CN106119331B - 一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法，包括如下步骤，S1，活化培养：将色绿藻细胞接种培养基中活化培养以获得种子液；具体的，可将色绿藻细胞活化培养至对数生长期，将处于对数生长期的培养液作为种子液；S2，诱导培养：将S1获得的种子液接种至诱导培养基中进行光诱导培养，所用光源为白光或蓝光，光源强度为60～330μmol m‑2s‑1，光暗周期为12:12(h)～24:0(h)，所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9～30g/L葡萄糖、0～0.75g/L硝酸钠，诱导培养基的pH值为6.0～7.0。本发明提供的方法可以诱导色绿藻高效合成虾青素。

Description

一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法
技术领域
本发明涉及藻类生物发酵培养技术，特别涉及一种通过诱导色绿藻高效合成虾青素的方法。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)被称为“超级抗氧化剂”，抗氧化能力是其它类胡萝卜素如β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素和角黄素等的10倍多，具有清除自由基、阻止脂质过氧化的强大能力，在预防动脉硬化、帕金森综合症、视网膜黄斑变性等年龄相关性疾病方面具有重要作用；对于维护眼睛和中枢神经系统健康，增强免疫系统功能、强化肌体能量代谢、抗癌、抗感染等具有多重功效。
目前虾青素的生产方法主要有三种，分别为从虾蟹壳内提取、化学合成以及红发夫酵母或雨生红球藻等生物法生产。此外，还有采用转基因植物技术培养番茄积累虾青素的报道。生物法，尤其是雨生红球藻培养法生产虾青素是目前天然虾青素最主要的生产方法，从中得到的虾青素均为3S,3’S构型，抗氧化活性高，无毒副作用，被FDA(美国食品和药物管理局)和EFSA(欧洲食品安全局)批准作为营养强化剂，在保健食品、医药、化妆品等领域中有着广泛的市场。
但是，由于雨生红球藻是自养培养，存在生长速率慢、培养周期长，面临着成本高、生产效率低且不稳定、易生物污染等技术瓶颈的制约。因此，仅仅依靠雨生红球藻的培养来生产天然虾青素，远远不能满足国际市场需求。
色绿藻(Chromochloris zofingiensis)是一种单细胞绿藻，被认为是天然虾青素的新来源。研究表明，虽然色绿藻和雨生红球藻同属于单细胞绿藻，但二者的细胞生理生化特性存在很大差别，虾青素的合成机制也是截然不同的。因而，雨生红球藻生产虾青素的工艺不能直接转用于色绿藻，需根据色绿藻的细胞特性和虾青素代谢调控机制进行有针对性的研究开发，这也是利用色绿藻产业化生产虾青素的首要任务。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法。
本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：
一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法，包括如下步骤，
S1，活化培养：将色绿藻细胞接种培养基中活化培养以获得种子液；具体的，可将色绿藻细胞活化培养至对数生长期，将处于对数生长期的培养液作为种子液；
S2，诱导培养：将S1获得的种子液接种至诱导培养基中进行光诱导培养，所用光源为白光或蓝光，光源强度为60～330μmol m-2s-1，光暗周期为12:12(h)～24:0(h)，所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9～30g/L葡萄糖、0～0.75g/L硝酸钠，诱导培养基的pH值为6.0～7.0。
优选的，步骤S2中，将所述种子液接种至诱导培养基并使种子液稀释至色绿藻细胞密度为2～3.5g/L。本申请发明人在研发过程中发现，采用优选的起始密度，诱导后可以获得较高的虾青素产率；过高的细胞密度，会导致每个细胞受到的光辐射强度过低，影响色素合成；过低的细胞密度，会导致每个细胞受到的光辐射强度过高，抑制色素合成；采用该优选的细胞密度，可以保证色绿藻细胞的光辐射强度适当。
优选的，步骤S2中，所述诱导培养基中，硝酸钠的浓度为0～0.2g/L。
优选的，步骤S2中，所述光源强度为300±30μmol m-2s-1，光暗周期为24:0(h)(即连续光照)；进一步优选的，步骤S2中，所述光源为白光。采用该优选方案，有助于色绿藻胞内虾青素的诱导合成，虾青素含量高、产量和产率高。在此基础上更进一步优选的，诱导培养基中，氮源浓度为0～0.1g/L。
优选的，步骤S2中，将接种有种子液的诱导培养基分装到透明微孔板或类似薄层培养容器(例如透明管道反应器)中，并置于微孔板振荡器上进行光诱导培养。相比于传统的三角瓶和发酵罐式光反应器而言，透明微孔板或类似薄层培养容器具有透光性好、装置简易、操作简便、运行成本低、节省空间和时间短等优势。该优选方案，有利于色绿藻高效积累虾青素，提高产量和产率。
作为一种较为优选的方案，步骤S2中，将所述种子液接种至诱导培养基并使种子液稀释至色绿藻细胞密度为2～3.5g/L，诱导培养基中硝酸钠的浓度为0～0.1g/L，将接种有种子液的诱导培养基分装至透明微孔板或类似薄层培养容器中，并置于微孔板振荡器上进行光诱导培养，光诱导培养所用光源为白光，光源强度为300±30μmol m-2s-1，光暗周期为24:0(h)。采用该优选方案，有助于色绿藻胞内虾青素的诱导合成，虾青素含量高、产量和产率高，且培养获得的色绿藻细胞内次级类胡萝卜素特别是虾青素的比例占总色素的比例较高。
作为一种具体实施方式，步骤S1中，对色绿藻细胞进行活化培养所用的培养基选自Basal、Bristol、BG-11、BBM、Kuhl中的至少一种。
作为一种具体实施方式，所述步骤S2中，所述诱导培养基中还包括如下浓度的各组分：0.175g/L磷酸二氢钾、0.075g/L磷酸氢二钾、0.025g/L七水硫酸镁、0.0025mg/L五水硫酸铜、5mg/L氯化铁、0.025g/L二水氯化钙、0.169mg/L一水硫酸锰、0.025g/L氯化钠、0.287mg/L七水硫酸锌、0.00124mg/L七水钼酸铵、0.061mg/L硼酸。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
本发明方法与现有的色绿藻积累虾青素的培养方式相比，可大大提高色绿藻胞内虾青素的产量和产率，方法简便，能耗低，有效降低生产成本，在利用色绿藻进行天然虾青素的积累方面具有重要应用价值。另外，采用本发明所提供的方法诱导色绿藻培养获得的藻粉中，虾青素与角黄素比例远高于2:1，食用安全，未来在食品和营养强化剂应用领域具有广阔的市场前景。
附图说明
图1.起始细胞密度对色绿藻生物量浓度和虾青素产量的影响；
图2.150μmol m-2s-1白光下硝酸钠浓度对色绿藻生物量浓度和虾青素产量的影响；
图3.150μmol m-2s-1蓝色LED光下硝酸钠浓度对色绿藻生物量浓度和虾青素产量的影响；
图4.150μmol m-2s-1蓝色LED光和白光下硝酸钠浓度对色绿藻细胞内色素百分含量的影响；
图5.300μmol m-2s-1蓝色LED光和白光下色绿藻生物量浓度、比生长速率以及虾青素含量、产量和产率；
图6.300μmol m-2s-1蓝色LED光和白光对色绿藻细胞内色素百分含量的影响。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明：
实施例1起始细胞密度对色绿藻生物量浓度和虾青素产量的影响
1.1菌种活化及种子液制备
将实验室中保存的色绿藻C.zofingiensis藻种转接到装有改良Bristol培养基的斜面上进行培养，培养温度为26℃，光照为10μmol m-2s-1，并观察色绿藻生长情况。
用接种环将色绿藻藻苔接种到装有改良Bristol液体培养基的三角瓶中进行培养，在温度为26℃、光照为10μmol m-2s-1的恒温振荡摇床中，培养3～5天用作种子液。
其中所述的改良Bristol培养基(pH 6.5)成分如下表1所示(单位为mg/L)：
组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L) 组分 含量(mg/L)
葡萄糖 9000 NaNO<sub>3</sub> 750 KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 175
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub> 75 MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 25 CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O 0.0025
FeCl<sub>3</sub> 5 CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 25 MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O 0.169
NaCl 25 ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.287 (NH<sub>4</sub>)<sub>6</sub>Mo<sub>7</sub>O<sub>24</sub>·7H<sub>2</sub>O 0.00124
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 0.061 / / / /
1.2不同起始细胞密度下的诱导培养
将培养好的色绿藻种子液在3800×g下离心2min，弃去上层培养基，并用无菌水重新悬浮后，再次离心去除上清液，将收集的色绿藻细胞采用改良的Bristol培养基进行稀释重悬，控制色绿藻的细胞密度分别为0.5、1.0、1.9、2.9g/L，分装到透明微孔板中，并置于微孔板振荡器中，一起放置于光照培养箱中进行诱导培养以积累虾青素。诱导培养基采用改良Bristol培养基，其和表1中的配方相比，不同仅在于：葡萄糖为30g/L，NaNO3为0.6g/L(碳氮比高于200)，pH为6.5。
培养条件为：转速为50～500r/m，温度为26℃、光源采用蓝色的LED硬灯条(光源的波长范围为460±10nm)串联并排放置，控制微孔板表面的光照强度为80±20μmol m-2s-1以上，分别培养12天。
培养结束后，测定色绿藻培养液的生物量浓度；离心收集细胞，离心洗涤多次后收集藻泥，真空冻干获得藻粉，分析藻粉内色素含量。
1.3起始细胞密度对色绿藻C.zofingiensis胞内虾青素产量的影响
经检测，不同起始细胞密度的色绿藻，在蓝光诱导条件下生物量和虾青素产量参见图1。不同起始密度下蓝光诱导后胞内虾青素含量差异不大，基本保持在2.05mg/g以上。其中当起始细胞密度为1.9～2.9g/L时，虾青素含量均达2.38mg/g以上，产量基本在15.95～22.41mg/L之间。
从图1可知，色绿藻起始细胞密度对于虾青素产率有较大影响，当细胞密度在1.9～2.9g/L时，可以获得较高的虾青素产率，基本在1.3～1.8mg/L/d之间。
实施例2～5白光诱导下氮源浓度对色绿藻C.zofingiensis积累虾青素的诱导效 果
实施例2-5按照如下步骤操作：
2.1、藻种活化及种子液制备
将实验室中保存的色绿藻C.zofingiensis藻种按1.1所述的培养方法，培养3～5天用作种子液。
2.2在白光和不同氮源浓度下积累虾青素的诱导培养
将培养好的色绿藻种子液按1.2所述的方法，收集色绿藻细胞。
采用含有不同氮源浓度的改良Bristol培养基进行稀释、重悬，并控制细胞密度为3g/L左右，其中实施例2～5分别依次采用氮源浓度为0、0.1、0.2、0.3g/L的改良Bristol培养基，葡萄糖均为10g/L，其他组分与表1中相同。
将接种后含有不同氮源浓度的诱导培养基，分装到透明微孔板中，置于微孔板振荡器中，一起放置于光照培养箱中，进行色绿藻C.zofingiensis培养积累虾青素。
培养条件为：转速为50–500r/m，温度为26℃、采用白色荧光灯并排放置作为光源，控制微孔板表面的光照强度为150±30μmol m-2s-1以上，分别培养12天。
对实施例2-5中色绿藻的生物量和胞内色素含量进行检测分析：培养结束后，将色绿藻培养液离心收集藻泥，冻干获得干藻粉并分析胞内色素含量。
2.3实验结果
结果可参见图2。由图2可知，实施例4，在氮源浓度为0.2g/L条件下，虾青素产量和产率均较高，分别为29.56mg/L、2.60mg/L/d。实施例2，在完全无氮培养时，色绿藻细胞内虾青素含量较高，为4.75mg/g。
实施例2～5的结果表明，白光条件下，氮源的增加有助于生物量的增加，而色绿藻细胞内虾青素的含量随着氮源浓度的增加却有极显著降低(p＜0.01)，虾青素的产量和产率也不会因氮源浓度增加而持续增加。因此，在白光下，低浓度氮源(0-0.2g/L)不仅可以保证胞内虾青素含量不会明显降低，同时可获得较高的虾青素产量和产率。
实施例6～9蓝光条件下不同氮源浓度诱导色绿藻C.zofingiensis积累虾青素
实施例2-5按照如下步骤操作：
3.1菌种活化及种子液制备
将实验室中保存的色绿藻C.zofingiensis菌种按1.1所述的培养方法，培养3～5天用作种子液。
3.2在蓝光和不同氮源浓度下积累虾青素的诱导培养
将培养好的色绿藻种子液按1.2所述的方法，收集色绿藻细胞。
采用含有不同氮源浓度的改良Bristol培养基进行稀释、重悬，并控制细胞密度为3g/L左右，其中实施例6～9分别依次采用氮源浓度为0、0.1、0.2、0.3g/L的改良Bristol培养基，葡萄糖均为10g/L，其他组分与表1中相同。
将接种色绿藻细胞的含有不同氮源的诱导培养基，分装到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振荡器中，一起放置于光照培养箱中进行色绿藻C.zofingiensis培养积累虾青素。
培养条件为：转速为50–500r/m，温度为26℃、采用蓝色LED硬灯条作为光源，控制微孔板表面的光照强度为150±30μmol m-2s-1以上，分别培养12天。
对实施例6-9色绿藻的生物量和胞内色素含量进行检测分析：培养结束后，色绿藻培养液离心收集藻泥，冻干获得干藻粉并进行色绿藻胞内色素含量分析。
3.3实验结果
结果可参见图3。由图3可知，实施例6在完全无氮培养时，色绿藻细胞内虾青素含量、虾青素产量和产率均较高，分别为5.53mg/g、27.97mg/L和2.33mg/L/d。在蓝光条件下，在低氮源浓度或无氮条件下(0-0.2g/L)具有较佳的虾青素产量和产率。
对实施例2-9中诱导培养所得色绿藻细胞内色素组成进行分析，结果见图4。图4中“W”代表白光条件下的色素组成，“B”代表蓝光条件下的色素组成。由图4可知，在实施例2-9中，色绿藻胞内次级类胡萝卜素均占到所有色素的81.88～94.09％之间。实施例2-9的虾青素/角黄素比值均大于2：1，但，相对于白光而言，蓝光条件下培养，虾青素/角黄素比值较高，可达7.5，表明采用蓝光可更有效调控色绿藻胞内色素的组分及其比例。
实施例10-13在高光强度下白光和蓝光诱导色绿藻积累虾青素
实施例10-13按照如下步骤进行：
4.1菌种活化及种子液制备
将实验室中保存的色绿藻C.zofingiensis菌种按1.1所述的培养方法，培养3～5天用作种子液。
4.2在白光和蓝色LED高光强照射下积累虾青素的诱导培养
将培养好的色绿藻种子液按1.2所述的方法，收集色绿藻细胞。
采用含有不同氮源浓度的改良Bristol培养基进行稀释、重悬，并控制细胞密度为3g/L左右，其中实施例10-13分别采用氮源浓度为0、0.1、0、0.1g/L的改良Bristol培养基，葡萄糖均为10g/L，其他组分与表1中相同。
将接种色绿藻细胞的含有不同氮源的诱导培养基分装到不同的透明微孔板中，并置于微孔板振荡器中，一起放置于光照培养箱中，进行色绿藻C.zofingiensis培养积累虾青素。
培养条件为：转速为50–500r/m，温度为26℃，实施例10-11(对应于图5、图6中“蓝光/无氮”、“蓝光/低氮”)采用蓝色的LED硬灯条作为光源，实施例12-13(对应于图5、图6中“白光/无氮”、“白光/低氮”)采用白色荧光灯管作为光源，控制微孔板表面的光照强度均为300±30μmol m-2s-1以上，分别培养12天。
对色绿藻的生物量和胞内色素含量进行检测分析：培养结束后，将色绿藻培养液离心收集藻泥，冻干获得干藻粉并进行色绿藻胞内色素含量分析。
4.3实验结果
通过检测高光诱导条件下细胞生物量和虾青素产量的变化规律，结果可参见图5。
由色绿藻细胞内虾青素积累量可知，高强度白光相对于高强度蓝光而言，更有利于色绿藻胞内虾青素的诱导合成。在无氮条件下，高强度白光可以高效诱导合成虾青素，获得较高的虾青素含量为7.11mg/g，其占色绿藻胞内色素的质量百分比可达到69.1％，这是目前已知的色绿藻胞内虾青素的最高含量；在低氮条件下(0.1g/L氮源)，虾青素含量略有降低，为6.51mg/g，但是由于生物量相对较高，因而在此条件下培养色绿藻，可以获得较高的虾青素产量和产率，分别为38.9mg/L和3.2mg/L/d。相对于之前的色绿藻生产虾青素的水平而言，采用本实施例的方法，色绿藻胞内虾青素的生产效率有显著提升，这也是目前已知的野生型色绿藻生产虾青素的最高水平。
综合以上结果表明，采用过高强度的蓝光，会在一定程度上抑制虾青素的合成，但是高强度的白光胁迫诱导，则可以进一步提高色绿藻胞内虾青素的积累量。
参见图6，实施例12可以将次级类胡萝卜素占总色素的比例提高到最高96.33％，同时虾青素比例也从最高65.83％提高到69.11％。实施例12～13，角黄素的比例基本维持在11.1～11.6％之间，相应的虾青素/角黄素比值在5.97～6.13之间。实施例10～11的高强度蓝光条件下，虾青素/角黄素比值在7.3～8.1之间。
由于人类日常饮食中的三文鱼等鱼类体内含有角黄素，过量摄入角黄素具有潜在的眼部病变和皮肤着色等可能风险。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)提出，对于角黄素每日摄入量需控制在0.03mg/kg bw/day(毫克/公斤体重/天)。虾青素的每日摄入量为0.06mg/kg bw/day(毫克/公斤体重/天)，因此控制虾青素和角黄素比值在2：1以上是口服安全的。本发明所提供的方法，采用色绿藻培养获得的藻粉中虾青素与角黄素比例远高于该值，食用安全，未来在食品和营养强化剂应用领域具有广阔的市场前景。
实施例10～11的高强度蓝光条件下，虾青素的产量和产率不如实施例12-13的高强度白光诱导，但是虾青素/角黄素比值却高于实施例12-13，高达7.3～8.1之间；而在实施例2-9中，蓝光条件下，虾青素/角黄素比值也高于白光条件下的诱导结果，说明可以利用蓝光培养来调控色绿藻胞内角黄素含量以及虾青素/角黄素比值。
本发明实施例中采用的检测方法可参照如下说明进行：
(一)色绿藻胞内虾青素的HPLC检测方法
1)色绿藻藻粉中虾青素的提取：
准确称取冻干藻粉10mg，置于装有陶瓷珠的冻存管中，加入含有0.1％(w/v)BHT的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，该混合溶剂中二氯甲烷：甲醇的体积比为3:1，高速振荡1分钟，然后置于液氮中迅速冷却，离心收集上清液；沉淀再次加入含有0.1％(w/v)BHT的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，振荡，置于液氮中冷却，离心收集上清液，重复该步骤直至藻泥呈无色为止。合并所有上清液，用氮气吹干后，用色谱纯的甲醇和MTBE的混合溶剂(二者的体积比为1:1)溶剂定容到1mL，用于HPLC法测定色绿藻胞内色素含量。
2)HPLC法测定虾青素含量
采用配备PDA检测器和YMCTM C30色谱柱(4.6mm×150mm,3μm)的液相色谱仪进行分析，洗脱液为色谱级甲醇(流动相A)、甲基叔丁基醚MTBE(流动相B)和水(流动相C)。梯度洗脱程序为：0-6min，95％→80％A、5％→20％B、0％C；6-12min,80％→60％A、20％→38％B、0→2％C；12-28min，60％→50％A、38％→48％B、2％C；28-33min，50％A、48％B、2％C；33-35min，50％→95％A、48％→5％B、2％→0％C；35-38min，95％A、5％B、0％C。
柱温箱温度为30℃，洗脱液流速为0.8mL/min，进样量为20μL，PDA检测器波长设置在300-700nm进行全波长扫描以测定色素吸收光谱图，同时在480nm波长下测定胞内色素的含量。色素的定性分析采用色素标准品(虾青素、叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、角黄素、玉米黄质)的保留时间和特征吸收光谱图进行分析，定量分析采用色素标准品制作的外标法标准曲线进行计算，对于酮基叶黄素和胡萝卜素类色素则采用类似的叶黄素标准曲线进行定量分析。
(二)色绿藻生物量浓度的测定方法
色绿藻培养过程中的生物量浓度测定方法采用干重法进行测定。将取样获得的藻液，量取一定体积置于事前称重的离心管中，在6000r/m转速下离心1min收集藻细胞沉淀，然后加入纯水振荡悬浮后，重复离心洗涤2次，除去上清液，将含有藻泥的离心管置于60℃烘箱中烘干至恒重，测定藻粉的差重，并换算获得色绿藻培养液中的生物量浓度。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种诱导色绿藻高效合成虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤，
S1，将色绿藻细胞进行活化培养以获得种子液；
S2，将S1获得的种子液接种至诱导培养基中，将接种有种子液的诱导培养基稀释至色绿藻细胞密度为2～3.5g/L，分装到透明微孔板或透明管道反应器中，并置于振荡器上进行光诱导培养，所采用的光源为白光，光源强度为120～330μmol m-2s-1，光暗周期为12:12h～24:0h，所述诱导培养基包括如下浓度的各组分：9～30g/L葡萄糖、0～0.2g/L硝酸钠，诱导培养基的pH值为6.0～7.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述诱导培养基中，硝酸钠的浓度为0～0.2g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述光源强度为300±30μmol m-2s-1，光暗周期为24:0h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述光源为白光。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中，将所述种子液接种至诱导培养基并使种子液稀释至色绿藻细胞密度为2～3.5g/L，诱导培养基中硝酸钠的浓度为0～0.1g/L，将接种有种子液的诱导培养基分装至透明微孔板或透明管道反应器中，并置于振荡器上进行光诱导培养，光诱导培养所用光源为白光，光源强度为300±30μmolm-2s-1，光暗周期为24:0h。
6.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的方法，其特征在于，步骤S1中，对色绿藻细胞进行活化培养所用的培养基选自Basal、Bristol、BG-11、BBM、Kuhl中的至少一种。
7.根据权利要求1～5中任一项权利要求所述的方法，其特征在于，步骤S2中，所述诱导培养基中还包括如下浓度的各组分：0.175g/L磷酸二氢钾、0.075g/L磷酸氢二钾、0.025g/L七水硫酸镁、0.0025mg/L五水硫酸铜、5mg/L氯化铁、0.025g/L二水氯化钙、0.169mg/L一水硫酸锰、0.025g/L氯化钠、0.287mg/L七水硫酸锌、0.00124mg/L七水钼酸铵、0.061mg/L硼酸。
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