ES2964732T3 - Procedimiento de enriquecimiento de protistas con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, más particularmente de clase omega 3, y su utilización para la producción de estos lípidos - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método para enriquecer protistas con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), en particular de la clase omega 3 (ω3), comprendiendo dicho método el cultivo de los protistas en un medio de cultivo que comprende un compuesto selenizado, y los protistas enriquecido en lípidos ricos en PUFA obtenidos mediante dicho método. La invención también se refiere a un método para producir lípidos ricos en PUFA, que comprende, después del método de enriquecimiento según la invención, un método para tratar los protistas mediante la extracción de los lípidos selenizados ricos en PUFA de la biomasa. La invención se refiere finalmente a cualquier producto alimentario, cosmético o farmacéutico que comprenda bien los lípidos selenizados así extraídos, bien la biomasa selenizada procedente del método de enriquecimiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de enriquecimiento de protistas con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, más particularmente de clase omega 3, y su utilización para la producción de estos lípidos
La invención se refiere a un procedimiento de enriquecimiento de protistas, y en particular de microalgas, con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de la clase omega 3 (w3), comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de los protistas en un medio de cultivo que comprende por lo menos un compuesto selenizado, así como a un procedimiento para la producción de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase w3, que utiliza el procedimiento de enriquecimiento según la invención.
La presente invención se refiere al campo general de la producción de ácidos grasos por microorganismos, en particular protistas, muy particularmente microalgas.
El término “protistas” designa unos eucariotas distintos de animales, hongos y plantas. Este grupo es muy heterogéneo y reúne unos organismos con organización celular denominada simple, unicelulares (el caso más frecuente) o pluricelulares sin tejidos especializados. Algunos protistas son autótrofos y otros son heterótrofos (como los protozoos, que se alimentan de microalgas, o como las microalgas del géneroSchizochytriumo del géneroCrypthecodinium).
Los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) (o PUFA por “Poly Unsaturated Fatty Acid” en inglés) pertenecen a los constituyentes principales de los lípidos en los sistemas biológicos. Un AGPI se forma a partir de una cadena hidrocarbonada que comprende por lo menos 18 átomos de carbono por molécula, terminada por un grupo carboxilo y contiene por lo menos dos dobles enlaces carbono-carbono.
Los AGPI se clasifican según su número de carbonos, su número de insaturaciones (o dobles enlaces carbonocarbono) y la ubicación de su primera insaturación partiendo del grupo opuesto al grupo carboxilo. Así, un ácido graso poliinsaturado C X:Y wZ es un ácido graso que comprende X átomos de carbono, Y insaturaciones, y de las cuales la primera insaturación está en la Zésima posición, es decir, la posición n°Z, en la que X y Y y Z son cada uno un número entero, siendo X superior o igual a 18.
Las dos clases más importantes de AGPI son las clases de los omega 3 (w3) y omega 6 (w6).
Entre los AGPI de clase w3 se encuentran el ácido a-linolénico (C 18:3 w3), el ácido eicosapentaenoico (o EPA) (C 20:5 w3) y el ácido docosahexaenoico (o DHA) (C 22:6 w3). El DHA tiene un total de seis insaturaciones en las posiciones 3, 6, 9, 12, 15 y 18.
De manera general, los AGPI son esenciales para el crecimiento y la supervivencia de todos los organismos en el mantenimiento de la integridad de las membranas, en el mantenimiento de la permeabilidad de las membranas y en el almacenamiento celular de carbono. Los mamíferos que no poseen las enzimas necesarias para su síntesis deben, por lo tanto, encontrarlas en su alimentación.
En los humanos, los AGPI desempeñan un papel indispensable en el desarrollo y el funcionamiento óptimo del cerebro, del corazón y de otros muchos órganos y tejidos. En particular, los AGPI de clase w3 se presentan como los compuestos más beneficiosos para la salud humana a largo plazo, ya que reducen los riesgos de enfermedades cardiovasculares y los trastornos inmunológicos e inflamatorios. También actuarían sobre el sistema cerebral, el sistema hormonal y el sistema inflamatorio. El DHA, en particular, permite un buen desarrollo fetal e infantil a nivel visual y neurológico, lo cual le confiere desde hace varios años un interés creciente en las diferentes formulaciones de los productos alimenticios, especialmente de los alimentos para lactantes.
Así, el mercado de los AGPI de clase w3 superó los 2 mil millones de dólares en 2014. Según el estudio de mercado “Omega-3 PUF A Market by Type (DHA, EpA, ALA), Source [Marine (Fish, Algal, Krill, Others), Plant (Flaxseed, Chia Seed, Others)], Aplicación (Dietary supplément, Functional F&B, Pharma, Infant Formula, Others) & Geography - Global Trend & Forecast to 2019”, este mercado superaría los 4 mil millones de dólares en 2019. Algunos alimentos son naturalmente ricos, como los pescados grasos (arenques, sardinas, caballa, etc.) y determinados aceites vegetales (colza, nueces, soja, etc.). Sin embargo, aunque los aceites de pescado representan actualmente la principal fuente industrial de AGPI, ya no pueden hacer frente de manera sostenible al aumento de la demanda, en particular para el DHA. En efecto, la demanda sostenida de aceites de pescado de alta calidad coincide con un contexto de sobrepesca, lo cual conduce al establecimiento de regulaciones pesqueras cada vez más estrictas, y a una disminución en la producción global de aceite de pescado. La producción de aceites de pescado también plantea problemas de refinado, en particular debido al sabor y al olor poco agradables de estos aceites de pescado, su baja estabilidad oxidativa y su contenido en colesterol y en productos tóxicos. Por ello, su utilización se ha limitado, en particular en el mercado de los complementos alimenticios.
Por consiguiente, una fuente alternativa comienza a utilizarse para este mercado floreciente de producción de AGPI: los microorganismos, en particular las microalgas. En efecto, estos últimos, debido a su extraordinaria diversidad y su plasticidad metabólica, representan una fuente significativa de AGPI para numerosas industrias, en particular las industrias alimentaria y farmacéutica. Entre estos microorganismos, se encuentran en particular las microalgas del reino de los protistas, tales como la familia de losThraustochytridesque comprende el géneroSchizochytriumy la familia deDinoflagellata(Dinoflagelados) que comprende el géneroCrypthecodinium.
La composición de ácidos grasos de las microalgas suele ser más simple que la de los aceites de pescado, reduciendo el número de etapas necesarias para concentrar los ácidos grasos deseados.
Las microalgasSchizochytriumyCrypthecodiniumson capaces de producir lípidos en una cantidad que va hasta el 40-50% de su biomasa seca y hasta el 30-40% de AGPI entre los lípidos totales. Estos AGPI se almacenan principalmente en forma de triglicéridos. Además, estas microalgas marinas no presentan un olor desagradable ya que no contienen colesterol, y, por lo tanto, no adolecen de los inconvenientes que presentan los aceites de pescado. Asimismo, son bien percibidas por el consumidor como un producto natural de origen vegetal. Asimismo, es posible producir microalgas a gran escala en biorreactores controlando todos los parámetros de cultivo. Por consiguiente, las microalgas representan ahora el primer plano de las fuentes de AGPI, como alternativa a los aceites de pescado. El DHA se utiliza en particular en formulaciones para lactantes y prematuros, y en los complementos alimenticios. Puede proceder de la acuicultura mediante la utilización de microalgas heterótrofas marinasCrypthecodiniumySchizochytrium.
Las condiciones de cultivo de las microalgas tienen una gran influencia en los rendimientos del AGPI. Sin embargo, si las cantidades de biomasa obtenidas varían mucho, se observa que las proporciones de EPA y DHA, con respecto a esta biomasa, permanecen generalmente constantes. Una de las vías exploradas para mejorar el crecimiento y la producción de moléculas de alto valor añadido, como los lípidos y los carotenoides en microalgas, es la suplementación del medio de cultivo de estas microalgas con compuesto(s) químico(s).
Así, la solicitud de patente US 2013/0217085 enseña que la adición de glicina betaína exógena o de trehalosa al medio de cultivo puede aumentar significativamente el rendimiento de fermentación de ácidos grasos poliinsaturados de laSchizochytrium,en particular laSchizochytrium limacinum;la adición de n-dodecano (portador de oxígeno) en el medio de cultivo deCrypthecodinium cohniiha permitido mejorar la producción de DHA para alcanzar el 51% de los lípidos totales, como se informó en la publicación Da Silvaet al.,“Effect of n-dodecane on Crypthecodinium cohnii fermentations and DHA production”, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 33 pp 408-416, 2006.
Sin embargo, más allá de la imagen negativa dada al consumidor por la utilización de estos compuestos químicos no de origen biológico (es decir, que no son de origen vegetal), la adición de estos compuestos, además de ser costosa, plantea problemas de purificación de las microalgas ya que se encuentran en la biomasa final.
Por otra parte, la solicitud de patente WO 2015/150716 describe un procedimiento de cultivo de microalgas del géneroAurantiochytrium,en particular un protista del géneroAurantiochytrium mangrovei,en un medio de cultivo casi libre de cloruro y casi libre de sodio, para la producción de DHA. Las cepas en cuestión son unas cepas deThraustochytridesdel géneroAurantiochytrium mangroveiyAurantiochytrium limacinum.El selenio se cita, entre muchos otros elementos, como un vehículo de sodio que eventualmente puede estar presente en una cantidad muy pequeña en el medio de cultivo (no más de 1 mg/L de selenito de sodio o no más de 0,46 mg/L de selenio). Además, se indica que las cepasSchizochytrium sp.no forman parte expresamente de la invención.
El documento Gennity JMet al:“A selenite-induced decrease in the lipid content of a red alga" Phytochemistry, 1985, vol. 24, no. 12 páginas 2823-2830 se refiere a dos algasDunaliella primolectayPorphyridium cruentumque, cultivadas en presencia de selenio, poseen una actividad glutatión peroxidasa. Los autores han mostrado que, en estas condiciones de cultivo, la producción de ácidos grasos poliinsaturados disminuye.
Finalmente, el documento WO 2013/010090 describe unas composiciones con un alto contenido en lípidos, así como unos procedimientos para su fabricación. El contenido en lípidos es de por lo menos el 67% con respecto a la materia seca. El alga es preferentemente una cepa o especie del géneroChlorella,del géneroSchizochytriumo del géneroCrypthecodinium.Sea cual sea el medio de cultivo, éste contiene extractos de levadura, preferentemente deSaccharomyces cerevisiae,que está preferentemente enriquecida con selenio. En este caso, el medio de cultivo comprende un compuesto selenizado. El contenido en selenio en el medio de cultivo es muy elevado, es decir del 10 al 100% para 7,5 g/l de levadura en el medio de cultivo, es decir de 75 a 750 mg/L de selenio.
Así, subsiste por lo tanto la necesidad de aumentar la producción de AGPI, en particular de clase w3, por las microalgas, simplificando al mismo tiempo la extracción a partir de la biomasa.
La invención tiene como objetivo superar los inconvenientes del estado de la técnica, proponiendo un procedimiento de aumento de la producción de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados (AGPI), en particular de clase w3, muy particularmente de DHA, mediante la utilización en el medio de cultivo de un compuesto selenizado.
Por “ricos en AGPI” se entiende, según la invención, que comprenden del 55% al 80%, preferentemente del 60 al 75% en peso de AGPI con respecto a los lípidos totales. En efecto, de manera sorprendente, el solicitante ha constatado que la adición de un compuesto selenizado en el medio de cultivo de protistas podría mejorar la producción de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase w3, muy particularmente de DHA, disminuyendo al mismo tiempo la cantidad de ácidos grasos saturados presentes en estos lípidos de la biomasa.
Un objetivo de la invención es, por lo tanto, optimizar la producción de lípidos ricos en AGPI, en particular de clase w3, más particularmente de DHA, mediante protistas, preferentemente por microalgas, de manera aún más preferida por microalgas marinas heterótrofas, que proporcionan una solución alternativa a las soluciones propuestas por el estado de la técnica, pero menos costosas y más fáciles de utilizar que éstas.
La invención tiene así por objeto, según un primer aspecto, un procedimiento de enriquecimiento de protistas con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados con respecto a los lípidos totales, en particular y preferentemente de clase omega 3 (ui3), comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de los protistas en un medio de cultivo que comprende por lo menos un compuesto selenizado, siendo la concentración en el medio de cultivo de dicho compuesto selenizado tal que el selenio esté presente en una concentración comprendida entre 1 y 8 mg/L.
El compuesto selenizado se selecciona preferentemente de entre el grupo formado por el ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico o una de sus sales, el selenito, el ácido selénico, el selenato, la selenocisteína, la selenometionina, la selenocistationina, la selenohomocisteína y la selenoadenosilselenometionina.
El compuesto selenizado se selecciona de manera aún más preferida de entre el grupo formado por el ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico (o el ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutanoico) o una de sus sales, el selenito, el ácido selénico y la selenometionina.
El ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico está generalmente en forma L, D o D, L.
La sal del ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico es preferentemente una sal de calcio, de zinc o de magnesio.
De manera particularmente ventajosa según la invención, los lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados son particularmente ricos en ácido docosahexaenoico (DHA). Por “rico en DHA”, se entiende, según la invención, que comprende del 45% al 70%, preferentemente del 48 al 60% en peso (de DHA con respecto a los lípidos totales). Salvo que se indique lo contrario, todos los porcentajes se dan en este documento en % en peso. Según la invención, los protistas son preferentemente unas microalgas del reino de las Chromalveolata.
Una de las ventajas de la invención es que el enriquecimiento con AGPI se acompaña de un empobrecimiento (en otras palabras, una disminución) de los ácidos grasos saturados que produce el protista en el contenido total de lípidos idéntico o superior con respecto al caso en el que, en igualdad de circunstancias, el medio de cultivo no comprende un compuesto selenizado. Esto significa que, en comparación con los contenidos de ácidos grasos saturados obtenidos con los protistas enriquecidos con AGPI según la técnica anterior, el protista comprende generalmente un contenido reducido de ácidos grasos saturados, es decir, generalmente comprendidos en un intervalo del 40 al 68% con respecto a los lípidos totales.
Sin querer estar ligado a ninguna teoría, la solicitante cree que la disminución en el contenido de los ácidos grasos saturados se realiza en beneficio de la producción de ácidos grasos insaturados. Según un primer modo de realización del procedimiento de producción según la invención, estas microalgas son de la división de lasStramenopiles,preferentemente de la familia deThraustochytrideso deLabyrinthulides,de manera aún más preferida del géneroSchizochytrium, Ulkenia, AurantiochytriumoThraustochytrium.Preferentemente en este caso, estas microalgas son de la división de lasStramenopiles,preferentemente de la familia deThraustochytrides,de manera aún más preferida del géneroSchizochytrium, UlkeniaoThraustochytrium.
Según un segundo modo de realización del procedimiento de producción según la invención, estas microalgas son de la división de lasAlveolata,preferentemente de la familia deDinoflagellata,de manera aún más preferida del géneroCrypthecodinium.
Según un modo de realización muy particularmente preferido, las microalgas son unas microalgas marinas heterótrofas de las especiesSchizochytrium limacinumoSchizochytrium mangrovei,o unas microalgas de la especieCrypthecodinium cohnii,preferentemente unas microalgas marinas heterótrofas de la especieSchizochytrium limacinum,o unas microalgas de la especieCrypthecodinium cohnii.Pero las microalgas heterótrofas de las especiesCrypthecodinium semeuse, Schizochytrium aggregatum, Ulkenia profunda, Ulkenia radiata, Ulkenia visurgensis, Aurantiochytrium mangrovei, Aurantiochytrium limacinum, Thraustochytrium globosum, Thraustochytrium aureum, Thraustochytrium pachyderma, Thraustochytrium aggregatumy/oThraustochytrium striatum,preferentemente de las especiesCrypthecodinium semeuse, Schizochytrium aggregatum, Ulkenia profunda, Ulkenia radiata, Ulkenia visurgensis, Thraustochytrium aureum, Thraustochytriumpachyderma, Thraustochytrium aggregatumy/oThraustochytrium striatum,también se pueden utilizar en el marco de la invención.
Por “A y/o B”, se entiende según la invención A, o B, o A y B.
Aparte de la presencia del o de los compuestos selenizados según la invención, el medio de cultivo es tal como el conocido por el experto en la técnica, en particular para la especie en cuestión, es decir, que incluye un medio de nutrición en los elementos químicos necesarios para el crecimiento del protista (nitrógeno; sales minerales; carbono; etc.).
En el caso particular del ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico, se puede hacer referencia para las condiciones de utilización de este ácido a la patente US9017985 de la solicitante, que se refiere a la utilización de este ácido para el enriquecimiento con selenio de un microorganismo fotosintético.
El procedimiento de enriquecimiento según la invención es tal que la concentración en el medio de cultivo de dicho compuesto selenizado es tal que el selenio está presente en una concentración comprendida entre 1 y 8 mg/L, por ejemplo 5 mg/L.
Cuando están presentes varios compuestos selenizados, esto se aplica al contenido total de selenio del medio, teniendo en cuenta cada uno de ellos.
El procedimiento de enriquecimiento se efectúa generalmente durante un período de 96 horas a 200 horas, por ejemplo durante un período igual a 187 horas.
La invención se refiere también a protistas enriquecidos con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase omega 3 (ui3), obtenidos según el procedimiento de enriquecimiento de la invención, siendo los protistas unas microalgas marinas heterótrofas.
De manera particularmente ventajosa según la invención, estos protistas también están enriquecidos con selenio, es decir, que comprenden entre 5 y 800 ppm (en peso) de selenio con respecto a su masa total.
Los protistas enriquecidos con lípidos ricos en AGPI, en particular de clase w3, obtenidos mediante el procedimiento de enriquecimiento según la invención, también son útiles como agente cosmético o nutricional. Esta masa selenizada enriquecida con lípidos ricos en AGPI, en particular de clase w3, puede aprovecharse ventajosamente, muy particularmente en la nutrición humana o animal, preferentemente animal.
La invención se refiere también, por lo tanto, a la utilización de estos protistas enriquecidos con lípidos ricos en AGPI, en particular de clase w3, obtenidos mediante el procedimiento de enriquecimiento según la invención, en nutrición o cosmética. Como corolario, la invención se refiere a cualquier producto alimenticio o cosmético que comprende protistas enriquecidos con lípidos ricos en AGPI, en particular de clase w3, obtenidos mediante el procedimiento de enriquecimiento según la invención.
Por lo tanto, los protistas enriquecidos con lípidos ricos en AGPI, en particular de clase w3, obtenidos mediante el procedimiento de enriquecimiento según la invención, se pueden utilizar muy particularmente en la nutrición humana o animal.
Sin embargo, dicha utilización también puede se efectuar después del tratamiento de extracción de lípidos ricos en AGPI de la biomasa o incluso la extracción de lípidos ricos en AGPI de la biomasa y la purificación de los lípidos así extraídos.
Esta otra utilización tan interesante como otra de las ventajas de la invención es que, de manera sorprendente, dichos lípidos también están enriquecidos con selenio, es decir, que comprenden más de 1 ppm, de manera aún más preferida más de 2 ppm (en peso) de selenio con respecto a su masa total. En todos los casos comprenden generalmente menos de 30 ppm de selenio con respecto a su masa total. La presencia de este contenido relativamente alto de selenio en los lípidos es otra característica del procedimiento según la invención. Se puede hablar así de “ lípidos de microalgas selenizados” o “ lípidos selenizados”.
La extracción se puede efectuar mediante cualquier procedimiento de extracción conocido por el experto en la técnica, tal como una extracción con por lo menos un disolvente orgánico o una extracción con dióxido de carbono en estado supercrítico.
Por lo tanto, la invención tiene por objeto, en un segundo aspecto, un procedimiento de producción de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, en particular de la clase omega 3 (w3), que comprende sucesivamente:
- un procedimiento de enriquecimiento de protistas con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase u>3, según la invención, para obtener unos protistas enriquecidos con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase u>3; y
- un procedimiento de tratamiento de los protistas enriquecidos con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase w3, mediante extracción de la biomasa de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase u>3, para obtener dichos lípidos (selenizados) ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase w3, y una biomasa selenizada empobrecida en lípidos.
La biomasa selenizada empobrecida en lípidos ricos en AGPI, obtenida después de esta extracción, también se puede utilizar ventajosamente, entre otros, en nutrición generalmente humana o animal, preferentemente animal.
El procedimiento de tratamiento de protistas enriquecidos con lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase u>3, consiste, por lo tanto, en una extracción de la biomasa de los lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, seguida lo más frecuente y preferentemente de una purificación de los lípidos así extraídos (separados de la biomasa) ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase w3. Este procedimiento de tratamiento va seguido generalmente de un análisis del perfil de los lípidos así obtenidos.
El procedimiento de extracción de lípidos de la biomasa es conocido por el experto en la técnica y se especifica, por ejemplo, en el ejemplo siguiente. La invención tiene por lo tanto por objeto, en un tercer aspecto, los lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de la clase omega 3 (w3), obtenidos según el procedimiento de producción de la invención, que, ventajosamente, también están enriquecidos con selenio, y como tales se califican como “lípidos selenizados”.
Los lípidos se pueden utilizar tal cual, lo más frecuentemente en nutrición humana o animal.
Por lo tanto, el procedimiento de producción de lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase u>3, según la invención, comprende la realización del procedimiento de enriquecimiento según la invención, teniendo este procedimiento de enriquecimiento las mismas características que las explicadas anteriormente.
La invención se refiere, finalmente, a cualquier producto alimenticio o cosmético que comprende unos lípidos ricos en ácidos grasos poliinsaturados, en particular de la clase omega 3 (u>3), obtenidos mediante el procedimiento de producción según la invención. La invención se comprenderá mejor a la vista de los ejemplos de realización siguientes, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
- la figura 1 es un gráfico que muestra el porcentaje en peso de los ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) en los lípidos totales después de 187 horas de incubación para elSchizochytrium limacinum;
- la figura 2 es un gráfico que da el porcentaje en peso de ácido docosahexaenoico (DHA) en los lípidos totales después de 187 horas de incubación para elSchizochytrium limacinum;
- la figura 3 es un gráfico que da el porcentaje en peso de los ácidos grasos saturados (AGS) en los lípidos totales después de 187 horas de incubación para elSchizochytrium limacinum;y
- la figura 4 es un gráfico que da el porcentaje en peso de ácidos grasos poliinsaturados (AGPI) en los lípidos totales, el porcentaje en peso de ácido docosahexaenoico (DHA) en los lípidos totales y el porcentaje en peso de ácidos grasos saturados (AGS) en los lípidos totales, después de 187 h de incubación para elCrypthecodinium cohnii.
Las figuras 1 a 4 se explican en los ejemplos 1 y 2 siguientes.
Ejemplos
Los ejemplos que siguen ilustran la invención sin por ello limitar su alcance.
Ejemplo 1. Cultivo de protista Schizochytrium en un medio que contiene por separado ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico (HMSeBA); selenito; ácido selénico; o selenometionina
Este cultivo condujo a la mejora de la producción de los ácidos grasos poliinsaturados y de DHA en particular.
ElSchizochytriumes un protista, y más precisamente una microalgaThraustochytrideheterótrofa.
Una cepa deSchizochytrium limacinumATCC-MYA1381 se obtuvo del banco ATCC (www.atcc.org).
Las características de crecimiento, así como la producción de lípidos deSchizochytrium limacinum semidieron en presencia de diferentes formas de selenio y se compararon en ausencia de dichos aditivos (control referenciado “Sin Se” en las figuras).
El precultivo de la cepaSchizochytrium limacinumATCC-MYA1381 se realizó en un medio líquido estándar, cuya composición se indica en la Tabla 1. Para ello, se echaron 50 ml de los cultivos de inicio (o “de arranque”) en un recipiente Erlen de 250 ml a partir de una colonia aislada en 633 M3 agar cítrico (www.atcc.org) y se cultivaron a 25°C ± 1°C en heterotrofia durante 48 h en este medio líquido estándar. El inóculo de 100 ml se echó después en un recipiente Erlen de 500 ml a partir de estos cultivos “de arranque” a una concentración inicial de 1,0.106 células/ml en las mismas condiciones de cultivo que este último durante 4 días. Los cultivos se airearon de forma continua mediante agitación orbital a 100 rpm (por “revoluciones por minuto”). Los cultivos de enriquecimiento con compuesto selenizado se echaron a partir del inóculo a una concentración inicial de 1,0.106 células/ml para un volumen final de 400 ml en un recipiente Erlen de 2,0 L a 25°C ± 1°C en heterotrofia durante 187 h. Los cultivos se airearon de forma continua mediante agitación orbital a 100 rpm. El enriquecimiento se efectuó en TO mediante adición de una disolución concentrada de selenio (disolución de ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico vendida por la empresa Tetrahedron a 0,0125 g/l referenciada “HMSeBA” en las figuras 1 a 3, selenito de sodio 0,0110 g/l referenciado “Selenito” en las figuras 1 a 3, ácido selénico 0,0082 g/l referenciado “Ácido selénico” en las figuras 1 a 3 y selenometionina 0,0124 g/l referenciada “SeMet » en las figuras 1 a 3) para una concentración final de 5 mg de selenio/l en el medio, sea cual sea la fuente del compuesto selenizado.
La biomasa deSchizochytrium limacinumse recogió entonces después de 72 h y 187 h de incubación.
Tabla 1. Resumen de las concentraciones de cada reactivo que compone el medio de cultivo líquido estándar.
El agua de mar artificial es un producto comercial común, en este caso fue el producto “Sal Instant Ocean” de la compañía AQUARIUM SYSTEMS. Su composición se detalla a continuación a título informativo: Na<+>(0.35 g/l); K<+>(0.01 g/l); Mg<2+>(0.04 g/l); Ca<2+>(0.01 g/l); Sr' (0.00054 g/l); Cl (0.641 g/l); S (SO4<2+>) (0.07 g/l); P (PO<4>) (0.000157 mg/L); N (NO3) (0.002 mg/L); N (NH4) (0.006 mg/L); Si (SiO3) (0.0105 mg/L); Li (0.0124 mg/L); Si (0.0148 mg/L); Mo (0.0057 mg/L); Ba (0.00385 mg/L); V (0.0048 mg/L); Ni (0.00329 mg/L); Cr (0.0129 mg/L); Al (0.214 mg/L); Cu (0.00377 mg/L); Zn (0.00108 mg/L); Mn (0.00218 mg/L); Fe (0.000442 mg/L); Cd (0.000890 mg/L); Pb (0.0144 mg/L); Co (0.00253 mg/L); Ag (0.00819 mg/L): Ti (0.00106 mg/L).
El extracto de levadura es un producto comercial estándar proporcionado por la compañía Merck.
Seguimiento de los cultivos
La concentración de biomasa total se siguió midiendo la masa seca (filtración en filtro GFC, Whatman, y después secado en un horno al vacío, 70°C y -0,8 bar (80 kPa), durante 24h mínimo antes del pesaje).
Se extrajeron 10<7>células/ml para cuantificar los lípidos totales. El procedimiento de extracción de lípidos es conocido por el experto en la técnica y es tal como se describe en la publicación “Bligh E.G. & Dyer W.J., A rapid method of total lipid extraction and purification, Can. J. Biochem. Physiol 37 195991 1-917”, habiéndose adaptado este procedimiento ligeramente para las células de microalgas. Así, para cada medición, aproximadamente 10 ml de cultivo (biomasa y medio) recién extraído se lavaron con agua desmineralizada para eliminar las sales extracelulares antes de la liofilización, después se colocaron en un tubo de vidrio y se centrifugaron durante 10 min a 3600 g y 4°C. Después de la centrifugación, se eliminó el sobrenadante y se liofilizó el sedimento que contenía las células. La extracción se realizó con 6 ml de una mezcla monofásica CHCls/MeOH (cloroformo/metanol) en proporciones 2/1 (VA/). Para garantizar la extracción completa de los lípidos, el tubo se mantuvo bajo agitación en un péndulo durante 6 h en la oscuridad, y después se almacenó a -20°C antes de ser analizado por GC-FID (cromatografía en fase gaseosa con detección por ionización de llama) para determinar la cantidad y los perfiles de ácidos grasos totales extraídos.
Los resultados obtenidos se ilustran en las figuras 1, 2 y 3 que dan, respectivamente, paraSchizochytrium limacinum,después de 187 h de incubación, el porcentaje de AGPI en los lípidos totales, el porcentaje de DHA en los lípidos totales y el porcentaje de AGS en los lípidos totales en las ordenadas, para cada una de las fuentes selenizadas indicadas en las abscisas.
Se ha constatado que la presencia del compuesto selenizado a 5 mg/L en el medio de cultivo permitió obtener un porcentaje de AGPI claramente superior al del control (como mínimo el 67% frente al 53%), sea cual sea la especie selenizada utilizada, siendo el resultado más interesante dado por el selenito (73%). También se constató que la presencia del compuesto selenizado a 5 mg/L en el medio de cultivo permitió obtener un porcentaje de DHA claramente superior al del control (como mínimo el 50% frente al 41%), sea cual sea la especie selenizada utilizada, siendo el resultado más interesante dado por el selenito (54%).
Finalmente, se constató que la presencia del compuesto selenizado a 5 mg/L en el medio de cultivo permitió obtener un porcentaje de AGS claramente inferior al del control (como mínimo el 31% frente al 44%), sea cual sea la especie selenizada utilizada, siendo el resultado más interesante dado por el selenito (26%).
Ejemplo 2. Cultivo de protista Crypthecodinium cohnii en un medio que contiene selenometioninaEste cultivo condujo a la mejora de la producción de ácidos grasos poliinsaturados y, en particular, de DHA. Se procedió de la misma manera que en el ejemplo 1, con la excepción del hecho de que el protista es elCrypthecodinium cohniien lugar deSchizochytrium limacinum,y que se utilizó sólo una fuente de selenio: selenometionina (“SeMet”).
ElCrypthecodinium cohniies un protista, y más precisamente una microalga heterótrofa. La cepaCrypthecodinium cohniiCCMP 316 se obtuvo del banco NCMA (https://ncma.bigelow.org). Los resultados obtenidos se ilustran en la figura 4 que da, porCrypthecodinium cohnii,después de 187 h de incubación, el porcentaje del compuesto en los lípidos totales en las ordenadas, para cada uno de los compuestos (AGPI, DHA y AGS) indicados en las abscisas, en presencia de selenometionina (referencia “Con SeMet”), o en la ausencia de compuesto selenizado (referencia “Sin Se”). Se constató que la presencia de selenometionina a 5 mg/L de selenio en el medio de cultivo permitió obtener un porcentaje de AGPI claramente superior al del control (el 35% frente al 25%).
También se constató que la presencia de selenometionina a 5 mg/L de selenio en el medio de cultivo permitió obtener un porcentaje de DHA claramente superior al del control (el 34% frente al 24%).
Finalmente, se constató que la presencia de selenometionina a 5 mg/L de selenio en el medio de cultivo permitió obtener un porcentaje de AGS claramente inferior al del control (el 53,5% frente al 64%).
Por otro lado, se constató un aumento del contenido de lípidos totales en la biomasa seca gracias a la utilización de la selenometionina. En efecto, se obtiene una cantidad del34% más de lípidos totales utilizando el cultivo en medio selenizado con respecto al medio control.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de enriquecimiento de protistas con lípidos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados con respecto a los lípidos totales,
comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de los protistas en un medio de cultivo que comprende por lo menos un compuesto selenizado,
siendo tal la concentración de dicho compuesto selenizado en el medio de cultivo que la concentración de selenio en el medio de cultivo esté comprendida entre 1 y 8 mg/L.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el compuesto selenizado se selecciona de entre el grupo formado por el ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico o una de sus sales, el selenito, el ácido selénico, el selenato, la selenocisteína, la selenometionina, la selenocistationina, la selenohomocisteína, y la selenoadenosilselenomationina.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el compuesto selenizado se selecciona de entre el ácido 2-hidroxi-4-metilselenobutírico o una de sus sales, el selenito, el ácido selénico, y la selenometionina.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las microalgas son de la división de lasStramenopiles,preferentemente de la familiaThraustochytridesoLabyrinthulides,de manera aún más preferida del géneroSchizochytrium, Ulkenia, AurantiochytriumoThraustochytrium.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las microalgas son de la divisiónAlveolata,preferentemente de la familiaDinoflagellata,de manera aún más preferida del géneroCrypthecodinium.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las microalgas son unas microalgas marinas heterótrofas de la especieSchizochytrium limacinumoSchizochytrium mangrovei,o unas microalgas de la especieCrypthecodinium cohnii.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 5 o 6, en el que las microalgas heterótrofas son unas microalgas de la especieSchizochytrium limacinumo unas microalgas de la especieCrypthecodinium cohnii.
8. Protistas obtenidos por el procedimiento de enriquecimiento con lípidos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, en particular de clase omega 3, con respecto a los lípidos totales, según una de las reivindicaciones 1 a 7, siendo los protistas unas microalgas marinas heterótrofas.
9. Producto alimenticio o cosmético que comprende unos protistas según la reivindicación 8.
10. Procedimiento de producción de lípidos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, con respecto a los lípidos totales, comprendiendo sucesivamente dicho procedimiento:
- un procedimiento de enriquecimiento de protistas según una de las reivindicaciones 1 a 7, de manera que se obtengan unos protistas enriquecidos con lípidos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados con respecto a los lípidos totales; y
- un procedimiento de tratamiento de los protistas enriquecidos por extracción de la biomasa de los lípidos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, con respecto a los lípidos totales, de manera que se obtengan unos lípidos que comprenden del 55% a 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, con respecto a los lípidos totales, y una biomasa selenizada empobrecida en lípidos.
11. Procedimiento de producción de lípidos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, con respecto a los lípidos totales, según la reivindicación 10, en el que a la extracción va seguida de una purificación de los lípidos así extraídos que comprenden del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados, con respecto a los lípidos totales.
12. Lípidos obtenidos mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 10 u 11, comprendiendo dichos lípidos del 55% al 80% en peso de ácidos grasos poliinsaturados con respecto a los lípidos totales, y más de 1 ppm en peso de selenio con respecto a su masa total.
13. Lípidos según la reivindicación 12, tales que comprenden más de 2 ppm en peso de selenio con respecto a su masa total.
14. Producto alimenticio o cosmético que comprende los lípidos selenizados según la reivindicación 12 o 13.
15. Producto alimenticio según la reivindicación 14, para la nutrición humana o animal.
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