Microbiol.vol.13,p.755,1967),一种Japonochytrium sp.ATCC 28207真菌(JP-A-1-199588)及包括腰鞭毛亚纲和定鞭藻纲的藻类(Joseph,J.D.Lipids,vol.10.p.395,1975;Nichols,P.D.等人,Phyto chemistry,vol.23,p.1043,1984)。然而这些方法是以自然繁殖或简单的稳定培养为基础,没有积极的藻细胞增殖。另外,由于DHA产率低,从工业应用性的观点看,这些方法不如鱼油生产法。
一般知道,在微生物培养方法中,间歇培养和补料间歇培养因二级代谢产物和抑制微生物生长的废物的积累而不能有效地保持高生产率水平,而从生产效率的观点看,由于连续培养能以高水平保持和控制培养基中微生物相的繁殖活性,所以这种培养更有利。可以从有关各种微生物蛋白(单细胞蛋白,SCP)生产方法等的大量报告中,发现连续培养的上述优点。然而,对于海洋微藻来说,在几乎全部情形下,是通过无剪切力的稳定培养来生产,甚至未浓度发展振荡培养方法,这是因为藻细胞对搅拌剪切力的敏感性。基于上述原因,一般认为连续培养不适用于海洋微藻。
关于海洋微藻的振荡培养,到本申请日之前,仅有一篇报告涉及在Crypthecodinium cohnii中DHA形成的环境条件(D.H.Beach等人;Biochimica et Biop hysica Acta,vol,316,pp 56-65,1975)和一本书(David J.Kyle等人;Industrial Application of Single Cell Oils,chapter 16,pp. 287-300,Americal Oil chemist'sSociety,1992),但用这些技术的DHA的生产量对于工业生产来讲太低了。最近,申请了一个关于用Crypthecodinium cohnii MK-8840(ATCC-40750)生产DHA及含它的配合物的发明(WO91/11918),公开了振荡培养海洋微藻的方法。该发明是一种方法,其中限制了对于藻细胞生长所必需的营养以便通过牺牲细胞生长来增加藻细胞中含DHA的成分。但是,由于该方法以耗尽营养成分作为必需的条件,因此,不能将其用以进一步提高藻细胞中含DHA脂为目的的连续培养系统,因此,从工业生产上看,它有一定的不足。结果是,必需要为这些现有技术生产方法的实现,和用这些方法的DHA实际的工业化生产解决大量的技术问题,因此,认为很难有经济效益。
另外,已经有报告说,通过现有技术的连续培养系统,可以改善藻细胞的生产量,但会降低所需产品的含量,并且当使用具有较小特定生长率的微生物时,与间歇培养系统相比,通过连续培养系统产生的二级代谢物造成经济上的损失(P.F.Stanbury and A.Whitaker,Principles of Fermentation Technology;a Japanese version translated by B.Ishizaki and published by Gakkai Shuppan Center,p.238,1988)。
已经知道海洋微藻,Crypthecodinium cohnii,一般通过无性或有性繁殖来进行自身繁殖。
在无性繁殖的情况下,每个滋养体变成一个球细胞,其细胞质重复1到3次的细胞分裂,释放2到8个游动细胞。然后,通过这些游动细胞的细胞分裂使藻细胞的单个数目成倍增加。
在有性繁殖的情况下,另一方面,两个游动细胞作为配子相互结合形成有4个鞭毛的接合子。然后,这些鞭毛消失形成球形接合子,经过减数分裂,每个所得的细胞变成一个滋养体完成其繁殖。
观察这种海洋微藻Crypthecodinium cohnii的无性生活史,本发明人已经分离出一个菌株,它能够仅通过无性繁殖,在一个延长时期具稳定完成其繁殖并发现了该菌株可以稳定繁殖的培养条件。以上述结论为基础,完成了本发明。
尽管DHA有各种生理活性,如抑制癌的功效,但由于其原材料依赖于鱼油,所以其供应和质量还不稳定。另外,为了除去鱼油特殊的臭味,现有技术的方法需要许多纯化步骤和费用。更严重的是,甚至通过这些纯化步骤也不能足以除去鱼油的特殊臭味,因此,显示了该产品的不方便利用性。由于这些技术问题尚未得到解决,所以最终产品很昂贵。
从上文看,提供一种生产方法就成为本发明的一个目的,其中,通过连续培养,可以用工业化方法生产并稳定地供应质量稳定的、代替鱼类的海洋微藻,由此,改善藻细胞中二十二碳六烯酸(DHA)的含量,且藻细胞的生产率比现有技术的方法高出很多,从藻细胞中稳定生产的DHA费用低。
为了克服现有技术中存在的上述问题,本发明人进行了深入的研究并用连续培养代替现有技术的间歇培养成功地生产出高密度的海洋微藻藻细胞,并发现,用该方法可以明显改善藻细胞中的DHA含量。以这些结果为基础,已经完成了本发明的DHA生产方法,其中,回收经连续培养系统生产的藻细胞并直接从细胞或经干燥后,提取并纯化DHA。
特别是,根据本发明,提供一种培养海洋微藻的方法,包括在通气和搅拌条件下,在培养基中连续培养海洋微藻,由此生产海洋微藻藻细胞。
优选地是,海洋微藻是Crypthecodinium cohnii,更优选地是对表面活性剂有抗性的,并且可以承受振荡培养和连续培养。优选地是,用多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸补充培养基。优选地是,在连续培养中使用Crypthecodinium cohnii的无性繁殖期。
本发明的另一目的是提供一种生产DHA的方法,包括从经上述海洋微藻生产方法生产的藻细胞中提取DHA。
本发明的另一目的是提供一种Crypthecodinium cohnii菌株,该菌株能够在通气和搅拌条件下承受连续培养并能生产DHA。
本发明的另一目的是提供一种Crypthecodinium cohnii菌株,该菌株对表面活性剂有抗性并能承受振荡培养和连续培养并能生产DHA。
通过进一步的描述,本发明的其它目的和优点是显而易见的。
在成功地发现并培育了能承受其连续培养的Crypthecodinium cohnii菌株的基础上,完成了本发明。通过从海洋微藻中经重复单细胞分离具有连续培养抗性的藻菌株,以及这些分离物随后的培养适应性,得到了该菌株,所述的藻菌株能够在振荡培养和连续培养条件下生长,曾认为所述的海洋微藻仅适合稳定培养。在上述特有的技术成功的基础上,获得了本发明的功效,所述的技术成功完全不同于现有技术,在重复它们的液体振荡培养后,现有技术会引起藻细胞繁殖能力的降低。
本发明中所用的微生物是能生产DHA的海洋微藻,如Crypthecodinium cohnii等。这些是已知的藻类,并且可以从包括ATCC(美国典型培养物收集中心)的保藏培养机构获得。上述微藻的说明性实例包括Crypthecodinium cohnii ATCC 30021,30543,30556,30571,30572,30575,50051,50053,50055,50056,50058,50060等保藏培养菌株,最佳的是Crypthecodinium cohnii ATCC 30021。
将这些藻菌株经过重复的单细胞分离和培养适应培育出一个能够承受连续培养条件的菌株,并在本发明的方法中使用如此培育的菌株的藻细胞。
为了培育上述菌株,将培养的藻细胞悬浮在1.0%到3.5%的生理盐水中达到102到103个细胞/ml的浓度,分散在含2%到4%重的葡萄糖和0.2%到0.5%重的酵母提取物的琼脂培养基上,然后温育3到4天。
接着,将在琼脂培养基上形成的每个菌落转移到300ml容积的锥形瓶中,该锥形瓶中含有已经用表面活性剂补充到0.01到1.0g/升终浓度的100ml液体培养基(Ⅱ),该培养基含有实施例中所示的组合物。将接种的菌落在150到250rpm的振荡器上,于24到32℃培养2到8天。将所得的培养混合物离心,回收藻细胞,用有机溶剂从回收的细胞中提取DHA以测量每个藻菌株的DHA生产率。
然后,将振荡培养得到的藻细胞悬浮在2%的生理盐水中,并将上述的稳定培养/振动荡培养过程复10到15次。在每个复步骤中,筛选有高生长率、高表面活性剂抗性和高DHA生产率以及能承受振荡培养条件的藻菌株。然后,用含有补充有上述表面活性剂的液体培养基(Ⅱ)的约5升容积的小发酵罐,在28到32℃,培养基PH7.0,搅拌速度200到350rpm,通气率0.2到1.5vvm条件下,将每个筛选的藻菌株经5到10次的重复连续培养。用这种方法,完成具有高生长率、高表面活性剂抗性和高DHA生产率以及能承受振荡培养和连续培养条件的藻菌株的培育。
将通过把约2%重的琼脂加到含2%到4%重葡萄糖及0.2%到0.5%重酵母提取物的生理盐水中而制备的琼脂培养基用于单细胞分离,并将在下列连续培养操作中所用的液体培养基用于培养适应。
在有关培养适应的振荡培养及连续培养中,将表面活性剂或消泡剂加到液体培养基中以达到0.01到1.0g/升的终浓度。
然后,用这样得到的连续培养抗性藻菌株进行连续培养。下面描述连续培养的条件。
可以将任何培养基组合物用于本发明的藻菌株培养,如果它们可以在培养基中适当的进行自身繁殖。
培养基可含有适当的碳源、氮源、无机盐等。可以被本发明的藻类同化的碳源的实例包括有机化合物,如甘油等,碳水化合物如葡萄糖、果糖、半乳糖等以及有机酸如柠檬酸、乙酸等。
另外,将多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸加到液体培养基中可以提高DHA的产量。认为在脲循环中可获得的氨基酸如精氨酸和谷氨酸有利于DHA的产率。将多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸加到液体培养基中的优选量是0.25-10mM。
培养基中用于连续培养的碳源浓度一般优选在0.1%到6.0%重量范围内,最好为0.2%到3.0%重。对于在藻细胞分离回收后,降低需处理的培养基中残余葡萄糖的数量,从而节约葡萄糖的费用,并将DHA产率保持在稳定的水平,上述浓度范围是优选的。
氮源的说明性实例包括通常所用的无机氮化合物,如硫酸铵、硝酸铵等,和有机氮源,如胨、酵母提取物、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米浆等。在培养基中,用于连续培养的氮源浓度可以优选占培养基中所含碳源的1/10到1/5。
关于无机盐,天然海水是最好的,但也可使用各种类型的已知的人造海水,以及各种钠盐、磷酸盐、镁盐、钾盐、硼酸盐、碳酸盐等。
也可以用痕量的重金属盐如铁盐、锰盐、钴盐、锌盐、氯化物、溴化物等。本发明方法所用的无机盐中,也包括这些重金属盐。
说到培养方法,用其无性繁殖,完成Crypthecodinium cohnii的连续培养。用这种方法,藻细胞中DHA的含量明显提高。
无性繁殖的条件是保持生长条件而不是减少生长所需的营养,由于在营养耗尽的条件下可以观察到新鲜水甲藻的有性繁殖[Phycologia,14(1),1-8(1975)]。
由于DHA累积于本发明所用的Crypthecodinium cohnii菌株的藻细胞内,所以通过提高藻细胞的生产率可以增加DHA的生产量。
另外,按下文实施例中所说明的,本发明中所用的海洋微藻Crypthecodinium cohnii,甚至经连续培养,也不降低作为其代谢物的DHA的含量。
为了将藻细胞密度提高到开始连续培养所必需的特定水平(如15g/升),需进行预培养。可以在15到32℃,最好28到32℃,中性培养基PH范围内完成预培养和连续培养。可以根据培养基中剩余的碳源和分泌的物质量确定培养的完成。
通过将培养基糖(葡萄糖)浓度控制在使藻菌株得到适当的特定生长速率的某一水平,优选的是6.0%重或更低的水平,最好是0.2%到3.0%重,完成连续培养。
酵母提取物作为氮源,其用量为葡萄糖浓度的1/5到1/10,并根据将在下文实施例中描述的培养基(Ⅰ)的组合物,使用矿物质。
可以用选自脂肪酸酯、有机硅等的表面活性剂或消泡剂完成连续培养,最好用配有喷雾器和搅拌器的罐发酵器。
表面活性剂或消泡剂的说明性实例包括甘油单脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯,和硅基消泡剂,如甘油单油酸酯,甘油单硬脂酸酯、甘油单棕榈酸酯、甘油单亚油酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、SiliconKM-75等。
优选的,在培养基中所用的表面活性剂或消泡剂的量为0.01到1.0g/升,以防止泡沫而不损害藻细胞的DHA生产量。
按照本发明的连续培养,将罐发酵器或大的罐作为培养容器,当藻细胞密度达到预先确定的水平时,将新鲜的培养基连续加到容器中,同时以与培养基添加速率相同的速率回收培养的培养基。通过离心、过滤或类似的方法从回收的培养培养基中收集由此繁殖的藻细胞。
有关供应培养基的稀释速率,可以以0.25hr-1或更低,但最好是0.1到0.2hr-1的液体体积速率有效地进行连续培养,以得到最大的生产量。如果速率大于0.25hr-1,会冲掉培养基并破坏连续培养的稳定操作,因为它高于Crypthecodiniumcohnii无性繁殖的特定生长速度。
尽管在连续培养操作期间,可以将稀释速率保持在一个稳定的水平,但最好逐渐增加稀释速率,如以10小时的间隔。
优选的是,以26到30℃,0.2到1.0vvm的通气速度,若使用高速搅拌机时,以高速搅拌机顶端外周速度为50到250cm/秒,进行连续培养。
通过添加新鲜的培养基并将上述培养条件保持在一个恒定的水平,从而有效进行连续培养。
对于连续添加的培养基,可以用实施例中所示的用葡萄糖和酵母提取物补充的培养基(Ⅲ)。
通过使用一般的离心、过滤等方法,例如在10℃,以8000xg离心10分钟,可以完成从流出的培养基中回收藻细胞。将由此回收的藻细胞用于DHA的提取,如此或经冻干或加热及通气方法干燥后进行提取。
优选的是在有脂肪酸氧化抑制剂,如α一生育酚存在或在惰性气体如氮气中,进行从藻细胞中提取和纯化DHA。实施例中所示的提取方法中,使用有机溶剂系统如甲醇/氯仿,Folch、Lees和Stanley的纯化方法也有用。可以通过各种类型的柱层析或再结晶,将由此部分纯化的产物进一步纯化。
实施例
用下面的实施例进一步说明本发明。但应理解,这些实施例仅起说明的目的,而不作为限制本发明的界限。
下面是在有创新力及比较的实施例中所用的培养基组合物和海水。
培养基(Ⅰ)(Aquamarine,由YaesuYakuhin制造)
MgSO4.6H2O 11.11g KBr 0.10g
Cacl2.2H2O 1.54g H3BO30.03g
Srcl3.6H2O 0.04g NaF 0.003g
Kcl 0.69g Nacl 24.53g
NaHCO30.20g Na2SO44.09g
蒸馏水1.0升。
PH7.0(用1N Hcl调整)
培养基(Ⅱ)
用2%(V/V)葡萄糖和0.2%(V/V)酵母提取物补充的改良培养基(Ⅰ)
培养基(Ⅲ)
用24%(V/V)葡萄糖和2.4%(V/V)酵母提取物补充的改良培养基(Ⅰ)
培养基(Ⅳ)
用0.5g/l的表面活性剂补充的改良培养基(Ⅱ)
日本Kawasaki-cho、Chuoh-Ku、Chiba-shi海边的
海水
有创新力的实施例1
将Crypthecodinium cohnii ATCC 30021的细胞悬浮在2%的生理盐水中,达到102到103个细胞/ml的密度,分散在含2%(重)葡萄糖和0.2%(重)酵母提取物的琼脂培养基上,然后在28℃温育4天。
接着,将在琼脂培养基上由此形成的每个菌落转移到含100ml培养基(Ⅳ)的300ml容积锥形瓶中,所述的培养基(Ⅳ)是由用表面活性剂补充的液体培养基(Ⅱ),达到0.5g/升的终浓度而制备的。将由此接种的菌落在180rpm的摇床上于28℃培养5天。使所得的培养混合物经离心回收藻细胞,用有机溶剂从回收的藻细胞中提取DHA以测量每个藻菌株的DHA生产量。用这种方法,筛选具有高DHA生产量的藻菌株。
然后,将由此筛选的藻菌株的细胞悬浮于2%生理盐水中,并将上文的稳定培养/振荡培养过程重复12次。在每个重复步骤,筛选表现高生长率、高表面活性剂抗性和高DHA生产量以及能承受振荡培养条件的藻菌株。然后,用含下列液体培养基(Ⅳ)的5升容积的小罐发酵器,在28℃,培养基PH7.0,300rpm的搅拌速度,0.3vvm的通气率,将上述筛选的每个藻菌株经过7次重复的连续培养。用这种方法,完成培育,得到具有高生长率,高表面活性剂抗性和高DHA生产量并能承受振荡和连续培养条件的藻菌株。将上述得到的连续培养抗性菌株在上述所述菌株能够重复其无性繁殖的条件下,用于下列培养步骤。
为了用于下列的培养实验,通过用2%(V/V)葡萄糖和0.2%(V/V)酵母提取物补充培养基(Ⅰ)的组合物,并将所得的混合物在120℃于高压灭菌锅中灭菌15分钟,从而制备培养基(Ⅱ)。
将一满环的Crypthecodinium cohnii ATCC30021的细胞接种到起始PH为5.5到7.5的100ml培养基(Ⅱ)中以在28℃完成为期7天的稳定培养。(下文将由此得到的藻细胞称为“稳定培养藻细胞”。)
将10ml由此得到的培养培养基接种到5个烧瓶(300ml容积)中的每个含100ml培养基(Ⅱ)(PH6.8)的瓶中,并在180rpm的旋转摇床上于28℃培养5天。(下文将由此得到的藻细胞称为“振荡培养藻细胞”。)
将5个烧瓶中所得的培养液(500ml)混合起来,并将其作为种培养物接种到含7升培养基(Ⅱ)(PH7.0)的10升容积的罐发酵器以在28℃、300rpm的搅拌速度和0.3vvm的通气率完成罐发酵。在这种情况下,将0.75g的脂肪酸酯基表面活性剂,甘油单油酸酯用作消泡剂。
在罐发酵开始后,收集样品,在105℃干燥5小时以测量藻细胞密度。当藻细胞的密度达到5g/升时,在与上述罐发酵相同的培养条件下,通过以0.1hr-1的稀释速率连续补充培养基(Ⅲ),从而开始连续培养。连续补料开始后,通过从0.1hr-1的起始速率到0.12,到0.14然后到0.16hr-1逐步增加稀释速率,完成为期3天的连续培养,细微调整稀释速率是为了将培养基葡萄糖浓度保持在0.5%到3.0%(重)的范围内。连续培养开始后,在培养培养基中未发现一个有复鞭毛的藻细胞。(下文将由此得到的藻细胞称为“连续培养藻细胞”。)
将从罐发酵器中流出的培养培养基于10℃以8000xg离心15分钟,以回收随后经冻干的藻细胞。
将部分培养培养基在105℃干燥5小时以找出一个产率为15.0g/升的干燥藻细胞和一个生产量为1.8g/hr/l的干燥藻细胞。
按一般使用的Bligh-Dyer提取法[Shin Seikagaku Jikken Koza(A New Course of Biochemical Experiments),vol,4Lipid-Ⅱ,P.9,1991,Tokyo Kagaku Dojin]从上述冻干藻细胞中提到并纯化DHA,其中,用5体积甲醇/氯仿(1/2)与藻细胞混合,并用搅切器处理。
将由此部分纯化的产品经甲基酯化作用(上一段落所描述的出版物,P.54)以便用DHA原样品通过气相层析分析确定其数量。
同样,用常规方法,通过液体层析(柱,ODS;流动相,甲醇∶水=95∶5;流速,1.0ml/min;检测,RI)完成DHA分离以得到纯度为99.2%的DHA,且发现其生产量为0.12g/l/hr。
经气相层析确定的藻细胞中的脂肪酸组成如下。
藻细胞
脂肪酸培养 稳定培养 振荡培养 连续
C12:0 33.4% 5.7% 3.0%
C14:0 40.2% 27.5% 16.2%
C16:0 10.9% 22.7% 23.7%
C18:0 0.9% 1.6% 1.8%
C18:1 3.3% 8.0% 9.1%
C22:6(DHA) 11.3% 34.5% 45.2%
总量 100.0% 100.0% 100.0%
有创新的实施例2
在与有创新的实施例1中的描述相同的条件下,培养海洋微藻Crypthecodinium cohnii的每个下述ATCC菌株。按照藻细胞产率和每小时DHA的产率在表1列出了结果(ATCC 30021,连续培养3天;其它菌株,连续培养1天)。
表1 Crypthecodinium cohnii连续培养的结果
C.cohniiATCC号 | 生产量 | C.cohniiATCC号 | 生产量 | ||
干细胞(g/hr/l) | DHA(g/hr/l) | 干细胞(g/hr/l) | DHA(g/hr/l) | ||
300213054330556305713057230775 | 1.800.840.780.840.720.66 | 0.120.050.040.050.040.04 | 500515005350055500565005850060 | 0.840.840.720.660.720.78 | 0.040.050.040.040.040.04 |
比较实施例1(补料间歇培养)
用Crypthecodinium cohniiATCC 30021作为试验菌株,在与有创新的实施例1中的描述相同的条件,完成稳定培养和振荡培养,将由此得到的500ml培养培养基作为菌种,接种到含7升培养基(Ⅱ)的10升容积的罐发酵器中。
首先,在28℃,培养基PH6.8,搅拌速度300rpm及0.3vvm的通气速率,用上述接种的罐发酵器进行间歇培养直到藻细胞密度(干细胞)达到5g/l。然后,通过在间歇培养开始后的60,80,100小时,无菌添加作为碳源的葡萄糖、作为氮源的酵母提取物和矿物质,由此补充占总量10%(重)的碳源、相当量的氮源10%(重)和培养基(Ⅰ)的各矿物质浓度,从而完成补料间歇培养。在补料间歇培养过程中,将培养基温度保持在恒定的28℃,但在间歇培养开始后60小时,将搅拌速度逐步从300rpm提高到315rpm,80小时后,达到330rpm,100小时后,到350rpm。以同样的方式,60小时后,将通气速率逐步从0.3vvm提高0.35vvm,80小时后达到0.4vvm,100小时后,达到0.5vvm。作为消泡剂,需要时,加入2.25g(总量)脱水山梨醇脂肪酸酯。培养120小时后,得到每升26.3g的干燥藻细胞。在最终得到的培养培养基中,发现藻细胞各有一个复鞭毛。
按与有创新实施例1中的描述相同的方法,完成从所得的干燥藻细胞中提取并纯化DHA以得到每升1.15g的DHA。干燥藻细胞和DHA的生产量分别为0.21g/hr/l和9.58mg/hr/l。
比较实施例2
按与有创新的实施例1中的描述相同的方法,间歇培养比较实施例1中得到的藻菌种,并且,当藻细胞密度达到干细胞为15g/l时以0.35hr-1的稀释速率开始连续培养基补料。然而,具有稳定细胞密度的连续培养仅持续12小时,因为藻细胞的生长率与培养基的补料速率不相匹配。
比较实施例3
用下列Crypthecodinium cohnii的各ATCC菌株重复比较实施例1的补料间歇培养,结果列于表2。
表2Crypthecodinium cohnii补料间歇培养的结果
C.cohniiATCC号 | 生产量 | C.cohniiATCC号 | 生产量 | ||
干细胞(g/hr/l) | DHA(g/hr/l) | 干细胞(g/hr/l) | DHA(g/hr/l) | ||
300213054330556305713057230775 | 0.210.190.160.180.190.19 | 0.010.0090.0080.0090.010.009 | 500515005350055500565005850060 | 0.210.180.190.160.190.21 | 0.010.0080.0080.0080.0090.01 |
有创新的实施例3
用Crypthecodinium cohnii ATCC 30021,在与有创新的实施例2中描述的相同的条件下,除另外还用0.267mM的精氨酸补充培养基外,完成连续培养。结果,得到0.16g/l的DHA生产量。
有创新的实施例4
在与有创新的实施例3中所描述的相同的培养条件下,除另外还用4.56g/l的甘油补充培养基外,完成连续培养。结果,得到0.12g/l的DHA生产量。
有创新的实施例5
在与有创新的实施例3中所描述的相同的培养条件下,除还用5.0g/l的丙酮酸补充培养基外,完成连续培养。结果,得到0.14g/l的DHA生产量。
因此,按上文所述,按照本发明的生产方法,通过从经连续液体培养方法生产的海洋微藻细胞中提取DHA,可以以低成本稳定地提供没有鱼腥味的DHA,所述的连续液体培养方法可以有效地生产具有工业上稳定的高DHA含量的高密度藻细胞,而现有技术中DHA生产是依赖于从鱼油如,金枪鱼、沙丁鱼等中提取,由于是天然产品,其生产量和质量不稳定很大程度上取决于捕鱼季节和区域。
Claims (12)
1、一种培养海洋微藻的方法,包括在通气和搅拌条件下,在液体培养基中连续培养海洋微藻,由此生产所述的海洋微藻藻细胞。
2、根据权利要求1的海洋微藻生产方法,其中所述的海洋微藻是Crypthecodinium cohnii。
3、根据权利要求2的海洋微藻生产方法,其中所述的Crypthecodinium cohnii是表面活性剂抗性的,并能承受振荡培养和连续培养条件。
4、根据权利要求1到3的任一海洋微藻生产方法,其中所述的液体培养基用多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸补充的。
5、根据权利要求2到4的任一海洋微藻生产方法,其中使用Crypthecodinium cohnii的无性繁殖阶段。
6、一种生产二十二碳六烯酸的方法,包括在通气和搅拌条件下,在液体培养基中连续培养海洋微藻,并从所述海洋微藻所得的藻细胞中提取二十二碳六烯酸。
7、根据权利要求6的二十二碳六烯酸的生产方法,其中所述的海洋微藻是Crypthecodinium cohnii。
8、根据权利要求7的二十二碳六烯酸的生产方法,其中所述的Crypthecodinium cohnii是表面活性剂抗性的并能承受振荡培养和连续培养条件。
9、根据权利要求6到8的任一二十二碳六烯酸的生产方法,其中所述的液体培养基用多元醇、丙酮酸、三油酸甘油酯和/或氨基酸补充。
10、根据权利要求7到9的任一二十二碳六烯酸的生产方法,其中使用Crypthecodinium cohnii的无性繁殖阶段。
11、一种能承受通气和搅拌连续培养条件并能生产二十二碳六烯酸的Crypthecodinium cohnii菌株。
12、一种对表面活性剂有抗性并能承受振荡培养和连续培养条件且能生产二十二碳六烯酸的Crypthecodinium cohnii菌株。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP99656/93 | 1993-04-26 | ||
JP9965693 | 1993-04-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1101034A true CN1101034A (zh) | 1995-04-05 |
Family
ID=14253101
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN94106621A Pending CN1101034A (zh) | 1993-04-26 | 1994-04-26 | 培养海洋微藻及用其生产二十二碳六烯酸的方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0622463A3 (zh) |
CN (1) | CN1101034A (zh) |
CA (1) | CA2121986A1 (zh) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN100384980C (zh) * | 2005-02-28 | 2008-04-30 | 山东大学威海分校 | 海洋微藻的培养方法 |
CN101168501B (zh) * | 2007-07-11 | 2010-04-07 | 南京工业大学 | 一种从隐甲藻中提取并精制富含dha脂肪酸的工艺 |
CN101591617B (zh) * | 2009-06-15 | 2011-03-23 | 南京工业大学 | 一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用 |
CN104017734A (zh) * | 1996-03-28 | 2014-09-03 | Dsmip资产有限公司 | 粒状微生物生物质的制备及其有价值的化合物的分离方法 |
CN104304843A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-01-28 | 山东禹王制药有限公司 | 一种鳀鱼鱼油微生物发酵脱腥的方法 |
CN101463371B (zh) * | 2000-01-19 | 2016-12-14 | Dsm Ip资产公司 | 无溶剂的提取方法 |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE446101T1 (de) * | 1993-06-09 | 2009-11-15 | Martek Biosciences Corp | Verwendung von docosahexaensäure zur herstellung eines arzneimittels zur behandlung der senilen demenz und alzheimer-erkrankung |
RU2346033C2 (ru) * | 2003-09-01 | 2009-02-10 | Новозимс А/С | Способ непрерывного культивирования водорослей |
GB201300354D0 (en) | 2013-01-09 | 2013-02-20 | Basf Pharma Callanish Ltd | Multi-step separation process |
FR3025215A1 (fr) | 2014-08-27 | 2016-03-04 | Fermentalg | Nouveau procede de culture de microalgues |
CN104292097B (zh) * | 2014-10-10 | 2016-01-06 | 内蒙古农业大学 | 羊脑萃取制食品级dha的方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4253271A (en) * | 1978-12-28 | 1981-03-03 | Battelle Memorial Institute | Mass algal culture system |
US5407957A (en) * | 1990-02-13 | 1995-04-18 | Martek Corporation | Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates |
EP0657543A4 (en) * | 1992-03-31 | 1997-01-02 | Kawasaki Steel Co | METHOD FOR PRODUCING DECOSAHEXAIC ACID. |
-
1994
- 1994-04-22 CA CA002121986A patent/CA2121986A1/en not_active Abandoned
- 1994-04-25 EP EP94302946A patent/EP0622463A3/en not_active Withdrawn
- 1994-04-26 CN CN94106621A patent/CN1101034A/zh active Pending
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104017734A (zh) * | 1996-03-28 | 2014-09-03 | Dsmip资产有限公司 | 粒状微生物生物质的制备及其有价值的化合物的分离方法 |
CN101463371B (zh) * | 2000-01-19 | 2016-12-14 | Dsm Ip资产公司 | 无溶剂的提取方法 |
CN100384980C (zh) * | 2005-02-28 | 2008-04-30 | 山东大学威海分校 | 海洋微藻的培养方法 |
CN101168501B (zh) * | 2007-07-11 | 2010-04-07 | 南京工业大学 | 一种从隐甲藻中提取并精制富含dha脂肪酸的工艺 |
CN101591617B (zh) * | 2009-06-15 | 2011-03-23 | 南京工业大学 | 一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和其应用 |
CN104304843A (zh) * | 2014-10-22 | 2015-01-28 | 山东禹王制药有限公司 | 一种鳀鱼鱼油微生物发酵脱腥的方法 |
CN104304843B (zh) * | 2014-10-22 | 2017-08-15 | 山东禹王制药有限公司 | 一种鳀鱼鱼油微生物发酵脱腥的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0622463A2 (en) | 1994-11-02 |
CA2121986A1 (en) | 1994-10-27 |
EP0622463A3 (en) | 1996-10-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3669372B2 (ja) | ω―3高度不飽和脂肪酸を高濃度で含む微生物産物のヘテロトロピックな製造方法 | |
CN1264967C (zh) | 海洋真菌裂殖壶菌ouc88的工业应用 | |
KR101238613B1 (ko) | 트라우스토키트리알레스 목의 미생물을 최적화된 저염 배지를 이용하여 배양하는 방법 | |
CN1890376A (zh) | 使用改进量的氯和钾在微藻类中产生高水平的dha | |
US6410282B1 (en) | Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi | |
JP3425622B2 (ja) | ラビリンチュラ属菌を用いた高度不飽和脂肪酸含有培養物および高度不飽和脂肪酸含有油脂の製造方法 | |
CN108034680A (zh) | 发酵生产二十二碳六烯酸的改进方法 | |
CN1101034A (zh) | 培养海洋微藻及用其生产二十二碳六烯酸的方法 | |
CN1914327A (zh) | 培养Thraustochytriales属微生物的方法 | |
KR101521274B1 (ko) | 신규 미세조류 오란티오키트리움(Aurantiochytrium sp.) LA3(KCTC12685BP) 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법 | |
AU2003226626B2 (en) | A method for enhancing levels of Polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists | |
CN1358839A (zh) | 利用海洋微藻异养培养生产长链多不饱和脂肪酸 | |
KR20060019507A (ko) | 트라우스토키트리드 원생생물내 고도불포화지방산의 레벨을증가시키는 방법 | |
EP1276891B1 (en) | A method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrids | |
KR101541521B1 (ko) | 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산 생산방법 | |
CN1033042C (zh) | 新的小球藻的生产方法 | |
JPH078268A (ja) | 海洋性微細藻類の培養方法およびこれを用いたドコサヘキサエン酸の製造方法 | |
EP0657543A1 (en) | Process for producing docosahexaenoic acid | |
TWI842054B (zh) | 易於萃取細胞中之油的新穎裂殖壺菌屬物種(Schizochytrium sp.)品系及使用其生產含ω-3之油的方法 | |
KR20230066973A (ko) | 세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법 | |
KR20230066972A (ko) | 세포 내 오일 추출이 용이한 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법 | |
JPH07147907A (ja) | 稚魚用生物飼料およびその製造方法 | |
JPH0965871A (ja) | 海洋性微細藻類の培養方法 | |
KR20240094204A (ko) | 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가-3를 함유한 오일 생산방법 | |
PL243222B1 (pl) | Sposób wytwarzania oleju mikrobiologicznego z hodowli mikroorganizmów olejogennych |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |