CN115581196A - 用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，该方法首先对待接种的发病肿根进行活化、扩繁；然后将十字花科植株种子均匀的铺在培养皿里进行催芽；然后选取发芽一致的种子放入充分吸营养液后的侵染钵播种孔内培养；将扩繁的新鲜发病肿根制作得到根肿菌休眠孢子；采用十字花科植株根部组织提取液将根肿菌休眠孢子稀释；得到根肿菌菌液；待侵染钵内幼苗2片子叶伸展开后，采用注射法将根肿菌菌液注射至侵染钵播种孔内，培养观察统计分析。本发明采用由压缩海绵制成的侵染钵接菌，操作简单、试验周期短、成本低廉、环境友好。本发明不仅适用于室内接种鉴定实验，也可在生产上用于大批量抗性品种的快速筛选。

Description

用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法
技术领域
本发明涉及根肿菌接种技术领域，具体涉及一种用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法。
背景技术
芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae Woronin)属原生界，根肿菌门，根肿菌纲，根肿菌属(Neuhauser et al.，2011)。根肿菌主要侵油菜、染萝卜、白菜、芥菜、甘蓝、花菜等十字花科植物的根部，从而引起植物根部肿大症状称为根肿病。油菜与十字花科蔬菜根肿病在全世界均有分布，其危害范围从十字花科蔬菜已扩展到一些花卉植物，侵染栽培及野生植物100个种(变种)以上(杨佩文等，2002)。受侵染的植株根组织异常大量增生，膨大形成瘤状，使根的正常生理机能受阻、根系生长和吸收能力受损，地上部植株表现为萎蔫、黄化、落叶，甚至枯萎死亡，造成品质下降、减产，给生产带来巨大损失。
因此，深入研究根肿病的致病机理和综合治理技术，对减轻和控制油菜与十字花科蔬菜根肿病的蔓延和危害，确保油菜籽与蔬菜的安全生产和产业化发展有着重要的意义。
人工接种鉴定是根肿病研究的首要技术环节，研究认为根肿病发病最佳孢子浓度为1×107～1×108孢子/g基质。较为常用的接种方法有蘸根法、灌根法、菌土法和根际土壤注射法等。其中菌土法是以基质内孢子浓度达到1×107～1×108孢子/g基质为标准(司军等，2009；谭翀等，2013；王神云等，2016)；申请号为201910084609.4的中国发明专利公开了一种根肿菌漂浮式菌液接种方法，该专利的特点是菌液用量大。灌根法、根际土壤注射法是向根际周围接种高浓度的菌液(李宁等，2015；马丹丹等，2016；孙超等，2016)，但存在由于浇水和土壤的渗透作用，菌液会大量流失，植物根系周围菌液浓度降低，以致时而发病时而不发病，影响鉴定结果。同时菌土法与灌根法、根际土壤注射法基质均不可重复使用。蘸根法则操作繁琐、效率低，费工、费时、费地。另外，如果用的栽培基质过于粘重，土壤空气不流通也会影响根系生长，最终导致接种鉴定结果重复性差、影响研究结果的准确性。目前，以上根肿菌接种技术都存在菌液用量大、基质不可重复使用，或操作繁琐，效率低等问题，并且如果防护不到位或实验完成后菌土处理不当，还会造成根肿菌传播的风险，严重污染自然环境。
因此，建立一个高效、稳定的接种方法是非常必要的，这样可以大大减轻试验造成的污染，减少人力物力的浪费，减轻根肿菌鉴定的工作负担，进而加速根肿病的研究进展。
发明内容
本发明针对现有技术使用的菌液量较大，操作费时费力，污染环境；接种菌液浓度不均匀，影响统计结果的问题；提供了一种用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法。该方法是利用压缩海绵基质构建侵染钵接种少量(以微升为单位)根肿菌菌液进行快速筛选抗性品种的接种方法；该方法首先按常规方法提取根肿菌休眠孢子，同时将根际注射法与压缩海绵基质构建侵染钵培养幼苗相结合进行接菌，使菌液尽可能长时间的富集在根毛周围；该方法接菌用量少、发病稳定、高效，并且实验中所利用到的侵染钵可以反复高温灭菌重复使用，不污染环境的同时又大大提高了接种效率；该方法还具有发病时间稳定一致，病原孢子侵染效率高、植物发病均一且可重复性好，植物各品种间长势一致，环境友好的特点。
为实现上述目的，本发明所设计一种用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，包括以下步骤：
1)对待接种的发病肿根进行活化、扩繁；
2)将十字花科植株种子均匀的铺在培养皿里进行催芽；
3)提前用低浓度营养液浸泡压缩海绵基质构建的侵染钵，使侵染钵充分吸低浓度营养液膨胀，然后选取发芽一致的种子放入充分吸低浓度营养液后的侵染钵播种孔内培养；
4)将步骤1)扩繁的新鲜发病肿根清洗后置于暗环境中腐化处理，清洗，将清洗干净的肿根放入榨汁机中，加入无菌水(淹没肿根即可)搅成匀浆，过滤得到根肿菌粗提液，离心，弃上清，得到根肿菌休眠孢子；
5)采用十字花科植株根部组织提取液将根肿菌休眠孢子稀释；得到根肿菌菌液(浓度为1×108孢子/mL)；
6)待侵染钵内幼苗2片子叶伸展开后，采用注射法将根肿菌菌液注射至侵染钵播种孔内，即植株根部位置并培养；植株生长期间，对植株定量浇施低浓度营养液；分别在接菌后的15天、20天、25天、30天，进行根肿病发病情况调查，发病记录为‘1’，未发病则记为‘0’；收集调查数据在Excel下初步整理，然后采用统计软件SPSS对数据进行统计及差异显著性分析。
进一步地，所述步骤2)中，十字花科植株为菊心大白菜或华油杂62R。
再进一步地，所述步骤2)中，催芽的具体步骤如下：
将十字花科植株种子进行温度为40℃～60℃的浸种，再用体积份数为75％的乙醇进行表面灭菌，无菌水清洗种子表面残留乙醇。将培养皿中垫上2层滤纸，把处理好的种子均匀的铺在培养皿里进行催芽。
再进一步地，所述步骤3)中，侵染钵是由压缩海绵基质制作而成，所述压缩海绵基质是按重量百分比将55％的聚氨酯泡沫塑料和45％的泥炭基质混合后压制成。
再进一步地，所述步骤3)中，低浓度营养液是由叶菜型蔬菜专用水培营养液稀释500倍而成。
根据实际清楚叶菜型蔬菜专用水培营养液可以选择霍格兰营养液。
再进一步地，所述侵染钵尺寸为：浸泡膨胀前：正面直径为2cm，底面直径为1.3cm，高为3cm；浸泡膨胀后：正面直径为2.6cm，底面直径1.7cm，高为3.7cm；侵染钵正面中心预留圆形空腔为播种孔，浸泡膨胀后播种孔直径为3mm，高为6mm。
上述播种具体包括以下步骤：选取露白一致的种子放入充分吸水后的侵染钵播种孔内(基质的吸水量为10mL/个)，侵染钵安置盒内不留有多余水分。每个菌株接种每个品种36株为一个重复，实验设3次重复。
再进一步地，所述步骤4)中，根肿菌休眠孢子的具体制备方法如下：
a.将新鲜发病肿根，用无菌水将表面清洗干净，置于温度为26℃的暗环境腐化处理1～2天后用自来水将表面杂质冲洗干净，再用体积份数为75％的乙醇消毒灭菌2min，最后用无菌水充分清洗；
b.将清洗干净的肿根放入榨汁机中，加入无菌水(淹没肿根即可)搅成匀浆，分别用一层纱布和八层纱布过滤掉滤渣，即得到根肿菌粗提液，最后将根肿菌粗提液装入离心管，12000rpm，离心12～15min，弃掉上清液，得到根肿菌休眠孢子。
再进一步地，所述步骤5)中，十字花科植株根系提取液由以下步骤制备而成：
1)取健康十字花科植株的根部组织，用自来水冲洗干净，再用体积份数为75％的乙醇消毒灭菌2min，无菌水充分冲洗，洗去表面乙醇，
2)用榨汁机搅成匀浆，最后用纱布过滤掉粗渣，得到滤液为根系提取液。
再进一步地，所述步骤6)中，注射法具体包括以下步骤：用移液枪吸取500μL的根肿菌菌液打入侵染钵中央播种孔内的根毛处，盖上保湿盖。
再进一步地，所述步骤6)中，培养具体包括以下步骤：接菌后前6～7天内不补充水分，以免稀释菌液。接菌6～7天后，每个侵染钵质安置盒倒入200～300mL的低浓度营养液，并将保湿盖上的通气孔打开，三叶期后随着苗子生长约5～7天需要补充一次低浓度营养液，每次补充300～500mL，每个盒子的补充量应当一致(每个安置盒有12个独立的侵染钵放置穴)；整个实验过程中务必保持室内温度为24～28℃。
本发明的有益效果：
1.维持根系周围菌液浓度。本发明采用由海绵压缩制成的侵染钵，具主动吸水、保水特性。其紧密的质地，既不影响根系生长，又可在一定时间内维持根系周围菌液浓度，避免其它接种方法中因接种的菌液在培养基质或土壤中流失，从而改变根系附近菌液浓度，导致植物发病不均匀，影响试验接种鉴定结果的问题。
2.侵染钵可重复利用、环境友好。本发明采用的侵染钵可在调查植物发病情况时，将植物根系从侵染钵上部播种孔内轻轻拔出，且不会对侵染钵造成破坏而使其散落。保证侵染钵经过高温灭菌后可重复利用，避免了其它接种基质因处理不当、散落各处对环境导致的污染，同时大大减少了资源的浪费。
3.低菌液用量。本发明中1×108孢子/mL接菌量为500μL，大大减少了菌液的用量。
4.提高接种效率。本发明所采用的方法较其它方法植物生长快、品种长势一致、发病均匀，在接种后第20～30天就可使根系表现出明显且稳定的发病现象，相比其他方法(接菌60天)缩短了试验周期。
总之，本发明接种方法采用由压缩海绵制成的侵染钵接菌，操作简单、试验周期短、成本低廉、环境友好。本发明针对快捷、均一、菌液用量少的接种方式设计，以接种后发病快，品种长势均一，发病均匀，病情判别灵敏度高，可重复性好为判断标准；不仅适用于室内接种鉴定实验，也可在生产上用于大批量抗性品种的快速筛选。
附图说明
图1为用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法的流程图；
图2为接种根肿菌后寄主不同时期发病率图；
图中，A为接种后第15天；B为接种后第20天；C为接种后第25天；D为接种后第30天；E为接种后第30天根瘤大小称重；
其中，不同小写字母表示菌株相同条件下不同寄主间的差异显著性(P<0.05)；不同大写字母表示寄主相同条件下不同菌株之间差异显著性(P<0.05)；
图3为不同菌株在‘菊心大白菜’上的侵染特性图；
图中，A为高感品种‘菊心大白菜’接种不同菌株后不同时期发病率图；B为接种不同菌株后不同时期‘菊心大白菜’根部症状图，图中比例尺长度均为1cm；
其中，不同小写字母表示同一时期不同菌株间的差异显著性(P<0.05)；不同大写字母表示同一菌株不同时期之间差异显著性(P<0.05)；
图4为不同菌株在‘华油杂62R’上的侵染特性图；
图中，A为抗根肿菌生理4号小种‘华油杂62R’接种不同菌株后不同时期发病率图；
B为接种不同菌株后不同时期‘华油杂62R’根部症状图，图中比例尺长度均为1cm；
其中，不同小写字母表示同一时期不同菌株间的差异显著性(P<0.05)；不同大写字母表示同一菌株不同时期之间差异显著性(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
为了充分说明本发明根肿病鉴定方法，我们选取了云南省不同地区的根肿菌材料。
本发明使用的根肿菌材料来自云南省各地区收集并扩繁得到的，且该7种根肿菌已通过分子标记方法完成了遗传关系的鉴定，选取该7种根肿菌，使用本发明鉴定方法，通过比较不同组合之间的发病结果，验证本发明鉴定方法的准确性，该7种根肿菌材料具体详见表1：
表1本实施例使用根肿菌来源
Figure BDA0003914435490000071
注：所有材料均保存于温度为-20℃环境中。
基于上述根肿菌，如图1所示的用于苗期快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，包括以下步骤：
1)活体接种活化、扩繁：将正式接种鉴定实验所需要的发病肿根(表1中任意一种)从温度为-20℃环境中取出，然后置于温度为26℃暗环境中腐化处理2～3天(目的是给予发病肿根内部的根肿菌休眠孢子最适的生长条件促使其萌发出鞭毛转为初级游动孢子)。同时将‘菊心大白菜’种子放入花盆中育苗，每个花盆中播种20～30粒种子。于人工气候室中培养，环境条件设置为日间温度为26℃，夜间温度为10℃。
2～3天后，将腐化好的肿根组织放入榨汁机中，加入无菌水(正好淹没肿根即可)将肿根组织搅成匀浆，再接种到‘菊心大白菜’根部；30～45天后即可收取活体接种活化、扩繁后的‘菊心大白菜’新鲜发病肿根；
2)催芽：取‘菊心大白菜’或‘华油杂62R’种子进行温汤浸种(温度为40℃～60℃温水，浸泡30min)，再用体积份数75％的乙醇进行表面灭菌，无菌水清洗种子表面残留乙醇。将培养皿中垫上2层滤纸，把处理好的种子均匀的铺在培养皿中，放入温度为26℃～28℃暗培养箱进行催芽；
3)播种：催芽1～2d后，提前用低浓度营养液(低浓度营养液是由叶菜型蔬菜专用水培营养液稀释500倍而成)浸泡压缩海绵基质构建的侵染钵，使侵染钵充分吸低浓度营养液膨胀(侵染钵的吸水量为10mL/个)，然后选取发芽一致的种子放入充分吸低浓度营养液后的侵染钵播种孔内培养；侵染钵安置盒内不留有多余水分，最后盖上保湿盖；每个菌株接种每个品种36株为一个重复，实验设3次重复。整个培养环境温度为24℃～28℃；
4)接种液制备：取第一步活体接种活化、扩繁后的‘菊心大白菜’新鲜发病肿根，置于温度为26℃暗环境腐化处理1～2天后，用自来水将根部表面杂质冲洗干净，再用体积份数为75％的乙醇消毒灭菌2min，最后用无菌水充分清洗。将清洗干净的肿根放入榨汁机中，加入无菌水(淹没肿根即可)搅成匀浆，分别用一层纱布和八层纱布过滤掉滤渣，即得到根肿菌粗提液，最后将根肿菌粗提液装入离心管，12000rpm，离心12～15min，弃掉上清液，得到根肿菌休眠孢子；
5)十字花科植株根系提取液制备：取健康‘菊心大白菜’植株的根部组织，用自来水冲洗干净，再用体积份数为75％的乙醇消毒2min，再用无菌水充分洗去表面乙醇，然后用榨汁机搅成匀浆，最后分别用一层纱布和八层纱布过滤掉滤渣，得到滤液为根系提取液。
6)根肿菌菌液制备：用十字花科植株根系提取液将根肿菌休眠孢子沉淀稀释到1×108孢子/mL，即得到根肿菌菌液；
7)接种：播种后约24h，植物根部长出大量根毛，此时用移液枪吸取500μL上述根肿菌菌液打入侵染钵中央播种孔内的根毛处，盖上保湿盖；
8)培养：接菌后前6～7天内不补充水分，以免稀释菌液。期间保持室内温度在24℃～28℃；接菌6～7天后，每个侵染钵安置盒中倒入200～300mL的低浓度营养液，并将保湿盖上的通气孔打开。三叶期后随着苗子生长约5～7天补充一次低浓度营养液，每次补充300～500mL，每个盒子的补充量应当一致(每个安置盒有12个独立的侵染钵放置穴)，整个实验过程中务必保持室内温度为24℃～28℃；
9)根肿病发病调查：分别在接种后第15天、20天、25天、30天进行发病情况调查，发病记录为‘1’，未发病则记为‘0’。最后一次调查完毕后，将肿根上部茎叶剪掉，然后将整个根系按垂直方向从侵染钵中拔出，以保证侵染钵的完整性。最后用吸水纸将根表面水分吸干，并对发病根瘤进行称重。
试验数据在Excel下初步整理，然后采用统计软件SPSS对数据进行统计及差异显著性分析。
10)基质高温灭菌：将使用过的侵染钵用高温专用袋子装好，放入灭菌锅中，120℃灭菌40min，最后放置通风处，供重复利用。
如图2所示：在接菌后第15天接种不同菌株后的‘菊心大白菜’、‘华油杂62R’发病关系为：YNPB01，华油(56％)>菊心(34％)；YNPB12，菊心(46％)＝华油(46％)；YNPB19，菊心(31％)>华油(11％)；YNPB21，菊心(67％)>华油(16％)；YNPB23，华油(20％)>菊心(13％)；YNPB24，华油(27％)>菊心(18％)；YNPB26，菊心(52％)>华油(12％)。2个寄主材料分别在接种YNPB01、YNPB19、YNPB21、YNPB24、YNPB26时发病率差异显著，其中在接菌YNPB19、YNPB21、YNPB26时，‘华油杂62R’较‘菊心大白菜’表现出显著抗性(图2A)；在接种后第20天，各个组合发病率均表现出显著差异，其中‘华油杂62R’在接种YNPB01、YNPB23时较‘菊心大白菜’表现更高发病率(图2B)；接种YNPB23 25天后2个品种发病率差异不显著。两个品种均在接种YNPB23、YNPB24时达到更高的发病率，表明2个品种对YNPB23、YNPB24都不具抗性(图2C、D)。
接种后第30天分别对感病植株的根瘤进行称重，如图2(E)、图3(B)、图4(B)所示：接种后30天‘菊心大白菜’的发病根瘤大小依次为YNPB21(0.86g)>YNPB26(0.65g)>YNPB23(0.46g)>YNPB24(0.37g)>YNPB01(0.26g)>YNPB12(0.26g)>YNPB19(0.23g)；‘华油杂62R’的根瘤大小分别为YNPB24(0.51g)>YNPB23(0.44g)>YNPB21(0.34g)>YNPB19(0.25g)＝YNPB26(0.25g)>YNPB01(0.24g)>YNPB12(0.23g)。2个寄主材料在接种YNPB21、YNPB24、YNPB26时根瘤大小有显著性差异，这和早期接种后的发病率趋势一致(图2A、B、E)。
图3、4为不同菌株接种到高感品种‘菊心大白菜’和抗生理4号小种品种‘华油杂62R’后在不同时期的侵染特性。如图3(A)所示：在接种后第15天各菌株在‘菊心大白菜’上侵染率依次为YNPB21(67％)>YNPB26(52％)>YNPB12(46％)>YNPB01(34％)>YNPB19(31％)>YNPB24(18％)>YNPB23(13％)，YNPB21显著高于其它菌株的侵染率。而YNPB12与YNPB26差异不显著，但侵染率均显著高于除YNPB21外的其它菌株。YNPB01与YNPB19差异不显著，但侵染率均显著高于YNPB23、YNPB24菌株；接种后第20天除YNPB21(78％)外其它菌株均较第15天显著增长，分别为YNPB01(48％)、YNPB12(67％)、YNPB19(42％)、YNPB23(68％)、YNPB24(79％)、YNPB26(69％)，其中YNPB12、YNPB23、YNPB24、YNPB26侵染率与YNPB21无显著差异，说明YNPB21在接种第15天时就表现出了较高的侵染力；接种第30天时，5个菌株在‘菊心大白菜’上的侵染率均达到89％以上，分别为YNPB26(100％)>YNPB24(98％)、YNPB21(98％)>YNPB19(93％)>YNPB23(89％)，侵染率均显著高于YNPB01(61％)、YNPB12(76％)菌株。并且，YNPB01、YNPB23较接菌第25天时差异不显著，而YNPB21与接种25天时差异显著，但从接种15天开始和其它4个菌株接种25天时差异不显著，说明YNPB21不仅在早期就表现出高侵染特性，并在第30天时又出现了一个明显的增长。
如图4(A)所示：将来源于不同地区的菌株接种到‘华油杂62R’根部后，第15天侵染率分别为YNPB01(56％)>YNPB12(46％)>YNPB24(27％)>YNPB23(20％)>YNPB21
(16％)>YNPB26(12％)>YNPB19(11％)，YNPB01、YNPB12显著高于其它菌株侵染率；在接种20天起，YNPB23(75％)、YNPB24(67％)之间差异不显著，但YNPB23(75％)、YNPB24(67％)均分别与其它5个菌株的侵染率差异显著，但均与之后2个调查时期侵染率差异不显著，说明相比其它菌株，YNPB23、YNPB24在第15～20天时在‘华油杂62R’上就达到了侵染高峰；接种后第30天各菌株侵染率分别为YNPB24(92％)>YNPB23(85％)>YNPB01(71％)>YNPB12(62％)>YNPB21
(49％)>YNPB26(43％)>YNPB19(41％)，这与接种到高感品种‘菊心大白菜’上相比，YNPB19、YNPB21、YNPB26在‘华油杂62R’上表现出较低的侵染力。
由上可知：‘华油杂62R’相比高感品种‘菊心大白菜’对YNPB19、YNPB21、YNPB26菌株更具有抗性，在接种第15天‘华油杂62R’对YNPB01、YNPB12就表现出高感特性，在接种20天后‘华油杂62R’对YNPB23、YNPB24表现出高感特性；植物早期15～20天发病率和最终根瘤大小表现出一定相关性，说明在根肿病抗性鉴定时可以将不同品种早期的发病率来作为快速评价品种抗性的一个指标，尤其是在生产上开展大批量品种材料抗性鉴定时，一种有效、可靠的早期快速鉴定手段无疑提高了工作效率，且可行性高。
随着时间推移，不具抗性的品种均会被侵染并表现出发病症状，但不同菌株完成侵染的时间会有差异，前期较高的侵染率往往预示着后期侵染率增长的缓慢，以及在同一调查时间侵染率越高的菌株将会造成更严重的植物发病率。总之，各个菌株在不同时期的侵染特性表明随着时间的增长侵染率逐渐增高，在早期被侵染的植物根瘤往往发病更加严重。因此生产上可利用不同菌株的侵染特性采取一定的防治措施。
综上所述，本发明不仅明确鉴别了根肿病高感、抗性品种之间的差异，还有效区分了不同菌株之间的侵染特性，并且本发明建立的根肿病早期高效、快速、稳定接种体系，避免了目前根肿菌接种技术上存在的发病不稳定、菌液用量大、环境污染严重、费工、费时、费地等一系列问题。另外，本发明采用压缩海绵基质构建的侵染钵种植，具主动吸水、保水特性，因此接种后6～7天内不需要额外浇施水分。其紧密的质地，既不影响根系生长，又可在一定时间内维持根系周围菌液浓度，这样可以保证根肿菌更好的侵入植物根内，并且在根部采样或根肿病性状鉴定需要洗根时，可以很快将根部清洗干净，且不要需要太多的水；本发明采用的侵染钵与传统基质有很大区别，传统的鉴定方法采用的基质栽培方法，不仅菌液用量大、易渗透，且基质容易到处散落，造成病原菌人为传播风险；本发明鉴定方法菌液用量少，植物发病快、发病率高，避免了其它接种方法中因接种的菌液在土壤中流失，从而降低菌液浓度，导致植物发病不均匀，影响试验接种鉴定结果的问题。同时大大减少对土壤和水资源的污染，使根肿菌污染面积扩大的速度降低。
传统栽培方法使用的基质价格高且不能重复利用，而本发明采用的侵染钵可在调查植物发病情况时，将植物根系从侵染钵上方播种孔内轻轻拔出，且不会对侵染钵造成破坏而使其散落，保证侵染钵经过高温灭菌后可重复利用，避免了其它接种基质因处理不当、散落各处对环境导致的污染，同时大大减少了资源的浪费。
因此，本发明操作简单，植株发病率高，鉴定方法精确，可重复性好。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内也意图包含这些改动和变型在内。其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对待接种的发病肿根进行活化、扩繁；
2)将十字花科植株种子均匀的铺在培养皿里进行催芽；
3)提前用低浓度营养液浸泡压缩海绵基质构建的侵染钵，使侵染钵充分吸低浓度营养液膨胀，然后选取发芽一致的种子放入充分吸低浓度营养液后的侵染钵播种孔内培养；
4)将步骤1)扩繁的新鲜发病肿根清洗后置于暗环境中腐化处理，清洗，将清洗干净的肿根放入榨汁机中，加入无菌水搅成匀浆，过滤得到根肿菌粗提液，离心，弃上清，得到根肿菌休眠孢子；
5)采用十字花科植株根部组织提取液将根肿菌休眠孢子稀释；得到根肿菌菌液；
6)待侵染钵内幼苗2片子叶伸展开后，采用注射法将根肿菌菌液注射至侵染钵播种孔内，即植株根部位置并培养；植株生长期间，对植株定量浇施低浓度营养液；分别在接菌后的15天、20天、25天、30天，进行根肿病发病情况调查，发病记录为‘1’，未发病则记为‘0’；收集调查数据在Excel下初步整理，然后采用统计软件SPSS对数据进行统计及差异显著性分析。
2.根据权利要求1所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤2)中，十字花科植株为菊心大白菜或华油杂62R。
3.根据权利要求2所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤2)中，催芽的具体步骤如下：
将十字花科植株种子进行温度为40℃～60℃的浸种，再用体积份数为75％的乙醇进行表面灭菌，无菌水清洗种子表面残留乙醇；将培养皿中垫上2层滤纸，把处理好的种子均匀的铺在培养皿里进行催芽。
4.根据权利要求1所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤3)中，侵染钵是由压缩海绵基质制作而成，所述压缩海绵基质是按重量百分比将55％的聚氨酯泡沫塑料和45％的泥炭基质混合后压制成。
5.根据权利要求4所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤3)中，低浓度营养液是由叶菜型蔬菜专用水培营养液稀释500倍而成。
6.根据权利要求4或5所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述侵染钵尺寸为：浸泡膨胀前：正面直径为2cm，底面直径为1.3cm，高为3cm；浸泡膨胀后：正面直径为2.6cm，底面直径为1.7cm，高为3.7cm；侵染钵正面中心预留圆形空腔为播种孔，浸泡膨胀后播种孔直径为3mm，高为6mm。
7.根据权利要求1所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤4)中，根肿菌休眠孢子的具体制备方法如下：
a.将新鲜发病肿根，用无菌水将表面清洗干净，置于温度为26℃的暗环境腐化处理1～2天后用自来水将表面杂质冲洗干净，再用体积份数为75％的乙醇消毒灭菌2min，最后用无菌水充分清洗；
b.将清洗干净的肿根放入榨汁机中，加入无菌水(淹没肿根即可)搅成匀浆，分别用一层纱布和八层纱布过滤掉滤渣，即得到根肿菌粗提液，最后将根肿菌粗提液装入离心管，12000rpm，离心12～15min，弃掉上清液，得到根肿菌休眠孢子。
8.根据权利要求1所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤5)中，十字花科植株根系提取液由以下步骤制备而成：
1)取健康十字花科植株的根部组织，用自来水冲洗干净，再用体积份数为75％的乙醇消毒灭菌2min，无菌水充分冲洗，洗去表面乙醇，
2)用榨汁机搅成匀浆，最后用纱布过滤掉粗渣，得到滤液为根系提取液；
所述根肿菌菌液的浓度为1×108孢子/mL。
9.根据权利要求1所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤6)中，注射法具体包括以下步骤：用移液枪吸取500μL的根肿菌菌液打入侵染钵中央播种孔内的根毛处，盖上保湿盖。
10.根据权利要求1所述用于快速筛选根肿病抗性品种的接种方法，其特征在于：所述步骤6)中，培养具体包括以下步骤：接菌后前6～7天内不补充水分，以免稀释菌液；接菌6～7天后，每个侵染钵质安置盒倒入200～300mL的低浓度营养液，并将保湿盖上的通气孔打开，三叶期后随着苗子生长约5～7天需要补充一次低浓度营养液，每次补充300～500mL，每个盒子的补充量应当一致；整个实验过程中务必保持室内温度为24～28℃。
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