CN106434817A - 一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别提供了一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法。本发明首先通过添加高浓度碱液的方式将营养培养结束后的雨生红球藻藻液pH值调整到10.0～12.0，在持续搅拌处理后，通过静置沉降去除上清液，将浓缩液接种至诱导培养基，利用高光、高温、高盐等条件进行虾青素诱导。本发明操作简单，一方面可以缩短雨生红球藻营养细胞浓缩时间，降低损失率，另一方面利用高碱性环境可以提升营养细胞环境耐受能力和诱导活性，同时，也可以对藻液中入侵生物造成抑制，提高生产过程的抗病虫害能力，提高虾青素的产量。

Description

一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法。
背景技术
虾青素以对抗不利的环境条件。
根据雨生红球藻的生长习性，目前利用雨生红球藻生产虾青素的模式一般采取两步培养法，即雨生红球藻绿色生长阶段和虾青素诱导阶段分别在不同的条件下实现。第一步，利用适宜的培养环境实现藻细胞的营养生殖，经过采收获得浓缩的绿色藻细胞；第二步，将采收的绿色藻细胞接种至新的反应器中，利用不利条件实现虾青素迅速积累。
两步培养法过程中，需要对第一步培养的绿色营养细胞进行浓缩采收，传统的自然沉降存在着沉降速度慢、沉降不彻底、藻细胞损失大、细胞活性降低等缺点，而离心分离能耗高，添加絮凝剂的方法无法实现藻细胞与絮凝剂分离，不能进行诱导培养。另外，由于绿色藻细胞对不利环境的耐受能力差，容易受到入侵生物的污染，在第二步诱导初期，外界环境的剧烈变化（高光、高盐、高温等）会导致部分细胞（如游动细胞）难以适应，迅速出现漂泊、自溶等现象，而死亡的细胞为藻液中存在的入侵生物提供了营养，会进一步影响健康细胞的生长，最终导致虾青素的产量锐减。
经检索查新，利用雨生红球藻生产虾青素的专利很多，但尚未发现利用碱液对雨生红球藻绿色生长阶段结束后进行处理以提高采收效率、诱导活性和抗病虫害能力的报道。
发明内容
本发明的所要解决的技术问题在于提供一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，实现雨生红球藻绿色营养细胞快速沉降浓缩，缩短藻细胞采收时间，减少去除营养培养基环节导致的藻细胞损失，同时避免了藻细胞因长时间静置导致的细胞活性下降，快速刺激藻细胞进入诱导应答阶段，增强诱导活性和抗病虫害能力，提高最终虾青素的产量。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：
一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，包括以下步骤：
a、营养培养：雨生红球藻接种至BG-11培养基中，温度20～25℃，光照50～80μmol/m2/s，通入含有0.5～1.5%的CO2的混合空气，培养7～15天；
b、碱预处理：将雨生红球藻绿色营养细胞收集于洁净的水池或储液罐内，加入碱液调整pH值，并在20～30℃、低光或者无光条件下进行持续搅拌。
c、藻液浓缩：停止搅拌，静置沉降后去除上清液，获得雨生红球藻的浓缩绿色藻细胞。
d、诱导：将浓缩绿色藻细胞接种至诱导培养基中，利用高光、高温、高盐等条件进行诱导，积累虾青素。
优选的，步骤b所述的碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、三磷酸钾等碱性物质一种或几种。
优选的，步骤b所述的加入碱液的方式为将浓度为5～10 M的碱溶液缓慢加入并不断搅拌。
优选的，步骤b所述的pH值为10.0～12.0。
优选的，步骤b所述的持续搅拌时间为0.5～2小时。
优选的，步骤c所述的静置沉降的时间为0.5～2小时。
通过添加高浓度碱液的方式将营养培养束后的雨生红球藻藻液pH值调整到10.0～12.0，在持续搅拌处理后，通过静置沉降去除上清液，将浓缩液接种至诱导培养基，利用高光、高温、高盐等条件进行虾青素诱导。本发明的有益效果是：在雨生红球藻绿色生长阶段结束后，利用碱进行预处理，一方面可以大大提高沉降效率，缩短自然沉降进行采收的时间，减少去除营养培养基环节导致的藻细胞损失，同时避免了藻细胞因长时间静置导致的细胞活性下降。另一方面，通过将绿色藻细胞置于高pH值环境中，快速刺激藻细胞进入诱导应答阶段，提升了藻细胞在诱导初期阶段的环境耐受能力，降低了细胞损失，提高最终虾青素的产量。另外，高碱性环境也可以对第一阶段培养过程中存在的部分入侵生物造成抑制效果，例如杂藻、细菌、真菌、原生动物等，从而降低第二阶段病虫害产生的风险。
具体实施方式
本发明提供了一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，是两步培养法产虾青素的一种处理工艺。
实施例1
1、营养培养：以BG-11培养基对雨生红球藻进行扩增培养，初始接种浓度按照0.05g/L接入，温度20～25℃，光照70μmol/m2/s，通入含有1.5%的CO2的混合空气进行光自养培养，培养10天。
2、碱预处理：将上述培养藻液收集至不锈钢搅拌罐内，缓慢加入浓度为10M的氢氧化钠溶液将藻液pH值调整到12.0，温度控制在20～30℃，在低光或者无光条件下持续搅拌0.5小时。对照组不进行碱预处理。
3、藻液浓缩：经过碱预处理后，停止搅拌，自然沉降1小时，去除上清液培养基，获得浓缩藻液，并计算损失率。实验数据显示，实验组去除上清液损失率为4.2%，对照组藻细胞仍然处于悬浮状态，培养基和藻细胞无法实现分离，因此延长对照组沉降时间至24小时，去除上清液损失率为15.6%。
4、诱导培养：将上述浓缩藻液接种至BG-11缺氮培养基，使藻细胞浓度在0.4g/L左右，置于室外诱导光生物反应器中进行诱导培养12天后，收集藻细胞并使用改良的Boussiba方法测定虾青素浓度。在培养结束时，从外观观察，实验组藻液状态良好，对照组有泡沫和贴壁生长现象。通过显微镜观察，实验组藻细胞均变红，对照组有部分藻细胞漂白。实验数据显示，实验组虾青素浓度为35.3mg/L，相比于对照提高了24.2%。
实验结果表明，经过碱预处理，雨生红球藻营养细胞浓缩时间大大缩短，去除上清液损失率降低，而且藻细胞环境耐受能力增强，诱导效率提高。
实施例2
1、营养培养：将雨生红球藻接种至BG-11培养基，并置于室外光生物反应器中培养，初始接种浓度按照0.1g/L，自然光照，温度20～25℃，通入含有1.0%的CO2的混合空气进行光自养培养，培养10天。通过显微镜观察，藻液中存在细菌、杂藻、原生动物、壶菌。
2、碱预处理：将上述培养藻液收集至不锈钢搅拌罐内，缓慢加入浓度为5M的氢氧化钠溶液将藻液pH值调整到11.0，温度控制在20～30℃，在无光条件下持续搅拌2小时。对照组不进行碱预处理。
3、藻液浓缩：经过碱预处理后，停止搅拌，自然沉降2小时，去除上清液培养基，获得浓缩藻液，并计算损失率。实验数据显示，实验组去除上清液损失率为9.1%，对照组藻细胞仍然处于悬浮状态，培养基和藻细胞无法实现分离，因此延长对照组沉降时间至24小时，去除上清液损失率为20.6%。
4、诱导培养：将上述浓缩藻液接种至BG-11缺氮培养基，使藻细胞浓度在0.4g/L左右，置于室外诱导光生物反应器中进行诱导培养12天后，收集藻细胞并使用改良的Boussiba方法测定虾青素浓度。在培养结束时，从外观观察，实验组藻液有少量泡沫和贴壁生长现象，显微镜观察有少量杂藻和原生动物，虾青素浓度为29.6mg/L。对照组在诱导培养5天大量泡沫、贴壁、结块等现象，12天后藻液已完全漂白。
实验结果表明，经过碱预处理，雨生红球藻营养细胞浓缩效率不但得到提升，诱导活性增强，而且藻液中已有的入侵生物很大程度受到抑制，保证了虾青素诱导生产的正常进行。
以上所述是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，本领域普通技术人员在不脱离本发明原理的前提下所做的改进和润饰，也应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、营养培养：雨生红球藻接种至BG-11培养基中，温度20～25℃，光照50～80μmol/m2/s，通入含有0.5～1.5%的CO2的混合空气，培养7～15天；
b、碱预处理：将雨生红球藻绿色营养细胞收集于洁净的水池或储液罐内，加入碱液调整pH值，并在20～30℃、低光或者无光条件下进行持续搅拌；
c、藻液浓缩：停止搅拌，静置沉降后去除上清液，获得雨生红球藻的浓缩绿色藻细胞；
d、诱导：将浓缩绿色藻细胞接种至诱导培养基中，利用高光、高温、高盐等条件进行诱导，积累虾青素。
2.根据权利要求1所述的一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于步骤b所述的碱是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、三磷酸钾等碱性物质一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于步骤b所述的加入碱液的方式为将浓度为5～10 M的碱溶液缓慢加入并不断搅拌。
4.根据权利要求1所述的一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于步骤b所述的pH值为10.0～12.0。
5.根据权利要求1所述的一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于步骤b所述的持续搅拌时间为0.5～2小时。
6.根据权利要求1所述的一种利用碱预处理技术提升雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于步骤c所述的静置沉降的时间为0.5～2小时。
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