CN107254410A - 一种具有高gla含量的栅藻、其培养方法及其应用 - Google Patents
一种具有高gla含量的栅藻、其培养方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有高GLA含量的栅藻，还涉及该藻株的培养方法及应用。本发明的栅藻总脂的脂肪酸主要由十六碳、油酸、亚油酸和GLA组成，并且总脂中GLA的含量在优化的培养条件下稳定在35‑45％。例如，进行3L的发酵实验，120h后，培养物的细胞干重可达到19.48g L‑1，总脂含量为12.1％，总脂中GLA的含量为42.42％，GLA的产率为0.2g L‑1d‑1。因此，该藻株具有作为工业化生产GLA原料的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微藻及其培养技术，更特别地，涉及一种具有高GLA含量的栅藻、其培养方法及其应用。
背景技术
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA)是指含有两个或两个以上双键且碳长度为18-22个碳原子的直链脂肪酸，主要包括亚油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、α-亚麻酸(ALA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等。在PUFA中，距羧基端最远的双键在第3个碳原子上则成为ω-3(n-3)系列，如在第6个碳原子上则称为ω-6(n-6)系列。
γ-亚麻酸(γ-linolenic acid，GLA)为ω-6系列多不饱和脂肪酸，是人体的必需脂肪酸，参与到多种代谢途径和组织结构中，它在人体组织中存在时间很短，且含量很少。正常人从食物中摄取的亚油酸(linoleicacid，LA)经Δ-6脱氢酶化为GLA，进而代谢为二高-γ-亚麻酸(doom-γ-Linolenic acid，DGLA)，再转变成前列腺素E1(PGE1)，或经Δ-5脱氢酶转化为花生四烯酸(arachidonic acid，AA)生成其它前列腺素(PGS)。但当人体摄取过量的饱和脂肪酸或出现脂肪酸代谢紊乱时，Δ-6脱氢酶受到抑制，则影响亚油酸向GLA的转化，可造成体内前列腺素缺乏，导致多种疾病产生。此时，需要及时补充GLA来防止或治疗相应的疾病。因此，GLA可在抗炎、降血脂、抗肿瘤、改善糖尿病并发症、防治高血压和动脉粥样硬化、抗心脑血管疾病等方面起重要作用。
目前，在一些高等植物、蓝藻和异养微生物中均发现有GLA的存在。月见草(Oenothera biennis L1)种子中油脂含量为15-25％，其中GLA占7-11.22％。玻璃苣(Boragoof ficinalis L1)种子中的油脂含量20-30％，其中GLA占15-25％。螺旋藻平均油脂含量为4-7％，在钝顶螺旋藻中GLA占总脂的8-25％，极大螺旋藻中GLA占总脂的24％左右。
在真菌中，被孢霉属(Mortierella ramanniana var)被认为是GLA的潜在工业生产原料，其总脂中80％左右为不饱和脂肪酸，GLA占总脂的10％左右。1985年，日本学者铃木修利用被孢霉发酵产GLA，发酵150h后,GLA的产量最高达到2.9g L-1，GLA产率为0.464g L- 1d-1(铃木修,1985)。
深黄被孢霉(Mortierella isabellina)是毛霉目中具有较高经济价值的丝状真菌，其菌体中油脂含量为55％-86％，油脂中GLA含量为3％-11％。有研究表明，将通过选育得到的深黄被孢霉菌株，在200L发酵罐内发酵培养96h，发酵菌体干重可达到25g L-1，菌体中油脂含量为67％，GLA含量为8％，最终可获得1.34g L-1的GLA，GLA产率为0.335g L-1d-1(邢来君和张宝文,1996)。何东平等通过诱变技术得到一种深黄被孢霉的突变株，突变株在86-125h的发酵周期内，每升发酵液生物量干重为27.5-34.1g，油脂占干重的55.9-60.3％，GLA占总脂的8.5-10.3％(何东平等,2014)。
但是由真菌来源获得的GLA中含有其α异构体，提高了生产和纯化的成本。
发明内容
发明人在研究过程中发现了一株栅藻，该藻株在不同条件下能进行光照自养生长、光照混养生长(自养/异养混合生长)和纯异养生长，在生长过程中能够积累高含量的油脂，并且，GLA占总脂含量的20％以上，当调节培养基成分后，GLA在总脂中含量最高可达45％，因此，该藻株可用于生产GLA。
基于以上发现和研究，本发明提供了一种栅藻，该藻株于2017年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2017282。
本发明的栅藻总脂的脂肪酸主要由十六碳、油酸、亚油酸和GLA组成，并且总脂中GLA的含量在优化培养条件下稳定在35-45％。例如，进行3L的发酵实验，120h后，培养物的细胞干重可达到19.48g L-1，总脂含量为12.1％，总脂中GLA的含量为42.42％，GLA的产率为0.2g L-1d-1。因此，该藻株具有作为工业化生产GLA原料的潜力。
本发明还提供了上述栅藻的培养方法，所述栅藻通过光照培养或异养培养。
在一个实施方案中，所述栅藻进行异养培养，所述栅藻进行异养培养，包括使用添加有碳源和氮源的基础培养基在黑暗条件下培养所述栅藻的步骤。在黑暗条件下，该藻株能够完全异养，生长速度比光照条件下更快。
在一个优选实施方案中，所述基础培养基为包含以下成分的水溶液：KH2PO4，0.7gL-1；K2HPO4，0.3g L-1；MgSO4 7H2O，0.3g L-1；FeSO4 7H2O，3mg L-1；甘氨酸，0.1g L-1；vitaminB1，0.01mg L-1；A5，1ml L-1。其中A5的成分为硼酸(H3BO3)2.86g/L，四水氯化锰(MnCl2·4H2O)1.81g/L，七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.22g/L，二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.39g/L，五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.08g/L，六水氯化钴(CoCl2·6H2O)0.01g/L。该基础培养基组分仅用于试验本发明的栅藻适合的氮源和碳源的种类和含量，而非限制本发明。本领域技术人员可根据需要选择任何需要的基础培养基来培养本发明的栅藻,例如，还可选择BG11培养基作为基础培养基。
在一个优选实施方案中，所述碳源为10-40g L-1的葡萄糖。葡萄糖的添加量对该藻株初期的生长速度影响不大，但是，培养到96h后，添加了20-40g L-1葡萄糖的培养基中，藻株仍然处于指数生长阶段，使得藻株最终能够达到更高的浓度，从而提高单位体积培养液中的脂肪酸产量。
在一个优选实施方案中，所述氮源为尿素、硝酸钾和/或酵母提取物。以尿素、硝酸钾和酵母提取物中的任一种或几种组合。适当的氮源有利于藻株的生长。
在一个优选实施方案中，所述氮源为1-10g L-1尿素。与其他氮源相比，尿素更便宜。尿素的添加量在1-10g L-1的范围内对总脂含量影响不大。但是，当尿素含量在4-7g L-1的范围内时，GLA的含量较高。
在一个优选实施方案中，所述栅藻的培养温度为25-35℃。该藻株在25-35℃下均能有良好生长，尤其在30-35℃之间，生长速度更快，状态更好，温度低于20℃时，藻株的生长速度显著降低。在25-30℃的范围内时，GLA的含量较高。
本发明还提供了上述栅藻在制备脂肪酸中的应用。
在一个优选实施方案中，所述脂肪酸为GLA。
本发明还提供了使用上述栅藻来制备脂肪酸，尤其是GLA的方法。
在一个优选实施方案中，用于制备脂肪酸的所述栅藻通过上述培养方法培养得到。
微生物保藏
本发明涉及的栅藻于2017年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 2017282。中国典型培养物保藏中心于2017年6月8日对该栅藻的存活性检测完毕，结果为存活。
附图说明
图1为栅藻HSJ296的光学显微照片；
图2为栅藻HSJ296在不同氮源下的生长曲线；
图3为栅藻HSJ296在不同尿素浓度下的生长曲线；
图4为栅藻HSJ296在不同尿素浓度下的总脂含量；
图5为栅藻HSJ296在不同温度下的生长曲线；
图6为栅藻HSJ296在不同温度下的总脂含量；
图7为栅藻HSJ296在不同葡萄糖浓度下的生长曲线；
图8为栅藻HSJ296在不同葡萄糖浓度下的总脂含量；
图9为栅藻HSJ296在发酵罐中的生长曲线。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.藻株筛选和保藏
研究人员通过分离纯化的方法从野外采集的水样中分离得到232株绿藻，用于筛选能够完全异养生长的GLA含量较高的绿藻。
发明人将232株除菌纯化的绿藻，接种到装有5ml葡萄糖浓度为30g L-1的BG11的试管中，利用控温摇床培养，培养温度设置为30℃，转速设置为150rpm，培养时间为5天。通过观察，筛选出30株能够完全异养的绿藻。将能够异养培养的30株绿藻，分别接种到装有120ml BG11的500ml三角瓶中培养，培养条件如前所述。培养5天后，离心收集藻液，冷冻干燥至恒重，分别称取0.1g藻粉并提取其油脂。将其油脂甲酯化，利用气相色谱测其油脂中脂肪酸组成及各成分的相对含量。
通过以上方法筛选出GLA占总脂含量最高的藻株，在培养条件未优化时GLA占总脂含量为25.78％。使用光学显微镜观察藻细胞形态，显示其具有栅藻属特征(图1)。提取藻细胞DNA为模板，用18S rDNA通用PCR引物扩增得到18S rDNA，进行测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。经序列比对，确认其属于栅藻属(Scenedesmus)，将其命名为栅藻HSJ296(Scenedesmus sp.HSJ296)
发明人于2017年5月24日将该藻株送至湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内的典型培养物保藏中心(CCTCC)进行微生物保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2017282。
2.栅藻HSJ296培养条件的优化
基础培养基：KH2PO4，0.7g L-1；K2HPO4，0.3g L-1；MgSO4 7H2O，0.3g L-1；FeSO4 7H2O，3mg L-1；甘氨酸，0.1g L-1；vitamin B1，0.01mg L-1；A5，1ml L-1。该基础培养基组分仅用于为栅藻HSJ296提供一些必须营养元素，并用于试验培养栅藻HSJ296时需要的最佳碳源和氮源，及其浓度，而非限制本发明。本领域技术人员可根据自己条件和需要使用其他基础培养基的组分组合。
2.1氮源的优化
在30℃黑暗异养培养条件下，利用基础培养基摇瓶培养栅藻HSJ296时，比较了5种氮源，即尿素、硝酸钾、硝酸铵、甘氨酸和酵母提取物对藻株生长的影响。培养基内葡萄糖浓度均为6g L-1，5种氮源的浓度均为1g L-1，振荡培养120h。
结果如图2所示，相比其他氮源，尿素最适合栅藻HSJ296的生长。其次，以酵母提取物或硝酸钾作为氮源时，栅藻HSJ296生长良好。但以硝酸铵或甘氨酸作为氮源时，栅藻HSJ296生长很慢。
为了进一步研究尿素对栅藻HSJ296生长的影响，我们设置了1-10g L-1范围内的四个尿素浓度梯度，进行藻株培养。栅藻HSJ296在不同尿素浓度下的生长曲线如图3所示，1-10g L-1的尿素浓度范围内，藻株生长速率的差距不大，尿素浓度为4g L-1时稍好。总脂含量如图4所示，尿素浓度为1、4、7和10g L-1时，其总脂含量分别为9.83％、10.93％、10.33％和10.78％。尿素浓度为4g L-1，其总脂含量稍高。
因此，尿素浓度为4g L-1时，最适合栅藻HSJ296的培养。
不同尿素浓度下栅藻HSJ296总脂的脂肪酸组成如表1所示。
表1不同尿素浓度下栅藻HSJ296总脂的脂肪酸组成(mol％)
2.2培养温度的优化
在黑暗异养培养条件下，利用基础培养基摇瓶培养栅藻HSJ296时，基础培养基内尿素浓度为4g L-1，葡萄糖浓度为20g L-1，研究了温度对藻株生长的影响。我们设置了四个温度梯度，振荡培养120h。
栅藻HSJ296在不同温度下的生长速率如图5所示，培养温度为30℃时，栅藻HSJ296的生长速率最快；在20℃和25℃时，栅藻HSJ296的生长速率都较慢；在35℃时其生长状态良好。该实验结果证明温度对栅藻HSJ296的生长速率影响较大。总脂含量如图6所示，，温度为30℃时，栅藻HSJ296的总脂含量为11.43％；温度为20℃、25℃和35℃时，总脂含量分别为10.63％、10.87％和10.93％。温度为30℃，该藻的油脂含量为最高。该实验结果证明，温度对栅藻HSJ296的油脂积累的影响不大。
因此，从生长速率和油脂含量两方面考虑，30℃都为栅藻HSJ296的最适培养温度。
不同温度下栅藻HSJ296总脂的脂肪酸组成如表2所示。
表2不同温度下栅藻HSJ296总脂的脂肪酸组成(mol％)
2.3糖浓度优化
葡萄糖是维持藻株异养生长的最常见的碳源。在探索初始葡萄糖浓度对栅藻HSJ296生物量积累的影响时，我们将葡萄糖浓度梯度设置为10、20、30和40g L-1，在黑暗异养培养条件下，利用摇瓶振荡培养栅藻HSJ296。基础培养基中的尿素浓度为4g L-1，培养温度为30℃。当然，葡萄糖只是用作藻细胞生长的碳源的一种例子，并非用于限制本发明。本领域技术人员可根据自己条件和需要使用其他碳源。
栅藻HSJ296在不同的葡萄糖浓度下的生长曲线如图7所示，在10-40g L-1初始葡萄糖浓度范围，在96h以内对栅藻HSJ296的生长影响不大。但初始葡萄糖为10g L-1时，培养到96h以后，藻株基本不生长；而初始糖浓度为20、30和40g L-1时，培养到96h以后，藻株仍呈指数期生长。
由以上数据可知，当基础培养基中初始葡萄糖浓度为10g L-1时，培养到96h后，培养基内的葡萄糖被基本消耗，培养基内缺乏碳源，藻株停止生长。培养120h后，藻株的产量分别为4.97、9.34、10.4和11.02g L-1(图中未显示)。以上数据说明，在异养培养条件下，葡萄糖对微藻生长的影响较大。
对于总脂的积累，如图8所示，当葡萄糖浓度在10-40g L-1之间时，总脂含量分别为10.43％、10.22％、10.42％和10.06％，略有波动。初始葡萄糖浓度对该藻油脂的积累影响不大。
不同葡萄糖浓度下栅藻HSJ296的总脂脂肪酸组成如表3所示。
表3不同葡萄糖浓度下栅藻HSJ296总脂的脂肪酸组成(mol％)
根据以上实验结果，在后续的发酵培养实验中，我们可以根据发酵需要在20-40gL-1的葡萄糖浓度范围内选择合适的糖浓度，进行发酵。
3.发酵罐培养
利用基础培养基异养培养栅藻HSJ296 120h,培养温度为30℃，初始葡萄糖浓度为20g L-1，尿素浓度为4g L-1，转速为200rpm，不控制pH。
如图9所示，培养时间在52-88h之间，细胞开始呈指数生长，第90h之后，该藻进入平台期。在第52h，葡萄糖也开始被快速消耗，在第76小时，葡萄糖浓度下降到4g L-1(数据未显示)。培养至120h，栅藻HSJ296停止生长，细胞干重达到19.48g L-1，总脂含量为12.1％，总脂中GLA的含量为42.42％。GLA的产量可达到1g L-1，即GLA的产率为0.2g L-1d-1。
发酵罐培养的栅藻HSJ296的总脂脂肪酸组成如表4所示。
表4发酵罐培养的栅藻HSJ296的总脂脂肪酸组成(mol％)
通过改良微藻的培养条件和培养方式来提高微藻的生长速率和GLA的产量，结果显示栅藻HSJ296的最适培养温度为30℃，最佳氮源为4g L-1尿素，葡萄糖初始浓度在20-40gL-1范围内都适合该藻的生长。在优化培养条件下，栅藻HSJ296总脂的脂肪酸主要由十六碳(C16:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)和GLA组成，并且总脂中GLA的含量稳定在35-45％之间。
进行3L的发酵实验，120h后，栅藻HSJ296的细胞干重可达到19.48g L-1，总脂含量为12.1％，总脂中GLA的含量为42.42％，GLA的产率为0.2g L-1d-1。将来，随着发酵条件的进一步优化，GLA的产量有望获得显著提高。栅藻HSJ296具有作为工业化生产GLA原料的潜力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院水生生物研究所
<120> 一种具有高GLA含量的栅藻、其培养方法及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1849
<212> DNA
<213> Scenedesmus HSJ296
<400> 1
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Claims (10)
1.一种栅藻，其特征在于，于2017年5月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO：M 2017282。
2.权利要求1所述的栅藻的培养方法，其特征在于，进行光照培养或异养培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述栅藻进行异养培养，包括使用添加有碳源和氮源的基础培养基在黑暗条件下培养所述栅藻的步骤。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述碳源为20-40g L-1的葡萄糖。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述氮源为尿素、硝酸钾和酵母提取物中的任一种或几种组合。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述氮源为1-10g L-1尿素。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的培养方法，其特征在于，所述栅藻的培养温度为25-35℃。
8.权利要求1所述的栅藻在制备脂肪酸中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述脂肪酸为GLA。
10.一种制备GLA的方法，其特征在于，从权利要求1所述的栅藻中提取GLA。
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