ES2929566T3 - Composiciones y procedimientos para controlar plagas de plantas - Google Patents

Abstract

Se describen nuevas proteínas insecticidas que son tóxicas para las plagas de lepidópteros. El ADN que codifica las proteínas insecticidas puede usarse para transformar organismos procarióticos y eucarióticos para expresar las proteínas insecticidas. Los organismos recombinantes o las composiciones que contienen los organismos recombinantes o las proteínas insecticidas solos o en combinación con un vehículo agrícola apropiado pueden usarse para controlar plagas de lepidópteros en diversos entornos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos para controlar plagas de plantas

Referencia al listado de secuencias presentado electrónicamente

La copia oficial del listado de secuencias se presenta electrónicamente a través de EFS-Web como un listado de secuencias en formato ASCII con un archivo denominado "80838-WO-REG-ORG-P-1_SeqList_ST25.txt", creado el 7 de julio de 2015 y con un tamaño de 56 kilobytes y se presenta al mismo tiempo que la memoria descriptiva.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio del documento de Estados Unidos con el número de serie 62/189.573, presentado el 7 de julio de 2015.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas plaguicidas y a las moléculas de ácido nucleico que las codifican, así como a composiciones y procedimientos para controlar plagas de plantas.

Antecedentes

El Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria del suelo grampositiva formadora de esporas que se caracteriza por su capacidad para producir inclusiones cristalinas que son específicamente tóxicas para determinados órdenes y especies de plagas de plantas, incluidos los insectos, pero que son inofensivas para las plantas y otros organismos no diana. Por esta razón, se pueden usar composiciones que comprenden cepas de Bacillus thuringiensis o sus proteínas insecticidas como insecticidas medioambientalmente aceptables para controlar vectores de insectos o plagas de insectos agrícolas de una diversidad de enfermedades humanas o animales.

Las proteínas cristalinas (Cry) de Bacillus thuringiensis presentan una actividad insecticida potente contra plagas de insectos, predominantemente lepidópteros, dípteros y coleópteros. Estas proteínas también han mostrado actividad contra plagas de los órdenes de himenópteros, homópteros, ftirápteros, malófagos y órdenes de plagas de ácaros, así como otros órdenes de invertebrados tales como nematelmintos, platelmintos y sarcomastigóforos (Feitelson, J. 1993. The Bacillus Thuringiensis family tree. En Advanced Engineered Pesticides. Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y.). Estas proteínas se clasificaron originariamente como Cryl a CryVI basándose principalmente en su actividad insecticida. Las clases principales fueron específicas de lepidópteros (I), específicas de lepidópteros y dípteros (II), específicas de coleópteros (III), específicas de dípteros (IV) y específicas de nematodos (V) y (VI). Las proteínas se clasificaron adicionalmente en subfamilias; a las proteínas más estrechamente relacionadas dentro de cada familia se les asignaron letras divisionales tales como CryIA, CryIB, CryIC, etc. Las proteínas incluso más estrechamente relacionadas dentro de cada división recibieron nombres tales como CryIC(a), CryIC(b), etc. Los términos "toxina Cry" y "delta-endotoxina" se han utilizado indistintamente con el término "proteína Cry". La nomenclatura actual de las proteínas y los genes Cry se basa en la homología de la secuencia de aminoácidos más que en la especificidad del insecto diana (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). En esta clasificación más aceptada, se asigna a cada toxina un único nombre que incorpora una categoría primaria (un número arábigo), una categoría secundaria (una letra mayúscula), una categoría terciaria (una letra minúscula) y una categoría cuaternaria (otro número arábigo). En la clasificación actual, los números romanos se han sustituido por números arábigos en la categoría primaria. Por ejemplo, "CryIA(a)" en la nomenclatura anterior es ahora "Cry1Aa" en la nomenclatura actual. Según Ibrahim et al. (2010, Bioeng. Bugs, 1:31-50), las toxinas Cry aún se pueden separar en seis clases principales según sus especificidades con respecto al huésped insecto e incluyen: Grupo 1 - lepidópteros, por ejemplo, Cry1, Cry9 y Cry15); grupo 2 - lepidópteros y dípteros (por ejemplo, Cry2); grupo 3 - coleópteros (Cry3, Cry7 y Cry8); grupo 4 -dípteros (Cry4, Cry10, Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 y Cry20); grupo 5 - lepidópteros y coleópteros (Cry11); y grupo 6 -nematodos (Cry6). Las toxinas Cry1I, Cry2, Cry3, Cry10 y Cry11 (73-82 kDa) son únicas debido a que parecen ser truncamientos naturales de las proteínas más grandes Cry1 y Cry4 (130-140 kDa).

Las proteínas Cry son moléculas proteicas globulares que se acumulan como protoxinas en forma cristalina durante la etapa de esporulación de Bt. Después de su ingestión por una plaga, los cristales normalmente se solubilizan para liberar protoxinas, que pueden variar en tamaño, por ejemplo, de 130 a 140 kDa para muchas de las proteínas Cry activas contra lepidópteros, tales como Cry1 y Cry9, y de 60 a 80 kDa para las proteínas Cry3 activas contra coleópteros y las proteínas Cry2 activas contra lepidópteros/dípteros. Después de que los cristales se hayan solubilizado por un insecto susceptible, las protoxinas liberadas se procesan mediante proteasas en el intestino del insecto, por ejemplo, tripsina y quimotripsina, para producir una toxina proteica Cry con núcleo resistente a proteasas. Este procesamiento proteolítico implica la eliminación de aminoácidos de diferentes regiones de las diversas protoxinas Cry. Por ejemplo, las protoxinas Cry que tienen 130-140 kDa generalmente se activan por medio de la eliminación proteolítica de un péptido N-terminal de 25-30 aminoácidos y aproximadamente la mitad de la proteína restante del extremo C-terminal, lo que da como resultado una toxina Cry madura de aproximadamente 60-70 kDa. Las protoxinas que tienen 60-80 kDa, por ejemplo Cry2 y Cry3, también se procesan, pero no en la misma medida que las protoxinas más grandes. De las protoxinas más pequeñas normalmente se eliminan la misma cantidad o más aminoácidos del extremo N-terminal que de las protoxinas más grandes, pero se eliminan menos aminoácidos del extremo C-terminal. Por ejemplo, la activación proteolítica de los miembros de la familia Cry2 normalmente implica la eliminación de aproximadamente 40-50 aminoácidos N-terminales. Muchas de las proteínas Cry son bastante tóxicas para insectos diana específicos, pero muchas tienen espectros de actividad estrechos.

Las proteínas Cry generalmente tienen cinco dominios de secuencia conservados y tres dominios estructurales conservados (véase, por ejemplo, de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). El primer dominio estructural conservado, denominado dominio I, normalmente consiste en siete hélices alfa y está involucrado en la inserción en la membrana y en la formación de poros. El dominio II normalmente consiste en tres láminas beta dispuestas en una configuración de clave griega, y el dominio III normalmente consiste en dos láminas beta antiparalelas en formación de 'barril tipo remolino' (de Maagd et al., 2001, citado anteriormente). Los dominios II y III están involucrados en el reconocimiento y la unión de receptores y, por lo tanto, se consideran determinantes de la especificidad de la toxina.

Numerosas plantas comercialmente valiosas, incluidos los cultivos agrícolas comunes, son susceptibles al ataque de plagas de plantas, incluidas plagas de insectos y nematodos, lo que provoca reducciones sustanciales en el rendimiento y la calidad de los cultivos. Por ejemplo, las plagas de plantas son un factor determinante en la pérdida de cultivos agrícolas importantes en el mundo. Solo en Estados Unidos se pierden aproximadamente 8 mil millones de dólares cada año debido a infestaciones por plagas de invertebrados, incluidos los insectos. Las plagas de insectos también son una carga para los cultivadores de hortalizas y frutas, los productores de flores ornamentales y los jardineros domésticos.

Las plagas de insectos se controlan principalmente mediante aplicaciones intensivas de plaguicidas químicos, que actúan por medio de la inhibición del crecimiento de los insectos, la prevención de la alimentación o la reproducción de los insectos, o provocan su muerte. También se han aplicado agentes biológicos de control de plagas, tales como cepas de Bacillus thuringiensis que expresan toxinas plaguicidas tales como las proteínas Cry, a plantas de cultivo con resultados satisfactorios, lo que ofrece una alternativa o un complemento a los plaguicidas químicos. Se han aislado los genes que codifican algunas de estas proteínas Cry, y se ha demostrado que su expresión en huéspedes heterólogos, tales como plantas transgénicas, proporciona otra herramienta para el control de plagas de insectos económicamente importantes.

Por lo tanto, se puede lograr un buen control de insectos, pero determinados productos químicos a veces también pueden afectar a insectos benéficos no diana, y determinados productos biológicos tienen un espectro de actividad muy estrecho. Además, el uso continuo de determinados procedimientos de control químico y biológico aumenta la posibilidad de que las plagas de insectos desarrollen resistencia a dichas medidas de control. Esto se ha aliviado parcialmente mediante diversas prácticas de gestión de la resistencia, pero sigue existiendo la necesidad de desarrollar agentes de control de plagas nuevos y eficaces que proporcionen un beneficio económico a los agricultores y que sean medioambientalmente aceptables. Se necesitan, en particular, agentes de control que puedan actuar sobre un espectro más amplio de plagas de insectos económicamente importantes y que controlen eficazmente las cepas de insectos que son, o que podrían volverse, resistentes a los agentes existentes de control de insectos.

Sumario

En vista de estas necesidades, es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos agentes de control de plagas proporcionando nuevos aislados de Bacillus thuringiensis (Bt), así como genes y proteínas plaguicidas novedosos que puedan usarse para controlar una diversidad de plagas de plantas.

La invención proporciona composiciones y procedimientos para conferir actividad plaguicida a bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas. En particular, se proporcionan genes quiméricos que comprenden polinucleótidos novedosos que codifican proteínas Cry aislados de Bt y secuencias sustancialmente idénticas a los mismos, cuya expresión da como resultado proteínas con toxicidad para plagas de insectos económicamente importantes, en particular plagas de insectos que infestan plantas. La invención se refiere además a las proteínas Cry novedosas resultantes de la expresión de los polinucleótidos, y a composiciones y formulaciones que contienen las proteínas Cry, que son tóxicas para los insectos al inhibir la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer y reproducirse, o que limitan los daños o las pérdidas de plantas de cultivo relacionados con insectos. Las proteínas Cry de la invención incluyen proteínas Cry nativas y proteínas Cry mutantes o variantes que presentan una o más sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Los ejemplos de proteínas Cry mutantes incluyen, sin limitación, aquellas que se han mutado para que tengan un espectro de actividad más amplio o una actividad específica más alta que sus homólogos de proteína Cry nativa, aquellas que se han mutado para introducir un epítopo para generar anticuerpos que reconozcan diferencialmente la proteína mutada de la proteína nativa o aquellas que se han mutado para modular la expresión en un organismo transgénico. Las proteínas Cry novedosas de la invención son altamente tóxicas para las plagas de insectos. Por ejemplo, las proteínas Cry de la invención se pueden usar para controlar una o más plagas de insectos económicamente importantes, tales como el gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), el cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), el gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea), el barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), la oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), el gusano falso medidor (Chrysodeixis includens), el barrenador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), el gusano cortador de frijol occidental (Richia albicosta), el gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), el barrenador asiático del maíz (Ostrinia furnacalis), el gusano cogollero del algodón (Helicoverpa armigera), el barrenador del tallo rayado (Chilo supresoris), el barrenador del tallo rosado (Sesamia calamistis), el doblador de hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis), y similares.

La invención también proporciona polinucleótidos sintéticos que codifican las proteínas Cry de la invención que tienen uno o más codones optimizados para la expresión en organismos transgénicos tales como bacterias transgénicas o plantas transgénicas.

La invención se refiere además a casetes de expresión y vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido que codifica una proteína Cry de la invención. La invención también proporciona bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformados que comprenden un gen quimérico, o un casete de expresión o un vector recombinante que son útiles para expresar una proteína Cry de la invención en las bacterias, plantas, células vegetales, tejidos y semillas transformados.

La invención también se refiere a cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) aisladas que producen las proteínas Cry de la invención. Dichas cepas de Bt pueden ser un aislado de origen natural o una cepa de Bt recombinante que produce una o más de las proteínas Cry de la invención.

La invención también se refiere a procedimientos de uso de polinucleótidos de la invención, por ejemplo, en constructos de ADN o genes quiméricos o casetes de expresión o vectores recombinantes para la transformación y la expresión en organismos, incluidas plantas y microorganismos, tales como bacterias. Las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden ser secuencias nativas o sintéticas que se han diseñado para la expresión en un organismo tal como una planta o una bacteria o para producir toxinas Cry híbridas con actividad plaguicida potenciada. La invención se refiere además a procedimientos para producir las proteínas Cry y a procedimientos para usar las secuencias de polinucleótidos y las proteínas Cry, por ejemplo, en microorganismos para controlar insectos o en plantas transgénicas para conferir protección contra daños provocados por insectos.

Otro aspecto de la invención incluye composiciones y formulaciones insecticidas que comprenden las proteínas Cry o cepas de Bacillus thuringiensis de la invención, y procedimientos de uso de las composiciones o formulaciones para controlar poblaciones de insectos, por ejemplo mediante la aplicación de las composiciones o formulaciones a las zonas infestadas por insectos, o para tratar profilácticamente zonas o plantas susceptibles de ser atacadas por insectos para conferir protección contra las plagas de insectos. Opcionalmente, las composiciones o formulaciones de la invención pueden, además de la proteína Cry o la cepa de Bt de la invención, comprende otros agentes plaguicidas tales como plaguicidas químicos para aumentar o mejorar la capacidad de control de insectos de la composición o formulación.

Las composiciones y procedimientos de la invención son útiles para controlar plagas de insectos que atacan plantas, particularmente plantas de cultivo. Las composiciones de la invención también son útiles para generar proteínas Cry alteradas o mejoradas que tengan actividad plaguicida, o para detectar la presencia de una proteína Cry o ácidos nucleicos en productos comerciales u organismos transgénicos.

Estas y otras características, aspectos y ventajas de la invención se entenderán mejor con referencia a la descripción detallada siguiente y las reivindicaciones.

Breve descripción de las secuencias en el listado de secuencias

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína BT-0016.

La SEQ ID NO: 2 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína BT-0026.

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína BT-0032.

La SEQ ID NO: 4 es una secuencia con codones optimizados que codifica una proteína BT-0016.

La SEQ ID NO: 5 es una secuencia con codones optimizados que codifica una proteína BT-0026.

La SEQ ID NO: 6 es una secuencia con codones optimizados que codifica una proteína BT-0032.

La SEQ ID NO: 7 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína BT-0016 mutante.

La SEQ ID NO: 8 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína BT-0026 mutante.

La SEQ ID NO: 9 es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína BT-0032 mutante.

La SEQ ID NO: 10 es una secuencia de aminoácidos de una proteína BT-0016.

NO: 11 es una secuencia de aminoácidos de una proteína BT-0026.

NO: 12 es una secuencia de aminoácidos de una proteína BT-0032.

NO: 13 es una secuencia de aminoácidos de una proteína BT-0016 mutante.

NO: 14 es una secuencia de aminoácidos de una proteína BT-0026 mutante.

NO: 15 es una secuencia de aminoácidos de una proteína BT-0032 mutante.

Las SEQ ID NO: 16-17 son secuencias de cebadores útiles en la invención.

Descripción detallada

La presente descripción no pretende ser un catálogo detallado de todas las diferentes formas en que se puede implementar la invención, o de todas las características que se pueden añadir a la presente invención. Por ejemplo, las características ilustradas con respecto a una forma de realización pueden incorporarse en otras formas de realización, y las características ilustradas con respecto a una forma de realización particular pueden eliminarse de esa forma de realización. Por lo tanto, la invención contempla que en algunas formas de realización de la invención, cualquier característica o combinación de características establecida en el presente documento pueda excluirse u omitirse. Además, para los expertos en la técnica, a la vista de la presente divulgación,resultarán evidentes numerosas variaciones y adiciones a las diversas formas de realización sugeridas en el presente documento que no se apartan de la presente invención. Por lo tanto, las siguientes descripciones pretenden ilustrar algunas formas de realización particulares de la invención, y no especificar exhaustivamente todas las permutaciones, combinaciones y variaciones de las mismas.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. La terminología utilizada en la descripción de la invención en el presente documento tiene el único propósito de describir formas de realización particulares y no pretende limitar la invención.

Definiciones

Tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen la referencia en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una planta" es una referencia a una o varias plantas e incluye equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la técnica, etc. Tal como se utiliza en el presente documento, la palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista (es decir, incluye también "y").

El término "aproximadamente", tal como se utiliza en el presente documento significa de forma aproximada, más o menos, alrededor de o en la región de. Cuando el término "aproximadamente" se utiliza junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo extendiendo los límites por encima y por debajo de los valores numéricos establecidos. En general, el término "aproximadamente" se utiliza en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor establecido en una variación del 20 por ciento, preferentemente del 10 por ciento hacia arriba o hacia abajo (mayor o menor). Con respecto a la temperatura, el término "aproximadamente" significa ± 1°C, preferentemente ± 0,5°C. Cuando se utiliza el término "aproximadamente" en el contexto de la presente invención (por ejemplo, en combinación con valores de temperatura o de peso molecular), se prefiere el valor exacto (es decir, sin "aproximadamente").

Por "actividad" de una proteína Cry tóxica de la invención se entiende que la proteína tóxica funciona como un agente de control de insectos activo por vía oral, tiene un efecto tóxico o es capaz de alterar o impedir la alimentación de los insectos, lo que puede provocar o no la muerte de los insectos. Cuando se administra al insecto una proteína tóxica de la invención, el resultado es normalmente la muerte del insecto, o el insecto no se alimenta de la fuente que hace que la proteína tóxica esté disponible para el insecto.

El término "amplificado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a la construcción de múltiples copias de una molécula de ácido nucleico o múltiples copias complementarias a la molécula de ácido nucleico utilizando como plantilla al menos una de las moléculas de ácido nucleico. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas de Q-beta replicasa, el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS) y la amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA). Véase, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, PERSING et al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C.

(1993). El producto de la amplificación se denomina "amplicón".

Los términos "constructo quimérico" o "gen quimérico" o "polinucleótido quimérico" o "ácido nucleico quimérico" (o términos similares), tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a un constructo o molécula que comprende dos o más polinucleótidos de diferente origen ensamblados en una solo molécula de ácido nucleico. Los términos "constructo quimérico", "gen quimérico", "polinucleótido quimérico" o "ácido nucleico quimérico" se refieren a cualquier constructo o molécula que contiene, sin limitación, (1) polinucleótidos (por ejemplo, ADN), incluidos polinucleótidos reguladores y codificantes que no se encuentran juntos en la naturaleza (es decir, al menos uno de los polinucleótidos del constructo es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros polinucleótidos), o (2) polinucleótidos que codifican partes de proteínas que no se unen de forma natural, o (3) partes de promotores que no se unen de forma natural. Además, un constructo quimérico, gen quimérico, polinucleótido quimérico o ácido nucleico quimérico puede comprender polinucleótidos reguladores y polinucleótidos codificantes que se derivan de diferentes fuentes, o comprender polinucleótidos reguladores y polinucleótidos codificantes derivados de la misma fuente, pero dispuestos de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. En algunas formas de realización de la invención, el constructo quimérico, gen quimérico, polinucleótido quimérico o ácido nucleico quimérico comprende un casete de expresión que comprende un polinucleótido de la invención bajo el control de polinucleótidos reguladores, en particular bajo el control de polinucleótidos reguladores funcionales en plantas o bacterias.

Una "secuencia codificante" es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe en forma de ARN tal como ARNm, ARNr, ARNt, ARNnp, ARN sentido o ARN antisentido. Preferentemente, el ARN se traduce posteriormente en un organismo para producir una proteína.

Tal como se utiliza en el presente documento, una secuencia "con codones optimizados" significa una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido recombinante, transgénico o sintético en la que los codones se eligen para reflejar el sesgo particular de codones que puede tener una célula u organismo huésped. Esto se realiza normalmente de tal manera que se preserve la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos con codones optimizados. En determinadas formas de realización, la secuencia de ADN del constructo de ADN recombinante incluye una secuencia con codones optimizados para la célula (por ejemplo, una célula animal, vegetal o fúngica) en la que se va a expresar el constructo. Por ejemplo, un constructo que se va a expresar en una célula vegetal puede tener la totalidad o parte de su secuencia (por ejemplo, el primer elemento de supresión génica o el elemento de expresión génica) con codones optimizados para la expresión en una planta. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.121.014.

"Controlar" insectos significa inhibir, a través de un efecto tóxico, la capacidad de las plagas de insectos para sobrevivir, crecer, alimentarse o reproducirse, o limitar los daños o pérdidas relacionados con los insectos en las plantas de cultivo o proteger el potencial de rendimiento de un cultivo cuando se cultiva en presencia de plagas de insectos. "Controlar" insectos puede o no significar matar a los insectos, aunque preferentemente significa matar a los insectos.

Los términos "comprende" o "que comprende", cuando se utilizan en la presente memoria descriptiva, especifican la presencia de características, números enteros, etapas, operaciones, elementos o componentes indicados, pero no excluyen la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes o grupos de los mismos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión de transición "que consiste esencialmente en" (y variantes gramaticales) significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse de forma que abarque los materiales o las etapas especificados que se enumeran en la reivindicación "y aquellos que no alteran materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s)" de la invención reivindicada. Por lo tanto, no se pretende que el término "que consiste esencialmente en", cuando se utiliza en una reivindicación de la presente invención, se interprete como equivalente a "que comprende".

En el contexto de la invención, "que corresponde a" o "corresponde a" significa que cuando las secuencias de aminoácidos de las proteínas Cry variantes u homólogas se alinean entre sí, los aminoácidos que "corresponden a" determinadas posiciones enumeradas en la proteína variante u homóloga son aquellas que se alinean con estas posiciones en una proteína de referencia, pero que no se encuentran necesariamente en las mismas posiciones numéricas exactas con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia particular de la invención. Por ejemplo, si la SEQ ID NO: 10 es la secuencia de referencia y está alineada con la SEQ ID NO: 12, la Met623 de la SEQ ID NO: 12 "corresponde a" la Met614 de la SEQ ID NO: 10.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "proteína Cry" significa una proteína insecticida de un tipo delta-endotoxina cristalina de Bacillus thuringiensis. El término "proteína Cry" puede referirse a la forma de protoxina o a cualquier fragmento activo o toxina de la misma con actividad insecticida.

"Administrar" una composición o proteína tóxica significa que la composición o proteína tóxica entra en contacto con un insecto, lo que facilita la ingestión oral de la composición o proteína tóxica, dando como resultado un efecto tóxico y el control del insecto. La composición o proteína tóxica se puede administrar de muchas formas reconocidas, que incluyen, pero sin limitación, expresión en plantas transgénicas, una o más composiciones proteicas formuladas, una o más composiciones proteicas pulverizables, una matriz de cebo o cualquier otro sistema de administración de proteína reconocido en la técnica.

El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo de un alineamiento de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. Aunque los aminoácidos presentes en otras posiciones pueden variar entre homólogos, los aminoácidos que están altamente conservados en posiciones específicas indican aminoácidos que probablemente son esenciales en la estructura, la estabilidad o la función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, pueden usarse como identificadores para determinar si algún polipéptido en cuestión pertenece a un grupo polipeptídico previamente identificado.

"Cantidad eficaz para controlar insectos" significa la concentración de una proteína tóxica que inhibe, a través de un efecto tóxico, la capacidad de los insectos para sobrevivir, crecer, alimentarse o reproducirse, o limita los daños o las pérdidas relacionados con los insectos en las plantas de cultivo o protege el rendimiento potencial de un cultivo cuando se cultiva en presencia de plagas de insectos. “Cantidad eficaz para controlar insectos” puede significar o no matar a los insectos, aunque preferentemente significa matar a los insectos.

"Casete de expresión", tal como se utiliza en el presente documento, significa una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de al menos un polinucleótido de interés, tal como un polinucleótido que codifica una proteína Cry de la invención, en una célula huésped apropiada, que comprende un promotor unido operativamente al polinucleótido de interés que está unido operativamente a una señal de terminación. Un "casete de expresión" también comprende generalmente polinucleótidos adicionales necesarios para la traducción apropiada del polinucleótido de interés. El casete de expresión también puede comprender otros polinucleótidos que no son necesarios en la expresión directa de un polinucleótido de interés, pero que están presentes debido a sitios de restricción convenientes para la eliminación del casete de un vector de expresión. El casete de expresión que comprende el o los polinucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. El casete de expresión también puede ser de origen natural, pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Normalmente, sin embargo, el casete de expresión es heterólogo con respecto al huésped, es decir, el polinucleótido de interés del casete de expresión no se encuentra de forma natural en la célula huésped y tiene que haberse introducido en la célula huésped o en un ancestro de la célula huésped mediante un proceso de transformación o un proceso de reproducción. La expresión del o de los polinucleótidos de interés en el casete de expresión generalmente se encuentra bajo el control de un promotor. En el caso de un organismo multicelular, tal como una planta, el promotor también puede ser específico o preferencial para un tejido, un órgano o una etapa de desarrollo particulares. Un casete de expresión, o fragmento del mismo, también puede denominarse "polinucleótido insertado" o "polinucleótido de inserción" cuando se transforma en una planta.

Un "gen" se define en el presente documento como una unidad hereditaria que comprende uno o más polinucleótidos que ocupa una ubicación específica en un cromosoma o un plásmido y que contiene la instrucción genética para una característica o un rasgo particular en un organismo.

Una "proteasa intestinal" es una proteasa que se encuentra de forma natural en el aparato digestivo de un insecto. Esta proteasa suele estar involucrada en la digestión de las proteínas ingeridas. Los ejemplos de proteasas intestinales incluyen la tripsina, que generalmente escinde los péptidos en el lado C-terminal de los residuos de lisina (K) o arginina (R), y la quimotripsina, que generalmente escinde los péptidos en el lado C-terminal de la fenilalanina (F), el triptófano (W) o la tirosina (Y).

El término "heterólogo", cuando se utiliza con referencia a un gen o un polinucleótido o un polipéptido, se refiere a un gen o un polinucleótido o un polipéptido que no está en su entorno natural o contiene una parte del mismo que no está en su entorno natural (es decir, ha sido alterado artificialmente). Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir un polinucleótido de una especie introducido en otra especie. Un gen heterólogo también puede incluir un polinucleótido nativo de un organismo que se ha alterado de alguna manera (por ejemplo, se ha mutado, se ha añadido en múltiples copias, se ha unido a un polinucleótido promotor o potenciador no nativo, etc.). Los genes heterólogos pueden comprender además polinucleótidos de genes vegetales que comprenden formas de ADNc de un gen vegetal; los ADNc pueden expresarse en una orientación sentido (para producir ARNm) o antisentido (para producir un transcrito de ARN antisentido que es complementario al transcrito de ARNm). En un aspecto de la invención, los genes heterólogos se distinguen de los genes vegetales endógenos en que el polinucleótido del gen heterólogo se une normalmente a polinucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran asociados de forma natural con el gen de la proteína codificada por el gen heterólogo o con polinucleótidos de genes vegetales en el cromosoma, o están asociados con porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en loci en los que el gen normalmente no se expresa). Además, un polinucleótido "heterólogo" se refiere a un polinucleótido que no está asociado de forma natural con una célula huésped en la que se introduce, incluidas múltiples copias de origen no natural de un polinucleótido de origen natural.

La "recombinación homóloga" es el intercambio ("entrecruzamiento") de fragmentos de ADN entre dos moléculas o cromátidas de ADN de cromosomas emparejados en una región de polinucleótidos idénticos. Un "evento de recombinación" significa en el presente documento un entrecruzamiento meiótico.

Una secuencia de ácido nucleico es "isocodificante" con una secuencia de ácido nucleico de referencia cuando la secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de referencia. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 4 es isocodificante con la SEQ ID NO: 1 porque ambas codifican la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10.

El término molécula de ácido nucleico, polinucleótido o proteína "aislados" es una molécula de ácido nucleico, polinucleótido o proteína que ya no está en su entorno natural. Una molécula de ácido nucleico, polinucleótido o proteína aislados de la invención puede encontrarse en una forma purificada o puede encontrarse en un huésped recombinante tal como en una bacteria transgénica o una planta transgénica.

Una "molécula de ácido nucleico" es ADN o ARN monocatenario o bicatenario que puede aislarse de cualquier fuente. En el contexto de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es preferentemente un segmento de ADN.

"Unido operativamente" se refiere a la asociación de polinucleótidos en un solo fragmento de ácido nucleico de forma que la función de uno afecte a la función del otro. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a un polinucleótido codificante o ARN funcional cuando es capaz de afectar a la expresión de ese polinucleótido codificante o ARN funcional (es decir, que el polinucleótido codificante o el ARN funcional se encuentra bajo el control transcripcional del promotor). El polinucleótido codificante en orientación sentido o antisentido puede estar unido operativamente a polinucleótidos reguladores.

Tal como se utilizan en el presente documento, "plaguicida", insecticida" y similares se refieren a la capacidad de una proteína Cry de la invención para controlar un organismo plaga o a una cantidad de una proteína Cry que puede controlar un organismo plaga tal como se define en el presente documento. La proteína Cry plaguicida puede matar un organismo plaga (por ejemplo, una plaga de insectos) o inhibir la capacidad del mismo para sobrevivir, crecer, alimentarse o reproducirse.

Una "planta" es cualquier planta en cualquier etapa de desarrollo, en particular una planta seminal.

Una "célula vegetal" es una unidad estructural y fisiológica de una planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. La célula vegetal puede estar en forma de una sola célula aislada o de una célula cultivada, o formar parte de una unidad con una organización superior tal como, por ejemplo, un tejido vegetal, un órgano vegetal o una planta completa.

"Cultivo de células vegetales" significa cultivos de unidades vegetales tales como, por ejemplo, protoplastos, células de cultivo celular, células en tejidos vegetales, polen, tubos polínicos, óvulos, sacos embrionarios, cigotos y embriones en diversos estadios de desarrollo.

"Material vegetal" se refiere a hojas, tallos, raíces, flores o partes de la flor, frutos, polen, óvulos, cigotos, semillas, esquejes, cultivos celulares o tisulares, o cualquier otra parte o producto de una planta.

Un "órgano de una planta" es una parte específica y visiblemente estructurada y diferenciada de una planta, tal como una raíz, un tallo, una hoja, una yema floral o un embrión.

"Tejido vegetal", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un grupo de células vegetales organizadas en una unidad estructural y funcional. Está incluido cualquier tejido de una planta in planta o en cultivo. Este término incluye, pero sin limitación, plantas enteras, órganos de plantas, semillas de plantas, cultivos de tejidos y cualquier grupo de células vegetales organizadas en unidades estructurales o funcionales. El uso de esta expresión junto con, o en ausencia de, cualquier tipo específico de tejido vegetal, tales como los enumerados anteriormente, o que esté contemplado de otra forma por esta definición, no pretende ser exclusivo de ningún otro tipo de tejido vegetal.

Un "polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto por muchos monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. Dichos "polinucleótidos" incluyen ADN, ARN, oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas del ARN o ADN biológico, tales como oligonucleótidos 2'-O-metilados) y similares. En algunas formas de realización, un ácido nucleico o polinucleótido puede ser monocatenario, bicatenario, multicatenario o combinaciones de los mismos. A menos que se indique lo contrario, un ácido nucleico o polinucleótido particular de la presente invención comprende o codifica opcionalmente polinucleótidos complementarios, además de cualquier polinucleótido indicado explícitamente.

"Polinucleótido de interés" se refiere a cualquier polinucleótido que, cuando se transfiere a un organismo, por ejemplo, a una planta, confiere al organismo una característica deseada tal como resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, tolerancia a herbicidas, resistencia a antibióticos, un valor nutricional mejorado, un rendimiento mejorado en un proceso industrial, la producción de enzimas o metabolitos comercialmente valiosos o una capacidad reproductiva alterada.

El término "promotor" se refiere a un polinucleótido, normalmente cadena arriba (5') de su polinucleótido codificante, que controla la expresión del polinucleótido codificante proporcionando el reconocimiento por parte de la ARN polimerasa y otros factores necesarios para una transcripción adecuada.

Un "protoplasto" es una célula vegetal aislada sin pared celular o solo con partes de la pared celular.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a una forma de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) o proteína o un organismo que normalmente no se encontraría en la naturaleza y, como tal, ha sido creado mediante la intervención humana. Tal como se utiliza en el presente documento, una "molécula de ácido nucleico recombinante" es una molécula de ácido nucleico que comprende una combinación de polinucleótidos que no se presentarían juntos en la naturaleza y es el resultado de la intervención humana, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que comprende una combinación de al menos dos polinucleótidos heterólogos entre sí, o una molécula de ácido nucleico que se ha sintetizado artificialmente y que comprende un polinucleótido que se diferencia del polinucleótido que normalmente existiría en la naturaleza, o una molécula de ácido nucleico que comprende un transgén incorporado artificialmente en el ADN genómico de una célula huésped y el ADN flanqueante asociado del genoma de la célula huésped. Un ejemplo de una molécula de ácido nucleico recombinante es una molécula de ADN que es el resultado de la inserción de un transgén en el ADN genómico de una planta que, finalmente, puede dar como resultado la expresión de una molécula de proteína o ARN recombinante en ese organismo. Tal como se utiliza en el presente documento, una "planta recombinante" es una planta que normalmente no existiría en la naturaleza, es el resultado de la intervención humana y contiene un transgén o una molécula de ácido nucleico heterólogo incorporados en su genoma. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es claramente diferente de la planta silvestre relacionada.

Los "elementos reguladores" se refieren a secuencias involucradas en el control de la expresión de una secuencia de nucleótidos. Los elementos reguladores comprenden un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés y señales de terminación. Normalmente también abarcan secuencias requeridas para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos.

El término "identidad" o "idéntico" o "sustancialmente idéntico", en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen al menos el 60%, preferentemente al menos el 80%, de forma más preferida al menos el 90%, de forma incluso más preferida al menos el 95% y de la forma más preferida al menos el 99% de identidad de residuos de aminoácidos o nucleótidos, cuando se comparan y se alinean de forma que la correspondencia sea máxima, tal como se mide utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante inspección visual. Preferentemente, la identidad sustancial existe a lo largo de una región de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 50 residuos o bases de longitud, de forma más preferida en una región de al menos aproximadamente 100 residuos o bases, y de la forma más preferida las secuencias son sustancialmente idénticas en al menos aproximadamente 150 residuos o bases. En una forma de realización especialmente preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas a lo largo de toda la longitud de las regiones codificantes. Además, las secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos sustancialmente idénticas realizan sustancialmente la misma función.

Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas de la subsecuencia si es necesario y se designan los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la o las secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, en función de los parámetros de programa designados.

El alineamiento óptimo de las secuencias para su comparación se puede realizar, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el procedimiento de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante inspección visual (véase, en general, Ausubel et al., más adelante).

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe por Altschul et al., J. Mol. Biol. 215403-410 (1990). El programa informático para realizar análisis por BLAST está disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, MD 20894, Estados Unidos). Este algoritmo implica en primer lugar identificar pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coinciden o satisfacen una determinada puntuación umbral T de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere a la puntuación umbral de la palabra vecina (Altschul et al., 1990). Estas coincidencias iniciales de palabras vecinas actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Después, las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada una de las secuencias hasta que se pueda aumentar la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de las palabras en cada dirección se detiene cuando la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en una cantidad X de su valor máximo alcanzado, la puntuación acumulativa alcanza cero o un valor inferior a cero debido a la acumulación de uno o más alineamientos residuales de puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un límite de corte de 100, M = 5, N = - 4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. u Sa 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc Nat’l Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)) que proporciona una indicación de la probabilidad de que se produzca una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de ensayo se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la secuencia de ácido nucleico de ensayo con la secuencia de ácido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, de forma más preferida inferior a aproximadamente 0,01, y de la forma más preferida inferior a aproximadamente 0,001.

Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustancialmente idénticas es que las dos moléculas se hibriden entre sí en condiciones rigurosas. La expresión "se hibrida específicamente con" se refiere a la unión, la duplicación o la hibridación de una molécula solo con una secuencia de nucleótidos particular en condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en un ADN o ARN de mezcla compleja (por ejemplo, celular total). "Se une(n) sustancialmente" se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico sonda y un ácido nucleico diana y abarca desajustes menores que pueden acomodarse reduciendo la rigurosidad de los medios de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia de ácido nucleico diana.

Las "condiciones de hibridación rigurosas" y "condiciones de lavado de hibridación rigurosas", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como las hibridaciones de Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes para parámetros ambientales diferentes. Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, parte I, capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Nueva York. En general, se seleccionan condiciones de hibridación y lavado muy rigurosas de forma que sean aproximadamente 5°C más bajas que el punto de fusión térmica (T^m) para la secuencia específica a una fuerza iónica y un pH definidos. Normalmente, en "condiciones rigurosas", una sonda se hibridará con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

La T^m es la temperatura (a un pH y una fuerza iónica definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Las condiciones muy rigurosas se seleccionan de forma que sean iguales a la T^m para una sonda particular. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una inmunotransferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42°C, realizándose la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas es NaCl 0,15 M a 72°C durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con 0,2x SSC a 65°C durante 15 minutos (véase, Sambrook, más adelante, para obtener una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado de rigurosidad alta va precedido por un lavado de rigurosidad baja para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1 x SSC a 45°C durante 15 minutos. Un ejemplo de lavado de baja rigurosidad para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40°C durante 15 minutos. Para sondas cortas (por ejemplo, aproximadamente de 10 a 50 nucleótidos), las condiciones rigurosas normalmente involucran concentraciones de sal menores de aproximadamente 1,0 M de iones Na, normalmente una concentración de iones Na (u otras sales) de aproximadamente 0,01 a 1,0 M a un pH de 7,0 a 8,3, y la temperatura es normalmente de al menos aproximadamente 30°C. También se pueden lograr condiciones rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una relación señal/ruido de 2x (o superior) con respecto a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Los siguientes son ejemplos de conjuntos de condiciones de hibridación/lavado que se pueden usar para clonar secuencias de nucleótidos homólogas que son sustancialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos de referencia de la presente invención: una secuencia de nucleótidos de referencia se híbrida preferentemente con la secuencia de nucleótidos de referencia en dodecilsulfato de sodio al 7%, (SDS), NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 2X SSC, SDS al 0,1% a 50°C, de forma más deseable en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 1 x SSC, SDS al 0,1% a 50°C, de forma aún más deseable en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO4 0,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0,5x SSC, SDS al 0,1% a 50°C, preferentemente en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 50°C, de forma más preferida en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 65°C.

Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o proteínas son sustancialmente idénticas es que la proteína codificada por el primer ácido nucleico presenta inmunológicamente reactividad cruzada con, o se une específicamente a, la proteína codificada por el segundo ácido nucleico. Por lo tanto, una proteína normalmente es sustancialmente idéntica a una segunda proteína, por ejemplo, cuando las dos proteínas se diferencian únicamente por sustituciones conservadoras.

"Sintético" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende bases o características estructurales que no están presentes en la secuencia natural. Por ejemplo, se dice que es sintética una secuencia artificial que codifica una proteína Cry de la invención que se parece más al contenido de G+C y a la distribución normal de codones de genes de plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas.

Tal como se utiliza en el presente documento, una proteína Cry que es "tóxica" para una plaga de insectos significa que la proteína Cry actúa como un agente de control de insectos activo por vía oral para matar la plaga de insectos, o que la proteína Cry es capaz de alterar o impedir la alimentación de los insectos, o que provoca la inhibición del crecimiento de la plaga de insectos, pudiendo ambos provocar o no la muerte del insecto. Cuando una proteína Cry de la invención se administra a un insecto o un insecto entra en contacto oral con la proteína Cry, el resultado es generalmente la muerte del insecto, o el crecimiento del insecto se ralentiza, o el insecto deja de alimentarse de la fuente que hace que la proteína Cry tóxica esté disponible para el insecto.

La "transformación" es un proceso para introducir ácidos nucleicos heterólogos en una célula u organismo huésped. En particular, la "transformación" se refiere a la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

"Transformado/transgénico/recombinante" se refieren a un organismo huésped, tal como una bacteria o una planta, en el que se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo. La molécula de ácido nucleico se puede integrar de forma estable en el genoma del huésped, o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Dicha molécula extracromosómica puede autorreplicarse. Se entenderá que las células, los tejidos o las plantas transformados no abarcan únicamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica del mismo. Un huésped "no transformado", "no transgénico" o "no recombinante" se refiere a un organismo de tipo silvestre, por ejemplo, una bacteria o una planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heterólogo.

Los nucleótidos se indican por sus bases mediante las siguientes abreviaturas estándar: adenina (A), citosina (C), timina (T) y guanina (G). Asimismo, los aminoácidos se indican mediante las siguientes abreviaturas estándar: alanina (Ala; A), arginina (Arg; R), asparagina (Asn; N), ácido aspártico (Asp; D), cisteína (Cys; C), glutamina (Gln ; Q), ácido glutámico (Glu; E), glicina (Gly; G), histidina (His; H), isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), lisina (Lys; K), metionina (Met ; M), fenilalanina (Phe; F), prolina (Pro; P), serina (Ser; S), treonina (Thr; T), triptófano (Trp; W), tirosina (Tyr; Y) y valina (Val ;V).

La presente invención proporciona composiciones y procedimientos para controlar plagas de plantas dañinas. En particular, la invención se refiere a proteínas Cry que pueden aislarse de bacterias, tales como Bacillus thuringiensis, que son tóxicas para plagas de insectos y a polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas Cry, y a la fabricación y el uso de los polinucleótidos y las proteínas Cry para controlar plagas de insectos.

Según algunas formas de realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico u opcionalmente una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry en su forma de protoxina o biológicamente activa, en la que la secuencia de nucleótidos (a) tiene una secuencia de SEQ ID NO: 3 o (b) codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia SEQ ID NO: 12; o (c) es una secuencia sintética de (a) o (b) que tiene codones optimizados para la expresión en un organismo transgénico. En otras formas de realización, la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO:. En otras formas de realización, la secuencia de nucleótidos sintética comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 6.

Los polinucleótidos que son fragmentos de polinucleótidos que codifican protoxina de la proteína Cry también están abarcados por la invención. Por "fragmento" se entiende una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos puede codificar una porción biológicamente activa de una proteína Cry, el denominado "fragmento toxina", o puede ser un fragmento que puede usarse como sonda de hibridación o cebador de PCR usando procedimientos divulgados a continuación. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cry comprenden al menos aproximadamente 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 nucleótidos contiguos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos codificante de proteína Cry de longitud completa divulgada en el presente documento (por ejemplo, 1875 nucleótidos para la SEQ ID NO:1) dependiendo del uso previsto. Por nucleótidos "contiguos" se entienden residuos de nucleótidos que son inmediatamente adyacentes entre sí. Algunos fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la invención codificarán fragmentos toxina que conservan la actividad biológica de la proteína Cry y, por lo tanto, conservan la actividad insecticida. Por "conserva la actividad insecticida" se entiende que el fragmento tendrá al menos aproximadamente el 30%, preferentemente al menos aproximadamente el 50%, de forma más preferida al menos aproximadamente el 70%, de forma incluso más preferida al menos aproximadamente el 80% de la actividad insecticida de la proteína Cry. Los procedimientos para medir la actividad insecticida son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J.252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; y la patente de Estados Unidos N25.743.477.

Un fragmento toxina de una proteína Cry de la invención codificará al menos aproximadamente 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, y 450 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína Cry de longitud completa de la invención (por ejemplo, 623 aminoácidos para la SEQ ID NO: 10).

En algunas formas de realización de la invención, se proporciona un gen quimérico que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a un polinucleótido que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry tóxica para una plaga de lepidópteros, en la que la secuencia de nucleótidos (a) es la SEQ ID NO: 3; o (b) codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es la SEQ ID NO: 12, o (c) es una secuencia sintética de (a) o (b) que tiene codones optimizados para la expresión en un organismo transgénico.

En otras formas de realización, el promotor heterólogo es un promotor que puede expresarse en plantas. Por ejemplo, sin limitación, el promotor que puede expresarse en plantas se puede seleccionar del grupo de promotores que consiste en ubiquitina, virus Cestrum amarillo, TrpA de maíz, OsMADS 6, histona H3 de maíz, UTR 5' del gen 9 del bacteriófago T3, sacarosa sintasa 1 de maíz, alcohol deshidrogenasa de maíz 1, complejo cosechador de luz de maíz, proteína de choque térmico de maíz, mtl de maíz, RuBP carboxilasa de subunidad pequeña de guisante, actina de arroz, ciclofilina de arroz, manopina sintasa de plásmido Ti, nopalina sintasa de plásmido Ti, calcona isomerasa de petunia, proteína rica en glicina 1 de alubia, patatina de patata, lectina, CaMV 35S y promotor de RuBP carboxilasa de subunidad pequeña de S-E9.

En formas de realización adicionales, la proteína codificada por el gen quimérico es tóxica para una o más plagas de lepidópteros seleccionadas del grupo que consiste en el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), el gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), el cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), el gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea), el barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), la oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), el gusano falso medidor (Chrysodeixis includens), el barrenador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), el gusano cortador de frijol occidental (Richia albicosta), el gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), el barrenador asiático del maíz (Ostrinia furnacalis), el gusano cogollero del algodón (Helicoverpa armigera), el barrenador del tallo rayado (Chilo supresoris), el barrenador del tallo rosado (Sesamia calamistis) y el doblador de hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis).

En otras formas de realización, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en o consiste en una cualquiera de la SEQ ID NO: 3.

En otras formas de realización, el polinucleótido comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es la SEQ ID NO: 12.

En algunas formas de realización, el gen quimérico de la invención comprende un polinucleótido que comprende una secuencia sintética de una secuencia de nucleótidos que es la SEQ ID NO: 6, en la que la secuencia sintética tiene codones optimizados para la expresión en un organismo transgénico. En otras formas de realización, el gen quimérico de la invención comprende un polinucleótido que comprende una secuencia sintética de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es la SEQ ID NO: 12, o un fragmento toxina de la misma, en la que la secuencia sintética tiene codones optimizados para la expresión en un organismo transgénico. En formas de realización adicionales, el organismo transgénico es una bacteria transgénica o una planta transgénica.

En algunas formas de realización, la invención proporciona un polinucleótido sintético que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de nucleótidos que es la SEQ ID NO: 6, o un fragmento de la misma que codifica la toxina.

Las proteínas Cry de la invención se pueden aislar de determinadas cepas de Bacillus thuringiensis (Bt) tales como C0633, C0724 y C1100. Se reconocerá que las proteínas Cry de la invención también se pueden aislar de otras cepas de Bt y que dichas cepas de Bt pueden aislarse mediante técnicas estándar y someterse a ensayo para determinar su toxicidad para una plaga de lepidópteros de la invención. En general, las cepas de Bt pueden aislarse de cualquier muestra ambiental, incluidos suelo, plantas, insectos, polvo de elevador de granos y otro material de muestra, etc., mediante procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Travers et al. (1987) Appl. Environ. Microbiol.

53:1263-1266; Saleh et al. (1969) Can J. Microbiol. 15:1101-1104; DeLucca et al. (1981) Can J. Microbiol. 27:865-870; y Norris, et al. (1981) "The genera Bacillus and Sporolactobacillus," en Starr et al. (eds.), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, Vol. II, Springer-Verlog Berlin Heidelberg. Después del aislamiento, las cepas de Bt se pueden someter a ensayo para determinar su toxicidad para una plaga de lepidópteros y se pueden identificar las proteínas Cry abarcadas por la invención. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona una cepa de Bacillus thuringiensis (Bt) aislada que produce una proteína Cry o una proteína Cry recombinante que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene de al menos el 80% a al menos el 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 10-12. En otras formas de realización, la cepa de Bt se selecciona del grupo que consiste en C0633, C0724 y C1100. En otras formas de realización más, la proteína Cry o la proteína Cry recombinante comprende, consiste esencialmente en o consiste en la SEQ ID NO: 12.

Según algunas formas de realización, la invención proporciona una proteína Cry opcionalmente aislada que es tóxica para una plaga de lepidópteros, en la que la proteína comprende, consiste esencialmente en (a) una secuencia de aminoácidos que es la SEQ ID NO: 12, o (b) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que es la SEQ ID NO: 6.

En otras formas de realización más, el aminoácido es la SEQ ID NO: 12.

En algunas formas de realización, la secuencia de aminoácidos comprende, consiste esencialmente en o consiste en la SEQ ID NO: 12. En otras formas de realización, la secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende, consiste esencialmente en o consiste en cualquiera de las SEQ ID NO: 3.

En otras formas de realización, las proteínas Cry de la invención son tóxicas para una plaga de lepidópteros seleccionada del grupo que consiste en el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), el gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), el cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), el gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea), el barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), la oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), el gusano falso medidor (Chrysodeixis includens), el barrenador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), el gusano cortador de frijol occidental (Richia albicosta), el gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), el barrenador asiático del maíz (Ostrinia furnacalis), el gusano cogollero del algodón (Helicoverpa armigera), el barrenador del tallo rayado (Chilo supresoris), el barrenador del tallo rosado (Sesamia calamistis) y el doblador de hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis).

En algunas formas de realización, la invención abarca una proteína Cry recombinante que es tóxica para una plaga de lepidópteros, en la que la proteína Cry recombinante comprende, consiste esencialmente en o consiste en (a) una secuencia de aminoácidos que es la SEQ ID NO: 12, o (b) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 6.

En otras formas de realización, la proteína Cry recombinante comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos que es la SEQ ID NO: 12.

En otras formas de realización más, la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 12.

En otras formas de realización más, la proteína Cry recombinante comprende, consiste esencialmente en o consiste en una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12. En otras formas de realización, la proteína Cry recombinante está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende, consiste esencialmente en o consiste en la SEQ ID NO: 6.

Los anticuerpos generados en respuesta a la provocación inmunitaria por un BT-0032 nativo o mutante y similares y proteínas Cry relacionadas también están abarcados por la invención. Dichos anticuerpos pueden producirse usando técnicas inmunológicas estándar para la producción de antisueros policlonales y, si se desea, inmortalizando las células productoras de anticuerpos del huésped inmunizado para obtener fuentes de producción de anticuerpos monoclonales. Las técnicas para producir anticuerpos frente a cualquier sustancia de interés son bien conocidas, por ejemplo, tal como en Harlow y Lane (1988. Antibodies a laboratory manual, página 726. Cold Spring Harbor Laboratory) y tal como en Goding (Monoclonal Antibodies: Principles & practice. 1986. Academic Press, Inc., Orlando, FL). La presente invención abarca proteínas insecticidas que reaccionan de forma cruzada con anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales, producidos contra una o más de las proteínas Cry insecticidas de la presente invención.

Los anticuerpos producidos en la invención también son útiles en inmunoensayos para determinar la cantidad o la presencia de un BT-0032 nativo o mutante o proteína Cry relacionada en una muestra biológica. Dichos ensayos también son útiles en la producción con control de calidad de composiciones que contienen una o más de las proteínas Cry de la invención o proteínas tóxicas relacionadas. Además, los anticuerpos se pueden usar para evaluar la eficacia de la producción recombinante de una o más de las proteínas Cry de la invención o una proteína relacionada, así como para cribar bibliotecas de expresión para detectar la presencia de una secuencia de nucleótidos que codifica una o más de las proteínas Cry de la invención o secuencias codificantes de proteínas relacionadas. Los anticuerpos también son útiles como ligandos de afinidad para purificar o aislar una cualquiera o varias de las proteínas de la invención y proteínas relacionadas. Las proteínas Cry de la invención y las proteínas que contienen epítopos antigénicos relacionados pueden obtenerse sobreexpresando longitudes completas o parciales de una secuencia que codifica la totalidad o parte de una proteína Cry de la invención o una proteína relacionada en una célula huésped preferida.

Se reconoce que las secuencias de ADN que codifican una proteína Cry nativa de la invención pueden alterarse mediante varios procedimientos, y que estas alteraciones pueden dar como resultado secuencias de ADN que codifican proteínas con secuencias de aminoácidos diferentes a las codificadas por una proteína Cry nativa de la invención. Una proteína Cry puede alterarse de varias formas para producir una proteína Cry mutante, que incluyen sustituciones, eliminaciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos de uno o más aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, incluidas hasta aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4 , aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, aproximadamente 70, aproximadamente 75, aproximadamente 80, aproximadamente 85, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 105, aproximadamente 110, aproximadamente 115, aproximadamente 120, aproximadamente 125, aproximadamente 130, aproximadamente 135, aproximadamente 140, aproximadamente 145, aproximadamente 150, aproximadamente 155 o más sustituciones, eliminaciones o inserciones de aminoácidos. Los procedimientos para realizar dichas manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína Cry nativa pueden prepararse mediante mutaciones en un polinucleótido que codifica la proteína. Esto también puede realizarse mediante una de varias formas de mutagénesis o en evolución dirigida. En algunos aspectos, los cambios codificados en la secuencia de aminoácidos no afectarán sustancialmente a la función de la proteína. Dichas variantes poseerán la actividad insecticida deseada. En algunas formas de realización de la invención, las secuencias de nucleótidos representadas por la SEQ ID NO:3 se alteran para introducir sustituciones de aminoácidos en la proteína codificada.

Se entiende que la capacidad de una proteína insecticida para conferir actividad insecticida puede mejorarse mediante el uso de dichas técnicas en las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, se puede expresar una proteína Cry en células huésped que muestran altas tasas de incorporación incorrecta de bases durante la replicación del ADN, tales como XL-1 Red (Stratagene, La Jolla, CA). Después de la propagación en dichas cepas, se puede aislar el ADN (por ejemplo, mediante preparación de ADN plasmídico o mediante amplificación por PCR y mediante clonación del fragmento de PCR resultante en un vector), cultivar las mutaciones de la proteína Cry en una cepa no mutagénica e identificar genes mutados con actividad insecticida, por ejemplo realizando un ensayo para determinar la actividad insecticida. Generalmente, la proteína se mezcla y se usa en ensayos de alimentación. Véase, por ejemplo, Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Dichos ensayos pueden incluir poner en contacto plantas con una o más plagas y determinar la capacidad de la planta para sobrevivir o provocar la muerte de las plagas. Ejemplos de mutaciones que dan como resultado una mayor toxicidad se encuentran en Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Alternativamente, se pueden realizar alteraciones en una secuencia de aminoácidos de la invención en el extremo amino o carboxi sin que afecten sustancialmente a la actividad. Esto puede incluir inserciones, eliminaciones o alteraciones introducidas por procedimientos moleculares modernos, tales como PCR, incluidas amplificaciones por PCR que alteran o amplían la secuencia codificante de proteínas en virtud de la inclusión de secuencias codificantes de aminoácidos en los oligonucleótidos utilizados en la amplificación por PCR. Alternativamente, las secuencias de proteínas añadidas pueden incluir secuencias de codificación de proteínas completas, tales como las que se usan comúnmente en la técnica para generar fusiones de proteínas. Dichas proteínas de fusión a menudo se utilizan para (1) aumentar la expresión de una proteína de interés (2) introducir un dominio de unión, actividad enzimática o epítopo para facilitar la purificación de proteínas, la detección de proteínas u otros usos experimentales conocidos en la técnica (3) la secreción o traducción diana de una proteína a un orgánulo subcelular, tal como el espacio periplasmático de bacterias Gram-negativas, o el retículo endoplasmático de las células eucariotas, dando como resultado esté último a menudo la glicosilación de la proteína.

Una proteína Cry de la invención también se puede mutar para introducir un epítopo para generar anticuerpos que reconozcan la proteína mutada. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona una proteína Cry mutada, en la que una sustitución de un aminoácido en una proteína Cry nativa produce una proteína Cry mutante que tiene una región antigénica que permite distinguir la proteína Cry mutante de la proteína Cry nativa en un ensayo de detección de proteínas.

En algunas formas de realización, la invención proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo que reconozca diferencialmente una proteína Cry mutada de la proteína Cry nativa de la que se deriva la proteína Cry mutada, comprendiendo el procedimiento las etapas de sustitución de aminoácidos en un bucle antigénico de una proteína Cry nativa y generar anticuerpos que reconozcan específicamente el bucle antigénico mutado en la proteína Cry mutada y no reconozcan la proteína Cry nativa. En una forma de realización, el bucle antigénico se identifica en regiones no conservadas fuera del dominio I de la proteína Cry nativa. En otra forma de realización, el bucle antigénico no es un bucle implicado en el reconocimiento del receptor de la proteína Cry en el intestino del insecto o implicado en la activación proteásica de la proteína Cry.

Las variantes de secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la invención también abarcan secuencias derivadas de procedimientos mutagénicos y recombinogénicos tales como transposición de ADN. Con dicho procedimiento, se pueden usar una o más regiones codificantes de proteínas tóxicas diferentes para crear una nueva proteína tóxica que posea las propiedades deseadas. De esta forma se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos con secuencias relacionadas que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombinarse de forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés se pueden trasponer entre un gen plaguicida de la invención y otros genes plaguicidas conocidos para obtener un nuevo gen que codifica una proteína con una propiedad de interés mejorada, tal como una mayor actividad insecticida. Las estrategias para dicha transposición de ADN son conocidas en la técnica. Véanse, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; y las patentes de Estados Unidos N° 5.605:793 y 5.837.458.

El intercambio o transposición de dominios es otro mecanismo para generar proteínas Cry alteradas de la invención. Los dominios pueden intercambiarse entre proteínas Cry, dando como resultado proteínas tóxicas híbridas o quiméricas con una actividad plaguicida o un espectro diana mejorados. Los procedimientos para generar proteínas recombinantes y analizarlas para determinar su actividad plaguicida son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol.

62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925). En algunas formas de realización, la invención proporciona proteínas Cry híbridas que comprenden en un extremo C terminal aminoácidos de una primera proteína Cry de la invención y en un extremo N terminal aminoácidos de una segunda proteína Cry de la invención diferente de la primera proteína Cry de la invención.

En algunas formas de realización, la invención proporciona un vector recombinante que comprende un polinucleótido, una molécula de ácido nucleico, un casete de expresión o un gen quimérico de la invención. En otras formas de realización, el vector se define adicionalmente como un plásmido, cósmido, fagémido, cromosoma artificial, fago o vector vírico. Determinados vectores para su uso en la transformación de plantas y otros organismos son conocidos en la técnica.

Por lo tanto, algunas formas de realización de la invención se refieren a casetes de expresión diseñados para expresar los polinucleótidos y las moléculas de ácido nucleico de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, "casete de expresión" significa una molécula de ácido nucleico que tiene al menos una secuencia de control unida operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés. De esta forma, por ejemplo, los promotores vegetales unidos operativamente a las secuencias de nucleótidos que se van a expresar se proporcionan en casetes de expresión para la expresión en una planta, parte de planta o célula de planta.

Un casete de expresión que comprende un polinucleótido de interés puede ser quimérico, lo que significa que al menos uno de sus componentes es heterólogo con respecto a al menos uno de sus otros componentes. Un casete de expresión también puede ser uno que se produzca de forma natural pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. Sin embargo, por lo general, el casete de expresión es heterólogo con respecto al huésped, es decir, la secuencia de ácido nucleico particular del casete de expresión no se presenta de forma natural en la célula huésped y tiene que haberse introducido en la célula huésped o en un ancestro de la célula huésped mediante un evento de transformación.

Además de los promotores unidos operativamente a las secuencias de nucleótidos de la invención, un casete de expresión de la presente invención también puede incluir otras secuencias reguladoras. Tal como se utiliza en el presente documento, "secuencias reguladoras" significa secuencias de nucleótidos ubicadas cadena arriba (secuencias no codificantes 5'), dentro o cadena abajo (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante, y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras incluyen, pero sin limitación, potenciadores, intrones, secuencias líder de traducción, señales de terminación y secuencias de señales de poliadenilación.

En algunas formas de realización, un casete de expresión de la invención también puede incluir polinucleótidos que codifican otras características deseadas además de las proteínas Cry de la invención. Dichos casetes de expresión que comprenden los rasgos apilados pueden usarse para crear plantas, partes de plantas o células de plantas que tengan un fenotipo deseado con los rasgos apilados (es decir, apilamiento molecular). Dichas combinaciones apiladas en plantas también pueden crearse mediante otros procedimientos que incluyen, pero sin limitación, cruce de plantas mediante cualquier metodología convencional. Si se apilan transformando genéticamente las plantas, las secuencias de nucleótidos de interés se pueden combinar en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más rasgos deseados puede usarse como diana para introducir rasgos adicionales mediante una transformación posterior. Las secuencias de nucleótidos adicionales pueden introducirse simultáneamente en un protocolo de cotransformación con una secuencia de nucleótidos, molécula de ácido nucleico, constructo de ácido nucleico o composición de la presente invención, proporcionados por cualquier combinación de casetes de expresión. Por ejemplo, si se van a introducir dos secuencias de nucleótidos, se pueden incorporar en casetes separados (trans) o se pueden incorporar en el mismo casete (cis). La expresión de polinucleótidos puede estar impulsada por el mismo promotor o por diferentes promotores. Se reconoce además que los polinucleótidos se pueden apilar en una ubicación genómica deseada utilizando un sistema de recombinación específico del sitio. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patente internacional N° WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 y WO 99/25853.

El casete de expresión también puede incluir una secuencia de codificación adicional para uno o varios polipéptidos o moléculas de ARN bicatenario (ARNbc) de interés para lograr rasgos agronómicos que son principalmente beneficiosas para una empresa de semillas, un cultivador o un procesador de granos. Un polipéptido de interés puede ser cualquier polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de interés. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos de interés que son adecuados para la producción en plantas incluyen aquellos que dan como resultado rasgos agronómicamente importantes tales como resistencia a herbicidas (también denominada a veces "tolerancia a herbicidas"), resistencia a virus, resistencia a patógenos bacterianos, resistencia a insectos, resistencia a nematodos o resistencia a hongos. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 5.569.823, 5.304.730, 5.495.071, 6.329.504 y 6.337.431. El polipéptido también puede ser uno que aumente el vigor o el rendimiento de la planta (incluyendo rasgos que permitan que una planta crezca a diferentes temperaturas, condiciones del suelo y niveles de luz solar y precipitación), o uno que permita la identificación de una planta que muestre un rasgo de interés (por ejemplo, un marcador seleccionable, un color de cubierta de la semilla, etc.). Varios polipéptidos de interés, así como procedimientos para introducir estos polipéptidos en una planta, se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N24.761.373, 4.769.061, 4.810.648, 4.940.835, 4.975.374, 5.013.659, 5.162.602, 5.276.268, 5.304.730, 5.495.071,5.554.798, 5.561.236, 5.569.823, 5.767.366, 5.879.903. 5.928.937, 6.084.155, 6.329.504 y 6.337.431, así como en la publicación de patente de Estados Unidos N° 2001/0016956. Véase también la dirección de Internet lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/.

Los polinucleótidos que confieren resistencia/tolerancia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o el meristema, tal como una imidazalinona o una sulfonilurea, también pueden ser adecuados en algunas formas de realización de la invención. Los polinucleótidos de ejemplo de esta categoría codifican enzimas ALS y AHAS mutantes tal como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5.767.366 y 5.928.937. Las patentes de Estados Unidos N° 4.761.373 y 5.013.659 se refieren a plantas resistentes a varios herbicidas de imidazalinona o sulfonamida. La patente de Estados Unidos N° 4.975.374 se refiere a células vegetales y plantas que contienen un ácido nucleico que codifica una glutamina sintetasa (GS) mutante resistente a la inhibición por herbicidas que se sabe que inhiben la GS, por ejemplo, fosfinotricina y metionina sulfoximina. La patente de Estados Unidos N° 5.162.602 divulga plantas resistentes a la inhibición por herbicidas de ciclohexanodiona y ácido ariloxifenoxipropanoico. La resistencia la confiere una acetil coenzima A carboxilasa (ACCasa) alterada.

Los polipéptidos codificados por secuencias de nucleótidos que confieren resistencia al glifosato también son adecuados para la invención. Véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 4.940.835 y la patente de Estados Unidos N° 4.769.061. La patente de Estados Unidos N° 5.554.798 divulga plantas de maíz transgénicas resistentes al glifosato, cuya resistencia es conferida por un gen alterado de 5-enolpiruvil-3-fosfoshikimato (EPSP) sintasa.

También son adecuados los polinucleótidos que codifican resistencia a compuestos de fosfono tales como glufosinato de amonio o fosfinotricina, y ácidos piridinoxi o fenoxipropiónicos y ciclohexonas. Véase la solicitud de patente europea N° 0242246. Véanse también las patentes de Estados Unidos N° 5.879.903, 5.276.268 y 5.561.236.

Otros polinucleótidos adecuados incluyen los que codifican resistencia a herbicidas que inhiben la fotosíntesis, tales como una triazina y una benzonitrilo (nitrilasa) Véase la patente de Estados Unidos N° 4.810.648. Los polinucleótidos adecuados adicionales que codifican resistencia a herbicidas incluyen aquellos que codifican resistencia a ácido 2,2-dicloropropiónico, setoxidim, haloxifop, herbicidas de imidazolinona, herbicidas de sulfonilurea, herbicidas de triazolopirimidina, herbicidas de s-triazina y bromoxinilo. También son adecuados los polinucleótidos que confieren resistencia a una enzima protox, o que proporcionan una mayor resistencia a las enfermedades de las plantas; una mayor tolerancia a condiciones ambientales adversas (estrés abiótico) que incluyen, pero sin limitación, sequía, frío excesivo, calor excesivo o salinidad excesiva del suelo o acidez o alcalinidad extremas; y alteraciones en la arquitectura o el desarrollo de la planta, incluidos cambios en el tiempo de desarrollo. Véanse, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos N° 2001/0016956 y la patente de Estados Unidos N° 6.084.155.

Los polinucleótidos adecuados adicionales incluyen aquellos que codifican polipéptidos plaguicidas (por ejemplo, insecticidas). Estos polipéptidos se pueden producir en cantidades suficientes para controlar, por ejemplo, plagas de insectos (es decir, cantidades que controlan insectos). Se reconoce que la cantidad de producción de un polipéptido plaguicida en una planta necesaria para controlar insectos u otras plagas puede variar dependiendo del cultivo, el tipo de plaga, factores ambientales y similares. Los polinucleótidos útiles para proporcionar resistencia adicional a insectos o plagas incluyen, por ejemplo, aquellos que codifican toxinas identificadas en organismos de Bacillus. Se han clonado polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican proteínas Cry de Bacillus thuringiensis (Bt) de varias subespecies y se ha descubierto que los clones recombinantes son tóxicos para las larvas de insectos lepidópteros, dípteros y coleópteros. Ejemplos de dichas proteínas insecticidas de Bt incluyen proteínas Cry tales como CrylAa, CrylAb, CrylAc, CrylB, CrylC, CrylD, CryIEa, CrylFa, Cry3A, Cry9A, Cry9B, Cry9C, y similares, así como proteínas insecticidas vegetativas tales como VIP1, VIP2, VIP3, y similares. Una lista completa de proteínas derivadas de Bt se puede encontrar en Internet en la base de datos de nomenclatura de toxinas de Bacillus thuringiensis mantenida por la Universidad de Sussex (véase también, Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813).

Los polipéptidos que son adecuados para la producción en plantas incluyen además aquellos que mejoran o facilitan la conversión de plantas cosechadas o partes de plantas en un producto comercialmente útil, lo que incluye, por ejemplo, un contenido o una distribución de carbohidratos aumentados o modificados, propiedades de fermentación mejoradas, un mayor contenido de aceite, un mayor contenido de proteínas, una digestibilidad mejorada y un mayor contenido de productos nutracéuticos, por ejemplo, un mayor contenido de fitoesteroles, un mayor contenido de tocoferoles, un mayor contenido de estanoles o un mayor contenido de vitaminas. Los polipéptidos de interés también incluyen, por ejemplo, los que dan como resultado, o contribuyen a, un contenido reducido de un componente no deseado en un cultivo cosechado, por ejemplo, ácido fítico o enzimas degradadoras de azúcar. Por "dar como resultado" o "contribuir a" se entiende que el polipéptido de interés puede contribuir directamente o indirectamente a la existencia de un rasgo de interés (por ejemplo, aumentar la degradación de la celulosa mediante el uso de una enzima celulasa heteróloga).

En algunas formas de realización, el polipéptido contribuye a mejorar la digestibilidad de alimentos o piensos. Las xilanasas son enzimas hemicelulolíticas que mejoran la descomposición de las paredes celulares de las plantas, lo que da lugar a una mejor utilización de los nutrientes de las plantas por parte de un animal. Esto da lugar a una tasa de crecimiento y una conversión alimenticia mejoradas. Además, se puede reducir la viscosidad de los piensos que contienen xilano. La producción heteróloga de xilanasas en células vegetales también puede facilitar la conversión lignocelulósica en azúcares fermentables en el procesamiento industrial.

Se han identificado y caracterizado numerosas xilanasas de microorganismos fúngicos y bacterianos (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.437.992; Coughlin et al. (1993) "Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases" Espoo; Souminen y Reinikainen, eds. (1993) Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:125-135; la publicación de patente de Estados Unidos N° 2005/0208178; y la publicación PCT N° WO 03/16654). En particular, se han identificado tres xilanasas específicas (XYL-I, XYL-II y XYL-III) en T. reesei (Tenkanen et al. (1992) Enzyme Microb. Technol. 14:566; Torronen et al. (1992) Bio/Technology 10:1461; y Xu et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:718).

En otras formas de realización, un polipéptido útil para la invención puede ser una enzima degradadora de polisacáridos. Las plantas de la presente invención que producen tal enzima pueden ser útiles para generar, por ejemplo, materias primas de fermentación para bioprocesamiento. En algunas formas de realización, las enzimas útiles para un proceso de fermentación incluyen alfa amilasas, proteasas, pululanasas, isoamilasas, celulasas, hemicelulasas, xilanasas, ciclodextrina glicotransferasas, lipasas, fitasas, lacasas, oxidasas, esterasas, cutinasas, enzima hidrolizante de almidón granular y otras glucoamilasas.

Las enzimas que degradan polisacáridos incluyen: enzimas que degradan almidón tales como a-amilasas (EC 3.2.1.1), glucuronidasas (EC 3.2.1.131); exo-1,4-a-D glucanasas tales como amiloglucosidasas y glucoamilasa (EC 3.2.1.3), pamilasas (EC 3.2.1.2), a-glucosidasas (EC 3.2.1.20) y otras exoamilasas; enzimas desramificadoras de almidón, tales como a) isoamilasa (EC 3.2.1.68), pululanasa (EC 3.2.1.41) y similares; b) celulasas tales como exo-1,4-3-celobiohidrolasa (EC 3.2.1.91), exo-1,3-p-D-glucanasa (EC 3.2.1.39), p-glucosidasa (EC 3.2.1.21); c) L-arabinasas, tales como endo-1,5-a-L-arabinasa (EC 3.2.1.99), a-arabinosidasas (EC 3.2.1.55) y similares; d) galactanasas tales como endo-1,4-p-D-galactanasa (E^c 3.2.1.89), endo-1,3-p-D-galactanasa (EC 3.2.1.90), a-galactosidasa (EC 3.2.1.22), p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) y similares; e) mananasas, tales como endo-1,4-p-D-mannanasa (EC 3.2.1.78), p-manosidasa (EC 3.2.1.25), a-manosidasa (EC 3.2.1.24) y similares; f) xilanasas, tales como endo-1,4-pxilanasa (EC 3.2.1.8), p-D-xilosidasa (EC 3.2.1.37), 1,3-p-D-xilanasa y similares; y g) otras enzimas tales como a-L-fucosidasa (EC 3.2.1.51), a-L-ramnosidasa (EC 3.2.1.40), levanasa (EC 3.2.1.65), inulanasa (EC 3.2.1.7), y similares. En una forma de realización, la a-amilasa es la a-amilasa sintética, Amy797E, que se describe en la patente de Estados Unidos N28.093.453.

Otras enzimas que pueden usarse con la invención incluyen proteasas, tales como proteasas fúngicas y bacterianas. Las proteasas fúngicas incluyen, pero sin limitación, aquellas obtenidas de Aspergillus, Trichoderma, Mucor y Rhizopus, tales como A. niger, A. awamori, A. oryzae y M. miehei. En algunas formas de realización, los polipéptidos de la presente invención pueden ser enzimas de celobiohidrolasa (CBH) (EC 3.2.1.91). En una forma de realización, la enzima celobiohidrolasa puede ser CBH1 o CBH2.

Otras enzimas útiles con la invención incluyen, pero sin limitación, hemicelulasas, tales como manasas y arabinofuranosidasas (EC 3.2.1.55); ligninasas; lipasas (por ejemplo, EC 3.1.1.3), glucosa oxidasas, pectinasas, xilanasas, transglucosidasas, alfa-1,6-glucosidasas (por ejemplo, EC 3.2.1.20); esterasas tales como esterasa de ácido ferúlico (EC 3.1.1.73) y acetil xilano esterasas (EC 3.1.1.72); y cutinasas (por ejemplo, EC 3.1.1.74).

Las moléculas de ARN bicatenario útiles con la invención incluyen, pero sin limitación, aquellas que suprimen genes de insectos diana. Tal como se utilizan en el presente documento, se pretende que las palabras "supresión génica", cuando se toman conjuntamente, se refieran a cualquiera de los procedimientos bien conocidos para reducir los niveles de proteína producidos como resultado de la transcripción génica a ARNm y la posterior traducción del ARNm. La supresión génica también se pretende que signifique la reducción de la expresión de proteínas de un gen o secuencia codificante, incluida la supresión génica postranscripcional y la supresión transcripcional. La supresión génica postranscripcional está mediada por la homología entre la totalidad o una parte de un ARNm transcrito a partir de un gen o secuencia codificante que es la diana de la supresión y el ARN bicatenario correspondiente utilizado para la supresión, y se refiere a la reducción sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible en la células para su unión con ribosomas. El ARN transcrito puede estar en la orientación sentido para efectuar lo que se denomina cosupresión, en la orientación antisentido para efectuar lo que se denomina supresión antisentido, o en ambas orientaciones produciendo un ARNbc para efectuar lo que se denomina interferencia de ARN (iARN). La supresión de la transcripción está mediada por la presencia en la célula de un ARNbc, un agente de supresión génica, que muestra una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de ADN promotora o su complemento para efectuar lo que se denomina supresión trans del promotor. La supresión génica puede ser eficaz contra un gen de una planta nativa asociado con un rasgo, por ejemplo, para proporcionar a las plantas niveles reducidos de una proteína codificada por el gen nativo o niveles potenciados o reducidos de un metabolito afectado. La supresión génica también puede ser eficaz contra genes diana en plagas de plantas que pueden ingerir, o ponerse en contacto con, material vegetal que contiene agentes de supresión génica, diseñados específicamente para inhibir o suprimir la expresión de una o más secuencias homólogas o complementarias en las células de la plaga. Dichos genes diana para la supresión pueden codificar una proteína esencial, cuya función predicha se selecciona del grupo que consiste en formación muscular, formación de hormonas juveniles, regulación de hormonas juveniles, regulación y transporte de iones, síntesis de enzimas digestivas, mantenimiento del potencial de membrana celular, biosíntesis de aminoácidos, degradación de aminoácidos, formación de esperma, síntesis de feromonas, detección de feromonas, formación de antenas, formación de alas, formación de patas, desarrollo y diferenciación, formación de huevos, maduración de larvas, formación de enzimas digestivas, síntesis de hemolinfa, mantenimiento de hemolinfa, neurotransmisión, división celular, metabolismo energético, respiración y apoptosis.

En algunas formas de realización, la invención proporciona una célula huésped no humana transgénica que comprende un polinucleótido, una molécula de ácido nucleico, un gen quimérico, un casete de expresión o un vector recombinante de la invención. La célula huésped no humana transgénica puede incluir, pero sin limitación, una célula vegetal, una célula de levadura, una célula bacteriana o una célula de insecto. En consecuencia, en algunas formas de realización, la invención proporciona una célula bacteriana seleccionada de los géneros Bacillus, Brevibacillus, Clostridium, Xenorhabdus, Photorhabdus, Pasteuria, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, o Alcaligenes. Así, por ejemplo, como agentes biológicos de control de insectos, las proteínas Cry de la invención se pueden producir mediante la expresión de un gen quimérico que codifica las proteínas Cry de la invención en una célula bacteriana. Por ejemplo, en algunas formas de realización, se proporciona una célula de Bacillus thuringiensis que comprende un gen quimérico de la invención.

En formas de realización adicionales, la invención proporciona una célula de planta transgénica que es una célula de planta dicotiledónea o una célula de planta monocotiledónea. En formas de realización adicionales, la célula de planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en una célula de soja, una célula de girasol, una célula de tomate, una célula de una planta del género Brassica, una célula de algodón, una célula de remolacha azucarera y una célula de tabaco. En formas de realización adicionales, la célula monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en una célula de cebada, una célula de maíz, una célula de avena, una célula de arroz, una célula de sorgo, una célula de caña de azúcar y una célula de trigo. En algunas formas de realización, la invención proporciona una pluralidad de células dicotiledóneas o células monocotiledóneas que expresan una proteína Cry de la invención que está codificada por un gen quimérico de la invención. En otras formas de realización, la pluralidad de células se yuxtaponen para formar un apoplasto y se cultivan con luz solar natural.

En otras formas de realización de la invención, una proteína Cry insecticida de la invención se expresa en un organismo superior, por ejemplo, una planta. En este caso, las plantas transgénicas que expresan cantidades eficaces de la proteína insecticida están protegidas de plagas de plantas tales como plagas de insectos. Cuando un insecto comienza a alimentarse de una planta transgénica de este tipo, ingiere la proteína Cry insecticida expresada. Esto puede disuadir al insecto de seguir mordiendo el tejido de la planta o incluso puede dañar o matar al insecto. Un polinucleótido de la invención se inserta en un casete de expresión, que después se integra de forma estable en el genoma de la planta. En otras formas de realización, el polinucleótido se incluye en un virus autorreplicante no patógeno. Las plantas transformadas según la invención pueden ser monocotiledóneas o dicotiledóneas e incluyen, pero sin limitación, maíz, soja, arroz, trigo, cebada, centeno, avena, sorgo, mijo, girasol, cártamo, remolacha azucarera, algodón, caña de azúcar, colza, alfalfa, tabaco, cacahuetes, hortalizas, incluidos boniatos, judías, guisantes, achicoria, lechuga, col, coliflor, brócoli, nabo, zanahoria, berenjena, pepino, rábano, espinaca, patata, tomate, espárragos, cebolla, ajo, melones, pimiento, apio, calabaza, calabacín, frutas, incluidas manzana, pera, membrillo, ciruela, cereza, melocotón, nectarina, albaricoque, fresa, uva, frambuesa, mora, piña, aguacate, papaya, mango, plátano y plantas especiales, tales como Arabidopsis, y plantas leñosas, tales como coníferas y árboles de hoja caduca. Preferentemente, las plantas de la invención son plantas de cultivo tales como maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, colza y similares.

Una vez que un polinucleótido deseado se ha transformado en una especie de planta particular, se puede propagar en esa especie o trasladarse a otras variedades de la misma especie, incluidas, en particular, las variedades comerciales, usando técnicas de reproducción tradicionales.

Un polinucleótido de la invención se expresa en plantas transgénicas, provocando así la biosíntesis de la proteína Cry correspondiente, ya sea en forma de protoxina o de toxina madura, en las plantas transgénicas. De esta forma, se generan plantas transgénicas con mayor protección del rendimiento en presencia de presión de insectos. Para su expresión en plantas transgénicas, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden requerir modificación y optimización. Aunque en muchos casos los genes de organismos microbianos pueden expresarse en plantas a altos niveles sin modificación, la baja expresión en plantas transgénicas puede ser el resultado de secuencias de nucleótidos microbianos que tienen codones que no son preferidos en plantas. Se sabe en la técnica que los organismos vivos tienen preferencias específicas con respecto al uso de codones, y los codones de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente invención se pueden cambiar para ajustarse a las preferencias de las plantas, manteniendo mientras los aminoácidos codificados por las mismas. Además, la alta expresión en plantas, por ejemplo plantas de maíz, se logra mejor a partir de secuencias codificantes que tienen al menos el 35% de contenido de GC, o al menos el 45%, o al menos el 50%, o al menos el 60%. Las secuencias de nucleótidos microbianos que tienen un bajo contenido de GC pueden expresarse deficientemente en las plantas debido a la existencia de motivos ATTTA que pueden desestabilizar los mensajes y de motivos AATAAA que pueden provocar una poliadenilación inapropiada. Aunque determinadas secuencias de genes pueden expresarse adecuadamente tanto en especies de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para tener en cuenta las preferencias específicas de codones y las preferencias de contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que se ha demostrado que estas preferencias difieren (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Además, las secuencias de nucleótidos se criban para detectar la existencia de sitios de corte y empalme ilegítimos que puedan provocar el truncamiento del mensaje. Todos los cambios que deben realizarse dentro de las secuencias de nucleótidos, tales como los descritos anteriormente, se realizan utilizando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigida al sitio, PCR y construcción de genes sintéticos utilizando los procedimientos descritos, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5.625.136, 5.500.365 y 6.013.523.

En algunas formas de realización, la invención proporciona secuencias de codificación sintéticas o polinucleótidos elaborados según el procedimiento divulgado en la patente de Estados Unidos N° 5.625.136. En este procedimiento, se utilizan codones preferidos del maíz, es decir, el único codón que codifica con mayor frecuencia ese aminoácido en el maíz. El codón preferido del maíz para un aminoácido particular puede derivarse, por ejemplo, de secuencias génicas conocidas del maíz. Por ejemplo, el uso de codones de maíz para 28 genes de plantas de maíz se encuentra en Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989). Las secuencias sintéticas ejemplificadas específicamente de la presente invención producidas con codones optimizados de maíz están representadas por cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9. Se reconoce que los codones optimizados para la expresión en una especie de planta también funcionarán en otras especies de plantas, pero posiblemente no al mismo nivel que las especies de plantas para las que se optimizaron los codones. De esta manera, las secuencias de nucleótidos pueden optimizarse para la expresión en cualquier planta. Se reconoce que puede optimizarse o sintetizarse la totalidad o cualquier parte de una secuencia de nucleótidos. Es decir, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que es en parte secuencia nativa y en parte secuencia con codones optimizados.

Para un inicio eficaz de la traducción, las secuencias adyacentes a la metionina iniciadora pueden requerir modificaciones. Por ejemplo, pueden modificarse mediante la inclusión de secuencias que se sabe que son eficaces en las plantas. Joshi ha sugerido un consenso apropiado para las plantas (NAR 15:6643-6653 (1987)) y Clonetech sugiere otro iniciador de traducción por consenso (catálogo 1993/1994, página 210). Estos consensos son adecuados para su uso con las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Las secuencias se incorporan en constructos que comprenden las secuencias de nucleótidos, hasta e incluido el ATG (dejando el segundo aminoácido sin modificar), o alternativamente hasta e incluido el GTC posterior al ATG (con la posibilidad de modificar el segundo aminoácido del transgén).

Las nuevas secuencias codificantes de la proteína Cry de la invención, ya sea como su secuencia nativa o como secuencias sintéticas tal como se ha descrito anteriormente, pueden fusionarse operativamente con una diversidad de promotores para la expresión en plantas, incluidos promotores constitutivos, inducibles, regulados temporalmente, regulados por el desarrollo, regulados químicamente, preferidos de tejido y específicos de tejido para preparar moléculas de ADN recombinante, es decir, genes quiméricos. La elección del promotor variará en función de los requisitos temporales y espaciales para la expresión, y también en función de la especie diana. Por lo tanto, se prefiere la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en hojas, tallos o tallos, espigas, inflorescencias (por ejemplo, espigas, panículas, mazorcas, etc.), raíces o plántulas. En muchos casos, sin embargo, se busca la protección contra más de un tipo de plaga de insectos y, por lo tanto, es deseable la expresión en múltiples tejidos. Aunque se ha demostrado que muchos promotores de dicotiledóneas son operativos en monocotiledóneas y viceversa, de forma ideal se seleccionan promotores de dicotiledóneas para la expresión en dicotiledóneas, y promotores de monocotiledóneas para la expresión en monocotiledóneas. Sin embargo, no hay restricción a la procedencia de los promotores seleccionados; es suficiente que sean operativos para impulsar la expresión de las secuencias de nucleótidos en la célula deseada.

Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de CaMV 35S (SEQ ID NO: 1546; Odell et al., Nature 313:810-812, 1985); promotor de arabidopsis At6669 (SEQ ID NO: 1652; véase la publicación PCT N° WO04081173A2); Ubi 1 de maíz (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); CaMV 19S (Nilsson et al., Physiol. Plant 100:456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al., Plant J November; 2(6):837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992);ciclofilina de arroz (Bucholz et al., Plant Mol Biol. 25(5):837-43, 1994); histona H3 de maíz (Lepetit et al., Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); actina 2 (An et al., Plant J. 10(1 );107-121, 1996), promotor CT2 de punta de raíz constitutivo (SEQ ID NO: 1535; véase también la publicación ^pC^t N° IL/2005/000627) y Synthetic Super MAS (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Otros promotores constitutivos incluyen los de las patentes de Estados Unidos N° 5.659.026, 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121,5.569.597, 5.466.785, 5.399.680, 5.268.463 y 5.608.142. Molec. Biol.

Promotores específicos de tejido o preferenciales de tejido útiles para la expresión de las nuevas secuencias codificantes de proteína Cry de la invención en plantas, particularmente maíz, son aquellos que dirigen la expresión en raíces, médula, hojas o polen. Los promotores específicos de tejido adecuados incluyen, pero sin limitación, promotores específicos de hojas [tales como los descritos, por ejemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; and Matsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993], promotores preferidos de semillas [por ejemplo, de genes específicos de semillas (Simon et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), albúmina de nuez de Brasil (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235-245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), zeína (Matzke et al., Plant Mol Biol, 143).323-321990), napA (Stalberg, et al., Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171-184, 1997), oleosina de girasol (Cummins, et al., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992)], promotores específicos del endospermo [por ejemplo, LMW y HMW de trigo, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216:81-90, 1989; NAR 17:461-2), gliadinas a, b y g de trigo (EMB03:1409-15, 1984), promotor ltrl de cebada, hordeína B1, C, D de cebada (Theor Appl Gen 98:1253-62, 1999; Plant J 4:343-55, 1993; Mol Gen Genet 250:750-60, 1996), DOF de cebada (Mena et al., The Plant Journal, 116(1): 53-62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina de arroz NRP33, globulina de arroz Glb-1 (Wu et al., Plant Cell Physiology 39(8) 885-889, 1998), alfa-globulina de arroz REB/OHP-1 (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADp-glucosa PP de arroz (Trans Res 6:157-68, 1997), familia génica ESR de maíz (Plant J 12:235-46, 1997), gamma-kafirina de sorgo (Plant Mol. Biol 32:1029-35, 1996)], promotores específicos de embriones [por ejemplo, OSH1 de arroz (Sato et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117­ 8122), KNOX (Postma-Haarsma et al., Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et al., J. Biochem., 123:386, 1998)], promotores específicos de flores [por ejemplo, AtPRP4, caleno sintasa (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al., Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apetala-3, tejidos reproductivos de plantas [por ejemplo, promotores OsMADS (solicitud de patente de Estados Unidos 2007/0006344)].

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención también se pueden expresar bajo la regulación de promotores regulados químicamente. Esto permite que las proteínas Cry de la invención se sinteticen solo cuando las plantas de cultivo se tratan con los productos químicos inductores. En la solicitud publicada EP 0332 104 y en la patente de Estados Unidos N° 5.614.395 se detallan ejemplos de dicha tecnología para la inducción química de la expresión génica. En una forma de realización, el promotor regulado químicamente es el promotor PR-1a de tabaco.

Otra categoría de promotores útiles en la invención es la que es inducible por lesión. Se han descrito numerosos promotores que se expresan en sitios de lesiones y también en sitios de infección por fitopatógenos. Idealmente, un promotor de este tipo solo debería estar activo localmente en los sitios de invasión de insectos y, de esta forma, las proteínas insecticidas solo se acumularían en las células que necesitan sintetizar las proteínas insecticidas para matar la plaga de insectos invasora. Ejemplos de promotores de este tipo incluyen los descritos por Stanford et al. Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant Cell 1:151 -158 (1989), Rohrmeier y Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), y Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993).

Los ejemplos no limitantes de promotores que generan patrones de expresión específicos de tejidos que son útiles en la invención incluyen los específicos de tejidos verdes, los específicos de raíces, los específicos de tallos o los específicos de flores. Los promotores adecuados para la expresión en tejido verde incluyen muchos que regulan genes implicados en la fotosíntesis y muchos de estos se han clonado a partir de monocotiledóneas y dicotiledóneas. Uno de estos promotores es el promotor PEPC de maíz del gen de la fosfoenol carboxilasa (Hudspeth y Grula, Plant Molec.

Biol. 12:579-589 (1989)). Otro promotor de la expresión específica de la raíz es el descrito por de Framond (FEBS 290:103-106 (1991)) o la patente de Estados Unidos N° 5.466.785). Otro promotor útil en la invención es el promotor específico del tallo descrito en la patente de Estados Unidos N° 5.625.136, que naturalmente impulsa la expresión de un gen trpA de maíz.

Además de la selección de un promotor adecuado, los constructos para la expresión de una toxina insecticida en plantas requieren que un terminador de transcripción apropiado esté unido operativamente cadena abajo de la secuencia de nucleótidos heteróloga. Varios de estos terminadores están disponibles y son conocidos en la técnica (por ejemplo, tml de CaMV, E9 de rbcS). Cualquier terminador disponible que se sepa que funciona en plantas puede usarse en el contexto de la presente invención.

Se pueden incorporar muchas otras secuencias en los casetes de expresión descritos en la presente invención. Estas incluyen secuencias que se ha demostrado que mejoran la expresión, tales como secuencias de intrones (por ejemplo, de Adhl y broncel) y secuencias líder víricas (por ejemplo, de TMV, MCMV y AMV).

Puede ser preferible dirigir la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención a diferentes ubicaciones celulares en la planta. En algunos casos, la ubicación en el citosol puede ser deseable, mientras que en otros casos, puede preferirse la ubicación en algún orgánulo subcelular. Puede usarse cualquier mecanismo para dirigir productos génicos, por ejemplo, en plantas, para la puesta en práctica de la presente invención, y se sabe que dichos mecanismos existen en plantas y las secuencias que controlan el funcionamiento de estos mecanismos se han caracterizado con cierto detalle. Se han caracterizado secuencias que provocan el direccionamiento de productos génicos a otros compartimentos celulares. Las secuencias aminoterminales pueden ser responsables de dirigir una proteína de interés a cualquier compartimento celular, tal como una vacuola, mitocondria, peroxisoma, cuerpos proteicos, retículo endoplasmático, cloroplasto, gránulo de almidón, amiloplasto, apoplasto o pared celular de una planta (por ejemplo, Unger et. al. Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989); Rogers et. al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6512-651; patente de Estados Unidos N° 7.102.057; documento WO 2005/096704. Opcionalmente, la secuencia señal puede ser una secuencia señal N-terminal de cerosa, una secuencia señal N-terminal de gammazeína, un dominio de unión a almidón, un dominio de unión a almidón C-terminal, una secuencia de direccionamiento al cloroplasto, que importa la proteína madura al cloroplasto (Comai et. al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15104-15109; van den Broeck, et. al. (1985) Nature 313: 358-363; patente de Estados Unidos N° 5.639.949) o una secuencia de señal de secreción de células de aleurona (Koehler y Ho, Plant Cell 2: 769-783 (1990)). Además, las secuencias amino terminales junto con las secuencias carboxi terminales son responsables del direccionamiento a vacuolas de los productos génicos (Shinshi et. al. (1990) Plant Molec. Biol. 14: 357-368). En una forma de realización, la secuencia señal seleccionada incluye el sitio de escisión conocido, y la fusión construida tiene en cuenta cualquier aminoácido después del sitio o sitios de escisión, que se requieren para la escisión. En algunos casos, este requisito puede cumplirse mediante la adición de un pequeño número de aminoácidos entre el sitio de escisión y el ATG del transgén o, alternativamente, la sustitución de algunos aminoácidos dentro de la secuencia del transgén. Estas técnicas de construcción son bien conocidas en la técnica y son igualmente aplicables a cualquier compartimento celular.

Se reconocerá que los mecanismos descritos anteriormente para el direccionamiento celular pueden utilizarse no solo junto con sus promotores afines, sino también junto con promotores heterólogos para lograr un objetivo de direccionamiento celular específico bajo la regulación transcripcional de un promotor que tiene un patrón de expresión diferente al del promotor del que se deriva la señal de direccionamiento.

Transformación de plantas

Los procedimientos para transformar plantas son bien conocidos y rutinarios en la técnica y se describen a lo largo de la literatura. Los ejemplos no limitantes de procedimientos para la transformación de plantas incluyen la transformación mediante suministro de ácido nucleico mediado por bacterias (por ejemplo, a través de Agrobacterium), suministro de ácido nucleico mediado por virus, suministro de ácido nucleico mediado por filamentos de ácido nucleico o carburo de silicio, suministro de ácido nucleico mediado por liposomas, microinyección, bombardeo de micropartículas, transformación mediada por fosfato de calcio, transformación mediada por ciclodextrina, electroporación, transformación mediada por nanopartículas, sonicación, infiltración, captación de ácido nucleico mediada por PEG, así como cualquier otro mecanismo eléctrico, químico, físico (mecánico) o biológico que dé como resultado la introducción de ácido nucleico en la célula vegetal, incluida cualquier combinación de los mismos. Las guías generales para varios procedimientos de transformación de plantas conocidos en la técnica incluyen Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. y Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), páginas 67-88) y Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002)).

Para la transformación mediada por Agrobacterium, son adecuados los vectores binarios o los vectores que portan al menos una secuencia de borde de ADN-T, mientras que para la transferencia directa de genes (por ejemplo, bombardeo de partículas y similares) cualquier vector es adecuado y puede usarse ADN lineal que contiene solo la construcción de interés. En el caso de la transferencia directa de genes, se puede utilizar la transformación con una sola especie de ADN o la cotransformación (Schocher et al., Biotechnology 4:1093-1096 (1986)). Tanto para la transferencia directa de genes como para la transferencia mediada por Agrobacterium, la transformación generalmente (pero no necesariamente) se lleva a cabo con un marcador seleccionable que puede ser una selección positiva (fosfomanosa isomerasa), proporcionar resistencia a un antibiótico (kanamicina, higromicina o metotrexato) o un herbicida (glifosato o glufosinato). No obstante, la elección del marcador seleccionable no es crítica para la invención.

La transformación mediada por Agrobacterium es un procedimiento que se utiliza comúnmente para transformar plantas debido a su alta eficacia de transformación y debido a su amplia utilidad con muchas especies diferentes. La transformación mediada por Agrobacterium generalmente implica la transferencia del vector binario que porta el ADN extraño de interés a una cepa de Agrobacterium apropiada que puede depender del complemento de genes vir portados por la cepa de Agrobacterium huésped ya sea en un plásmido Ti co-residente o cromosómicamente (Uknes et al. (1993) Plant Cell 5:159-169). La transferencia del vector binario recombinante a Agrobacterium se puede lograr mediante un procedimiento de apareamiento triparental utilizando Escherichia coli que porta el vector binario recombinante, una cepa de E. coli colaboradora que porta un plásmido que es capaz de movilizar el vector binario recombinante a la cepa de Agrobacterium diana. Alternativamente, el vector binario recombinante se puede transferir a Agrobacterium por transformación de ácidos nucleicos (Hofgen y Willmitzer (1988) Nucleic Acids Res. 16:9877).

Tanto las dicotiledóneas como las monocotiledóneas pueden transformarse utilizando Agrobacterium. Los procedimientos para la transformación del arroz mediada por Agrobacterium incluyen procedimientos bien conocidos para la transformación del arroz, tales como los descritos en cualquiera de los siguientes documentos: solicitud de patente europea EP 1198985 A1, Aldemita y Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan et al. (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994). En el caso de la transformación del maíz, el procedimiento preferido es tal como se describe en Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002). Dichos procedimientos se describen adicionalmente a modo de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, en: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo que se van a expresar se clonan preferentemente en un vector, que es adecuado para transformar Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711). Las agrobacterias transformadas por un vector de este tipo pueden utilizarse después de forma conocida para la transformación de plantas, tales como plantas utilizadas como modelo, tales como Arabidopsis o plantas de cultivo tales como, por ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas magulladas o hojas picadas en una solución agrobacteriana y después cultivándolas en medios adecuados. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hagen y Willmitzer en Nucl. Acid Res. (1988) 16, 9877 o se conoce, entre otros, por F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; en Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. S. D. Kung y R. Wu, Academic Press, 1993, páginas 15-38.

La transformación de una planta por Agrobacterium recombinante por lo general implica el co-cultivo del Agrobacterium con explantes de la planta y sigue procedimientos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera en un medio de selección que porta un marcador de resistencia a antibióticos o herbicidas entre los bordes del ADN-T del plásmido binario.

Tal como se ha explicado anteriormente, otro procedimiento para transformar plantas, partes de plantas y células de plantas implica impulsar partículas inertes o biológicamente activas en tejidos y células vegetales. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 4.945.050, 5.036.006 y 5.100.792. Generalmente, este procedimiento implica propulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células vegetales en condiciones eficaces para que atraviesen la superficie externa de la célula y que permitan su incorporación dentro del interior de la misma. Cuando se utilizan partículas inertes, el vector puede introducirse en la célula recubriendo las partículas con el vector que contiene el ácido nucleico de interés. Alternativamente, una célula o células pueden estar rodeadas por el vector, de modo que la estela de la partícula transporte el vector a la célula. También pueden impulsarse partículas biológicamente activas (por ejemplo, una célula de levadura desecada, una bacteria desecada o un bacteriófago, cada uno de los cuales contiene uno o más ácidos nucleicos que se pretende introducir) al interior del tejido vegetal.

En otras formas de realización, un polinucleótido de la invención se puede transformar directamente en el genoma plastídico. Una ventaja importante de la transformación plastídica es que los plástidos son generalmente capaces de expresar genes bacterianos sin modificaciones sustanciales, y los plástidos son capaces de expresar múltiples marcos de lectura abiertos bajo el control de un único promotor. La tecnología de transformación plastídica se describe ampliamente en las patentes de Estados Unidos N° 5.451.513, 5.545.817 y 5.545.818, en la solicitud PCT N° WO 95/16783, y en McBride et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. La técnica básica para la transformación de cloroplastos implica la introducción de regiones de ADN plastídico clonado que flanquean un marcador seleccionable junto con el gen de interés en un tejido diana adecuado, por ejemplo, utilizando transformación biolística o de protoplastos (por ejemplo, cloruro de calcio o transformación mediada por PEG). Las regiones flanqueantes de 1 a 1,5 kb, denominadas secuencias de direccionamiento, facilitan la recombinación homóloga con el genoma plastídico y, por tanto, permiten la sustitución o modificación de regiones específicas del plastoma. Inicialmente, las mutaciones puntuales en los genes rps12 y 16S rRNA del cloroplasto que confieren resistencia a la espectinomicina o la estreptomicina pueden utilizarse como marcadores seleccionables para la transformación (Svab, Z., Hajdukiewicz, P., y Maliga, P. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., y Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). La presencia de sitios de clonación entre estos marcadores permite la creación de un vector de direccionamiento a plástidos para la introducción de genes extraños (Staub, J.M. y Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601 606). Se pueden obtener aumentos sustanciales en la frecuencia de transformación reemplazando los genes recesivos de resistencia a los antibióticos del ARNr o de la proteína r con un marcador seleccionable dominante, el gen bacteriano aadA que codifica la enzima cletoxificadora de espectinomicina aminoglucósido-3'-adeniltransferasa (Svab, Z. y Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Anteriormente, este marcador se había utilizado con éxito para la transformación de alta frecuencia del genoma plastídico del alga verde Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Se conocen en la técnica otros marcadores seleccionables útiles para la transformación de plástidos y están incluidos dentro del alcance de la invención. Normalmente, se requieren aproximadamente 15-20 ciclos de división celular después de la transformación para alcanzar un estado homoplastídico. La expresión plastídica, en la que los genes se insertan mediante recombinación homóloga en la totalidad de los varios miles de copias del genoma plastídico circular presentes en cada célula vegetal, aprovecha la ventaja que supone el enorme número de copias sobre los genes expresados en el núcleo para permitir niveles de expresión que pueden superar fácilmente el 10% de la proteína vegetal soluble total. En una forma de realización, un polinucleótido de la invención puede insertarse en un vector de direccionamiento a plástidos y transformarse en el genoma plastídico de una planta huésped deseada. Así, se pueden obtener plantas homoplásticas para genomas plastídicos que contienen una secuencia de nucleótidos de la invención, que son capaces de mostrar una alta expresión del polinucleótido.

Los procedimientos de selección de plantas, células vegetales o cultivos de tejidos vegetales transgénicos transformados son rutinarios en la técnica y pueden emplearse en los procedimientos de la invención proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, un vector recombinante de la invención también puede incluir un casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos para un marcador seleccionable, que puede usarse para seleccionar una planta, una parte de una planta o una célula vegetal transformada. Tal como se utiliza en el presente documento, "marcador seleccionable" significa una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, imparte un fenotipo distinto a la planta, parte de la planta o célula vegetal que expresa el marcador y, por lo tanto, permite que dichas plantas, partes de plantas o células vegetales transformadas se distingan de aquellas que no tienen el marcador. Dicha secuencia de nucleótidos puede codificar un marcador seleccionable o cribable, dependiendo de si el marcador confiere un rasgo que puede seleccionarse por medios químicos, tales como, por ejemplo, mediante el uso de un agente selectivo (por ejemplo, un antibiótico, un herbicida o similar), o si el marcador es simplemente un rasgo que se puede identificar por medio de la observación o el ensayo, tal como, por ejemplo, mediante cribado (por ejemplo, el rasgo del locus R). Por supuesto, en la técnica se conocen muchos ejemplos de marcadores seleccionables adecuados y se pueden usar en los casetes de expresión descritos en el presente documento.

Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero sin limitación, una secuencia de nucleótidos que codifica neo o nptii, que confiere resistencia a la kanamicina, G418 y similares (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); una secuencia de nucleótidos que codifica bar, que confiere resistencia a la fosfinotricina; una secuencia de nucleótidos que codifica una 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSP) sintasa alterada, que confiere resistencia al glifosato (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); una secuencia de nucleótidos que codifica una nitrilasa tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confiere resistencia al bromoxinilo (Stalker et al. (1988) Science 242: 419-423); una secuencia de nucleótidos que codifica una acetolactato sintasa (ALS) alterada que confiere resistencia a la imidazolinona, la sulfonilurea u otros productos químicos inhibidores de la ALS (solicitud de patente EP N° 154204); una secuencia de nucleótidos que codifica una dihidrofolato reductasa resistente a metotrexato (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); una secuencia de nucleótidos que codifica una dalapón deshalogenasa que confiere resistencia al dalapón; una secuencia de nucleótidos que codifica una manosa-6-fosfato isomerasa (también conocida como fosfomanosa isomerasa (PMI)) que confiere la capacidad de metabolizar la manosa (patentes de Estados Unidos N° 5.767.378 y 5.994.629); una secuencia de nucleótidos que codifica una antranilato sintasa alterada que confiere resistencia al 5-metiltriptófano; o una secuencia de nucleótidos que codifica hph que confiere resistencia a la higromicina. Un experto en la técnica es capaz de elegir un marcador seleccionable adecuado para su uso en un casete de expresión de la presente invención.

Los marcadores seleccionables adicionales incluyen, pero sin limitación, una secuencia de nucleótidos que codifica pglucuronidasa o uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen varios sustratos cromogénicos; una secuencia de nucleótidos del locus R que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en los tejidos vegetales (Dellaporta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac" 263-282 en: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson y Appels eds., Plenum Press 1988)); una secuencia de nucleótidos que codifica la p-lactamasa, una enzima para la que se conocen varios sustratos cromogénicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogénica) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); una secuencia de nucleótidos que codifica xylE que codifica una catecol dioxigenasa (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105); una secuencia de nucleótidos que codifica la tirosinasa, una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaquinona, que a su vez se condensa para formar melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); una secuencia de nucleótidos que codifica la p-galactosidasa, una enzima para la que existen sustratos cromogénicos; una secuencia de nucleótidos que codifica la luciferasa (lux) que permite la detección de bioluminiscencia (Ow et al. (1986) Science 234: 856-859); una secuencia de nucleótidos que codifica aecuorina que puede emplearse en la detección por bioluminiscencia sensible al calcio (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268); o una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína fluorescente verde (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406). Un experto en la técnica es capaz de elegir un marcador seleccionable adecuado para su uso en un casete de expresión de la presente invención.

Además, como es bien sabido en la técnica, las plantas transgénicas intactas pueden regenerarse a partir de células vegetales transformadas, el cultivo de tejidos vegetales o protoplastos cultivados usando cualquiera de una diversidad de técnicas conocidas. La regeneración de plantas a partir de células vegetales, cultivo de tejidos vegetales o protoplastos cultivados se describe, por ejemplo, en Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMilan Publishing Co. Nueva York (1983)); y Vasil I. R. (ed.) (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I (1984), y Vol. II (1986)).

Además, las propiedades genéticas modificadas genéticamente en las semillas y plantas transgénicas, partes de plantas o células vegetales de la invención descritas anteriormente pueden transmitirse mediante reproducción sexual o crecimiento vegetativo y, por lo tanto, pueden conservarse y propagarse en plantas descendientes. En general, la conservación y la propagación utilizan procedimientos agrícolas conocidos desarrollados para adaptarse a fines específicos, tales como la cosecha, la siembra o la labranza.

Por lo tanto, un polinucleótido puede introducirse en la planta, parte de la planta o célula vegetal de varias maneras que son bien conocidas en la técnica, tal como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, no se depende de ningún procedimiento particular para introducir uno o más polinucleótidos en una planta, sino que se puede usar cualquier procedimiento que permita que uno o más polinucleótidos se integren de manera estable en el genoma de la planta. Cuando se va a introducir más de un polinucleótido, los respectivos polinucleótidos se pueden ensamblar como parte de una sola molécula de ácido nucleico, o como moléculas de ácido nucleico separadas, y se pueden ubicar en la misma o en diferentes moléculas de ácido nucleico. En consecuencia, los polinucleótidos se pueden introducir en la célula de interés en un solo evento de transformación, en eventos de transformación separados o, por ejemplo, en plantas, como parte de un protocolo de reproducción.

Formas de realización adicionales de la invención incluyen productos cosechados producidos a partir de plantas transgénicas o partes de las mismas de la invención, así como un producto procesado producido a partir de los productos cosechados. Un producto cosechado puede ser una planta completa o cualquier parte de la planta, tal como se describe en el presente documento. Así, en algunas formas de realización, los ejemplos no limitantes de un producto cosechado incluyen una semilla, una fruta, una flor o parte de la misma (por ejemplo, una antera, un estigma y similares), una hoja, un tallo y similares. En otras formas de realización, un producto procesado incluye, pero sin limitación, harina, sémola, aceite, almidón, cereal y similares producidos a partir de una semilla cosechada u otra parte de la planta de la invención, en el que dicha semilla u otra parte de la planta comprende una molécula de ácido nucleico/polinucleótido/secuencia de nucleótidos de la presente invención.

En otras formas de realización, la invención proporciona un extracto de una semilla transgénica o una planta transgénica de la invención, en la que el extracto comprende una molécula de ácido nucleico, un polinucleótido, una secuencia de nucleótidos o una proteína tóxica de la invención. Los extractos de plantas o partes de plantas se pueden preparar según procedimientos bien conocidos en la técnica (véanse de la Torre et al., Food, Agric. Environ. 2(1):84-89 (2004); Guidet, Nucleic Acids Res. 22(9): 1772-1773 (1994); Lipton et al., Food Agric. Immun. 12:153-164 (2000)).

Composiciones Insecticidas

En algunas formas de realización, la invención proporciona una composición insecticida que comprende una proteína Cry de la invención en un vehículo agrícolamente aceptable. Tal como se utiliza en el presente documento, un "vehículo agrícolamente aceptable" puede incluir material natural o sintético, orgánico o inorgánico que se combina con la proteína Cry activa para facilitar su aplicación a la planta o parte de la misma. Los ejemplos de vehículos aceptables en agricultura incluyen, sin limitación, polvos, agentes de espolvoreo, microgránulos, gránulos, pulverizaciones, emulsiones, coloides y soluciones. Los vehículos agrícolamente aceptables incluyen además, pero sin limitación, componentes inertes, dispersantes, tensioactivos, adyuvantes, agentes de adherencia, adhesivos, aglutinantes o combinaciones de los mismos, que pueden usarse en formulaciones agrícolas. Dichas composiciones se pueden aplicar de cualquier forma que ponga en contacto las proteínas plaguicidas u otros agentes de control de plagas con las plagas. En consecuencia, las composiciones se pueden aplicar a las superficies de plantas o partes de plantas, incluidas semillas, hojas, flores, tallos, tubérculos, raíces y similares. En otras formas de realización, una planta que produce una proteína Cry de la invención in planta es un vehículo agrícola de la proteína Cry expresada.

En formas de realización adicionales, la composición insecticida comprende una célula bacteriana o una célula bacteriana transgénica de la invención, en la que la célula bacteriana o la célula bacteriana transgénica produce una proteína Cry de la invención. Dicha composición insecticida se puede preparar por desecación, liofilización, homogeneización, extracción, filtración, centrifugación, sedimentación o concentración de un cultivo de Bacillus thuringiensis (Bt). Dichos cultivos de Bt se pueden seleccionar del grupo de cepas de Bt que consisten en C0633, C0724, C1100 descritas a continuación en los Ejemplos o cultivos de Bt transgénicos. En formas de realización adicionales, la composición comprende de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 99% en peso de la proteína Cry de la invención.

Las proteínas Cry de la invención se pueden usar en combinación con otros agentes de control de plagas para aumentar el abanico de plagas diana o para la prevención o la gestión de la resistencia de los insectos. Por lo tanto, en algunas formas de realización, la invención proporciona una composición que controla una o más plagas de plantas, en la que la composición comprende una primera proteína Cry de la invención y un segundo agente de control de plagas diferente de la primera proteína Cry. En otras formas de realización, la composición es una formulación para la aplicación tópica a una planta. En otras formas de realización más, la composición es una planta transgénica. En formas de realización adicionales, la composición es una combinación de una formulación aplicada por vía tópica a una planta transgénica. En algunas formas de realización, la formulación comprende la primera proteína Cry de la invención cuando la planta transgénica comprende el segundo agente de control de plagas. En otras formas de realización, la formulación comprende el segundo agente de control de plagas cuando la planta transgénica comprende la primera proteína Cry de la invención.

En algunas formas de realización, el segundo agente de control de plagas puede ser un agente seleccionado del grupo que consiste en un plaguicida químico, tal como un insecticida, una proteína insecticida de Bacillus thuringiensis (Bt), una proteína insecticida de Xenorhabdus, una proteína insecticida de Photorhabdus, una proteína insecticida de Brevibacillus laterosporus, una proteína insecticida de Bacillus sphaericus, un inhibidor de la proteasa (tanto de tipo serina como de cisteína), lectinas, alfa-amilasa, peroxidasa, colesterol oxidasa y una molécula de ARN bicatenario (ARNbc).

En otras formas de realización, el segundo agente de control de plagas es un plaguicida químico seleccionado del grupo que consiste en piretroides, carbamatos, neonicotinoides, bloqueadores de los canales de sodio neuronales, lactonas macrocíclicas insecticidas, antagonistas del ácido gamma-aminobutírico (GABA), ureas insecticidas y miméticos de la hormona juvenil. En otras formas de realización, el plaguicida químico se selecciona del grupo que consiste en abamectina, acefato, acetamiprid, amidoflumet (S-1955), avermectina, azadiractina, azinfós-metilo, bifentrina, binfenazato, buprofezina, carbofurano, clorfenapir, clorfluazurón, clorpirifós, clorpirifós-metilo, cromafenozida, clotianidina, ciflutrina, beta-ciflutrina, cihalotrina, lambda-cihalotrina, cipermetrina, ciromazina, deltametrina, diafentiurón, diazinón, diflubenzurón, dimetoato, diofenolán, emamectina, endosulfán, esfenvalerato, etiprol, fenoticarb, fenoxicarb, fenpropatrina, fenproximato, fenvalerato, fipronil, flonicamid, flucitrinato, tau-fluvalinato, flufenerim (UR-50701), flufenoxurón, fonofós, halofenozida, hexaflumurón, imidacloprid, indoxacarb, isofenfós, lufenurón, malatión, metaldehído, metamidofós, metidatión, metomilo, metopreno, metoxicloro, monocrotofós, metoxifenozida, nitiazina, novalurón, noviflumurón (XDE-007), oxamilo, paratión, paratión-metilo, permetrina, forato, fosalona, fosmet, fosfamidón, pirimicarb, profenofós, pimetrozina, piridalilo, piriproxifeno, rotenona, espinosad, espiromesifina (BSN 2060), sulfofós, tebufenozida, teflubenzurón, teflutrina, terbufós, tetraclorvinfós, tiacloprid, tiametoxam, tiodicarb, tiosultap-sodio, tralometrina, triclorfón y triflumurón, aldicarb, oxamilo, fenamifós, amitraz, quinometionato, clorobencilato, cihexatina, dicofol, dienocloro, etoxazol, fenazaquina, óxido de fenbutatina, fenpropatrina, fenpiroximato, hexitiazox, propargita, piridabeno y tebufenpirad. En otras formas de realización más, el plaguicida químico se selecciona del grupo que consiste en cipermetrina, cihalotrina, ciflutrina y beta-ciflutrina, esfenvalerato, fenvalerato, tralometrina, fenoticarb, metomilo, oxamilo, tiodicarb, clotianidina, imidacloprid, tiacloprid, indoxacarb, espinosad, abamectina, avermectina, emamectina, endosulán, etiprol, fipronil, flufenoxurón, triflumurón, diofenolán, piriproxifeno, pimetrozina y amitraz.

En formas de realización adicionales, el segundo agente de control de plagas puede ser uno o más de cualquier número de proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis que incluyen, pero sin limitación, una proteína Cry, una proteína insecticida vegetativa (VIP) y quimeras insecticidas de cualquiera de las proteínas insecticidas anteriores. En otras formas de realización, el segundo agente de control de plagas es una proteína Cry seleccionada del grupo que consiste en Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ad, Cry1Ae, Cry1Af, Cry1Ag, Cry1Ah, CrylAi, Cry1Aj, Cry1Ba, Cry1Bb, Cry1Bc, Cry1Bd, Cry1Be, Cry1Bf, Cry1Bg, Cry1Bh, Cry1Bi, Cry1Ca, Cry1Cb, Cry1Da, Cry1Db, Cry1Dc, Cry1Dd, Cry1 Ea, Cry1 Eb, Cry1 Fa, Cry1 Fb, Cry1 Ga, Cry1 Gb, Cry1 Gc, Cry1 Ha, Cry1 Hb, Cry1 Hc, Cry1 la, Cry1 Ib, Cry1 Ic, Cry1 Id, Cry1 Ie, Cry1 If, Cry1 Ig, Cry1 Ja, Cry1 Jb, Cry1 Jc, Cry1 Jd, Cry1 Ka, Cry1 La, Cry1 Ma, Cry1 Na, Cry1 Nb, Cry2Aa, Cry2Ab, Cry2Ac, Cry2Ad, Cry2Ae, Cry2Af, Cry2Ag, Cry2Ah, Cry2Ai, Cry2Aj, Cry2Ak,Cry2Al, Cry2Ba, Cry3Aa, Cry3Ba, Cry3Bb, Cry3Ca, Cry4Aa, Cry4Ba, Cry4Ca, Cry4Cb, Cry4Cc, Cry5Aa, Cry5Ab, Cry5Ac, Cry5Ad, Cry5Ba, Cry5Ca, Cry5Da, Cry5Ea, Cry6Aa, Cry6Ba, Cry7Aa, Cry7Ab, Cry7Ac, Cry7Ba, Cry7Bb, Cry7Ca, Cry7Cb, Cry7Da, Cry7Ea, Cry7Fa, Cry7Fb, Cry7Ga, Cry7Gb, Cry7Gc, Cry7Gd, Cry7Ha, Cry7Ia, Cry7Ja, Cry7Ka, Cry7Kb, Cry7La, Cry8Aa, Cry8Ab, Cry8Ac, Cry8Ad, Cry8Ba, Cry8Bb, Cry8Bc, Cry8Ca, Cry8Da, Cry8Db, Cry8Ea, Cry8Fa, Cry8Ga, Cry8Ha, Cry8Ia, Cry8Ib, Cry8Ja, Cry8Ka, Cry8Kb, Cry8La, Cry8Ma, Cry8Na, Cry8Pa, Cry8Qa, Cry8Ra, Cry8Sa, Cry8Ta, Cry9Aa, Cry9Ba, Cry9Bb, Cry9Ca, Cry9Da, Cry9Db, Cry9Dc, Cry9Ea, Cry9Eb, Cry9Ec, Cry9Ed, Cry9Ee, Cry9Fa, Cry9Ga, Cry10Aa, Cry11 Aa, Cry11 Ba, Cry11 Bb, Cry12Aa,Cry13Aa, Cry14Aa, Cry14Ab, Cry15Aa, Cry16Aa, Cry17Aa, Cry18Aa, Cry18Ba, Cry18Ca, Cry19Aa, Cry19Ba, Cry19Ca, Cry20Aa, Cry20Ba, Cry21Aa, Cry21Ba, Cry21Ca, Cry21Da, Cry21Ea, Cry21Fa, Cry21Ga, Cry21Ha, Cry22Aa, Cry22Ab, Cry22Ba, Cry22Bb, Cry23Aa, Cry24Aa, Cry24Ba, Cry24Ca, Cry25Aa, Cry26Aa, Cry27Aa, Cry28Aa, Cry29Aa, Cry29Ba, Cry30Aa, Cry30Ba, Cry30Ca, Cry30Da, Cry30Db, Cry30Ea, Cry30Fa, Cry30Ga,Cry31Aa, Cry31Ab, Cry31Ac, Cry31Ad, Cry32Aa, Cry32Ab, Cry32Ba, Cry32Ca, Cry32Cb, Cry32Da, Cry32Ea, Cry32Eb, Cry32Fa, Cry32Ga, Cry32Ha, Cry32Hb, Cry321a, Cry32Ja, Cry32Ka, Cry32La, Cry32Ma, Cry32Mb, Cry32Na, Cry32Oa, Cry32Pa, Cry32Qa, Cry32Ra, Cry32Sa, Cry32Ta, Cry32Ua, Cry33Aa, Cry34Aa, Cry34Ab, Cry34Ac, Cry34Ba, Cry35Aa, Cry35Ab, Cry35Ac, Cry35Ba, Cry36Aa, Cry37Aa, Cry38Aa, Cry39Aa, Cry40Aa, Cry40Ba, Cry40Ca, Cry40Da, Cry41Aa, Cry41Ab, Cry41Ba, Cry42Aa, Cry43Aa, Cry43Ba, Cry43Ca, Cry43Cb, Cry43Cc, Cry44Aa, Cry45Aa, Cry46Aa Cry46Ab, Cry47Aa, Cry48Aa, Cry48Ab, Cry49Aa, Cry49Ab, Cry50Aa, Cry50Ba, Cry51Aa, Cry52Aa, Cry52Ba, Cry53Aa, Cry53Ab, Cry54Aa, Cry54Ab, Cry54Ba, Cry55Aa, Cry56Aa, Cry57Aa, Cry57Ab, Cry58Aa, Cry59Aa, Cry59Ba, Cry60Aa, Cry60Ba, Cry61Aa, Cry62Aa, Cry63Aa, Cry64Aa, Cry65Aa, Cry66Aa, Cry67Aa, Cry68Aa, Cry69Aa, Cry69Ab, Cry70Aa, Cry70Ba, Cry70Bb, Cry71Aa, Cry72Aa y Cry73Aa.

En formas de realización adicionales, el segundo agente de control de plagas es una proteína insecticida vegetativa Vip3 seleccionada del grupo que consiste en Vip3Aa1, Vip3Aa2, Vip3Aa3, Vip3Aa4, Vip3Aa5, Vip3Aa6, Vip3Aa7, Vip3Aa8, Vip3Aa9, Vip3Aa10, Vip3Aa11, Vip3Aa12, Vip3Aa13, Vip3Aa14, Vip3Aa15, Vip3Aa16 , Vip3Aa17, Vip3Aa18, Vip3Aa19, Vip3Aa20, Vip3Aa21, Vip3Aa22, Vip3Aa2 , Vip3Aa24, Vip3Aa25, Vip3Aa26, Vip3Aa27, Vip3Aa28, Vip3Aa29, Vip3Aa30, Vip3Aa31, Vip3Aa32, Vip3Aa33 , Vip3Aa34, Vip3Aa35, Vip3Aa36, Vip3Aa37, Vip3Aa38, Vip3Aa39, Vip3Aa40, Vip3Aa41, Vip3Aa42, Vip3Aa43, Vip3Aa44, Vip3Ab1, Vip3Ab2, Vip3Ac1, Vip3Ad1, Vip3Ad2, Vip3Ae1, Vip3Af1, Vip3Af2, Vip3Af3, Vip3Ag1, Vip3Ag2, Vip3Ag3 HM117633, Vip3Ag4, Vip3Ag5, Vip3Ah1, Vip3Ba1, Vip3Ba2, Vip3Bb1, Vip3Bb2 y Vip3Bb3.

En otras formas de realización más, la primera proteína Cry de la invención y el segundo agente de control de plagas se coexpresan en una planta transgénica. Esta coexpresión de más de un principio plaguicida en la misma planta transgénica puede realizarse modificando genéticamente una planta para que contenga y exprese todos los genes necesarios. Alternativamente, una planta, Parental 1, puede modificarse genéticamente para la expresión de la proteína Cry de la invención. Una segunda planta, Parental 2, puede modificarse genéticamente para la expresión de un segundo agente de control de plagas. Al cruzar la Parental 1 con la Parental 2, se obtienen plantas descendientes que expresan todos los genes introducidos en las Parentales 1 y 2.

En otras formas de realización, la invención proporciona una planta transgénica apilada resistente a la infestación por plagas de plantas que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARNbc para la supresión de un gen esencial en una plaga diana y una secuencia de ADN que codifica una proteína Cry de la invención que muestra actividad biológica contra la plaga diana. Se ha notificado que los ARNbc son ineficaces contra determinadas plagas de lepidópteros (Rajagopol et al. 2002. J. Biol. Chem. 277:468-494), probablemente debido al alto pH del intestino medio que desestabiliza el ARNbc. Por lo tanto, en algunas formas de realización en las que la plaga diana es una plaga de lepidópteros, una proteína Cry de la invención actúa reduciendo transitoriamente el pH del intestino medio que sirve para estabilizar el ARNbc coingerido haciendo que el ARNbc sea eficaz para silenciar los genes diana.

Además de proporcionar composiciones, la invención proporciona procedimientos para producir una proteína Cry tóxica para una plaga de lepidópteros. Dicho procedimiento comprende cultivar una célula huésped no humana transgénica que comprende un polinucleótido o un gen quimérico o una molécula de ácido nucleico o un vector recombinante de la invención en condiciones en las que la célula huésped produce una proteína tóxica para la plaga de lepidópteros. En algunas formas de realización, la célula huésped no humana transgénica es una célula vegetal. En algunas otras formas de realización, la célula vegetal es una célula de maíz. En otras formas de realización, las condiciones en las que se cultivan las células vegetales o las células de maíz incluyen la luz solar natural. En otras formas de realización, la célula huésped no humana transgénica es una célula bacteriana. En otras formas de realización más, la célula huésped no humana transgénica es una célula de levadura.

En otras formas de realización del procedimiento, la plaga de lepidópteros se selecciona del grupo que consiste en el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis), el gusano cortador negro (Agrotis Ípsilon), el cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), el gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea), el barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), la oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), el gusano falso medidor (Chrysodeixis includens), el barrenador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), el gusano cortador de frijol occidental (Richia albicosta), el gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), el barrenador asiático del maíz (Ostrinia furnacalis), el gusano cogollero del algodón (Helicoverpa armigera), el barrenador del tallo rayado (Chilo supresoris), el barrenador del tallo rosado (Sesamia calamistis) y el doblador de hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis) y cualquier combinación de los mismos.

En formas de realización adicionales del procedimiento, el gen quimérico comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 1 -3, o un fragmento de la misma que codifica la toxina. En otras formas de realización más, la proteína producida comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 10-12, o un fragmento toxina de la misma.

En algunas formas de realización del procedimiento, el gen quimérico comprende una secuencia de nucleótidos que tiene codones optimizados para la expresión en una planta. En otras formas de realización, el gen quimérico comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9, o un fragmento de la misma que codifica la toxina. En formas de realización adicionales, la proteína producida comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 10-15, o un fragmento toxina de la misma.

En formas de realización adicionales, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta transgénica resistente a plagas (por ejemplo, resistente a insectos), que comprende: introducir en una planta un polinucleótido, un gen quimérico, un vector recombinante, un casete de expresión o una molécula de ácido nucleico de la invención que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry de la invención, en el que la secuencia de nucleótidos se expresa en la planta, confiriendo así a la planta resistencia a al menos una plaga de insectos lepidópteros, y produciendo una planta transgénica resistente a insectos. En algunas formas de realización, una planta transgénica resistente a plagas es resistente al menos al barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) o al gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), en comparación con una planta de control que carece del polinucleótido, gen quimérico, vector recombinante, casete de expresión o molécula de ácido nucleico de la invención. En algunas formas de realización, la introducción se realiza mediante transformación de la planta. En otras formas de realización, la introducción se realiza cruzando una primera planta que comprende el gen quimérico, el vector recombinante, el casete de expresión o la molécula de ácido nucleico de la invención con una segunda planta diferente.

En algunas formas de realización, una planta transgénica de la invención que es resistente al menos al barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) o al gusano cortador negro (Agrotis ipsilon) es además resistente a al menos un insecto adicional, en el que el insecto adicional incluye, pero sin limitación, el cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda), el gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea), el barrenador de la caña de azúcar (Diatraea saccharalis), la oruga de las leguminosas (Anticarsia gemmatalis), el gusano falso medidor (Chrysodeixis includens), el barrenador del maíz del suroeste (Diatraea grandiosella), el gusano cortador de frijol occidental (Richia albicosta), el gusano cogollero del tabaco (Heliothis virescens), el barrenador asiático del maíz (Ostrinia furnacalis), el gusano cogollero del algodón (Helicoverpa armigera), el barrenador del tallo rayado (Chilo supresoris), el barrenador del tallo rosado (Sesamia calamistis) y el doblador de hojas de arroz (Cnaphalocrocis medinalis) y cualquier combinación de los mismos.

En formas de realización adicionales, se proporciona un procedimiento para controlar al menos una plaga de insectos lepidópteros tales como el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) o el gusano cortador negro (Agrotis ipsilon), comprendiendo el procedimiento administrar a los insectos una cantidad eficaz de una proteína Cry de la invención. Para ser eficaz, la proteína Cry en primer lugar es ingerida por vía oral por el insecto. Sin embargo, la proteína Cry puede administrarse al insecto de muchas formas reconocidas Las formas de administrar una proteína por vía oral a un insecto incluyen, pero sin limitación, proporcionar la proteína (1) en una planta transgénica, en la que el insecto come (ingiere) una o más partes de la planta transgénica, ingiriendo así el polipéptido que se expresa en la planta transgénica; (2) en una o varias composiciones proteicas formuladas que pueden aplicarse o incorporarse, por ejemplo, a medios de crecimiento de insectos; (3) en una o varias composiciones proteicas que pueden aplicarse a la superficie, por ejemplo, pulverizarse, sobre la superficie de una parte de la planta, que después es ingerida por el insecto cuando el insecto come una o más de las partes de la planta pulverizada; (4) una matriz de cebo; o (5) cualquier otro sistema de administración de proteínas reconocido en la técnica. Por lo tanto, se puede usar cualquier procedimiento de administración oral a un insecto para administrar las proteínas Cry tóxicas de la invención. En algunas formas de realización particulares, la proteína Cry de la invención se administra por vía oral a un insecto, en la que el insecto ingiere una o más partes de una planta transgénica.

En otras formas de realización, la proteína Cry de la invención se administra por vía oral a un insecto, en el que el insecto ingiere una o más partes de una planta pulverizada con una composición que comprende las proteínas Cry de la invención. La administración de las composiciones de la invención a la superficie de una planta se puede realizar usando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica para aplicar compuestos, composiciones, formulaciones y similares a las superficies de las plantas. Algunos ejemplos no limitantes de administración o puesta en contacto con una planta o parte de la misma incluyen pulverización, espolvoreado, rociado, esparcido, nebulización, atomización, difusión, remojo, inyección en el suelo, incorporación al suelo, empapamiento (por ejemplo, tratamiento del suelo o la raíz), inmersión, vertido, recubrimiento, infiltración en hojas o tallos, revestimiento de semillas o tratamiento de semillas, y similares, y combinaciones de los mismos. Estos y otros procedimientos para poner en contacto una planta o parte de la misma con uno o varios compuestos, composiciones o formulaciones son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas formas de realización, la invención abarca un procedimiento para proporcionar a un agricultor un medio para controlar una plaga de lepidópteros, comprendiendo el procedimiento suministrar o vender al agricultor material vegetal tal como una semilla, comprendiendo el material vegetal un polinucleótido, un gen quimérico, un casete de expresión o un vector recombinante capaz de expresar una proteína Cry de la invención en una planta cultivada a partir de la semilla, tal como se ha descrito anteriormente.

Las formas de realización de la presente invención se pueden entender mejor con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Identificación de cepas de Bt activas

Se cultivaron aislados de Bacillus thuringiensis a partir de esporas presentes en colecciones actuales y se mantuvieron en placas de agar con penicilina T3 . Cada aislado se cultivó aeróbicamente en bloques de 24 pocillos profundos durante aproximadamente 10 días a 28°C hasta la esporulación, que se verificó mediante tinción con azul de Coomasie/ácido acético y visualización con un microscopio. Después de la esporulación, se evaluaron la actividad de las fracciones soluble e insoluble frente a especies de lepidópteros de interés. Las fracciones se analizaron en un bioensayo de contaminación superficial, en el que las fracciones se superpusieron a una dieta artificial de múltiples especies. Cada aislado se evaluó frente a al menos cuatro especies de lepidópteros, incluidas Helicoverpa zea (gusano elotero del maíz), Agrotis Ípsilon (gusano cortador negro), Ostrinia nubilalis (barrenador europeo del maíz) y Spodoptera frugiperda (cogollero del maíz) con un tamaño de muestra de 12 larvas neonatas. La duración de cada ensayo fue de aproximadamente 7 días a temperatura ambiente; las placas se puntuaron por mortalidad así como por inhibición del crecimiento larvario. Se consideró activa la mortalidad observada al presentar un aumento del 30% con respecto al control negativo. Sobre la base de los ensayos iniciales con insectos, se seleccionaron las cepas C0633, C0724 y C1100 para su posterior análisis.

Ejemplo 2: Aislamiento y secuenciación de genes Bt

Construcción de la biblioteca genómica de fósmidos: Para algunas cepas de Bt que se identificaron en el ejemplo 1, los genes que codifican las proteínas supuestamente activas se aislaron utilizando un procedimiento de biblioteca de fósmidos esencialmente tal como se describe en Park et al. (FEMSLett. 284:28-34 (2008). La biblioteca de fósmidos se construyó usando un kit de producción de biblioteca de fósmidos CopyControl™ (Epicentre, Madison, WI) según el protocolo del fabricante. En resumen, el ADN purificado de cada cepa de Bt (aproximadamente 0,5 gg) se trató enzimáticamente para reparar los extremos romos y después se ligó en el vector del fósmido pCC1 FOS (Epicentre). Después del empaquetamiento in vitro en fagos lambda e infección de Escherichia coli (E.coli) EPI1300-T1®, las células bacterianas se sembraron en Luria-Bertani (LB) que contenía 12,5 gg/ml de cloranfenicol. Las placas se incubaron a aproximadamente 37°C durante 24 h antes de la selección de colonias. Las colonias de E. coli transfectadas se transfirieron a placas de 96 pocillos que contenían 150 gl de medio LB que contenía cloranfenicol y se incubaron a 37°C durante 24 h.

Cribado de hibridación de colonias: Se plaqueó una biblioteca de fósmidos a una densidad de 300 ufc por placa de 100 x 15 mm de L-agar más 15 gg/ml de cloranfenicol. Se plaquearon un total de 3000 fósmidos. Las hibridaciones de filtro se realizaron utilizando círculos de filtro Immobilon-Ny+ de 87 mm (EMD Millipore, Billerica, MA). Las extracciones de las colonias se llevaron a cabo de la siguiente manera: los filtros se dispusieron en placas durante aproximadamente 5 minutos, después, utilizando pinzas, los filtros se levantaron de la superficie del agar y se dispusieron con la colonia hacia arriba en papel de filtro Whatman empapado con NaOH 0,5 M durante 5 minutos. Los filtros con colonias se dispusieron después en papel de filtro Whatman empapado con 2X SSC durante 5 min. El ADN se inmovilizó a la membrana con un UV Stratalinker® ajustado a 2000 x 100 gJ (Stratagene, Inc., La Jolla, CA). A continuación, los filtros se secan al aire sobre papel de filtro Whatman. Los filtros se prehibridaron y se hibridaron en NaPO4250 mM, pH 7,0, SDS al 7%, BSA al 1 % a 65°C, tal como se describe por el proveedor. Los filtros de hibridación se lavaron con 2X SSC, 0,5% de SDS durante 30 min a 65°C, seguido de 0,2X SSC, 0,2% de SDS durante 30 min a 65°C. Los filtros se expusieron a una película de rayos X (Kodak® BIOMAX® XAR, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) durante la noche con pantallas intensificadoras a -80°C. Las colonias positivas se transfirieron a agar L con 15 gg/ml de cloranfenicol adicionales.

Sondas de hibridación: Se diseñaron cebadores de PCR para amplificar un fragmento de un gen de tipo cry2 del ADN genómico de una cepa de Bt denominada C0633. El par de cebadores incluía un cebador directo denominado OAR2609a con la secuencia GTTTAAACATGAATAATGTATTGAATAGCG (SEQ ID NO: 16) y un cebador inverso denominado OAR2610a con la secuencia GGCGCGCCTTAATACAGTGGTAGAAGATTAG (SEQ ID NO: 17). La reacción de PCR se llevó a cabo en las condiciones de ciclo siguientes: [94°C, 5 min], 25x [94°C, 30 s, 55°C, 30 s, 72°C 2 min]. La reacción contenía tampón 1X One Taq® (New England Biolabs, Beverly, m A), 200 gm dNTP, 80 ng de ADN, 2,5 U de ADN polimerasa One Taq®, 50 ng de cada cebador y agua destilada estéril hasta 50 gl de reacción total.

El amplicón resultante se separó en gel de TAE con agarosa al 1% que contenía bromuro de etidio. El amplicón se observó bajo luz ultravioleta y se separó del gel cortándolo. El ADN se aisló usando un kit de extracción en gel tal como se como describe por el proveedor (Qiagen, Valencia, CA). Las sondas se marcaron con EasyTide (á-32P) dCTP 3000 Ci/mmol (Perkin Elmer, Waltham, MA) utilizando el sistema de marcado de cebadores aleatorio Rediprime II (GE Healthcare, Pittsburgh, PA). Los nucleótidos no incorporados se eliminaron usando columnas de cromatografía Micro Bio-Spin 30 (Biorad, Hercules, CA). Las sondas se calentaron a 95°C durante 5 min antes de añadirlas a la solución de hibridación.

Secuenciación del gen Bt: Las preparaciones de ADN para 2-4 clones independientes se preparan siguiendo las instrucciones del fabricante (Qiagen). Las reacciones de secuenciación con cebadores diseñados para ambas cadenas de la secuencia de nucleótidos predicha de interés se llevaron a cabo utilizando el kit BigDye™ Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Los productos de reacción se sometieron a electroforesis en instrumentos de secuenciación ABI373 o ABI377. Todos los datos de secuenciación se analizan utilizando el paquete informático Phred/Phrap/Consed (Universidad de Washington) con una tasa de error igual o inferior a 10-4 al nivel de la secuencia consenso. La secuencia se montó con el programa Sequencher™ (Versión 4.7, Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI). Cada gen se secuenció con una cobertura de 4X.

Ejemplo 3. Clonación y síntesis del gen Bt

Se diseñaron pares de cebadores específicos de Cry2 para facilitar la identificación y la clonación de genes de tipo cry2. Se diseñó un par de cebadores para hibridarlos con un extremo 5' de un gen tipo cry2 con la adición de un sitio de restricción Pmel y a un extremo 3' con la adición de un sitio de restricción AscI. El cebador directo 5' se denominó OAR2609a con la secuencia GTTTAAACATGAATAATGTATTGAATAGG (SEQ ID NO: 16) y un cebador inverso OAR2610a que tiene la secuencia GGCGCGCCCTACTCTTGTGTTTCAATAAA (SEQ ID NO: 17). Los sitios de restricción insertados están subrayados en los cebadores respectivos. La reacción de PCR se llevó a cabo utilizando las condiciones de ciclo siguientes: 30x [98°C, 10 s, 55°C, 30 s, 72°C, 2 min]. La reacción contenía tampón HF Phusion 1X, dNTP 200 |um, 80 ng de ADN, 1 U de ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs), 50 ng de cada cebador y agua destilada estéril hasta 50 |ul de reacción total.

La reacción de PCR se limpió con el kit de limpieza y concentrado de ADN de Zymo Research. El ADN se digirió con 10 U de AscI (New England Biolabs) con 2,4 ug de amplicón, tampón 1X Cutsmart en 40 ul y después se incubó a 37°C durante 3 horas. El ADN digerido se limpió utilizando el kit de limpieza y concentrado de ADN de Zymo Research.

El amplicón resultante se clonó en el vector TOPO pCR 4.0 tal como se describe por el proveedor (Life Technologies). El ADN plasmídico aislado se digirió con Pmel y AscI según se describe por el proveedor (New England Biolabs).

El fragmento PmeI/AscI se clonó en un vector lanzadera denominado pCIB5634 diseñado para la expresión tanto en E. coli como en B. thuringiensis. El vector pCIB5634 se digirió con Pmel y AscI. El vector digerido y el fragmento del gen se purificaron exponiéndolos en un gel basado en tampón Tris Acetato EDTA con agarosa al 1%. Los fragmentos se recortaron del gel y se limpiaron con el kit de extracción de gel de QIAGEN, tal como se describe por el proveedor. Los fragmentos se ligaron entre sí utilizando un kit de ligadura de New England Biolabs tal como se describe por el proveedor. La reacción de ligadura se transformó en células TOP10 (Life Technologies) tal como se describe por el proveedor y se plaquearon en L-agar que contenía 100 mg/ml de ampicilina. El ADN del plásmido se aisló de una única colonia y el clon identificado se secuenció de nuevo con una cobertura de 2X para confirmar la secuencia correcta.

Algunos genes Bt que se seleccionaron para la producción recombinante pero que no se clonaron directamente del ADN genómico se enviaron a proveedores externos para la síntesis de genes completos. Estos genes de Bt sintetizados se subclonaron en los vectores lanzadera descritos anteriormente para su posterior expresión y ensayo de actividad biológica adicional.

Ejemplo 4. Ensamblaje y análisis del genoma

Algunos genes cry de Bt de la invención se aislaron de las cepas identificadas en el ejemplo 1 usando un enfoque de secuenciación del genoma completo. En resumen, se cortó ADN de Bacillus utilizando un dispositivo ultrasónico Covaris S2 (Covaris, Inc., Woburn, MA) con el programa DNA_400bp ajustado al ciclo de trabajo siguiente: 10%; intensidad: 4; ciclos/ráfaga: 200. El ADN se trató con el módulo de reparación de extremos/formación de colas de dA NEBNext® Ultra™ (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA). Se ligaron adaptadores de Bioscience con los índices 1-57(1 -27 Brasil, 28-57 Estados Unidos, Reino Unido y Suiza) usando NEB Quick Ligation™ tal como se describe por el proveedor (New England Biolabs, Inc. Ipswich, MA). Las ligaduras se limpiaron usando perlas Agencourt AMPure XP tal como describe por el proveedor (Beckman Coulter, Inc., Indianapolis, IN).

La biblioteca se fraccionó por tamaño de la forma siguiente: se mezcló una muestra de 50 ul con 45 ul de mezcla de perlas al 75% (perlas AMPure al 25% más solución de NaCl/PEG al 75%, TekNova, N° de cat. P4136). La mezcla se agitó y se dispuso en una rejilla magnética. El sobrenadante resultante se transfirió a un pocillo nuevo y se añadieron 45 ul de mezcla de perlas al 50% (perlas AMPure al 50% más solución de NaCl/PEG al 50%, TekNova, N° de cat. P4136). Esta mezcla se agitó y se dispuso en una rejilla magnética. Se eliminó el sobrenadante resultante y se lavaron las perlas con etanol al 80%. Se añadieron 25 ul de tampón de elución (EB) y se dispuso la mezcla en una rejilla magnética. El sobrenadante resultante final se eliminó y se dispuso en un tubo de 1,5 ml. Este procedimiento produjo bibliotecas con un intervalo de tamaño de 525 pares de bases de ADN (pb) (inserto más adaptador).

La biblioteca de ADN dimensionada se amplificó usando KAPA Biosystem HiFi Hot Start (Kapa Biosystems, Inc., Wilmington, MA) usando las condiciones de ciclo siguientes: [98°C, 45 s]; 12 x [98°C, 15 s, 60°C, 30 s, 72°C, 30 s];

[72°C, 1 min]. Cada reacción contenía: 5 ul de biblioteca de a Dn , 1 ul de cebador universal de Bioscience (25 uM), 18 ul de agua estéril, 1 ul de cebador indexado de Bioscience (25 uM), 25 ul de polimerasa 2X KAPA HiFi.

Las bibliotecas se sometieron al bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) utilizando chips de alta sensibilidad para determinar el intervalo de tamaño de la biblioteca y el tamaño medio del inserto. Todas las bibliotecas se procesaron para la secuenciación de extremos emparejados (PE) (100 ciclos por lectura; 12-24 bibliotecas por carril) en un sistema de secuenciación HiSeq 2500 utilizando los protocolos de secuenciación estándar del fabricante (Illumina, Inc., San Diego, CA).

Se utilizó una herramienta de análisis computacional de Bacillus desarrollada para identificar y caracterizar los posibles genes de tipo Cry para priorizar los más favorables para evaluarlos en pruebas de laboratorio adicionales.

El ensamblaje y análisis del genoma así como el análisis de la biblioteca genómica descritos anteriormente llevaron a la identificación de tres genes de tipo Cry2 en las cepas de Bacillus thuringiensis con toxicidad al menos para el barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis) o gusano elotero del maíz (Helicoverpa zea). Las características de identificación de los genes y proteínas de tipo Cry2 se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Genes/proteínas Cry identificados en cepas de Bacillus thuringiensis.

Ejemplo 5. Homología de BT0016, BT0026 y BT0032 con proteínas Cry de Bt conocidas

Una búsqueda en bases de datos de proteínas con las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención revela que son homólogas a proteínas insecticidas conocidas. La comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas de la invención con la base de datos no redundante (nr) mantenida por el NCBI (sitio de Internet en ncbi.nlm.nih.gov) utilizando el algoritmo BLAST reveló que las proteínas de la invención tienen la mayor identidad con las proteínas de la familia Cry2. Más específicamente, BT0016 tiene aproximadamente el 71% de identidad con las proteínas Cry2A, ejemplos de las cuales se pueden encontrar en NCBI con los números de acceso M31738, M23724, X57252, AF200816, AAQ52362, EF439818, ACH91610 y EU939453, y aproximadamente el 88% de identidad con las proteínas Cry2B, cuyas secuencias de ejemplo se pueden encontrar en NCBI con los números de acceso KC156658 y KF014123. BT0026 tiene aproximadamente el 77% de identidad con las proteínas Cry2A y aproximadamente el 66% de identidad con las proteínas Cry2B. BT0032 tiene aproximadamente el 88% de identidad con las proteínas Cry2A y aproximadamente el 72% de identidad con las proteínas Cry2B.

Ejemplo 6. Expresión de proteína de Bt en células huésped recombinantes

Expresión en Bacillus. Las proteínas Cry descritas en el ejemplo 4 se expresaron en una cepa sin cristales de Bacillus thuringiensis (Bt) que no tiene actividad insecticida de fondo observable a través de un vector lanzadera denominado pCIB5634', diseñado para la expresión tanto en E. co licomo en Bt. El vector pCIB5634 comprende un promotor CryAc que impulsa la expresión del gen Cry de Bt clonado y un marcador de resistencia a la eritromicina. Los casetes de expresión que comprenden la secuencia de codificación de Cry de interés se transformaron en la cepa de Bt huésped por medio de electroporación y las cepas de Bt transgénicas se seleccionaron en placas de agar que contenían eritromicina. Las cepas de Bt seleccionadas se cultivaron hasta la fase de esporulación en medio T3 a 28°C durante 4-5 días. Los sedimentos celulares se recogieron y se lavaron iterativamente antes de la solubilización en tampón de carbonato (50 mM) de pH alto que contenía DTT 2 mM.

Expresión en E. coli. Las proteínas Cry se expresaron en cepas de E. coli que utilizan vectores pET28a o pET29a (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania). Los constructos se transformaron por electroporación y los clones de E. coli transgénicos se seleccionaron en placas de agar que contenían kanamicina. Las cepas de E. coli transgénicas seleccionadas se cultivaron y se indujo la expresión de la proteína Cry usando inducción con IPTG a 28°C. Las células se resuspendieron en tampón de carbonato (50 mM) de pH alto que contenía DTT 2 mM y después se rompieron usando un homogeneizador Microfluidics LV-1.

Análisis de la expresión. Los lisados celulares resultantes de cepas de Bt o E. coli transgénicas se clarificaron después mediante centrifugación y se analizó la pureza de las muestras mediante SDS-PAGE y electroferograma utilizando un sistema BioRad Experion (Biorad, Hercules, CA). Las concentraciones de proteína total se determinaron por medio del ensayo Bradford o Thermo 660. A continuación, las proteínas Cry purificadas se analizaron en los bioensayos que se describen a continuación.

Ejemplo 7. Actividad de proteínas Cry en bioensayos

Las proteínas Cry producidas en el ejemplo 6 se sometieron a ensayo frente a una o varias de las siguientes especies de plagas de insectos utilizando un procedimiento de bioensayo de dieta artificial reconocido en la técnica: el cogollero del maíz (FAW; Spodoptera frugiperda), el gusano elotero del maíz (CEW; Helicoverpa zea), el barrenador europeo del maíz (ECB; Ostrinia nubilalis), el gusano cortador negro (BCW; Agrotis ipsilon), el barrenador de la caña de azúcar (SCB; Diatraea saccharalis), la oruga de las leguminosas (VBC; Anticarsiagemmatalis), el gusano falso medidor (SBL; Pseudoplusia includens), el barrenador del maíz del suroeste (SWCB; Diatraea grandiosella), el gusano cortador de frijol occidental (WBCW; Striacosta albicosta), el gusano cogollero del tabaco (TBW; Heliothis virescens), el barrenador asiático del maíz (ACB; Ostrinia furnacalis), el gusano cogollero del algodón (CBW; Helicoverpa armigera), el barrenador del tallo rayado (SSB; Chilo supresoris), el barrenador del tallo rosado (PSB; Sesamia calamistis) y el doblador de hojas de arroz (RLF; Cnaphalocrocis medinalis).

Se aplicó una cantidad igual de proteína en solución a la superficie de una dieta artificial para insectos (Bioserv, Inc., Frenchtown, NJ) en placas de 24 pocillos. Después de que la superficie de la dieta se secara, se añadieron a cada pocillo larvas de las especies de insectos que se estaban sometiendo a ensayo. Las placas se sellaron y se mantuvieron en condiciones ambientales de laboratorio con respecto a la temperatura, la iluminación y la humedad relativa. Un grupo de control positivo consistió en larvas expuestas a una cepa de Bacillus de tipo silvestre muy activa y de amplio espectro. Los grupos de control negativo consistieron en larvas expuestas a la dieta de insectos tratada solo con la solución tampón y larvas con dieta de insectos no tratada; es decir, dieta sola. La mortalidad se evaluó después de aproximadamente 120 horas y se puntuó con respecto a los controles.

Los resultados se muestran en la tabla 2, en la que significa que no hay actividad en comparación con el grupo de control, ''+/-'' significa el 0-10 % de actividad en comparación con el control (esta categoría también incluye el 0% de mortalidad con una fuerte inhibición del crecimiento larvario), un "+" significa el 10-25% de actividad en comparación con el control, "++" significa el 26-75% de actividad en comparación con el control y "+++" el 76-100% de actividad en comparación con el control. La designación "nt" en la tabla 2 significa que la proteína indicada no se sometió a ensayo contra esa plaga en particular.

Tabla 2. Resultados de bioensayos con proteínas Cry.

Ejemplo 8. Vectorización de genes para la expresión en plantas

Antes de la expresión en plantas, se sintetizaron polinucleótidos sintéticos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Cry mutante, mBT-00032 (SEQ ID NO: 15) en una plataforma de síntesis de genes automatizada (Genscript, Inc., Piscataway, NJ). Para este ejemplo, se preparó un primer casete de expresión que comprendía un promotor de ubiquitina de maíz (Ubi 1) unido operativamente a la secuencia codificante de la proteína Cry que estaba unida operativamente a un terminador Nos y se preparó un segundo casete de expresión que comprendía un promotor Ubi1 unido operativamente a una secuencia codificante de fosfomanosa isomerasa (PMI) que estaba unida operativamente a un terminador Nos. La expresión de PMI permite la selección positiva de plantas transgénicas con respecto a manosa. Ambos casetes de expresión se clonaron en un vector adecuado para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium.

Ejemplo 9. Expresión y actividad de proteínas Cry en plantas de maíz

La transformación de embriones de maíz inmaduros se realizó esencialmente tal como se describe por Negrotto et al., 2000, Plant Cell Reports 19: 798 803. En resumen, la cepa de Agrobacterium LBA4404 (pSB1) que comprende un vector de expresión descrito en el ejemplo 5 se cultiva en medio sólido de YEP (extracto de levadura (5 g/l), peptona (10 g/l), NaCl (5 g/l), 15 g/l de agar, pH 6,8) durante 2-4 días a 28°C. Aproximadamente 0,8X 109 células de Agrobacterium se suspenden en medio LS-inf complementado con As 100 pM. Las bacterias se preinducen en este medio durante aproximadamente 30-60 minutos.

Los embriones inmaduros de una línea de maíz endogámica se extirpan de mazorcas de 8-12 días con LS-inf líquido As 100 pM. Los embriones se enjuagan una vez con medio de infección nuevo. Después se añade solución de Agrobacterium y los embriones se agitan en vórtice durante 30 segundos y se dejan reposar con las bacterias durante 5 minutos. A continuación, los embriones se transfieren con el lado del escutelo hacia arriba a medio LSA y se cultivan en la oscuridad durante dos o tres días. Posteriormente, entre aproximadamente 20 y 25 embriones por placa de Petri se transfieren a medio LSDc complementado con cefotaxima (250 mg/l) y nitrato de plata (1,6 mg/l) y se cultivan en la oscuridad a aproximadamente 28°C durante 10 días.

Los embriones inmaduros, que producen callos embriogénicos, se transfieren a medio LSD1M0.5S. Los cultivos se seleccionan en este medio durante aproximadamente 6 semanas con una etapa de subcultivo a aproximadamente 3 semanas. Los callos supervivientes se transfieren a medio Reg1 complementado con manosa. Después del cultivo a la luz (régimen de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad), los tejidos verdes se transfieren a medio Reg2 sin reguladores de crecimiento y se incuban durante aproximadamente 1-2 semanas. Las plántulas se transfieren a cajas Magenta GA-7 (Magenta Corp, Chicago Ill.) que contienen medio Reg3 y se cultivan a la luz. Después de aproximadamente 2­ 3 semanas, las plantas se analizan para detectar la presencia de los genes PMI y el gen cry de Bt por PCR. Las plantas positivas del ensayo de PCR se transfieren a un invernadero para una evaluación adicional.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína Cry que es tóxica para una plaga de lepidópteros, en la que la secuencia de nucleótidos (a) tiene una secuencia de s Eq ID NO: 3, o (b) codifica una proteína Cry que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 12, o (c) es una secuencia sintética de (a) o (b) que tiene codones optimizados para la expresión en un organismo transgénico.

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos comprende la SEQ ID NO: 3.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la proteína Cry comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos sintética comprende la SEQ ID NO: 6.

5. Un gen quimérico que comprende un promotor heterólogo unido operativamente a la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. El gen quimérico de la reivindicación 5, en el que el promotor heterólogo es un promotor expresable en plantas, y en el que el promotor expresable en plantas se selecciona preferentemente del grupo de promotores que consiste en ubiquitina, virus Cestrum amarillo, TrpA de maíz, OsMADS 6, histona H3 de maíz, UTR 5' del gen 9 del bacteriófago T3, sacarosa sintasa 1 de maíz, alcohol deshidrogenasa de maíz 1, complejo cosechador de luz de maíz, proteína de choque térmico de maíz, mtl de maíz, RuBP carboxilasa de subunidad pequeña de guisante, actina de arroz, ciclofilina de arroz, manopina sintasa de plásmido Ti, nopalina sintasa de plásmido Ti, calcona isomerasa de petunia, proteína rica en glicina 1 de alubia, patatina de patata, lectina, CaMV 35S y promotor de RuBP carboxilasa de subunidad pequeña de S-E9.

7. Una proteína Cry aislada o recombinante que es tóxica para una plaga de lepidópteros, en la que la proteína Cry comprende (a) una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 12 o 15; o (b) una secuencia de aminoácidos que está codificada por una secuencia de nucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 o 6.

8. La proteína Cry de la reivindicación 7, en la que la secuencia de aminoácidos comprende la SEQ ID NO: 15.

9. La proteína Cry de la reivindicación 7, en la que la secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de nucleótidos que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 3 o 6.

10. Una cepa de Bacillus thuringiensis aislada o recombinante que produce la proteína Cry de la reivindicación 7.

11. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

12. Una célula bacteriana o vegetal transgénica que comprende el vector recombinante de la reivindicación 11, en la que la célula bacteriana es del género Bacillus, Clostridium, Xenorhabdus, Photorhabdus, Pasteuria, Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Salmonella, Pasteurella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, o Alcaligenes, y la célula vegetal transgénica es a) una célula vegetal dicotiledónea; o b) una célula vegetal monocotiledónea; o c) una célula vegetal dicotiledónea seleccionada del grupo que consiste en una célula de soja, una célula de girasol, una célula de tomate, una célula de una planta del género Brassica, una célula de algodón, una célula de remolacha azucarera y una célula de tabaco; o d) una célula vegetal monocotiledónea seleccionada del grupo que consiste en una célula de cebada, una célula de maíz, una célula de avena, una célula de arroz, una célula de sorgo, una célula de caña de azúcar y una célula de trigo.

13. Una planta transgénica que comprende la célula vegetal transgénica de la reivindicación 12, en la que la planta es a) una planta dicotiledónea; o b) una planta monocotiledónea; o c) una planta dicotiledónea seleccionada del grupo que consiste en una planta de soja, una planta de girasol, una planta de tomate, una planta del género Brassica, una planta de algodón, una planta de remolacha azucarera y una planta de tabaco; o d) una planta monocotiledónea seleccionada del grupo que consiste en una planta de cebada, una planta de maíz, una planta de avena, una planta de arroz, una planta de sorgo, una planta de caña de azúcar y una planta de trigo.

14. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 13, comprendiendo dicha semilla el vector recombinante de la reivindicación 11.

15. Un procedimiento para controlar una plaga de lepidópteros, que comprende administrar a la plaga de lepidópteros o a su entorno una composición que comprende una cantidad eficaz de la proteína Cry de la reivindicación 8.