CN108841887A - 利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法 - Google Patents

利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵液的后处理，特别是指一种利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法。方法包括采用异养培养的方法制备平滑菱形藻发酵液；将制备的平滑菱形藻发酵液在单色光或混合光的照射下转入光生物反应器中，在光照条件下通气诱导培养等工艺步骤；本发明解决了现有技术存在的异养培养制备的平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量低的技术难题。具有所制备的平滑菱形藻干燥藻粉中岩藻黄素的含量高、可以稳定实现连续工业化生产、能够从培养基的源头控制重金属、多氯联苯等海洋常见污染物、较大型海藻来源的岩藻黄素更安全等优点。

Description

利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的 方法
技术领域
本发明属于发酵液的后处理，特别是指一种利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法。
背景技术
岩藻黄素(Fucoxanthin)是一种天然的类胡萝卜素，又称岩藻黄质、褐藻素，参与光合作用中光系统II的反应。岩藻黄素具有独特的丙二烯结构，是一种具有强抗氧化性的活性分子，其在细胞、动物以及人体都证实具有多种功能活性，包括抗肥胖、抗糖尿病、抗炎症、抗癌、抗血管生成和抗疟等生理活性。综合以上功能，岩藻黄素是一种具有广阔保健食品和药物开发前景的天然产物，具有巨大的市场价值。
目前市场上岩藻黄素主要是通过裙带菜(Undariapinnatifida)、海带(Laminariajaponica)等大型海藻中提取获得。但是上述方法存在着大型海藻在细胞壁厚、多糖类物质含量高、纯化困难和海洋污染等问题，且大型海藻中岩藻黄素含量极低(仅为干重的0.01％-0.07％)，限制了岩藻黄素的应用。海洋微藻细胞中岩藻黄素含量即高达0.6％，是大型海藻的近100倍，是岩藻黄素更好的替代来源。
平滑菱形藻(Nitzchia laevis)为一种单细胞藻类，属于硅藻门(Bacillariophyta)。利用平滑菱形藻生产岩藻黄素的研究较少。申请人前期研究发现，平滑菱形藻具有目前最高的岩藻黄素产率9.88mg/(L·d)，且能异养发酵，具有较优的工业化潜力(申请号：201710523735.6)。平滑菱形藻作为一种单细胞植物，光照培养条件下岩藻黄素含量最高可达1.38％(占细胞干重)，但生物量浓度偏低，通常低于1g/L(专利申请号：201710525234.1)。经过发酵罐发酵优化研究，平滑菱形藻细胞密度最高达到21.2g/L，是光照培养的20-30倍，然而发酵后细胞中的岩藻黄素含量仅为0.75％(占细胞干重)，仅为光照条件下培养的一半。因此如何有效提高异养培养制备的平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量成为该工艺需要解决的技术难题之一。
申请人通过检索发现，臧正蓉等(海洋科学，2015，39(7)：1-6)发现不同光质(蓝光、绿光和红光)对光照培养条件下的硅藻三角褐指藻的岩藻黄素含量有明显影响，红光可促进三角褐指藻的生长并提高岩藻黄素含量，而绿光和蓝光则抑制细胞生长和降低岩藻黄素的含量，但该研究所用藻种为三角褐指藻，且是利用单色光的连续照射培养。Heui-Chun等研究了不同光质(蓝光、绿光、红光和白光)对海洋硅藻角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)中岩藻黄素积累的影响，发现蓝光刺激岩藻黄素积累，而红光抑制岩藻黄素积累，但该研究所用藻种为角毛藻，且是利用单色光持续照射培养，未探究藻的异养培养特性和对发酵后细胞的岩藻黄素积累影响(Bulletin of the Korean Society of FisheriesTechnology,2014,50:447-454)。申请人发现光质对平滑菱形藻中岩藻黄素积累的影响目前尚未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法。通过采用光照处理异养培养平滑菱形藻发酵液，诱导岩藻黄素的积累，进而进一步提高发酵生产岩藻黄素的产率。
本发明的整体技术构思是：
利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，包括如下工艺步骤：
A、采用异养培养的方法制备平滑菱形藻发酵液，所述的平滑菱形藻选自平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP559、或平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP 1092；
B、将步骤A中制备的平滑菱形藻发酵液在单色光或混合光的照射下转入光生物反应器中，在光照条件下通气诱导培养，发酵液装量为20％-80％，培养温度20℃-30℃，诱导周期1-4天；所述的光照强度为不超过200μmol·m-2·s-1,所述光源为单色光或蓝白混合光，蓝光:白光的比例为0-1：0-1。
本发明的具体技术构思还有：
所述的步骤B中光照所用的光源包括但不局限于采用太阳光、荧光灯灯光、LED灯灯光或其组合。
为提高光照诱导培养下岩藻黄素的积累效果，优选的技术实施方式是，所述的步骤B中光照诱导培养的条件是：采用三角瓶时将其置于光照摇床中振荡培养，摇床转速为150转/分钟；或采用柱式光生物反应器时通入二氧化碳体积含量低于5％的无菌空气培养，通气量为3升/分钟。
更为优选的光照诱导培养条件是，所述的步骤B中光照培养的条件是：选用柱式光生物反应器，在光照强度为5-200μmol·m-2·s-1的条件下通入二氧化碳体积含量低于5％的无菌空气培养，通气量为3升/分钟。
更进一步优选的技术实现方式是，所述的步骤B中光照培养的条件是：光照强度为10μmol·m-2·s-1，光源选用白光或蓝光:白光＝1：1的蓝白混合光。
优选的步骤A中的异养培养方法是，步骤A中异养培养的方法采用申请号为201710523735.6的说明书中记载的方法。步骤A中异养培养的方法还可以选用其它无光条件下的异养培养方法，均不脱离本发明的技术实质。
优选的技术实现方式是，步骤A中异样培养的培养基包括如下原料组分：
NaCl 10g/L-32g/L；Na2SiO3·9H2O 30mg/L-700mg/L；MgSO4·7H2O 1.09g/L-2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L-0.27g/L；KH2PO4 0.031g/L-0.062g/L；K2HPO40.00375g/L-0.0075g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L-0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.025mg/L-0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L-0.311mg/L；CoCl2·6H2O 0.0114mg/L-0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.012mg/L-0.024mg/L；H3BO33.06g/L-30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L-0.278mg/L；Tris-buffer 0.089g/L-0.892g/L；H2SO4 1.64μg/L-16.4μg/L；vitamin B12 1.5g/L-15×10-5g/L；biotin 2.5g/L-25×10-5g/L；氮源0.2g/L-7g/L；pH＝6-9。
所述的氮源选用有机氮源、无机氮源或其组合，其中有机氮源包括但不限于酵母膏、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、尿素、蛋白水解物或其组合，无机氮源包括但不限于选用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、碳酸氢铵或其组合。
步骤A中优选的培养条件是，步骤A中异样培养的条件为：培养温度20℃-30℃，培养周期为3-12天；采用三角瓶摇床培养，摇瓶转速为100-300转/分钟；采用发酵罐培养，搅拌转速200-700rmp，无菌空气通气量1-3升/分钟。
为验证本发明的技术效果，申请人采用如下方法进行实验：
1、平滑菱形藻细胞干重的测定
接种后每隔24小时取3mL发酵液，在转速为3000转/分钟的条件下离心5分钟，ddH2O洗涤后重新离心，重复2次；将发酵液滤至预称重的滤纸上，放入80℃真空干燥箱中烘干至恒重。
2、岩藻黄素的检测
目前申请人未发现岩藻黄素检测的国家或者企业标准，主要通过紫外可见吸光法(UV法)和高效液相色谱仪(HPLC)检测，因UV法特异性差，易受其他色素的干扰，因此HPLC法是目前检测岩藻黄素含量的方法中较好的检测手段。本申请参照Guo等人的研究，并在其基础上进行改进，具体如下：
称取20mg冻干后的藻粉，低温研磨后加入5mL无水乙醇震荡提取10分钟，离心(条件为温度4℃、转速3000转/分钟、时间5分钟)收集上清，沉淀中重新加入3mL无水乙醇震荡提取，直至藻粉呈白色。收集提取液，在温度4℃、转速为12000转/分钟的条件下离心10分钟，取上清氮气吹干，再加入1mL无水乙醇溶解色素，过膜后高效液相色谱仪(HPLC)分析，整个过程避光条件下进行。
3、HPLC分析方法
高效液相色谱仪waters2695，配置PDA检测器，检测波长450nm，选用C18反相柱(250mm×4.6mm×5mm)。流动相为：A相为纯乙酸乙酯，B相为乙腈：甲醇：水＝84:2:14，C相为纯甲醇，采用梯度洗脱，流动相均采用HPLC级。
梯度洗脱条件如下：
时间(min) A(％) B(％) C(％) 流速(mL/min)
0 0 100 0 0.8
15 32 0 68 0.8
30 32 0 68 0.8
35 0 100 0 0.8
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明首次提出利用不同光质的光源诱导发酵后平滑菱形藻发酵液，以提高其中岩藻黄素含量，经申请人实验证实，所制备的平滑菱形藻干燥藻粉中岩藻黄素的含量高(至少可达0.8-1.0％，最高可达1.19％，较现有技术提高20％以上，最高可达58.7％)。
2、本发明提供的方法具有应用于工业化生产岩藻黄素的潜力，不同光质的光源诱导后发酵平滑菱形藻细胞的岩藻黄素含量大大提高。
3、本发明所获得的平滑菱形藻粉，在不受外界条件限制下可以稳定实现连续工业化生产的基础上，能够从培养基的源头控制重金属、多氯联苯等海洋常见污染物，较大型海藻来源的岩藻黄素更安全。
附图说明
图1是发酵后平滑菱形藻细胞在紫外可见分光光度计下300-800nm扫描的光谱图。
从图中可见，平滑菱形藻细胞在440nm和674nm有两个较为显著的吸收峰，说明细胞对蓝光和红光有比较强的吸收。此结果为选择合适波长诱导平滑菱形藻提供了依据。
图2是发酵后平滑菱形藻细胞经不同光质(光强度为10μmol·m-2·s-1)照射诱导后的岩藻黄素含量比较。
从图中可见，黑暗条件下，平滑菱形藻的岩藻黄素含量仅为0.75％(占细胞干重)。红光对岩藻黄素积累无显著促进作用；白光和蓝光显著提高岩藻黄素含量，分别提高至1.09％和1.11％，而蓝光和白光(1:1)的混合光提升最显著，高达1.19％。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
发酵后平滑菱形藻细胞光诱导提高岩藻黄素含量
生产菌种选用平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047(购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校微藻保藏库，Culture Collection of Algae at The University of Texasat Austin，简称UTEX)。
工艺步骤如下：
A、采用异养培养的方法制备平滑菱形藻发酵液，异样培养的培养基包括如下原料组分：
NaCl 10g/L-32g/L；Na2SiO3·9H2O 30mg/L-700mg/L；MgSO4·7H2O 1.09g/L-2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L-0.27g/L；KH2PO4 0.031g/L-0.062g/L；K2HPO40.00375g/L-0.0075g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L-0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.025mg/L-0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L-0.311mg/L；CoCl2·6H2O 0.0114mg/L-0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.012mg/L-0.024mg/L；H3BO33.06g/L-30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L-0.278mg/L；Tris-buffer 0.089g/L-0.892g/L；H2SO4 1.64μg/L-16.4μg/L；vitamin B12 1.5g/L-15×10-5g/L；biotin 2.5g/L-25×10-5g/L；氮源0.2g/L-7g/L；pH＝6-9。
所述的氮源选用有机氮源、无机氮源或其组合，其中有机氮源包括但不限于酵母膏、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、尿素、蛋白水解物或其组合，无机氮源包括但不限于选用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、碳酸氢铵或其组合。
步骤A中异样培养的条件为：培养温度20℃-30℃，培养周期为3-12天；采用三角瓶摇床培养，摇瓶转速为100-300转/分钟；采用发酵罐培养，搅拌转速200-700rmp，无菌空气通气量1-3升/分钟。
B、将步骤A中制备的平滑菱形藻发酵液在单色光或混合光的照射下转入光生物反应器中，在光照条件下通气诱导培养，以500mL锥形瓶为培养容器，将异养发酵培养后的平滑菱形藻发酵液转入300mL(装量为60％)，诱导条件如下：光源为蓝光：白光＝1：1的蓝白混合光，光照强度为10μmol·m-2·s-1，光照所用的光源包括但不局限于采用太阳光、荧光灯灯光、LED灯灯光或其组合。诱导培养温度为23℃，转速为150转/分钟，培养周期2天。
收集步骤B培养结束后的培养液，离心洗涤，冷冻干燥。
其余内容如前述。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中的藻种选择平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP559(购自美国海洋微藻和微生物保藏中心，National Center for MarineAlgae and Microbiota，简称NCMA)。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中的藻种选择平滑菱形藻(Nitzschialaevis)CCMP 1092(购自美国海洋微藻和微生物保藏中心，National Center for MarineAlgae and Microbiota，简称NCMA)。
实施例1-3的效果分析：
平滑菱形藻在混合光(蓝光：白光＝1：1)培养条件下，岩藻黄素的含量最高为1.19％(占细胞干重)，比无光异养发酵提高58.7％。
实施例4
本实施例与实施例3的区别是，步骤B中三角瓶装液量为100mL(装量为20％)，混合光强度为60μmol·m-2·s-1，诱导培养温度为23℃。
实施例4的效果分析：
本实施例中的生产菌种岩藻黄素积累较佳，岩藻黄素含量为1.1％。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于生物反应器选用700mL柱式光生物反应器，装液量为560mL(装量为80％)，步骤B中辅以光照强度为20μmol·m-2·s-1的光照，通气量为3L/分钟，诱导培养周期为4天，其余内容与实施例1相同。
实施例6-12
实施例6-12与实施例4的区别在于实施例6-12的混合光蓝光与白光的比例依次分别为0：1、1：10、1：6、1：1、4：1、10：1、1：0，诱导培养周期为2天。
实施例5-12的效果分析：
参见图2，进行混合光诱导处理，可进一步提高岩藻黄素含量，使得岩藻黄素进一步提高，岩藻黄素含量最高达1.10％。
实施例13
将实施例1中步骤A中制备的平滑菱形藻发酵液在混合光的照射下转入光生物反应器中，在光照条件下通气诱导培养，以700mL柱式光合反应器为培养容器，将异养发酵培养后的平滑菱形藻发酵液转入500mL(装量为71.4％)，诱导条件蓝光：白光＝1：1的蓝白混合光，光照强度为10μmol·m-2·s-1，光照所用的光源为LED灯灯光或其组合，通入气体为无菌空气，气流量为3升/分钟。诱导培养温度为23℃，培养周期1天。
实施例14-16
实施例14-16与实施例13的区别在于实施例14-16的光照强度分别为5、100、200μmol·m-2·s-1。
实施例13-16效果分析：
蓝光：白光＝1：1的蓝白混合光照射下，发酵液中平滑菱形藻细胞的岩藻黄素含量显著提高，提高范围为20％-58.7％，岩藻黄素最高含量达1.19％。
实施例17-19
实施例17-19与实施例13的区别在于实施例17-19的无菌空气通入过程中，二氧化碳占无菌空气的体积含量的5％、2.5％、1％。
实施例17-19效果分析：
不同二氧化碳通入比例下，平滑菱形藻细胞的岩藻黄素含量提高范围为30％-50％。
实施例20
将实施例1中步骤A中制备的平滑菱形藻发酵液在混合光的照射下转入光生物反应器中，在光照条件下通气诱导培养，以700mL柱式光合反应器为培养容器，将异养发酵培养后的平滑菱形藻发酵液转入500mL(装量为71.4％)，诱导条件白光，光照强度为20μmol·m-2·s-1，光照所用的光源为太阳光，通入气体为无菌空气，气流量为3升/分钟。诱导培养温度为23℃，培养周期1天。
实施例21-22
实施例21-22与实施例20的区别在于实施例21-22的光源为荧光灯，且光强度分别为5μmol·m-2·s-1和200μmol·m-2·s-1，诱导温度为20℃和30℃。
实施例20-22效果分析：
不同光源和不同光照强度下，平滑菱形藻细胞的岩藻黄素含量均有显著提高，提高范围为30％-58％，最高岩藻黄素含量为1.18％。

Claims (9)

1.利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、采用异养培养的方法制备平滑菱形藻发酵液，所述的平滑菱形藻选自平滑菱形藻(Nitzschia laevis)UTEX 2047、平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP559、或平滑菱形藻(Nitzschia laevis)CCMP 1092；
B、将步骤A中制备的平滑菱形藻发酵液在单色光或混合光的照射下转入光生物反应器中，在光照条件下通气诱导培养，发酵液装量为20％-80％，培养温度20℃-30℃，诱导周期1-4天；所述的光照强度为不超过200μmol·m-2·s-1,所述光源为单色光或蓝白混合光，蓝光:白光的比例为0-1：0-1。
2.根据权利要求1所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于所述的步骤B中光照所用的光源包括但不局限于采用太阳光、荧光灯灯光、LED灯灯光或其组合。
3.根据权利要求1所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于所述的步骤B中光照诱导培养的条件是：采用三角瓶时将其置于光照摇床中振荡培养，摇床转速为150转/分钟；或采用柱式光生物反应器时通入二氧化碳体积含量低于5％的无菌空气培养，通气量为3升/分钟。
4.根据权利要求1所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于所述的步骤B中光照诱导培养的条件是：选用柱式光生物反应器，在光照强度为5-200μmol·m-2·s-1的条件下通入二氧化碳体积含量低于5％的无菌空气培养，通气量为3升/分钟。
5.根据权利要求4所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于所述的步骤B中光照诱导培养的条件是：光照强度为10μmol·m-2·s-1，光源选用白光或蓝光:白光＝1：1的蓝白混合光。
6.根据权利要求1所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于步骤A中异养培养的方法采用申请号为201710523735.6的说明书中记载的方法。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于步骤A中异样培养的培养基包括如下原料组分：
NaCl 10g/L-32g/L；Na2SiO3·9H2O 30mg/L-700mg/L；MgSO4·7H2O 1.09g/L-2.18g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L-0.27g/L；KH2PO4 0.031g/L-0.062g/L；K2HPO4 0.00375g/L-0.0075g/L；FeCl3·6H2O 0.291mg/L-0.582mg/L；MnCl2·4H2O 0.025mg/L-0.246mg/L；ZnCl20.031mg/L-0.311mg/L；CoCl2·6H2O 0.0114mg/L-0.0228mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.012mg/L-0.024mg/L；H3BO3 3.06g/L-30.56g/L；(NH4)6MO7O24·4H2O 0.028mg/L-0.278mg/L；Tris-buffer 0.089g/L-0.892g/L；H2SO4 1.64μg/L-16.4μg/L；vitamin B12 1.5g/L-15×10-5g/L；biotin 2.5g/L-25×10-5g/L；氮源0.2g/L-7g/L；pH＝6-9。
8.根据权利要求7所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于所述的氮源选用有机氮源、无机氮源或其组合，其中有机氮源包括但不限于酵母膏、蛋白胨、酵母提取物、氨基酸、尿素、蛋白水解物或其组合，无机氮源包括但不限于选用硝酸钾、硝酸钠、氯化铵、碳酸氢铵或其组合。
9.根据权利要求7所述的利用光照提高异养培养平滑菱形藻发酵液中岩藻黄素含量的方法，其特征在于步骤A中异样培养的条件为：培养温度20℃-30℃，培养周期为3-12天；采用三角瓶摇床培养，摇瓶转速为100-300转/分钟；采用发酵罐培养，搅拌转速200-700rmp，无菌空气通气量1-3升/分钟。
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