BR112019013710A2 - Composições e métodos para controle de pragas de plantas - Google Patents

Composições e métodos para controle de pragas de plantas Download PDF

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Scott Rose Mark
Jucovic Milan
Richard Bramlett Matthew
Fleming Christopher
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Abstract

são divulgadas novas proteínas inseticidas que são tóxicas para pragas de lepidópteros. os polinucleotídeos codificando as proteínas inseticidas podem ser usados para transformar organismos procarióticos e eucarióticos para expressarem as proteínas inseticidas. os organismos recombinantes ou composições contendo os organismos recombinantes ou as proteínas inseticidas sozinhos ou em combinação com outros agentes de controle de pragas e um transportador agrícola apropriado podem ser usados para controlar pragas de lepidópteros em vários ambientes.

Description

COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA CONTROLE DE PRAGAS DE PLANTAS REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA
ELETRONICAMENTE [0001] A cópia oficial da listagem de sequências é submetida eletronicamente através de EFS-Web como uma listagem de sequências em formato ASCII com um ficheiro chamado 81065-US-ORG-NAT-l_SeqList_ST25.txt, criado a 13 de dezembro, 2016, e tendo um tamanho de 224 quilobytes e é depositada simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida em este documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
ÁREA DA INVENÇÃO [0002] Esta invenção se relaciona com proteínas pesticidas e os polinucleot ídeos que as codificam, bem como composições e métodos para controle de pragas de plantas.
ANTECEDENTES [0003] As pragas de plantas são um fator preponderante na perda das culturas agrícolas importantes no mundo. Cerca de 8 biliões de dólares são perdidos todos os anos somente nos E.U.A. devido a infestações de pragas de invertebrados incluindo insetos. Adicionalmente às perdas em culturas de campo, as pragas de insetos são também um problema econômico em bens derivados de plantas de cultura, a produção de legumes e hortaliças e frutos e em jardins domésticos.
[0004] As pragas de insetos são maioritariamente controladas por aplicações intensivas de pesticidas químicos, que são ativos através da inibição do crescimento de insetos, prevenção da alimentação ou reprodução de insetos ou por
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2/144 causarem a morte. Os agentes biológicos de controle de pragas, tais como estirpes de Bacillus thuringiensis expressando toxinas pesticidas tais como proteínas Cry, têm sido também aplicados a plantas de cultura com resultados satisfatórios, oferecendo uma alternativa ou complemento aos pesticidas quimicos. Os genes codificando algumas destas proteínas Cry foram isolados e foi mostrado que a sua expressão em hospedeiros heterólogos tais como plantas transgênicas proporciona outra ferramenta para o controle de pragas de insetos economicamente importantes. [0005] Bom controle dos insetos pode ser assim alcançado, mas certos químicos podem por vezes também afetar insetos benéficos não alvo e certos biológicos têm um espectro muito estreito de atividade. Adicionalmente, o uso continuado de certos métodos de controle químico e biológico aumenta a chance de as pragas de insetos desenvolverem resistência a tais medidas de controle. Isto foi parcialmente aliviado por várias práticas de gestão da resistência, mas permanece uma necessidade de se desenvolverem novos e eficazes agentes de controle de pragas que proporcionem um benefício econômico aos agricultores e que sejam ambientalmente aceitáveis. São particularmente necessários agentes de controle que possam visar espectros diferentes de pragas de insetos economicamente importantes e que controlem eficientemente estirpes de insetos que são ou se podem tornar resistentes a agentes de controle de insetos existentes.
SUMÁRIO [0006] Tendo em conta estas necessidades é um objetivo da presente invenção proporcionar novos agentes de controle
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3/144 de pragas pelo proporcionar de novos isolados de Bacillus thuringiensis (Bt) bem como novos genes e proteínas pesticidas que podem ser usados para controlar uma variedade de pragas de plantas e artigos.
[0007] A invenção proporciona composições e métodos para conferição de atividade pesticida a bactérias, plantas, partes de plantas, células de plantas, tecidos e sementes. Em particular, novos polinucleotídeos que codificam proteínas Cry isoladas a partir de Bt e sequências substancialmente idênticas a eles são proporcionados. A invenção está adicionalmente dirigida a genes quiméricos compreendendo os novos polinucleotídeos cuja expressão resulta em proteínas Cry com toxicidade a pragas de insetos economicamente importantes, particularmente pragas de insetos que infestam plantas ou artigos derivados a partir de plantas. A invenção está adicionalmente dirigida às novas proteínas Cry resultando da expressão dos polinucleotídeos e a composições e formulações contendo as proteínas Cry, que são tóxicas para insetos por inibição da capacidade das pragas de insetos de sobreviverem, crescerem e se reproduzirem, ou de limitação dos danos ou perda relacionados com insetos a plantas de cultura ou artigos derivados a partir de plantas de cultura. As proteínas Cry da invenção incluem proteínas Cry nativas e suas variantes bem como proteínas Cry modificadas que têm uma ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos. Exemplos de proteínas Cry modificadas incluem sem limitação aquelas que são mutadas para modularem a sua atividade biológica. Tal modulação pode, por exemplo, ampliar ou estreitar seu espectro de
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4/144 atividade ou aumentar ou diminuir sua especificidade em comparação com suas contrapartidas de proteínas Cry nativas. As proteínas Cry da invenção podem ser mutadas para introduzirem um epítopo para gerar anticorpos que reconhecem diferencialmente a proteína modificada a partir da proteína nativa ou podem ser mutadas para modificarem a expressão em um organismo transgênico, tal como uma planta ou bactéria. As proteínas Cry da invenção são altamente ativas contra pragas de insetos economicamente importantes, por exemplo, pragas de insetos de plantas de cultura tais como lagarta-rosca (BCW; Agrotis ipsilon), broca europeia do milho (ECB; Ostrinia nubilalis), lagarta-do-cartucho do milho (FAW; Spodoptera frugiperda) , lagarta da espiga (CEW; Helicoverpa zea) , broca da cana (SCB; Diatraea saccharalis), lagarta-dasoja (VBC; Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsamedideira (SBL; Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (SWCB; Diatraea grandiosella), lagarta-rosca do oeste (WBC; Richia albicosta), lagarta do tabaco (TBW; Heliothis virescens), broca asiática do milho (ACB; Ostrinia furnacalis), traça do algodão (CBW; Helicoverpa armigera), broca riscada do tronco (SSB; Chilo suppressalis), broca do entrenó rosa (PSB; Sesamia calamistis), lagarta enroladora da folha do arroz (RLF; Cnaphalocrocis medinalis) e similares ou pragas de inseto economicamente importantes de produtos armazenados ou bens derivados a partir de plantas de cultura tais como traça branca doméstica (WHM; Endrosis sarcitrella) , traça caseira marrom (BHM; Hofmannophila pseudospretella) , alucite (AGM; Sitotroga cerealella) , traça da farinha
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5/144 tropical (ADM; Cadra cautella), traça da farinha (MFM; Ephestia kuehniella), traça dos cereais (IMM; Plodia interpunctella), traça dos grãos (EGM; Nemapogon granella) e similares .
[0008] A invenção também proporciona polinucleotideos sintéticos que codificam as proteínas Cry da invenção que têm um ou mais códons otimizados para expressão em organismos transgênicos tais como bactérias transgênicas ou plantas transgênicas.
[0009] A invenção está adicionalmente dirigida a cassetes de expressão e vetores recombinantes compreendendo um polinucleotideo que codifica uma proteina Cry da invenção. A invenção também proporciona bactérias, plantas, partes de plantas, células, tecidos e sementes de plantas transformados compreendendo um gene quimérico ou um cassete de expressão ou um vetor recombinante que são úteis na expressão de uma proteina Cry da invenção nas bactérias, plantas, células, tecidos e sementes de planta transformados.
[0010] A invenção está também dirigida a estirpes isoladas de Bacillus thuringiensis (Bt) que produzem as proteínas Cry da invenção. Tais estirpes de Bt podem ser um isolado ocorrendo naturalmente ou uma estirpe recombinante de Bt que produza uma ou mais das proteínas Cry da invenção.
[0011] A invenção está também dirigida a métodos de uso de polinucleotideos da invenção, por exemplo em construtos de DNA ou genes quiméricos ou cassetes de expressão ou vetores recombinantes para transformação e expressão em organismos, incluindo plantas e microrganismos, tais como bactérias. As sequências de nucleotídeos ou aminoácidos
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6/144 podem ser sequências nativas ou sintéticas que foram concebidas para expressão em um organismo tal como uma planta ou bactéria ou na preparação de toxinas Cry hibridas com atividade pesticida intensificada. A invenção está adicionalmente dirigida a métodos de preparação das proteínas Cry e a métodos de uso das sequências de polinucleotídeos e proteínas Cry, por exemplo em microrganismos para controlar insetos ou em plantas transgênicas para conferir proteção contra danos causados por insetos.
[0012] Outro aspecto da invenção inclui composições e formulações inseticidas compreendendo as proteínas Cry ou as estirpes de Bacillus thuringiensis da invenção e métodos de uso das composições ou formulações para controlar populações de pragas de insetos, por exemplo por aplicação das composições ou formulações a áreas infestadas por insetos ou para tratar profilaticamente áreas ou plantas suscetíveis a insetos para conferir proteção contra as pragas de insetos. Opcionalmente, as composições ou formulações da invenção podem, adicionalmente à proteína Cry ou estirpe de Bt da invenção, compreender outros agentes pesticidas tais como pesticidas químicos ou biológicos de modo a aumentar ou intensificar a capacidade controladora de insetos das composições ou formulações da invenção.
[0013] As composições e métodos da invenção são úteis para controle de pragas de insetos que atacam plantas, particularmente plantas de cultura ou bens derivados a partir de plantas de cultura. As composições da invenção são também úteis para geração de proteínas Cry alteradas
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7/144 ou melhoradas que têm atividade pesticida ou para detecção da presença de uma proteina Cry ou polinucleotideos em produtos comerciais ou organismos transgênicos.
[0014] Estas e outras características, aspectos e vantagens da invenção serão mais bem entendidos com referência à seguinte descrição detalhada e reivindicações.
BREVE DESCRIÇÃO DOS VÁRIOS DESENHOS [0015] As Fig. 1A-E mostram um alinhamento de uma proteína
BT2CrylJ e várias modalidades de proteínas BT2CrylJ modificadas.
[0016] As Fig. 2A-B mostram um alinhamento de uma proteína Cryllgl, uma proteína BT25CrylI e uma proteína BT25CrylI variante.
[0017] As Fig. 3A-B mostram um alinhamento de uma proteína CrylJal, uma proteína BT2CrylJ e uma proteína BT2CrylJ variante.
[0018] As Fig. 4A-B mostram um alinhamento de uma proteína CrylJcl, uma proteína BT53CrylJ e uma proteína BT53CrylJ variante.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS NA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0019] SEQ ID NO: 1 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ.
[0020] SEQ ID NO: 2 é uma sequência de aminoácidos de
BT25CrylI •
[0021] SEQ ID NO: 3 é uma sequência de aminoácidos de
BT53CrylJ.
[0022] SEQ ID NO: 4 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ [0023] SEQ variante. ID NO: 5 é uma sequência de aminoácidos de
BT25CrylI variante.
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8/144
[0024] SEQ ID NO: 6 é uma sequência de aminoácidos de
BT53CrylJ variante.
[0025] SEQ ID NO: 7 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 3.
[0026] SEQ ID NO: 8 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 4 .
[0027] SEQ ID NO: 9 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 5/6.
[0028] SEQ ID NO: 10 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 3/4 .
[0029] SEQ ID NO: 11 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 4/5/6.
[0030] SEQ ID NO: 12 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 3/5/6.
[0031] SEQ ID NO: 13 é uma sequência de aminoácidos de
BT2CrylJ variante modificada na a-hélice 3/4/5/6.
[0032] SEQ ID NO: 14 é uma sequência de nucleotideos
codificando SEQ ID NO: 1.
[0033] SEQ ID NO: 15 é uma sequência de nucleotideos
codificando SEQ ID NO: 2.
[0034] SEQ ID NO: 16 é uma sequência de nucleotideos
codificando SEQ ID NO: 3.
[0035] SEQ ID NO: 17 é uma sequência que tem códons
otimizados codificando SEQ ID NO: 1.
[0036] SEQ ID NO: 18 é uma sequência que tem códons
otimizados codificando SEQ ID NO: 2.
[0037] SEQ ID NO: 19 é uma sequência que tem códons
otimizados codificando SEQ ID NO: 3.
[0038] SEQ ID NO: 2 0 é uma sequência de nucleotideos
codificando SEQ ID NO: 4.
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9/144
[0039] SEQ ID NO: 21 é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0040] SEQ ID SEQ ID NO: NO 22 : 5 . é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0041] SEQ ID SEQ ID NO: NO 23 : 6. é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0042] SEQ ID SEQ ID NO: NO 24 : 7 . é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0043] SEQ ID SEQ ID NO: NO 25 : 8. é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0044] SEQ ID SEQ ID NO: NO 26 : 9. é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0045] SEQ ID SEQ ID NO: NO 27 : 10 é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0046] SEQ ID SEQ ID NO: NO 28 : 11 é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0047] SEQ ID SEQ ID NO: NO 29 : 12 é uma sequência de nucleotídeos
codificando [0048] SEQ ID SEQ ID NO: 30 NO é : 13 uma sequência de nucleotídeos de um
vetor de vai [0049] SEQ ID -vem. NO: 31 é uma sequência de nucleotídeos de um
vetor de transformação binária.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0050] Esta descrição não se destina a ser um catálogo detalhado de todas as maneiras diferentes pelas quais a invenção pode ser implementada ou todas as características que podem ser adicionadas à presente invenção. Por exemplo, as características ilustradas no que diz respeito a uma modalidade podem ser incorporadas em outras modalidades e as características ilustradas no que diz
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10/144 respeito a uma modalidade particular podem ser eliminadas dessa modalidade. Assim, a invenção contempla que, em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características apresentada aqui possa ser excluída ou omitida. Adicionalmente, numerosas variações e adições às várias modalidades sugeridas aqui serão claras para os peritos na técnica à luz da presente divulgação, que não se afastem a partir da presente invenção. Consequentemente, as seguintes descrições se destinam a ilustrar algumas modalidades particulares da invenção e não a especificar exaustivamente todas as suas permutações, combinações e variações.
[0051] A não ser que de outro modo definidos, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido pelo perito na técnica à qual esta invenção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui é somente para o propósito de descrição de modalidades particulares e não se destina a ser limitante da invenção.
Definições [0052] Como usadas aqui e nas reivindicações anexas, as formas singulares um, uma e o/a incluem referentes plurais a não ser que o contexto dite claramente de outro modo. Assim, por exemplo, a referência a uma planta é uma referência a uma ou mais plantas e inclui seus equivalentes conhecidos dos peritos na técnica e assim por diante. Como usada aqui, a palavra ou significa qualquer membro de uma lista particular e inclui também qualquer combinação de membros dessa lista (i.e., inclui também e) .
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11/144 [0053] O termo cerca de é usado aqui para significar aproximadamente, mais ou menos, em torno de ou na região de. Quando o termo cerca de é usado em conjunção com uma gama numérica, ele modifica essa gama por extensão das fronteiras acima e abaixo dos valores numéricos apresentados. Em geral, o termo cerca de é usado aqui para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor apresentado por uma variância de 20 por cento, preferencialmente 10 por cento para cima ou para baixo (maior ou menor). No que diz respeito a uma temperatura, o termo cerca de significa ± 1 °C, preferencialmente ± 0,5 °C. Onde o termo cerca de é usado no contexto desta invenção (p.ex., em combinações com valores de temperatura ou peso molecular), o valor exato (i.e., sem cerca de) é preferencial.
[0054] Uma proteina Cry ativa ou a atividade de uma proteina Cry da invenção se entende que a proteina Cry funciona como um agente de controle de insetos, tem um efeito tóxico ou é capaz de interromper ou deter a alimentação de insetos, o que pode ou não causar morte do inseto. Quando uma proteina Cry da invenção é administrada ao inseto, o resultado é tipicamente a morte do inseto ou o inseto não se alimenta da fonte que torna a proteina Cry disponível para o inseto.
[0055] Como usado aqui, o termo amplificado significa a construção de múltiplas cópias de um polinucleotideo ou múltiplas cópias complementares do polinucleotideo usando pelo menos um dos polinucleotideos como um molde. Os sistemas de amplificação incluem o sistema de reação em cadeia da polimerase (PCR), sistema de reação em cadeia
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12/144 da ligase (LCR), amplificação à base de sequências de nucleotídeos (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontário), sistemas de Replicase Q-Beta, sistema de amplificação à base de transcrição (TAS) e amplificação de deslocamento de fitas (SDA). Ver, p.ex., Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, PERSING et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). 0 produto da amplificação é denominado um amplicon.
[0056] 0 termo construto químico ou gene quimérico ou polinucleotideo quimérico ou ácido nucléico quimérico (ou termos similares) como usado aqui se refere a um construto ou molécula compreendendo dois ou mais polinucleotídeos de diferente origem montados em um único polinucleotideo. 0 termo construto químico, gene quimérico, polinucleotideo quimérico ou ácido nucléico quimérico se refere a qualquer construto ou molécula que contém, sem limitação, (1) polinucleotídeos (p.ex., DNA), incluindo polinucleotídeos reguladores e codificantes que não são encontrados em conjunto na natureza (i.e., pelo menos um dos polinucleotídeos no construto é heterólogo no que diz respeito a pelo menos um dos seus outros polinucleotídeos) ou (2) polinucleotídeos codificando partes de proteínas não naturalmente contíguas ou (3) partes de promotores que não são naturalmente contíguos. Adicionalmente, um construto quimérico, gene quimérico, polinucleotídeo quimérico ou ácido nucléico quimérico pode compreender polinucleotídeos reguladores e polinucleotídeos codificantes que são derivados a partir de diferentes
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13/144 fontes ou compreender polinucleotídeos reguladores e polinucleotídeos codificantes derivados a partir da mesma fonte, mas dispostos de um modo diferente daquele encontrado na natureza. Em algumas modalidades da invenção, o construto quimérico, gene quimérico, polinucleotideo quimérico ou ácido nucléico quimérico compreende um cassete de expressão compreendendo um polinucleotideo da invenção sob o controle de polinucleotídeos reguladores, particularmente sob o controle de polinucleotídeos reguladores funcionais em plantas ou bactérias.
[0057] Uma sequência codificante é uma sequência de nucleotídeos que é transcrita em RNA tal como mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, RNA senso ou RNA antissenso. Preferencialmente, o RNA é depois traduzido em um organismo para produzir uma proteína.
[0058] Como usada aqui, uma sequência que tem códons otimizados significa uma sequência de nucleotídeos de um polinucleotideo recombinante, transgênico ou sintético em que os códons são escolhidos para refletirem o viés de códons particular que uma célula ou organismo hospedeiro pode ter. Isto é tipicamente feito de um tal modo de modo a preservar a sequência de aminoácidos do polipeptideo codificado pela sequência de nucleotídeos que tem códons otimizados. Em certas modalidades, a sequência de DNA do construto de DNA recombinante inclui sequência que tem códons otimizados para a célula (p.ex., uma célula animal, de planta ou fúngica) na qual o construto é para ser expresso. Por exemplo, um construto para ser expresso em uma célula de planta pode toda a ou partes da sua sequência
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14/144 (p.ex., o primeiro elemento de supressão de genes ou o elemento de expressão de genes) que tem códons otimizados para expressão em uma planta. Ver, p.ex., Pat. dos E.U.A. No. 6,121,014, incorporada aqui por referência.
[0059] Controlar insetos significa inibir, através de um efeito tóxico, a capacidade de pragas de insetos de sobreviver, crescer, se alimentar ou reproduzir ou limitar danos ou perda relacionados com insetos em plantas de cultura ou proteger o potencial de rendimento de uma cultura quando cultivada na presença de pragas de insetos. Controlar insetos pode ou não significar morte dos insetos, embora signifique preferencialmente morte dos insetos.
[0060] Os termos compreende ou compreendendo, quando usados em este relatório descritivo, especificam a presença de caracteristicas, números inteiros, passos, operações, elementos ou componentes referidos, mas não excluem a presença ou adição de uma ou mais outras suas caracteristicas, números inteiros, passos, operações, elementos, componentes ou grupos.
[0061] Como usada aqui, a frase transicional consistindo essencialmente em (e variantes gramaticais) significa que o escopo de uma reivindicação é para ser interpretado como englobando os materiais ou passos especificados recitados na reivindicação e aqueles que não alteram materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Assim, o termo consistindo essencialmente em quando usado em uma reivindicação desta invenção não se destina a ser interpretado como sendo equivalente a compreendendo.
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15/144 [0062] No contexto da invenção, correspondendo a ou corresponde a significa que, quando as sequências de aminoácidos de proteínas Cry variantes ou modificadas estão alinhadas entre si, os aminoácidos que correspondem a certas posições enumeradas na proteína variante ou modificada são aqueles que se alinham com estas posições em uma proteína de referência, mas que não estão necessariamente em estas posições numéricas exatas em relação à sequência de aminoácidos de referência particular da invenção. Por exemplo, se SEQ ID NO: 1 for a sequência de referência e for alinhada com SEQ ID NO: 3, Pro419 de SEQ ID NO: 3 corresponde a Pro421 de SEQ ID NO: 1 ou Tyr417 de SEQ ID NO: 3 corresponde a Asn419 de SEQ ID NO: 1.
[0063] Como usado aqui, o termo proteína Cry significa uma proteína inseticida de um tipo de delta-endotoxina cristalina de Bacillus thuringiensis. 0 termo proteína Cry pode se referir à forma de pró-toxina ou qualquer seu fragmento ou toxina em termos inseticidas. As proteínas Cry de Bacillus thuringiensis têm atividade inseticida potente predominantemente contra insetos de pragas de lepidópteros, dípteros e coleópteros. Estas proteínas mostraram também atividade contra pragas das Ordens Hymenoptera, Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga e ordens de pragas Acari, bem como outras ordens de invertebrados tais como Nemathelminthes, Platyhelminthes e Sarcomastigorphora (Feitelson, J. 1993. The Bacillus Thuringiensis family tree. Em Advanced Engineered Pesticides. Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, N.Y.) . Estas proteínas foram originalmente classificadas
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16/144 principalmente com base na sua atividade inseticida. As principais classes eram especificas de Lepidoptera (Cryl), especificas de Lepidoptera e Diptera (Cryll), especificas de Coleoptera (CrylII), especificas de Diptera (CrylV) e especificas de nematódeos (CryV) e (CryVI). As proteínas foram adicionalmente classificadas em subfamílias; às proteínas mais altamente relacionadas dentro de cada família foram atribuídas letras divisionais tais como CrylA, CrylB, CrylC, etc. Às proteínas ainda mais estreitamente relacionadas dentro de cada divisão foram dados nomes tais como CrylC(a), CrylC(b), etc. Os termos toxina Cry e delta-endotoxina têm sido usados indistintamente com o termo proteína Cry. A nomenclatura corrente para proteínas e genes Cry é baseada em homologia de sequências de aminoácidos ao invés de especificidade de alvo de insetos (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813). Em esta classificação mais aceite, a cada proteína Cry é atribuído um nome único incorporando uma classificação primária (um número romano) se tiver <45% de identidade de sequências com proteínas Cry denominadas conhecidas, por exemplo Cryl ou Cry2 e similares; uma classificação secundária (uma letra maiúscula) se tiver >45% e <75% de identidade de sequências com proteínas Cry denominadas conhecidas, por exemplo Cryll ou CrylJ e similares; uma classificação terciária (uma letra minúscula) se tiver de 75% a 95% de identidade de sequências com proteínas Cry denominadas conhecidas, por exemplo CrylJa ou CrylJc e similares; e uma classificação quaternária (outro número arábico) se tiver >95% de identidade de sequências com proteínas Cry
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17/144 denominadas conhecidas, por exemplo CrylJal ou CrylJa2 e similares. Na classificação corrente, os numerais romanos foram trocados por numerais árabes na classificação primária. Por exemplo, CrylA(a) sob a nomenclatura antiga é agora CrylAa sob a nomenclatura corrente. De acordo com Ibrahim et al. (2010, Bloeng. Bugs, 1:31-50), as toxinas Cry podem ser ainda separadas em seis classes principais de acordo com as suas especificidades de hospedeiros de insetos e incluem: Grupo 1—lepidópteros (p.ex., Cryl, Cry9 e Cryl5); grupo 2—lepidópteros e dípteros (p.ex., Cry2); grupo 3—coleópteros (Cry3, Cry7 e Cry8); grupo 4—dípteros (Cry4, CrylO, Cryll, Cryl6, Cryl7, Cryl9 e Cry20); grupo 5—lepidópteros e coleópteros (Cryll); e grupo 6—nematódeos (Cry6) . As toxinas Cryll, Cry2, Cry3, CrylO e Cryll (73-82 kDa) são únicas porque parecem ser truncações naturais das proteínas Cryl e Cry4 maiores (130-140 kDa).
[0064] As proteínas Cry são moléculas de proteínas globulares que se acumulam como pró-toxinas na forma cristalina durante a etapa de esporulação de Bt. Após ingestão por uma praga, os cristais são tipicamente solubilizados para liberarem pró-toxinas, que podem variar em tamanho, por exemplo, de 130-140 kDa para muitas das proteínas Cry ativas em lepidópteros, tais como Cryl e Cry9, e 60-80 kDa para as proteínas Cry3 ativas em coleópteros e as proteínas Cry2 ativas em lepidópteros/dípteros. Após os cristais serem solubilizados por um inseto suscetível, as pró-toxinas liberadas são processadas por proteases presentes no intestino do inseto, por exemplo tripsina e quimotripsina,
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18/144 para produzir uma toxina de proteina Cry nuclear resistente a proteases. Este processamento proteolitico envolve a remoção de aminoácidos de diferentes regiões das várias pró-toxinas Cry. Por exemplo, pró-toxinas Cry que têm 130-140 kDa são tipicamente ativadas através da remoção proteolitica de um peptideo N-terminal de 25-30 aminoácidos e aproximadamente metade da restante proteina do terminal C resultando em uma toxina Cry madura de aproximadamente 60-70 kDa. As pró-toxinas que têm 60-80 kDa, p.ex., Cry2 e Cry3, são também processadas, mas não na mesma extensão das pró-toxinas maiores. As pró-toxinas mais pequenas têm tipicamente um número igual ou maior de aminoácidos removidos do terminal N do que as pró-toxinas maiores, mas menos aminoácidos removidos do terminal C. Por exemplo, a ativação proteolitica de membros da familia Cry2 envolve tipicamente a remoção de aproximadamente 4050 aminoácidos N-terminais. Muitas das proteínas Cry são bastante tóxicas para insetos alvo específicos, mas muitas têm espectros de atividade estreitos.
[0065] As proteínas Cry têm geralmente cinco domínios de sequência conservados e três domínios estruturais conservados (ver, por exemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17: 193-199) . O primeiro domínio estrutural conservado, chamado Domínio I, consiste tipicamente em sete hélices alfa e está envolvido na inserção na membrana e formação dos poros. O domínio II consiste tipicamente em três folhas beta dispostas em uma configuração de chave grega e o domínio III consiste tipicamente em duas folhas beta antiparalelas em formação de torta (de Maagd et al., 2001, supra). Os domínios II
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19/144 e III estão envolvidos no reconhecimento e ligação ao receptor e são, portanto, considerados determinantes da especificidade da toxina.
[0066] 0 termo Cryll se refere a qualquer membro de um grupo de proteínas Cry tendo pelo menos 75% de identidade de sequências com o holótipo de proteína Cryll (No. Acesso NCBI CAA44633) e o termo Cryllgse refere a qualquer membro de um grupo de proteínas Cryll tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com o holótipo de proteína Cryllg (No. Acesso NCBI KC156701) de acordo com Crickmore et al. supra., incorporado aqui por referência.
[0067] 0 termo CrylJ se refere a qualquer membro de um grupo de proteínas Cry tendo pelo menos 75% de identidade de sequências com o holótipo de proteína CrylJ (No. Acesso NCBI AA22341) e o termo CrylJase refere a qualquer membro de um grupo de proteínas Cry tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com o holótipo de proteína CrylJa acima identificado, de acordo com Crickmore et al. supra., incorporado aqui por referência. 0 termo CrylJc se refere a qualquer membro de um grupo de proteínas Cry tendo pelo menos 95% de identidade de sequências com o holótipo de proteína CrylJcl (No. Acesso NCBI AAC31092).
[0068] Administrar uma composição ou proteína tóxica significa que a composição ou proteína tóxica entra em contato com um inseto, o que facilita a ingestão oral da composição ou proteína Cry tóxica, resultando em um efeito tóxico e controle do inseto. A composição ou proteína Cry tóxica pode ser administrada em muitos modos reconhecidos, incluindo, mas não se limitando a, expressão em plantas transgênicas, composição(ões) de proteína formulada (s),
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20/144 composição(ões) de proteína pulverizável(eis), uma matriz isca ou qualquer outro sistema de administração de proteínas reconhecido na técnica.
[0069] 0 termo domínio se refere a um conjunto de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de um alinhamento de sequências de proteínas evolutivamente relacionadas. Embora os aminoácidos em outras posições possam variar entre homólogos, os aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são provavelmente essenciais na estrutura, estabilidade ou função de uma proteína. Identificados pelo seu elevado grau de conservação em sequências alinhadas de uma família de homólogos de proteínas, eles podem ser usados como identificadores para determinar se qualquer polipeptideo em questão pertence a um grupo de polipeptideos previamente identificado.
[0070] Quant idade controladora de insetos eficaz significa aquela concentração de uma proteína Cry que inibe, através de um efeito tóxico, a capacidade dos insetos de sobreviverem, crescerem, se alimentarem ou reproduzirem ou limita os danos ou perdas relacionados com insetos em plantas de cultura ou protege o potencial de rendimento de uma cultura quando cultivada na presença de pragas de insetos. Quantidade controladora de insetos eficaz pode ou não significar uma quantidade que mata os insetos, embora signifique preferencialmente uma quantidade que mata insetos.
[0071] Cassete de expressão como usado aqui significa um polinucleotídeo capaz de dirigir a expressão de pelo menos
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21/144 um polinucleotideo de interesse, tal como um polinucleotideo que codifica uma proteina Cry da invenção, em uma célula hospedeira apropriada, compreendendo um promotor operacionalmente ligado ao polinucleotideo de interesse que está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Um cassete de expressão compreende também tipicamente polinucleotideos adicionais requeridos para tradução apropriada do polinucleotideo de interesse. 0 cassete de expressão pode também compreender outros polinucleotideos não necessários na expressão direta de um polinucleotideo de interesse, mas que estão presentes devido a locais de restrição convenientes para remoção do cassete a partir de um vetor de expressão. 0 cassete de expressão compreendendo o(s) polinucleotideo(s) de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo no que diz respeito a pelo menos um dos seus outros componentes. 0 cassete de expressão pode ser também um que ocorra naturalmente, mas foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, o cassete de expressão é heterólogo no que diz respeito ao hospedeiro, i.e., o polinucleotideo de interesse no cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e tem de ter sido introduzido na célula hospedeira ou em um antepassado da célula hospedeira por um processo de transformação ou um processo de melhoramento. A expressão do(s) polinucleotideo(s) de interesse no cassete de expressão está geralmente sob o controle de um promotor. No caso de um organismo multicelular, tal como uma planta, o promotor pode ser também especifico ou preferencial de
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22/144 um tecido ou órgão ou etapa particular de desenvolvimento. Um cassete de expressão, ou seu fragmento, pode ser também referido como polinucleotideo inserido ou polinucleotideo de inserção quando transformado em uma planta.
[0072] Um gene é definido aqui como uma unidade hereditária compreendendo um ou mais polinucleotídeos que ocupa uma localização específica em um cromossomo ou plasmídeo e que contém as instruções genéticas para uma característica ou traço particular em um organismo.
[0073] Uma protease intestinal é uma protease naturalmente encontrada no trato digestivo de um inseto. A protease intestinal está tipicamente envolvida na digestão de proteínas ingeridas. Exemplos de proteases intestinais de insetos incluem tripsina, que tipicamente cliva peptideos no lado C-terminal de resíduos de lisina (K) ou arginina (R) , e quimotripsina, que tipicamente cliva peptideos no lado C-terminal da fenilalanina (F) , triptofano (W) ou tirosina (Y).
[0074] 0 termo heterólogo quando usado em referência a um gene ou um polinucleotideo ou um polipeptideo se refere a um gene ou um polinucleotideo ou um polipeptideo que é ou contém uma sua parte não no seu ambiente natural (i.e., foi alterado pela mão do homem) . Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir um polinucleotideo de uma espécie introduzido em outra espécie. Um gene heterólogo pode também incluir um polinucleotideo nativo de um organismo que foi alterado de alguma forma (p.ex., mutado, adicionado em múltiplas cópias, ligado a um promotor não nativo ou polinucleotideo intensificador, etc.). Os genes
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23/144 heterólogos podem adicionalmente compreender polinucleotideos de genes de plantas que compreendem formas de cDNA de um gene de planta; os cDNA podem ser expressos em uma orientação senso (para produzir mRNA) ou antissenso (para produzir um transcrito de RNA antissenso que é complementar ao transcrito do mRNA). Em um aspecto da invenção, os genes heterólogos são distinguidos dos genes endógenos de plantas no fato de que polinucleotideo do gene heterólogo está tipicamente unido a polinucleotideos compreendendo elementos reguladores tais como promotores que não são encontrados naturalmente associados ao gene para a proteina codificada pelo gene heterólogo ou ao polinucleotideo do gene da planta no cromossomo ou está associado a porções do cromossoma não encontradas na natureza (p.ex., genes expressos em loci. onde o gene não é normalmente expresso). Adicionalmente, um polinucleotideo heterólogo se refere a um polinucleotideo não naturalmente associado a uma célula hospedeira na qual é introduzido, incluindo múltiplas cópias não ocorrendo naturalmente de um polinucleotideo ocorrendo naturalmente.
[0075] A recombinação homóloga é a troca (cruzamento) de fragmentos de DNA entre duas moléculas de DNA ou cromatideos de cromossomos emparelhados em uma região de polinucleotideos idênticos. Um evento de recombinação é aqui entendido como significando um cruzamento meiótico.
[0076] Uma sequência de nucleotideos é isocodifiçada com uma sequência de nucleotideos de referência quando a sequência de nucleotideos codifica um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo
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24/144 codificado pela sequência de nucleotideos de referência. Por exemplo, SEQ ID NO:17 é isocodificante com SEQ ID NO: 14 porque ambas codificam a sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1.
[0077] O termo polinucleotideo ou proteina isolado é um polinucleot ideo ou proteina que já não existe no seu ambiente natural. Um polinucleotideo ou proteina isolado da invenção pode existir em uma forma purificada ou pode existir em um hospedeiro recombinante tal como em uma bactéria transgênica ou uma planta transgênica. Portanto, se pretendo que uma reivindicação dirigida a um polinucleotideo isolado englobe esse polinucleotideo quando o polinucleotideo está compreendido dentro de uma planta.
[0078] Operacionalmente ligado se refere à associação de polinucleotideos em um único fragmento de nucleotideo tal que a função de um afete a função do outro. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a um polinucleotideo codificante ou RNA funcional quando é capaz de afetar a expressão desse polinucleotideo codificante ou RNA funcional (i.e., o polinucleotideo codificante ou RNA funcional está sob o controle transcricional do promotor). Os polinucleotideos codificantes em orientação senso ou antissenso podem estar operacionalmente ligados a polinucleotideos reguladores.
[0079] Como usados aqui, pesticida, inseticida e similares se referem à capacidade de uma proteina Cry da invenção de controlar um organismo praga ou uma quantidade de uma proteina Cry que consegue controlar um organismo praga como definido aqui. Assim, uma proteina Cry
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25/144 pesticida pode matar ou inibir a capacidade de um organismo praga (p.ex., praga de insetos) de sobreviver, crescer, se alimentar ou reproduzir.
[0080] Uma planta é qualquer planta em qualquer etapa de desenvolvimento, particularmente uma planta de sementes.
[0081] Uma célula de planta é uma unidade estrutural e fisiológica de uma planta, compreendendo um protoplasto e uma parede celular. A célula de planta pode estar na forma de uma única célula isolada ou uma célula cultivada ou como parte de uma unidade de organização superior tal como, por exemplo, tecido de planta, um órgão de planta ou uma planta inteira.
[0082] Cultura de células de plantas significa culturas de unidades de plantas tais como, por exemplo, protoplastos, células de cultura de células, células em tecidos de plantas, pólen, tubos de pólen, óvulos, sacos embrionários, zigotos e embriões em várias etapas de desenvolvimento.
[0083] Material de planta se refere a folhas, caules, raizes, flores ou partes de flores, frutos, pólen, óvulos, zigotos, sementes, estacas, culturas de células ou tecidos ou qualquer outra parte ou produto de uma planta.
[0084] Um órgão de planta é uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta tal como uma raiz, caule, folha, broto de flor ou embrião.
[0085] Tecido de planta como usado aqui significa um grupo de células de plantas organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de uma planta in planta ou em cultura está incluído. Este termo inclui, mas não está limitado a, plantas inteiras, órgãos de
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26/144 plantas, sementes de plantas, cultura de tecidos e quaisquer grupos de células de plantas organizados em unidades estruturais ou funcionais. 0 uso deste termo em conjunção com, ou na ausência de, qualquer tipo especifico de tecido de planta como listado acima ou de outro modo englobado por esta definição não se destina a ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido de planta.
[0086] Um polinucleotideo se refere a um polimero composto por muitos monômeros de nucleotideos covalentemente ligados em uma cadeia. Tais polinucleotideos incluem DNA, RNA, oligonucleotídeos modificados (p.ex., oligonucleotideos compreendendo bases que não são tipicas de RNA ou DNA biológico, tais como oligonucleotideos 2'O-metilados) e similares. Em algumas modalidades, um polinucleotideo pode ter fita única, fita dupla, fitas múltiplas ou suas combinações. A não ser que de outro modo indicado, um ácido nucléico ou polinucleotideo particular da presente invenção compreende ou codifica opcionalmente polinucleotideos complementares, adicionalmente a qualquer polinucleotideo explicitamente indicado.
[0087] Polinucleotideo de interesse se refere a qualquer polinucleotideo que, quando transferido para um organismo, p.ex., uma planta, confere ao organismo uma caracteristica desejada tal como resistência a insetos, resistência a doenças, tolerância a herbicidas, resistência a antibióticos, valor nutricional melhorado, desempenho melhorado em um processo industrial, produção de enzimas ou metabolitos comercialmente valiosos ou capacidade reprodutiva alterada.
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27/144 [0088] O termo promotor se refere a um polinucleotídeo, usualmente a montante (5') do seu polinucleotídeo codificante, que controla a expressão do polinucleotídeo codificante pelo proporcionar do reconhecimento de RNA polimerase e outros fatores requeridos para transcrição apropriada.
[0089] Um protoplasto é uma célula de planta isolada sem uma parede celular ou somente com partes da parede celular.
[0090] Como usado aqui, o termo recombinante se refere a uma forma de polinucleotídeo (p.ex., DNA ou RNA) ou proteína ou um organismo que não seria normalmente encontrado na natureza e como tal foi criado por intervenção humana. Como usado aqui, um polinucleotídeo recombinante é um polinucleotídeo compreendendo uma combinação de polinucleotídeos que não ocorrería naturalmente em conjunto e é o resultado de intervenção humana, p.ex., um polinucleotídeo que é compreendido por uma combinação de pelo menos dois polinucleotídeos heterólogos entre si ou um polinucleotídeo que é artificialmente sintetizado e compreende um polinucleotídeo que se desvia do polinucleotídeo que existiría normalmente na natureza ou um polinucleotídeo que compreende um transgene artificialmente incorporado no DNA genômico de uma célula hospedeira e o DNA flanqueante associado do genoma da célula hospedeira. Um exemplo de um polinucleotídeo recombinante é uma molécula de DNA resultando da inserção de um transgene no DNA genômico de uma planta, o que pode em última análise resultar na expressão de um RNA ou molécula de proteína
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28/144 recombinante em esse organismo. Uma proteina recombinante é uma proteina codificada por um polinucleotideo recombinante que foi clonada em um sistema que suporta a expressão do polinucleotideo e tradução de mRNA. Por exemplo, uma proteína Cry tendo uma sequência de aminoácidos nativa ou uma sequência de aminoácidos mutada e expressa em uma planta é uma proteína Cry recombinante. Como usada aqui, uma planta recombinante é uma planta que não existiría normalmente a natureza, é o resultado de intervenção humana e contém um transgene ou polinucleotideo heterólogo incorporado no seu genoma. Como resultado de tal alteração genômica, a planta recombinante é distintamente diferente da planta de tipo selvagem relacionada.
[0091] Elementos reguladores se referem a sequências envolvidas no controle da expressão de uma sequência de nucleotídeos. Os elementos reguladores compreendem um promotor operacionalmente ligado à sequência de nucleotídeos de interesse e sinais de terminação. Englobam também tipicamente sequências requeridas para a tradução apropriada da sequência de nucleotídeos.
[0092] 0 termo identidade ou idêntica ou substancialmente idêntica, no contexto de duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 80%, mais
preferencialmente pelo menos 90%, ainda mais
preferencialmente pelo menos 95% e, o mais
preferencialmente, pelo menos 99% de identidade de
resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos, quando comparadas
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29/144 e alinhadas para correspondência máxima, como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequências ou por inspeção visual. Preferencialmente, a identidade substancial existe ao longo de uma região das sequências que tem pelo menos cerca de 50 residues ou bases em comprimento, mais preferencialmente ao longo de uma região de pelo menos cerca de 100 residues ou bases e, o mais preferencialmente, as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 residues ou bases. Em uma modalidade especialmente preferida, as sequências são substancialmente idênticas ao longo do comprimento inteiro das regiões codificantes. Além do mais, sequências de nucleotideos ou aminoácidos substancialmente idênticas desempenham substancialmente a mesma função.
[0093] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência com a qual as sequências de teste são comparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, se necessário são designadas coordenadas de subsequências e são designados parâmetros do programa de algoritmo de sequências. O algoritmo de comparação de sequências calcula depois a percentagem de identidade de sequências para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa designados.
[0094] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser conduzido, p.ex., pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981),
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30/144 pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Blol. 48: 443 (1970), pelo método de pesquisa de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat ' 1. Acad Scl. USA 85: 2444 (1988), por implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) ou por inspeção visual (ver em geral, Ausubel et al. , infra).
[0095] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinação da percentagem de identidade de sequências e a similaridade de sequências é o algoritmo BLAST, que é descrito em Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). O software para a realização de análises BLAST está publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894 EUA) . Este algoritmo envolve em primeiro lugar a identificação de pares de sequência de elevada pontuação (HSPs) por identificação de pequenas palavras de comprimento W na sequência de consulta, que correspondem a ou satisfazem alguma pontuação limiar de valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência da base de dados. T é referido como o limiar de pontuação de palavra vizinha (Altschul et al., 1990). Estas correspondências de palavra de proximidade iniciais atuam como sementes para iniciação de buscas para se encontrar HSPs mais longos contendo os mesmos. As correspondências de palavras são depois prolongadas em ambas as direções ao longo de cada sequência tanto quanto
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31/144 a pontuação de alinhamento cumulativa possa ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre>0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes; sempre<0). Para sequências de aminoácidos é usada uma matriz de pontuação para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das correspondências de palavra em cada direção é interrompida quando a pontuação do alinhamento cumulativo cai de uma quantidade X a partir do seu valor máximo alcançado, a pontuação cumulativa tende para zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa ou é alcançada a extremidade de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. 0 programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequênciasde aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrõesum comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10 e a matriz de pontuação BLOSUM62 (ver Henikoff&
Henikoff, Proc. Natl. Acad Sei. USA 89: 10915 (1989)).
[0096] Adicionalmente ao cálculo da percentagem de identidade de sequências, o algoritmo BLAST realiza também uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, p.ex., Karlin & Altschul, Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridade proporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor
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32/144 probabilidade de soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade com a qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeos de teste é considerada similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação da sequência de nucleotídeos de teste com a sequência de nucleotídeos de referência for menor do que cerca de 0,1, mais preferencialmente menor do que cerca de 0,01 e, o mais preferencialmente, menor do que cerca de 0,001.
[0097] Outra indicação de que duas sequências de nucleotídeos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridam entre si sob condições estringentes. A frase hibridar especificamente com se refere à ligação, duplicação ou hibridação de uma molécula somente a uma sequência de nucleotídeos específica sob condições rigorosas quando essa sequência está presente em uma mistura complexa (p.ex., celular total) de DNA ou RNA. Se liga(m) substancialmente se refere à hibridação complementar entre um nucleotídeo sonda e um nucleotídeo alvo e abrange não correspondentes mínimas que podem ser acomodadas por redução da estringência dos meios de hibridação para se alcançar a detecção desejada da sequência de nucleotídeos alvo.
[0098] Condições de hibridação estringentes e condições de lavagem de hibridação estringentes no contexto de experiências de hibridação de polinucleotídeos tais como hibridações de Southern e Northern são dependentes da sequência e são diferentes sob diferentes parâmetros
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33/144 ambientais. As sequências mais longas hibridam especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extensivo para a hibridação de nucleotídeos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, Elsevier, Nova Iorque. Geralmente, as condições de hibridação e lavagem altamente estringentes são selecionadas para serem cerca de 5 °C menores do que ο ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a uma força iônica e pH definidos. Tipicamente, sob condições estringentes, uma sonda irá hibridar com sua subsequência alvo, mas não com outras sequências.
[0099] A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibridam com uma sonda perfeitamente correspondida. As condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridação estringentes para hibridação de polinucleotídeos complementares que têm mais do que 100 resíduos complementares em um filtro em uma transferência de Southern ou Northern é formamida a 50% com 1 mg de heparina a 42 °C, com a hibridação sendo levada a cabo durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes é NaCl a 0,15 M a 72 °C durante cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem estringentes é uma lavagem com 0,2x SSC a 65 °C durante 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição do tampão SSC). Frequentemente, uma lavagem de estringência
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34/144 elevada é precedida por uma lavagem de baixa estringência para remover sinal de fundo da sonda. Uma lavagem de estringência média exemplificativa para um dúplex, p.ex., mais do que 100 nucleotideos, é lx SSC a 45 °C durante 15 minutos. Uma lavagem de estringência baixa exemplificativa para um dúplex, por ex., mais do que 100 nucleotideos, é
4-6x SSC a 40 °C durante 15 minutos. Para sondas curtas (p.ex., cerca de 10 a 50 nucleotideos), as condições estringentes envolvem tipicamente concentrações de sal de íon de Na a menos do que cerca de 1,0 M, tipicamente concentração de íon de Na (ou outros sais) de cerca de 0,01 a 1,0 Ma pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30 °C. As condições estringentes podem ser também alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes tais como formamida. Em geral, uma razão entre sinal e ruído de 2x (ou mais elevada) do que aquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio de hibridação particular indica detecção de uma hibridação específica. Os polinucleotídeos que não hibridam entre si sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticos se as proteínas que eles codificarem forem substancialmente idênticas. Isto ocorre, p.ex., quando uma cópia de um polinucleotídeo é criada usando a degenerescência máxima de códons permitida pelo código genético.
[00100] O que se segue são exemplos de conjuntos de condições de hibridação/lavagem que podem ser usadas para clonar sequências homólogas de nucleotideos que são substancialmente idênticas às sequência de nucleotideos de referência da presente invenção: uma sequência de
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35/144 nucleotídeos de referência híbrida preferencialmente com a sequência de nucleotídeos de referência em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPCri a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 2x SSC, SDS a 0,1% a 50 °C, mais desejavelmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPCri a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50°C com lavagem em lx SSC, SDS a 0,1% a 50 °C, mais desejavelmente ainda em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPCri a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,5x SSC, SDS a 0,1% a 50 °C, preferencialmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPCri a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,lx SSC, SDS a 0,1% a 50 °C, mais preferencialmente em dodecil sulfato de sódio (SDS) a 7%, NaPCri a 0,5 M, EDTA a 1 mM a 50 °C com lavagem em 0,lx SSC, SDS a 0,1% a 65 °C.
[00101] Uma indicação de que duas proteínas são substancialmente idênticas é que um anticorpo criado contra uma proteína codificada por um primeiro polinucleotideo é imunologicamente reativo de modo cruzado com, ou se liga especificamente a, uma proteína codificada por um segundo polinucleotideo. Assim, uma proteína é tipicamente substancialmente idêntica a uma segunda proteína, por exemplo, onde as duas proteínas diferirem somente em substituições conservativas.
[00102] Sintético se refere a uma sequência de nucleotídeos compreendendo bases ou características estruturais que não estão presentes na sequência natural. Por exemplo é dito que uma sequência artificial codificando uma proteína Cry da invenção que se assemelha mais estreitamente ao conteúdo de G+C e à distribuição normal de códons de genes de plantas dicot ou monocot é sintética.
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36/144 [00103] Como usado aqui, tóxico é sinônimo de inseticida e se entende que uma proteína Cry da invenção tem um efeito negativo em uma praga de insetos por morte da praga de insetos ou por interrupção ou paragem da alimentação da praga de insetos ou causando inibição do crescimento da praga de insetos, ambas as quais podem ou não causar morte do inseto. Quando uma proteína Cry da invenção é administrada a um inseto ou um inseto em contato oral com a proteína Cry, o efeito tóxico é tipicamente a morte do inseto ou o crescimento do inseto é desacelerado ou o inseto deixa de se alimentar da fonte que torna a proteína Cry tóxica disponível para o inseto.
[00104] Transformação é um processo para introdução de um polinucleotideo heterólogo em uma célula ou organismo hospedeiro. Em particular, transformação significa a integração estável de uma molécula de DNA no genoma de um organismo de interesse.
[00105] Transformado/transgênico/recombinante se referem a um organismo hospedeiro tal como uma bactéria ou uma planta no qual um polinucleotideo heterólogo foi introduzido. 0 polinucleotideo pode ser estavelmente integrado no genoma do hospedeiro ou o polinucleotideo pode estar também presente como uma molécula extracromossômica. Uma tal molécula extracromossômica pode ser autorreplicante. Células, tecidos ou plantas transformados são entendidos como englobando não só o produto final de um processo de transformação, mas também a sua descendência transgênica. Um hospedeiro não transformado, não transgênico ou não recombinante se refere a um organismo de tipo selvagem, p.ex., uma
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37/144 bactéria ou planta, que não contém o polinucleotideo heterólogo.
[00106] Os nucleotideos são indicados aqui pelas suas bases pelas seguintes abreviaturas padrão: adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G). Os aminoácidos são do mesmo modo indicados pelas seguintes abreviaturas padrão: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D) , cisteina (Cys; C) , glutamina (Gin; Q) , ácido glutâmico (Glu; E) , glicina (Gly; G) , histidina (His; H), isoleucina (lie; 1), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K) , metionina (Met; M) , fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptofano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) e valina (Vai; V).
[00107] Esta invenção proporciona composições e métodos para controle de pragas prejudiciais de plantas de cultura e bens derivados a partir de plantas de cultura. Em particular, a invenção se relaciona com proteínas Cry que podem ser isoladas a partir de bactérias, tais como Bacillus thuringiensis, que são tóxicas para pragas de insetos e com polinucleotídeos que compreendem sequências de nucleotideos que codificam as proteínas Cry e com a preparação e uso dos polinucleotídeos e proteínas Cry para controlar pragas de insetos.
[00108] Polinucleotídeos que são fragmentos de polinucleotídeos codificantes de pró-toxinas de proteína Cry são também englobados pela invenção. Por fragmento se entende uma porção da sequência de nucleotideos codificando uma proteína Cry. Um fragmento de uma sequência de nucleotideos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína Cry, o assim chamado
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38/144 fragmento de toxina, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como sonda de hibridação ou iniciador de PCR usando métodos divulgados em baixo. Os polinucleotídeos que são fragmentos de uma sequência de nucleotídeos codificando proteína Cry compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 de nucleotídeos contíguos ou até ao número de nucleotídeos presentes em uma sequência de nucleotídeos codificando proteína Cry de comprimento total (por exemplo, 3504 nucleotídeos para SEQ ID NO: 14) dependendo do uso pretendido. Por nucleotídeos contíguos se entendem resíduos de nucleotídeos que são imediatamente adjacentes entre si. Alguns fragmentos das sequências de nucleotídeos da invenção irão codificar fragmentos de toxina que retêm a atividade biológica da proteína Cry e, consequentemente, retêm a atividade inseticida. Por retém a atividade inseticida se entende que o fragmento terá pelo menos cerca de 30%, preferencialmente pelo menos cerca de 50%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 80% da atividade inseticida da proteína Cry. Métodos para medição da atividade inseticida são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Czapla e Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252: 199206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293, e Pat. dos E.U.A. No. 5,743,477, todos os quais são aqui incorporados por referência na sua totalidade.
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39/144 [00109] Um fragmento de toxina de uma proteina Cry da invenção irá codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 e 450 aminoácidos contíguos ou até ao número total de aminoácidos presentes em uma proteína Cry de comprimento total da invenção (por exemplo, 1167 aminoácidos para SEQ ID NO: 1) . Assim, em algumas modalidades, as proteínas Cry que tiverem sido ativadas por meio de processamento proteolítico, por exemplo, por proteases preparadas a partir do intestino de um inseto, podem ser caracterizadas e os aminoácidos N-terminais ou C-terminais do fragmento de toxina ativado identificados. Em este aspecto da invenção, o perito pode determinar que, por exemplo, um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 1 pode compreender aminoácidos de cerca da posição 28, 30, 36, 41, 43, 44,
45, 47 ou 48 a cerca da posição 610, 615, 616, 622, 623, 624 ou 625 de SEQ ID NO:1 ou um fragmento de toxina de
SEQ ID NO: 2 pode compreender aminoácidos de cerca da posição 21, 23, 28, 35, 38, 46 ou 61 a cerca da posição 607, 611, 618, 625 ou 628 de SEQ ID NO: 2 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 3 pode compreender aminoácidos de cerca da posição 23, 24, 28, 30, 32, 33, 35, 36, 37 ou 40 a cerca da posição 611, 616, 617, 625, 626, 647, 653 ou 654 de SEQ ID NO: 3. Variantes de proteínas Cry produzidas por introdução ou eliminação de locais de processamento de proteases em posições apropriadas na sequência codificante para permitir, ou eliminar, a divagem proteolítica de uma proteína variante maior por proteases de insetos, plantas ou microrganismos estão também dentro do escopo da invenção. É entendido que o resultado final
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40/144 de tal manipulação é a geração de moléculas de fragmentos de toxina tendo a mesma ou diferente atividade do que a proteina Cry de pró-toxina intata.
[00110] De acordo com algumas modalidades, a invenção proporciona um polinucleotideo ou opcionalmente um polinucleotideo isolado compreendendo uma sequência de nucleotideos codificando uma proteina Cry em sua forma de pró-toxina ou um seu fragmento de toxina que é tóxico para uma praga de lepidópteros, em que a sequência de nucleotideos (a) tem pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-16 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-16; ou (b) codifica uma proteina compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3; ou (c) é uma sequência sintética de (a) ou (b) que tem códons otimizados para expressão em um organismo transgênico.
[00111] Em outras modalidades, a praga de lepidópteros é selecionada do grupo consistindo em broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda), lagarta da espiga (Helicoverpa zea) , broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsamedideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella), lagarta-rosca do oeste (Richia albicosta), lagarta do tabaco (Heliothis virescens), broca asiática do milho (Ostrinia furnacalis), traça do algodão (Helicoverpa armigera), broca riscada do
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41/144 tronco (Chilo suppressalis) , broca do entrenó rosa (Sesamia calamistis) e lagarta enroladora da folha do arroz (Cnaphalocrocis medinalis).
[00112] Em outras modalidades ainda, a sequência de nucleotídeos ou a sequência de nucleotídeos sintética compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-2 9 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-29. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos sintética compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-22 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-22.
[00113] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo da invenção compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína Cry compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3. Em algumas outras modalidades, a sequência de aminoácidos compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13.
[00114] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo da invenção codifica uma proteína Cry que é uma proteína Cryll ou CrylJ. Em outras modalidades, a proteína Cryll é uma proteína Cryllg. Em outras modalidades ainda, a proteína Cryllg compreende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5. Em outras modalidades, a proteína Cryllg é tóxica para uma praga de lepidópteros selecionada do grupo consistindo em
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42/144 broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) e broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella). Em outras modalidades ainda, a sequência sintética compreende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 18 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00115] Em algumas modalidades, o polinucleotideo da invenção codifica uma proteína CrylJ que é uma proteína CrylJa ou CrylJc. Em outras modalidades, a proteína CrylJa compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOs: 7-13 e um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 ou qualquer uma de SEQ ID NOs: 7-13. Em outras modalidades, a proteína CrylJa é tóxica para uma praga de lepidópteros selecionada do grupo consistindo em broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) , lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) , lagarta da espiga (Helicoverpa zea) , broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-dasoja (Anticarsia gemmatalis) , lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens). Em outras modalidades ainda, a sequência sintética compreende SEQ ID NO: 17 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00116] Em outras modalidades, a proteína CrylJc compreende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6. Em outras modalidades ainda, a proteína
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CrylJc é tóxica para uma praga de lepidópteros selecionada do grupo consistindo em broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta da espiga (Helicoverpa zea), broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja (Anticarsia genunatalis) , lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens). Em outras modalidades, a sequência sintética compreende, consiste essencialmente em ou consiste em SEQ ID NO: 19 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00117] Em algumas modalidades da invenção é proporcionado um gene quimérico que compreende um promotor heterólogo operacionalmente ligado a um polinucleotideo compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteina Cry tóxica para uma praga de lepidópteros, em que a sequência de nucleotideos (a) tem pelo menos 80% (p.ex., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) a pelo menos 99% (99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-16 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1416; ou (b) codifica uma proteina compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% (p.ex., 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9%) a pelo menos 99% (99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%,
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99,7%, 99,8%, 99,9%) de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3; ou (c) é uma sequência sintética de (a) ou (b) que tem códons otimizados para expressão em um organismo transgênico.
[00118] Em outras modalidades, o promotor heterólogo no gene quimérico da invenção é operacionável em múltiplas espécies bacterianas. Em outras modalidades, a espécie bacteriana é Bacillus thuringiensis ou Escherichia coli. Em outras modalidades ainda, o promotor heterólogo é um promotor de CrylAc ou sua variante. Em modalidades adicionais, o promotor de CrylAc compreende os, consiste essencialmente nos ou consiste nos nucleotídeos 12-197 de SEQ ID NO: 30 ou um seu fragmento. Em outras modalidades ainda, o promotor heterólogo é um promotor de CrylAc e o polinucleotideo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3.
[00119] Em outras modalidades, o promotor heterólogo no gene quimérico da invenção é um promotor expressável em plantas. Por exemplo, sem limitação, o promotor expressável em plantas pode ser selecionado do grupo de promotores consistindo em ubiquitina, vírus de enrolamento da folha amarela de Cestrum, TrpA do milho, OsMADS 6, histona H3 do mais, 5' UTR do gene 9 do bacteriófago T3, sacarose sintetase 1 do milho, álcool desidrogenase 1 do milho, complexo de captação de luz do milho, proteína de choque térmico do milho, mtl do mais, subunidade pequena de RuBP carboxilase da ervilha, actina do arroz, ciclofilina do arroz, manopina sintase do plasmídeo Ti,
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45/144 nopalina sintase do plasmideo Ti, chalcona isomerase de petúnia, proteina rica em glicina 1 do feijão, patatina da batata, lectina, CaMV 35S e promotor da subunidade pequena de RuBP carboxilase S-E9.
[00120] Em modalidades adicionais, a proteína codificada pelo gene quimérico é tóxica para uma ou mais pragas de lepidópteros selecionadas do grupo consistindo em broca europeia do milho (ECB; Ostrinia nubilalis), lagarta-rosca (BCW; Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho do milho (FAW; Spodoptera frugiperda) , lagarta da espiga (CEW; Helicoverpa zea), broca da cana (SCB; Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja (VBC; Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsa-medideira (SBL; Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (SWCB; Diatraea grandiosella), lagarta-rosca do oeste (WBC; Richia albicosta), lagarta do tabaco (TBW; Heliothis virescens), broca asiática do milho (ACB; Ostrinia furnacalis), traça do algodão (CBW; Helicoverpa armigera), broca riscada do tronco (SSB; Chilo suppressalis) , broca do entrenó rosa (PSB; Sesamia calamistis) ou lagarta enroladora da folha do arroz (RLF; Cnaphalocrocis medinalis).
[00121] Em modalidades adicionais, o gene quimérico compreende um polinucleotídeo que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 14 ou um seu fragmento codificante de toxina ou tem pelo menos 96% ou
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46/144 pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 15 ou um seu fragmento codificante de toxina ou tem pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 16 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00122] Em outras modalidades, o polinucleotídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-29 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-29.
[00123] Em outras modalidades ainda, o polinucleotídeo compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3.
[00124] Em outras modalidades ainda, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina.
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47/144 [00125] Em modalidades adicionais, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento de toxina.
[00126] Em modalidades ainda adicionais, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento de toxina.
[00127] Em outras modalidades, a sequência de aminoácidos compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13.
[00128] Em algumas modalidades, o gene quimérico da invenção compreende um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos sintética que tem pelo menos 80% ou pelo
menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo
menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências ao longo
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48/144 do comprimento inteiro de qualquer uma de SEQ ID NOs : 1422, em que a sequência sintética tendo códons otimizados para expressão é um organismo transgênico. Em outras modalidades, o gene quimérico da invenção compreende um polinucleotideo compreendendo uma sequência sintética de uma sequência de nucleotideos que codifica uma proteína
compreendendo uma sequência de aminoácidos que tem pelo
menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo
menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo
menos 86% ou pelo menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo
menos 89% ou pelo menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo
menos 92% ou pelo menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo
menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo
menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo
menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências ao longo do comprimento inteiro de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13, ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13, em que a sequência sintética tendo códons otimizados para expressão é um organismo transgênico. Em outras modalidades, a proteína compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13. Em modalidades adicionais, o organismo transgênico é uma bactéria transgênica ou uma planta transgênica. Em outras modalidades ainda, a bactéria transgênica é Escherichia coli ou Bacillus thuringiensis. Em outras modalidades de realização, a planta transgênica é Zea mays.
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49/144 [00129] Em algumas modalidades, o gene quimérico da invenção compreende um polinucleotideo que codifica uma proteína Cryll ou CrylJ. Em outras modalidades, a proteína Cryll é uma proteína Cryllg. Em outras modalidades, a proteína Cryllg compreende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5. Em outras modalidades ainda, a Cryllg é tóxica para a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) e broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella). Em outras modalidades, a proteína Cryllg é codificada por um polinucleotideo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em SEQ ID NO: 18 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00130] Em algumas modalidades, o gene quimérico codifica uma proteína CrylJ que é uma proteína CrylJa ou CrylJc. Em outras modalidades, a proteína CrylJa compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOs: 7-13 e um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 ou qualquer uma de SEQ ID NOs: 7-13. Em outras modalidades, a proteína CrylJa é tóxica para a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda), lagarta da espiga (Helicoverpa zea) , broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-dasoja (Anticarsia gemmatalis) , lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens). Em outras modalidades, a proteína CrylJa é
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50/144 codificada por um polinucleotídeo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em SEQ ID NO: 17 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00131] Em algumas modalidades, o gene quimérico codifica uma proteina CrylJ que é uma proteína CrylJc. Em outras modalidades, a proteína CrylJc compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6. Em outras modalidades ainda, a proteína CrylJc é tóxica para a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta da espiga (Helicoverpa zea), broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) , broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens) . Em outras modalidades, a proteína CrylJc é codificada por um polinucleotídeo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em SEQ ID NO: 19 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00132] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polinucleotídeo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que é tóxica para uma praga de lepidópteros, em que a sequência de nucleotídeos tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo
menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo
menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo menos 87% ou pelo
menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo menos 90% ou pelo
menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo menos 93% ou pelo
menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo
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51/144 menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou tem pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-22 ou um fragmento codificante de toxina de
qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-22.
[00133] Em outras modalidades, a invenção proporciona um
polinucleotideo sintético compreendendo, consistindo
essencialmente em ou consistindo em, uma sequência de
nucleotideos que codifica uma proteína que é tóxica para
uma praga de lepidópteros, em que a sequência de
nucleotideos codifica uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo
menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo
menos 86% ou pelo menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo
menos 89% ou pelo menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo
menos 92% ou pelo menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo
menos 95% ou pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo
menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo
menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou tem pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências ao longo do comprimento inteiro de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13. Em outras modalidades, o polinucleotideo sintético codifica uma proteína compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13.
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52/144 [00134] As proteínas Cry da invenção podem ser isoladas a partir de certas estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) tais como SC0532, SC0705 e SC0666 descritas aqui. Será reconhecido que as proteínas Cry da invenção podem ser também isoladas a partir de outras estirpes de Bt e que tais estirpes de Bt podem ser isoladas por técnicas padrão e testadas quanto à presença das proteínas Cry da invenção ou quanto à toxicidade para uma praga de lepidópteros da invenção . Geralmente, as estirpes de Bt podem ser isoladas a partir de qualquer amostra ambiental, incluindo solo, planta, inseto, poeira de elevação de grãos e outro material de amostragem por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Travers et al. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1263-1266; Saleh et al. (1969) Can J. Microbiol. 15: 1101-1104; DeLucca et al. (1981) Can J. Microbiol. 27: 865870, e Norris, et al. (1981) “The genera Bacillus and Sporolactobacillus“, Em Starr et al. (ed.), “The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria”, Volume II, Springer-Verlag Berlim Heidelberga; todos incorporados aqui por referência. Após isolamento, as estirpes de Bt podem ser testadas quanto à toxicidade para uma praga de lepidópteros e uma ou mais proteínas Cry englobadas pela invenção podem ser identificadas usando, por exemplo, as sequências de nucleotídeos ou aminoácidos divulgadas aqui e técnicas moleculares padrão na técnica. Portanto, em algumas modalidades, a invenção engloba uma estirpe de Bacillus thuringiensis (Bt) que produz uma proteína Cry ou uma proteína Cry recombinante compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13. Em outras modalidades, a estirpe de Bt é selecionada do grupo consistindo em SC0532, SC0705 e SC0666. Em modalidades ainda adicionais, a proteína Cry ou proteína Cry recombinante compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID
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NOs : 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13.
[00135] De acordo com algumas modalidades, a invenção proporciona uma proteina Cry ou uma proteina Cry opcionalmente isolada ou uma proteína Cry recombinante que é tóxica para uma praga de lepidópteros, em que a proteína Cry, proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante compreende, consiste essencialmente em ou consiste em (a) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% de identidade de sequências a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-6 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-6; ou (b) uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência de nucleotideos que tem pelo menos 80% de identidade de sequências a pelo menos 99% de identidade de sequências com uma sequência de nucleotideos representada por qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-19 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-19.
[00136] Em outras modalidades, a proteína Cry ou proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-6 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-6. Em outras modalidades ainda, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou
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54/144 pelo menos 99, 9% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina.
[00137] Em modalidades adicionais, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou um seu fragmento de toxina.
[00138] Em modalidades ainda adicionais, a sequência de aminoácidos tem pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento de toxina.
[00139] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácidos compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um seu fragmento de toxina. Em outras modalidades, a sequência de aminoácidos é codificada por uma sequência de nucleotídeos compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-2 9 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-29.
[00140] Em outras modalidades, a proteína Cry ou proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante da invenção é tóxica para uma praga de lepidópteros selecionada do grupo consistindo em broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera
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55/144 frugiperda), lagarta da espiga (Helicoverpa zea), broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja {Anticarsia gemmatalis) , lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) , broca do milho do sudoeste {Diatraea grandiosella), lagarta-rosca do oeste (Richia albicosta), lagarta do tabaco {Heliothis virescens), broca asiática do milho {Ostrinia furnacalis), traça do algodão (Heli coverpa armigera), broca riscada do tronco {Chilo suppressalis), broca do entrenó rosa {Sesamia calamistis) ou lagarta enroladora da folha do arroz {Cnaphalocrocis medinalis).
[00141] Em outras modalidades, a proteina Cry, a proteina Cry opcionalmente isolada ou proteina Cry recombinante compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 80% a pelo menos 99% de identidade de sequências com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13.
[00142] Ainda em outras modalidades, a sequência de aminoácidos da proteina Cry, proteina Cry opcionalmente isolada ou proteina Cry recombinante tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8%
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56/144 ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina.
[00143] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 2 ou um seu fragmento de toxina.
[00144] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 3 ou um seu fragmento de toxina.
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57/144 [00145] Ainda em outras modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 4 ou um seu fragmento de toxina.
[00146] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 5 ou um seu fragmento de toxina.
[00147] Ainda em outras modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
Petição 870190061644, de 02/07/2019, pág. 76/181
58/144 isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 6 ou um seu fragmento de toxina.
[00148] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 7 ou um seu fragmento de toxina.
[00149] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou
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59/144 pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 8 ou um seu fragmento de toxina.
[00150] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ
ID NO: 9 ou um seu fragmento de toxina.
[00151] Ainda em outras modalidades, a sequência de
aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente
isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80%
ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
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60/144
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99 ', 1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento de toxina.
[00152] Ainda em outras modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento de toxina.
[00153] Ainda em outras modalidades, a sequência de aminoácidos da proteína Cry, proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
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61/144 menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99,2% ou pelo menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento de toxina.
[00154] Ainda em outras modalidades, a sequência de aminoácidos da proteina Cry, proteina Cry opcionalmente isolada ou proteina Cry recombinante tem pelo menos 80% ou pelo menos 81% ou pelo menos 82% ou pelo menos 83% ou pelo menos 84% ou pelo menos 85% ou pelo menos 86% ou pelo
menos 87% ou pelo menos 88% ou pelo menos 89% ou pelo
menos 90% ou pelo menos 91% ou pelo menos 92% ou pelo
menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo
menos 96% ou pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo
menos 99% ou pelo menos 99,1% ou pelo menos 99, 2% ou pelo
menos 99,3% ou pelo menos 99,4% ou pelo menos 99,5% ou pelo menos 99,6% ou pelo menos 99,7% ou pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% de identidade de sequências com SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento de toxina.
[00155] Ainda em outras modalidades, a proteina Cry, proteina Cry opcionalmente isolada ou proteina Cry recombinante compreende, consiste essencialmente em ou consiste em uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 4-13 ou um seu fragmento de toxina. Em outras modalidades, a proteina Cry recombinante é codificada por uma sequência de nucleotideos que compreende, consiste essencialmente em ou consiste em qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-2 9 ou um seu fragmento codificante de toxina.
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62/144 [00156] Em algumas modalidades, a proteína Cry, proteína Cry opcionalmente isolada ou proteína Cry recombinante da invenção é uma proteína Cryll ou CrylJ. Em outras modalidades, a proteína Cryll é uma proteína Cryllg. Em outras modalidades, a proteína Cryllg compreende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5. Em outras modalidades ainda, a Cryllg é tóxica para a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) , broca da cana (Diatraea saccharalis) , lagartafalsa-medideira (Chrysodeixis includens) e broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella). Em outras modalidades, a proteína Cryllg é codificada por um polinucleotideo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em SEQ ID NO: 18 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00157] Em algumas modalidades, a proteína CrylJ, proteína CrylJ opcionalmente isolada ou proteína CrylJ recombinante é uma proteína CrylJa ou CrylJc. Em outras modalidades, a proteína CrylJa compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOs: 7-13 e um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 ou qualquer uma de SEQ ID NOs: 7-
13. Em outras modalidades, a proteína CrylJa é tóxica para a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) , lagartado-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) , lagarta da espiga (Helicoverpa zea), broca da cana (Diatraea saccharalis) , lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis) , lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens). Em outras modalidades, a
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63/144 proteína CrylJa é codificada por um polinucleotídeo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em SEQ ID NO: 17 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00158] Em algumas modalidades, a proteína CrylJ, proteína CrylJ opcionalmente isolada ou proteína CrylJ recombinante que é uma proteína CrylJc. Em outras modalidades, a proteína CrylJc compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6. Em outras modalidades ainda, a proteína CrylJc é tóxica para a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta da espiga (Helicoverpa zea), broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens). Em outras modalidades, a proteína CrylJc é codificada por um polinucleotídeo sintético compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em SEQ ID NO: 19 ou um seu fragmento codificante de toxina.
[00159] Anticorpos criados em resposta a desafio imunitário por uma proteína Cry BT2CrylJ, BT25CrylI e BT53CrylJ ou proteínas Cry relacionadas nativas ou mutantes são também englobados pela invenção. Tais anticorpos podem ser produzidos usando técnicas imunológicas padrão para produção de antissoros policlonais e, se desejado, imortalização das células produtoras de anticorpos do hospedeiro imunizado para fontes de produção de anticorpos monoclonais. Técnicas para produção de anticorpos para qualquer substância de interesse são bem conhecidas,
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p.ex., como em Harlow e Lane (1988. Antibodies a laboratory manual, pp. 726. Cold Spring Harbor Laboratory) e como em Coding (Monoclonal Antibodies: Principles & practice, 1986. Academic Press, Inc., Orlando, FL), ambos os quais são incorporados aqui por referência. A presente invenção engloba proteínas inseticidas que reagem de modo cruzada com anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais, criados contra uma ou mais das proteínas Cry inseticidas da presente invenção.
[00160] Os anticorpos produzidos na invenção são também úteis em imunoensaios para determinação da quantidade ou presença de uma proteina Cry BT2CrylJ, BT25CrylI e BT53CrylJ ou relacionada nativa ou mutante em uma amostra biológica. Tais ensaios são também úteis na produção com qualidade controlada de composições contendo uma ou mais das proteínas Cry da invenção ou proteínas Cry relacionadas. Adicionalmente, os anticorpos podem ser usados para avaliar a eficácia da produção recombinante de uma ou mais das proteínas Cry da invenção ou uma proteína relacionada, bem como para rastreamento de bibliotecas de expressão quanto à presença de uma sequência de nucleotideos codificando uma ou mais das proteínas Cry da invenção ou sequências codificantes de proteínas relacionadas. Os anticorpos são também úteis como ligandos de afinidade para purificação ou isolamento de qualquer uma ou mais das proteínas da invenção e proteínas relacionadas. As proteínas Cry da invenção e as proteínas contendo epítopos antigênicos relacionados podem ser obtidas por sobre-expressão de comprimentos totais ou parciais de uma sequência codificando toda uma
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65/144 ou parte de uma proteína Cry da invenção ou uma proteína relacionada em uma célula hospedeira preferencial.
[00161] É reconhecido que as sequências de DNA que codificam uma proteína Cry nativa da invenção podem ser alteradas por vários métodos e que essas alterações podem resultar em sequências de DNA codificando proteínas com sequências de aminoácidos diferentes daquelas codificadas por uma proteína Cry da invenção. Uma proteína Cry pode ser alterada de vários modos para preparar uma proteína Cry mutante incluindo substituições de aminoácidos, deleções, truncações e inserções de um ou mais aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3, ou um fragmento de toxina de SEQ ID NOs: 1-3, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de
65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85,
cerca de 90, cerca de 100, cerca de 105, cerca de 110,
cerca de 115, cerca de 120, cerca de 125, cerca de 130,
cerca de 135, cerca de 140, cerca de 145, cerca de 150,
cerca de 155 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, as variantes de sequências de aminoácidos de uma proteína Cry nativa podem ser preparadas por mutações em um polinucleotideo que codifica a proteína. Isto pode ser também alcançado por uma de várias formas de mutagênese ou em evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na sequência de aminoácidos não
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66/144 afetarão substancialmente a função da proteina. Tais variantes possuirão uma atividade inseticida desejada. Em algumas modalidades da invenção, as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NOs: 14-16 são alteradas para introduzirem substituições de aminoácidos na proteína codificada resultando em uma proteína mutante tendo essencialmente as mesmas propriedades inseticidas que a proteína nativa. Em outras modalidades, a proteína mutante resultante é codificada por um polinucleotideo mutante sintético compreendendo uma sequência de nucleotídeos representada por qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-29 ou um fragmento codificante de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-2 9. Em outras modalidades, as proteínas mutantes compreendem, consistem essencialmente em ou consistem em uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma de SEQ ID NOs: 4-13 ou um fragmento de toxina de qualquer uma de SEQ ID NOs: 4-13.
[00162] Em outras modalidades, a atividade inseticida de uma proteína Cry nativa da invenção pode ser modulada por inserção, deleção ou substituição de aminoácidos na sequência de aminoácidos da proteína Cry nativa resultando em uma proteína Cry modificada da invenção. Por exemplo, a atividade inseticida de uma proteína Cry é modulada onde a proteína Cry modificada é tóxica para uma gama mais ampla ou mais estreita de insetos em comparação com a gama de insetos que é afetada por uma proteína Cry nativa. Pode ser desejável criar uma proteína Cry modificada com toxicidade para uma gama mais ampla de pragas de insetos do que a proteína Cry nativa onde múltiplas pragas se alimentam de uma única planta de cultura de interesse,
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67/144 enquanto uma proteína Cry modificada com toxicidade para uma gama mais estreita de insetos pode ser desejável onde, por exemplo, uma praga de insetos particular contra a qual uma proteína Cry nativa é ativa não se alimenta da planta de cultura na qual a proteína Cry modificada será expressa. Esta redução na gama de pragas alvo pode ajudar a mitigar o desenvolvimento de resistência aos insetos em múltiplos ambientes de sistemas de cultura, por exemplo, onde milho transgênico, soja transgênica e algodão transgênico são cultivados em proximidade estreita entre si.
[00163] Em algumas outras modalidades, a atividade inseticida de uma proteína Cry nativa pode ser modulada por substituição de pelo menos um aminoácido na alfa-hélice 3, alfa-hélice 4, alfa-hélice 5 ou alfa-hélice 6 do domínio I da sequência de aminoácidos de Cry nativa por um aminoácido diferente daquele em essa posição na proteína Cry nativa. Em outras modalidades, a proteína Cry nativa é uma proteína CrylJ. Em outras modalidades, a proteína CrylJ é uma proteína CrylJa ou CrylJc. Em outras modalidades ainda, os aminoácidos na alfa-hélice 3 de uma proteína CrylJ nativa correspondendo às posições de aminoácidos 97, 105, 108, 110, 118 e 119 de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3 estão substituídos por um aminoácido diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteína CrylJ nativa resultando em uma proteína CrylJ modificada. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos na alfa-hélice 3 de uma proteína CrylJa resultam em uma proteína CrylJa modificada que é tóxica em uma gama mais estreita de insetos do que
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68/144 uma proteína CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteína CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 e a CrylJa modificada tem uma substituição A97T, S105N, L108I, G110A, K118S e T119D na alfa-hélice 3. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 7 ou um seu fragmento de toxina. Em outras modalidades ainda, a CrylJa tem atividade contra a lagarta-falsa-medideira e lagarta do tabaco, mas pouca ou nenhuma atividade contra a broca europeia do milho, broca da cana, broca do milho do sudoeste, lagarta-rosca, lagarta-do-cartucho do milho, lagarta da espiga ou lagarta-da-soja em comparação com uma proteína CrylJa nativa.
[00164] Em algumas modalidades, os aminoácidos na alfa-hélice 4 de uma proteína CrylJa nativa correspondendo às posições de aminoácidos 123, 126, 130, 131, 136, 138, 139, 149 e 150 de SEQ ID NO: 1 estão substituídos por um aminoácido diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteína CrylJa nativa resultando em uma proteína CrylJa modificada. Em outras modalidades, as substituições de aminoácidos na alfa-hélice 4 da proteína CrylJa resultam em uma proteína CrylJa modificada que é tóxica em uma gama mais estreita de insetos do que uma proteína CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteína CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina e a CrylJa modificada tem uma substituição T123E, R126K, T130I, E131D, I136L, A138G, Q139L, V149I e V150I na alfa-hélice 4. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 8 ou um seu fragmento de toxina. Em outras modalidades ainda, a CrylJa tem atividade contra a lagarta-falsa-medideira, lagarta
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69/144 da-soja e lagarta do tabaco, mas pouca ou nenhuma atividade contra a broca europeia do milho, broca da cana, broca do milho do sudoeste, lagarta-rosca, lagarta-docartucho do milho e lagarta da espiga em comparação com uma proteína CrylJa nativa.
[00165] Em algumas modalidades, os aminoácidos na alfa-hélice 5/6 de uma proteína CrylJa nativa correspondendo às posições de aminoácidos 158, 161, 176, 186, 196, 197, 198 e 200 de SEQ ID NO: 1 estão substituídos por um aminoácido diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteína CrylJa nativa resultando em uma proteína CrylJa modificada. Em outras modalidades, as substituições de aminoácidos na alfa-hélice 5/6 da proteína CrylJa resultam em uma proteína CrylJa modificada tendo essencialmente o mesmo espectro de atividade inseticida que uma CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteína CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina e a CrylJa modificada tem uma substituição L158S; T161V; V176I; T186K; V196I; N197R; R198E e G200H na alfa-hélice 5/6. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 9 ou um seu fragmento de toxina.
[00166] Em algumas modalidades, os aminoácidos na alfa-hélice 3 e alfa-hélice 4 de uma proteína CrylJa nativa correspondendo às posições de aminoácidos 97, 105, 108, 110, 118, 119, 123, 126, 130, 131, 136, 138, 139, 149 e 150 de SEQ ID NO: 1 estão substituídos por um aminoácido diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteína CrylJa nativa resultando em uma proteína CrylJa modificada. Em algumas modalidades, as
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70/144 substituições de aminoácidos na alfa-hélice 3 e alfahélice 4 da proteína CrylJa resultam em uma proteína CrylJa modificada que é tóxica em uma gama mais estreita de insetos do que uma proteína CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteína CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina e a CrylJa modificada tem uma substituição A97T, S105N, L108I, G110A, K118S, T119D, T123E, R126K, T130I, E131D, I136L, A138G, Q139L, V149I e V150I na alfa-hélice 3 e alfa-hélice 4. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 10 ou um seu fragmento de toxina. Em outras modalidades ainda, a CrylJ tem atividade nula ou reduzida contra a broca da cana, FAW e CEW e essencialmente a mesma atividade contra a broca europeia do milho, broca do milho do sudoeste, lagarta-rosca, lagarta-falsa-medideira, lagarta-da-soja e lagarta do tabaco em comparação com uma proteína CrylJa nativa.
[00167] Em algumas modalidades, os aminoácidos na alfa-hélice 4 e alfa-hélice 5/6 de uma proteína CrylJa nativa correspondendo às posições de aminoácidos 123, 126, 130, 131, 136, 138, 139, 149, 150, 158, 161, 176, 186, 196, 197, 198 e 200 de SEQ ID NO: 1 estão substituídos por um aminoácido diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteína CrylJa nativa resultando em uma proteína CrylJa modificada. Em outras modalidades, as substituições de aminoácidos na alfa-hélice 4 e alfahélice 5/6 da proteína CrylJa resultam em uma proteína CrylJa modificada que é tóxica para uma gama mais estreita de insetos do que uma proteína CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteína CrylJa modificada é ativa contra
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71/144 pragas de insetos na Familia Noctuidae, mas não ativa contra praga de insetos na Família Crambidae. Em outras modalidades, a proteína CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina e a CrylJa modificada tem uma substituição T123E, R126K, T130I, E131D, I136L, A138G, Q139L, V149I, V150I, L158S; T161V; V176I; T186K; V196I; N197R; R198E e G200H na alfa-hélice 4 e alfa-hélice 5/6. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 11 ou um seu fragmento de toxina. Em outras modalidades ainda, a proteína CrylJa modificada não tem atividade contra os membros da Família Crambidae broca europeia do milho, broca da cana e SWCB. Em outras modalidades, a proteína CrylJa modificada tem atividade contra os membros de Noctuidae lagarta-rosca, lagarta-docartucho do milho, lagarta da espiga, lagarta-falsamedideira, lagarta-da-soja e lagarta do tabaco. Em outras modalidades ainda, a proteína CrylJa modificada tem atividade reduzida contra a lagarta-rosca, lagarta-docartucho do milho e lagarta da espiga em comparação com a proteína CrylJa nativa. Em outras modalidades ainda, a proteína CrylJa modificada não tem atividade contra a broca europeia do milho, broca da cana e broca do milho do sudoeste tem atividade contra a lagarta-rosca, lagartado-cartucho do milho, lagarta da espiga, lagarta-falsamedideira, lagarta-da-soja e lagarta do tabaco.
[00168] Em algumas modalidades, os aminoácidos na alfahélice 3 e alfa-hélice 5/6 de uma proteína CrylJa nativa correspondendo às posições de aminoácidos 97, 105, 108, 110, 118, 119, 158, 161, 176, 186, 196, 197, 198 e 200 de SEQ ID NO: 1 estão substituídos por um aminoácido
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72/144 diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteina CrylJa nativa resultando em uma proteina CrylJa modificada. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos na alfa-hélice 3 e alfahélice 5/6 da proteina CrylJa resultam em uma proteina CrylJa modificada sem atividade inseticida em comparação com a proteina CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteina CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina e a CrylJa modificada tem uma substituição A97T, S105N, L108I, G110A, K118S, T119D,
L158S; T161V; V176I; T186K; V196I; N197R; R198E e G200H na alfa-hélice 3 e alfa-hélice 5/6. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 12 ou um seu fragmento de toxina.
[00169] Em algumas modalidades, os aminoácidos na alfa-hélice 3, alfa-hélice 4 e alfa-hélice 5/6 de uma proteina CrylJa nativa correspondendo às posições de aminoácidos 97, 105, 108, 110, 118, 119, 123, 126, 130, 131, 136, 138, 139, 149, 150, 158, 161, 176, 186, 196, 197, 198 e 200 de SEQ ID NO: 1 estão substituídos por um aminoácido diferente do aminoácido que está presente em estas posições na proteina CrylJa nativa resultando em uma proteina CrylJa modificada. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos na alfa-hélice 3, alfa-hélice 4 e alfa-hélice 5/6 da proteina CrylJa resultam em uma proteina CrylJa modificada com a mesma atividade inseticida que uma proteina CrylJa nativa. Em outras modalidades, a proteina CrylJa nativa compreende SEQ ID NO: 1 ou um seu fragmento de toxina e a CrylJa modificada tem uma substituição A97T, S105N, L108I, G110A, K118S, T119D, T123E, R126K, T130I,
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E131D, I136L, A138G, Q139L, V149I, V150I, L158S; T161V; V176I; T186K; V196I; N197R; R198E e G200H na alfa-hélice 3, alfa-hélice 4 e alfa-hélice 5/6. Em outras modalidades ainda, a CrylJa modificada compreende SEQ ID NO: 13 ou um seu fragmento de toxina.
[00170] É entendido que a capacidade de uma proteina inseticida de conferir atividade inseticida pode ser melhorada pelo uso de tais técnicas nas composições desta invenção. Por exemplo se pode expressar uma proteína Cry em células hospedeiras que exibem elevadas taxas de incorporação incorreta de bases durante a replicação do DNA, tal como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após propagação em tais estirpes se pode isolar o DNA (por exemplo por preparação de DNA de plasmídeo ou por amplificação por PCR e clonagem do fragmento de PCR resultante em um vetor), cultivar as mutações da proteína Cry em uma estirpe não mutagênica e identificar os genes mutados com atividade inseticida, por exemplo por realização de um ensaio para testar quanto à atividade inseticida. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de alimentação. Ver, por exemplo Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290-293. Tais ensaios podem incluir contato de plantas com uma ou mais pragas e a determinação da capacidade da planta de sobreviver ou causar a morte das pragas. Exemplos de mutações que resultam em toxicidade aumentada são encontrados em Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 775806.
[00171] Alternativamente, alterações podem ser feitas a uma sequência de aminoácidos da invenção no terminal amino ou
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74/144 carbóxi sem afetar substancialmente a atividade. Isto pode incluir inserções, deleções ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações por PCR que alteram ou prolongam a sequência codificante da proteina em virtude da inclusão de sequências codificantes de aminoácidos nos oligonucleotideos usados na amplificação por PCR. Alternativamente, as sequências de proteina adicionadas podem incluir sequências codificantes de proteínas inteiras, tais como aquelas comumente usadas na técnica para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são frequentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática ou epitopo de forma a
facilitar a purificação das proteínas. , detecção das
proteínas ou outros usos experimentais conhecidos na
técnica, (3) visar secreção ou tradução de uma proteína
para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias Gram-negativas ou o retículo endoplasmático das células eucarióticas, o último dos quais resulta frequentemente em glicosilação da proteína.
[00172] Uma proteína Cry da invenção pode ser também mutada para introduzir um epitopo para gerar anticorpos que reconhecem a proteína mutada. Portanto, em algumas modalidades, a invenção proporciona uma proteína Cry mutada, em que uma substituição de aminoácido em uma proteína Cry nativa produz uma proteína Cry mutante tendo uma região antigênica que permite que a proteína Cry mutante seja distinguida da proteína Cry nativa em um ensaio de detecção de proteínas.
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75/144 [00173] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um método de preparação de um anticorpo que reconhece diferencialmente uma proteína Cry mutada da proteína Cry nativa a partir da qual a proteína Cry mutada é derivada, compreendendo o método os passos de substituição de aminoácidos em uma alça antigênica de uma proteína Cry nativa e criação de anticorpos que reconhecem especificamente a alça antigênica mutada na proteína Cry mutada e não reconhecem a proteína Cry nativa. Em uma modalidade, a alça antigênica é identificada em regiões não conservadas no exterior do domínio I da proteína Cry nativa. Em outra modalidade, a alça antigênica não é uma alça envolvida no reconhecimento de receptores do intestino dos insetos da proteína Cry ou envolvida na ativação por proteases da proteína Cry.
[00174] As sequências de nucleotideos e aminoácidos variantes da invenção englobam também sequências derivadas a partir de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tais como embaralhamento de DNA. Com um tal procedimento, uma ou mais regiões codificantes de proteínas tóxicas diferentes podem ser usadas para criar uma nova proteína tóxica possuindo as propriedades desejadas. Deste modo, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de sequências relacionadas compreendendo regiões de sequências que têm identidade de sequências substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, os motivos de sequências codificando um domínio de interesse podem ser misturados entre um gene pesticida da invenção e outros
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76/144 genes pesticidas conhecidos para se obter um novo gene codificando uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal como uma atividade inseticida aumentada. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291 e Pat. dos E.U.A. Nos. 5,605,793 e 5,837,458.
[00175] A troca ou embaralhamento de domínios é outro mecanismo para geração de proteínas Cry alteradas da invenção. Os domínios podem ser trocados entre as proteínas Cry, resultando em proteínas tóxicas híbridas ou quiméricas com atividade pesticida ou espectro alvo melhorado. Métodos para geração de proteínas recombinantes e teste das mesmas quanto à atividade pesticida são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67: 5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 20923-20930; Rang et al. 91999 Appl. Environ. Microbiol. 65: 2918-2925). Em algumas modalidades, a invenção proporciona proteínas Cry híbridas compreendendo, em um terminal C, aminoácidos de uma primeira proteína Cry da invenção e, em um terminal N, aminoácidos de uma segunda proteína Cry diferente da primeira proteína Cry da invenção. Em outras modalidades, a invenção proporciona proteínas Cry híbridas
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77/144 compreendendo, em um terminal N, aminoácidos de uma proteina Cry da invenção e, em um terminal C, aminoácidos de uma segunda proteina Cry diferente da primeira proteina Cry da invenção.
[00176] Quando uma sequência de polinucleotideos heteróloga codificando uma proteina Cry englobada pela invenção é introduzida em uma planta, o polinucleotídeo introduzido é estavelmente integrado no genoma da planta agora transgênica. Assim, de acordo com a invenção, a proteina Cry codificada pode ser mutada in situ por edição de DNA visada usando várias técnicas de edição do genoma tais como nucleases de dedos de zinco (ZNFs), nucleases efetoras tipo ativadores da transcrição (TALENS), meganucleases e Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) (Pat. dos E.U.A. No. 8,697,359; Ran et al., incorporada por referência). 0 sistema CRISPR pode ser usado para introduzir modificações de nucleotideos especificas na sequência alvo. Originalmente descoberto em bactérias, onde várias cascatas CRISPR diferentes funcionam como sistemas imunitários inatos e mecanismos de defesa natural, o sistema CRISPR-Cas9 manipulado pode ser programado para visar trechos específicos do código genético e para fazer cortes em localizações precisas. Ao longo dos últimos anos, aquelas capacidades foram aproveitadas e usadas como ferramentas de edição do genoma, permitindo que os investigadores modifiquem permanentemente genes em células de plantas.
[00177] Assim, a invenção engloba um método para geração de um polinucleotídeo mutante codificando uma proteina Cry
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78/144 modificada em que o referido método compreende modificação de um genoma de planta compreendendo um polinucleotideo codificando uma proteína Cry usando CRISPR. 0 método envolve direcionamento de Cas9 ao lócus genômico específico, em este caso um polinucleotídeo codificando proteína Cry, através de uma sequência guia de 2 0 nt do RNA guia único. Uma Ferramenta de Conceção CRISPR online pode identificar locais alvo adequados (world wide web em tools.genome-engineering.org. Ran et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system nature protocols, VOL. 8 NO. 11, 2281-2308, 2013). As plantas alvo para os métodos de mutagênese/edição do genoma de acordo com a invenção são quaisquer plantas monocot ou dicot nas quais um polinucleotídeo codificando proteína Cry da invenção foi introduzido.
[00178] Em uma modalidade exemplificativa, a atividade de uma proteína CrylJ pode ser modulada por mutação de um gene crylJ, por exemplo um gene codificando BT2CrylJa (SEQ ID NO: 1) ou BT53CrylJ (SEQ ID NO: 3), compreendido em um genoma de mais transgênico por manipulação de enzimas de restrição de DNA recombinantes por fusão de uma nuclease, por exemplo Fokl, com uma estrutura que se liga a um local no gene crylJ para preparar um corte de fita dupla dentro do gene crylJ e substitui por um polinucleotídeo manipulado que compreende as mutações de interesse. Fokl é uma endonuclease de restrição tipo IIS bacteriana consistindo em um domínio de ligação de DNA N-terminal, que pode ser forçada a se ligar a sequências de DNA específicas no genoma, e um domínio de divagem de DNA não específico no terminal C. Plantas expressando a
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79/144 proteína CrylJ mutadas com atividade modulada podem ser selecionadas usando bioensaios de insetos como divulgado aqui .
[00179] Em algumas modalidades, a invenção proporciona um vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo, um cassete de expressão ou um gene quimérico da invenção. Em outras modalidades, o vetor é adicionalmente definido como um plasmídeo, cosmídeo, fagemídeo, cromossomo artificial, fago ou vetor viral. Certos vetores compreendendo um ou mais cassetes de expressão para uso em transformação de plantas e outros organismos são bem conhecidos na técnica.
[00180] Assim, algumas modalidades da invenção estão dirigidas a cassetes de expressão concebidos para expressarem os polinucleotídeos codificando proteína Cry da invenção. Como usado aqui, cassete de expressão significa um polinucleotídeo tendo pelo menos uma sequência de controle operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Deste modo, por exemplo, promotores de plantas operacionalmente ligados às sequências de nucleotídeos a serem expressas são proporcionados em cassetes de expressão para expressão em uma planta, parte de planta ou célula de planta.
[00181] Um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um dos seus componentes é heterólogo no que diz respeito a um outro dos seus outros componentes. Um cassete de expressão pode ser também um que ocorra naturalmente, mas que tenha sido obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, no entanto, o cassete de expressão é
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80/144 heterólogo no que diz respeito ao hospedeiro, i.e., a sequência de nucleotideos particular do cassete de expressão não ocorre naturalmente na célula hospedeira e tem de ter ido introduzida na célula hospedeira ou um antepassado da célula hospedeira por um evento de transformação.
[00182] Adicionalmente aos promotores operacionalmente ligados às sequências de nucleotideos da invenção, um cassete de expressão desta invenção pode também incluir outras sequências reguladoras. Como usadas aqui, sequências reguladoras significam sequências de nucleotideos localizadas a montante (sequências não codificantes 5'), dentro ou a jusante (sequências não codificantes 3') de uma sequência codificante e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência codificante associada. As sequências reguladoras incluem, mas não estão limitadas a, intensificadores, introns, sequências lider da tradução, sinais de terminação e sequências de sinal de poliadenilação.
[00183] Em algumas modalidades, um cassete de expressão da invenção pode também incluir polinucleotideos que codificam outros traços desejados adicionalmente às proteínas Cry da invenção. Tais cassetes de expressão compreendendo os traços empilhados podem ser usados para criar plantas, partes de plantas ou células de plantas tendo um fenótipo desejado com os traços empilhados (i.e., empilhamento molecular). Tais combinações empilhadas em plantas podem também ser criadas por outros métodos incluindo, mas não se limitando a, cruzamento de plantas
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81/144 por qualquer metodologia convencional. Se empilhadas por transformação genética das plantas, as sequências de nucleotideos podem ser combinadas em qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou mais traços desejados pode ser usada como o alvo para introduzir traços adicionais por transformação subsequente. Sequências de nucleotideos adicionais podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de cotransformação com uma sequência de nucleotideos, polinucleotideo, construto de polinucleotideo ou composição desta invenção, proporcionados por qualquer combinação de cassetes de expressão. Por exemplo, se duas sequências de nucleotideos forem introduzidas, elas podem ser incorporadas em cassetes separados (trans) ou podem ser incorporadas no mesmo cassete (cis). A expressão de polinucleotídeos pode ser conduzida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. É adicionalmente reconhecido que os polinucleotídeos podem ser empilhados em uma localização genômica desejada usando um sistema de recombinação sítioespecífico. Ver, p.ex., Publicações de Pedidos Internacionais de Patentes Nos. WO 99/25821; WO 99/25854; WO 99/25840; WO 99/25855 e WO 99/25853.
[00184] 0 cassete de expressão pode também incluir uma sequência codificante adicional para um ou mais polipeptídeos ou moléculas de RNA de fita dupla (dsRNA) de interesse para traços agronômicos que beneficiam maioritariamente uma empresa de sementes, produtor ou processador de grãos. Um polipeptídeo de interesse pode ser qualquer polipeptídeo codificado por uma sequência de
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82/144 nucleotídeos de interesse. Exemplos não limitantes de polipeptideos de interesse que são adequados para produção em plantas incluem aqueles resultando em traços agronomicamente importantes tais como resistência a herbicidas (também por vezes referida como tolerância a herbicidas), resistência a virus, resistência a patógenos bacterianos, resistência a insetos, resistência a nematódeos ou resistência a fungos. Ver, p.ex., Patentes dos E.U.A. Nos. 5,569,823; 5,304,730; 5,495,071; 6,329,504; e 6,337,431. O polipeptideo pode ser também um que aumente o vigor ou rendimento da planta (incluindo traços que permitam que uma planta cresça a diferentes temperaturas, condições de solo e niveis de luz solar e precipitação) ou um que permita a identificação de uma planta exibindo um traço de interesse (p.ex., um marcador selecionável, cor do revestimento da semente, etc.). Vários polipeptideos de interesse, bem como métodos para
introdução destes polipeptideos em uma planta, são
descritos, por exemplo, nas Patentes dos EUA Nos .
4,761,373; 4,769,061; 4,810,648; 4, 940,835; 4, 975, 374;
5,013,659; 5,162,602; 5, 276, 268; 5, 304,730; 5, 495, 071;
5,554,798; 5,561,236; 5, 569, 823; 5, 767,366; 5, 879, 903,
5, 928, 937; 6,084,155; 6, 329, 504 e 6,337,431; bem como
Publicação de Patente dos EUA No. 2001/0016956. Ver
também, na World Wide Web em
lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/.
[00185] Polinucleotídeos conferindo resistência/tolerância a um herbicida que inibe o ponto de cultura ou meristema, tal como uma imidazalinona ou uma sulfonilureia, podem ser também adequados em algumas modalidades da invenção.
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Polinucleotideos exemplificativos em esta categoria codificam enzimas ALS e AHAS mutantes como descrito, p.ex., nas Patentes dos E.U.A. Nos. 5,767,366 e 5,928,937. As Patentes dos E.U.A. Nos. 4,761,373 e 5,013,659 estão dirigidas a plantas resistentes a vários herbicidas de imidazalinona ou sulfonamida. A Patente dos E.U.A. No. 4,975,374 se relaciona com células de plantas e plantas contendo um polinucleotideo codificando uma glutamina sintetase (GS) mutante resistente à inibição por herbicidas que são conhecidos por inibirem a GS, p.ex., fosfinotricina e metionina sulfoximina. A Patente dos E.U.A. No. 5,162,602 divulga plantas resistentes à inibição pelos herbicidas ciclo-hexanodiona e ácido ariloxifenóxipropanoico. A resistência é conferida por uma acetilcoenzima A carboxilase (ACCase) alterada.
[00186] Polipeptídeos codificados por sequências de nucleotideos conferindo resistência ao glifosato são também adequados para a invenção. Ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 4,940,835 e Patente dos E.U.A. No. 4,769,061. A Patente dos E.U.A. No. 5,554,798 divulga plantas de mais transgênicas resistentes ao glifosato, resistência essa que é conferida por um gene da 5-enolpiruvil-3fosfochiquimato (EPSP) sintase alterado.
[00187] Polinucleotideos codificando resistência a compostos de fosfono tais como glufosinato de amônio ou fosfinotricina e ácidos piridinóxi ou fenoxipropiônicos e ciclo-hexonas são também adequados. Ver, Pedido de Patente Européia No. 0 242 24 6. Ver também, Patentes U.S. No. 5, 879, 903, 5, 276, 268 e 5, 561,236.
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84/144 [00188] Outros polinucleotídeos adequados incluem aqueles codificando resistência a herbicidas que inibem a fotossíntese, tais como uma triazina e uma benzonitrila (nitrilase). Ver, Patente dos E.U.A. No. 4,810,648. Polinucleotídeos adequados adicionais codificando resistência a herbicidas incluem aqueles codificando resistência ao ácido 2,2-dicloropropiônico, setoxidim, haloxifope, herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilureia, herbicidas de triazolpirimidina, herbicidas de s-triazina e bromoxinil. Também adequadas são polinucleotídeos conferindo resistência a uma enzima protox ou que proporcionam resistência intensificada a doenças de plantas; tolerância intensificada a condições ambientais adversas (estresse abiótico) incluindo, mas não se limitando a seca, frio excessivo, calor excessivo ou salinidade do solo excessiva ou acidez ou alcalinidade extrema; e alterações na arquitetura ou desenvolvimento de plantas, incluindo mudanças no tempo de desenvolvimento. Ver, p.ex., Publicação de Patente dos E.U.A. No. 2001/0016956 e Patente dos E.U.A. No. 6,084,155.
[00189] Polinucleotídeos adequados adicionais incluem aqueles codificando polipeptideos pesticidas (p.ex., inseticidas). Estes polipeptideos podem ser produzidos em quantidades suficientes para controlar, por exemplo, pragas de insetos (i.e., quantidades controladoras de insetos). É reconhecido que a quantidade de produção de um polipeptideo pesticida em uma planta necessária para controlar insetos ou outras pragas pode variar dependendo do cultivar, tipo de praga, fatores ambientais e
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85/144 similares. Polinucleotideos úteis para resistência adicional a insetos ou pragas incluem, por exemplo, aqueles que codificam toxinas identificadas em organismos Bacillus. Polinucleotideos compreendendo sequências de nucleotideos codificando proteínas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) de várias subespécies foram clonados e foi descoberto que os clones recombinantes eram tóxicos para larvas de insetos lepidópteros, dípteros e coleópteros. Exemplos de tais proteínas inseticidas de Bt incluem as proteínas Cry tais como CrylAa, CrylAb, CrylAc, CrylB, CrylC, CrylD, CrylEa, CrylEa, Cry3A, Cry9A, Cry9B, Cry9C e similares, bem como proteínas inseticidas vegetativas tais como Vipl, Vip2, Vip3 e similares. Uma lista completa de proteínas derivadas de Bt pode ser encontrada na worldwide web na Base de Dados de Nomenclatura de Toxinas de Bacillus thuringiensis mantida pela Universidade de Sussex (ver também, Crickmore et al.
(1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 807-813).
[00190] Polipeptídeos que são adequados para produção em plantas incluem adicionalmente aqueles que melhoram ou de outro modo facilitam a conversão de plantas ou partes de plantas coletadas em um produto comercialmente útil, incluindo, por exemplo, conteúdo ou distribuição de carboidratos aumentado ou alterado, propriedades de fermentação melhoradas, conteúdo de óleo aumentado, conteúdo de proteínas aumentado, digestibilidade melhorada e conteúdo de nutracêuticos aumentado, p.ex., conteúdo de fitoesterol aumentado, conteúdo de tocoferol aumentado, conteúdo de estanol aumentado ou conteúdo de vitaminas aumentado. Os polipeptídeos de interesse incluem
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86/144 também, por exemplo, aqueles resultando em ou contribuindo para um conteúdo reduzido de um componente indesejado em uma cultura coletada, p.ex., ácido fítico ou enzimas de degradação do açúcar. Por resultando em ou contribuindo para se significa que o polipeptideo de interesse possa diretamente ou indiretamente contribuir para a existência de um traço de interesse (p.ex., aumento da degradação da celulose pelo uso de uma enzima celulase heteróloga).
[00191] Em algumas modalidades, o polipeptideo contribui para uma digestibilidade melhorada de alimentos ou rações. As xilanases são enzimas hemicelulolíticas que melhoram a degradação das paredes celulares de plantas, o que leva a melhor utilização dos nutrientes das plantas por um animal. Isto leva a uma taxa de crescimento e conversão de rações melhoradas. Igualmente, a viscosidade das rações contendo xilana pode ser reduzida. A produção heteróloga de xilanases em células de plantas pode também facilitar a conversão lignocelulósica em açúcares fermentáveis no processamento industrial.
[00192] Numerosas xilanases de microrganismos fúngicos e bacterianos foram identificadas e caracterizadas (ver, p.ex., Patente dos E.U.A. No. 5, 437, 992; Coughlin et al. (1993) '‘‘'Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases Espoo; Souminen e Reinikainen, eds. (1993) Foundation for
Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8: 125135; Publicação de Patente dos E.U.A. No. 2005/0208178, e Publicação PCT No. WO 03/16654) . Em particular, três xilanases especificas (XYL-I, XYL-II e XYL-III) foram identificadas em T. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme
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Microb. Technol. 14: 566; Torronen et al. (1992)
Bio/Technology 10: 1461 e Xu et al. (1998) Appl.
Microbiol. Biotechnol. 49: 718).
[00193] Em outras modalidades, um polipeptídeo útil para a invenção pode ser uma enzima de degradação de polissacarídeos. As plantas da presente invenção produzindo uma tal enzima podem ser úteis para geração, por exemplo, de matérias-primas de fermentação para bioprocessamento. Em algumas modalidades, as enzimas úteis para um processo de fermentação incluem alfa-amilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, ciclodextrina glicotransferases, lipases, fitases, lacases, oxidases, esterases, cutinases, enzima da hidrólise do amido granular e outras glucoamilases.
[00194] Enzimas que degradam polissacarídeos incluem: enzimas de degradação do amido tais como α-amilase (EC 3.2.1.1), glucuronidases (E.C. 3.2.1.131), exo-1,4-oí-Dglucanases tais como amiloglucosidases e glucoamilase (EC 3.2.1.3), β-amilases (EC 3.2.1.2), α-glucosidases (EC 3.2.1.20), e outras exo-amilases; enzimas de desramificação do amido, tais como: a) isoamilase (EC 3.2.1.68), pululanase (EC 3.2.1.41), e similares, b) celulases tais como exo-1,4-3-celobioidrolase (EC
3.2.1.91), exo-1,3-p-D-glucanase (EC 3.2.1.39), βglucosidase (EC 3.2.1.21), c) L-arabinases, tais como endo-1,5-a-L-arabinase (EC 3.2.1.99), α-arabinosidases (EC 3.2.1.55) e similares; d) galactanases tais como endo1, 4^-D-galactanase (EC 3.2.1.89), endo-1,3-β-ϋgalactanase (EC 3.2.1.90), α-galactosidase (EC 3.2.1.22),
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88/144 β-galactosidase (EC 3.2.1.23) e similares; e) mananases, tais como endo-1,4-p-D-mananase (EC 3.2.1.78), βmanosidase (EC 3.2.1.25), α-manosidase (EC 3.2.1.24) e similares, f) xilanases, tais como endo-1,4-3-xilanase (EC 3.2.1.8), β-D-xilosidase (EC 3.2.1.37), 1,3-3-D-xilanase, e similares; e g) outras enzimas tais como α-L-fucosidase (EC 3.2.1.51), alfa-L-ramnosidase (EC 3.2.1.40), levanase (EC 3.2.1.65), inulanase (EC 3.2.1.7) e similares. Em uma modalidade, a a-amilase é a a-amilase sintética, Amy797E, descrita na Patente dos E.U.A. No. 8,093,453, aqui incorporada como referência na sua totalidade.
[00195] Enzimas adicionais que podem ser usadas com a invenção incluem proteases, tais como proteases fúngicas e bacterianas. As proteases fúngicas incluem aquelas, mas não estão limitadas àquelas, obtidas a partir de Aspergillus, Trichoderma, Mucor e Rhizopus, tais como A. niger, A. awamori, A. oryzae e M. miehei. Em algumas modalidades, os polipeptideos desta invenção podem ser enzimas celobioidrolase (CBH) (EC 3.2.1.91). Em uma modalidade, a enzima celobioidrolase pode ser CBH1 ou CBH2 .
[00196] Outras enzimas úteis com a invenção incluem, mas não estão limitadas a, hemicelulases, tais como manases e arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55); ligninases; lipases (p.ex., E.C. 3.1.1.3), glucose oxidases, pectinases, xilanases, transglucosidases, alfa 1,6 glucosidases (p.ex., E.C. 3.2.1.20); celobioidrolases; esterases tais como ácido ferúlico esterase (EC 3.1.1.73) e acetil xilano esterases (EC 3.1.1.72); e cutinases (p.ex., E.C, 3.1.1.74) .
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89/144 [00197] Moléculas de RNA de fita dupla úteis com a invenção incluem aquelas, mas não estão limitadas àquelas, que suprimem genes de insetos alvo. Como usado aqui, as palavras supressão de genes, quando tomadas em conjunto, se destinam a se referir a qualquer um dos métodos bem conhecidos para redução dos niveis de proteina produzidos como resultado da transcrição de genes em mRNA e tradução subsequente do mRNA. Supressão de genes se destina também a significar a redução da expressão de proteina a partir de um gene ou uma sequência codificante incluindo supressão de genes pós-transcricional e supressão transcricional. A supressão de genes pós-transcricional é mediada pela homologia entre todo o ou parte de um mRNA transcrito a partir de um gene ou sequência codificante visada para supressão e o correspondente RNA de fita dupla usado para supressão e se refere à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponivel disponivel na célula para ligação por ribossomos. 0 RNA transcrito pode estar na orientação senso para efetuar o que é chamada cossupressão, na orientação antissenso para efetuar o que é chamada supressão antissenso ou em ambas as orientações produzindo um dsRNA para efetuar o que é chamada interferência de RNA (RNAi). A supressão transcricional é mediada pela presença na célula de um dsRNA, um agente de supressão de genes, exibindo identidade de sequências substancial com uma sequência de DNA promotora ou o seu complemento para efetuar o que é referido como supressão trans do promotor. A supressão de genes pode ser eficaz contra um gene de planta nativo associado a um traço, p.ex., para proporcionar plantas com niveis reduzidos de
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90/144 uma proteína codificada pelo gene nativo ou com níveis intensificados ou reduzidos de um metabolite afetado. A supressão de genes pode ser também eficaz contra genes alvo em pragas de plantas que podem ingerir ou contatar com material de planta contendo agentes de supressão de genes, especificamente concebidos para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da praga. Tais genes visados para supressão podem codificar uma proteína essencial a função prevista da qual é selecionada do grupo consistindo em formação de músculo, formação de hormônios juvenis, regulação de hormônios juvenis, regulação e transporte de íons, síntese de enzimas digestivas, manutenção do potencial de membrana da célula, biossíntese de aminoácidos, degradação de aminoácidos, formação de esperma, síntese de feromônios, sensor de feromônios, formação de antenas, formação de asas, formação de patas, desenvolvimento e diferenciação, formação de ovos, maturação de larvas, formação de enzimas digestivas, síntese de hemolinfa, manutenção de hemolinfa, neurotransmissão, divisão celular, metabolismo da energia, respiração e apoptose.
[00198] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma célula hospedeira não humana transgênica compreendendo um polinucleotideo, um gene quimérico, um cassete de expressão ou um vetor recombinante da invenção. A célula hospedeira não humana transgênica pode incluir, mas não está limitada a, uma célula de planta, uma célula de levedura, uma célula bacteriana ou uma célula de inseto. Conformemente, em algumas modalidades, a invenção
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91/144 proporciona uma célula bacteriana selecionada dos gêneros Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Xenorhabdus, Photorhabdus, Pasteuria, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter,
Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, ou Alcaligenes. Assim, por exemplo, como agentes biológicos de controle de insetos, as proteínas Cry da invenção podem ser produzidas por expressão de um gene quimérico codificando as proteínas Cry da invenção em uma célula bacteriana. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula de Bacillus thuringiensis compreendendo um gene quimérico da invenção é proporcionada.
[00199] Em modalidades adicionais, a invenção proporciona uma célula de planta transgênica que é uma célula de planta dicot ou uma célula de planta monocot. Em modalidades adicionais, a célula de planta dicot é selecionada do grupo consistindo em uma célula de soja, célula de girassol, célula de tomate, célula de cultura de couves, célula de algodão, célula de beterraba-sacarina e célula de tabaco. Em modalidades adicionais, a célula de planta monocot é selecionada do grupo consistindo em uma célula de cevada, célula de mais, célula de aveia, célula de arroz, célula de sorgo, célula de cana-de-açúcar e célula de trigo. Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma pluralidade de células de dicot ou células de monocot expressando uma proteína Cry da invenção que é codificada por um gene quimérico da invenção. Em outras modalidades,
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92/144 a pluralidade de células é justaposta para formar um apoplasto e é cultivada à luz solar natural.
[00200] Em outras modalidades da invenção, uma proteina Cry inseticida da invenção é expressa em um organismo superior, por exemplo, uma planta. Em este caso, as plantas transgênicas expressando quantidades eficazes da proteina inseticida se protegem a si mesmas de pragas de plantas tais como pragas de insetos. Quando um inseto começa a se alimentar de uma tal planta transgênica ingere a proteína Cry inseticida expressa. Isto pode impedir que o inseto morda adicionalmente o tecido da planta ou pode mesmo prejudicar ou matar o inseto. Um polinucleotídeo da invenção é inserido em um cassete de expressão, que é depois estavelmente integrado no genoma da planta. Em outras modalidades, o polinucleotídeo é incluído em um vírus autorreplicante não patogênico. As plantas transformadas de acordo com a invenção podem ser monocots ou dicots e incluem, mas não estão limitadas a, milho (mais), soja, arroz, trigo, cevada, centeio, aveia, sorgo, milhete, girassol, cártamo, beterraba-sacarina, algodão, cana de açúcar, colza, alfafa, tabaco, amendoins, legumes, incluindo, batata-doce, feijão, ervilha, chicória, alface, couve, couve-flor, brócolis, nabo, cenoura, berinjela, pepino, rabanete, espinafre, batata, tomate, aspargos, cebola, alho, melão, pimenta, aipo, abóboramoranga, abóbora, abobrinha, frutas, incluindo, maçã, pera, marmelo, ameixa, cereja, pêssego, nectarina, damasco, morango, uva, framboesa, amora, abacaxi, abacate, mamão, manga, banana, e plantas de especialidade tais como Arabidopsis e plantas lenhosas tais como árvores coníferas
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93/144 e de folha caduca. Preferencialmente, as plantas da invenção são plantas de cultura tais como mais, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba-sacarina, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza e similares.
[00201] Logo que um polinucleotideo desejado tenha sido transformado em uma espécie de planta particular pode ser propagado em essa espécie ou movido para outras variedades da mesma espécie, incluindo particularmente variedades comerciais, usando técnicas de melhoramento tradicionais.
[00202] Um polinucleotideo da invenção é expresso nas plantas transgênicas, causando assim a biossíntese da proteína Cry correspondente, em forma de pró-toxina ou de toxina madura, nas plantas transgênicas. Deste modo, plantas transgênicas com proteção de rendimento intensificada na presença de pressão de insetos. Para a sua expressão nas plantas transgênicas, as sequências de nucleotideos da invenção podem requerer modificação e otimização. Embora em muitos casos os genes de organismos microbianos poderem ser expressos em plantas a níveis elevados sem modificação, a baixa expressão nas plantas transgênicas pode resultar da sequência de nucleotideos microbianas tendo códons que não são preferenciais em plantas. É conhecido na técnica que todos os organismos têm preferências específicas para o uso de códons, e os códons das sequências de nucleotideos descritas em esta invenção podem ser mudados para se ajustarem às preferências das plantas, enquanto mantêm os aminoácidos codificados deste modo. Além do mais, a elevada expressão em plantas, por exemplo plantas de milho, é mais bem obtida a partir de
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94/144 sequências codificantes que têm pelo menos cerca de 35% de conteúdo de GC ou pelo menos cerca de 45% ou pelo menos cerca de 50% ou pelo menos cerca de 60%. As sequências de nucleotídeos microbianas que têm baixos conteúdos de GC podem expressar fracamente em plantas devido à existência de motivos ATTTA que podem desestabilizar mensagens e motivos AATAAA que podem causar poliadenilação inapropriada. Embora certas sequências de genes possam ser adequadamente expressas em espécies de plantas tanto monocot como dicot, as sequência podem ser modificadas para contabilizar as preferências quanto aos códons e preferências quanto ao conteúdo de GC especificas de monocotiledôneas ou dicotiledôneas pois foi mostrado que estas preferências diferem (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)). Adicionalmente, as sequências de nucleotídeos são rastreadas quanto à existência de locais de splicing ilegítimos que podem causar truncação de mensagem. Todas as mudanças requeridas que sejam feitas dentro das sequências de nucleotídeos tais como aquelas descritas acima são feitas usando técnicas bem conhecidas de mutagênese sítio-dirigida, PCR e construção de genes sintéticos usando os métodos descritos por exemplo nas Patentes dos E.U.A. Nos. 5,625,136; 5,500,365 e 6,013,523.
[00203] Em algumas modalidades, a invenção proporciona sequências codificantes ou polinucleotídeos sintéticos preparados de acordo com o procedimento divulgado na Pat. dos E.U.A. No. 5,625,136, aqui incorporada por referência. Em este procedimento, códons preferenciais do mais, i.e., o único códon que codifica o mais frequentemente aquele aminoácido no mais. O códon preferencial do mais para um
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95/144 aminoácido particular pode ser derivado, por exemplo, a partir de sequências de genes conhecidas do mais. Por exemplo, o uso de códons de mais por 28 genes de plantas de mais é encontrado em Murray et al., Nucleic Acids Research 17: 477-498 (1989), a divulgação do qual é incorporada aqui como referência. Sequências sintética especificamente exemplificadas da presente invenção preparadas com códons otimizados de mais são representadas por qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-22. É reconhecido que códons otimizados para expressão em uma espécie de planta irão também funcionar em outra espécie de planta, mas possivelmente não ao mesmo nivel da espécie de planta para a qual os códons foram otimizados. Deste modo, a sequência de nucleotideos pode ser otimizada para expressão em qualquer planta. É reconhecido que toda a ou qualquer parte de uma sequência de nucleotideos pode ser otimizada ou sintética. Isto é, um polinucleotideo pode compreender uma sequência de nucleotideos que é parte sequência nativa e parte sequência que tem códons otimizados.
[00204] Para iniciação eficiente da tradução, as sequências adjacentes à metionina de iniciação podem requerer modificação. Por exemplo podem ser modificadas pela inclusão de sequências conhecidas por serem eficazes em plantas . Joshi sugeriu um consenso apropriado para plantas (NAR 15: 6643-6653 (1987)) e Clonetech sugere um iniciador de tradução de consenso adicional (catálogo 1993/1994, página 210). Estes consensos são adequados para uso com a sequência de nucleotideos desta invenção. As sequências são incorporadas em construções compreendendo as sequências de nucleotideos, até e incluindo a ATG
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96/144 (enquanto deixa o segundo aminoácido não modificado) ou, alternativamente, até e incluindo a GTC subsequente à ATG (com a possibilidade de modificar o segundo aminoácido do transgene).
[00205] As novas sequências codificantes das proteínas Cry da invenção, como a sua sequência nativa ou como sequências sintéticas como descrito acima, podem ser operacionalmente fundidas a uma variedade de promotores para expressão em plantas incluindo promotores constitutivos, induzíveis, temporalmente regulados, regulados quanto ao desenvolvimento, quimicamente regulados, preferenciais de tecidos e específicos de tecidos, para preparar moléculas de DNA recombinante, i.e.f genes quiméricos. A escolha do promotor irá variar dependendo dos requisitos temporais e espaciais para expressão e dependendo também das espécies alvo. Assim, a expressão das sequências de nucleotídeos desta invenção em folhas, em galhos ou caules, em espigas, em inflorescências (p.ex., espinhos, panículas, sabugos, etc.), em raízes ou plântulas é preferencial. Em muitos casos, no entanto, proteção contra mais do que um tipo de praga de insetos e, logo, expressão em múltiplos tecidos é desejável. Embora tenha sido mostrado que muitos promotores de dicotiledôneas são operacionais em monocotiledôneas e vice-versa, idealmente são selecionados promotores de dicotiledôneas para expressão em dicotiledôneas e promotores de monocotiledôneas para expressão em monocotiledôneas. No entanto, não existe restrição quanto à proveniência de promotores selecionados; é suficiente que eles sejam operacionais no
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97/144 direcionamento da expressão das sequências de nucleotideos na célula desejada.
[00206] Promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, promotor do CaMV 35S (Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985); promotor de Arabidopsis At6669 (ver
Publicação PCT No. WO 0 4 0 8117 3A2 ) ; Ubi 1 do milho (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); actina do arroz (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100: 456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al., Plant J novembro; 2 (6): 837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al.,
Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); Ciclofilina do arroz (Bucholz et al., Plant Mol Biol. 25 (5): 837-43, 1994); Histona H3 do milho (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al., Plant J. 10 (1); 107121, 1996), promotor constitutivo de ponta de raiz CT2 (pedido PCT No. IL/2005/000627) e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995) . Outros promotores constitutivos incluem aqueles presentes nas Pat. dos E.U.A. Nos. 5, 659, 026, 5, 608,149; 5, 608,144;
5, 604,121; 5, 569, 597: 5, 466, 785; 5, 399, 680; 5, 268,463; e 5,608,142.
[00207] Promotores preferidos de tecidos ou específicos de tecidos úteis para a expressão das novas sequências codificantes de proteínas cry da invenção em plantas, particularmente mais, são aqueles que dirigem a expressão em raiz, medula, folha ou pólen. Promotores adequados específicos para tecidos incluem, mas não se limitam a, promotores específicos para folhas [tal como descrito, por
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98/144 exemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12: 255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105: 357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3: 509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138, 1993, e Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, 1993], promotores preferenciais para sementes [p.ex., de genes específicos para sementes (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), Albumina da castanha-do-brasil (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEES Letts. 221: 43-47, 1987), Zeina (Matzke et al., Plant Mol Biol, 143:323-32 1990), napA (Stalberg, et al., Planta 199: 515-519, 1996), Trigo SPA (Albanietal, Plant Cell, 9: 171-184, 1997), oleosina do girassol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992)], promotores específicos do endosperma [p.ex, LMW e HMW do trigo, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216: 81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas a, b e g do trigo (EMBO 3: 140915, 1984), Promotor de itrl de cevada, Bl, C, D hordeina de cevada (Theor Appl Gen 98: 1253-62, 1999; Plant J 4: 343-55, 1993; Mol Gen Genet 250: 750-60, 1996), DOF de Cevada (Mena et al., The Plant Journal, 116 (1) : 53-62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), Promotor sintético (VicenteCarbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 do arroz, -globulina Glb-1 do arroz (Wu et al., Plant Cell Physiology 39 (8) 885-889, 1998), alfaPetição 870190061644, de 02/07/2019, pág. 117/181
99/144 globulina REB/OHP-1 do arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucose PP do arroz (Trans Res 6: 157-68, 1997), família de genes ESR do milho (Plant J 12: 235-46, 1997), gama-cafirina do sorgo (Plant Mol. Biol 32: 1029-35, 1996)], promotores específicos para embriões [p.ex., OSHI do arroz (Sato et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39: 257-71, 1999), oleosina do arroz (Wu et at, J. Biochem., 123: 386, 1998)], promotores específicos de flores [p.ex., AtPRP4, chaleno sintase (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95109, 1990), LAT52 (Twell et al., Mol. Gen Genet. 217: 240245; 1989), apetala-3, tecidos reprodutivos de plantas [p.ex., promotores OsMADS (Pedido de Patente dos E.U.A. 2007/0006344)] .
[00208] A sequência de nucleotídeos desta invenção pode ser também expressa sob a regulação de promotores que são quimicamente regulados. Isto permite que as proteínas Cry da invenção sejam sintetizadas somente quando as plantas de cultura são tratadas com os químicos indutores. Exemplos de tal tecnologia para indução química da expressão de genes são detalhados no pedido publicado EP 0 332 104 e Patente dos EUA No. 5, 614,395. Em uma modalidade, o promotor quimicamente regulado é o promotor do tabaco PR-la.
[00209] Outra categoria de promotores úteis na invenção é aquela que é induzível por feridas. Foram descritos inúmeros promotores que são expressos em locais de ferida e também nos locais de infeção fitopatogênica. Idealmente, um tal promotor só deve ser ativo localmente nos locais
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100/144 da invasão de insetos e, deste modo, as proteínas inseticidas só se acumulam em células que necessitam de sintetizar as proteínas inseticidas para matar a praga de insetos invasora. Exemplos de promotores deste tipo incluem aqueles descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215: 200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993) e Warner et al. Plant J. 3: 191-201 (1993).
[00210] Exemplos não limitantes de promotores que causam padrões de expressão específicos de tecidos que são úteis na invenção incluem específicos de tecidos verdes, específicos de raízes, específicos de caules ou específicos de flores. Promotores adequados para expressão em tecido verde incluem muitos que regulam genes envolvidos na fotossíntese e muitos destes foram clonados a partir de monocotiledôneas e dicotiledôneas. Um tal promotor é o promotor de PEPC do mais do gene da fosfoenol carboxilase (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12: 579589 (1989)). Outro promotor para expressão específica de raízes é aquele descrito por de Framond (FEBS 290: 103106 (1991) ou Patente dos EUA No. 5, 466, 785) . Outro promotor útil na presente invenção é o promotor específico do caule descrito na Pat. dos E.U.A. No. 5, 625, 136 que conduz naturalmente a expressão de um gene trpA do mais.
[00211] Adicionalmente à seleção de um promotor adequado, os construtos para expressão de uma toxina inseticida em plantas requerem um terminador de transcrição apropriado para ser operacionalmente ligado a jusante da sequência
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101/144 de nucleotídeos heteróloga. Vários tais terminadores estão disponíveis e são conhecidos na técnica (p.ex., tml de CaMV, E9 de rbcS). Qualquer terminador disponível conhecido por funcionar em plantas pode ser usado no contexto desta invenção.
[00212] Numerosas outras sequências podem ser incorporadas em cassetes de expressão descritos em esta invenção. Estas incluem sequências que mostraram intensificar a expressão tais como sequências de introns (p.ex., de Adhl e bronzel) e sequências lider virais (p.ex., de TMV, MCMV e AMV) .
[00213] Pode ser preferencial visar a expressão da sequência de nucleotideos da presente invenção para diferentes localizações celulares na planta. Em alguns casos, a localização no citosol pode ser desejável, ao passo que, em outros casos, a localização em algumas organelas subcelulares pode ser preferencial. Qualquer mecanismo para direcionamento de produtos de genes, p.ex., em plantas, podem ser usados para praticar esta invenção e tais mecanismos são conhecidos por existirem em plantas e as sequências controlando o funcionamento destes mecanismos foram caracterizadas em algum detalhe. Foram caracterizadas sequências que causam o direcionamento dos produtos de genes para outros compartimentos celulares. As sequências terminais amino podem ser responsáveis pelo direcionamento de uma proteina de interesse para qualquer compartimento celular, tal como um vacúolo, mitocôndria, peroxissomo, corpos de proteínas, retículo endoplasmático, cloroplasto, grânulo de amido, amiloplasto, apoplasto ou parede celular de uma planta (p.ex., Unger et. al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418
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102/144 (1989); Rogers et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-651; Pat. dos E.U.A. No. 7,102,057; WO 2005/096704, todos os quais são deste modo incorporados por referência. Opcionalmente, a sequência sinal pode ser uma sequência sinal terminal N de cera, uma sequência sinal terminal N de gama-zeína, um dominio de ligação de amido, um dominio de ligação de amido terminal C, uma sequência de direcionamento para cloroplastos, que importa a proteína madura para o cloroplasto (Cornai et. al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15104-15109; van den Broeck, et. al. (1985) Nature 313: 358-363; Pat. dos E.U.A. No. 5,639,949) ou uma sequência sinal de segregação de células de aleurona (Koehler & Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Adicionalmente, as sequências terminais amino em conjugação com sequências terminais carbóxi são responsáveis por direcionamento vacuolar de produtos de genes (Shinshi et. al. (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357368). Em uma modalidade, a sequência sinal selecionada inclui o local de divagem conhecido e a fusão construída tem em consideração quaisquer aminoácidos após o(s) local (ais) de divagem, que são requeridos para divagem. Em alguns casos, este requisito pode ser satisfeito pela adição de um pequeno número de aminoácidos entre o local de divagem e o transgene ATG ou, alternativamente, substituição de alguns aminoácidos dentro da sequência do transgene. Estas técnicas de construção são bem conhecidas na técnica e são igualmente aplicáveis a qualquer compartimento celular.
[00214] Será reconhecido que os mecanismos acima descritos para direcionamento celular podem ser usados não só em
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103/144 conjunção com seus promotores cognatos, mas também em conjunção com promotores heterólogos de modo a efetuar um objetivo de direcionamento celular especifico sob a regulação transcricional de um promotor que tem um padrão de expressão diferente daquele do promotor a partir do qual o sinal de direcionamento deriva.
Transformação de Plantas [00215] Os procedimentos para transformação de plantas são bem conhecidos e rotineiros na técnica e são descritos ao longo da literatura. Exemplos não limitantes de métodos para transformação de plantas incluem transformação através de administração de polinucleotideos mediada por bactérias (p.ex., através de Agrobacterium) , administração de polinucleotideos mediada por virus, administração de polinucleotideos mediada por carbeto de silicio ou filamentos monocristalinos, administração de polinucleotideos mediada por lipossomos, microinjeção, bombardeamento de microparticulas, transformação mediada por fosfato de cálcio, transformação mediada por ciclodextrinas, eletroporação, transformação mediada por nanopartículas, sonicação, infiltração, captação de polinucleotideos mediada por PEG, bem como qualquer outro mecanismo elétrico, químico, físico (mecânico) ou biológico que resulte na introdução de polinucleotídeo na célula de planta, incluindo qualquer sua combinação. Guias gerais para vários métodos de transformação de plantas conhecidos na técnica incluem Miki et al. (Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993),
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104/144 páginas 67-88) e Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7: 849-858 (2002)) .
[00216] Para transformação mediada por Agrobacterium são adequados vetores binários ou vetores contendo pelo menos uma sequência de borda de T-DNA, ao passo que para transferência direta de genes (p.ex., bombardeamento de partículas e similares) é adequado qualquer vetor e pode ser usado DNA linear contendo somente a construção de interesse. No caso de transferência direta de genes pode ser usada transformação com uma única espécie de DNA ou cotransformação (Schocher et al., Biotechnology 4: 10931096 (1986)). Para transferência direta de genes e transferência mediada por Agrobacterium, a transformação é usualmente (mas não necessariamente) realizada com um marcador selecionável que pode ser uma seleção positiva (Fosfomanose Isomerase), proporcionar resistência a um antibiótico (canamicina, higromicina ou metotrexato) ou um herbicida (glifosato ou glufosinato). No entanto, a escolha do marcador selecionável não é crítica para a invenção.
[00217] A transformação mediada por Agrobacterium é um método comumente usado para transformação de plantas devido à sua elevada eficácia de transformação e devido à sua ampla utilidade com muitas espécies diferentes. A transformação mediada por Agrobacterium envolve tipicamente a transferência do vetor binário transportando o DNA estranho de interesse para uma estirpe de Agrobacterium apropriada que pode depender do complemento de genes vir transportados pela estirpe de Agrobacterium hospedeira em um plasmídeo Ti corresidente ou
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105/144 cromossomicamente (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5: 159169) . A transferência do vetor binário recombinante para Agrobacterium pode ser alcançada por um procedimento de acoplamento trigenitor usando Escherichia coli que transporta o vetor binário recombinante, uma estirpe auxiliar de E. coli que transporta um plasmídeo capaz de mobilizar o vetor binário recombinante para a estirpe de Agrobacterium alvo. Alternativamente, o vetor binário recombinante pode ser transferido para Agrobacterium por transformação com polinucleotídeos (Hõfgen & Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16: 9877).
[00218] Dicotils bem como monocots podem ser transformadas usando Agrobacterium. Métodos para transformação de arroz mediada por Agrobacterium incluem métodos bem conhecidos para transformação de arroz, tais como aqueles descritos em qualquer um dos seguintes: Pedido de patente europeia EP 1198985 Al, Aldemita e Hodges (Planta 199: 612-617, 1996) ; Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3) : 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cujas divulgações são incorporadas aqui por referência como se totalmente apresentadas. No caso de transformação do milho, o método preferencial é como descrito em Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14 (6) : 745-50, 1996) ou Frame et al. (Plant Physiol 129 (1) : 13-22, 2002), cujas divulgações são incorporadas aqui por referência como se totalmente apresentadas. Os referidos métodos são adicionalmente descritos a titulo de exemplo em B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, em: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 e em Potrykus
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Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Os polinucleotideos ou o construto a ser expresso é preferencialmente clonado em um vetor, que é adequado para transformação em Agrobacterium tumefaciens, por exemplo pBinl9 (Bevan et al. , Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). As agrobactérias transformadas por um tal vetor podem ser depois usadas de modo conhecido para a transformação de plantas, tais como plantas usadas como um modelo, como Arabidopsis, ou plantas de cultura tais como, a título de exemplo, plantas de tabaco, por exemplo por imersão de folhas pisadas ou folhas cortadas em uma solução agrobacteriana e depois cultura das mesmas em meio adequado. A transformação de plantas por meio de Agrobacterium tumefaciens é descrita, por exemplo, por Hagen e Willmitzer em Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877, ou é conhecida inter alia a partir de F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; em Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.
[00219] A transformação de uma planta por Agrobacterium recombinante envolve usualmente cocultura da Agrobacterium com explantes da planta e segue métodos bem conhecidos na técnica. O tecido transformado é regenerado em meio de seleção transportando um marcador de resistência a antibióticos ou herbicidas entre as fronteiras do T-DNA de plasmídeo binário.
[00220] Como discutido previamente, outro método para transformação de plantas, partes de plantas e células de plantas envolve impulsionamento de partículas inertes ou biologicamente ativas para tecidos e células de plantas.
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Ver, p.ex., Patentes dos EUA Nos. 4,945,050; 5,036,006 e 5,100,792. Geralmente, este método envolve impulsionamento de partículas inertes ou biologicamente ativas para células de plantas sob condições eficazes para penetrarem na superfície externa da célula e originar incorporação dentro do seu interior. Quando são usadas partículas inertes, o vetor pode ser introduzido na célula por revestimento das partículas com o vetor contendo o polinucleotideo de interesse. Alternativamente, uma célula ou células podem estar rodeadas pelo vetor tal que o vetor seja transportado para a célula pelo rasto da partícula. Partículas biologicamente ativas (p.ex., uma célula de levedura seca, uma bactéria seca ou um bacteriófago, contendo cada um um ou mais polinucleotídeos que precisam de ser introduzidos) podem ser também impelidas para tecido de planta.
[00221] Em outras modalidades, um polinucleotídeo da invenção pode ser diretamente transformado no genoma de plastídeo. Uma grande vantagem da transformação de plastídeos é que os plastídeos são geralmente capazes de expressar genes bacterianos sem modificação substancial e os plastídeos são capazes de expressar múltiplas grelhas de leitura aberta sob controle de um único promotor. A tecnologia de transformação com plastídeos é extensamente descrita nas Patentes dos E.U.A. Nos. 5,451,513, 5,545,817 e 5,545,818, no Pedido PCT No. WO 95/16783 e em McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sei. USA 91, 7301-7305. A técnica básica para transformação de cloroplastos envolve introdução de regiões de DNA de plastídeo clonado flanqueando um marcador selecionável em conjunto com o
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108/144 gene de interesse em um tecido alvo adequado, p.ex., usando transformação biolistica ou com protoplastos (p.ex., transformação mediada por cloreto de cálcio ou PEG). As regiões de flanqueamento de 1 a 1,5 kb, denominadas sequências de direcionamento, facilitam a recombinação homóloga com o genoma de plastideo e assim permitem a substituição ou modificação de regiões especificas do plastoma. Inicialmente, mutações pontuais nos genes 16S de rRNA e rpsl2 de cloroplasto conferindo resistência à espectinomicina ou estreptomicina podem ser utilizadas como marcadores selecionáveis para transformação (Svab, Z., Hajdukiewicz, P. e Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M. e Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45) . A presença de locais de clonagem entre estes marcadores permite a criação de um vetor de direcionamento para plastideos para introdução de genes estranhos (Staub, J. M. e Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606) . Podem ser obtidos aumentos substanciais na frequência de transformação por substituição dos genes de resistência a antibióticos de proteina r ou rRNA recessivos com um marcador selecionável dominante, codificando o gene bacteriano aadA a enzima de cletoxificação da espectinomicina aminoglicosideo-3'adeniltransferase (Svab, Z., e Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 913-917) . Previamente, este marcador havia sido usado com sucesso para a transformação de elevada frequência do genoma de plastideo da alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 4083-4089) . Outros marcadores selecionáveis úteis para transformação de plastideos são
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109/144 conhecidos na técnica e englobados dentro do escopo da invenção. Tipicamente são requeridos aproximadamente 1520 ciclos de divisão celular após transformação para se alcançar um estado homoplastídico. A expressão em plastídeos, na qual os genes são inseridos por recombinação homóloga em todos os vários milhares de cópias do genoma de plastídeo circular presente em cada célula de planta, tira vantagem da enorme vantagem do número de cópias em relação a genes expressos no núcleo para permitir níveis de expressão que podem prontamente exceder 10% da proteína de planta solúvel total. Em uma modalidade, um polinucleotídeo da invenção pode ser inserido em um vetor de direcionamento para plastídeos e transformado no genoma de plastídeo de uma planta hospedeira desejada. Assim podem ser obtidas plantas homoplásticas para genomas de plastídeos contendo uma sequência de nucleotideos da invenção, que são capazes de elevada expressão do polinucleotídeo.
[00222] Métodos de seleção de plantas, células de plantas ou cultura de tecidos de plantas transgênicas e transformadas são rotineiros na técnica e podem ser empregues nos métodos da invenção proporcionados aqui. Por exemplo, um vetor recombinante da invenção pode também incluir um cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotideos para um marcador selecionável, que pode ser usado para selecionar uma planta, parte de planta ou célula de planta transformada. Como usado aqui, marcador selecionável significa uma sequência de nucleotideos que quando expressa confere um fenótipo distinto à planta, parte de planta ou célula de planta
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110/144 expressando o marcador e permite assim que tais plantas, partes de plantas ou células de plantas transformadas sejam distinguidas daquelas que não têm o marcador. Uma tal sequência de nucleotídeos pode codificar um marcador tanto selecionável como rastreável, dependendo de se o marcador confere um traço que pode ser selecionado por meios químicos, tal como por uso de um agente seletivo (p.ex., um antibiótico, herbicida ou similar) ou se o marcador é simplesmente um traço que se pode identificar através de observação ou teste, tal como por rastreamento (p.ex., o traço do lócus R) . Obviamente, muitos exemplos de marcadores selecionáveis adequados são conhecidos na técnica e podem ser usados nos cassetes de expressão descritos aqui.
[00223] Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, uma sequência de nucleotídeos codificando neo ou nptll, que confere resistência à canamicina, G418 e similares (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183-188); uma sequência de nucleotídeos codificando bar, que confere resistência à fosfinotricina; uma sequência de nucleotídeos codificando uma 5enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase alterada, que confere resistência ao glifosato (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6: 915-922); uma sequência de nucleotídeos codificando uma nitrilase tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confere resistência ao bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242: 419-423); uma sequência de nucleotídeos codificando uma acetolactato sintase (ALS) alterada que confere resistência à imidazolinona, sulfonilureia ou outros químicos inibidores de ALS (Pedido
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111/144 de Patente EP No. 154204); uma sequência de nucleotídeos codificando uma di-hidrofolato redutase (DHFR) resistente ao metotrexato (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 12500-12508); uma sequência de nucleotídeos codificando uma dalapona desalogenase que confere resistência à dalapona; uma sequência de nucleotídeos codificando uma manose-6-fosfato isomerase (também referida como fosfomanose isomerase (PMI)) que confere uma capacidade de metabolizar a manose (Patentes dos EUA Nos. 5,767,378 e 5,994,629); uma sequência de nucleotídeos codificando uma antranilato sintase alterada que confere resistência ao 5-metiltriptofano ou uma sequência de nucleotídeos codificando hph que confere resistência à higromicina. Um perito na técnica é capaz de escolher um marcador selecionável adequado para uso em um cassete de expressão desta invenção.
[00224] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, mas não estão limitados a, uma sequência de nucleotídeos codificando β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos; uma sequência de nucleotídeos do lócus R que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al., Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac 263-282 Em: Chromosome Structure and Function: Impact of New
Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); uma sequência de nucleotídeos codificando β-lactamase, uma enzima para a qual são conhecidos vários substratos cromogênicos (p.ex.,
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PADAC, uma cefalosporina cromogênica) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 75: 3737-3741); uma sequência de nucleotídeos codificando xylE que codifica uma catecol dioxigenase (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Scl. USA 80: 1101-1105); uma sequência de nucleotídeos codificando tirosinase, uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, que por seu turno condensa para formar melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129: 2703-2714); uma sequência de nucleotídeos codificando β-galactosidase, uma enzima para a qual existem substratos cromogênicos; uma sequência de nucleotídeos codificando luciferase (lux) que permite a detecção por bioluminescência (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859); uma sequência de nucleotídeos codificando aquorina que pode ser empregue na detecção por bioluminescência sensível ao cálcio (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126: 1259-1268); ou uma sequência de nucleotídeos codificando uma proteína verde fluorescente (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14: 403-406) . Um perito na técnica é capaz de escolher um marcador selecionável adequado para uso em um cassete de expressão desta invenção.
[00225] Adicionalmente, como é bem conhecido na técnica, plantas transgênicas intatas podem ser regeneradas a partir de células de plantas, cultura de tecido de plantas ou protoplastos cultivados transformados, usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas. A regeneração de plantas a partir de células de plantas, cultura de tecidos de plantas ou protoplastos cultivados é descrita, por exemplo, em Evans et al. (Handbook of Plant Cell
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Cultures, Vol. 1, MacMilan Publishing Co. Nova Iorque (1983)), e Vasil I. R. (ed.) (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I (1984) e Vol. II (1986)) .
[00226] Adicionalmente, as propriedades genéticas manipuladas nas sementes e plantas, partes de plantas ou células de plantas transgênicas da invenção descritas acima podem ser transmitidas por reprodução sexuada ou crescimento vegetative e podem portanto ser mantidas e propagadas em plantas da descendência. Geralmente, a manutenção e propagação fazem uso de métodos agrícolas conhecidos desenvolvidos para se ajustarem a objetivos específicos tais como coleta, semeadura ou crescimento de rebentos.
[00227] Um polinucleotideo pode, portanto, ser introduzido na planta, parte de planta ou célula de planta em qualquer número de modos que são bem conhecidas na técnica, como descrito acima. Portanto, nenhum método particular para introdução de um ou mais polinucleotídeos em uma planta é invocado, ao invés, qualquer método que permita que o um ou mais polinucleotídeos sejam estavelmente integrados no
genoma da planta pode ser usado. Onde mais do que um
polinucleotideo é para ser introduzido, os respectivos
polinucleotídeos podem ser montados como um único
polinucleotideo ou como polinucleotídeos separados e podem estar localizados nos mesmos ou diferentes cassetes de expressão ou vetores. Conformemente, os polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula de interesse em um único evento de transformação, em eventos de transformação
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114/144 separados ou, por exemplo, em plantas, como parte de um protocolo de melhoramento.
[00228] Modalidades adicionais da invenção englobam produtos coletados produzidos a partir das plantas transgênicas ou suas partes compreendendo um polinucleotideo codificando proteínas Cry da invenção, bem como um produto processado produzido a partir dos produtos coletados. Um produto coletado pode ser uma planta inteira ou qualquer parte de planta, como descrito aqui. Assim, em algumas modalidades, exemplos não limitantes de um produto coletado incluem uma semente, um fruto, uma flor ou sua parte (p.ex., uma antera, um estigma e similares), uma folha, uma haste e similares. Em outras modalidades, um produto processado inclui, mas não está limitado a, farinha, farelo, óleo, amido, cereal e similares produzidos a partir de uma semente ou outra parte de planta coletada da invenção, em que a semente ou outra parte de planta compreende uma sequência de polinucleotídeos ou nucleotideos da invenção. Em algumas modalidades, a invenção engloba produtos coletados e produtos processados, tais como farelo ou farinha que compreendem uma proteína Cry da invenção, onde a proteína Cry continua a realizar a função inseticida que tinha na planta transgênica a partir da qual o produto coletado ou produto processado foi derivado.
[00229] Em outras modalidades, a invenção proporciona um extrato de uma semente transgênica ou uma planta transgênica da invenção, em que o extrato compreende um polinucleotideo ou uma proteína Cry da invenção. Extratos de plantas ou partes de plantas podem ser preparados de acordo com procedimentos bem conhecidos na técnica (Ver
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115/144 de la Torre et al., Food, Agric. Environ. 2 (1) : 84-89 (2004); Guidet, Nucleic Acids Res. 22 (9): 1772-1773 (1994); Lipton et al., Food Agric. Immun. 12: 153-164 (2000)) .
Composições Inseticidas [00230] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma composição inseticida compreendendo uma proteína Cry da invenção em um transportador agricolamente aceitável. Como usado aqui, um transportador agricolamente aceitável pode incluir material natural ou sintético, orgânico ou inorgânico que é combinado com a proteína Cry ativa para facilitar a sua aplicação à ou na planta ou sua parte. Exemplos de transportadores agricolamente aceitáveis incluem, sem limitação, pós, poeiras, grânulos, granulados, pulverização, emulsões, coloides e soluções. Transportadores agricolamente aceitáveis incluem adicionalmente, mas não estão limitados a, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, adjuvantes, agentes de aderência, adesivos, aglutinantes ou suas combinações, que podem ser usados em formulações agrícolas. Tais composições podem ser aplicadas de qualquer modo que coloque as proteínas pesticidas ou outros agentes de controle de pragas em contato com as pragas. Conformemente, as composições podem ser aplicadas às superfícies de plantas ou partes de plantas, incluindo sementes, folhas, flores, hastes, tubérculos, raízes e similares. Em outras modalidades, uma planta produzindo uma proteína Cry da invenção in planta é um transportador agrícola da proteína Cry expressa.
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116/144 [00231] Em modalidades adicionais, a composição inseticida compreende uma célula bacteriana ou uma célula bacteriana transgênica da invenção, em que a célula bacteriana ou célula bacteriana transgênica produz uma proteína Cry da invenção. Tal composição inseticida pode ser preparada por dessecação, liofilização, homogenização, extração, filtração, centrifugação, sedimentação ou concentração de uma cultura de Bacillus thuringiensis (Bt). Tais culturas de Bt podem ser selecionadas do grupo de estirpes de Bt consistindo em SC0532, SC0705, SC0666 descritas em baixo nos Exemplos ou culturas transgênicas de St. Em modalidades adicionais, a composição compreende de cerca de 1% a cerca de 99% em peso da proteína Cry da invenção.
[00232] As proteínas Cry da invenção podem ser usadas em combinação com outros agentes de controle de pragas para aumentar a gama de pragas alvo ou para a prevenção ou gestão da resistência a insetos. Portanto, em algumas modalidades, a invenção proporciona uma composição que controla uma ou mais pragas de plantas, em que a composição compreende uma primeira proteína Cry da invenção e um segundo agente de controle de pragas diferente da primeira proteína Cry. Em outras modalidades, a composição é uma formulação para aplicação tópica a uma planta. Em outras modalidades ainda, a composição é uma planta transgênica. Em modalidades adicionais, a composição é uma combinação de uma formulação aplicada topicamente a uma planta transgênica. Em algumas modalidades, a formulação compreende a primeira proteína Cry da invenção quando a planta transgênica compreende o segundo agente de controle de pragas. Em outras modalidades, a formulação compreende
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117/144 o segundo agente de controle de pragas quando a planta transgênica compreende a primeira proteina Cry da invenção.
[00233] Em algumas modalidades, o segundo agente de controle de pragas pode ser um agente selecionado do grupo consistindo em um pesticida químico, tal como um inseticida, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis {Bt), uma proteína inseticida de
Xenorhabdus, uma proteína inseticida de Photorhabdus, uma proteína inseticida de Brevibacillus laterosporus, uma proteína inseticida de Bacillus sphaericus, um inibidor de proteases (ambos os tipos serina e cisterna), lectinas, alfa-amilase, peroxidase, colesterol oxidase e uma molécula de RNA de fita dupla (dsRNA).
[00234] Em outras modalidades, o segundo agente de controle de pragas é um pesticida químico selecionado do grupo consistindo em piretroides, carbamatos, neonicotinoides, bloqueadores de canais de sódio neuronais, lactonas macrocíclicas inseticidas, antagonistas do ácido gamaaminobutírico (GABA), ureias inseticidas e miméticos de hormônios juvenis. Em outras modalidades, o pesticida químico é selecionado do grupo consistindo em abamectina, acefato, acetamiprida, amidoflumete (S-1955), avermectina, azadiractina, azinfos-metila, bifentrina, binfenazato, buprofezina, carbofurano, clorfenapir, clorfluazurona, clorpirifos, clorpirifos-metila, cromafenozida, clotianidina, ciflutrina, beta-ciflutrina, cialotrina, lambda-cialotrina, cipermetrina, ciromazina, deltametrina, diafentiurona, diazinona, diflubenzurona, dimetoato, diofenolano, emamectina, endossulfano,
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118/144 esfenvalerato, etiprol, fenotiocarbe, fenoxicarbe, fenpropatrina, fenproximato, fenvalerato, fipronil, flonicamida, flucitrinato, tau-fluvalinato, flufenerim (UR-50701), flufenoxurona, fonofos, halofenozida, hexaflumurona, imidacloprida, indoxacarbe, isofenfos, lufenurona, malationa, metaldeido, metamidofos, metidationa, metomil, metopreno, metoxiclor, monocrotofos, metoxifenozida, nitiazina, novalurona, noviflumurona (XDE-007), oxamil, parationa, parationametila, permetrina, forato, fosalona, fosmete, fosfamidona, pirimicarbe, profenofos, pimetrozina, piridalil, piriproxifeno, rotenona, espinosade, espiromesifina (BSN 2060), sulprofos, tebufenozida, teflubenzurona, teflutrina, terbufos, tetraclorvinfos, tiacloprida, tiametoxam, tiodicarbe, tiosultap-sódio, tralometrina, triclorfona e triflumurona, aldicarbe, oxamil, fenamifos, amitraz, quinometionato, clorobenzilato, ciexatina, dicofol, dienoclor, etoxazol, fenazaquina, óxido de fenbutatina, fenpropatrina, fenpiroximato, hexitiazox, propargita, piridabeno e tebufenpirad. Em outras modalidades ainda, o pesticida quimico é selecionado do grupo consistindo em cipermetrina, cialotrina, ciflutrina e beta-ciflutrina, esfenvalerato, fenvalerato, tralometrina, fenoticarbe, metomil, oxamil, tiodicarbe, clotianidina, imidacloprida, tiacloprida, indoxacarbe, espinosade, abamectina, avermectina, emamectina, endosulfano, etiprol, fipronil, flufenoxurona, triflumurona, diofenolano, piriproxifeno, pimetrozina e amitraz.
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119/144 [00235] Em modalidades adicionais, o segundo agente de controle de pragas pode ser uma ou mais de qualquer número de proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis incluindo, mas não se limitando a uma proteína Cry, uma proteína inseticida vegetativa (VIP) e quimeras inseticidas de qualquer uma das proteínas inseticidas precedentes. Em outras modalidades, o segundo agente de controle de praga é uma proteína
Cry selecionada do grupo consistindo em CrylAa,
CrylAl, CrylAc, CrylAd, CrylAe,
CrylAf,
CrylBc,
CrylCa,
CrylEl,
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CrylLa,
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Cry7Ea,
Cry7Ha,
Cry8Al,
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Cry9Ga
CrylOAa, CryllAa, CryllBa, CryllBl, Cryl2Aa,Cryl3Aa,
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120/144
Cryl4Aa, Cryl4Al, Cryl5Aa, Cryl6Aa, Cryl7Aa, Cryl8Aa,
Cryl8Ba, Cryl8Ca, Cryl9Aa, Cryl9Ba, Cryl9Ca, Cry20Aa,
Cry20Ba, Cry21Aa, Cry21Ba, Cry21Ca, Cry21Da, Cry21Ea,
Cry21Fa, Cry21Ga, Cry21Ha, Cry22Aa, Cry22Al, Cry22Ba,
Cry22Bl, Cry23Aa, Cry24Aa, Cry24Ba, Cry24Ca, Cry25Aa,
Cry2 6Aa, Cry27Aa, Cry28Aa, Cry29Aa, Cry29Ba, Cry30Aa,
Cry30Ba, Cry30Ca, Cry30Da, Cry30Dl, Cry30Ea, Cry30Fa,
Cry30Ga, Cry31Aa, Cry31Al, Cry31Ac, Cry31Ad, Cry32Aa,
Cry32Al, Cry32Ba, Cry32Ca, Cry32Cl, Cry32Da, Cry32Ea,
Cry32El, Cry32Fa, Cry32Ga, Cry32Ha, Cry32Hl, Cry32la,
Cry32Ja, Cry32Ka, Cry32La, Cry32Ma, Cry32Ml, Cry32Na,
Cry320a, Cry32Pa, Cry32Qa, Cry32Ra, Cry32Sa, Cry32Ta,
Cry32Ua, Cry33Aa, Cry34Aa, Cry34Al, Cry34Ac, Cry34Ba,
Cry35Aa, Cry35Al, Cry35Ac, Cry35Ba, Cry3 6Aa, Cry37Aa,
Cry38Aa, Cry39Aa, Cry40Aa, Cry40Ba, Cry40Ca, Cry40Da,
Cry41Aa, Cry41Al, Cry41Ba, Cry42Aa, Cry43Aa, Cry43Ba,
Cry43Ca, Cry43Cl, Cry43Cc, Cry44Aa, Cry45Aa, Cry4 6Aa
Cry46Al, Cry47Aa, Cry48Aa, Cry48Al, Cry49Aa, Cry49Al,
Cry50Aa, Cry50Ba, Cry51Aa, Cry52Aa, Cry52Ba, Cry53Aa,
Cry53Al, Cry54Aa, Cry54Al, Cry54Ba, Cry55Aa, Cry5 6Aa,
Cry57Aa, Cry57Al, Cry58Aa, Cry5 9Aa, Cry5 9Ba, Cry60Aa,
Cry60Ba, Cry61Aa, Cry62Aa, Cry63Aa, Cry64Aa, Cry65Aa,
Cry66Aa, Cry67Aa, Cry68Aa, Cry69Aa, Cry69Al, Cry70Aa,
Cry70Ba, Cry70Bl, Cry71Aa, Cry72Aa e Cry73Aa.
[00236] Em modalidades adicionais, ο segundo agente de
controle da praga é uma proteína inseticida vegetativa
Vip3 selecionada do grupo consistindo em Vip3Aal, Vip3Aa2,
Vip3Aa3, Vip3Aa4, Vip3Aa5, Vip3Aa6, Vip3Aa7, Vip3Aa8,
Vip3Aa9, Vip3AalO, Vip3Aall, Vip3Aal2, Vip3Aal3,
Vip3Aal4, Vip3Aal5, Vip3Aal6 , Vip3Aal7, Vip3Aal8,
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Vip3Aal9, Vip3Aa2 0, Vip3Aa21, Vip3Aa22, Vip3Aa2 ,
Vip3Aa2 4, Vip3Aa2 5, Vip3Aa2 6, Vip3Aa2 7, Vip3Aa2 8,
Vip3Aa2 9, Vip3Aa30, Vip3Aa31, Vip3Aa32, Vip3Aa33 ,
Vip3Aa34, Vip3Aa35, Vip3Aa3 6, Vip3Aa37, Vip3Aa38,
Vip3Aa3 9, Vip3Aa4 0, Vip3Aa41, Vip3Aa42, Vip3Aa4 3,
Vip3Aa44, Vip3Abl, Vip3Ab2, Vip3Acl, Vip3Adl, Vip3Ad2, Vip3Ael, Vip3Afl, Vip3Af2, Vip3Af3,
Vip3Agl,Vip3Ag2,Vip3Ag3 HM117633, Vip3Ag4, Vip3Ag5, Vip3Ahl, Vip3Bal, Vip3Ba2, Vip3Bbl, Vip3Bb2 e Vip3Bb3.
[00237] Em outras modalidades ainda, a primeira proteina Cry da invenção e o segundo agente de controle de pragas são coexpressos em uma planta transgênica. Esta coexpressão de mais do que um principio pesticida na mesma planta transgênica pode ser alcançada por manipulação genética de uma planta para conter e expressar todos os genes necessários. Alternativamente, uma planta, Progenitor 1, pode ser geneticamente manipulada para a expressão da proteína Cry da invenção. Uma segunda planta, Progenitor 2, pode ser geneticamente manipulada para a expressão de um segundo agente de controle de pragas. Por cruzamento do Progenitor 1 com o Progenitor 2 são obtidas plantas de descendência que expressam todos os genes introduzidos nos Progenitores 1 e 2.
[00238] Em outras modalidades, a invenção proporciona uma planta transgênica empilhada resistente a infestação por pragas de plantas compreendendo uma sequência de DNA codificando um dsRNA para supressão de um gene essencial em uma praga alvo e uma sequência de DNA codificando uma proteína Cry da invenção exibindo atividade biológica contra a praga alvo. Foi relatado que os dsRNAs são
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122/144 ineficazes contra certas pragas de lepidópteros (Rajagopol et al. 2002. J. Biol. Chem. 277: 468-494), provavelmente devido ao elevado pH do mesentério que desestabiliza o dsRNA. Portanto, em algumas modalidades onde a praga alvo é uma praga de lepidópteros, uma proteina Cry da invenção atua para reduzir transientemente o pH do mesentério que serve para estabilizar o dsRNA coingerido tornando o dsRNA eficaz no silenciamento dos genes alvo.
[00239] Adicionalmente a proporcionar composições, a invenção proporciona métodos de produção de uma proteina Cry tóxica para uma praga de lepidópteros. Um tal método compreende cultura de uma célula hospedeira não humana transgênica que compreende um polinucleotideo ou um gene quimérico ou um vetor recombinante da invenção sob condições nas quais a célula hospedeira produz uma proteína tóxica para a praga de lepidópteros. Em algumas modalidades, a célula hospedeira não humana transgênica é uma célula de planta. Em algumas modalidades diferentes, a célula de planta é uma célula de mais. Em outras modalidades, as condições sob as quais a célula de planta ou célula de mais são cultivadas incluem luz solar natural. Em outras modalidades, a célula hospedeira não humana transgênica é uma célula bacteriana. Em outras modalidades ainda, a célula hospedeira não humana transgênica é uma célula de levedura.
[00240] Em outras modalidades do método, a praga de lepidópteros é selecionada do grupo consistindo em broca europeia do milho (Ostrinla nubilalis), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho do milho (Spodcptera frugiperda), lagarta da espiga (Helicoverpa
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123/144 zea) , broca da cana {Diatraea saccharalis), lagarta-daso ja {Anticarsia gemmatalis) , lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens) , broca do milho do sudoeste {Diatraea grandiosella) , lagarta-rosca do oeste {Richia albicosta), lagarta do tabaco {Heliothis virescens), broca asiática do milho {Ostrinia furnacalis), traça do algodão {Helicoverpa armigera), broca riscada do tronco {Chilo suppressalis), broca do entrenó rosa {Sesamia calamistis) ou lagarta enroladora da folha do arroz {Cnaphalocrocis medinalis) e qualquer sua combinação.
[00241] Em outras modalidades do método, o gene quimérico compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-2 9 ou um seu fragmento codificante de toxina. Em outras modalidades ainda, a proteina produzida compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13 ou um seu fragmento de toxina.
[00242] Em algumas modalidades do método, o gene quimérico compreende uma sequência de nucleotideos que tem códons otimizados para expressão em uma planta. Em outras modalidades, o gene quimérico compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-22 ou um seu fragmento codificante de toxina. Em modalidades adicionais, a proteina produzida compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-6 ou um seu fragmento de toxina.
[00243] Em modalidades adicionais, a invenção proporciona um método de produção de uma planta transgênica resistente a pragas (p.ex., resistente a insetos), compreendendo: introdução em uma planta de um polinucleotideo, um gene quimérico, um vetor recombinante, um cassete de expressão ou um polinucleotideo da invenção compreendendo uma
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124/144 sequência de nucleotideos que codifica uma proteína Cry da invenção, em que a proteína Cry codificada é expressa na planta, conferindo deste modo à planta resistência a pelo menos uma praga de insetos lepidópteros e produção de uma planta transgênica resistente a insetos. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo, gene quimérico, vetor recombinante, cassete de expressão ou polinucleotídeo compreende uma sequência de nucleotideos que codifica qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-13. Em outras modalidades, o polinucleotídeo, gene quimérico, vetor recombinante, cassete de expressão ou polinucleotídeo compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 17-22. Em outras modalidades ainda, a planta transgênica resistente a pragas é resistente pelo menos à broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) ou lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) em comparação com uma planta de controle não tendo o polinucleotídeo, gene quimérico, vetor recombinante, cassete de expressão ou polinucleotídeo da invenção. Em algumas modalidades, a introdução é alcançada por transformação da planta. Em outras modalidades, a introdução é alcançada por cruzamento de uma primeira planta compreendendo o polinucleotídeo, gene quimérico, vetor recombinante, cassete de expressão ou polinucleotídeo da invenção com uma segunda planta diferente resultando na semente e plantas da descendência tendo o polinucleotídeo, gene quimérico, vetor recombinante, cassete de expressão ou polinucleotídeo incorporado no seu genoma.
[00244] Em algumas modalidades, uma planta transgênica da invenção que é resistente pelo menos à broca europeia do
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125/144 milho (Ostrinia nubilalis) ou lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) é adicionalmente resistente a pelo menos um inseto adicional, em que o inseto adicional inclui, mas não está limitado a, lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda), lagarta da espiga (Helicoverpa zea) , broca da cana (Diatraea saccharalis), lagarta-dasoja (Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsa-medideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) , lagarta-rosca do oeste (Richia albicosta), lagarta do tabaco (Heliothis virescens) , broca asiática do milho (Ostrinia furnacalis) , traça do algodão (Helicoverpa armigera) , broca riscada do tronco (Chilo suppressalis), broca do entrenó rosa (Sesamia calamistis) ou lagarta enroladora da folha do arroz (Cnaphalocrocis medinalis) e qualquer sua combinação.
[00245] Em modalidades adicionais, um método de controle de pelo menos uma praga de insetos lepidópteros como a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) ou lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) é proporcionado, compreendendo o método administração aos insetos de uma quantidade eficaz de uma proteina Cry da invenção. Para ser eficaz, a proteína Cry é em primeiro lugar ingerida oralmente pelo inseto. No entanto, a proteína Cry pode ser administrada ao inseto de muitos modos reconhecidos. Os modos para administrar uma proteína oralmente a um inseto incluem, mas não estão limitados a, proporcionar a proteína (1) em uma planta transgênica, em que o inseto come (ingere) uma ou mais partes da planta transgênica, ingerindo deste modo o polipeptideo que é expresso na planta transgênica; (2) em uma(s) composição(ões) de proteína(s) formulada(s) que
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126/144 pode (m) ser aplicada (s) a, ou incorporada (s) em, por exemplo, meios de crescimento de insetos; (3) em uma(s) composição(ões) de proteína(s) que pode(m) ser aplicada(s) à superfície, por exemplo, pulverizada(s), sobre a superfície de uma parte da planta, a qual é então ingerida pelo inseto quando o inseto come uma ou mais das partes da planta pulverizadas; (4) uma matriz isca ou (5) qualquer outro sistema de administração de proteínas reconhecido na técnica. Assim pode ser usado qualquer método de administração oral a um inseto para administrar as proteínas Cry tóxicas da invenção. Em algumas modalidades particulares, a proteína Cry da invenção é administrada oralmente a um inseto, em que o inseto ingere uma ou mais partes de uma planta transgênica.
[00246] Em outras modalidades, a proteína Cry da invenção é administrada oralmente a um inseto, em que o inseto ingere uma ou mais partes de uma planta pulverizada com uma composição compreendendo as proteínas Cry da invenção. A administração das composições da invenção à superfície de uma planta pode ser feita usando qualquer método conhecido dos peritos na técnica para aplicação de compostos, composições, formulações e similares à superfícies de plantas. Alguns exemplos não limitantes de administração ou contato de uma planta ou sua parte incluem pulverização, empoeiramento, aspersão, dispersão, nebulização, atomização, difusão, embebição, injeção no solo, incorporação no solo, encharcamento (p.ex., tratamento na raiz, no solo), imersão, vazamento, revestimento, infiltração da folha ou haste, cobertura lateral ou tratamento de sementes e similares e suas
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127/144 combinações. Estes e outros procedimentos para contato de uma planta ou sua parte com composto(s) , composição(ões) ou formulação (ões) são bem conhecidos dos peritos na técnica.
[00247] Em algumas modalidades, a invenção engloba um método de proporcionar a um agricultor um meio de controle de uma praga de lepidópteros, compreendendo o método fornecimento ou venda ao agricultor de material de planta tal como uma semente, compreendendo o material de planta um polinucleotideo, gene quimérico, cassete de expressão ou um vetor recombinante capaz de expressar uma proteina Cry da invenção em uma planta desenvolvida a partir da semente, como descrito acima.
[00248] As modalidades desta invenção podem ser mais bem entendidas por referência aos seguintes exemplos. A descrição anterior e seguinte de modalidades da invenção e as várias modalidades não se destinam a limitar as reivindicações, mas são ao invés ilustrativas das mesmas. Portanto será entendido que as reivindicações não estão limitadas aos detalhes específicos destes exemplos. Será apreciado pelos peritos na técnica que outras modalidades da invenção podem ser praticadas sem se afastarem do espírito e do escopo da divulgação, o escopo da qual é definido pelas reivindicações anexas.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Identificação de Estirpes de Bt Contendo Novas Proteínas Cry [00249] Isolados de Bacillus thuringiensis presentes em coleções correntes foram cultivados a partir de esporos e mantidos em placas de ágar T3 + penicilina. Cada isolado
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128/144 foi cultivado aerobicamente em blocos de 24 poços profundos durante cerca de 10 dias a 28 °C até à esporulação, que foi verificada por coloração com azul de Coomassie/ácido acético e visualização com um microscópio. Após esporulação, ambas as frações solúveis e insolúveis foram testadas quanto à atividade contra espécies de lepidópteros de interesse. As frações foram testadas em um bioensaio de contaminação da superfície, onde as frações foram vertidas sobre uma dieta artificial multiespécie. Cada isolado foi rastreado contra pelo menos quatro espécies de lepidópteros, incluindo Helicoverpa zea (lagarta da espiga), Agrotis ipsilon (lagarta-rosca), Ostrinia nubilalis (broca europeia do milho) e Spodoptera frugiperda (lagarta-do-cartucho do milho) com um tamanho de amostra de 12 larvas neonatais. A duração de cada ensaio foi cerca de 7 dias à temperatura ambiente; as placas foram pontuadas quanto à mortalidade bem como inibição do crescimento das larvas. A mortalidade observada a um aumento de 30% em relação ao controle negativo foi considerada ativa. Com base no teste inicial de insetos, três estirpes de Bt, designadas SC0532, SC0666 e SC0705, foram selecionadas para análise adicional.
Exemplo 2. Montagem e Análise do Genoma [00250] Genes cry de Bt da invenção foram isolados a partir das estirpes identificadas no Exemplo 1 usando uma abordagem de sequenciamento do genoma inteiro. Resumidamente, DNA de Bacillus foi cortado usando um dispositivo de ultrassons Covaris S2 (Covaris, Inc., Woburn, MA) com o programa DNA_400bp definido no ciclo de trabalho: 10%; intensidade: 4; ciclos/bombada: 200. O DNA
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129/144 foi tratado com o módulo de reparação final NEBNext® Ultra™/módulo dA-tailing (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA). Os adaptadores de indices de Biooscience 157 (1-27 Brasil, 28-57 EUA, RU e Suíça) foram ligados usando NEB Quick Ligation™ como descrito pelo fornecedor (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA). As ligações foram limpas usando esférulas Agencourt AMPure XP como descrito pelo fornecedor (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN).
[00251] A biblioteca foi fracionada por tamanho como se segue: Uma amostra de 50 pL foi misturada com 45 pL mistura de esférulas a 75% (esférulas AMPure a 25% mais solução de NaCl/PEG a 75%; TekNova, Inc. Hollister, CA, EUA; # de cat P4136) . A mistura foi agitada e colocada em um suporte magnético. O sobrenadante resultante foi transferido para um novo poço e 45 pL de mistura de esférulas a 50% (esférulas AMPure a 50% mais solução de NaCl/PEG a 50%; # de cat da TekNova P4136) foram adicionados. Esta mistura foi agitada e colocada em um suporte magnético. O sobrenadante resultante foi removido e as esférulas foram lavadas com etanol a 80%. 25 pL de tampão de tampão de eluição (EB) foram adicionados e a mistura colocada em um suporte magnético. O sobrenadante final resultante foi removido e colocado em um tubo de 1,5 mL. Este método originou bibliotecas na gama de tamanhos de 525 pares de bases (pb) de DNA (inserção mais adaptador).
[00252] A biblioteca de DNA dimensionada foi amplificada usando KAPA Biosystem HiFi Hot Start (Kapa Biosystems, Inc., Wilmington, MA) usando as seguintes condições de ciclos: [98 °C, 45 s] ; 12 x [98 °C, 15 s, 60 °C, 30 s, 72 °C, 30 s] ; [72 °C, 1 min] . Cada reação continha: 5 pL de
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DNA da biblioteca, 1 pL de iniciador universal da Bioscience (25 uM) , 18 pL de água estéril, 1 pL de iniciador indexado da Bioscience (25 uM), 25 pL de 2X KAPA HiFi polimerase.
[00253] As bibliotecas foram analisadas no 2100 Bioanalyzer da Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) usando chips de Elevada Sensibilidade para determinar a gama de tamanhos da biblioteca e tamanho médio de inserção. Todas as bibliotecas foram processadas quanto a sequenciamento final emparelhado (PE) (100 ciclos por leitura; 12-24 bibliotecas por pista) em um sistema de sequenciamento HiSeq 2500 usando protocolos de sequenciamento padrão do fabricante (Illumina, Inc., San Diego, CA).
[00254] Uma ferramenta de análise computacional de Bacillus desenvolvida para identificar e caracterizar genes tipo Cry foi usada para priorização dos lideres para testes laboratoriais adicionais.
[00255] A montagem e análise do genoma bem como a análise da biblioteca genômica descrita acima levaram à identificação de três genes tipo Cryl nas estirpes de Bacillus thuringiensis com toxicidade para pelo menos a broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis) ou lagarta da espiga (Helicoverpa zea) . As características de identificação dos genes e proteínas tipo Cryl são mostradas na Tabela 1.
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Tabela 1. Genes/proteínas Cry identificados em estirpes de Bacillus thuringiensis.
Estirpe Proteína/ Gene Nome Membro da Família Cry Mais Próximo Peso Molecular (kD) SEQ ID NO: de aminoácidos SEQ ID NO: de nucleotídeos
SC0532 BT2CrylJ CrylJa 132, 6 1 14
SC0705 BT25CrylI Cryllg 79, 8 2 15
SCO 6 6 6 BT53CrylJ CrylJc 133, 3 3 16
Exemplo 3. Homologia de BT2CrylJ, BT25CrylI e BT53CrylJ com Proteínas Cry de Bt Conhecidas [00256] A comparação das sequências de aminoácidos das proteínas na Tabela 1 com a base de dados não redundante (nr) mantida pelo National Center for Biotechnology Information (NCBI) (world wide web em ncbi.nlm.nih.gov), usando o algoritmo BLAST, revelou que as proteínas têm a identidade mais elevada com proteínas Cry, particularmente aquelas na família Cryl. Mais especificamente, BT2CrylJ tem cerca de 98% de identidade com proteínas CrylJa, sequências exemplificativas das quais podem ser encontradas no NCBI sob os números de acesso AAA22341 (CrylJal), HM070030 (CrylJa2) e JQ228425 (CrylJa3). BT25CrylI tem cerca de 95% de identidade com proteínas Cryllg, uma sequência exemplificativa da qual pode ser encontrada no NCBI sob o número de acesso KC156701 (cryllgl). BT53CrylJ tem cerca de 99% de identidade com proteínas CrylJc, exemplos das quais podem ser encontrados no NCBI sob os números de acesso AAC31092 (CrylJcl) e AAQ52372 (CrylJc2).
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Exemplo 4. Expressão de Proteínas de Bt em Células Hospedeiras Recombinantes [00257] As proteínas Cry descritas nos Exemplos 2 e 3 foram expressas em células hospedeiras bacterianas recombinantes através de um vetor de vai-vem designado pCIB5634', concebido para expressão em ambas E. coli e Bacillis thuringiensis. 0 vetor pCIB5634' compreende um promotor de CrylAc modificado variante (pb 12-97 de SEQ ID NO: 30) que melhora a expressão do gene Cry de Bt clonado e um marcador de resistência à eritromicina em relação ao promotor de CrylAc nativa. Por exemplo, uma sequência codificante de BT25CrylI foi clonada no vetor pCIB5634' usando locais de restrição BamHI e Saci resultando em um vetor de vai-vem de expressão de Cry compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 30.
[00258] Expressão em Bacillus. Cassetes de expressão compreendendo a sequência codificante de proteínas Cry de interesse foram transformados em uma estirpe de Bacillus thuringiensis (Bt) sem cristais não tendo atividade inseticida de fundo observável através de eletroporação e estirpes transgênicas de Bt foram selecionadas em placas de ágar contendo eritromicina. As estirpes transgênicas de Bt selecionadas foram cultivadas até à fase de esporulação em meio T3 a 28 °C durante 4-5 dias. Péletes de células foram coletados e lavados iterativamente antes da solubilização da proteína expressa em tampão de carbonato (50 mM) a pH elevado contendo DTT a 2 mM.
[00259] Expressão em E. coli. As proteínas Cry foram expressas em estirpes de E. coli usando vetores pET28a ou pET29a (Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha). Os construtos
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133/144 foram transformados por eletroporação e clones transgênicos de E. coli foram selecionados em placas de ágar contendo canamicina. Estirpes transgênicas de E. coli selecionadas foram cultivadas e a expressão de proteínas Cry induzida usando indução por IPTG a 28 °C. As células foram ressuspensas em tampão de carbonato (50 mM) a pH elevado contendo DTT < 2 mM e depois quebradas usando um homogenizador LV-1 da Microfluidics.
[00260] Análise da Expressão. Os lisados celulares resultantes de estirpes transgênicas de Bt ou E. coli foram depois clarificados através de centrifugação e amostras foram analisadas quanto à pureza através de SDSPAGE e eletroferograma usando um sistema Experion da BioRad (Biorad, Hercules, CA). As concentrações totais de proteína foram determinadas através de ensaio Bradford ou Thermo 660. As proteínas Cry purificadas foram depois testadas em bioensaios descritos em baixo.
Exemplo 5. Atividade de Proteínas Cry em Bioensaios [00261] As proteínas Cry produzidas no Exemplo 4 foram testadas contra uma ou mais das seguintes espécies de pragas de insetos usando um método de bioensaio de dieta artificial reconhecido na técnica: lagarta-do-cartucho do milho (FAW; Spodoptera frugiperda), lagarta da espiga (CEW; Helicoverpa zea), broca europeia do milho (ECB; Ostrinia nubilalis), lagarta-rosca (BCW; Agrotis ipsilon), broca da cana (SCB; Diatraea saccharlis), lagarta-da-soja (VBC; Anticarsia gemmatalis), lagartafalsa-medideira (SBL; Pseudoplusia includens), broca do milho do sudoeste (SWCB; Diatraea grandiosella), broca do milho do sudoeste (WBCW; Striacosta albicosta), lagarta
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134/144 do tabaco (TBW; Heliothis virescens) , broca asiática do milho (ACB; Ostrinia furnacalis) , traça do algodão (CBW; Helicoverpa armigera) , broca riscada do tronco (SSB; Chilo suppressalis) , broca do entrenó rosa (PSB; Sesamia inferens) ou lagarta enroladora da folha do arroz (RLF; Cnaphalocrocis medinails).
[00262] Uma quantidade igual de proteina em solução foi aplicada à superficie de uma dieta artificial de insetos (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ) em placas de 24 poços.
Após a superficie da dieta ter secado, larvas das espécies de insetos sendo testadas foram adicionadas a cada poço. As placas foram seladas e mantidas às condições laboratoriais ambientes no que diz respeito à temperatura, iluminação e umidade relativa. Um grupo de controle positivo consistiu em larvas expostas a uma estirpe de Bacillus de tipo selvagem muito ativa e de amplo espectro. Os grupos de controle negativo consistiram em larvas expostas a dieta de insetos tratada somente com a solução tampão ou vetor vazio e larvas na dieta de insetos não tratada; i.e.f somente dieta. A mortalidade foi avaliada após cerca de 120 horas e pontuada em relação aos controles .
[00263] Os resultados são mostrados na Tabela 2, onde um significa nenhuma mortalidade em comparação com o grupo de controle, um + /- significa 0-10% de mortalidade em comparação com o grupo de controle (esta categoria inclui também 0% de mortalidade com forte inibição de crescimento larval), um + significa 10-25% de atividade em comparação com o grupo de controle, um ++ significa 26-75% de mortalidade em comparação com o grupo de
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135/144 controle e um +++ significa 76-100% de mortalidade em comparação com o grupo de controle.
Tabela 2. Resultados de bioensaios com Proteínas Cry.
BT Proteínas Espécie de Insetos
FAW CEW ECB BCW SCB VBC SBL SWCB TBW
BT2CrylJ + /- + +++ +++ +++ + + + ++ + + + + + +
BT25CrylI — — + — — + /- +/- —
BT53CrylJ — +++ + + +++ +++ +++ +++ +/- +++
Exemplo 6. Mutagênese da proteína BT2CrylJ [00264] A proteina BT2CrylJ tem 98% de identidade com as proteínas CrylJa conhecidas CrylJal (No. de Acesso do NCBI AAA22341), CrylJa2 (No. de Acesso do NCBI HM070030) e CrylJa3 (No. de Acesso do NCBI JQ228425) . Com base na nomenclatura padrão de proteínas Cry de Bt (Crickmore et al. 1998. Microbiol. Molecular Biol. Rev. 62: 807-813), a BT2CrylJ seria o mais provavelmente designada uma proteína CrylJa. Dada a identidade muito elevada entre BT2CrylJa e CrylJal, tendo somente 24 diferenças de aminoácidos ao longo de 1167 aminoácidos totais, se pode esperar que as duas proteínas teriam o mesmo espectro de atividade e especificidade. Surpreendentemente, BT2CrylJa parece ter um espectro de atividade mais amplo ou atividade específica mais elevada do que as proteínas CrylJa conhecidas. Por exemplo, os resultados de alguma investigação sugerem que CrylJal tem atividade mínima contra a lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda) , lagarta da espiga (Helicoverpa zea) e broca
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136/144 europeia do milho (Ostrinia nubilalis) e nenhuma atividade contra a lagarta-rosca (Agrotis ipsilon) (Patentes dos EUA Nos. 5,322,687 e 6,593,293), ao passo que BT2CrylJa tem elevada atividade contra a lagarta-do-cartucho do milho, lagarta da espiga, broca europeia do milho e lagartarosca. Outros relatórios sugerem que CrylJal tem alguma atividade contra a traça do algodão (Helicoverpa armigera), mas nenhuma atividade contra a traça de dorso diamante ou nóctua (Spodoptera exígua) (Choi et al. 2007. J. Microbiol. Biotechnol. 17: 1498-1503). Outros relatórios ainda sugerem que CrylJa2 é ativa contra a traça de dorso diamante e CrylJa3 é ativa contra a broca asiática do milho (Ostrinia furnacalis) (Hai-Shou et al. 2015. Genetics 11: 1145-1451).
[00265] Vinte e três das vinte e quatro diferenças de aminoácidos entre BT2CrylJ da invenção e CrylJal estão na região das alfa-hélices 3 a 6 abrangendo o dominio I. A última diferença de aminoácidos está na região no dominio II conhecida como alfa-8 de Alça, que é uma região que se acredita ser importante na ligação dos receptores do intestino dos insetos. Para se determinar quais dos aminoácidos do dominio I podem ser importantes na modulação da atividade de proteínas CrylJ foram feitas mutações na sequência de aminoácidos de BT2CrylJ (SEQ ID NO: 1) em três blocos, que correspondem essencialmente a regiões abrangendo a alfa-hélice 3, alfa-hélice 4 e alfahélices 5 & 6, respectivamente. Os três blocos de mutação foram designados: BLK-1 compreendendo as seguintes substituições de aminoácidos, A97T, S105N, L108I, G110A, K118S e T119D, que abrange a alfa-hélice 3 e um aminoácido
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137/144 adicional na alça entre as alfa-hélices 3 e 4; BLK-2 compreendendo as seguintes substituições de aminoácidos, T123E, R126K, T130I, E131D, I136L, A138G, Q139L, V149I e V150I, que abrange a alfa-hélice 4 e dois aminoácidos na alça entre as alfa-hélices 4 e 5; e BLK-3 compreendendo as seguintes substituições de aminoácidos, L158S, T161V, V176I, T186K, V196I, N197R, R198E e G200H, que abrange a alfa-hélice 5 e uma porção da alfa-hélice 6. Proteínas BT2CrylJ compreendendo combinações dos três blocos de mutação foram também preparadas resultando em um total de sete proteínas BT2CrylJ modificadas que foram testadas contra insetos alvo.
[00266] Construtos compreendendo cada um dos blocos de mutação e combinações dos blocos de mutação foram preparados por síntese de fragmentos de polinucleotídeos 5' NcoI-BglII de aproximadamente 663 pb de SEQ ID NO: 14 codificando os aminoácidos substituídos na região desejada da sequência de aminoácidos de BT2CrylJ. Cada fragmento de polinucleotídeo foi clonado em um vetor compreendendo a sequência codificante de BT2CrylJ nativa de comprimento total cortada com enzimas NcoI-BglII. Cada fragmento substituiu depois a extremidade 5' do gene de comprimento total resultando em uma sequência codificante de comprimento total (SEQ ID NOs: 23-29) codificando uma proteína BT2CrylJ modificada (SEQ ID NOs: 7-13). Cada vetor foi clonado em uma estirpe de Bacillus thuringiensis menos cristais como descrito acima.
[00267] As proteínas BT2CrylJ modificadas foram expressas como descrito acima e testadas contra três espécies de pragas de insetos na Família Crambidae, broca europeia do
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138/144 milho (Ostrinia nubilalis) , broca da cana (Diatraea saccharalis) e broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella), e seis espécies de pragas de insetos na Familia Noctuidae, lagarta-rosca (Agrotis ipsilon), lagarta-do-cartucho do milho (Spodoptera frugiperda), lagarta da espiga (Heli coverpa zea), lagarta-falsamedideira (Chrysodeixis includens), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis) e lagarta do tabaco (Heliothis virescens) . A presença de cada proteina BT2CrylJ modificada foi confirmada por SDS-PAGE corado com Coomassie usando as células de Bt transportando o vetor vazio como um controle negativo. A atividade inseticida, como percentagem de mortalidade corrigida, das sete proteínas BT2CrylJ modificadas em comparação com uma proteína BT2CrylJ nativa (SEQ ID NO: 1) e um controle de vetor vazio é mostrada na Tabela 3.
Tabela 3. Atividade inseticida de proteínas BT2CrylJ modificadas.
Percentagem de Mortalidade Corrigida
Proteína Modificada ou Controles ECB SCB SWCB BCW FAW CEW SBL VBC TBW
BT0002CrylJa 83 100 75 75 100 75 100 100 100
BT21J-BLK-1 0 0 0 0 0 8 42 0 92
BT21J-BLK-2 8 0 0 8 0 8 100 67 42
BT21J-BLK-3 75 92 75 92 83 100 100 100 100
BT21J-BLK-1/2 83 75 75 67 25 42 100 100 92
BT21J-BLK-2/3 8 8 0 42 83 50 100 100 92
BT21J-BLK-1/3 0 0 0 0 0 8 0 0 0
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BT21J-BLK- 1/2/3 83 100 75 92 92 92 100 100 100
Vetor Vazio 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Exemplo 7. Vetorização de Genes para Expressão em Plantas [00268] Antes da expressão em plantas, um polinucleotídeo sintético compreendendo uma sequência de nucleotideos tendo códons otimizados para expressão na planta e codificando uma proteína Cry da invenção, tal como uma BT2CrylJ (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO) ou uma sequência variante (SEQ ID NO: 4), BT25CrylI (SEQ ID NO: 2) ou uma sequência variante (SEQ ID NO: 5) ou BT53CrylJ (SEQ ID NO: 3) ou uma sequência variante (SEQ ID NO: 6), é sintetizado por métodos conhecidos na técnica. Para este exemplo foi preparado um primeiro cassete de expressão compreendendo um promotor de ubiquitina do mais (Ubil) operacionalmente ligado à sequência codificante sintética de BT53CrylJ (SEQ NO ID: 19) que está operacionalmente ligada a um terminador da ubiquitina (Ubi361) e foi preparado um segundo cassete de expressão compreendendo um promotor da ubiquitina do mais 1 (Ubil) operacionalmente ligado a uma sequência codificante de fosfomanose isomerase (PMI) que está operacionalmente ligada a um terminador Ubil do mais. A expressão de PMI permite a seleção positiva de plantas transgênicas em manose. Ambos os cassetes de expressão foram clonados em um vetor binário (SEQ ID NO: 31) para uso na transformação de mais mediada por Agrobacterium.
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Exemplo 8. Expressão e Atividade de Proteínas Cry em Plantas de Mais [00269] A transformação de embriões de mais imaturos foi realizada essencialmente como descrito em Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798 803. Brevemente, a estirpe de Agrobacterium LBA4404 (pSBl) compreendendo um vetor binário descrito no Exemplo 7 foi cultivada em meio sólido YEP (extrato de levedura (5 g/L), peptona (10 g/L) , NaCl (5 g/L), ágar a 15 g/L, pH 6,8) durante 2-4 dias a 28 °C. Aproximadamente 0,8 X 109 células de Agrobacterium foram suspensas em meio LS-inf suplementado com As a 100 μΜ. As bactérias foram pré-induzidas em este meio durante aproximadamente 30-60 minutos.
[00270] Embriões imaturos de uma linha de mais endogâmico foram excisados a partir de espigas com cerca de 8-12 dias de idade para LS-inf + As a 100 μΜ liquido. Os embriões foram enxaguados uma vez com meio de infeção fresco. Solução de Agrobacterium foi depois adicionada e os embriões foram submetidos a vórtice durante cerca de 30 segundos e deixados assentar com as bactérias durante 5 minutos. Os embriões foram depois transferidos com o escutelo para cima para o meio LSAs e cultivados no escuro durante dois a três dias. Subsequentemente, entre aproximadamente 20 e 25 embriões por placa de Petri foram transferidos para meio LSDc suplementado com cefotaxima (250 mg/L) e nitrato de prata (1,6 mg/L) e cultivados no escuro a aproximadamente 28 °C durante 10 dias.
[00271] Os embriões imaturos, produzindo calo embriogênico, foram transferidos para meio LSD1M0.5S. As culturas foram selecionadas em este meio durante aproximadamente 6
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141/144 semanas com um passo de subcultura em cerca de 3 semanas. Os calos sobreviventes foram transferidos para meio Regl suplementado com manose. Após cultura na luz (regime de 16 horas de luz/8 horas de escuro), os tecidos verdes foram depois transferidos para meio Reg2 sem reguladores de crescimento e incubados durante cerca de 1-2 semanas. As plântulas foram transferidas para caixas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago, Ill.) contendo meio Reg3 e cultivadas na luz. Após cerca de 2-3 semanas, as plantas foram testadas quanto à presença dos genes PMI e do gene Bt53crylJ por PCR. As plantas positivas do ensaio de PCR foram transferidas para uma estufa para avaliação adicional.
[00272] As plantas transgênicas de múltiplos eventos independentes foram avaliadas quanto ao número de cópias (determinado por análise Taqman), nivel de expressão de proteina (determinado por ELISA) e eficácia contra espécies de pragas de insetos de interesse em bioensaios de excisão de folha. Especificamente, o tecido de plantas foi excisado a partir de 25 eventos de cópia única (etapa V3-V4) e infestado com larvas neonatais de uma praga alvo, depois incubado à temperatura ambiente durante cerca de 5 dias. Discos de folha de plantas transgênicas expressando a proteína BT53CrylJ variante (SEQ ID NO: 6) foram testados contra a lagarta da espiga (Helicoverpa zea; CEW), lagarta-rosca (Agrotis ipsilon; BCW) e broca da cana (Diatraea saccharalis; SCB).
[00273] Os níveis de expressão da proteína BT53CrylJ nos 25 eventos transgênicos variaram de cerca de 3 ng/mg de TSP a cerca de 11 ng/mg de TSP. Os resultados do bioensaio de
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142/144 plantas confirmaram que plantas de mais estavelmente transformadas expressando uma proteína BT53CrylJ são tóxicas para uma ou mais pragas de insetos lepidópteros com 15/25 plantas tendo atividade contra CEW, 7/25 plantas tendo atividade contra BCW e 11/25 plantas tendo atividade contra SCB.
Exemplo 9. Mutação de um Gene Codificando Proteína Cry Compreendido em uma Planta Transgênica [00274] 0 seguinte exemplo ilustra o uso de edição do genoma para incorporar mutações em um gene codificando uma proteína CrylJ da invenção, incluindo, mas não se limitando a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 e
SEQ ID NO: 6, compreendido em uma planta de mais transgênica.
[00275] A modificação do genoma visada, também conhecida como edição do genoma, é útil para introdução de mutações em sequências de DNA específicas. Estas tecnologias de edição do genoma, que incluem nucleases de dedos de zinco (ZNFs), nucleases efetoras tipo ativadores da transcrição (TALENS), meganucleases e Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) têm sido aplicadas com sucesso a mais do que 50 diferentes organismos incluindo plantas de cultura. Ver, p.ex., Belhaj, K., et al., Plant Methods 9, 39 (2013); Jiang, W., et al., Nucleic Acids Res, 41, el88 (2013) . O sistema CRISPR/Cas para edição do genoma é baseado na expressão transiente de nuclease Cas9 e um RNA guia único (sgRNA) manipulado que especifica a sequência de polinucleotídeo visada.
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143/144 [00276] Cas9 é uma grande DNA nuclease monomérica guiada para uma sequência alvo de DNA com o auxílio de um complexo de dois RNAs não codificantes de 20 nucleotídeos (nt): CRIPSR RNA (crRNA) e crRNA transativante (tracrRNA), que estão funcionalmente disponíveis como quimera de RNA sintético único. A proteína Cas9 contém dois domínios de nuclease homólogos com nucleases RuvC e NHN. O domínio de nuclease NHN diva a fita de DNA complementar ao passo que o domínio tipo RuvC diva a fita não complementar e, como resultado, um corte cego é introduzido no DNA de crylJ alvo.
[00277] Quando a Cas9 e o sgRNA são transientemente expressos em células de mais vivos, quebras de fita dupla (DSBs) no DNA de crylJ visado específico é criado no mais transgênico. Mutação no local de quebra é introduzida através de vias de união de extremidades não homólogas e reparação de DNA dirigida por homologia.
[00278] Mutações específicas, por exemplo as mutações BLK1 descritas acima, são introduzidas no gene codificando BT2CrylJ ou uma sua variante, tal como SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 4, através do uso de plasmídeos recombinantes expressando a nuclease Cas9 e o alvo sgRNA que tem códons otimizados para a sequência de crylJ no mais transgênico. A implementação do método é por um método de agroinfiltração com Agrobacterium tumufaciens transportando o plasmídeo binário abrigando a sequência alvo especificada de interesse de crylJ. Após o sgRNA se ligar à sequência codificante de crylJ, a nuclease Cas9 faz cortes específicos na sequência codificante e introduz as mutações BLK1 durante a reparação do DNA. Assim, o gene crylJ agora mutado codificará uma proteína CrylJ
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modificada, tal como SEQ ID NO: 7, onde uma mutação na
posição 97 substitui 1 Ala (A) with Thr (T) ; uma mutação na
posição 105 substitui Ser (S) por Asn (N) ; uma mutação na
posição 108 substitui Leu (L) por Ile (I) ; uma mutação na
posição 110 substitui Gly (G) por Ala (A) ; uma mutação na
posição 118 substitui a Lys (K) por Ser (S) e uma mutação na posição 119 substitui Thr (T) por Asp (D). As células de plantas compreendendo polinucleotídeos crylJ mutados são rastreados por PCR e sequenciamento. Os calos que abrigam mutações no gene crylJ são induzidos a regenerarem plantas para avaliação do fenótipo para atividade inseticida modulada da proteína CrylJ modificada expressa.

Claims (20)

  1. Reivindicações
    1. Proteína Cry recombinante que é tóxica para uma praga de lepidópteros, caracterizada pelo fato de que a proteína Cry compreende (a) uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 95% a pelo menos 99% de identidade de sequências com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1-3 ou seus fragmentos de toxina; ou (b) uma sequência de aminoácidos que é codificada por uma sequência de nucleotídeos que tem pelo menos 95% a pelo menos 99% de identidade de sequências com uma sequência de nucleotídeos de qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-2 9 ou seus fragmentos codificantes de toxina.
  2. 2. Proteína Cry, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína Cry é a) uma proteína Cryll ou CrylJ; ou b) uma proteína Cryllg; ou c) uma proteína CrylJa ou CrylJc.
  3. 3. Proteína Cry, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a) a proteína Cryllg compreende SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 5; ou b) a proteína CrylJa compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NOs: 7-13 e um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 ou qualquer uma de SEQ ID NOs: 7-13; ou c) a proteína CrylJc compreende SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 ou um fragmento de toxina de SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 6.
  4. 4. Proteína Cry, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a praga de lepidópteros é selecionada do grupo consistindo em broca europeia do milho (Ostrinia nubilalis), lagarta-do-cartucho do milho
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    2/5 (Spodoptera frugiperda), lagarta da espiga (Helicoverpa zea) , broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis), lagarta-falsamedideira (Chrysodeixis includens), broca do milho do sudoeste (Diatraea grandiosella) , lagarta-rosca do oeste (Richia albicosta), lagarta do tabaco (Heliothis virescens) , broca asiática do milho (Ostrinia furnacalis) , traça do algodão (Heli coverpa armigera) , broca riscada do tronco (Chilo suppressalis) , broca do entrenó rosa (Sesamia calamistis) e lagarta enroladora da folha do arroz (Cnaphalocrocis medinalis).
  5. 5. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeos que a) codifica uma proteína Cry, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 e 4; ou b) compreende qualquer uma de SEQ ID NOs: 14-29 ou seus fragmentos codificantes de toxina.
  6. 6. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor heterólogo que funciona em uma planta ou bactéria operacionalmente ligado ao polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5.
  7. 7. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a) o promotor expressável em plantas é uma ubiquitina, vírus de enrolamento da folha amarela de Cestrum, TrpA do milho, OsMADS 6, histona H3 do mais, 5' UTR do gene 9 do bacteriófago T3, sacarose sintetase 1 do milho, álcool desidrogenase 1 do milho, complexo de captação de luz do milho, proteína de choque térmico do milho, mtl do mais, subunidade pequena de RuBP carboxilase da ervilha, actina do arroz, ciclofilina do arroz, manopina sintase do plasmídeo Ti, nopalina sintase do plasmídeo Ti,
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    3/5 chalcona isomerase de petúnia, proteína rica em glicina 1 do feijão, patatina da batata, lectina, CaMV 35S ou um promotor da subunidade pequena de RuBP carboxilase S-E9; ou b) o promotor expressável em bactérias compreende os nucleotídeos 12-197 de SEQ ID NO: 30.
  8. 8. Composição inseticida, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína Cry, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende uma bactéria ou uma planta compreendendo a proteína Cry.
  9. 9. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 5 .
  10. 10. Célula bacteriana ou célula de planta transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor recombinante, de acordo com a reivindicação 9.
  11. 11. Célula de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a célula de planta é a) uma célula de planta dicot; ou b) uma célula de planta monocot; ou c) uma célula de planta dicot selecionada do grupo consistindo em uma célula de soja, célula de girassol, célula de tomate, célula de cultura de couves, célula de algodão, célula de beterraba-sacarina e célula de tabaco; ou d) uma célula de planta monocot selecionada do grupo consistindo em uma célula de cevada, célula de milho, célula de aveia, célula de arroz, célula de sorgo, célula de cana-de-açúcar e célula de trigo.
  12. 12. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende a célula de planta transgênica, de acordo com a reivindicação 11.
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    4/5
  13. 13. Semente transgênica da planta transgênica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato que a semente compreende o polinucleotideo.
  14. 14. Produto coletado, caracterizado pelo fato de que é derivado a partir da planta transgênica, de acordo com a reivindicação 12, ou a semente, de acordo com a reivindicação 13, em que o produto coletado compreende a proteina Cry e a proteina Cry tem a mesma função que tinha na planta transgênica.
  15. 15. Produto processado, caracterizado pelo fato de que é derivado a partir do produto coletado, de acordo com a reivindicação 14, em que o produto processado é selecionado do grupo consistindo em farinha, farelo, óleo e amido, ou um produto derivado a partir deles, e em que o produto processado compreende a proteina Cry e a proteina Cry tem a mesma função que tinha na planta transgênica.
  16. 16. Método de produção de uma proteina Cry que é tóxica para uma praga de lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende: cultura da célula transgênica, de acordo com a reivindicação 10, sob condições nas quais a célula transgênica produz a proteina Cry.
  17. 17. Método de produção de uma planta transgênica resistente a insetos, caracterizado pelo fato de que compreende: introdução em uma planta do gene quimérico, de acordo com a reivindicação 6, em que a proteina Cry é expressa na planta, produzindo deste modo uma planta transgênica resistente a insetos.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o passo de introdução é alcançado por a) transformação da planta com o gene quimérico; ou b)
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    5/5 cruzamento de uma primeira planta compreendendo o gene quimérico com uma segunda planta diferente; ou c) edição do genoma de um gene quimérico preexistente em uma planta transgênica.
  19. 19. Método de controle de uma praga de lepidópteros, caracterizado pelo fato de que compreende administração à praga de lepidópteros ou um seu ambiente de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz da proteina Cry, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 e 4.
  20. 20. Proteina CrylJ hibrida, caracterizada pelo fato de que compreende do terminal N ao terminal C uma porção de CrylJa correspondendo aos aminoácidos 1-8 9 de SEQ ID NO: 1, uma porção de CrylJc correspondendo às posições de aminoácidos 90-201 de SEQ ID NO: 1 e uma porção de CrylJa correspondendo às posições de aminoácidos 202-1167 de SEQ ID NO: 1.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113382634B (zh) * 2019-02-20 2023-09-12 先正达农作物保护股份公司 工程化的杀有害生物蛋白及控制植物有害生物的方法
AR118478A1 (es) * 2019-03-28 2021-10-06 Syngenta Crop Protection Ag Modulación de expresión transgénica

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5322687A (en) * 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
US6593293B1 (en) * 1999-09-15 2003-07-15 Monsanto Technology, Llc Lepidopteran-active Bacillus thuringiensis δ-endotoxin compositions and methods of use
ATE421973T1 (de) 1999-12-28 2009-02-15 Bayer Bioscience Nv Inzektizide proteinen von bacillus thuringiensis
RU2013132357A (ru) * 2010-12-13 2015-01-20 Зингента Партисипейшнс Аг Cry1I БЕЛКИ И ГЕНЫ ДЛЯ БОРЬБЫ С НАСЕКОМЫМИ
CN110172466A (zh) * 2013-03-07 2019-08-27 巴斯夫农业解决方案种子美国有限责任公司 毒素基因及其使用方法
CA2963480A1 (en) * 2014-10-15 2016-04-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
EP3715362A1 (en) 2014-10-16 2020-09-30 Monsanto Technology LLC Novel chimeric insecticidal proteins toxic or inhibitory to lepidopteran pests
CN104673706B (zh) * 2014-12-20 2018-03-06 东北农业大学 苏云金芽胞杆菌fh21、杀虫基因，表达蛋白及其应用

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Publication number Publication date
US20220251599A1 (en) 2022-08-11
US11359209B2 (en) 2022-06-14
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AR110667A1 (es) 2019-04-17
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US20210261631A1 (en) 2021-08-26
EP3565404A4 (en) 2021-01-20
CA3044425A1 (en) 2018-07-12
PH12019501509A1 (en) 2020-06-29
CL2019001778A1 (es) 2019-10-04
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