CN110699393B - 一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品 - Google Patents

一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品，所述方法利用裂殖壶菌在添加有菜籽粕的发酵液中进行发酵，得到多不饱和脂肪酸。本发明创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替酵母浸膏等传统培养基成分，利用其对裂殖壶菌进行发酵生产多不饱和脂肪酸，不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分高效的利用，使多不饱和脂肪酸的制造成本降低，提高了多不饱和脂肪酸的生产水平及产品品质，也给多不饱和脂肪酸的生产制造提供了新的策略。

Description

一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品。
背景技术
菜籽粕是油菜籽榨油后的副产物，是非常良好的蛋白来源之一，我国油菜籽产量居世界第一，油菜籽经加工可得约65％油粕，菜籽制油后所产生菜籽粕高达858万吨，产量巨大。目前菜籽粕主要用于植物肥料或按少量比例添加作反刍动物或淡水鱼养殖饲料，如中国专利CN101715875、CN101491289A等，其应用具有较大的局限性，这主要源于普通菜籽粕中含有较多的抗营养因子、蛋白质变性严重，影响其使用效果。
目前已有利用微生物发酵菜籽饼粕的相关报道，能够在降低抗营养因子的同时提高相对蛋白含量，如CN101434982B公开了一种微生物固态发酵制备菜籽活性肽的方法，将通过压榨或浸出制油工艺得到的菜籽粕粉碎，以具有产蛋白酶能力的单一菌种接入粉碎的菜籽粕进行固态发酵；加水提取固态发酵后的培养基，分离去除残渣，得到菜籽活性肽，是一种低成本、适合工业化大批量制备菜籽活性肽的方法。如CN101492708A公开了一种混菌固态发酵制备生物活性专一的菜籽肽的方法，采用枯草芽孢杆菌、乳酸菌或产朊假丝酵母之一与雅致放射毛霉或宇佐美曲霉复配，制备发酵剂；将该发酵剂接种于粉碎的菜籽粕，进行固态发酵；提取固态发酵后的培养基，得到菜籽肽。上述现有技术提供了提升菜籽粕价值的行之有效的手段，但大多数为固态发酵获得的是菜籽粕的发酵产物。
DHA是一种对人体非常重要的多不饱和脂肪酸，是Omega-3不饱和脂肪酸家族中的重要成员，可通过微藻发酵获得。DHA是神经系统细胞生长及维持的必要因素，是大脑和视网膜的重要构成成分，约占眼睛视网膜脂质的50％，而在人体大脑皮层中含量也高达20％，可见DHA对胎婴儿智力和视力发育至关重要。大量研究证明DHA不但对脑神经传导和突触的生长发育极为有利，而且能阻止胆固醇在血管壁上的沉积、预防或减轻动脉粥样硬化和冠心病的发生。DHA已经被广泛应用于人类营养领域，拥有广阔的市场空间，目前也已有一些关于制备DHA的报道。目前藻类发酵为生产DHA多不饱和脂肪酸油脂的主要途径之一。
CN103937843A公开了一种利用混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，是一种利用葡萄糖和甘油混合碳源发酵裂殖壶菌生产DHA的方法，该方法既吸收了葡萄糖单一碳源发酵时菌体生长速度快、总脂含量高的优点，又具有甘油单一碳源发酵时DHA含量高的特征；提高了底物利用率，提高了DHA发酵水平，同时保证了较高的藻油品质，十分有利于促进裂殖壶菌发酵生产DHA的产业化发展。
CN104450809A公开了一种促进裂殖壶菌油脂中二十二碳六烯酸合成的方法，该方法通过添加外源调控因子对三羧酸转运体系中的苹果酸酶的活性进行抑制，使裂殖壶菌体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)含量大幅下降，促进DHA的大量合成，所述外源调控因子为芝麻酚。该方法还可以通过选择发酵碳源，使菌体内的磷酸戊糖途径代谢通量降低，使裂殖壶菌体内NADPH含量大幅下降，促进DHA的大量合成，可大幅提高菌体油脂中DHA含量，且易于工业化应用。
目前，由于DHA的制造成本还远高于植物油，还无法普及到全体国民，因此开发出一种质优价廉的制备DHA的方法是非常有意义的。
现有技术中还没有将菜籽粕应用于裂殖壶菌的发酵技术中，对于裂殖壶菌是否能够利用菜籽粕进行正常的生长代谢处于未知状态，本申请中对于菜籽粕这一新的应用领域进行探索。
发明内容
菜籽粕目前的应用比较有限，一是由于菜籽粕中纤维素的含量较高，影响了微生物对于蛋白质的利用；二是由于由于菜籽粕中含有约为2.2％-4.4％的植酸成分，植酸具有很强的螯合阳离子作用，能与金属离子铁、锌、钙、镁、钾等元素以及一些蛋白质形成络合物，大大降低这些元素的生物利用率和蛋白质的生物学效价；另外菜籽粕中含有的硫甙、酚类物质对于微生物的发酵有不利影响。
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品。该制备方法创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替酵母浸膏等传统培养组分，利用其对裂殖壶菌进行发酵生产多不饱和脂肪酸，不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分的利用，使多不饱和脂肪酸的制造成本降低，也给多不饱和脂肪酸的生产制造提供了新的策略。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法利用裂殖壶菌在添加有菜籽粕的发酵液中进行发酵，得到多不饱和脂肪酸。
现有技术中常用的发酵有机氮源主要为酵母浸膏，碳源为葡萄糖，而本发明创造性地将量大质优价廉的菜籽粕代替酵母浸膏等传统培养组分，利用其对裂殖壶菌进行发酵生产多不饱和脂肪酸，不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分高效的利用，使多不饱和脂肪酸的制造成本降低，提高了多不饱和脂肪酸的生产水平及产品品质，也给多不饱和脂肪酸的生产制造提供了新的策略。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)将裂殖壶菌在添加有菜籽粕的活化培养基中进行活化培养，得到活化培养液；
(2)将步骤(1)得到的活化培养液在添加有菜籽粕的扩大培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
(3)将步骤(2)得到的扩大培养液在添加有菜籽粕的发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
(4)将步骤(3)得到的发酵液经破壁、萃取、脱溶处理，得到所述多不饱和脂肪酸。
优选地，所述菜籽粕为经过酶水解预处理得到的菜籽粕。
菜籽粕是一种廉价优良的天然植物蛋白资源，必需氨基酸含量较高，将其进行酶解后产生具有生理活性肽类的可能性较大，因此本发明提供的一种优选技术方案是将菜籽粕进行发酵处理前先经过酶水解预处理。
优选地，所述酶为蛋白酶，蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶或酸性蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合，优选中性蛋白酶。所述至少两种的组合例如碱性蛋白酶和酸性蛋白酶的组合、中性蛋白酶和酸性蛋白酶的组合、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的组合等，其他任意可行的组合方式便不在此一一赘述。
优选地，所述中性蛋白酶的添加量按每克菜籽粕计算为1500-4500U/g，例如1500U/g、2000U/g、2500U/g、3000U/g、3500U/g、4000U/g或4500U/g等。
优选地，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的pH值为6-7.5，例如pH＝6、pH＝6.5、pH＝7或pH＝7.5等。
优选地，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的温度为30-50℃，例如30℃、35℃、40℃、45℃或50℃等。
优选地，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的时间为1-4h，例如1h、2h、3h或4h等。
优选地，在经过蛋白酶水解预处理之前，采用纤维素酶和/或木聚糖酶进行初步水解，优选纤维素酶。
优选地，木聚糖酶的添加量按每克菜籽粕计算为10-450U/g，最适温度为35-50℃、最适pH为4.5-5.5。
优选地，所述纤维素酶水解菜籽粕的温度为40-60℃，例如40℃、45℃、48℃、50℃、55℃或60℃等。
优选地，所述纤维素酶水解菜籽粕的pH值为3.5-6.0，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0等。
优选地，所述纤维素酶水解菜籽粕的时间为1-2h，例如1h、1.2h、1.5h、1.8h或2h等。
优选地，所述纤维素酶的添加量按每克菜籽粕计算，为10-300U/g，例如10U/g、20U/g、50U/g、80U/g、100U/g、150U/g、180U/g、200U/g、250U/g或300U/g等，优选10-150U/g。
优选地，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不小于10％，例如10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％等。
优选地，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不少于18％。
所述小肽是指分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白。小肽与菜籽粕中的粗蛋白相比更容易被裂殖壶菌所利用。
进行酶解时所限定的上述温度、pH值、时间和添加量都是影响蛋白酶解效果的重要因素，只有在上述数值范围的配合下，才能使蛋白酶解的处理效果更佳，最终使得发酵制备多不饱和脂肪酸的含量更高。
优选地，所述菜籽粕为经过植酸酶水解处理的菜籽粕。
由于菜籽粕中除了菜籽蛋白和丰富的必须氨基酸使其能够作为氮源外，还有硫甙、植酸、单宁、多酚等成分，而其中的植酸含量约为2.2％-4.4％，植酸具有很强的螯合阳离子作用，能与金属离子铁、锌、钙、镁、钾等元素以及一些蛋白质形成络合物，大大降低这些元素的生物利用率和蛋白质的生物学效价，特别是裂殖壶菌来源于海水，海水中有大量钙、镁等离子，使得裂殖壶的培养基中也需要大量的金属离子成分，因此菜籽粕中的植酸对于裂殖壶菌的生长代谢会产生严重影响，所以此处提供的一种优选方案是在菜籽粕进行发酵处理前尽量降低菜籽粕中的植酸含量，以促进裂殖壶菌的利用。
优选地，所述水解的温度为40-60℃，例如40℃、45℃、48℃、50℃、55℃或60℃等。
优选地，所述水解的pH值为3.5-6.0，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5或6.0等。
优选地，所述水解的时间为1-3.5h，例如1h、1.2h、1.5h、1.7h、1.8h、2h、3h或3.5h等。
优选地，水解时间为1-2h。
优选地，所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，为2-35U/g，例如2U/g、3U/g、5U/g、10U/g、15U/g、20U/g、25U/g、30U/g或35U/g等，优选5-20U/g。
优选地，所述植酸酶的处理可与纤维素酶的水解处理同时进行。优选地，所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，为5-20U/g；所述纤维素酶添加量按每克菜籽粕计算，为10-150U/g；所述水解反应pH值为3.5-6.0；所述水解的温度为40-60℃；所述水解时间为1-2h。
本发明意外地发现使用纤维素酶和植酸酶同时预处理菜籽粕时会对植酸的降解起到更显著的作用，即纤维素酶和植酸酶产生了协同作用，具体表现为，相同条件下能够使菜籽粕中植酸的含量下降更快，还能够促进蛋白酶水解后的小肽含量更高，且当纤维素酶的添加量在10-150U/g，植酸酶的添加量为5-20U/g时，具有最佳的协同效果。
植酸酶进行水解时所限定的上述温度、pH值、时间和添加量都是影响植酸水解效果的重要因素，只有在上述数值范围的配合下，才能使植酸的处理效果更佳，最终使得发酵制备多不饱和脂肪酸的含量更高。
在部分优选的实施例中植酸酶和纤维素酶共同添加的水解条件为pH＝3.5-6，温度为40-60℃，水解时间为1-2h。
另外，降低菜籽粕中植酸含量的方式还可以是：在酸性(pH＝4.0)的条件下对植酸进行萃取；或在萃取之前加EDTA、氯化钠或氯化钙破坏蛋白质和植酸间的络合以进一步降低植酸的含量。
优选地，不同的酶水解步骤间可用pH调节剂如盐酸、氢氧化钠、柠檬酸等将pH调至合适条件。优选地，酶处理过程中可进行搅拌操作。
优选地，酶处理的体系固液比控制在6-30％(w/v)，为了突显发明点，本发明实施例中的固液比为20％。
水解完成后的菜籽粕经过干燥即可进行进一步应用，也可以直接将定量的水解液投入发酵培养中使用。
当然，本发明还可以采取一些其他处理手段去除菜籽粕中其他的非有利成分，例如用活性炭吸附去硫甙、醇洗沉淀除酚等。
在本发明中，步骤(1)所述活化培养的方法为：将裂殖壶菌菌株接种于活化培养基中培养。
优选地，所述活化培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、菜籽粕、氯化钠和硫酸镁。
优选地，所述菜籽粕的浓度为10-20g/L。
优选地，所述活化培养基包括葡萄糖15-25g/L、谷氨酸钠20-30g/L、菜籽粕10-20g/L、氯化钠5-15g/L和硫酸镁0.2-0.8g/L。
所述在进行活化培养时菜籽粕的浓度需要特定选择在10-20g/L范围内，低于此浓度，氮源不足，限制菌体生长，生物量偏低，限制了后续的产物总量。高于此浓度，氮源过量，抑制菌体代谢，降低了细胞产物积累能力。
所述葡萄糖的浓度可以为15g/L、16g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/L、24g/L或25g/L等。
所述谷氨酸钠的浓度可以为20g/L、21g/L、22g/L、24g/L、25g/L、26g/L、28g/L、29g/L或30g/L等。
所述菜籽粕的浓度可以为10g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L或20g/L等。
所述氯化钠的浓度可以为5g/L、6g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L等。
所述硫酸镁的浓度可以为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L或0.8g/L等。
优选地，所述活化培养的温度为25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述活化培养的时间为35-45h，例如35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h或45h等。
优选地，所述活化培养可以选择在摇床振摇下进行，转速为100-200r/min，例如100r/min、120r/min、150r/min、160r/min、180r/min或200r/min等。
在本发明中，步骤(2)所述扩大培养的方法为：将步骤(1)得到的活化培养液接种于扩大培养基中培养。
优选地，所述扩大培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、菜籽粕、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙。
优选地，所述菜籽粕的浓度为10-20g/L。
优选地，所述扩大培养基包括葡萄糖35-45g/L、谷氨酸钠20-30g/L、菜籽粕10-20g/L、氯化钠5-15g/L、硫酸镁2-8g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L和氯化钙0.2-0.8g/L。
所述葡萄糖的浓度可以为35g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、44g/L或45g/L等。
所述谷氨酸钠的浓度可以为20g/L、21g/L、22g/L、24g/L、25g/L、26g/L、28g/L、29g/L或30g/L等。
所述菜籽粕的浓度可以为10g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L或20g/L等。
所述氯化钠的浓度可以为5g/L、6g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L等。
所述硫酸镁的浓度可以为2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L或8g/L等。
所述磷酸二氢钾的浓度可以为0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.5g/L或2g/L等。
所述氯化钙的浓度可以为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L或0.8g/L等。
优选地，所述扩大培养的温度为25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述扩大培养的时间为35-45h，例如35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h或45h等。
优选地，所述扩大培养可以在摇床振摇下进行，转速为100-200r/min，例如100r/min、120r/min、150r/min、160r/min、180r/min或200r/min等。
另外，扩大培养根据规模可选的在摇瓶或者种子罐中进行。
优选地，所述活化培养液与扩大培养基的体积比为1:(8-10)，例如1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10等。
在本发明中，步骤(3)所述发酵培养的方法为：将步骤(2)得到的扩大培养液接种于发酵培养基中培养。
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、菜籽粕、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸铵和氯化钾。
优选地，所述菜籽粕的浓度为5-15g/L。
发酵培养时需要兼顾菌体的生长和代谢，菜籽粕添加量若低于此浓度范围则会氮源不足，限制菌体生长，高于此浓度范围则会，氮源过量，抑制菌体生长。
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖35-45g/L、谷氨酸钠25-35g/L、菜籽粕5-15g/L、氯化钠2-8g/L、硫酸镁2-8g/L、磷酸二氢钾0.5-2g/L、氯化钙0.2-0.8g/L、碳酸氢钠0.2-0.8g/L、硫酸钠5-10g/L、硫酸铵4-8g/L和氯化钾0.2-0.8g/L。
所述葡萄糖的浓度可以为35g/L、36g/L、38g/L、39g/L、40g/L、41g/L、42g/L、44g/L或45g/L等。
所述谷氨酸钠的浓度可以为25g/L、26g/L、27g/L、28g/L、29g/L、30g/L、31g/L、33g/L或35g/L等。
所述菜籽粕的浓度可以为5g/L、6g/L、8g/L、9g/L、10g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L等。
所述氯化钠的浓度可以为2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L或8g/L等等。
所述硫酸镁的浓度可以为2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L或8g/L等。
所述磷酸二氢钾的浓度可以为0.5g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.5g/L或2g/L等。
所述氯化钙的浓度可以为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L或0.8g/L等。
所述碳酸氢钠的浓度可以为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L或0.8g/L等。
所述硫酸钠的浓度可以为5g/L、6g/L、8g/L、9g/L或10g/L等。
所述硫酸铵的浓度可以为4g/L、5g/L、6g/L、7g/L或8g/L等。
所述氯化钾的浓度可以为0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L或0.8g/L等。
优选地，所述发酵培养的温度为25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等。
优选地，所述发酵培养的时间为90-140h，例如90h、100h、110h、120h、130h或140h等。
优选地，所述发酵培养在摇床振摇下进行，转速为200-250r/min，例如200r/min、210r/min、220r/min、230r/min、240r/min或250r/min等。
优选地，所述发酵培养在规模级发酵罐中进行，搅拌速度为80-140rpm。
优选地，所述扩大培养液与发酵培养基的体积比为1:(8-10)，例如1:8、1:8.5、1:9、1:9.5或1:10等。
上述活化培养、扩大培养和发酵培养所涉及的温度、时间、转速条件等都是相互配合作用的，只要在上述各条件的协同配合下，才能使得最终制备得到的含量最高。
在本发明中，步骤(4)所述破壁是指利用碱性蛋白酶进行破壁。
优选地，步骤(4)所述萃取使用的萃取剂包括正己烷。所述萃取的过程具体为：将发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200mL萃取剂，之后每次加入150mL萃取剂。
作为本发明的优选技术方案，所述利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法具体包括如下步骤：
(1)将菜籽粕进行酶水解预处理，得到菜籽粕处理物，使得其中小肽含量不低于10％；
(2)将裂殖壶菌在25-30℃、100-200r/min摇床振摇下，在添加有步骤(1)得到的菜籽粕的活化培养基中进行活化培养35-45h，得到活化培养液，其中活化培养基中菜籽粕含量为10-20g/L；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液在25-30℃、100-200r/min摇床振摇下，在添加有步骤(1)得到的菜籽粕的扩大培养基中进行扩大培养35-45h，得到扩大培养液,其中扩大培养基中菜籽粕含量为10-20g/L；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液在25-30℃、200-250r/min摇床振摇下，在添加有步骤(1)得到的菜籽粕的发酵培养基中进行发酵培养90-140h，得到发酵液，其中发酵培养基中菜籽粕含量为5-15g/L；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、萃取、脱溶处理，得到所述多不饱和脂肪酸。
另一方面，本发明提供如上所述的制备多不饱和脂肪酸的方法制备得到的多不饱和脂肪酸。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明创造性地将量大质优价廉的菜籽粕经过处理后代替酵母浸膏等传统碳氮源，利用其对裂殖壶菌进行发酵生产多不饱和脂肪酸，确认了裂殖壶菌能够利用菜籽粕进行生长代谢，并建立其发酵体系。不仅使菜籽粕这种副产物得到了充分高效的利用，使多不饱和脂肪酸的制造成本降低，提高了多不饱和脂肪酸的生产水平及产品品质，也给多不饱和脂肪酸的生产制造提供了新的策略。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行活化培养40h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁0.5g/L，pH自然；
(2)将步骤(1)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行扩大培养40h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L和氯化钙0.5g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在28℃、220r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.5g/L、碳酸氢钠0.5g/L、硫酸钠8g/L、硫酸铵6g/L和氯化钾0.5g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、并进行脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例2
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将菜籽粕用纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，纤维素添加量为50U/g；再将pH调至7，温度降至40℃，添加中性蛋白酶水解2h，其添加量为4000U/g，水解结束后干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；
(2)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行活化培养40h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁0.5g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行扩大培养40h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L和氯化钙0.5g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在28℃、220r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.5g/L、碳酸氢钠0.5g/L、硫酸钠8g/L、硫酸铵6g/L和氯化钾0.5g/L，pH自然；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例3
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将菜籽粕用植酸酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为10U/g，水解结束后干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；
(2)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行活化培养40h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁0.5g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行扩大培养40h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L和氯化钙0.5g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在28℃、220r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.5g/L、碳酸氢钠0.5g/L、硫酸钠8g/L、硫酸铵6g/L和氯化钾0.5g/L，pH自然；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例4
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为10U/g，纤维素酶的添加量为50U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解2h，干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；
(2)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行活化培养40h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁0.5g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行扩大培养40h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L和氯化钙0.5g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在28℃、220r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.5g/L、碳酸氢钠0.5g/L、硫酸钠8g/L、硫酸铵6g/L和氯化钾0.5g/L，pH自然；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例5
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将菜籽粕用植酸酶在50℃下pH值为5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为10U/g；再调节pH至7，料液温度降至40℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4000U/g，水解2h，干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；
(2)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行活化培养40h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖20g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L和硫酸镁0.5g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在28℃、180r/min摇床振摇下进行扩大培养40h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L和氯化钙0.5g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在28℃、220r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钙0.5g/L、碳酸氢钠0.5g/L、硫酸钠8g/L、硫酸铵6g/L和氯化钾0.5g/L，pH自然；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例6
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在60℃下pH值为5.5的环境中进行水解预处理1h，植酸酶的添加量为20U/g，纤维素酶的添加量为150U/g；再调节pH至6，料液温度降至30℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为1500U/g，水解4h，干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；
(2)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在25℃、200r/min摇床振摇下进行活化培养45h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖15g/L、谷氨酸钠20g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L和硫酸镁0.2g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在25℃、200r/min摇床振摇下进行扩大培养45h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖35g/L、谷氨酸钠20g/L、菜籽粕10g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L和氯化钙0.2g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在25℃、250r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖35g/L、谷氨酸钠25g/L、菜籽粕5g/L、氯化钠2g/L、硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钙0.2g/L、碳酸氢钠0.2g/L、硫酸钠2g/L、硫酸铵4g/L和氯化钾0.2g/L，pH自然；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例7
本实施例提供一种制备多不饱和脂肪酸的方法，所述方法如下：
(1)将菜籽粕用植酸酶、纤维素酶在40℃下pH值为4.5的环境中进行水解预处理2h，植酸酶的添加量为5U/g，纤维素酶的添加量为10U/g，再调节pH至7.5，料液温度降至45℃，加入中性蛋白酶进行水解，中性蛋白酶的添加量为4500U/g，水解1h，干燥得到处理后的菜籽粕，作为下述各培养基的添加成分；
(2)将裂殖壶菌菌株接种到活化培养基中，在30℃、100r/min摇床振摇下进行活化培养35h，得到活化培养液；所述活化培养基为：葡萄糖25g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕20g/L、氯化钠15g/L和硫酸镁0.8g/L，pH自然；
(3)将步骤(2)得到的活化培养液按照10％的体积百分含量接种于扩大培养基中，在30℃、100r/min摇床振摇下进行扩大培养35h，得到扩大培养液；所述扩大培养液为：葡萄糖45g/L、谷氨酸钠30g/L、菜籽粕20g/L、氯化钠15g/L、硫酸镁8g/L、磷酸二氢钾2g/L和氯化钙0.8g/L，pH自然；
(4)将步骤(3)得到的扩大培养液按照10％的体积百分含量接种于发酵培养基中，在30℃、200r/min摇床振摇下进行发酵培养120h，得到发酵液；所述发酵培养基为：葡萄糖45g/L、谷氨酸钠35g/L、菜籽粕15g/L、氯化钠8g/L、硫酸镁8g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.8g/L、碳酸氢钠0.8g/L、硫酸钠10g/L、硫酸铵8g/L和氯化钾0.8g/L，pH自然；
(5)将步骤(4)得到的发酵液经破壁、加入正己烷进行萃取、脱溶处理，得到所述DHA油脂。
实施例8
本实施例提供一种制备DHA的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于将步骤(2)中“菜籽粕15g/L”替换为“菜籽粕30g/L”；步骤(3)中“菜籽粕15g/L”替换为“菜籽粕30g/L”；步骤(4)中“菜籽粕10g/L”替换为“菜籽粕20g/L”，其他条件均不变。
实施例9
本实施例提供一种制备DHA的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于将步骤(2)中“菜籽粕15g/L”替换为“菜籽粕5g/L”；步骤(3)中“菜籽粕15g/L”替换为“菜籽粕5g/L”；步骤(4)中“菜籽粕10g/L”替换为“菜籽粕2g/L”，其他条件均不变。
实施例10
本实施例提供一种制备DHA的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于步骤(1)中中性蛋白酶的添加量为500U/g，其他条件均不变。
实施例11
本实施例提供一种制备DHA的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于步骤(1)中的“纤维素酶”替换为“木聚糖酶”，其他条件均不变。
对比例1
本对比例提供一种制备DHA的方法，所述方法与实施例4的区别仅在于将步骤(2)(3)(4)中的“菜籽粕”全部替换为“酵母浸膏”，其他条件均不变。
评价试验1：
对实施例1-7和实施例10-11中菜籽粕的植酸降解率和小肽的含量进行测定。其中，植酸的测定方法按照GB 17406-1998进行测定；小肽的检测方法采用三氯乙酸酸溶蛋白测定分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白：准确称取样品1.0g(精确至0.001g)，加入15％三氯乙酸(TCA)溶液溶解并定容至50mL，混匀并静置5min，过滤，滤液作为备用液，然后按照GB/T 22492-2008中附录B“肽含量的测定方法”进行测定，即得肽含量。实施例中菜籽粕来源为普通市售未处理的菜籽粕，其中植酸含量为3.6％，处理后结果如表1所示：
表1
植酸降解率％ 小肽％
实施例1 - 0.25
实施例2 0.5 10.07
实施例3 56.8 0.38
实施例4 80.6 25.28
实施例5 55.5 10.95
实施例6 90.2 20.03
实施例7 72.3 23.42
实施例10 70.9 6.90
实施例11 70.0 15.75
评价试验2：
对上述实施例1-11和对比例1制备得到的经过脱溶处理后的发酵液进行总油和DHA含量的测定，测定总油方法为：称取菌体m0后，加入盐酸，消化样品。再加入石油醚混合，加入乙醚混合，静置分层。倒出上清液于称量好的平底烧瓶中m1，蒸干后，置于烘箱中干燥再次称重m2。测定结果如表2所示。
式中：m0代表试样的质量(g)；
m1代表烘前平底烧瓶的质量(g)；
m2代表烘后平底烧瓶的质量(g)；
DHA含量方法为：GB 5413.27-2010，结果如表2所示(总油含量是指每升发酵液中油的重量、DHA含量是指DHA在总油中的百分比、DHA产量是指每升发酵液中DHA的重量)：
表2
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根据表1和表2的数据：实施例1表明直接添加菜籽粕时，菜籽粕中的植酸与培养基中的金属离子络合，影响培养基成分，严重影响裂殖壶菌的生长代谢，使得裂殖壶菌在甘油三酯量、DHA含量上都有所降低，导致DHA产量降低。将植酸直接采用植酸酶水解后，其DHA产量及总油量有所提升，但植酸水解率不高，使其产物水平还未达到传统培养基发酵水平。水解植酸时加入纤维素酶或木聚糖酶同时进行不仅能够提高植酸的水解率，当植酸水解率达到70％以上时，裂殖壶菌的发酵水平能够接近于传统的培养基发酵水平；水解纤维素还有利于其后粗蛋白水解成小肽，不同酶之间的互相协同促进使用能够将菜籽粕中植酸含量降低90.2％，小肽含量提高至20％以上；将其水解产物进一步运用于裂殖壶菌的发酵其DHA产量最高能够提升13.9％。裂殖壶菌发酵时菜籽粕作为培养组分其添加量对于裂殖壶菌的生长代谢至关重要，菜籽粕浓度过高或过低也会影响总油和DHA的含量。
申请人声明，虽然以上实施例均为摇瓶发酵培养，放大培养时整体培养基体系依然能够延用，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (25)

1.一种制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述方法利用裂殖壶菌在添加有菜籽粕的发酵液中进行发酵，得到多不饱和脂肪酸；
所述菜籽粕为经过中性蛋白酶水解预处理得到的菜籽粕，且在经过中性蛋白酶酶解处理之前，采用纤维素酶和植酸酶先同时进行初步水解；
所述植酸酶的添加量按每克菜籽粕计算，5-20 U/g；所述纤维素酶添加量按每克菜籽粕计算，为10-150 U/g；所述初步水解反应 pH值为3.5-6.0；所述初步水解的温度为40-60℃；所述初步水解时间为1-2h。
2.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）将裂殖壶菌在添加有菜籽粕的活化培养基中进行活化培养，得到活化培养液；
（2）将步骤（1）得到的活化培养液在添加有菜籽粕的扩大培养基中进行扩大培养，得到扩大培养液；
（3）将步骤（2）得到的扩大培养液在添加有菜籽粕的发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
（4）将步骤（3）得到的发酵液经破壁、萃取、脱溶处理，得到所述多不饱和脂肪酸。
3.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶的添加量按每克菜籽粕计算为1500-4500 U/g。
4.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的pH值为6-7.5。
5.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的温度为30-50℃。
6.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述中性蛋白酶水解菜籽粕的时间为1-4h。
7.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不小于10%，所述小肽为分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白。
8.如权利要求1所述的制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，所述经过酶水解预处理得到的菜籽粕中小肽的质量百分含量为不少于18%，所述小肽为分子量在10000道尔顿以下的小分子蛋白。
9.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，步骤（1）所述活化培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、菜籽粕、氯化钠和硫酸镁。
10.如权利要求9所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述菜籽粕的浓度为10-20 g/L。
11.如权利要求9所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述活化培养基包括葡萄糖15-25 g/L、谷氨酸钠20-30 g/L、菜籽粕10-20 g/L、氯化钠5-15 g/L和硫酸镁0.2-0.8 g/L。
12.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述活化培养的温度为25-30℃。
13.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述活化培养的时间为35-45 h。
14.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，步骤（2）所述扩大培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、菜籽粕、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾和氯化钙。
15.如权利要求14所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述菜籽粕的浓度为10-20 g/L。
16.如权利要求14所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述扩大培养基包括葡萄糖35-45 g/L、谷氨酸钠20-30 g/L、菜籽粕10-20 g/L、氯化钠5-15 g/L、硫酸镁2-8 g/L、磷酸二氢钾0.5-2 g/L和氯化钙0.2-0.8 g/L。
17.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述扩大培养的温度为25-30℃。
18.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述扩大培养的时间为35-45 h。
19.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述活化培养液与扩大培养基的体积比为1:(8-10)。
20.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，其特征在于，步骤（3）所述发酵培养基包括葡萄糖、谷氨酸钠、菜籽粕、氯化钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、碳酸氢钠、硫酸钠、硫酸铵和氯化钾。
21.如权利要求20所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述菜籽粕的浓度为5-15 g/L。
22.如权利要求20所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述发酵培养基包括葡萄糖35-45 g/L、谷氨酸钠25-35 g/L、菜籽粕5-15 g/L、氯化钠2-8 g/L、硫酸镁2-8 g/L、磷酸二氢钾0.5-2 g/L、氯化钙0.2-0.8 g/L、碳酸氢钠0.2-0.8 g/L、硫酸钠5-10 g/L、硫酸铵4-8 g/L和氯化钾0.2-0.8 g/L。
23.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述发酵培养的温度为25-30℃。
24.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述发酵培养的时间为90-140 h。
25.如权利要求2所述的利用菜籽粕发酵制备多不饱和脂肪酸的方法，所述扩大培养液与发酵培养基的体积比为1:(8-10)。
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