CN113862323A - 一种培养用于制造虾青素的红球藻属生物的方法 - Google Patents
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Abstract
一种培养红球藻属(Haematococcus)生物用于制造虾青素的方法，包括以下步骤：‑准备一基材‑将红球藻属生物排列在基材表面‑从培养过程的开始，将排列在基材上的红球藻属生物暴露于高光照强度下，和避免红球藻属生物的两步培养过程，这种两步法的第一步初始培养是将红球藻属生物暴露于低光能下培养，接着第二步继续培养红球藻属生物，将红球藻属生物暴露于相对于前一步骤中更强的光能下，从而诱导虾青素的合成，并且任选地；‑收获培养的红球藻属生物；和/或‑分离虾青素。
Description
本申请是申请日为2016年9月9日，申请号为2016800528556，发明名称为“一种培养用于制造虾青素的红球藻属生物的方法”的发明申请的分案申请。
本发明涉及一种改进的培养制造虾青素所用的红球藻属(Haematococcus)生物的方法。
微藻，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)因为它的次级代谢化合物虾青素而被熟知，虾青素具有高染色和抗氧化性能。它的着色作用主要被运用在水产养殖业，以增强三文鱼和虾肉的粉红色(Lorenz和Cysewski 2000)。作为抗氧化剂，虾青素已经投入市场作为人类健康补品(例如AstaReal，Algatechnologies公司，赛安诺科技公司，纽力克斯夏威夷公司，富士健康科学公司)。目前，虾青素主要的来源是化学合成(例如CARDAX和BASF，只能用于饲养动物)。
然而，天然来源的虾青素引起了人们越来越多的关注，并且有着很高的价值，这是因为一些研究发现天然的或者“生物学”的虾青素产物具有更好的生物利用率和抗氧化性，并且普遍能得到消费者们更多的青睐(Nguyen 2013)。
但是，从雨生红球藻产生虾青素仍是一昂贵的并且富有挑战性的技术。在一定程度上，这是由于只有在细胞停止分裂时雨生红球藻中才能产生虾青素的事实。因为虾青素的产生只有在一定的压力因素下被诱导，例如高光强度(大于200μmol光子m-2s-2)、盐胁迫和营养素缺乏(Aflalo等，2007)。
基于此，现有技术包括两个阶段：(i)“绿相”，此阶段中的培养参数对于产生高细胞密度以提供足够的生物量是最佳的(光强度：50-200μmol光子m-2s-1；温度：20-25℃；pH6.5-8)；(ii)“红相”，此阶段中应用压力增强虾青素的产量和累积，同时伴有细胞分裂的显著减少或停止。于是，对产物虾青素监测可发现，此已经建立的技术方案中，约占用了50％生产周期的绿相没有任何的虾青素产出(Suh等.2006；Aflalo等.2007)。并且，由于要求两个独立的生物反应系统，包含两步骤的方法有更高的技术要求：为提供弱光强度，绿相通常需要在室内进行，用人造光源进行照射来避免光化学应激；而红相则需要在室外光生物反应器中发现的高太阳能辐照度。
两步法除了这些显而易见的缺陷之外，此现有技术培养技术还是基于管式反应器和开放池中的悬浮生长(Lorenz和Cysewski，2000)。然而，熟知这些系统的建立、运行和维护需要很高的成本(Ozkan等，2012)。生物反应器设计的最新进展表明，基于生物膜的生物反应器可能克服悬浮型生物反应器的一些缺点(例如Berner等，2014)。具体来说，在低光强下，利用多孔基材生物反应器，雨生红球藻能够在生物膜中成功地生长(Wan等，2014；Yin等，2015；Zhang等，2014)。在溶胶-凝胶固定的活微藻中也能检测到虾青素的形成(Fiedler等，2007)。
本发明的目的是在一步过程中利用生物膜(固定的)培养红球藻来改进虾青素生产方法，该方法利用高光强度以提高生物产量，从而诱导和增加虾青素的产量。本发明的另一个目的是避免现有技术的两步过程的缺点。
发明概述
本发明的目的通过培养用于制造虾青素的红球藻属生物的方法得以解决，所述方法包括以下步骤：
-提供基材，
-将红球藻属生物排列在基材的表面上，
-从培养过程的开始，将排列在基材上的红球藻属生物暴露于高光照强度下，和
-避免红球藻属生物的两步培养过程，这种两步法的第一步初始培养是将红球藻属生物暴露于低光能下培养，接着第二步继续培养红球藻属生物，将红球藻属生物暴露于相对于前一步骤中更强的光能下，从而诱导虾青素的合成；
-任选收获培养的红球藻属生物；和/或
-分离虾青素。
本发明基于这样的意外发现：第一步(绿相)中，在低光照条件下产生足够量的红球藻属生物的细胞量，从而在足够量的细胞量形成后，在高光强度下诱导虾青素形成，这并不是强制性的。
与根据现有技术的两步培养雨生红球藻属生物方法相反，本发明提供了在强光下一步培养生物量和虾青素的制造方法，并且维护和收获成本低，特别是通过应用生物膜光生物反应器。
根据本发明，本领域技术人员将术语高光强度理解为不是相对术语，而是作为具体术语，例如，相当于至少约150,200,250或500μmol光子m-2s-1或更多。
应激因素是环境影响，其诱导红球藻属生物特别是雨生红球藻的虾青素产生，例如150μmol光子m-2s-1以上的光强度，盐度(0.8％NaCl)，高于30℃的温度和营养缺乏，特别是氮和磷的营养缺乏，但其他缺陷也可以发挥作用。具体而言，如本文所述的生物膜中生长的红球藻属生物特别是雨生红球藻细胞中的虾青素含量，在除了高光强度之外，同时使细胞培养于不含氮或磷源的培养基时，仍可以增加约50％。在相同的设置下，通过施用氮和/或磷消除，每个生长表面的总虾青素生产能力仍然可以增加至约15％。
用于培养雨生红球藻的光照通常在300nm至780nm的紫外和可见光范围内。
有些资料显示，在高光照强度下(约1,000μmol光子m-2s-1)，雨生红球藻的生物量增加，但是虾青素积累较低，只有当高光条件与营养限制条件同时存在时才会产生虾青素(DelRío等，2005；Garcia-MaleaLópez等，2006)。根据本发明，整个培养过程可以在高强度(自然)的光照下一步进行，并且根据收获方法，可以将其优化成具有高生物量、高虾青素含量和产量的连续生产过程。经历了超过10天强度为785μmol光子m-2s-1的光照后，生物量可达16g干物质m-2d-1，其中虾青素含量为干物质的2-2.5％。因此，虾青素产量可以达到0.39mg m-2d-1。在传统的两步法中，即使仅仅在第二步，即红相中，这些值趋于较低。Wang等人观察到，考虑到两个步骤的整个周期的更精确的值会更低(2013年)。
在本发明的一个实施例中，红球藻属生物是雨生红球藻。本发明将通过参考雨生红球藻进行进一步描述。本领域技术人员可以理解，与雨生红球藻有关的公开对于能够产生虾青素的其他红球藻属生物也是有效的。
在本发明的另一个实施方案中，第一步(绿相)中的低光能为约50μmol光子m-2s-1至小于约200μmol光子m-2s-1。
在又一个实施方案中，第二步(红相)中较高的光能为至少约200μmol光子m-2s-1，特别是至少约500μmol光子m-2s-1。
在本发明的另一个实施方案中，将红球藻培养在材料(基材)的表面上。
在本发明的又一个实施例中，该材料是片状材料。
在本发明的另一个实施例中，片状材料是多孔的。
在本发明的另一个实施方案中，片状材料选自纸，纤维素酯，特别是醋酸纤维素，混合纤维素酯，纤维素，硝酸纤维素，聚酰胺，聚酯和/或聚烯烃。
图1描绘了一个实验室规模的双层试管。
图2显示了在不同光照强度下培养的雨生红球藻的生物量和虾青素产量。
图3比较了本文介绍的10天一步法所得的，与假设的PSBR两步过程相结合的5天“绿相”和5天“红相”一共所得的雨生红球藻的生物量(g m-2)和虾青素(g m-2)产量。
发明详述
在WO 2005/010140 A1中描述了在生物膜中培养微藻的特别有用的方法以及它们的生长和虾青素的收获，特别是用于本发明的多孔基质。该参考文献通过引用并入。图1描绘了一个实验室规模的双层试管。由Schultze等人(2015)提出的alg-固定的微藻，pcm-聚碳酸酯膜作为微藻的载体，gf-玻璃纤维垫，用于空气供应的空气膜泵，cm培养基在各种光照和二氧化碳条件下于生物膜中培养微藻。Liu等人(2013)；Murphy等人(2012)；Nowack等人(2005)描述了实现WO 2005/010140A1中描述的原理的多孔基质生物反应器的其他实验室规模的改进，这些文献通过引用并入。
Naumann等人(2013)和Zhang等人(2015)描述了这种提供高达几平方米基材表面的用于生物膜培养的特定技术的放大，这些文献全部通过引用并入。
使用由Zhang等人(2014)，Wan等人(2014年)和Yin等人(2015)提出的装置在低光强下使用多孔基材生物反应器生长雨生红球藻，全部通过引用并入。
不同于将雨生红球藻培养在这些多孔基材生物反应器的变体中，雨生红球藻可以被固定在不显示两个主表面的其他基材的生物膜中生长。这可以是可变或固定的结构等，这种结构与用在生物膜表面上的培养基一起提供。
通过使用这些培养步骤，可以培养雨生红球藻并且将其置于高光强度下。
图2显示了如下文实施例1中所述的实验中，在不同光照水平并补充5％CO2的条件下对雨生红球藻的培养。在45μmol m-2s-1的低光照强度下(与悬浮培养的绿相相当)，不会产生虾青素，并且只有中等量的生物量。大约530和785μmol m-2s-1的高光强度导致生物量和虾青素产量平行增加，表明(i)通过高光诱导虾青素不会影响生物量的增加，如在悬浮型生物反应器中观察到的，以及(ii)虾青素的生产可以通过连续的一步过程进行，其不经过非生产性(绿相)培养阶段。在785μmol m-2s-1的光强下能达到最高的虾青素生产率。高光诱导下虾青素的总生产率约为0.39g m-2d-1，在实验期间呈线性，在生长10天后达到3.3g m-2。在更长的培养期间，虾青素可以高于4g m-2，并且在更高的光强度如1,013μmol m-2s-1时，虾青素生产力仍然高达0.32g m-2d-1(数据未显示)。实验者构建了假设的两阶段实验，以和本发明的一阶段系统进行生产力的比较。
图3比较了使用本文的16天一步法的生物量(g m-2±SD，n＝3；图3A)和总虾青素(gm-2±SD，n＝3；图3B)与使用PSBR两步法，其包括8天的“绿相”和8天“红相”的生物量与总虾青素量，以比较光线是唯一应用的应激因素时两种方法的效率。一步法中暴露于1000μmol光子m-2s-116天(黑方块)，而两步法中暴露在90μmol光子m-2s-1下8天和在1,000μmol光子m-2下8天(灰色方块)。垂直虚线表示两步法中何时切换光强度。明/暗周期为14/10小时，并且在整个培养期间通气并供应5％的CO2。生物量在每个培养阶段都呈线性增加，但速度差异很大(图3A)。在低光照条件下能够观察到5.4g m-2d-1的生长速率，当转为高光照时，其增加到17.2g m-2d-1。这个值与在一步法中在前8天期间1,000μmol光子m-2s-1直接培养的而获得的值相似。并且，在第8天，产量数值为146g m-2，而两步法平均为48.2g m-2，一步法高出三倍。分析总虾青素量时观察到了类似的趋势：两步法中的产量仅发生在高光强下，与一步法前8天观察到的相似：0.34和0.35g m-2d-1(图3B)。在第8天，在1,000μmol光子m-2s-1强度下虾青素产量为2.5g m-2，在90μmol光子m-2s-1下虾青素产量为0.08g m-2，导致32倍的增加。这种差异在暴露于强光后被消除，并且在第16天两组的虾青素产量均达到2.8g m-2。但是，在两步法系统中，它需要的时间两倍于一步法。因此，高辐照度的影响与暴露的开始无关。也就是说，使用弱光强的绿相阻碍了高生产率，它需要较长的培养时间才能达到相似的产量，这增加了成本和污染风险。
根据本发明，在培养之后，通过机械力的作用，例如通过刮刀或气刀或其他用来吹掉材料的合适的工具，雨生红球藻可以从支持物特别是穿孔的支持物上解离，或者，通过化学处理如用表面活性剂和/或有机溶剂处理。
在另一个实施例中，雨生红球藻可以与穿孔支持物一起收获。例如，如果雨生红球藻已经分解残留在支持物上，那么可以通过提取获得成分，这是可以操作的。提取的雨生红球藻或细胞碎片可以与提取物一起与支持物机械分离。
在又一个实施方案中，可以使用(低)体积的液体(例如水，培养基)从穿孔支持物上洗去固定化的雨生红球藻，获得用于进一步处理的浓缩悬浮液(浓缩，干燥，和/或提取虾青素)或雨生红球藻可以通过在流动培养基中收集松散的生物质来获得。
具体而言，干燥后可将雨生红球藻从支持物上解离，然后收集。
在另一个实施方案中，雨生红球藻可以在干燥或不干燥之后或不提取虾青素的情况下从支持物上解离下来并被使用。
在又一个实施方案中，当雨生红球藻保留在支持物上并且用化学物质从雨生红球藻上除去虾青素时，可以通过用化学品如溶剂特别是有机溶剂处理来提取虾青素。
具体而言，可以通过利用有机溶剂的方法从干燥或浓缩的雨生红球藻细胞中提取虾青素(Dong等，2014)，如盐酸预处理，然后丙酮萃取，己烷/异丙醇混合溶剂萃取，甲醇萃取然后丙酮萃取，或其他天然油如大豆油或棕榈油。此外，虾青素可以在粉碎雨生红球藻细胞之后通过使用二氧化碳超临界萃取(例如Nobre等人，2006)。
本发明是通过以下非限制性实施例来描述的。
实施例1
实验装置
台式生物膜光生物反应器
Schultze等人(2015)描述了使用的台式双层光生物反应器(PBR)，该文献通过引用并入本文。简而言之，该系统由在聚氯乙烯(PVC)支架上的透明PMMA管(长50厘米，直径12厘米)内垂直放置的玻璃纤维垫(50×10厘米)组成。培养基不断由蠕动泵循环。它被置于在玻璃纤维的顶部，通过重力向下扩散并返回到PVC支撑件内的中间储存器。给该系统提供1L培养基，每2-3天更换一次以避免营养限制藻类生长。在PVC管内提供通气。
为了接种到生物反应器，浓缩雨生红球藻悬浮培养物，然后如Naumann等人(2013)所述，被过滤到聚碳酸酯膜上(PC40，孔径0.4μm，直径25mm，Whatman，Dassel，德国)，以获得5g m-2的初始生物量密度，参考文献通过引用并入。然后将过滤器放置在PBR上的湿玻璃纤维垫上。
在一步法中，在整个实验期间使用富含营养物的培养基，并测试了不同的光强度。为了比较，在低光下进行两步实验。完全培养基最初用于生长。6天后，通过改变培养基诱导应激，即除去氮源和/或额外的盐(0.8％)。
取样和测定干重
在每个取样点，从每个PBR收集至少三个过滤器。已经长出接种区域的细胞被移除并且将过滤器冷冻干燥至恒重。通过重量分析测定干重并将细胞储存在-20℃以备虾青素分析。
虾青素测定
如Li等人(2012)所述，通过分光光度法测定虾青素。用二甲基亚砜(DMSO，默克公司，达姆施塔特，德国)提取冷冻干燥的生物质样品，在70℃温育5分钟，然后以4000g离心5分钟。重复提取直到获得无色颗粒。收集上清液并在测量530nm的OD值(Infinite M200板读取器，Tecan，
瑞士)。当需要完全提取时，通过用沙子研磨破碎细胞。基于用DMSO中溶解和稀释的虾青素标准品(98.6％纯度，Dr.Ehrenstorfer，Ausburg，德国)构建的校准曲线确定虾青素浓度。
此外，适用于促进微藻生长的其他人工或天然培养基可用于雨生红球藻的培养。
补充的CO2有利于促进生物量生长，特别是在高光照条件下，但是这不是必需的。
光源通常可以是人工照明和利用自然阳光，而出于经济原因(特别是如果需要高强度的话)可能优选使用日光。
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Claims (9)
1.一种用于改进虾青素生产的方法，所述方法包括在一步过程中利用生物膜在基材上于高光强度下培养红球藻属(Haematococcus)生物，以提高生物产量，同时诱导和增加虾青素产量，其中所述高光强度为200μmol光子m-2s-1或更高。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述虾青素从收获的红球藻属生物中分离。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述红球藻属生物是雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基材是片状材料。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述基材是多孔片材。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述片状材料选自：纸、纤维素酯，特别是醋酸纤维素、混合纤维素酯、纤维素、硝酸纤维素、聚酰胺、聚酯和聚烯烃。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养期间使用14/10小时的明/暗周期与5％CO2。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述虾青素产量高于4g m-2。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述低光照条件并不是强制性的，其中所述低光照为50μmol光子m-2s-1至小于200μmol光子m-2s-1。
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