CN110452824A - 一种生产长链二元酸的菌株及其应用 - Google Patents

一种生产长链二元酸的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种菌株，特别涉及一种生产长链二元酸的菌株，本发明还涉及发酵生产长链二元酸的方法。一种热带假丝酵母菌株，该菌株为热带假丝酵母10468(Candida topicalis 10468)，保藏号为CCTCC NO:M2017164。该菌株的用途是用于发酵长链二元酸。一种长链二元酸的生产方法，通过所述的热带假丝酵母菌株在29‑41℃的发酵温度发酵生产长链二元酸。本发明解决了目前热带假丝酵母菌株温度适应范围窄、无法实现高温发酵的技术问题，进而解决电能消耗、设备投资、人员投入大及由此带来的生产成本高的技术问题。

Description

一种生产长链二元酸的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种菌株，特别涉及一种生产长链二元酸的菌株，本发明还涉及发酵生产长链二元酸的方法。
背景技术
长链二元酸是合成香料、尼龙工程塑料、热熔胶、树脂、耐寒性增塑剂、医药和农药等的重要原料，其结构式为HOOC(CH2)nCOOH，其中n为大于7的整数。特别是十二碳二元酸(DC12)和十四碳二元酸(DC14)，它们分别是合成具有特殊性能和广泛用途的高级尼龙工程塑料尼龙1212和尼龙1414等的重要原料。十二碳以上的长链二元酸，自然界中不存在，化学法合成路线长，反应需要高温高压，对催化剂要求比较苛刻，因此在工业规模上的长链二元酸品种较少，只有十二碳长链二元酸等少数品种。目前化工上也没有经济可行的合成方法，因此，利用微生物的特异性转化能力，在常温常压下转化正烷烃或脂肪酸生成相应的长链二元酸，是目前业内研究的重点。生物法生产长链二元酸的一重要优点在于可以使用相同的微生物、相同设备、培养基，通过提供不同底物的方案生产各种不同碳链长度的长链二元酸，而化学合成法仅能生产单一二元酸。
公开号CN1139659C、公开日为2002-09-18的中国专利公开了一种利用微生物同步发酵正十四烷(nC14)高产十二烷1，1 2-二羧酸(DC14)的方法，突变株NP-6-5接入含有C11-C18各种正烷烃为基质的培养基后，发酵的温度控制在27～31℃。公开号CN1502700A、公开日2004-06-09的中国专利公开了一种利用微生物氧化C14正烷烃高产α、ω－正长链十四碳二元酸(DCA14)的方法，发酵温度控制在28-35℃。公开号CN1928100A、公开日2007-03-14的中国专利申请公开了一种利用生物合成生产长链α、ω－二羧酸的方法，特别是高产十二碳二元酸(DC12)的方法，其发酵混合液的温度控制在26～32℃。公开号CN101225411A、公开日2008-07-23的中国专利公开了一种利用生物合成生产长链α、ω－二羧酸的方法，特别是高产C11～C14混合长链二元酸(DCm)的方法，发酵混合液的温度控制在26～32℃。
虽有很多专利公开了不同高产菌株利用不同底物发酵产二元酸的方案，但其发酵温度都控制较低。由于菌体自身的呼吸代谢作用致使发酵培养物温度上升，尤其在环境温度较高时(如夏天)最为明显。在二元酸工业生产中，为了维持热带假丝酵母较低的最佳发酵温度(29℃～32℃)需要大量水来冷却降温，有时候所用的水也需要事先冷却降温，这无疑增加了电能消耗、设备投资、人员投入，增加了生产成本且不利于节能减排。
发明内容
本发明的第一方面目的在于提供一种热带假丝酵母菌株，以解决目前热带假丝酵母菌株温度适应范围窄、无法实现高温发酵的技术问题，进而解决电能消耗、设备投资、人员投入大及由此带来的生产成本高的技术问题。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，达到本发明的第一方面目的。
一种热带假丝酵母菌株，该菌株为热带假丝酵母10468(Candida topicalis10468)，保藏编号为CCTCC NO:M2017164。
本发明的第二方面目的在于提出上述热带假丝酵母菌株的用途，所述热带假丝酵母菌株如上文所述，所述热带假丝酵母菌株的用途是用于生产长链二元酸；优选地，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种；更优选地，所述长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。
本发明的第三方面目的在于提出一种长链二元酸的生产方法，以解决目前热带假丝酵母菌株温度适应范围窄、无法实现高温发酵的技术问题，以及由此带来的电能消耗大、设备投资高、人员投入多、生产成本高的技术问题。
本发明通过以下技术方案解决上述第三方面技术问题，达到本发明的第三方面目的。
一种长链二元酸的生产方法，通过如上文所述的热带假丝酵母菌株在29-41℃、29.5-41℃、30-41℃、30.5-41℃、31-41℃、31.5-41℃、32-41℃、32.5-41℃、33-41℃、33.5-41℃、34-41℃、34.5-41℃、35-41℃、35.5-41℃、36-41℃、36.5-41℃、37-41℃、37.5-41℃38-41℃、38.5-41℃、39-41℃、39.5-41℃、40-41℃或40.5-41℃的种子生产温度制备种子液和/或；
在29-41℃、29.5-41℃、30-41℃、30.5-41℃、31-41℃、31.5-41℃、32-41℃、32.5-41℃、33-41℃、33.5-41℃、34-41℃、34.5-41℃、35-41℃、35.5-41℃、36-41℃、36.5-41℃、37-41℃、37.5-41℃38-41℃、38.5-41℃、39-41℃、39.5-41℃、40-41℃或40.5-41℃的发酵温度发酵生产长链二元酸。
进一步，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种；优选地，所述长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述发酵的底物包括或者是C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述发酵的底物包括或者是C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述发酵的底物的添加量为100-400mL/L。
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述发酵的发酵培养基包括：
碳源 10g/L-40g/L
氮源 每种所述氮源浓度为0.5-10g/L
无机盐 每种所述无机盐浓度为0.5-12g/L。
又进一步，所述碳源包括或者是蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种；
所述氮源包括或者是酵母膏、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵中的一种或多种；
所述无机盐包括或者是钾盐和钠盐中的一种或多种；优选地，所述钾盐包括或者是氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括或者是氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或多种。
优选地，所述发酵培养基包括：
在上述任一技术方案的基础上进一步，所述生产方法包括以下步骤：
a)菌种活化；
b)利用种子培养基制备种子液；
c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵。
又进一步，所述菌种活化的培养基包括或者是YPD培养基。所述YPD培养基包括葡萄糖2.0％(w/v)、酵母膏1.0％(w/v)、蛋白胨2.0％(w/v)、琼脂2.0％(w/v)，余量为水。
又进一步，所述种子培养基包括：蔗糖10-20g/L，玉米浆2-4g/L，酵母膏3-8g/L，磷酸二氢钾4-12g/L，尿素0.5-4g/L、与所述长链二元酸碳数相同的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种0～80ml/L；
优选地，制备所述种子液的培养时间12～48h，种子成熟指标为稀释30倍后OD620为0.5～1.0。
本发明的热带假丝酵母菌株，温度适应性广，最适温度区间较大(该菌株是在29-41℃条件下可以高效发酵产酸)，能在高温(温度可高达41℃)下进行发酵，在环境温度较高的情况下发酵生产长链二元酸，也可以不用冷却水来降温，减少了电能消耗(发酵温度从41℃降到30℃所需消耗的能量Q＝CM△T，按照生产上600m3的罐计算至少需要5150度电)、设备投资、人员投入，降低了生产成本，有利于节能减排。
保藏信息
菌株：热带假丝酵母10468(Candida topicalis 10468)
保藏日期：2017年4月1日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)
保藏编号：CCTCC NO:M2017164
附图说明
图1是本发明的热带假丝酵母10468的第一代的菌落照片；
图2是本发明的热带假丝酵母10468的第六代的菌落照片。
具体实施方式
下面结合附图，详细说明本发明。
本申请的发明人通过以现有长链二元酸生产菌株热带假丝酵母(Candidatropicalis)CAT N145(该菌株在公开号为CN 102839133A，公开日为2012-12-26的中国发明专利中已经公开，在该专利程序中已于2011年6月9日提交位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC M 2011192)为出发菌株，通过驯化、常规诱变方法进行诱变育种后，筛选得到了一株新的热带假丝酵母，命名为热带假丝酵母10468(Candidatopicalis 10468)，其能够在温度为29-41℃将不同长度的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸衍生物(如直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐)或它们中的两种以上的混合物高效转化为相应的二元酸。尤其是，该菌种在35～41℃下，培养36～48h，OD620能达到0.5～1.0；而现有技术中的各种热带假丝酵母在35～41℃下，培养36～48h，OD620远低于0.5。
一种长链二元酸的生产方法，包括以下步骤：
a)菌种活化；在一个优选的具体实施方式中，所述菌种活化是摇床培养1～2天；所述菌种活化的培养基包括或者是YPD培养基，优选地，所述YPD培养基包括葡萄糖2.0％(w/v)、酵母膏1.0％(w/v)、蛋白胨2.0％(w/v)、琼脂2.0％(w/v)，余量为水。
b)利用种子培养基制备种子液；在一个优选的具体实施方式中，所述利用种子培养基制备种子液，是在29-41℃培养，优选在37℃培养，培养时间36～48h，测得种子液的OD620在0.5～1.0(水稀释30倍)时，接种到装有发酵培养基的摇瓶中。所述种子培养基包括：蔗糖10-20g/L，玉米浆2-4g/L，酵母膏3-8g/L，磷酸二氢钾4-12g/L，尿素0.5-4g/L，正烷烃、直链饱和脂肪酸和直链饱和脂肪酸衍生物(如直链饱和脂肪酸酯、直链饱和脂肪酸盐)中的一种或多种0～80mL/L(所述正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸衍生物与所述长碳链二元酸的碳数相同)。
c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵，通过如上文所述的热带假丝酵母菌株在29-41℃的发酵温度发酵生产长链二元酸，优选37℃-41℃。
所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种；更优选地，所述长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。
所述发酵的底物包括或者是C9-C18正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述发酵的底物包括或者是C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述发酵的底物的添加量为100-400mL/L。
所述发酵的培养基包括：
碳源 10g/L-40g/L
氮源 每种所述氮源浓度为0.5-10g/L
无机盐 每种所述无机盐浓度为0.5-12g/L。
所述碳源包括或者是蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种；
所述氮源包括或者是酵母膏、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵中的一种或多种；
所述无机盐包括或者是钾盐和钠盐中的一种或多种；优选地，所述钾盐包括或者是氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括或者是氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种。
在一个优选的实施例中，所述发酵的培养基包括：
发酵初始时，发酵液中的底物浓度100-400mL/L，用NaOH溶液调节培养基pH至7.5。
本发明中，培养基中加入的底物，即正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸衍生物中的一种或多种，碳链长度需要与所需生产的二元酸的碳链长度相对应。
以下实施例中所使用的二元酸测定方法：
发酵液中二元酸含量检测：发酵液经前处理后气相色谱检测(内标法)，色谱条件：色谱柱：Supelco SPB-50 30m*0.53mm*0.5μm(货号54983)。气相色谱仪(Shimadzu，GC-2014)。方法：初温100℃，15℃/min升温至230℃,保持2min。载气为氢气，进样口温度280℃，FID温度280℃，进样量4μL。
根据产物峰面积和已知浓度的内标峰面积比进行产物浓度计算。
实施例1
本发明的热带假丝酵母(Candida tropicalis)10468，经传代实验验证，经五次传代后菌落形态及生产长链二元酸的能力均未出现明显变化(见图1、图2)。在35℃条件下，第一代和第六代菌株经摇瓶发酵产DC12分别为171.40g/L和171.65g/L；菌落形态：菌落表面光滑湿润呈乳白色有光泽、圆形、边缘整齐。可见本发明的热带假丝酵母(Candidatropicalis)10468的传代稳定性良好。
实施例2
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养36h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，nC11 1mL；在29℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.8(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为1.5mLnC11，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在29℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC11二元酸的含量为46g/L。
实施例3
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在35℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.6(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为172.53g/L。
实施例4
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养48h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素4g/L；在40℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.52(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸钾10g/L，氯化钠2g/L，尿素3g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC13，培养基在121℃灭菌20分钟。在40℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC13二元酸的含量为143.21g/L。
实施例5
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，nC14 2ml；在41℃培养48h，测得种子液的OD620为0.5(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠0.5g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为6mLnC14，培养基在121℃灭菌20分钟。在41℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC14二元酸的含量为310g/L。
实施例6
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，nC16 2ml；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.75(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC16，培养基在121℃灭菌20分钟。在40℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC16二元酸的含量为108.95g/L。
实施例7
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，十四碳脂肪酸甲酯2ml；在40℃培养48h，测得种子液的OD620为0.55(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的底物为3.5mL十四碳脂肪酸甲酯，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC14二元酸的含量为144.22g/L。
实施例8
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在29℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到0.9(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在40℃条件下发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为167g/L。
实施例9
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，nC11 2mL；在40℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到0.5(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC11，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在40℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC11二元酸的含量为100.95g/L。
实施例10
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，nC14 2mL；在29℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到1(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC14，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC14二元酸的含量为203.04g/L。
实施例11
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，nC14 2ml；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.72(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC14，培养基在121℃灭菌20分钟。在29℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC14二元酸的含量为207g/L。
实施例12
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在29℃条件下培养48h，测得种子液的OD620达到了0.91(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在29℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为170.54g/L。
实施例13
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在37℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.57(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在29℃条件下发酵，发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为165g/L。
实施例14
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，nC11 2mL；在35℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.56(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC11，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC11二元酸的含量为108g/L。
实施例15
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆2g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾8g/L，尿素2g/L，nC11 2mL；在37℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.53(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖40g/L，玉米浆5g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾8g/L，硝酸钾4g/L，氯化钠1.5g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC11，发酵培养基在121℃灭菌20分钟。在37℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC11二元酸的含量为109g/L。
实施例16
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在37℃条件下培养48h。测得种子液的OD620为0.57(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在37℃条件下发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为164g/L。
实施例17
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素4g/L，nC13 2ml；在37℃条件下培养42h，测得种子液的OD620为0.6(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸钾9g/L，氯化钠2g/L，尿素2g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC13，培养基在121℃灭菌20分钟。在37℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC13二元酸的含量为149.22g/L。
实施例18
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖15g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素4g/L，nC13 2ml；在35℃条件下培养48h。测得种子液的OD620为0.7(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾4g/L，硝酸钾9g/L，氯化钠3g/L，尿素2g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC13，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC13二元酸的含量为151.72g/L。
实施例19
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，nC14 2ml；在37℃培养36h，测得种子液的OD620为0.65(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC14，培养基在121℃灭菌20分钟。在37℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC14二元酸的含量为201g/L。
实施例20
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，nC16 2ml；在40℃培养48h，测得种子液的OD620为0.6(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC16，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC16二元酸的含量为112g/L。
实施例21
取1支甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖10g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾4g/L，尿素0.5g/L，nC16 2ml/L；在37℃培养48h，测得种子液的OD620为0.7(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖10g/L，玉米浆1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾4g/L，尿素0.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC16，培养基在121℃灭菌20分钟。在37℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC16二元酸的含量为110.04g/L。
对比例1
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.15(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为40g/L。
对比例2
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在41℃培养48h，测得种子液的OD620为0.1(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟，。在41℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为5g/L。
对比例3(ES4-6-5 35℃C14发酵)
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)ES4-6-5(公开号CN1502700A、公开日2004-06-09的中国专利公开)甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏6g/L，磷酸二氢钾10g/L，尿素2g/L，nC14 2ml；在35℃培养48h，测得种子液的OD620为0.18(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖35g/L，玉米浆3g/L，酵母膏5g/L，磷酸二氢钾10g/L，硝酸钾5g/L，氯化钠1.5g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC14，培养基在121℃灭菌20分钟。在35℃条件下发酵。发酵结束后，测定发酵液中的DC14二元酸的含量为35g/L。
对比例4
取1支热带假丝酵母(Candida tropicalis)CAT N145甘油管种子接入YPD活化培养基中，培养24h后接培养液进种子培养基(培养基于121℃灭菌20分钟)。种子培养基包括：蔗糖20g/L，玉米浆4g/L，酵母膏8g/L，磷酸二氢钾12g/L，尿素1g/L，nC12 2ml；在29℃条件下培养48h，测得种子液的OD620为0.8(水稀释30倍)，将种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中，发酵培养基包括：蔗糖30g/L，玉米浆3g/L，酵母膏3g/L，磷酸二氢钾12g/L，硝酸钾7g/L，氯化钠1g/L，尿素1.5g/L。发酵培养基中所加的正烷烃为3.5mLnC12，培养基在121℃灭菌20分钟。在29℃条件下发酵结束后，测定发酵液中的DC12二元酸的含量为150g/L。

Claims (11)

1.一种热带假丝酵母菌株，其特征在于，该菌株为热带假丝酵母10468(Candidatopicalis 10468)，保藏编号为CCTCC NO:M2017164。
2.一种热带假丝酵母菌株的用途，其特征在于，所述热带假丝酵母菌株如权利要求1所述，所述热带假丝酵母菌株的用途是用于生产长链二元酸；优选地，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种；更优选地，所述长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。
3.一种长链二元酸的生产方法，其特征在于，通过如权利要求1所述的热带假丝酵母菌株在29-41℃、29.5-41℃、30-41℃、30.5-41℃、31-41℃、31.5-41℃、32-41℃、32.5-41℃、33-41℃、33.5-41℃、34-41℃、34.5-41℃、35-41℃、35.5-41℃、36-41℃、36.5-41℃、37-41℃、37.5-41℃38-41℃、38.5-41℃、39-41℃、39.5-41℃、40-41℃或40.5-41℃的种子生产温度制备种子液和/或；
在29-41℃、29.5-41℃、30-41℃、30.5-41℃、31-41℃、31.5-41℃、32-41℃、32.5-41℃、33-41℃、33.5-41℃、34-41℃、34.5-41℃、35-41℃、35.5-41℃、36-41℃、36.5-41℃、37-41℃、37.5-41℃38-41℃、38.5-41℃、39-41℃、39.5-41℃、40-41℃或40.5-41℃的发酵温度发酵生产长链二元酸。
4.如权利要求3所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述长链二元酸为C9-C18的直链饱和二元酸中的一种或多种；优选地，所述长链二元酸为C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的直链饱和二元酸中的一种或多种。
5.如权利要求3或4所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述发酵的底物包括或者是C9-C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述发酵的底物包括或者是C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17和C18的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种；优选地，所述发酵的底物的添加量为100-400mL/L。
6.如权利要求3-5任一项所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述发酵的发酵培养基包括：
碳源 10g/L-40g/L
氮源 每种所述氮源浓度为0.5-10g/L
无机盐 每种所述无机盐浓度为0.5-12g/L。
7.如权利要求6所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述碳源包括或者是蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、糖蜜、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖和山梨醇中的一种或多种；
所述氮源包括或者是酵母膏、玉米浆、尿素、氨水、硫酸铵、硝酸钾和硝酸铵中的一种或多种；
所述无机盐包括或者是钾盐和钠盐中的一种或多种；优选地，所述钾盐包括或者是氯化钾、硝酸钾、磷酸二氢钾和磷酸氢二钾中的一种或多种，所述钠盐包括或者是氯化钠、硝酸钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠中的一种或多种。
8.如权利要求6或7所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述发酵培养基包括：
9.如权利要求3-8任一项所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述生产方法包括以下步骤：
a)菌种活化；
b)利用种子培养基制备种子液；
c)将所述种子液接种到发酵培养基中发酵。
10.如权利要求9所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述菌种活化的培养基包括或者是YPD培养基。
11.如权利要求9所述的长链二元酸的生产方法，其中，所述种子培养基包括：蔗糖10-20g/L，玉米浆2-4g/L，酵母膏3-8g/L，磷酸二氢钾4-12g/L，尿素0.5-4g/L、与所述长链二元酸的碳数相同的正烷烃、直链饱和脂肪酸、直链饱和脂肪酸酯和直链饱和脂肪酸盐中的一种或多种0～80ml/L；
优选地，制备所述种子液的培养时间为12～36h，种子成熟指标为稀释30倍后OD620为0.5～1.0。
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