CN109825546B - 一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：将雨生红球藻置于附着式培养系统中进行培养，并在雨生红球藻的培养过程中利用人工光源，同时人工控制其他生长因素，使雨生红球藻在与外界隔离的情况下生长并积累虾青素。本发明利用人工照明代替阳光，在与外界完全隔离的情况下利用附着式培养系统培养雨生红球藻以生产虾青素，完全避免了天气等外界因素对雨生红球藻的生长和虾青素生长的影响，达到全年不间断的稳定生产，不再局限于年日照量高，气候温和的地理位置，可以在任何地方进行。本发明单位占地面积产出率高，生产效率远高于现有雨生红球藻培养系统系统。
Description
技术领域
本发明属于生物物质制备技术领域，具体为一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法。
背景技术
天然虾青素是目前已知的最强抗氧化剂，可被作为一种新型的活性因子应用在食品、饮料、化妆品、护肤品、药品之中。因此天然虾青素具有巨大的市场潜力。目前公认的最佳的天然虾青素的生产方法是利用雨生红球藻。雨生红球藻是属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属的微生物。在有利的环境下为绿色的虫体细胞，以分裂的方式生殖，而在不利的环境下，虫体细胞会停止分裂并转化为红包囊，同时开始大量的产生并积累虾青素。据文献报告，某些雨生红球藻红包囊的虾青素含量可以达到细胞干重的5％以上。鉴于雨生红球藻的上述特点，使用雨生红球藻的培养来获得虾青素的方法一般需要两个阶段：1)绿色虫体培养阶段以积累细胞数量；2)红色包囊阶段以积累虾青素(即绿-红两段培养)。而目前大规模的雨生红球藻生产均使用光照作为诱发红色包囊形成的因素，即在绿色虫体培养阶段使用弱光，再使用强光诱发红色包囊的产生，这种类型的培养方法在近十年中并没有重大的改进。
目前，雨生红球藻的工业化生产均使用日光作为最主要的光源，雨生红球藻在生产过程中需要被直接或间接的暴露在外界环境中。因此，外界环境(如天气变化)会直接影响雨生红球藻的生长，从而导致虾青素产量的不稳定等一系列问题，严重时还可能导致雨生红球藻的大量死亡。同时，雨生红球藻的培养和天然虾青素的生产被限制在了全年阳光比较充沛且温度比较恒定的地理位置。同样的，目前雨生红球藻的工业化生产均使用浸没式培养系统，相对于附着式培养系统，浸没式培养系统有着细胞浓度低、占地面积大、易受污染、细胞后处理能耗高、耗水量大等缺点。
于2011年10月20日申请的、专利号为201110319768.1的中国发明专利提供了一种使用LED培养雨生红球藻的方法，但此方法只是用红色、蓝色两种单色的LED光源，且只适用于浸没式的培养系统。
于2005年5月11日申请的、专利号为200510043526.9的中国发明专利也提供了一种仅适用于浸没式培养系统的红色、蓝色两种单色的LED光源进行雨生红球藻培养的方法。
于2015年申请的、专利号为201580017963.5的中国发明专利给出了另一种只使用红色、蓝色两种单色的LED培养雨生，红球藻的方法。以上方法相较于使用阳光作为光源的培养方法，其虾青素的产量有一定提高，但仍无法达到理想的产量。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：
将雨生红球藻置于附着式培养系统中进行培养，并在雨生红球藻的培养过程中利用人工光源，同时人工控制其他生长因素，使雨生红球藻在与外界隔离的情况下生长并积累虾青素。
作为本发明的一种优选技术方案，雨生红球藻是指属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属的微生物。
作为本发明的一种优选技术方案，附着式培养系统是指将雨生红球藻附着在浸有液体培养基的固体载体表面进行培养的培养系统，固体载体附着有雨生红球藻细胞的表面直接接触气体相。
作为本发明的一种优选技术方案，固体载体是指任意一种有吸水性的多孔固体材料、或吸水性的多孔固体材料与其他材料构成的结构；
在培养系统内部，即雨生红球藻能够接触到的所有部分，包括培养基、固体载体、固体载体四周的气体相以及输送培养基、气体相的管道及设备，是与外界环境隔离的洁净环境。
作为本发明的一种优选技术方案，人工光源为集成发光二极管组成的阵列，LED阵列由发出不同波长的可见光LED灯珠、紫外光LED灯珠、红外光LED灯珠任意组成；
可见光LED灯珠是指能够产生波长400nm～700nm的LED灯珠；
紫外光LED灯珠是指能够产生波长200nm～400nm的LED灯珠；
红外光LED灯珠是指能够产生波长700nm～1000nm的LED灯珠；
LED阵列所产生的光的光谱的特征之一为：其可见光光段的有两个波峰，分别在410hm～490nm之间和610hm～690nm之间；其紫外光段有两个个波峰，分别在200nm～300μnm之间和300nm～400nm之间；其红外光段的有一个波峰，在700nm～1000nm之间；
可见光光段按通量密度计算，其400nm～500nm光与600nm～700nm光的比例为20∶1～1∶20；
LED阵列的所产生的光的光谱的特征之二为：按光通量密度计算，可见光与紫外光的比例为1∶10～10∶1，可见光与红外光的比例为1∶10～10∶1；
LED阵列所产生的光的强度，在到达被雨生红球藻细胞附着的固体载体表面时，按光通量密度计算，在100μmol·m-2·s-1～5000μmol·m-2·s-1之间；
LED阵列对雨生红球藻在生长过程中的照射时间为每天4～24小时。
作为本发明的一种优选技术方案，LED阵列的光谱、光强在雨生红球藻的培养过程中保持不变，或根据细胞生长阶段的不同进行变化和调整。
作为本发明的一种优选技术方案，人工控制的其他生长因素包括温度、二氧化碳浓度、培养基的组成与各个组分的浓度。
作为本发明的一种优选技术方案，温度是指雨生红球藻生长过程中的培养基的温度以及培养环境的气温，此温度为12℃～38℃；
二氧化碳浓度是指在雨生红球藻直接接触的气体相中的二氧化碳的气体分压占的总气压的百分比，此浓度为0.04％～10％；
培养基是指为雨生红球藻提供在生长过程中所需要的养分的液体物质，其组成成分包括可以被雨生红球藻吸收利用的氮、磷、微量元素、维生素以及其他促生长成分；
培养基中氮元素浓度为0mM～35mM，磷元素的浓度为0mM～20mM；
培养基中微量元素包括钠、钾、镁、硼、钙、锌、锰、钼、铜、钴中的一种或几种；
其他促生长成分包括醋酸及其盐、过氧化氢、乙醇、土壤溶出液、可溶性的腐殖质、单糖中的一种或几种。
作为本发明的一种优选技术方案，培养基的成分在雨生红球藻的培养过程中保持不变，或根据细胞生长阶段的不同进行变化和调整。
作为本发明的一种优选技术方案，根据具体培养条件的不同，雨生红球藻藻种的不同和对虾青素含量要求的不同，需要的培养时间为2～50天。
本发明的有益效果是：
(1)本发明利用人工照明代替阳光，在与外界完全隔离的情况下利用附着式培养系统培养雨生红球藻以生产虾青素，完全避免了天气等外界因素对雨生红球藻的生长和虾青素生长的影响。用本发明所述的方法培养雨生红球藻可以达到全年不间断的稳定生产。同时，本发明使得雨生红球藻的生产不再局限于年日照量高，气候温和的地理位置，本发明中所述的封闭的培养环境使雨生红球藻的培养可以在任何地方进行。
(2)本发明通过使用LED人工照明代替阳光，通过组合不同的LED灯珠，对雨生红球藻在生长时的光照光谱、光照光强、光照时间进行了优化和强化，去除了多余的光波段。配合先进的细胞浓度极高的附着式培养系统，有效地提高了雨生红球藻细胞对光的利用率。相比采用阳光的浸没式培养方法，本发明所述的培养系统能够更高效率的培养虾青素含量更高的雨生红球藻。同时，LED的高效率也保证了本发明所述的培养方法优秀的能耗与虾青素产出的比率。
(3)本发明所述方法将单位面积的虾青素产量较目前广泛应用的以阳光为光源的传统浸没式培养方法提高了23倍以上。相比其他文献中使用LED的方法，提高了11倍以上。且并不一定要使用传统的绿-红两段式培养法，大大提高了虾青素的生产效率，同时保证了虾青素的全年候稳定生产。
附图说明
图1为本发明所述培养方法使用的培养系统的示意图。
图2为实施例中使用本发明所述方法与对照例1、对照例2中培养方法培养雨生红球藻的生物质的年生产量的对比。
图3为实施例中使用本发明所述方法与对照例1、对照例2中培养方法虾青素年生产量的对比。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。本发明所举实施例中所使用的分析检测方法如下：
(1)雨生红球藻在培养系统中的生物质浓度的测定
将收获的雨生红球藻膏体(实施例)、含有雨生红球藻的培养基(对照例)离心获得浓缩的生物质。将获得的生物质在-56℃下冷冻干燥，并计算出细胞干重量，此数值为雨生红球藻在培养系统中的生物质浓度。上述浓度除以各个被收获系统的占地面积再乘以单位换算常数得到单位占地面积的生物质浓度。
(2)雨生红球藻细胞虾青素含量测定
从不同的系统中获得的冻干生物质中称取5mg。将称取的生物质放入1mL丙酮中，用细胞破碎机(奥盛，Bioprep-24，中国)破碎(10颗2.8mm不锈钢珠，30秒，6.5m/s，9循环)，离心后取出上清液装入干净容器，将沉淀物继续用1mL的丙酮萃取4次，每次萃取并离心后的上清液汇入装有破碎离心上清液的同一容器。将此容器中的丙酮溶液稀释10倍得到丙酮稀释液。向上述丙酮稀释液中按1∶1体积比加入含有胆固醇酯酶的Tris-HCl pH7.0的缓冲液，缓冲液中胆固醇酯酶浓度为4单元/mL。在37℃下反应45分钟，将虾青素酯转化为游离虾青素。按体积比1∶1向上述溶液中加入石油醚以将游离虾青素萃取到石油醚中。离心使得石油醚和含有丙酮的水相分离，将石油醚小心取出后放入一个洁净的容器。使用氮气在低温下将石油醚蒸发，将干燥后的遗留物溶解到与丙酮稀释液体积比为1∶1的高纯丙酮中。将20μL的上述高纯丙酮溶液用高效液相色谱仪进行分析(Infinity 1260，安捷伦，美国；柱为InfinityLab 120 HILIC 2.1x150mm，2.7μm，安捷伦，美国；流动相为82：18的己烷：丙酮；流速1mL/分钟；定量波长474nm)。最终虾青素的浓度根据虾青素的标准曲线计算得到(虾青素标准≥98％，西格玛，德国)。将上述方法获得的虾青素浓度换算为mg虾青素/g冻干生物质，再乘以各个系统单位面积的生物质浓度、单位换算常数换算为单位占地面积的虾青素产量。
实施例
使用UTEX2505(德克萨斯州立大学藻种库，美国)作为培养的雨生红球藻藻种，使用标准的3倍氮BBM液体培养基作为培养基，使用两边贴有厚度为1mm天然棉无纺布的硬质PP塑料网作为固体载体。将0.1米宽、1米高的固体载体以20cm的间隔垂直地面放置，即在0.1米宽，1米长的面积上平行摆放5块固体载体。使用波峰值为270nm、390nm、450nm、660nm、840nm的LED灯珠组成板式LED阵列，此阵列为双面，即正反都有相同的LED灯珠，且其大小与固体载体相同。将4个上述LED阵列摆放到5块固体载体之间，每两块固体载体夹一块双面的LED阵列与固体载体之间间距为10cm。上述LED阵列的光通量密度比为1∶4∶10∶8∶1，达固体载体表面的总光通量密度为600μmol.m-2·s-1，光照时间为每天24小时。固体培养载体下方有一个培养基箱，用于储藏培养基。使用水泵将箱中的培养基注入固体培养载体上部的PP塑料网位置，培养基靠重力流下，回到培养基箱中，如此循环。培养系统使用培养基总量为8L。培养过程中每天对培养基中氮磷的浓度进行检测，并在缺少时给与补充。在系统使用前将与雨生红球藻接触的部分进行适当的消毒处理，再将干重为10g的新鲜雨生红球藻以喷涂的方式均匀的接种到固体载体表面。将固体载体连通LED阵列用一个配有进气、出气口的密封空间中，此空间内的温度通过内循环空调进行调节，此空间内温度在培养过程中始终处于24±1℃。在培养期间向此空间内通入洁净的，含二氧化碳体积比为1％的空气。培养系统接种后，每5天用刮板刮取固体载体表面的雨生红球藻进行收获，获得膏状的雨生红球藻生物质。此系统总运行时间为60天。
对照例1
使用UTEX2505(德克萨斯州立大学藻种库，美国)作为培养的雨生红球藻种，使用标准的3倍氮BBM培养基作为培养基，使用内部尺寸为0.1米宽、1米高，0.1米厚的玻璃平板式光反应器，以10cm的间隔垂直地面放置，即在0.1米宽，1米长的面积上平行摆放5个光反应器。使用波峰值为450nm、660nm的LED灯珠组成板式LED阵列，此阵列为单面，且其大小与反应器相同。将5个上述LED阵列摆放到5个反应器前方，每两个反应器夹一块双面的LED阵列。上述LED阵列的光通量密度比为2∶1，光照时间为每天24小时。培养系统使用培养基总量为8L。培养过程中每天对反应器中培养基中氮磷的浓度进行检测，并在缺少时给与补充。在系统使用前将与雨生红球藻接触的部分进行适当的消毒处理，再将干重为10g的新鲜雨生红球藻注如反应器接种。反应器内培养基的温度透过内置的温度调节装置进行调节，此温度在培养过程中始终处于24±1℃。在培养期间向反应器底部通入洁净的，含二氧化碳体积比为1％的空气，气体由反应器顶部的配有逆止阀的出气口排出。此系统使用传统的两段式培养，培养系统接种后，使用达反应器的总光通量密度为100μmol·m-2·s-1的光强培养11天后，将光强增加到600μmol·m-2·s-1继续培养4天。此系统每15天收获一次，获得的是生物质浓度小于1％的液体培养基。此系统总运行时间为60天。
对照例2
使用UTEX2505(德克萨斯州立大学藻种库，美国)作为培养的雨生红球藻种，使用标准的3倍氮BBM培养基作为培养基，使用内部尺寸为0.1米宽、1米高，0.1米厚的玻璃平板式光反应器，以10cm的间隔垂直地面放置，即在0.1米宽，1米长的面积上平行摆放5个光反应器。培养系统使用培养基总量为8L。培养过程中每天进行对反应器中的培养基中的氮磷浓度进行检测，并在缺少时给与补充。在系统使用前将与雨生红球藻接触的部分进行适当的消毒处理，再将干重为10g的新鲜雨生红球藻注入反应器接种。此系统使用阳光作为光源，此系统在培养过程中处在透明的，有空调系统的温室中。反应器内培养基的温度透过温室内部气温进行调节，此温度在培养过程中始终处于24±3℃。在培养期间向反应器底部通入洁净的，含二氧化碳体积比为1％的空气，气体由反应器顶部的配有逆止阀的出气口排出。此系统使用传统的两段式培养，培养系统接种后，先使用遮阳布遮挡反应器，使达反应器的总光通量密度为100μmol·m-2·s-1左右，如此培养20天后，去除遮光布继续培养10天。此系统每30天收获一次，获得的是生物质浓度小于1％的液体培养基。此系统总运行时间为60天，其中30天在夏季(7、8月)，30天在冬季(12、1月)以获得年平均值。此系统运行地点为云南昆明。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将雨生红球藻置于附着式培养系统中进行培养，并在雨生红球藻的培养过程中利用人工光源，同时人工控制其他生长因素，使雨生红球藻在与外界隔离的情况下生长并积累虾青素；
人工光源为集成发光二极管组成的阵列，LED阵列由发出不同波长的可见光LED灯珠、紫外光LED灯珠、红外光LED灯珠任意组成；
可见光LED灯珠是指能够产生波长400nm～700nm的LED灯珠；
紫外光LED灯珠是指能够产生波长200nm～400nm的LED灯珠；
红外光LED灯珠是指能够产生波长700nm～1000nm的LED灯珠；
LED阵列所产生的光的光谱的特征之一为：其可见光光段的有两个波峰，分别在410nm～490nm之间和610nm～690nm之间；其紫外光段有两个个波峰，分别在200nm～300μnm之间和300nm～400nm之间；其红外光段的有一个波峰，在700nm～1000nm之间；
可见光光段按通量密度计算，其400nm～500nm光与600nm～700nm光的比例为20：1～1：20；
LED阵列的所产生的光的光谱的特征之二为：按光通量密度计算，可见光与紫外光的比例为1：10～10：1，可见光与红外光的比例为1：10～10：1；
LED阵列所产生的光的强度，在到达被雨生红球藻细胞附着的固体载体表面时，按光通量密度计算，在100μmol·m-2·s-1～5000μmol·m-2·s-1之间；
LED阵列对雨生红球藻在生长过程中的照射时间为每天4～24小时。
2.根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，雨生红球藻是指属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属的微生物。
3.根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，附着式培养系统是指将雨生红球藻附着在浸有液体培养基的固体载体表面进行培养的培养系统，固体载体附着有雨生红球藻细胞的表面直接接触气体相。
4.根据权利要求3所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，固体载体是指任意一种有吸水性的多孔固体材料、或吸水性的多孔固体材料与其他材料构成的结构；
在培养系统内部，即雨生红球藻能够接触到的所有部分，包括培养基、固体载体、固体载体四周的气体相以及输送培养基、气体相的管道及设备，是与外界环境隔离的洁净环境。
5.根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，LED阵列的光谱、光强在雨生红球藻的培养过程中保持不变，或根据细胞生长阶段的不同进行变化和调整。
6.根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，其他生长因素包括温度、二氧化碳浓度、培养基的组成与各个组分的浓度。
7.根据权利要求6所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，温度是指雨生红球藻生长过程中的培养基的温度以及培养环境的气温，此温度为12℃～38℃；
二氧化碳浓度是指在雨生红球藻直接接触的气体相中的二氧化碳的气体分压占的总气压的百分比，此浓度为0.04％～10％；
培养基是指为雨生红球藻提供在生长过程中所需要的养分的液体物质，其组成成分包括可以被雨生红球藻吸收利用的氮、磷、微量元素、维生素以及其他促生长成分；
培养基中氮元素浓度为0mM～35mM，磷元素的浓度为0mM～20mM；
培养基中微量元素包括钠、钾、镁、硼、钙、锌、锰、钼、铜、钴中的一种或几种；
其他促生长成分包括醋酸及其盐、过氧化氢、乙醇、土壤溶出液、可溶性的腐殖质、单糖中的一种或几种。
8.根据权利要求7所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，培养基的成分在雨生红球藻的培养过程中保持不变，或根据细胞生长阶段的不同进行变化和调整。
9.根据权利要求1所述的利用雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，根据具体培养条件的不同，雨生红球藻藻种的不同和对虾青素含量要求的不同，需要的培养时间为2～50天。
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