CN109207547A - 一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，属于微藻生物功能开发技术领域。该方法是在雨生红球藻的藻细胞培养阶段采用光照强度2000‑3000lx、产物积累阶段采用光照强度7000‑12000lx的蓝光、红光和白光三色复合光进行混合光照。本发明的技术方案克服了现有技术中存在的仅利用红色光或红白混合光促进藻株生长，仅利用蓝色光或蓝白混合光促进雨生红球藻积累虾青素的技术偏见。在雨生红球藻的生长和虾青素的累积两个阶段同时使用白色、蓝色和红色三色光进行光刺激。发明人通过实验证明，采用三色光同时对雨生红球藻进行生长刺激和产物诱导，其技术效果明显优于仅使用单色光或仅与白光混合。

Description

一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法

技术领域

本发明涉及一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，属于微藻生物功能开发技术领域。

背景技术

虾青素(astaxanthin，ASTA)，化学名3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β-胡萝卜素，为一种多见于河虾外壳、牡蛎、鲑鱼中的一种红色类胡萝卜素。虾青素具有极强的抗氧化能力，其抗氧化能力为维生素C的6000倍，维生素E的1000倍，并且天然的虾青素是唯一一个能够通过血脑屏障的一种类胡萝卜素，被成为“超级维生素E”。

目前，虾青素的获取途径主要有利用类似类胡萝卜素进行化学合成、从甲壳类动物中提取、利用红发夫酵母菌株等真菌进行生产以及利用雨生红球藻等微藻进行生产。雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)由于其含有较高的虾青素，并且很早就被证明其虾青素与天然生在三文鱼体内的类胡萝卜素结构完全相同，使其成为生产虾青素最为理想的生物来源。传统的利用雨生红球藻大规模生产虾青素的方法是二步法，即将雨生红球藻的营养生长和虾青素的累积分为两个阶段，这两个阶段分别在不同的光反应器中，不同的培养条件下进行。二步法虽然解决了雨生红球藻细胞生长繁殖与孢子形成、累积虾青素所需条件不同的矛盾，但仍存在工艺复杂、生产成本偏高、虾青素产量偏等问题。

近些年来，虽然人们对雨生红球藻等微藻累积虾青素等副产物的研究不断深入，发现藻种、培养基、温度、光照、诱导剂等多种因素都会对产物最终的累积量造成影响。随着微生物培养技术的日益发达，研究者近些年来主要的研究重点是筛选并获得高效的诱导剂。例如，2010年，申请人利用茉莉酸、茉莉酸甲酯和油菜素内酯诱导雨生红球藻累积虾青素(参见专利申请201010505952.0、201010505970.9和201010505966.2)，其技术效果较对照组提高34.4％-94.2％。2017年，申请人发现通过添加西红柿汁可提高雨生红球藻对虾青素的累积量，累积量达到对照组的3.09倍。除此以外，专利申请201710049628.4公开了利用钨酸钠诱导雨生红球藻快速转化积累虾青素，产量达到500pg/cell左右。专利201410424056.X公开了利用乙醇和海水晶诱导雨生红球藻生产虾青素，产量最高可达到142.72mg/L。

光照是影响微生物生长的重要条件。目前，对于光照条件对雨生红球藻累积虾青素的影响研究人员有这样的共识，即红色波段的光能够促进雨生红球藻的生长，而蓝色的光能够促进雨生红球藻累积虾青素。基于此，在雨生红球藻的培养过程一般是在前期生长阶段采用红色波段的光，而在后期诱导阶段采用蓝色的光。例如，专利201310038104.1、201610334988.4等。基于以上认识，在雨生红球藻的培养过程中，主要采用自然光、红光或白光与红光的混合光进行培养，而诱导阶段则主要采用自然光、蓝光或白光与蓝色混合光进行诱导。虽然，单色红光和单色蓝光对雨生红球藻的生长和诱导虾青素累积确有作用，但在培养阶段和诱导阶段仅仅使用一种颜色光或仅与白色自然光搭配使用这一技术偏见势必影响进一步提高雨生红球藻积累虾青素。

发明内容

为进一步提高雨生红球藻生产虾青素的产量，本发明提供了一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，所采取的技术方案如下：

一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，该方法是在雨生红球藻的藻细胞培养阶段采用光照强度2000-3000lx、产物积累阶段采用光照强度7000-12000lx的蓝光、红光和白光三色复合光进行混合光照。

优选地，所述混合光照三色光的光照强度比例为：蓝光：红光：白光＝(1～5)：(5～1)：3。

更优选地，在雨生红球藻的藻细胞培养阶段，三色光的光强比例为：蓝光：红光：白光＝2：5：3；在虾青素积累阶段，三色光的光强比例为：蓝光：红光：白光＝5：2：3。

优选地，所述光照强度最高为12000±1000lx。

优选地，所述的方法的步骤如下：

1)将雨生红球藻接种在BBM培养基或MCM培养基上，在培养温度为20～25℃，光强2000-3000lx下，采用光强比例为蓝光：红光：白光＝(1～5)：(5～1)：3的三色光进行混合光照，光暗比为12h/12h的条件下培养至雨生红球藻的对数生长期；

2)改变步骤1)所得的对数生长期的雨生红球藻藻液的方式，采用光暗比24h/0h，光强比例为蓝光：红光：白光＝(1～5)：(5～1)：3的三色光进行混合光照诱导雨生红球藻积累虾青素，直至光学显微镜下观察雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累。

优选地，步骤1)所述雨生红球藻为712藻株。

优选地，步骤1)采用光强比例为蓝光：红光：白光＝2：5：3的三色光进行混合光照。

优选地，步骤1)采用光强比例为蓝光：红光：白光＝5：2：3的三色光进行混合光照。

优选地，所述产物积累阶段采用光照强度10000-12000lx的蓝光、红光和白光三色复合光进行混合光照。

优选地，所述方法在培养过程中通入空气使藻体悬浮。

相对于现有技术，本发明获得的有益效果：

本发明的技术方案克服了现有技术中存在的仅利用红光或红白混合光促进藻株生长，仅利用蓝色光或蓝白混合光促进雨生红球藻积累虾青素的技术偏见。在雨生红球藻的生长和虾青素的累积两个阶段同时使用不同比例的白色、蓝色和红色三色光进行光刺激。发明人通过实验证明，采用不同比例三色光同时对雨生红球藻进行生长刺激和产物诱导，其技术效果明显优于仅使用单色光或仅与白光混合。

本发明获得了预料不到的技术效果，发明人在雨生红球藻的培养过程中偶然同时打开红色光和蓝色光，发现二者共同使用时的技术效果要好于单独使用时的技术效果之和。在采用蓝光：红光：白光＝5：2：3复合比例条件，在10000lx的强光诱导刺激下，虾青素的产量可达到165.32mg/L。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例所用的材料、试剂、方法、仪器等，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法、仪器。本领域技术技术人员均可通过商业渠道获得。

以下实施例所选用的藻种为雨生红球藻712藻种，该藻种为现有藻种在山东理工大学、中国海洋大学等多家高校和研究院所保藏。

培养雨生红球藻所用的培养基采用现有培养雨生红球藻常用的pH8.0的MCM培养基或BBM培养基。培养容器采用现有的常用的光生物反应器。

雨生红球藻的一般培养方法：

1.按照5％的接种量，将雨生红球藻712藻种接种到MCM培养基或BBM培养基中，在20～25℃，光照强度2000-3000lx，光暗比12h/12h的条件下，培养至藻细胞达到对数生长期，一般藻细胞的浓度到达约5×10⁶个/mL；

2.改变步骤1达到对数生长期的雨生红球藻的光照条件，明暗比改为24h/0h，同时改变照射用三种不同颜色的光组成比例，20～25℃，10000-12000lx条件下继续培养至雨生红球藻细胞完全变红，虾青素积累完成为止。

在培养过程中，光生物反应器始终通过向培养液中曝气(在通气率在0.28±0.1v/vm空气)使藻种悬浮于培养液中。

培养结束和虾青素的测定的方法，是在进入诱导阶段后每天取少量的藻液样品在光学显微镜下观察藻细胞的颜色变化以及虾青素的积累情况。在显微镜底下发现细胞完全变红时，即可测定虾青素的含量，测定步骤参照1991年，Boussiba等人的方法进行，具体如下：

1)取藻液5ml，5000rpm离心5min，弃上清液后得藻细胞沉淀；

2)向藻细胞沉淀中加入3ml含5％氢氧化钾和30％甲醇破坏叶绿素5min后，5000rpm离心收集沉淀；

3)在收集的沉淀中分别加入3ml二甲基亚砜，利用超声波破壁后(3次，15s，5s间隙，输出功率为40W)，于70℃水浴中处理10min，抽提至藻体发白；

4)然后10000rpm离心10min，分别取上清液于492nm下测定OD值；

5)按照公式C(mg/L)＝(4.5×A×Va)/Vb计算两种上清液中虾青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亚砜的体积，Vb表示藻液体积。

实施例1

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采取的步骤与上述雨生红球藻的培养方法相同，具体参数及区别之处在于：选用MCM培养基，在20～25℃的条件下进行培养，光照强度为3000lx，使用的光源为白色光源，并且在进入到诱导阶段仍使用10000lx的白色光源强光刺激诱导。实验结束后，按照上述虾青素的测定方法取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量为：4.58mg/L.

实施例2

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采取的步骤与上述雨生红球藻的培养方法相同，具体参数及区别之处在于：选用MCM培养基，在20～25℃的条件下进行培养，光照强度为3000lx，在雨生红球藻达到对数期前，采用红光照射；在达到诱导期，进入对数期后采用10000lx的蓝光诱导。实验结束后，按照上述虾青素的测定方法取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量为：65.63mg/L。

实施例3

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采取的步骤与上述雨生红球藻的培养方法相同，具体参数及区别之处在于：选用MCM培养基，在20～25℃的条件下进行培养，光照强度为3000lx，在雨生红球藻达到对数期前，采用蓝光照射；在达到诱导期，进入对数期后采用10000lx的红光诱导。实验结束后，按照上述虾青素的测定方法取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量为：9.02mg/L。

实施例4

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采取的步骤与上述雨生红球藻的培养方法相同，具体参数及区别之处在于：选用MCM培养基，在20～25℃的条件下进行培养，光照强度为10000lx，在雨生红球藻的细胞培养期(即达到对数期前)的光强为3000lx，诱导期均采用蓝色、红色和白色三种混合光源进行照射，并且三种光源的光强相等，总光强达到10000lx。实验结束后，按照上述虾青素的测定方法取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量为：89.32mg/L。

实施例5

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采用的方法与实施例4相同，不同之处在于：调整了混合光的比例，按照蓝光：红光：白光的顺序分别设置了以下八组实验，见表1。

表1不同比例混合光的实验分组(对数期以前培养光强为3000lx，诱导期光强为10000lx)

实验结束后，按照上述虾青素的测定方法取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量，如表2。

表2不同比例混合光的

实验组	虾青素含量(mg/L)	实验组	虾青素含量(mg/L)
				实验组1	84.32	实验组5	79.75
实验组2	90.32	实验组6	77.32
				实验组3	98.32	实验组7	81.23
实验组4	79.43	实验组8	69.32

实施例6

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采用的方法与实施例4相同，不同之处在于：在雨生红球藻的藻细胞培养阶段采用蓝光：红光：白光＝2：5：3的比例，而在诱导阶段则采用蓝光：红光：白光＝5：2：3的比例。实验结束后，按照上述虾青素的测定方法取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量为：122.42mg/L，该结果显著优于实施例5中雨生红球藻在细胞培养阶段和诱导阶段采用统一三色光比例的情况。

实施例7

本实施例提供了一种利用雨生红球藻生产虾青素的方法，所采用的方法与实施例6相同，不同之处在于：改变了诱导时照射的总光强，分别选用7000lx、8000lx、9000lx、11000lx以及12000lx的总光照强度。培养结束后，按照上述虾青素的测定方法每组取8个平行样品测定其虾青素的含量，结果其虾青素的平均含量分别为：99.32mg/L、103.53mg/L、97.44mg/L、119.32mg/L和102.90mg/L。

实施例8

本实施例按照实施例6的方法，进行了两次放大实验，光生物反应器的体积分别增大到500L和5t，藻种、培养基、培养温度、光照条件、光源组成比例等主要参数保持不变，补气量等其他参数视具体情况进行常规调整。培养后，测定虾青素含量分别达到了143.2mg/L和165.32mg/L。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于，在雨生红球藻的藻细胞培养阶段采用光照强度2000-3000lx、虾青素积累阶段采用光照强度7000-12000lx的蓝光、红光和白光三色复合光进行混合光照。

2.根据权利要求1所述的一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于，所述混合光照三色光的光照强度比例为：蓝光：红光：白光＝(1～5)：(5～1)：3。

3.根据权利要求2所述的一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于，在雨生红球藻的藻细胞培养阶段，三色光的光强比例为：蓝色：红色：白色＝2：5：3；在虾青素积累阶段，三色光的光强比例为：蓝光：红光：白光＝5：2：3。

4.根据权利要求1所述的一种三色光复合培养诱导雨生红球藻高产虾青素的方法，其特征在于，所述产物积累阶段采用光照强度10000-12000lx的蓝光、红光和白光三色复合光进行混合光照。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：

1)将雨生红球藻接种在BBM培养基或MCM培养基上，在培养温度为20～25℃，光强2000-3000lx下，采用光强比例为蓝光：红光：白光＝(1～5)：5：3的三色光进行混合光照，光暗比为12h/12h的条件下培养至雨生红球藻的对数生长期；

2)改变步骤1)所得的对数生长期的雨生红球藻藻液的方式，采用光暗比24h/0h，光强比例为蓝光：红光：白光＝5：(1～5)：3的三色光进行混合光照诱导雨生红球藻积累虾青素，直至光学显微镜下观察雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)采用光强比例为蓝光：红光：白光＝2：5：3的三色光进行混合光照。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)采用光强比例为蓝光：红光：白光＝5：2：3的三色光进行混合光照。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述光强为12000lx。

9.根据权利要求1-8所述任一方法，其特征在于，培养过程中通入空气使藻体悬浮。