KR20150028613A

KR20150028613A - Led 조사를 이용한 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류

Info

Publication number: KR20150028613A
Application number: KR20130107473A
Authority: KR
Inventors: 임성근; 권태호
Original assignee: (주)엔비엠
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2015-03-16
Also published as: KR101545274B1

Abstract

본 발명은 미세조류에 LED를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법, 미세조류에 LED를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류에 관한 것이다.

Description

LED 조사를 이용한 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류 {Method for producing microalgae with increased astaxanthin content using LED irradiation and the microalgae thereof}

본 발명은 LED 조사를 이용한 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세조류에 LED를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법, 미세조류에 LED를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류에 관한 것이다.

아스타잔틴 (astaxanthin)은 자연계에 존재하는 카로테노이드 (carotenoid)의 일종으로 연어, 송어, 새우, 바다가재, 게 등에서 붉은색을 띠게 한다. 이러한 어류와 갑각류는 아스타잔틴을 자가 합성하지 못하기 때문에 먹이사슬을 통해 섭취해야 하므로 아스타잔틴을 사료에 첨가해 양식하기도 한다. 또한, 아스타잔틴은 항산화효능, 자외선에 의한 눈과 피부 보호, 면역기능 강화 등 다양한 기능이 알려져 있어 최근에는 아스타잔틴을 함유한 건강 기능식품, 기능성 화장품 등을 개발하기 위한 활발한 연구가 진행중이다.

아스타잔틴은 상기의 어류나 갑각류로부터 추출하거나, 아스타잔틴을 생산할수 있는 균주를 배양시켜 얻을 수 있으나, 미세조류의 경우, 추출 효율이 낮고 배양이 어려우며, 아스타잔틴의 생산성이 낮아 고 함량의 아스타잔틴을 생산하기 위한 배양공정과 균주개량이 요구되고 있다.

아스타잔틴을 생산할 수 있는 균주를 배양시켜 고 함량의 아스타잔틴을 생산하기 위한 방법으로 미세조류 대량 배양을 위한 광생물반응기 개발, 형광등을 광원으로 광 조사량을 증가시켜서 미세조류에 의한 아스타잔틴 생산량을 증가시키기 위한 연구가 이루어졌지만, 높은 광조사량을 위한 에너지 비용이 크고, 고열이 발생하는 단점이 있다. 또한 방사선 조사 선량 40 mGy/h~400 mGy/h를 조사하여 아스타잔틴 생산 균주로부터 아스타잔틴을 생산하는 방법이 개발되었지만, 방사선의 특성상 운전 및 조작이 불편하고 사용에 제한이 있어 비효율적이다.

이에, 본 발명자는 고 함량의 아스타잔틴을 생산하기 위해 아스타잔틴을 생산할 수 있는 균주의 배양 과정 중에 특정 파장의 LED를 조사하여 아스타잔틴 생산 균주의 균체와 아스타잔틴의 함량을 증가시킬 수 있는 방법을 개발하였다.

한편, 한국등록특허 제01058781호에서는 방사선 조사를 이용한 아스타잔틴의 생산방법이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0001773호에서는 2차 효소반응을 이용하여 헤마토코커스 플루비알리스 균주로부터 아스타잔틴의 추출방법이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 LED 조사를 이용한 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류에 대해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기한 종래 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명에서는 아스타잔틴 고생산 미세조류인 헤마토코쿠스 플루비알리스의 아스타잔틴 생산을 위한 최적 배양 조건을 분석하던 중, 각각의 파장의 LED 광원 (6500K 백색광, 460nm 청색광, 525nm 녹색광, 630nm 및 660nm 적색광)을 배양 초기에는 200 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 약하게 조사하다가 세포 성장이 정점에 다다른 배양 7일째부터 1000 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 강하게 조사하여 10일 동안 배양한 결과, 630nm 적색광 조사인 경우 아스타잔틴 함량이 가장 많이 축적되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명을 통해 세포량 증가를 위한 초기 배양시에는 녹색광을 제외한 LED 광원인 6500K 백색광, 460nm 청색광, 630nm 및 660nm 적색광을 약하게 조사하다가 세포 성장 정점 이후에는 630nm 적색광만을 강하게 조사하는 것이 아스타잔틴 생산을 위한 최적 배양 조건인 것을 확인할 수 있었다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 미세조류에 LED를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 미세조류에 LED를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류를 제공한다.

이상에서 설명한 바와 같이 본 발명은 아스타잔틴을 생산하는 미세조류 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하기 위한 인공 광원으로 특정 파장의 LED를 사용하였고, 아스타잔틴을 생산하기 위해 배양 후기에 광량을 증가시킴으로서 효과적인 헤마토코쿠스 플루비알리스의 성장뿐만 아니라 아스타잔틴의 생산량도 기존의 배양방법과 달리 짧은 시간에 효과적으로 증가시킬 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용한 광생물 반응기와 LED의 구조를 개략적으로 나타낸 단면도이다.
도 2는 도 1에 나타낸 광생물반응기를 이용해 각각의 파장에서 아스타잔틴을 생산하는 미세조류 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하는 예를 나타낸 사진이다.
도 3은 도 1에 나타낸 광생물반응기를 이용해 각각의 파장에서 아스타잔틴을 생산하는 미세조류 헤마토코쿠스 플루비알리스를 배양하고, 배양된 세포 형상 및 아스타잔틴 생산을 나타낸 사진이다.
도 4는 도 1에 나타낸 광생물반응기를 이용해 각각의 파장에서 아스타잔틴을 생산하는 미세조류 헤마토코쿠스 플루비알리스 배양 후 건조중량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 각각의 파장의 LED 광원을 조사하여 생산한 아스타잔틴을 생산하는 미세조류로부터 아스타잔틴의 함량을 HPLC로 분석한 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미세조류에 LED (light emitting diode)를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법에서, 상기 LED 조사는 배양 6~8일째부터 625~635nm 적색광을 조사하는 것일 수 있고, 바람직하게는 미세조류 배양 초기부터 배양 6~8일째까지 6400~6600K 백색광, 625~635nm 또는 645~700nm 적색광 또는 430~480nm 청색광을 100~500 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하고, 그 이후로는 625~635nm 적색광을 900~1100 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 미세조류 배양 초기부터 배양 6~8일째까지 660nm 적색광을 100~500 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하고, 그 이후로는 630nm 적색광을 900~1100 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키기 위한 최적 방법은 세포량 증가를 위한 초기 배양시에는 녹색광을 제외한 LED 광원인 6500K 백색광, 460nm 청색광, 630nm 및 660nm 적색광을 약하게 조사하다가 세포 성장 정점 이후에는 630nm 적색광만을 강하게 조사하는 것이다.

세포량 증가를 위한 초기 배양시에는 접종된 세포량에 따라 LED 광량을 다소 조절할 수 있는데, 접종된 세포량이 많을수록 LED 광량은 다소 높아지고, 접종된 세포량이 적을수록 LED 광량은 다소 낮아질 수 있으며, 그 범위는 100~500 umol photon m^-2s^-1의 광량일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법에서, 상기 LED 조사는 온도 24~28℃에서, 4~6%(v/v)의 이산화탄소를 0.8~1.1L/h로 주입하는 조건에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는 온도 25℃에서, 5%(v/v)의 이산화탄소를 1L/h로 주입하는 조건에서 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법에서, 상기 미세조류는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 미세조류에 LED (light emitting diode)를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법에서, 상기 LED 조사 조건은 전술한 바와 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법에서, 상기 미세조류는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류를 제공한다. 상기 미세조류는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

균주 및 배지

본 발명에 사용된 균주는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) NIES-144로서 일본의 NIES (National Institute for Environmental Studies, Tsukuba, Japan)으로부터 구입되었다. 본 실험에 사용된 배지는 MBBM 배지이고, 구성 성분을 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

MBBM (Modified Bold's basal medium) 배지에 첨가된 주성분 함량

Components	Stock solution (g/100 mL )	mL / liter
KH₂PO₄ K₂HPO₄ NaCl	17.5 g 7.5 g 2.5 g	1 mL
MgSO₄·7H₂O	7.5 g	1 mL
NaNO₃	25 g	1 mL
CaCl₂·2H₂O	2.5 g	1 mL
Na₂EDTA/KOH	1 g/0.62g	1 mL
FeSO₄·7H₂O,H₂SO₄	0.5 g/0.1 mL	1 mL
H3BO3	1.15 g	1 mL
Trace Metal solution	See below	1 mL

MBBM (Modified Bold's basal medium) 배지에 첨가된 미량 금속 함량

Components	Stock solution (g/1L)	mL / liter
MnCl₂·4H₂O	1.81 g	1 mL
ZnSO₄·7H₂O	0.222 g
CuSO₄·5H₂O	0.079 g
Co(NO₃)₂·6H₂O	0.049 g
Na₂MoO₄·2H₂O	0.39 g

실시예 1: 특정파장의 LED 를 광원으로 이용한 헤마토코쿠스 플루비알리스 ( Haematococcus pluvialis )의 배양

1L 삼각플라스크에 MBBM 배지 600 mL을 넣고 7일간 배양한 헤마토코쿠스 플루비알리스 (NIES144) 세포를 10% 접종한 후 20 umol photon m^-2s^-1세기의 빛을 24시간 조사하면서 25℃에서 100 rpm으로 교반하며 7일간 생육시켰다. 도 1에 나타낸 5개의 내부조사형 광생물반응기에 내부광원인 백색(white 6500K), 청색(450 nm), 녹색(525nm), 적색(630nm와 660 nm)를 각각 하나씩 삽입하고, 교반배양기에서 7일간 배양한 배양액 400 mL을 4L MBBM 배지에 10%가 되도록 접종하였다. 이어서 각각의 광생물반응기를 알루미늄 호일로 싸서 외부의 빛이 들어가지 못하도록 차단하고, 각각의 파장의 LED의 광량을 200 umol photon m^-2s^-1로 맞춘 후, 25℃의 온도에서 5% (v/v)의 이산화탄소를 1L/h으로 유입하면서 배양하였다. 배양시간의 경과에 따라 배양 6일까지는 200 umol photon m^-2s^-1의 광량을 조사하였고, 7일 이후부터는 아스타잔틴을 생산하기 위해 1000 umol photon m^-2s^- ¹를 조사하여 광스트레스를 유도하였다. 배양시간에 따라 24시간 간격으로 40 mL씩 샘플을 취해 건조중량(dry cell weight)을 측정하고, 현미경을 관찰하여 그 결과를 도 3과 도 4에 나타내었다.

실시예 2: 특정 파장의 LED 를 조사하여 배양한 헤마토코쿠스 플루비알리스로부터 생산된 아스타잔틴의 함량 비교

상기에서 각각의 파장의 LED를 조사하여 배양한 헤마토코쿠스 플루비알리스 미세조류로부터 아스타잔틴의 농도 분석을 위해 후지사 (Fuji chemical industry Co., LTD., Spectrophotometric and HPLC analysis method for determining astaxanthin content in AstaREAL-P2AF, http://www.fujihealthscience.com/assay method.pdf)의 방법을 이용하였다. 즉, 배양 10일째에 각각의 파장에서 배양한 2 mL 현탁액을 원심분리기(centrifuge 5415D, eppendorf, German)를 사용하여 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하고, 아세톤(acetone) 0.2 mL를 첨가한 후 5분간 균질화하여 세포벽을 파쇄하였다. 13,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 불순물이 제거된 용매층을 취하였다. HPLC는 영린기기의 YL9111 Binary pump와 YL9120 UV/Vis 검출기를 사용하였고, 컬럼(column)은 YMC carotenoid 250 x 4.6 mmI.D., S-5um column(YMC Co., Ltd, Japan)을 사용하였다. 이동상으로는 메탄올(methanol), 메틸 tert-부틸 에테르(methyl tert-butryl ether), 1% 인산(phosphoric acid)를 75:15:4(Methanol: MTBE: 1% phosphoric acid)의 비율로 하였다. 시료는 각각 20 uL를 주입하였고, 유속은 1 mL/min이었으며, YL9120 UV/vis 검출기로 474 nm에서 분석하였다. 표준곡선은 아스타잔틴(Wako chemical industries, Ltd., 제품번호 013-23051)을 이용하여 검량곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였다. 각각의 파장의 LED 조사에 의한 헤마토코쿠스 플루비알리스의 아스타잔틴 생산량 결과는 도 5와 하기 표 3에 나타내었다. 도 5와 같이 헤마토코쿠스 플루비알리스의 아스타잔틴의 함량은 적색 630nm 파장을 조사하였을 때 31.4 mg/g으로 가장 높았으며, 녹색 525nm 파장을 조사했을 때 17.9 mg/g으로 가장 낮았다. 배양 7일째까지는 적색 660nm 파장을 조사했을 때 세포 중량이 가장 높았지만, 이후 아스타잔틴 생산을 위해 1000 umol photon m^-2s^-1의 광량을 조사하면서 급격하게 세포 중량이 감소하였다. 이는 적색 660nm 파장은 다른 파장에 비해 동일한 광량이지만 상대적으로 더 많은 스트레스를 받는 것을 의미한다. 적색 660nm의 파장에서 배양 7일 이후 너무 강한 빛에 의한 광 스트레스로 녹색의 세포가 붉게 변하지 않고 하얗게 변하는 것을 도 3에서 관찰할 수 있다.

각각의 파장에서 배양한 헤마토코쿠스 플루비알리스로부터 생산한 아스타잔틴의 함량 비교

LED 파장	all trans-astaxanthin (mg/g)
White 6500K	24.8
Blue, 460nm	26.3
Green, 525nm	17.9
Red, 630nm	31.4
Red, 660nm	19.3

본 발명을 통해 세포량 증가를 위한 초기 배양시에는 녹색광을 제외한 LED 광원인 6500K 백색광, 460nm 청색광, 630nm 및 660nm 적색광을 약하게 조사하다가 세포 성장 정점 이후에는 630nm 적색광만을 강하게 조사하는 것이 아스타잔틴 생산을 위한 최적 배양 조건인 것을 확인할 수 있었다.

상기와 같이 본 발명은 특정 파장의 LED를 이용하여 광합성 미생물의 바이오매스를 대량 생산 및 광 특이적인 광합성 미생물 유래 유용 소재를 생산하는데 이점이 있다.

1 : 반응부 2 : 칼럼부
3 : 조명부 4 : 상부캡
5 : 칼럼부(2)의 내부 6 : 순환튜브
7 : 냉각장치 8 : 전원
9 : 모듈 10 : 채취구
11 : 기체 공급부 12 : 유량계
13 : 필터부 14 : 펌프

Claims

미세조류에 LED (light emitting diode)를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 LED 조사는 배양 6~8일째부터 625~635nm 적색광을 조사하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 LED 조사는 배양 6~8일째까지 6400~6600K 백색광, 625~635nm 또는 645~700nm 적색광 또는 430~480nm 청색광을 100~500 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하고, 그 이후로는 625~635nm 적색광을 900~1100 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하는 것을 특징으로 하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 미세조류는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)인 것을 특징으로 하는 미세조류의 아스타잔틴 함량을 증가시키는 방법.
미세조류에 LED (light emitting diode)를 조사하여 배양하는 단계를 포함하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 LED 조사는 배양 6~8일째까지 6400~6600K 백색광, 625~635nm 또는 645~700nm 적색광 또는 430~480nm 청색광을 100~500 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하고, 그 이후로는 625~635nm 적색광을 900~1100 umol photon m^-2s^-1의 광량으로 조사하는 것을 특징으로 하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 미세조류는 헤마토코쿠스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)인 것을 특징으로 하는 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류의 제조방법.
제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조 방법에 의해 제조된 아스타잔틴 함량이 증가된 미세조류.