ES2402076T3 - Sobreproducción de ácido dihomo-gamma linolénico por una cepa mutante de Parietochloris incisa - Google Patents
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Abstract
Una cepa mutante de Parietochloris incisa, caracterizada porque comprende una concentración intracelularsustancialmente reducida de ácido araquidónico (AA) conjuntamente con una concentración intracelularsustancialmente incrementada de ácido dihomo-gamma-linolénico 20:3ω6 (DGLA), en el que dicha cepa es la cepaIKG-1, que tiene N.º de Acceso ATCC PTA- 8497.
Description
Sobreproducción de ácido dihomo-gamma linolénico por una cepa mutante de Parietochloris incisa
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la cepa mutante de Parietochloris incisa que tiene N.º de Acceso ATCC PTA-8497 y
5 a un procedimiento para la producción de ácido dihomo-gamma linolénico (DGLA) a partir de dicha microalga. Más específicamente, el procedimiento incluye el cultivo de dicha microalga rica en ácido araquidónico que ha perdido o ha reducido significativamente su capacidad para la desaturación de DELTA 5.
Antecedentes de la invención
DGLA es un ácido graso industrialmente importante que puede usarse para las aplicaciones farmacéuticas y
10 nutricionales, en alimentación para acuicultura y para animales y para potenciar sus sistemas inmunológicos reduciendo de este modo su mortalidad y morbilidad debido al estrés y las enfermedades. DGLA, también conocido como ácido 8,11,14-eicosatrienoico, se encuentra solamente en microorganismos y siempre en porcentajes bajos. Usualmente, sirve como un intermedio en la biosíntesis de ácido araquidónico (AA, 20:4ω6), facilitándose la conversión de DGLA a AA por la enzima ∆5 desaturasa.
15 Las microalgas son una fuente de productos bioquímicos "verde" y renovable. Se pueden cultivar fototróficamente o adaptarse, o manipularse para crecimiento en condiciones heterótrofas.
El alga de agua dulce Parietochloris incisa es la fuente vegetal más rica del ácido graso poliinsaturado (PUFA) AA.
En condiciones de ausencia de nitrógeno, el contenido de AA puede alcanzar el 21 % de peso seco.
Los aceites vegetales son capaces de producir diversos PUFA. Sin embargo, aquellos producidos por plantas
20 superiores están restringidos a cadenas de hasta 18 átomos de carbono. Las microalgas por otro lado, se conocen por producir PUFA de hasta 22 átomos de carbono de largo.
Tanto AA como DGLA son PUFA de interés farmacológico significativo. DGLA se encuentra en muchos organismos como un intermedio; sin embargo, hay pocos organismos huéspedes naturales en los que hay acumulación de cantidades significativas de este PUFA. Posiblemente la única fuente tal es el mutante deficiente en ∆5 desaturasa del
25 hongo Mortierella (documento US 6.602.690). Sin embargo, un inconveniente asociado con los PUFA producidos por este mutante fúngico es la proporción DGLA/AA desfavorablemente baja (aproximadamente 12). Una desventaja adicional de los PUFA derivados de hongos es que son susceptibles a oxidación y es necesario que se añadan antioxidantes sintéticos para evitar deterioro por oxidación. Dado que la oxidación es una reacción en cadena, incluso una cantidad pequeña de oxígeno puede destruir PUFA rápidamente.
30 Existe así una necesidad de una fuente natural, "verde" de DGLA que supere los problemas anteriormente mencionados.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona
una cepa mutante de Parietochloris incisa caracterizada porque comprende una concentración sustancialmente
35 reducida de ácido araquidónico (AA) conjuntamente con una concentración intracelular sustancialmente incrementada de ácido dihomo-gamma linolénico 20:3ω6 (DGLA), en el que dicha cepa es la cepa IKG-1, que tiene N.º de Acceso de ATCC PTA-8497. También se proporciona un procedimiento para producir DGLA, que comprende incubar la cepa mutante de la microalga Parietochloris incisa que es defectiva en su gen de la ∆5 desaturasa (∆5D) y recuperar lípidos que contienen DGLA de la misma. En un procedimiento preferido de la invención, la proporción de DGLA a AA (en una
40 base en peso) en el producto final (es decir, en los lípidos que contienen DGLA) es mayor de 25. En una realización particularmente preferida, esta proporción es mayor de 50.
Como una guía general, la frase "concentración intracelular de AA sustancialmente reducida", como se usa en el presente documento se tomaría para querer decir que dicha concentración es aproximadamente el 1 % de los ácidos grasos totales o menos. De forma similar, la frase "concentración intracelular sustancialmente incrementada de DGLA"
45 se refiere a una concentración de DGLA mayor de aproximadamente el 30 % de los ácidos grasos totales.
Se contempla que, la concentración intracelular de AA es menor del 0,1 % (p/p), mientras que la concentración intracelular de DGLA es al menos el 30 % (p/p). Ambas de las concentraciones en % p/p mencionadas anteriormente son para entenderse como que se refieren al porcentaje de la sustancia indicada en relación con los ácidos grasos celulares totales.
50 La cepa de Parietochloris incisa mutante mencionada anteriormente es una cepa que es defectiva en su gen de la ∆5 desaturasa (∆5D). El término "defectiva" se usa en este contexto para hacer referencia al hecho de que el gen de la ∆5 desaturasa (∆5D) bien está ausente o bien tiene sustancialmente menos actividad desaturasa que el gen de tipo silvestre debido a una mutación puntual (por ejemplo una sustitución, inserción o deleción de una base de ácido nucleico individual) o a una mutación más grande (por ejemplo una inversión o reordenamiento de una secuencia).
La presente invención se refiere particularmente a la cepa mutante IKG-1 de Parietochloris incisa, que se depositó con el N.º de Acceso PTA-8497 en la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, EE.UU., en los 5 términos del Tratado de Budapest.
Se describe un lípido que contiene DGLA, en el que la proporción de DGLA frente a ácido araquidónico es al menos 25 partes en peso. En otro aspecto descrito, la concentración de DGLA en dicho lípido que contiene DGLA es al menos el 30 % (p/p), al menos el 90 % (p/p) de los lípidos totales en dicho lípido que contiene DGLA son triacilgliceroles.
Se describe adicionalmente un precursor E1 de prostaglandinas de origen en las algas. Dicho precursor de
10 prostaglandina E1 se puede obtener a partir de la cepa mutante de Parietochloris incisa, como se caracteriza anteriormente.
Cabe señalar que el término "precursor de prostaglandina E1" se usa en este contexto para hacer referencia a cualquier ácido graso o mezcla de ácidos grasos que puede servir cono un material de partida o intermedio en la síntesis de AA. Ejemplos de tales ácidos grasos incluyen GLA y DGLA.
15 Se describen composiciones que comprenden lípidos que contienen DGLA y/o precursores de prostaglandina E1, todos los cuales se caracterizan como se describe anteriormente. Tales composiciones se pueden preparar para usar en una diversidad de aplicaciones incluyendo alimentos animales, formulaciones para infantes humanos y suplementos alimentarios.
Por ejemplo, la composición puede ser una composición de comida sana que comprende un lípido que contiene DGLA 20 referida al presente documento.
Dicha composición de comida sana se puede usar, entre otras cosas, para aliviar los efectos secundarios experimentados tras ingestión de alcohol.
Descripción detallada
Con el fin de generar cepas mutantes de P. incisa, la cepa de tipo silvestre puede exponerse a un agente mutágeno y
25 después plaquearse en un medio sólido a una temperatura baja. Las colonias que demostraron crecimiento disminuido en estas condiciones pueden seleccionarse y analizarse después en su contenido en AA y en DGLA.
Los cultivos de P. incisa pueden mutagenizarse por una diversidad de técnicas diferentes que incluyen irradiación (por ejemplo con rayos X o luz ultravioleta), tratamiento con mutágenos químicos (por ejemplo 1-metil-3-nitro-nitrosoguanidina, metanosulfonato y 6-mercaptopurina).
30 Tras la mutagénesis, las células se plaquearon en placas de agar y se llevaron a una temperatura baja (por ejemplo 15 °C). Las colonias que mostraron crecimiento disminuido pueden después aislarse y analizarse en su contenido lipídico.
Los autores de la presente invención encontraron inesperadamente que una de las colonias seleccionadas como se describe anteriormente demostró ser deficiente en AA. En condiciones de ausencia de nitrógeno la proporción de AA en este mutante fue más baja del 1 % en comparación con más del 50 % en el tipo silvestre. Sin embargo, la proporción
35 de precursor inmediato de AA, DGLA (20:3ω6) se incrementó desde aproximadamente el 1 % hasta por encima del 30 % en el mutante. La proporción de DGLA/AA en los PUFA producidos por el mutante de alga es mayor de 25 y en ciertas circunstancias, mayor de 50, ambas de las cuales proporciones son claramente superiores a la proporción DGLA/AA de 12 asociada con PUFA producidos por el mutante fúngico descrito en la técnica anterior mencionada anteriormente.
40 En vista de la proporción de DGLA/AA alterada mencionada anteriormente, se puede concluir que la cepa mutante seleccionada es defectiva en gen de la ∆5 desaturasa (∆5D) que desatura DGLA a AA. De forma similar al tipo silvestre, el mutante es capaz de acumular contenidos altos de lípidos, mayoritariamente triacilgliceroles, en ausencia de nitrógeno, permitiendo la aplicación biotecnológica del procedimiento.
El aceite rico en DGLA de mutante de P. incisa es superior al aceite fúngico porque contiene β caroteno, un
45 antioxidante natural. Los PUFA fúngicos son susceptibles de oxidación y deben añadirse antioxidantes sintéticos para evitar deterioro por oxidación. Dado que la oxidación es una reacción en cadena, incluso una cantidad pequeña de oxígeno puede destruir PUFA rápidamente.
Como se menciona anteriormente, están descritas composiciones que comprenden lípidos que contienen DGLA y/o precursores de prostaglandina E1.
50 Tales composiciones se pueden preparar para usar en una diversidad de aplicaciones incluyendo, pero no limitadas a, alimentos animales, formulaciones para infantes humanos, suplementos alimentarios y composiciones de comida sana. Además de los lípidos que contienen DGLA mencionados anteriormente y/o los precursores de prostaglandina E1, dichas composiciones pueden comprender adicionalmente componentes activos incluyendo agentes farmacéuticamente activos y nutracéuticamente activos, así como cargas, vehículos, tampones, agentes voluminizadores y otros excipientes e ingredientes inactivos como se conocen bien en la técnica. Detalles adicionales de excipientes que se pueden usar en composiciones farmacéuticas y nutracéuticas se pueden encontrar en trabajos de referencia estándar tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co, Easton, Pa, EE.UU.
El siguiente ejemplo se proporciona para propósitos ilustrativos y con el fin de explicar y describir más en particular la presente invención.
Ejemplo
Mutagénesis
10 La cepa de P. incisa se aisló de una muestra de nieve del monte Oyama (Japón). La microalga se ha identificado como la clorofícea, Parietochloris incisa (Trebouxiophyceae) (Watanabe y cols. 1996, Phycol. Res. 44: 107-8).
Antes de mutagénesis, los cultivos se cultivaron en medio de nutrientes BG-11 (Stanier y cols., 1971, Bacteriological Reviews, 35: 171-205) en matraces de 150 ml en condiciones de temperatura y luz controladas. Los matraces se situaron en un agitador de temperatura regulada a 25 °C y se iluminaron por luces fluorescentes a una intensidad
15 lumínica de 115 μmol fotón m-2s-1 como se describe anteriormente (Bigogno y cols. 2002, Phytochemistry 60, 497-503). Los cultivos se proporcionaron con una mezcla de aire y CO2 (99:1, v/v).
Se retiraron cincuenta ml de cultivos en crecimiento logarítmico y se sonicaron en matraces de 150 ml segregando las aglutinaciones celulares. Se expusieron diez ml de suspensión celular, que contienen mayoritariamente células individuales, al mutágeno, 1-metil-3-nitro-nitrosoguanidina (MNNG) a una concentración final de 100 μg/ml. La 20 solución de reserva de MNNG se preparó en DMSO (5 mg/ml) facilitando la penetración del mutágeno a través de la pared celular del alga. Tras 1 h de incubación en un agitador incubador, las células se recogieron por centrifugación (1500 x g) y se lavaron con medio BG-11 libre de mutágeno. La etapa de lavado se repitió varias veces. Finalmente, las células se sonicaron en 10 ml de medio y se contaron los números de células de cultivos no tratados y tratados. Las suspensiones celulares se diluyeron secuencialmente hasta 1000 células/ml y se plaquearon 50-100 células en placas
25 de Petri con medio de agar BG-11. Los cultivos resultantes se duplicaron y se incubaron en luz fluorescente a temperatura ambiente y a temperatura baja (15 °C). El porcentaje de células supervivientes se determinó después de 10 días. Se seleccionaron colonias, que mostraron crecimiento pobre o apariencia diferente a temperatura baja, para cultivo en medio BG11 líquido en matraces. Después de que se logró suficiente biomasa, las células se transfirieron en medio libre de nitrógeno líquido durante 14 días, se recogieron y se analizaron para composición de ácidos grasos.
30 La composición de ácidos grasos del tipo silvestre (WT) y del mutante deficiente en ∆5 desaturasa (MUT) de P. incisa, expresada como porcentaje de p/p de los ácidos grasos totales se muestra en la siguiente tabla.
Composición de ácidos grasos (% de AG total)
DGLA/ TFA
Cepa 16:0 16:2 18:0 18:1 18:1 18:2 18:3 18:3 20:3 20:4
AA (IDW)
ω6 ω9ω7 ω3ω6ω6 ω6
WT 10,9 0,6 2,8 11,0 4,3 11,1 0,9 0,9 1,2 54,6 0,02 33,3
MUT 8,0 0,2 1,9 34,4 2,9 12,8 1,2 1,1 34,4 0,1 340 36,4
Claims (2)
- REIVINDICACIONES1. Una cepa mutante de Parietochloris incisa, caracterizada porque comprende una concentración intracelular sustancialmente reducida de ácido araquidónico (AA) conjuntamente con una concentración intracelular5 sustancialmente incrementada de ácido dihomo-gamma-linolénico 20:3ω6 (DGLA), en el que dicha cepa es la cepa IKG-1, que tiene N.º de Acceso ATCC PTA-8497.
- 2. Un procedimiento para producir DGLA, que comprende incubar una cepa mutante de la microalga Parietochloris incisa que es defectiva en su gen de la ∆5 desaturasa (∆5D) y recuperar los lípidos que contienen DGLA de la misma, en el que dicha cepa es la cepa IKG-1, que tiene N.º de Acceso ATCC PTA-8497.10 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la proporción de DGLA a AA en los lípidos que contienen DGLA es mayor de 25:1 en peso.
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