BR102013002599A2

BR102013002599A2 - Plantas resistentes a glifosato e métodos associados

Info

Publication number: BR102013002599A2
Application number: BRBR102013002599-2A
Authority: BR
Inventors: Justin M Lira; Robert Cicchillo; Carla N Yerkes; Andrew E Robinson
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2012-02-01
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2015-08-11
Also published as: JP2015506703A; ES2716481T3; MX348268B; AU2015215946B2; TW201341394A; IL243904A0; UA115547C2; AR089873A1; EP2809147B1; US20170022517A1; UA116980C2; AU2013205600A1; AU2013205525A1; KR20140132353A; WO2013116773A1; JP2018068304A; EP2809142A1; MX345618B; US10577619B2; EP3219200A1

Abstract

Plantas resistentes a glifosato e métodos associados a presente ovencão íefeíe-so a certos polpeptideos derivados de unimas dgt procarjóticas e ácidos nuclecos úteis na codificação dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTAS RESISTENTES A GLIFOSATO E MÉTODOS ASSOCIADOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 61/593.555 depositado em 1 de fevereiro de 2012 e também Pedido de Patente Provisório U.S. No. de série 61/625.222 depositado em 17 de abril de 2012.

DECLARAÇÃO DE ACORDO COM 37 C.F.R. ξ 1.821(c) ou (e) - LISTAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA COMO ARQUIVO DE TEXTO ASCII

De acordo com 37 C.F.R. § 1.821 (c) ou (e), um arquivo contendo uma versão de texto ASCII da Listagem de Sequência foi apresentado concomitante com o presente pedido.

CAMPO DA TÉCNICA

A presente invenção refere-se à biotecnologia de planta. Modalidades particulares referem-se a polipeptídeos envolvidos em metabolismo de N-(fosfonometil)glicina e ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos. Modalidades particulares referem-se a plantas, partes de planta e células de planta que compreendem polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos estranhos. ANTECEDENTES

Espécies daninhas têm sido um problema em campos cultivados por muito tempo. Embora controle de erva-daninha possa ser uma operação de trabalho intenso, ele se tornou mais fácil pela disponibilidade de herbicidas químicos de morte de erva-daninha eficientes. O uso disseminado de herbicidas, junto com variedades de cultura e fertilizantes aperfeiçoados, fez uma contribuição significante para a "revolução verde" na agricultura. Herbicidas particularmente úteis são aqueles que têm um espectro amplo de atividade herbicida. Infelizmente, herbicidas de espectro amplo tipicamente têm um efeito prejudicial sobre plantas de cultura expostas ao herbicida. Uma maneira de superar este problema é produzir plantas de cultura que sejam tolerantes ao herbicida de espectro amplo.

Um exemplo de um herbicida de espectro amplo é N-fosfono-metil-glicina, também conhecido como glifosato. Glifosato tem sido usado extensivamente por fazendeiros em todo o mundo para controle de ervas-daninhas antes do plantio de cultura, por exemplo, em plantio direto. Ainda, o glifosato é um meio eficiente para controle de ervas-daninhas e plantas voluntárias entre ciclos de produção e rotações de cultura. O glifosato não é transportado para solos após o uso, e é amplamente considerado ser um dos herbicidas químicos mais ambientalmente seguros e amplamente eficazes disponíveis para uso em agricultura. O glifosato mata plantas através da inibição do curso do ácido chiquímico. Este curso leva à biossíntese de compostos aromáticos, incluindo aminoácidos, vitaminas e hormônios de planta. O glifosato bloqueia a condensação de ácido fosfoenolpirúvico (PEP) e ácido 3-fosfochiquímico para ácido 5-enolpiruvil-3-fosfochiquímico através da ligação a e inibição da atividade da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase, geralmente referida como "EPSP" sintase e "EPSPS".

Infelizmente, quaisquer plantas de cultura são conhecidas que sejam naturalmente tolerantes a glifosato, e, então, a utilidade deste herbicida para controle de erva-daninha em culturas cultivadas foi limitada. Um método para produzir plantas de cultura tolerantes a glifosato é introduzir um gene codificando uma forma tolerante a glifosato heteróloga de um gene de EPSPS na planta de cultura usando as técnicas de engenharia genética. Usando mutagênese química, formas tolerantes a glifosato de EPSPS foram produzidas em bactérias, e os genes heterólogos foram introduzidos em plantas para produzir plantas tolerantes a glifosato. Vide, por exemplo, Comais e outros (1983) Science 221:370-71. Os genes de EPSPS heterólogos podem ser superexpressos nas plantas de cultura para obter um nível de tolerância desejado.

Os exemplos acima da técnica relacionada e limitações relacionadas com os mesmos pretendem ser ilustrativos e não exclusivos. Outras limitações da técnica relacionada se tornarão aparentes àqueles versados na técnica quando de uma leitura do relatório.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO São descritos aqui polipeptídeos isolados tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 e ácidos nucleicos codificando um poli-peptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 (por exemplo, SEQ ID NOs:2-4). São também descritos plantas, partes de planta, órgãos de planta, semente de planta e células de planta compreendendo um polipeptí-deo heterólogo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1.

Algumas modalidades incluem uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1. Em exemplos particulares, o ácido nucleico heterólogo compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3. Algumas modalidades incluem uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta compreendendo um ácido nucleico heterólogo que hibridiza para outro ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta adstringência. Em exemplos particulares, a planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta compreendendo um ácido nucleico heterólogo que hibridiza para outro ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta adstringência compreende um polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico heterólogo que confere tolerância a glifosato (ou aumenta tolerância a glifosato) à planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta.

Em modalidades adicionais, a invenção refere-se a métodos de geração de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta resistente a glifosato compreendendo: transformação de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta com um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO:1; e expressando o ácido nucleico de maneira a produzir o polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1.

Outras modalidades incluem vetores compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1. Exemplos particulares incluem vetores compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptideo tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO:1. Por exemplo, um vetor pode compreender uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.

Modalidades particulares incluem plantas e células de planta tolerantes a glífosato expressando um polipeptideo heterólogo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1.

Modalidades adicionais incluem métodos para controle de ervas-daninhas em um campo ou área sob cultivo contendo plantas resistentes a glífosato, em que tal método pode compreender: plantio de uma planta ou uma semente de planta compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptideo heterólogo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 no campo ou área sob cultivo; e aplicação ao campo ou área sob cultivo de uma quantidade suficiente de glífosato para controlar ervas-daninhas no campo sem afetar significantemente a planta.

Em algumas modalidades, a invenção refere-se a células rege-neráveis para uso em cultura de tecido de plantas resistentes a glífosato. Tal cultura de tecido pode ser capaz de regeneração de plantas tendo as características fisiológicas e morfológicas das plantas resistentes a glífosato acima, e também de regeneração de plantas tendo substancialmente o mesmo genótipo que as plantas resistentes a glífosato. Células regeneráveis em tais culturas de tecido podem ser, por exemplo, embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, flores, sementes, vagens e pecíolos. Modalidades particulares referem-se a plantas regeneradas a partir de uma cultura de tecido de acordo com o acima.

Em algumas modalidades, a invenção refere-se a células que não são regeneráveis para produzir plantas, por exemplo, para uso na produção de linhagens de célula de planta resistentes a glífosato. Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a plantas compreendendo em parte tais células.

Em certas modalidades, a presente invenção refere-se à aplica- ção de herbicidas múltiplos a culturas plantadas em uma área sob cultivo. Uma aplicação pós-emergente (over-the-top) de glifosato em adição a herbicidas múltiplos tem vantagem das propriedades herbicidas diferentes, de maneira que controle de erva-daninha é provido com uma combinação aperfeiçoada de flexibilidade e economia. Por exemplo, herbicidas individuais podem ter longevidades diferentes na área sob cultivo, isto é, alguns herbicidas podem persistir e ser eficazes por um tempo relativamente longo após eles terem sido aplicados à área, enquanto outros herbicidas podem ser rapidamente quebrados em outros compostos e/ou não ativos. Um sistema de aplicação de herbicida aperfeiçoado de acordo com modalidades particulares permite o uso de glifosato e herbicidas múltiplos de maneira que um cultivador pode configurar a seleção de herbicidas particulares para uso em uma situação particular.

Em outras modalidades, a presente invenção refere-se a métodos e composições para fabricação e uso de uma planta que é tolerante a mais de um herbicida ou classe ou subclasse de herbicida, conforme descrito abaixo. Em modalidades particulares, é provida uma planta que é tolerante a ambos glifosato e pelo menos outro herbicida (ou classe ou subclasse de herbicida) ou agente químico (ou classe ou subclasse de agente químico) (por exemplo, fungicidas, inseticidas, reguladores de crescimento de planta e similar). Tais plantas podem encontrar uso, por exemplo, em métodos compreendendo tratamento de plantas de cultura com herbicidas múltiplos. Desta maneira, a invenção provê plantas resistentes a herbicida que toleram tratamento com um herbicida ou combinação de herbicidas (incluindo uma combinação de herbicidas que agem, cada um, através de um modo diferente de atividade de herbicida) ou que toleram tratamento com uma combinação de pelo menos um herbicida e pelo menos outro agente químico. Desta maneira, a invenção descreve métodos aperfeiçoados de cultivo de plantas de cultura em que as ervas-daninhas são seletivamente controladas.

Uma planta resistente a herbicida de acordo com algumas modalidades pode compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo que confere tolerância a glifosato e uma molécu- Ia de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). De acordo com os parágrafos acima, são providas plantas que compreendem pelo menos uma terceira molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo conferindo à planta uma característica selecionada do grupo consistindo em uma característica de tolerância a herbicida: uma característica de resistência a inseto; uma característica agronômica; uma característica de resistência à doença; uma característica de ácido graxo modificada; e uma característica do fitato reduzida.

Em alguns exemplos, uma planta resistente a herbicida compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga codificando um polipeptídeo que confere tolerância a glifosato e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere tolerância a glufosinato. Alguns exemplos incluem uma planta resistente a herbicida compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que fornece à planta uma característica selecionada do grupo consistindo em uma característica de tolerância a herbicida; uma característica de tolerância a inseto; uma característica agronômica; uma característica de resistência à doença; uma característica de ácido graxo modificada; e uma característica do fitato reduzida.

Em exemplos particulares, uma planta resistente a herbicida compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga codificando um polipeptídeo que confere tolerância a glifosato e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida que inibe acetolactato sintase (ALS) (Lee e outros (1988) EMBOJ. 7:1241), também conhecida como enzima acetoidroxiácido sintase (AHAS) (Miki e outros (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449). Alguns exemplos incluem uma planta resistente a herbicida compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que fornece à planta uma característica selecionada do grupo consistindo em uma característica de tolerância a herbicida; uma característica de resistência a inseto; uma característica agronômica; uma característica de resistência a inseto; uma característica de ácido graxo modificada; e uma característica do fitato reduzida.

Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode ser combina- do (ou "empilhado") em uma planta com qualquer outra molécula de ácido nucleico, por exemplo e sem limitação, para prover resistência ou tolerância adicional a glifosato ou outra herbicida, para prover resistência a insetos ou doenças selecionadas, para prover aprimoramento nutricional, para prover características agronômicas aperfeiçoadas e prover uma proteína ou outro produto útil em ração, alimento, usos industriais, usos farmacêuticos e/ou outros usos. Exemplos incluem o empilhamento de dois ou mais ácidos nu-cleicos de interesse dentro do genoma de uma planta. Tal "empilhamento de gene" pode ser realizado através de cruzamento de planta convencional u-sando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, re-transformação de uma planta transgênica ou adição de novas características através de integração direcionada via recombinação homóloga. Exemplos particulares de tal pilha incluem qualquer combinação do que segue: um ácido nucleico dgt-28\ um ácido nucleico Cry34Ab1; um ácido nucleico Cry35Ab1\ um ácido nucleico Cry1F\ um ácido nucleico Cry1Ac\ um ácido nucleico aad-12, um ácido nucleico aad-1; um ácido nucleico pat; e um ácido nucleico DSM-2.

Em adição aos aspectos e modalidades exemplares descritos acima, aspectos e modalidades adicionais se tornarão aparentes através do estudo das descrições que seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1 inclui um alinhamento de sequência parcial de enzimas EPSP sintase exemplares (isto é, DGT-28, DGT-32, DGT-33 e outras). Todas as três dessas enzimas DGT exemplares compartilham uma alanina conservada na posição 96 do aminoácido da enzima EPSP sintase aroA. A localização deste aminoácido é indicada por um asterisco e o resíduo de aminoácido está sublinhado. A FIGURA 2 inclui um alinhamento de enzimas DGT exemplares (isto é, DGT-1, DGT-3 e DGT-7). A localização de um resíduo de aminoácido mutado que foi mudado de uma glicina para uma alanina é indicada pelo primeiro asterisco. A localização de um segundo resíduo de aminoácido mutado que foi mudado de uma treonina para uma isoleucina é indicada pelo segundo asterisco. A localização de um terceiro resíduo de aminoácido mu-tado que foi mudado de uma prolina para uma serina é indicada pelo terceiro asterisco.

As FIGURAS 3-30 incluem mapas de vários plasmídeos exemplares: pDAB107527 (FIG. 3); pDAB105530 (FIG. 4); pDAB105531 (FIG. 5); pDAB105532 (FIG. 6); pDAB105533 (FIG. 7); pDAB105534 (FIG. 8); pDAB4104 (FIG. 9); pDAB102715 (FIG. 10); pDAB107532 (FIG. 11); pDAB107534 (FIG. 12); pDAB102785 (FIG. 13); pDAB100445 (FIG. 14); pDAB102946 (FIG. 15); pDAB100469 (FIG. 16); pDAB102028 (FIG. 17); pDAB102029 (FIG. 18); pDAB102032 (FIG. 19); pDAB102034 (FIG. 20); pDAB100429 (FIG. 21); pDAB100442 (FIG. 22); pDAB100430 (FIG. 23); pDAB102036 (FIG. 24); pDAB102038 (FIG. 25); pDAB102040 (FIG. 26); pDAB102042 (FIG. 27); pDAB107712 (FIG. 28); pDAB107713 (FIG. 29); e pDAB107714 (FIG. 30). A FIGURA 31 inclui valores de IC50 obtidos após introdução de várias mutações em DGT-1 (A) e DGT-7 (B) usando PEP 1 mM. Para ambas as curvas de IC5o da FIGURA 31 (A) e da FIGURA 31 (B), triângulos fechados representam tipo selvagem, círculos abertos representam mutantes de GA, quadrados abertos representam mutantes de GAPS e quadrados fechados representam mutantes de TI PS.

As FIGURAS 32-46 incluem mapas de vários plasmídeos exemplares: pDAB102719 (FIG. 32); pDAB102718 (FIG. 33); pDAB107663 (FIG. 34); pDAB107664 (FIG. 35); pDAB107665 (FIG. 36); pDAB107666 (FIG. 37); pDAB109812 (FIG. 38); pDAB101556 (FIG. 39); pDAB107698 (FIG. 40); pDAB108384 (FIG. 41); pDAB108385 (FIG. 42); pDAB108386 (FIG. 43); pDAB108387 (FIG. 44); pDAB102716 (FIG. 45); pDAB102717 (FIG. 46); pDAB110828 (FIG. 47); pDAB110827 (FIG. 48); pDAB107545 (FIG. 49); pDAB107548 (FIG. 50); pDAB107553 (FIG. 51); pDAB102792 (FIG. 52); pDAB107602 (FIG. 53); e pDAB107533 (FIG. 54). DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral São revelados aqui novos polipeptídeos envolvidos em metabo- lismo de N-(fosfonometil)glicina e ácidos nucleicos codificando tais polipeptí-deos. Em alguns exemplos, tal polipeptídeo confere (ou aumenta) tolerância a glifosato em uma célula de planta em que o polipeptídeo é heterologamen-te expresso, por exemplo, sem afetar de modo adverso a ligação da EPSP sintase com seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP). II. Termos A fim de esclarecer mais a extensão da presente invenção, as definições específicas, termos e abreviações que seguem são providos. A menos que especificamente de outra maneira definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por um versado comum na técnica. A menos que de outra maneira claro a partir do contexto em que ele aparece, um termo singular deve incluir pluralidades e termos plurais são compreendidos incluir o singular. Desta maneira, os artigos indefinidos "um" e "uma" conforme u-sado precedendo um elemento ou componente são não restritivos com relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Em que faixas de valores numéricos são providas aqui (por exemplo, "menos do que cerca de X", "menos do que X" e "por exemplo, X1...e X2"), as faixas são compreendidas incluir todos os valores e faixas de valores incluídos na faixa provida, como se esses valores e faixas incluídos tivessem sido expressamente mencionados.

Conforme aqui usado, os termos "compreendendo", "incluindo", "tendo" e "contendo" e variações dos mesmos são abertos (isto é, não exclusivos). Por exemplo, uma composição ou método que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitada a apenas esses elementos. Tal composição ou método pode (ou não) incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes à composição ou método. Ainda, a menos que expressamente de outro modo declarado, "ou" é usado no sentido inclusivo (e não no exclusivo). Por exemplo, uma condição "A ou B" é satisfeita por qualquer um do que segue: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente); A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente); e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).

Planta: Conforme aqui usado, o termo "planta" inclui uma planta inteira e qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta. O termo "partes de planta" inclui qualquer parte(s) de uma planta incluindo, por exemplo e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente imatura); um corte de planta; uma célula de planta; uma cultura de célula de planta; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embrião, flores, frutas, brotos, folhas, hastes e explantes). Um tecido de planta ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células de planta que é organizado em uma unidade estrutural ou funcional. Uma célula de planta ou cultura de tecido pode ser capaz de regeneração de uma planta tendo as características fisiológicas e morfológicas da planta da qual a célula ou tecido foi obtido e de regeneração de uma planta tendo substancialmente o mesmo genótipo que a planta. Em contraste, algumas células de planta não são capazes de ser regeneradas para produzir plantas. Células regene-ráveis em uma célula de planta ou cultura de tecido podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólens, folhas, anteras, raizes, pontas de raiz, seda, flores, grãos, espigas, castanhas, cascas ou caules.

Partes de planta incluem partes que podem ser colhidas e partes úteis para propagação de plantas progênies. Partes de planta úteis para propagação incluem, por exemplo e sem limitação: semente; fruta; um corte; uma muda; um tubérculo; e um talo da raiz. Uma parte que pode ser colhida de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta incluindo, por e-xemplo e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; haste; fruta; semente; e raiz.

Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica da planta compreendendo um protoplasto e uma parede celular. Uma célula de planta pode estar na forma de uma célula única isolada ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula culturada) e pode ser parte de uma unidade organizada maior (por exemplo, um tecido de planta, órgão de planta e planta). Desta maneira, uma célula de planta pode ser um protoplasto, uma célula de produção de gameta ou uma célula ou coleção de células que podem se regenerar em uma planta inteira. Desta maneira, uma semente, que compreende células de planta múltiplas e é capaz de se regenerar em uma planta inteira, é considerada uma "célula de planta" em modalidades aqui.

Resistência/tolerância a herbicida: Quando se referindo a plantas que são resistentes ou tolerantes a glifosato, quer dizer que uma aplicação de uma quantidade de glifosato na planta não afeta significantemente ou mata a planta, em que uma planta do tipo selvagem da mesma espécie seria significantemente afetada e/ou morta pela aplicação da quantidade de glifosato. Uma planta pode ser naturalmente tolerante a um herbicida particular ou uma planta pode ser tornada tolerante a herbicida como um resultado de engenharia genética, tal como, por exemplo, cruzamento seletivo: transformação genética; e/ou a introdução de um transgene dentro de um genoma da planta. Uma "planta resistente a glifosato" refere-se a uma planta contendo uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico que confere tolerância a herbicida quando provida a uma planta heteróloga ou outro organismo expressando-o (isto é, que torna a planta ou outro organismo tolerante a herbicida).

Uma planta que é resistente ou tolerante a glifosato pode mostrar algum impacto mínimo da aplicação de glifosato à planta. Por exemplo, pode haver uma alteração em crescimento e desenvolvimento normais da planta, em que a planta pode exibir sinais ou sintomas que estão associados com estresse ou doença. Tal impacto mínimo resultante da aplicação de glifosato a plantas que são resistentes ou tolerantes a glifosato está em contraste com o impacto adverso que resulta da aplicação de glifosato a plantas que são suscetíveis a glifosato. Um versado na técnica pode distinguir entre plantas que são resistentes a glifosato e plantas que são suscetíveis a glifosato. Aplicação de glifosato a plantas compreendendo um ácido nucleico que confere tolerância a glifosato resulta em significantemente menos impacto do que aplicação da mesma quantidade de glifosato a uma planta da mesma espécie que não compreende uma molécula de ácido nucleico que confere tolerância a glifosato.

Uma planta que é tolerante a um herbicida ou outro agente quí- mico mostra tolerância aperfeiçoada em comparação com uma planta controle apropriada. Dano resultante de tratamento herbicida ou outro agente químico pode ser avaliado através da avaliação de qualquer parâmetro de crescimento ou bem-estar de planta. Tais parâmetros são conhecidos daqueles versados na técnica e sua seleção está dentro da sabedoria do versado. Dano à planta pode ser avaliado através de inspeção visual e/ou através de análise estatística de um ou mais parâmetro(s) adequados de crescimento ou bem-estar de planta em plantas individuais ou um grupo(s) de plantas. Desta maneira, dano pode ser avaliado através da avaliação de parâmetros incluindo, por exemplo e sem limitação: altura da planta; peso da planta; comprimento da folha; floração; fertilidade; produção de seda; rendimento; e produção de semente. Dano pode ser também avaliado através da avaliação do tempo decorrido para um estágio particular de desenvolvimento (por exemplo, produção de seda, floração e dispersão de pólen) ou o tempo decorrido até uma planta ter se recuperado de tratamento com um agente químico e/ou herbicida particular.

Ao fazer avaliações de dano, valores podem ser dados a graus particulares de dano de maneira que análise estatística ou comparações quantitativas podem ser feitas. O uso de faixas de valores para descrever graus de dano particulares é conhecido na técnica, e qualquer faixa ou escala adequada pode ser usada. Por exemplo, scores de lesão de herbicida (também chamados scores de tolerância) podem ser dados. Desta maneira, tolerância a herbicida pode também ser indicada por outras classificações nesta escala, em que uma planta controle apropriada (ou grupo de plantas controle) exibe um score estatisticamente inferior na escala em resposta a um tratamento com herbicida do que um grupo de plantas objeto de exame.

Dano causado por um herbicida ou outro agente químico pode ser avaliado em vários momentos após uma planta ter sido tratada com um herbicida. Frequentemente, dano é avaliado mais ou menos no momento que uma planta controle exibe dano máximo. Algumas vezes, dano é avaliado após um período de tempo no qual uma planta controle que não foi tratada com herbicida ou outro agente químico tem crescimento mensurável e/ou se desenvolveu em comparação com o tamanho ou estágio no qual o tratamento foi administrado. Dano pode ser avaliado em qualquer um de muitos momentos adequados, por exemplo, em 12 horas; em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e/ou 14 dias; em 3 e/ou 4 semanas; ou mais, após uma planta objeto de exame ter sido tratada com herbicida. Qualquer momento de avaliação é adequado contanto que ele permita detecção de uma diferença em resposta a um tratamento de plantas de teste e controle.

Um herbicida não "afeta significantemente" uma planta quando ele não tem nenhum efeito sobre a planta, quando ele tem algum efeito sobre a planta do qual a planta se recupera mais tarde ou quando ele tem um efeito sobre a planta que é prejudicial, mas que é contrabalançado, por e-xemplo, pelo impacto do herbicida particular sobre as ervas-daninhas. Desta maneira, por exemplo, uma planta de cultura pode não ser "significantemente afetada" por um herbicida ou outro tratamento se a planta exibir menos do que cerca de 25%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9%, menos do que cerca de 8%, menos do que cerca de 7%, menos do que cerca de 6%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% de diminuição em pelo menos um parâmetro adequado que é indicativo de saúde e/ou produtividade de planta, em comparação com uma planta controle a-propriada (por exemplo, uma planta não tratada da mesma espécie). Em modalidades particulares, uma planta é tolerante a um herbicida ou outro produto químico se ela mostrar dano em comparação com uma planta controle apropriada que é menos do que o dano exibido pela planta controle em pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% ou 1000% ou mais. Uma planta de cultura que não é significantemente afetada por um herbicida ou outro tratamento pode exibir uma diminuição em pelo menos um parâmetro, mas a diminuição é de natureza temporária, e a planta se recupera totaímente dentro de, por exemplo, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas ou cerca de 6 sema- nas. Em modalidades particulares, uma planta que é tolerante a um herbicida ou outro agente químico pode ser caracterizada pelo fato que a planta não é significantemente afetada pela aplicação do herbicida ou outro agente químico.

Parâmetros adequados que são indicativos de saúde e/ou produtividade incluem, por exemplo e sem limitação: altura da planta; peso da planta; altura da planta; tempo decorrido para um estágio particular de desenvolvimento; floração; rendimento; e produção de semente. A avaliação de um parâmetro pode ser realizada através de inspeção visual e/ou análise estatística do parâmetro. Uma vez avaliado em uma planta objeto de estudo e uma planta controle, uma comparação pode ser feita de maneira a determinar se a planta objeto de estudo é significantemente afetada pelo herbicida ou outro tratamento.

Plantas controle apropriadas que podem ser usadas para determinar resistência a um herbicida (ou outro agente químico) incluem plantas da mesma espécie que não compreendem um ácido nucleico e/ou polipeptí-deo de tolerância a herbicida heterólogo putativo e plantas que realmente compreendem o ácido nucleico e/ou polipeptídeo de tolerância a herbicida heterólogo putativo, mas que não foram tratadas com o herbicida.

Herbicida: Um "herbicida" é um agente químico que causa lesão temporária ou permanente a uma planta. Exemplos não limitantes de herbicida são listados e discutidos em mais detalhes em outros pontos aqui. Um herbicida pode ser incorporado a uma planta ou suas células ou pode agir sobre a planta ou células sem ser incorporado. Um "ingrediente ativo" é um agente químico em uma formulação herbicida que é responsável pela fitotoxidez da formulação. Ingredientes ativos em formulações herbicidas comerciais são tipicamente identificados como um ingrediente ativo no rótulo do produto. Informação no rótulo do produto está disponível na U.S. Environmental Pro-tection Agency e é atualizada on Une em oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own. Informação do rótulo está também disponível on Une em www.cdms.net.

Quando usado com relação a um herbicida, o termo "equivalente ácido" se refere-se à taxa ou quantidade do ácido parental ativo herbicida.

Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou polipeptídeo) foi substancialmente separado, produzido separado dos ou purificados dos outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA e RNA cromossomal ou extracromossomal e proteínas), enquanto realizando uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo através de quebra de ligações químicas conectando o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas através de métodos de purificação padrão. O termo também compreende ácidos nucleicos e proteínas preparados através da expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados. Ácido nucleico: Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" são usados intercomutavelmente aqui e compreendem um ácido nucleico singular; ácidos nucleicos piurais; um fragmento de ácido nucleico, variante ou seu derivado; e construto de ácido nucleico (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e DNA de plasmídeo (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeo de uma sequência de cDNA de comprimento integral, ou um fragmento da mesma, incluindo sequências 5’ e/ou 3’ não traduzidas e sequência(s) de codificação. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de qualquer um de polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode incluir ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos não modificados ou ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de DNA de filamento simples ou filamento duplo; DNA que é uma mistura de regiões simples e duplas; RNA de filamento simples e duplo; e RNA que é mistura de regiões de filamento simples e duplo. Moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA podem ser de filamento simples, filamento duplo ou uma mistura de regiões de filamento simples e filamento duplo. Os termos acima também incluem formas quimicamente, enzimaticamente e metabolicamente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico. É compreendido que um DNA específico se refere também ao complemento do mesmo, cuja sequência é determinada de acordo com as regras de emparelhamento de base de desoxirribonucleotídeo.

Conforme aqui usado, o termo "gene" refere-se a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou polipeptídeo/proteína). Um gene pode incluir sequências reguladoras precedendo (sequências de não codificação 5’) e/ou seguindo (sequências de não codificação 3’) a sequência codificando o produto funcional.

Conforme aqui usado, o termo "sequência de codificação" se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de ami-noácido específica. Uma "sequência reguladora" se refere a uma sequência de nucleotídeo localizada a montante (por exemplo, sequências de não codificação 5’), dentro ou a jusante (por exemplo, sequências de não codificação 3’) de uma sequência de codificação, que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras incluem, por exemplo e sem limitação: promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; sequências de reconhecimento de poliadenilação; sítios de processamento de RNA; sítios de ligação efetores; e estruturas tronco-alça.

Conforme aqui usado, o termo "degeneração de códon" refere-se à redundância no código genético que permite variação de uma sequência de nucleotídeo particular sem afetar a sequência de aminoácido do poli-peptídeo codificado. Uma vez que tal códon consiste em três nucleotídeos, e os nucleotídeos compreendendo DNA são restritos a quatro bases específicas, há 64 combinações possíveis de nucleotídeos, 61 dos quais codificam aminoácidos (os três códons restantes codificam sinais terminando tradução). Como resultado, muitos aminoácidos são designados por mais de um códon. Por exemplo, os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro tripletos, serina e arginina por seis, enquanto triptofano e metionina são codificados por apenas um tripleto. O "código genético" que mostra quais códons codificam quais aminoácidos é geralmente conhecido na técnica. A degeneração nele permite que as bases de um DNA variem em uma faixa ampla sem alterar a sequência de aminoácido das proteínas codificadas pelo DNA.

Em algumas das presentes modalidades, quando projetando uma sequência de codificação para expressão aperfeiçoada em uma célula hospedeira, o gene é projetado de maneira que a frequência de uso de có-don nele se aproxime da frequência do uso de códon preferido da célula hospedeira. Desta maneira, o termo "otimizado no códon" refere-se a genes ou sequências de codificação de ácidos nucleicos para transformação de vários hospedeiros, em que códons no gene ou sequência de codificação foram alterados para refletir o uso de códon típico no organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. Em exemplos, tal otimização inclui substituição de pelo menos um, mais de um, um número significante e/ou todos os códons no gene ou sequência de codificação com um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes deste organismo.

Muitos organismos exibem uma tendência para uso de códons particulares para codificar inserção de um aminoácido particular em uma cadeia de peptídeo em crescimento. Preferência de códon, ou tendência para códon, diferenças em uso de códon entre organismos, é dada pela degeneração do código genético, e é bem documentada dentre muitos orgânicos. Tendência de códon frequentemente se relaciona com a eficiência de tradução de RNA mensageiro (mRNA), que é por sua vez acreditada ser dependente, inter alia, das propriedades dos códons sendo traduzidos e da disponibilidade de moléculas de RNA de transferência particulares (tRNA). A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados mais frequentemente em síntese de peptídeo. Desta maneira, os genes podem ser feitos especialmente ou projetados para expressão de gene ótima em um dado organismo com base em otimização de códon.

Dado o grande número de sequências de gene disponíveis para uma ampla variedade de espécies de animal, planta e microbianas, é possível calcular as frequências relativas de uso de códon. Tabelas de uso de códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, no "Codon Usage Data-base" disponível na internet em kasuza.or.jp/codon/, e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Vide Nakamura e outros (2000) Nucle. Acids Res. 28:292. Ao utilizar uma tabela de uso de códon, um versado na técnica pode aplicar as frequências correspondendo a uma dada espécie a qualquer dada sequência de polipeptídeo, projetar e produzir um fragmento de ácido nucleico sintético de uma região de codificação otimizada no códon que codifica o polipeptídeo, mas que usa códons ótimos para a espécie.

Tendência de códon é refletida na composição de base média de regiões de codificação de proteína. Por exemplo, organismos tendo ge-nomas com teores de G+C relativamente baixos utiliza mais códons tendo A ou T na terceira posição de códons sinônimos, enquanto aqueles tendo teores de G+C maiores utilizam mais códons tendo G ou C na terceira posição. Ainda, é pensado que a presença de códons "menores" dentro de um mRNA possa reduzir a taxa de tradução absoluta deste mRNA, especialmente quando a abundância relativa do tRNA carregado correspondendo ao códon menor é baixa. Uma extensão deste raciocínio é que a diminuição de taxa de tradução pelos códons menores individuais seria pelo menos aditiva para códons menores múltiplos. Desta maneira, mRNAs tendo teores relativos altos de códons menores teriam taxas de tradução correspondentemente baixas. Esta taxa podería ser refletida pelos níveis correspondentemente baixos da proteína codificada. A tendência de códon pode ser calculada com a frequência na qual um códon simples é usado com relação aos códons para todos os ami-noácidos. Alternativamente, a tendência de códon pode ser calculada como a frequência na qual um códon simples é usado para codificar um aminoáci-do particular, com relação a todos os outros códons para este aminoácido (códons sinônimos). O termo "identidade percentual" (ou "identidade %") refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo (ou sequências de polinucleotídeo), conforme determinado através de comparação das sequências. A identidade percentual pode expressar o grau de relação de sequência entre as sequências de polipeptídeo (ou polinucleotídeo), como pode ser determinada pela compatibilidade entre as cadeias de caracteres de tais sequências. Em geral, identidade se refere a uma correspondência nu-cleotídeo-para-nucleotídeo ou aminoácido-para-aminoácido exata de dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeo, respectivamente. A identidade percentual de duas sequências, sejam sequências de ácido nucleico ou aminoácido, é o número de compatibilidades exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100. Vide Russell e Barton (1994) J. Mol. Biol. 244:332-50. Técnicas para alinhamento de sequências de ácido nucleico e aminoácido e determinação de identidade são conhecidas no campo e incluem, por exemplo e sem limitação, aquelas providas em: Computational Molecular Bioloqy (1988) (Lesk, A.M., Ed.) Oxford University, NY; Biocomputinq: Informatics and Genome Projects (1993) (Smith, D.W., Ed.) Academic, NY; Computer Analvsis of Sequence Data, Part I (1994) (Griffin, A.M. e Griffing, H.G., Eds.) Humania, N.J.; Sequence Analvsis in Molecualr Bioloqy (1987) (von Heinje, G., Ed.) Academic, NY; e Sequence Analvsis Iniciador (1991) (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) Stockton, NY. Uma técnica para determinação da identidade percentual entre duas sequências pode incluir provisão da sequência de nucleotídeo de um mRNA ou gene e/ou provisão ou inferência da sequência de aminoácido então codificada, e comparação da(s) sequência(s) com uma segunda sequência de nucleotídeo e/ou aminoácido. Sequências genômicas podem ser determinadas e comparadas desta maneira.

Ainda, métodos para alinhamento de sequências de ácido nucleico e aminoácido e determinação de identidade são incorporados em vários programas de software de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequência e cálculos de identidade percentual podem ser realizados, por exemplo, usando o programa AlignX® do Vector NTI® suite (Invitro-gen, Carlsbad, CA) ou programa MegaAlign® do LASERGENE® bioinforma- tics computing suite (DNASTAR® Inc., Madison, Wl). Alinhamento múltiplo de sequências pode ser realizado usando o método Clustal®, que compreende muitas variedades de um algoritmo de alinhamento, incluindo Clustal® V e Clustal® W (Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Higgins e outros (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-91). Para alinhamentos múltiplos em Clustal® V, valores default que podem ser usados incluem GAP PENALTY = 10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Parâmetros default para alinhamento múltiplo em Clustal® W incluem (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PE-NALTY=0,2, Ret. Seq. Diverg. (%)=30, Peso Transição DNA=0,5, Matriz Peso Proteína=Serie Gonnet, Matriz Peso DNA=IUB). Parâmetros default para alinhamentos de par de base e cálculo de identidade percentual entre sequências de proteína que podem ser usadas em um método Clustal® são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOWS=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros default podem ser KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED=4. Após alinhamento de sequências usando um programa Clustal®, é possível obter uma "identidade percentual" visualizando a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa.

Em algumas modalidades, um ácido nucleico codifica um poli-peptídeo tendo uma identidade de sequência (quando comparado com um polipeptídeo de referência; por exemplo, um polipeptídeo DGT) de, por e-xemplo e sem limitação: pelo menos cerca de 55%; pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 75%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90%; pelo menos cerca de 95% tem a mesma função ou similar que o polipeptídeo de referência. Desta maneira, qualquer porcentagem inteira de identidade de, por exemplo, 55% a 100% pode ser útil na descrição de ácidos nucleicos particulares aqui, por exemplo e sem limitação: 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99%. Certos fragmentos de ácido nucleico não têm apenas a identidade de sequência acima, mas podem codificar um poli-peptídeo tendo, por exemplo e sem limitação: pelo menos 50 aminoácidos; pelo menos 100 aminoácidos; pelo menos 150 aminoácidos; pelo menos 200 aminoácidos; e pelo menos 250 aminoácidos. Modalidades particulares incluem um ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 90% de identidade com SEQ ID NO:1 (por exemplo, pelo menos 89% de identidade; pelo menos cerca de 90% de identidade; pelo menos cerca de 91% de identidade; pelo menos cerca de 92% de identidade; pelo menos cerca de 93% de identidade; pelo menos cerca de 94% de identidade; pelo menos cerca de 95% de identidade; pelo menos cerca de 96% de identidade; pelo menos cerca de 97% de identidade; pelo menos cerca de 98% de identidade; pelo menos cerca de 99% de identidade; e pelo menos cerca de 99,5% de identidade). O termo "software de análise de sequência" se refere a um algoritmo de computador ou programa de software que é útil para a análise de sequências de nucleotídeo ou amínoácido. "Software de análise de sequência" pode estar comercialmente disponível ou independentemente desenvolvido. Exemplos não limitantes de software de análise de sequência incluem: o suite GCG de programas (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison Wl); BLASTP®, BLASTN® e BLASTX® (Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10); DNASTAR® (DNASTAR®, Inc. Madison, Wl); Sequencher® (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Ml); e o programa FASTA® incorporando o algoritmo Smith-Waterman (Pearson (1994) Comput. Methods Genome Res. fProc. Int. Svmp.1. Meeting Date 1992 (Su-hai e Sandor, Eds.), Plenum: New York, NY, pp. 111-20). Em que software de análise de sequência foi usado para analisar uma sequência de nucleotídeo ou amínoácido aqui, os resultados da análise mostrada foram gerados usando valores default do programa referido, a menos que de outro modo especificado. Conforme aqui usado, o termo "valores de default' refere-se a um conjunto de valores ou parâmetros que originalmente carrega com o software de análise de sequência quando ele é primeiro inicializado.

Hibridização: Um ácido nucleico compreendendo toda ou parte de uma sequência de nucleotídeo pode ser usado como uma sonda que "hi- bridiza" seletivamente para sequências de nucleotídeo presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonado ou fragmentos de cD-NA (por exemplo, bibliotecas genômicas ou de cDNA de um organismo escolhido) que têm uma quantidade significante de identidade de sequência com uma sequência de sonda. Uma sonda de hibridização pode ser um fragmento de DNA genômico; um fragmento de DNA de plasmideo; um fragmento de cDNA; um fragmento de RNA; um fragmento de DNA amplificado por PCR; um oligonucleotídeo; ou outro polinucleotídeo; e uma sonda pode ser marcada com um grupo detectável (por exemplo, 32P) ou qualquer outro marcador detectável. Desta maneira, por exemplo e sem limitação, uma sonda para hibridização pode ser feita através de marcação de um oligonucleotídeo sintético que hibridiza especificamente para um ácido nucleico aqui presente (por exemplo, um ácido nucleico tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1). Métodos para preparação de sondas para hibridização, e para construção de cDNA e bibliotecas genômicas, são conhecidos na técnica. Sambrook e outros (1989) Molecular Cloninq: A Labora-torv Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Uma orientação extensa para a hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrada em Sambrook e outros (1989), supra', and Ausubel e outros (1997) Short Protocols in Molecular Bioloqy, Terceira Edição, Wiley, NY, New York, pp. 2-40.

Em algumas modalidades, hibridização de ácido nucleico (por exemplo, para DNA amplificado) pode ser usada para identificar a presença de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas são capazes de "hibridizar especificamente" para outra molécula de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Em alguns e-xemplos, um ácido nucleico hibridiza especificamente sob condições adstringentes para um ácido nucleico-alvo. Conforme aqui usado, duas moléculas de ácido nucleico são ditas ser capazes de hibridizar especificamente uma para a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de filamento duplo, antiparalela, sob condições adstringentes (por exemplo, alta adstringência).

Um ácido nucleico é dito ser o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se as duas moléculas de ácido nucleico exibirem complementaridade de sequência completa. Conforme aqui usado, ácidos nucleicos são ditos exibir "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Moléculas que exibem complementaridade completa vão geralmente hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições de "alta adstringência" convencionais. Condições de alta adstringência convencionais são descritas por Sambrook e outros (1989), supra.

Duas moléculas são ditas exibir "complementaridade mínima" se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições de "baixa adstringência" pelo menos convencionais. Condições de baixa adstringência convencionais são também descritas por Sambrook e outros (1989), supra. A fim de que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, ela precisa apenas exibir a complementaridade mínima de sequências para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob as concentrações de solvente e sal empregadas.

Fatores que afetam a adstringência de hibridização são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem, por exemplo: temperatura; pH; resistência iônica; e concentração de solventes orgânicos (por exemplo, formamida e dimetilsulfóxido). Como é conhecido daqueles versados na técnica, adstringência de hibridização é aumentada por temperaturas maiores, resistência iônica menor e concentrações de solvente menores. Condições adstringentes podem também ser obtidas com a adição de agentes de desestabilização tal como formamida. O termo "condição adstringente" ou "condições de adstringência" é definido com relação à hibridização de um ácido nucleico para outro ácido nucleico-alvo (isto é, para uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo de interesse particular) através do procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook e outros (1989), supra (at 9.52-9.55). Vide também Sambrook e outros (1989) em 9.47-9.52 e 9.56-9.58.

Especificidade em muitas aplicações é relacionada com as condições de lavagens pós-hibridização, em que fatores incluem a resistência iônica e temperatura da solução de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, o ponto de fusão térmico (Tm) pode ser aproximado da equação: Tm = 81,5°C+16,6 (logM)+0,41 (%GC)-0,61 (%form)-500/L, (1) em que M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, %form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de base. Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-84. A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH particulares) na qual 50% de uma sequência-alvo complementar hibridizam para uma sonda perfeitamente compatível. ATmé reduzida em cerca de 1 °C para cada 1% de incompatibilidade. Desta maneira, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para sequências da identidade desejada hibridizar. Por exemplo, se hibridização de sequências com 90% de identidade for pretendida, a Tm pode ser diminuída 10°C (sob resistência iônica e pH particulares). Condições adstringentes podem, por exemplo, ser selecionadas para serem cerca de 5°C menores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para uma sequência específica e seu complemento em resistência iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente adstringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1, 2, 3 ou 4°C menor do que a Tm; condições moderadamente adstringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 6, 7, 8, 9 ou 10°C menor do que a Tm; condições de baixa adstringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11 a 20°C menor do que a Tm.

Em alguns exemplos, condições adstringentes são aquelas em que a concentração de sal é menor do que cerca de 1,5 M Na+ (por exemplo, cerca de 0,01 a 1,0 M Na+) em pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para ácidos nucleicos curtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos de comprimento) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maiores do que 50 nucleotídeos de comprimento). Condições de baixa adstringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCI 1,0 M, dodecil sulfato de sódio 0,1% (SDS) a 37°C e uma lavagem em SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCI 3,0M/citrato de trissódio 0,3M) a 50 a 55°C. Condições de adstringência moderada exemplares incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, NaCI 1,0M, SDS 0,1% a 37°C e uma lavagem em SSC 0,5X a 1X a 55 a 60°C. Condições de alta adstringência exemplares incluem hibridização em cerca de 50% de formamida, sal de Na cerca de 1,0 M, SDS cerca de 0,1% em cerca de 37°C e uma lavagem em cerca de SSC 0,1X em cerca de 60 a 65°C.

Conforme aqui usado, o termo "polipeptídeo" inclui um polipeptí-deo singular, polipeptídeos plurais e fragmentos dos mesmos. Este termo se refere a uma molécula compreendida de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo "polipeptídeo" se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, e não se refere a um comprimento ou tamanho específico do produto. Desta maneira, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, proteína, cadeia de aminoácido e qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos são incluídos na definição de "polipeptídeo", e os termos acima são usados in-tercomutavelmente com "polipeptídeo" aqui. Um polipeptídeo pode ser isolado de uma fonte biológica natural ou produzido através de tecnologia recom-binante, mas um polipeptídeo específico não é necessariamente traduzido de um ácido nucleico específico. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer maneira apropriada, incluindo, por exemplo e sem limitação, através de síntese química.

Endógeno e Heterólogo: Conforme aqui usado, o termo "nativo" se refere à forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo que é encontrada na natureza com suas próprias sequências reguladoras, se presentes. O termo "endógeno" se refere à forma nativa do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo em sua localização natural no organismo ou no genoma do organismo.

Em contraste, o termo "heterólogo" se refere a um polinucleotí-deo, gene ou polipeptídeo que é normalmente encontrado em sua localização no organismo de referência (hospedeiro). Por exemplo, um ácido nuclei-co heterólogo pode ser um ácido nucleico que é normalmente encontrado no organismo de referência em uma localização genômica diferente. A título de exemplo adicional, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que não é normalmente encontrado no organismo de referência. Um organismo hospedeiro compreendendo um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser produzido através da introdução do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo no organismo hospedeiro. Em exemplos particulares, um polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de codificação nativa, ou porção da mesma, que é reintroduzida em um organismo fonte em uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo correspondente. Em exemplos particulares, um gene heterólogo compreende uma sequência de codificação nativa, ou porção da mesma, que é reintroduzida em um organismo fonte em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma sequência de codificação nativa que é uma porção de um gene quimérico incluindo regiões reguladoras não nativas que é reintroduzido no hospedeiro nativo. Em e-xemplos particulares, um polipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo nativo que é reintroduzido em um organismo fonte em uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente.

Um gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser um gene ou polipeptídeo que compreende uma sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico funcional codificando um polipeptídeo funcional que é fundido a outros genes ou polipeptídeo para produzir um polipeptídeo quimérico ou de fusão ou um gene codificando o mesmo. Genes e proteínas de modalidades particulares incluem sequências de comprimento integral especificamente exemplificadas e porções, segmentos, fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e dele-ções internas e/ou terminais comparado com moléculas de comprimento integral), variantes, mutantes, quiméricos e fusões dessas sequências.

Modificação: Conforme aqui usado, o termo "modificação" pode se referir a uma mudança em um polinucleotídeo de referência particular que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Uma modificação pode também se referir a uma mudança em um polipeptídeo de referência que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada do polipeptídeo de referência. Alternativamente, o termo "modificação" pode se referir a uma mudança em um polinucleotídeo de referência que resulta em atividade aumentada ou realçada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência, bem como uma mudança em um polipeptídeo de referência que resulta em atividade aumentada ou realçada do polipeptídeo de referência. Mudanças tais como a acima podem ser feitas através de vários métodos bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo e sem limitação: deleção de uma porção da molécula de referência; mutação da molécula de referência (por exemplo, através de mutagênese espontânea, através de mutagênese aleatória, através de mutagênese causada por genes mutantes e através de mutagênese de transposon); substituição de uma porção da molécula de referência; inserção de um elemento na molécula de referência; sub-regulagem da expressão da molécula de referência; alteração da localização celular da molécula de referência; alteração do estado da molécula de referência (por exemplo, através de metilação de um polinucleotídeo de referência e através de fosforilação ou ubiquitinação de um polipeptídeo de referência); remoção de um co-fator da molécula de referência; introduzida de um RNA/DNA de antissentido se direcionando à molécula de referência; introdução de um RNA/DNA de interferência se direcionando à molécula de referência; modificação química da molécula de referência; modificação covalente da molécula de referência; irradiação da molécula de referência com radiação UV ou raios-X; recombinação homóloga que altera a molécula de referência; recombinação mitótica que altera a molécula de referência; substituição do promotor da molécula de referência; e/ou combinações de qualquer um dos acima.

Orientação na determinação de quais nucleotídeos ou resíduos de aminoácido podem ser modificados em um exemplo específico pode ser encontrada através da comparação da sequência do polinucleotídeo ou poli-peptídeo de referência com aquela de polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos (por exemplo, levedura ou bacteriana homóloga) e maximização do número de modificações feitas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou sequências de consenso.

Derivado e Variante: O termo "derivado", conforme aqui usado, se refere a uma modificação de uma sequência exemplar da invenção. Tais modificações incluem a substituição, inserção e/ou deleção de uma ou mais bases de uma sequência de codificação da presente invenção que preserva, altera lígeiramente ou aumenta a função da sequência de codificação em uma espécie de cultura. Tais derivados podem ser prontamente determinados por um versado na técnica, por exemplo e sem limitação, usando técnicas de modelagem por computador para previsão e otimização da estrutura da sequência. O termo "derivado" então também inclui ácidos nucleicos he-terólogos compreendendo uma sequência tendo identidade de sequência substancial com uma sequência exemplar da presente invenção, de maneira que elas podem ter a mesma funcionalidade, ligeiramente alterada ou aumentada para uso em expressão de DGT-28 em uma planta de cultura.

Conforme aqui usado, o termo "variante" se refere a um polipep-tídeo diferindo de um polipeptídeo exemplar da presente invenção por inserções, deleções, mutações e/ou substituições de aminoácido, que podem ser introduzidas usando, por exemplo e sem limitação, técnicas de DNA recom-binantes. Orientação na determinação de quais resíduos de aminoácido podem ser substituídos, adicionados ou deletados dentro de uma sequência de aminoácido de referência pode ser encontrada comparando a sequência do polipeptídeo de referência particular com aquela de polipeptídeos homólogos, e minimização do número de mudanças de sequência de aminoácido feitas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou substituindo aminoácidos com uma sequência de consenso. Um polipeptídeo variante pode ter aminoácidos substituídos, e ainda reter a atividade funcional do polipeptídeo de referência. Genes "variantes" compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica o mesmo polipeptídeo que um gene de referência ou um polipeptídeo equivalente que tem uma atividade equivalente ou similar ao polipeptídeo de referência.

Em algumas modalidades, genes variantes podem ser usados para produzir proteínas variantes, e hospedeiros recombinantes podem ser usados para produzir as proteínas variantes. Por exemplo, genes e proteínas variantes podem ser construídos, os quais compreendem resíduos contíguos (aminoácido ou nucleotídeo) de qualquer sequência exemplificada na presente invenção. Um gene ou proteína variante pode ter, por exemplo e sem limitação: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292 e 293 resíduos contíguos (aminoácido ou nucleotídeo) que correspondem a um segmento (do mesmo tamanho) na sequência exemplificada. Segmentos similarmente dimensionados, especialmente aqueles para regiões conservadas, podem ser também usados como sondas e/ou iniciadores. É compreendido por aqueles versados na técnica que muitos níveis de identidade de sequência são úteis na identificação de polipeptídeos (por exemplo, de outras espécies) que têm a mesma função ou atividade ou uma similar que o polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante tendo uma identidade de sequência (quando comparado com um polipeptídeo de referência; por exemplo, um polipeptídeo DGT-28) de, por exemplo e sem limitação: pelo menos cerca de 55%; pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 65%; pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 75%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90%; e pelo menos cerca de 95%, tem a mesma função ou uma similar que o polipeptídeo de referência.

Estratégias para projeto e construção de genes e proteínas variantes que compreendem resíduos contíguos de uma molécula particular podem ser determinadas através da obtenção e exame da estrutura de uma proteína de interesse (por exemplo, coordenadas 3-D (tridimensionais) de uma estrutura de cristal e/ou um modelo molecular). Em alguns exemplos, uma estratégia pode ser direcionada a certos segmentos de uma proteína que são ideais para modificação, tais como segmentos expostos à superfície, e não segmentos internos que estão envolvidos com dobra de proteína e integridade estrutural 3-D essencial. A Patente U.S. No. 5.605.793, por e-xemplo, refere-se a métodos para geração de diversidade molecular adicional usando rearranjo de DNA após fragmentação aleatória ou focada, isto pode ser referido como "embaralhamento" de gene, que tipicamente envolve mistura de fragmentos (de um tamanho desejado) de duas ou mais moléculas de DNA diferentes, seguido por rodadas repetidas de renaturação. Este processo pode melhorar a atividade de uma proteína codificada por um gene objeto de exame. O resultado pode ser uma proteína quimérica tendo atividade aperfeiçoada, especificidade de substrato alterada, estabilidade de enzima aumentada, estereoespecificidade alterada ou outras características.

Uma "substituição" de aminoácido pode ser o resultado de substituição de um aminoácido em uma sequência de referência com outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas similares (isto é, substituição de aminoácido conservativa) ou ela pode ser o resultado de substituição de um aminoácido em uma sequência de referência com um aminoáci- do tendo propriedades estruturais e/ou químicas diferentes (isto é, substituição de aminoácido não conservativa). Aminoácidos podem ser substituídos nas classes estruturais e/ou químicas que seguem: não polar; polar na carregada; básica; e ácida. Desta maneira, substituições de aminoácido "con-servativas" podem ser feitas com base em similaridade em polaridades, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade ou na natureza anfifática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, trip-tofano e metionina; aminoácidos polares não carregados (neutros) incluem serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Alternativamente, substituições de aminoácido "não conservati-vas" podem ser feitas selecionando as diferenças na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade ou natureza anfifática de qualquer um desses aminoácidos. "Inserções" ou "deleções" podem estar dentro da faixa de variação conforme estruturalmente ou funcionalmente tolerado pelas proteínas recombinantes.

Em algumas modalidades, uma proteína variante é "truncada" com relação a uma proteína de comprimento integral, de referência. Em alguns exemplos, uma proteína truncada retém a atividade funcional da proteína de referência. Por proteína "truncada" quer dizer que uma porção de uma proteína pode ser clivada, por exemplo, enquanto a proteína truncada restante retém ou exibe a atividade desejada após divagem. Clivagem pode ser obtida através de qualquer uma de várias proteases. Ainda, proteínas efetivamente clivadas podem ser produzidas usando técnicas de biologia molecular, em que as bases de DNA codificando uma porção da proteína são removidas da sequência de codificação, ou através de digestão com endonucleases de restrição ou outras técnicas disponíveis do versado no campo. Uma proteína truncada pode ser expressa em um sistema heterólo-go, por exemplo, E. coli, baculovírus, sistemas virais à base de plasmídeo e levedura. Proteínas truncadas conferindo tolerância a herbicida podem ser confirmadas usando o sistema heterólogo expressando a proteína em um bioensaio de tolerância a herbicida, tal como descrito aqui. É bem conhecido na técnica que proteínas truncadas podem ser produzidas com sucesso de maneira que elas retêm a atividade funcional da proteína de referência de comprimento integral. Por exemplo, proteínas de Bt podem ser usadas em uma forma truncada (proteína de núcleo). Vide, por exemplo, Hofte e White-ley (1989) Microbiol. Rev. 53(2):242~55; e Adang e outros (1985) Gene 36:289-300.

Em alguns casos, especialmente para expressão em plantas, pode ser vantajoso usar genes truncados que expressam proteínas truncadas. Genes truncados podem codificar um polipeptídeo compreendido de, por exemplo, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% da proteína de comprimento integral.

Os genes e proteínas variantes que retêm a função da sequência de referência a partir da qual eles foram projetados podem ser determinados por um versado na técnica, por exemplo, através do ensaio de variantes recombinantes quanto à atividade. Se tal ensaio de atividade for conhecido e caracterizado, então a determinação de variantes funcionais requer apenas experimentação de rotina.

Mudanças específicas no "sítio ativo" de uma enzima podem ser feitas para afetar sua funcionalidade inerente com relação à atividade ou estereoespecificidade. Vide Muller e outros (2006) Protein Sei. 15(6):1356-68. Por exemplo, a estrutura tauD conhecida foi usada como uma dioxigena-se modelo para determinar resíduos de sítio ativo enquanto ligada ao seu substrato inerente, taurina. Vide Elkins e outros (2002) Biochemistry 41(16): 5185-92. Informação adicional com relação à otimização de sequência e capacidade de projeto de sítios ativos de enzima pode ser encontrada em Chakrabarti e outros (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102(34):12035-40. Várias propriedades estruturais e características tridimensionais de uma proteína podem ser mudadas sem afetar de modo adverso a ativida- de/funcionalidade da proteína. Substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas de maneira que não afetem de modo adverso a atividade e/ou configuração tridimensional da molécula (substituições "toleradas"). Proteínas variantes podem ser também projetadas, as quais diferem no nível de sequência da proteína de referência, mas que retêm a mesma estrutura tridimensional essencial geral ou uma similar, distribuição de carga de superfície e similar. Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 7.058.515; Larson e outros, (2002) Protein Sei. 11:2804-13; Crameri e outros (1997) Nat. Biotech-nol. 15:436-8; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-51; Stemmer (1994) Nature 370:389-91; Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-53; Crameri e outros (1996) Nat. Med. 2:100-3; e Crameri e outros (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-9.

Projeto computacional de UTRs 5’ ou 3’ (por exemplo, grampos-de-cabelo sintéticos) que são adequadas para uso em um construto de expressão (por exemplo, um construto de expressão de DGT-28) pode ser também realizado e pode ser usado para projetar elementos dentro de ácidos nucleicos de algumas modalidades da presente invenção. Modelagem por computador e UTRs e técnicas de modelagem por computador para uso na previsão/avaliação de derivados de UTR 5’ e 3’ incluem, por exemplo e sem limitação: MFoLd® versão 3.1 (disponível da Genetics Corporation Groups, Madison, Wl; vide Zucker e outros, "Algorithms and Thermodyna-mies for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide," em RNA Biochemistry and Biotechnoloqy. 11-43, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999; Zucker e outros. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-40; Zucker e outros. "RNA Secondary Structure Prediction", em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick e R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, 2000); e COVE®{RNA structure analysis using covariance models (stochastic context free grammar methods)) v.2.4.2 (Eddy and Durbin (1994) Nucl. Acids Res. 22:2079-88), que é livremente distribuído como um código fonte e que pode ser baixado acessando o website, genetics.wustl.edu/eddy/software/; e FOLDALIGN® (vide Gorodkin e outros. (1997) Nucleic Acids Res. 25(18):3724-32 e Gorodkin e outros. (1997) Pro-ceedings International Conference on Intelligent Systems for Molecular Bío-logy ISMB International Conference on Intelligent Systems for Molecular Bio-logy 5:120-123), também livremente distribuído e disponível para baixar no website, foldaiign.ku.dk/software/ index.html.

Promotor: O termo "promotor" se refere a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação de ácido nucleico ou RNA funcional. No exemplo, a sequência de codificação controlada está localizada 3’ para uma sequência de promotor. Um promotor pode ser derivado em sua totalidade de um gene nativo, um promotor pode ser compreendido de elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados na natureza ou um promotor pode compreender ainda segmentos de DNA sintético. É compreendido por aqueles versados na técnica que promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em tecidos ou tipos de célula diferentes, ou em estágios de desenvolvimento diferentes, ou em resposta a condições ambientais ou fisiológicas diferentes. Exemplos de todos os promotores acima são conhecidos e usados na técnica para controlar a expressão de ácidos nucleicos heterólogos. Promotores que direcionam a expressão de um gene na maioria dos tipos de célula na maioria das vezes são geralmente referidos como "promotores constitutivos". Ainda, embora aqueles versados na técnica (em muitos casos sem sucesso) tenham tentado delinear os limites exatos de sequências reguladoras, deve ser compreendido que fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade promotora idêntica. A atividade de promotor de um ácido nucleico particular pode ser ensaiada usando técnicas familiares àqueles no campo.

Operavelmente ligado: O termo "operavelmente ligado" se refere a uma associação de sequências de ácido nucleico em um ácido nucleico único, em que a função de uma das sequências de ácido nucleico é afetada por outra. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado com uma sequência de codificação quando o promotor é capaz de realizar a expressão desta sequência de codificação (por exemplo, a sequência de codificação está sob o controle transcripcional do promotor). Uma sequência de codificação pode ser operavelmente ligada a uma sequência reguladora em uma orientação de sentido ou antissentído.

Expressão: O termo "expressão", conforme aqui usado, pode se referir à transcrição e acúmulo estável de RNA de sentido (mRNA) ou antis-sentido derivado de um DNA. Expressão pode também se referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Conforme aqui usado, o termo "superexpres-são” se refere à expressão que é maior do que a expressão endógena do mesmo gene ou um gene relacionado. Desta maneira, um gene heterólogo é "superexpresso" se sua expressão for maior do que aquela de um gene en-dógeno comparável.

Transformação: Conforme aqui usado, o termo "transformação" se refere à transferência e à integração de um ácido nucleico ou fragmento do mesmo em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo um ácido nucleico trans-formante são referidos como organismos "transgênicos", "recombinantes" ou "transformados". Métodos de transformação conhecidos incluem, por exemplo: transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizoge-nes\ transformação de fosfato de cálcio; transformação de polibreno; fusão de protoplasto; eletroporação; métodos ultrassônicos (por exemplo, sonopo-ração); transformação de lipossoma; microinjeção; transformação com DNA nu; transformação com vetores de plasmídeo; transformação com vetores virais; transformação biolística (bombardeamento de micropartícula); transformação mediada por carbida de silício WHISKERS; feixe de aerossol; e transformação mediada por PEG.

Introduzido: Conforme aqui usado, o termo "introduzido" (no contexto de introdução de um ácido nucleico em uma célula) inclui transformação de uma célula, bem como cruzamento de uma planta compreendendo o ácido nucleico com uma segunda planta, de maneira que a segunda planta contém o ácido nucleico, como pode ser realizado utilizando técnicas de cruzamento de planta convencionais. Tais técnicas de cruzamento são conhecidas no campo. Para uma discussão de técnicas de cruzamento de planta vide Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4a Edição, AVI Publication Co., Westport CT. Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um ácido nucleico em uma planta. Esta técnica tem sido usada por décadas para introdução de características em plantas. Um exemplo de uma descrição de retrocruzamento (e outras metodologias de cruzamento de planta) pode ser encontrado em, por exemplo, Poelman (1995), supra; e Jensen (1988) Plant Breeding Methodoloqy, Wiley, New York, NY. Em um protocolo de retrocruzamento exemplar, uma planta original de interesse (a "origem recorrente") é cruzada com uma segunda planta (a "origem não recorrente") que carrega um ácido nucleico a ser introduzido. A progênie resultante deste cruzamento é então cruzada novamente com a origem recorrente, e o processo é repetido até que uma planta convertida seja obtida, em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas da origem recorrente são recuperadas na planta convertida, em adição ao ácido nucleico da origem não recorrente.

Plasmídeo/vetor: Os termos "plasmídeo" e "vetor", conforme aqui usado, se referem a um elemento cromossomal extra que pode carregar um ou mais gene(s) que não são parte do metabolismo central da célula. Plas-mídeos e vetores tipicamente são moléculas de DNA de filamento duplo circulares. No entanto, plasmídeos e vetores podem ser ácidos nucleicos lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de filamento simples ou duplo, e podem ser derivados de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotí-deo foram unidas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e uma sequência de DNA de codificação junto com qualquer sequência não traduzida 3’ apropriada em uma célula. Em exemplos, plasmídeos e vetores podem compreender sequências autonomamente replicantes, sequências de integração de genoma e/ou sequências de fago ou nucleotídeo. III. DGT-28 e Sequências de codificação de DGT-28 Algumas das presentes modalidades proveem um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 90% de identidade (por exemplo, 89%, pelo me- nos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade) com a SEQ ID NO:1. Tal polipeptídeo é referido aqui como um polipeptídeo DGT-28. Algumas das presentes modalidades proveem um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1. Exemplos particulares de tal ácido nucleico são referidos aqui como ácido nucleico "dgt-28". Ácidos nu-cleicos Dgt-28 podem ser úteis em qualquer uma de uma variedade de aplicações (por exemplo, introdução de resistência a glifosato) em que metabolismo de glifosato modificado é desejado em uma célula de planta.

Exemplos particulares de ácidos nucleicos d dgt-28 providos para propósitos ilustrativos aqui são SEQ ID NOs: 2 e 3. Desta maneira, algumas modalidades proveem um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade) com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO:1. Exemplos particulares de ácidos nucleicos dgt-28 incluem ácidos nucleicos que hibridizam especificamente para um ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições adstringentes (por exemplo, altamente adstringentes).

Em algumas modalidades, ácidos nucleicos de dgt-28 otimizados no códon são providos. Por exemplo, para obter expressão alta de um gene heterólogo em uma planta pode ser desejável projetar e engenheirar o gene de maneira que ele seja mais eficientemente expresso em uma célula da planta. Esta estratégia pode ser particularmente desejável nas circunstâncias em que um gene bacteriano é desejado ser expresso em uma célula de planta.

Desta maneira, alguns dos presentes exemplos proveem um gene otimizado em planta codificando uma proteína DGT-28 e métodos para seu projeto, para gerar uma sequência de DNA que pode ser expressa otimamente em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas e em que as modificações de sequência não impedem tradução ou transcrição. Projeto de um gene dgt-28 otimizado para expressão da mesma proteína DGT-28 em ambas as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas é exemplificado aqui com uma reengenharia da região de codificação de proteína deste gene para expressão ótima. Ácidos nucleicos de dgt-28 otimizados em planta exemplares aqui incluem SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO.3.

Na engenharia de um gene codificando uma proteína DGT-28 para expressão em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas (por exemplo, algodão, canola, tabaco, milho, soja, trigo e arroz), a tendência de códon da(s) planta(s) hospedeiro(s) prospectiva(s) pode ser determinada, por e-xemplo, através do uso de bancos de dados de sequência de DNA publicamente disponíveis para encontrar informação sobre a distribuição de códon de genomas de planta ou das regiões de codificação de proteína de vários genes de planta.

Ao projetar regiões de codificação em um ácido nucleico para expressão de planta, os códons primários ("primeira escolha") preferidos pela planta devem ser determinados, bem como podem ser as segunda, terceira, quarta, etc, escolhas de códons preferidos quando escolhas múltiplas existirem. Uma sequência de DNA nova pode ser então projetada, a qual codifica a sequência de aminoácido do mesmo peptídeo (por exemplo, uma proteína DGT-28), mas a nova sequência de DNA difere da sequência de DNA original pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido) para especificar o aminoácido em cada posição dentro da sequência de aminoácido. A nova sequência pode então ser analisada quanto a sítios de enzima de restrição que poderíam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados podem ser modificados adicionalmente através da substituição dos códons com primeiro, segundo, terceiro ou quarto códon preferido de escolha. Outros sítios na sequência que poderíam afetar transcrição ou tradução do gene de interesse são estruturas tronco-alça, junções e-xomíntron (5’ ou 3'), sinais de adição poli a e sinais de terminação de polime-rase de RNA; esses sítios podem ser removidos através da substituição de códons de planta. A sequência pode ser analisada adicionalmente e modificada para reduzir a frequência de dupletos TA ou CG. Em adição aos duple-tos, blocos de sequência G ou C que têm mais do que cerca de seis resíduos que são iguais podem afetar transcrição ou tradução da sequência. Desta maneira, esses blocos podem ser modificados através da substituição dos códons de primeira ou segunda escolha, etc, com o próximo códon preferido de escolha. A SEQ ID NO:2 (dgt-28 (v5)) foi otimizada para expressão em plantas dicotiledôneas. A SEQ ID NO:3 (dgt-28) (v6)) foi otimizada para expressão em plantas monocotiledôneas. O uso de códon nessas sequências sintéticas foi selecionado com base em uso de códon preferido; isto é, os produtos de expressão de cada um são codificados por códons tendo uma tendência ao uso de planta ou monocotiledônea ou dicotiledônea, e sequências prejudiciais e sítios de restrição supérfluos foram removidos para aumentar a eficiência de transcrição/tradução do polipeptídeo DGT-28 e facilitar etapas de manipulação de DNA.

Da mesma maneira, a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:4 (dgt-28 (v1)) foi otimizada para aperfeiçoar a expressão em Escheri-chia coli. Uso de códon em SEQ ID NO:4 foi selecionado com base em uso de códon de E. coli preferido; a proteína expressa é codificada por códons tendo uma tendência para uso de E. coli. Durante o novo projeto, sequências prejudiciais e sítios de restrição supérfluos foram removidos para aumentar a eficiência de transcrição/tradução da sequência de codificação de DGT-28 e facilitar etapas de manipulação de DNA. Desta maneira, expressão de DGT-28 de um ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:4 em E. coli pode resultar em expressão de proteína robusta, por exemplo, para caracterização enzimática de DGT-28.

Uma vez uma sequência de DNA otimizada (por exemplo, uma otimizada em planta) tendo sido projetada em papel, ou ín silico, moléculas de DNA reais podem ser sintetizadas no laboratório para corresponder em sequência precisamente à sequência projetada. Tais moléculas de ácido nucleico sintéticas podem ser clonadas e de outra maneira manipuladas exatamente como se elas fossem derivadas de fontes naturais ou nativas.

Um ácido nucleico da presente invenção pode ser clonado em um vetor para transformação em células procarióticas ou eucarióticas para replicação e/ou expressão. Vetores podem ser vetores procariótícos, por e-xemplo, plasmídeos, ou vetores embaralhados, vetores de inseto ou vetores eucarióticos. Um ácido nucleico da presente invenção pode ser clonado em um vetor de expressão, por exemplo, para administração a uma célula de planta. Em certas aplicações, pode ser preferível ter vetores que são funcionais em E. coli (por exemplo, produção de proteína para criação de anticorpos, análise de sequência de DNA, construção de insertos, obtenção de quantidades de ácidos nucleicos).

Para expressar uma proteína DGT-28 em uma célula, um ácido nucleico codificando a proteína é tipicamente subclonado em um vetor de expressão que contém um promotor para direcionar transcrição. Promotores bacterianos e eucarióticos adequados são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Labora-tory Manual (2a ed. 1989; 3a ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel e outros, supra). Sistemas de expressão bacteriana para expressão de um ácido nucleico da presente invenção estão disponíveis em, por exemplo, E. coli, Bacillus sp. e Salmonella (Paiva e outros., Gene 22:229-235 (1983)). Estojos para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucarióticos para células de mamífero, levedura e células de inseto são bem conhecidos daqueles versados na técnica e estão também comercialmente disponíveis. O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética para a célula é selecionado com relação ao uso pretendido da proteína DGT-28 (por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos e protozoários). Vetores de expressão bacteriana e de animal padrão são bem conhecidos na técnica e são descritos em detalhes, por exemplo, na Publicação de Patente 20050064474A1 e Publicações de Patente Internacionais WO 05/084190, WO 05/014791 e WO 03/080809. Métodos de transfecção padrão podem ser usados para produzir linhagens de célula bacteriana que expressam quantidades grandes de proteína, que podem então ser purificadas usando técnicas padrão. A seleção de um promotor usado para direcionar expressão de um ácido nucleico da presente invenção depende da aplicação particular. Vários promotores que direcionam expressão de um gene em uma planta podem ser empregados nas presentes modalidades. Tais promotores podem ser selecionados de promotores constitutivos, quimicamente regulados, in-duzíveis, específicos de tecido e preferidos de semente. Por exemplo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hospedeira pode ser usado para expressão e purificação de proteínas DGT-28. Exemplos não limi-tantes de promotores de planta incluem sequências de promotor derivadas de ubiquitina-10 de A. thaliana (ubi-10) (Callis e outros, 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); manopina sintase de A. tumefaciens (Amas) (Petolino e outros., Patente U.S. No. 6,730,824); e/ou Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV) (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139).

Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor 35 do Vírus do Mosaico da Couve-flor (Odell e outros. (1985) Nature 313:810-812); Promotor da actina do arroz (McElroy e outros. (1990) Plant Cell 2:163-171); Promotor da ubiquitina do milho (Patente U.S. Número 5.510.474; Christensen e outros. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e outros. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); promotor pEMU (Last e outros. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); promotor ALS (Patente U.S. Número 5.659.026); Promotor da Histona do Milho (Chabouté e outros. Plant Molecular Biology, 8:179-191 (1987)); e similar. A faixa de promotores compatíveis de planta disponíveis inclui promotores específicos de tecido e induzíveis. Um elemento regulador indu- zível é um que é capaz de diretamente ou indiretamente ativar transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar transcrição está presente em uma forma inativa, que é então diretamente ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da adição de um patógeno ou agente de doença tal como um vírus. Tipicamente, o fator proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar transcrição está presente em uma forma inativa que é então diretamente ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. Uma célula de planta contendo um elemento regulador induzível pode ser exposta a um indutor através da aplicação externa do indutor à célula ou planta tal como através de pulverização, banho, aquecimento ou métodos similares.

Qualquer promotor induzível pode ser usado nas presentes modalidades. Vide Ward e outros. Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Promotores induzíveis incluem, por exemplo e sem limitação: promotores do receptor de ecdisona (Número de Patente U.S. 6.504.082); promotores do sistema ACE1 que respondem a cobre (Mett e outros, PNAS 90: 4567-4571 (1993)); genes In2-1 e ln2-2 de milho que respondem a protetores de herbicida de benzenossulfonamida (Patente U.S. Número 5.364.780; Hershey e outros, Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz e outros., Mol. Gen. Gene-tics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Ge-net. 227: 229-237 (1991); promotores de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcripcional é induzida por um hormônio glucocorticosteroi-de, Schena e outros., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88: 10421 (1991) e Mc-Nellis e outros., (1998) Plant J. 14(2):247-257; o promotor GST do milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes (vide Patente U.S. No. 5.965.387 e Pedido de Paten- te Internacional, Publicação No. WO 93/001294); e promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico (vide Ono, S., Kusama, M., Ogura, R., Hiratsuka, K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Repórter System," Biosci Biotechno! Biochem. 2011 23 Set ;75(9):1796-800). Outros promotores regulados por agente químico de interesse incluem promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz e outros (1991) Mol. Geri. Genet. 227:229-237, Patentes U.S. Números 5.814.618 e 5.789.156).

Outro promotores reguláveis de interesse incluem um elemento regulador responsivo a frio ou um elemento regulador de choque térmico, cuja transcrição pode ser realizada em resposta à exposição a frio ou calor, respectivamente (Takahashi e outros, Plant Physiol. 99:383-390, 1992); o promotor do gene da álcool desidrogenase (Gerlach e outros, PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker e outros, PNAS 84( 19):6624-6628 (1987)), in-duzível por condições anaeróbicas; o promotor induzível por luz derivado do gene rbcS de ervilha ou gene psaDb de ervilha (Yamamoto e outros (1997) Plant J. 12(2):255-265); um elemento regulador induzível por luz (Feinbaum e outros., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam e Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20):9586-9590; O-rozeo e outros (1993) Plant Mol. Bio. 23(6): 1129-1138); um elemento regulador induzível por hormônio de planta (Yamaguchi-Shinozaki e outros, Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares e outros., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990) e similar. Um elemento regulador induzível pode ser também o promotor do gene In2-1 ou ln2-2 do milho, que responde a protetores de herbicida de ben-zenossulfonamida (Hershey e outros, Mol. Gen. Gene. 221.229-231, 1991; Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994) e o repressor Tet de transposon Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 221:229-237, 1991).

Promotores induzíveis por estresse incluem promotores induzíveis por estresse de sal/água tal como P5CS (Zang e outros (1997) Plant Sciences 129:81-89); promotores induzíveis pelo frio, tal como cor15a (Haje-la e outros, (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm e outros, (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc120 (Ouellet e outros, (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch e outros, (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909) e ci21A (Schneider e outros. (1997) Plant Physiol. 113:335-45); promotores induzíveis por seca, tais como Trg-31 (Chaudhary e outros, (1 996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57) e rd29 (Kasuga e outros, (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); promotores induzíveis osmóticos, tais como Rab17 (Vilardell e outros, (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) e osmotina (Raghothama e outros, (1993) Plant Mol Biol 23:1117-28); promotores induzíveis por calor, tais como proteínas de choque térmico (Barros e outros, (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs e outros, (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters e outros, (1996) J. Experimental Botany 47:325-338); e o elemento induzível por choque térmico do promotor da ubiquitina da salsa (WO 03/102198). Outros promotores induzíveis por estresse incluem rip2 (Patente U.S. No. 5.332.808 e Publicação U.S. No. 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi -Shinozaki e outros, (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Certos promotores são induzíveis por ferida, incluindo o promotor pMAS de Agrobacterium (Guevara-Garcia e outros, (1993) Plant J. 4(3):495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen e outros, (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343).

Promotores preferidos de tecido podem ser utilizados para se direcionar à transcrição e/ou expressão alta dentro de um tecido de planta particular. Exemplos desses tipos de promotores incluem expressão preferida de semente, tal como aquela provida pelo promotor da faseolina (Bustos e outros. 1989. The Plant Ce//Vol. 1, 839-853) e o gene da globulina-1 de milho, Belanger e outros, 1991 Genetics 129:863-972. Para dicotiledôneas, promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a, β-faseolina do feijão, napina, β-conglicina, lecitina de soja, cruciferina e similar. Para monocotiledôneas, promotores de semente preferidos incluem, mas não estão limitados a, zeína de 15 kDa do milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, γ-zeína, ceroso, encolhido 1, encolhido 2, globulina 1, etc. Promotores preferidos de semente também incluem aqueles promotores que direcionam expressão de gene predominantemente para tecidos específicos e den- tro da semente tal como, por exemplo, o promotor preferido do endosperma de γ-zeína, o promotor críptico de tabaco (Fobert e outros. 1994. "T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptíc promoter in tobacco". Plant J. 4: 567-577), o promotor do gene-P de milho (Chopra e outros. 1996. "Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements". Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant Cell. 1997, 1:109), o promotor de globulina-1 de milho (Belenger e Kriz.1991. "Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene". Genetics 129: 863-972) e promotores que direcionam expressão do revestimento da semente ou casca de grãos de milho, por exemplo, o promotor da glutamina sintetase específico de pericarpo (Muhitch e outros., 2002. "Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetasei_2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize". Plant Science 163:865-872).

Em adição ao promotor, um vetor de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionados requeridos para expressão do ácido nucleico nas células hospedeiro ou procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típico então contém um promotor operavelmente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína, e sinais requeridos, por exemplo, para poliadenilação eficiente do transcrito, terminação trans-cripcional, sítios de ligação de ribossomo ou terminação de tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, aumentadores e sinais de união heterólogos.

Outros componentes do vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso pretendido do gene. Exemplos incluem marcadores selecionáveis, sequências de direcionamento ou reguladoras, sequência de pep-tídeo de trânsito tal como a sequência de peptídeo de trânsito otimizada (vide Patente U.S. Número 5.510.471), sequências de estabilização tal como RB7 MAR (vide Thompson e Myatt (1997), Plant. Mol. Biol. 34: 687-692 e WO9727207) ou sequências líderes, íntrons, etc. Descrições gerais e exemplos de vetores de expressão de planta e genes repórter podem ser encon- tradas em Gruber e outros, "Vectors for Plant Transformation" em Methods in Plant Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy. Glíck e outros, eds; CRC Press pp. 89-119 (1993). A seleção de um vetor de expressão apropriado vai depender do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão pode incluir, no terminal 3’ de uma sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse, uma região de terminação transcripcio-nal e traducional funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação (nos) octopina sinta-se e a nopalina sintase (Depicker e outros, Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) e Shaw e outros. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)); vide também Guerineau e outros, Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon e outros. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen e outros, Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe e outros. Gene 91:151-158 (1990); Bailas e outros, Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi e outros, Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987).

Um cassete de expressão pode conter uma sequência líder 5’. Tais sequências líderes podem agir para aumentar tradução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, líderes de piconarvírus, líder de EMCV (região de não codificação 5’ de Encefalomio-cardite), Elroy-Stein e outros, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 86:6126-6130 (1989); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (Vírus Etch do Tabaco), Carrington e Freed, Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), líder MDMV (Vírus do Mosaico Anão do Milho (Maize Dwarf Mosaic Virus)), Allison e outros., Virology 154:9-20 (1986); proteína de ligação de cadeia pesada da i-munoglobulina humana (BiP), Macejak e outros, Nature 353:90-94 (1991); líder não traduzido do mRNA da proteína revestida do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA4), Jobling e outros, Nature 325:622-625 (1987); líder do Vírus do mosaico do tabaco (Tobacco mosaic virus leader (TMV)), Gallie e outros, (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; líder do vírus do mosqueado clorótico do milho (maize chlorotic mottle vírus) (MCMV) Lommel e outros, Virology 81:382-385 (1991). Vide também Della-Cioppa e outros, Plant Physiology 84:965-968 (1987). O construto pode também conter sequências que aumentam a tradução e/ou estabilidade do mRNA tais como íntrons. Um exemplo de tal íntron é o primeiro íntron do gene li da variante H3.III da histona de Arabi-dopsis thaliana. Chaubet e outros. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).

Naqueles casos em que é desejável ter o produto expresso da sequência de nucleotídeo heterólogo direcionado a uma organela particular, particularmente o plastídeo, amiloplasto ou ao retículo endoplásmico, ou se-cretado na superfície da célula ou extracelularmente, o cassete de expressão pode compreende ainda uma sequência de codificação para um peptí-deo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, o peptídeo de trânsito para a proteína carreadora acila, a subunidade pequena de RUBISCO, EPSP sintase de planta e Helianthus annuus (videLebrun e outros. Patente U.S. 5.510.417), peptídeo de trânsito de cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson e outros. Plant Physiol 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan e outros, Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan e outros, Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan e outros, J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004) e similar. Ainda, peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos são conhecidos na técnica, tal como o Peptídeo de Trânsito Otimizado (vide Patente U.S. Número 5.510.471). Peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais foram descritos anteriormente nas Patentes U.S. Nos. 5.717.084; 5.728.925. Um versado na técnica vai prontamente reconhecer as muitas opções disponíveis em expressão de um produto para uma organela particular. Por exemplo, a sequência de alfa amilase de cevada é frequentemente usada para direcionar expressão para o retículo endoplásmico. Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985).

Será compreendido por um versado na técnica que uso de tec- nologias de DNA recombinante podem melhorar o controle de expressão de moléculas de ácido nucleico transfectadas através da manipulação, por e-xemplo, do número de cópias das moléculas de ácido nucleico dentro da célula hospedeira, a eficiência com a qual essas moléculas de ácido nucleico são transcritas, a eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e a eficiência de modificações pós-traducionais. Ainda, a sequência promotora podería ser geneticamente engenheirada para melhorar o nível de expressão comparado com o promotor nativo. Técnicas recombinantes úteis para controle da expressão de moléculas de ácido nucleico incluem, mas não estão limitadas a, integração estável das moléculas de ácido nucleico em um ou mais cromossomos de célula hospedeira, adição de sequências de estabilidade de vetor a plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle transcripcíonal (por exemplo, promotores, operadores, au-mentadores), substituições ou modificações de sinais de controle traducional (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, sequências Shine-Dalgarno ou Kozak), modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de códon da célula hospedeira e deleção de sequências que desestabi-lizam transcritos.

Genes repórteres ou marcadores para seleção de células ou tecidos ou partes de planta ou plantas transformados podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabolitos tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, diidrofolato redutase, que confere resistência a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13:143-149, 1994; vide também Herrera Estrella e outros, Nature 303:209-213, 1983; Meijer e outros, Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991); neomicina fosfotranferase, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 e Fraley e outros. Proc. Natl. Acad. Sei USA 80:4803 (1983)); higromicina fosfotransferase, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32:481-485, 1984; vide também Waldron e outros., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian e outros, Plant Science 108:219-227, 1995); trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sei., USA 85:8047, 1988); ma-nose-6-fosfato isomerase que permite que as células utilizem manose (WO 94/20627); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao inibidor da ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-ornitína (DFMO; McConlogue, 1987, Em: Current Communications in Molecular Bioloqy, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência à Blasticidina S. (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995).

Marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia (Lee e outros, EMBO J. 7:1241-1248, 1988), um mutante psbA, que confere resistência à atrazina (Smeda e outros, Plant Physiol. 103:911-917, 1993) ou uma protoporfirinogênio oxidase mutante (vide Patente U.S. No. 5.767.373) ou outros marcadores conferindo resistência a um herbicida tal como glufosinato. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, genes codificando resistência a clo-ranfenicol (Herrera Estrella e outros, EMBO J. 2:987-992, 1983); estreptomi-cina (Jones e outros, Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); spectinomicina (Bretagne-Sagnard e outros, Transgenic Res. 5:131-137, 1996); bleomicina (Hille e outros, Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); sulfonamida (Guerineau e outros., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); bromoxinila (Stalker e outros, Science 242:419-423, 1988); glifosato (Shaw e outros., Science 233:478-481, 1986); fosfinotricina (DeBlock e outros., EMBO J. 6:2513-2518, 1987) e similar.

Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA de codificação de resistência a glufosinato e em uma modalidade pode ser a fosfino-tricino acetil transferase (pat), gene pat ou gene bar otimizado do milho sob o controle do promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca. Esses genes conferem resistência a bialafos. Vide (vide, Wohlleben e outros, (1988) Gene 70: 25-37); Gordon-Kamm e outros, Plant Cell 2:603; 1990; U-chimiya e outros, BioTechnology 11:835, 1993; White e outros, Nucl. Acíds Res. 18:1062, 1990; Spencer e outros, Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; e Anzai e outros., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989). Uma versão do ge- ne pat é o gene pat otimizado do milho, descrito na Patente U.S. No. 6.096.947.

Ainda, marcadores que facilitam identificação de uma célula de planta contendo o polinucleotídeo codificando o marcador podem ser empregados. Marcadores que podem ser classificados e avaliados são úteis, em que a presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula de planta. Exemplos incluem β-glucuronidase, ou gene uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, Patentes U.S. 5.268.463 e 5.599.670); cloranfenicol acetil transferase (Jefferson e outros, The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é beta-caroteno ou pró-vitamina A (Ye e outros, Science 287:303-305-(2000)). O gene foi usado para aumentar a nutrição de arroz, mas neste caso ele é empregado ao invés de um marcador selecionável, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourada provida. Diferente da situação em que o gene é usado por sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor de proteína é suficiente para propósitos de marcação. Outros marcadores que podem ser avaliados incluem os genes da antocia-nina/flavonoide em geral (vide discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127) incluindo, por exemplo, um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros, em Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); os genes que controlam biossíntese de pigmentos flavo-noides, tal como o gene C1 do milho (Kao e outros, Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler e outros, Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 do milho (Wienand e outros, Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler e outros., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene p1 (Grotewold e outros, Proc. Natl. Acad. Sei USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold e outros, Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko e outros, Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); os genes do locus bronze (Ralston e outros, Genetics (1988) 119:185-197;

Nash e outros, Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), dentre outros.

Exemplos adicionais de marcadores adequados incluem o gene da proteína fluorescente ciano (CYP) (Cyan Fluorescent Protein) (Boite e outros, (2004) J. Cell Science 117: 943-54e Kato e outros, (2002) Plant Phy-siol 129: 913-42), o gene da proteína amarelo fluorescente (PHIYFP® da E-vrogen; vide Boite e outros. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, que codifica uma luciferase, cuja presença pode ser detectada usando, por exemplo, película de raio X, contagem por cintilação, espectrometria fluorescente, câmeras de vídeo de pouca luz, câmeras de contagem de fóton ou luminometria multicavidade ((Teeri e outros. (1989) EMBO J. 8:343); um gene da proteína verde fluorescente ( green fluorescent protein) (GFP) (Sheen e outros, Plant J. (1995) 8(5):777-84); e DsRed2 em que as células de planta transformadas com o gene marcador são de cor vermelha, e então visualmente selecionáveis ((Dietrich e outros. (2002) Biotechniques 2(2): 286-293). Exemplos adicionais incluem um gene da β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Nat’1. Acad. Sei. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PA-DAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky e outros, Proc. Nat'l. Acad. Sei. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica uma catechol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene da α-amilase (Ikuta e outros, Biotech. (1990) 8:241); e um gene da tirosinase (Katz e outros, J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, que por sua vez condensa para formar o composto facilmente detectável menalina. Claramente, muitos tais marcadores estão disponíveis e são conhecidos do versado na técnica. IV, Células e organismos compreendendo DGT-28 Em algumas modalidades, uma célula e/ou organismo (por e-xemplo, uma célula de planta ou planta) é provido, o qual compreende um polipeptídeo heterólogo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO:1. Em modalidades particulares, uma célula e/ou organismo é provido, o qual compreende um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ 1D NO:1, por exemplo, um ácido nucleico dgt-28. Algumas modalidades incluem uma célula e/ou organismo compreendendo um ácido nucleico heterólogo que hibridiza para outro ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta adstringência.

Uma célula de planta, parte de planta e/ou planta pode ser geneticamente modificada para compreender um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, uma proteína DGT-28) e/ou ácido nucleico heterólogo (por exemplo, um ácido nucleico dgt-28) através de qualquer um de vários métodos de introdução de uma molécula heteróloga conhecida na técnica. Em modalidades particulares na presente invenção, uma molécula heteróloga é introduzida em uma célula de planta, parte de planta e/ou planta através de um método selecionado de, por exemplo e sem limitação: transformação e cruzamento seletivo (por exemplo, retrocruzamento).

Qualquer espécie ou célula de planta pode ser geneticamente modificada para compreender um polipeptídeo heterólogo e/ou ácido nucleico aqui. Em algumas modalidades, a célula de planta que é então geneticamente modificada não é capaz de regeneração para produzir uma planta. Em algumas modalidades, plantas que são geneticamente modificadas de acordo com a presente invenção (por exemplo, células hospedeiro de planta) incluem, mas não estão limitadas a, plantas superiores, uma planta dicotile-dônea, uma planta monocotiledônea, uma planta consumível, uma planta de milho e uma planta utilizada para seus óleos (por exemplo, uma planta de semente oleosa). Tais plantas incluem, por exemplo e sem limitação: alfafa; soja; algodão; semente de colza (canola); semente de linhaça; milho; arroz; braquiária; trigo; açafrão; sorgo; beterraba; girassol; tabaco; e gramas (por exemplo, turí grass). Em exemplos particulares, uma célula de planta ou planta geneticamente modificada aqui inclui, por exemplo e sem limitação: Brassica napus; mostarda indiana (Brassica juncea); Mostarda etiópica (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); repolho (Brassica olera-cea); Glycine max; Linum usitatissimum; Zea mays; Carthamus tinctorius; Helianthus annuus; Nicotiana tabacum; Arabidopsis thaliana, noz brasileira (Betholettia excelsa), csemente de mamona (Ricinus communis), coco (Co-cus nucifera); coentro (Coriandrum sativum)\ Gossypium spp.\ amendoim (Arachis hypogaea), jojoba (Simmondsia chincnsis); palma de óleo (Elaeis guineeis)\ oliva (Olea eurpaeá)\ Oryza sativa; abóbora (Cucurbita maxima); cevada (Hordeum vulgare); cana-de-açúcar (Saccharum officinarum)', Triti-cum spp. (inciuding Triticum durum e Triticum aestivum), e lentilha d água (Lemnaceae sp.). Em algumas modalidades, a planta pode ter uma base genética particular, como para cultivares de elite, cultivares do tipo selvagem e variedades comercialmente distinguíveis. Ácidos nucleicos introduzidos em uma célula de planta podem ser usados para conferir características desejadas em essencialmente qualquer planta. Uma ampla variedade de plantas e sistemas de célula de planta pode ser engenheirada quanto às características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas aqui usando um ácido nucleico codificando um polipep-tídeo DGT e vários métodos de transformação. As presentes modalidades podem usar qualquer um de muitos métodos para a transformação de plantas (e produção de plantas geneticamente modificadas) que são conhecidas na técnica. Vários métodos para transformação de planta foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformações biológica e física para plantas dicotiledôneas, bem como plantas monocotiledôneas (vide, por exemplo, Goto-Fumiyuki e outros, (1999) Nat. Biotechnol. 17:282-6; Míki e outros. (1993) Methods in Plant Molecular Bioloqy and Biotechnoloqy (Glick, B. R. e Thompson, J. E., Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 67-88). Ainda, vetores e métodos de cultura in vitro para transformação e regeneração de célula e tecido de plantas são descritos, por exemplo, em Gruber e outros (1993), supra, nas páginas 89-119. Técnicas de transformação de planta disponíveis para introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeira de planta incluem, por exemplo e sem limitação: transformação com T-DNA desarmado usando Agrobacte-rium tumefaciens ou A. rhizogenes como o agente de transformação; trans-fecção com fosfato de cálcio; transformação com polibreno; fusão de proto-plasto; eletroporação (D'Halluin e outros, (1992) Plant Cell 4:1495-505); mé- todos ultrassônicos (por exemplo, sonoporação); transformação de liposso-ma; microinjeção; contato com DNA nu; contato com vetores de plasmídeo; contato com vetores virais; biolística (por exemplo, bombardeamento com partícula de DNA (vide, por exemplo, Klein e outros (1987) Nature 327:70-3) e bombardeamento com micropartícula (Sanford e outros. (1987) Parí. Sei. Technol. 5:27; Sanford (1988) Trends Biotech. 6:299, Sanford (1990) Physi-ol. Plant 79:206; e Klein e outros. (1992) Biotechnology 10:268); transformação mediada por carbida de silício WHISKERS (Kaeppler e outros, (1990) Plant Cell Rep. 9:415-8); transformação de nanopartícula (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. US2009/0104700A1); feixe de aerossol; e absorção mediada por polietileno glicol (PEG). Em exemplos específicos, um ácido nucleico heterólogo pode ser introduzido diretamente no DNA genômico de uma célula de planta.

Um método ampíamente utilizado para introdução de um vetor de expressão em uma planta é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Horsch e outros. (1985) Science 227:1229. A. tumefa-ciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas de planta conhecidas como sendo úteis para transformar geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Kado (1991) Crit. Rev. Plant Sei. 10:1. Detalhes com relação a sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de gene mediada por Agrobacterium estão também disponíveis em, por exemplo, Gruber e outros, supra, Miki e outros, supra, Moloney e outros, (1989) Plant Cell Reporís 8:238 e Patentes U.S. Nos. 4.940.838 e 5.464.763.

Se Agrobacterium for usada para a transformação, o DNA a ser inserido tipicamente é clonado em plasmídeos especiais; ou em um vetor intermediário ou um vetor binário. Vetores intermediários não podem replicar sozinhos em Agrobacterium. O vetor intermediário pode ser transferido para A. tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). O sistema Superbinário de Tabaco Japonês é um exemplo de tal sistema (revisto por Komari e outros. (2006) Methods in Molecular Bioloqy (K. Wang, ed.) No. 343; Agrobacteríum Protocols, 2a Edição, Vol. 1, Humana Press Inc., Toto-wa, N.J., pp.15-41; e Komori e outros. (2007) Plant Physiol. 145:1155-60). Vetores binários podem replicar sozinhos ambos em E. coli e em Agrobacte-rium. Vetores binários compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante que são estruturados pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobac-terium (Holsters, 1978). A Agrobacteríum compreende um plasmídeo carregando uma região vir. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula de planta. T-DNA adicional pode estar contido.

As funções de virulência do hospedeiro Agrobacteríum tumefaci-ens vão direcionar a inserção de um filamento T contendo o construto e marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula é infectada pelas bactérias usando um vetor de T DNA binário (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-21) ou o procedimento de co-cultivo (Horsch e outros. (1985) Science 227:1229-31). Em geral, o sistema de transformação de Agrobacteríum é usado para engenheirar plantas dicotiledôneas. Bevan e outros, (1982,) Ann. Rev. Genet 16:357-84; Rogers e outros, (1986) Methods Enzymol. 118:627-41. O sistema de transformação de Agrobacteríum pode ser também usado para transformar, bem como transferir, ácidos nucleicos para plantas monocotiledôneas e células de planta. Vide Patente U.S. No. 5.591.616; Hernalsteen e outros, (1984) EMBO J 3:3039-41; Hooykass-Van Slogteren e outros, (1984) Nature 311:763-4; Grimsley e outros, (1987) Nature 325:1677-9; Boulton e outros, (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; e Gould e outros. (1991) Plant Physiol, 95:426-34.

As manipulações genéticas de um hospedeiro recombinante da presente invenção podem ser realizadas usando técnicas genéticas e avaliação padrão, e podem ser realizadas em qualquer célula hospedeira que seja adequada para manipulação genética. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante pode ser qualquer hospedeiro organismo ou microorganismo adequado para modificação genética e/ou expressão de gene recombinante. Em aigumas modalidades, um hospedeiro recombinante pode ser uma planta. Técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padrão usadas aqui são bem conhecidas no campo e são descritas em, por exemplo e sem limitação: Sambrook e outros. (1989), supra; Silhavy e outros, (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel e outros. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoe, e Wiley-lnterscience, New York, NY.

Seguindo a introdução de um ácido nucleico em uma célula de planta, a célula de planta pode ser cultivada, e quando da emergência de tecido de diferenciação tais como brotos e raízes, plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas pode ser gerada. Metodologias para regeneração de plantas são conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Ptant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil eThorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). Plantas geneticamente modificadas descritas aqui podem ser culturadas em um meio de fermentação ou cultivadas em um meio adequado tal como solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas maiores pode ser qualquer meio de crescimento para plantas, incluindo, mas não limitado a, solo, areia e qualquer outro meio em partícula que apoie crescimento de raiz (por e-xemplo, vermiculita, perlita, etc) ou cultura hidropônica, bem como luz, água e suplementos nutricionais adequados que facilitem o crescimento da planta maior. Células de planta transformadas que são produzidas através de qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser culturadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado, e então o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração se apoiam em manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente se apoiando em um marcador biocida e/ou herbicida que foi introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas. Regeneração de planta a partir de protoplastos culturados é descrita em Evans e outros., "Protoplasts Isolation and Culture" em Handbook of Plant CelI Cultu-re, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Ra-ton, 1985. Regeneração pode ser também obtida a partir de calo, explantes, órgãos, pólens, embriões de planta ou partes da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas em geral em Klee e outros (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.

Em outras modalidades, as células de planta que são transformadas não são capazes de regeneração para produzir uma planta. Tais células podem ser empregadas, por exemplo, no desenvolvimento de uma linhagem de célula de planta tendo o fenótipo relevante, por exemplo, resistência a herbicida.

Uma célula de planta, calo, tecido ou planta transformado pode ser identificado e isolado através de seleção ou avaliação do material de planta engenheirado quanto a características codificadas pelos genes marcadores presentes no DNA transformante. Por exemplo, seleção pode ser realizada através de cultivo do material de planta engenheirado em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida ao qual o construto de gene transformante confere resistência. Ainda, plantas e células de planta transformadas podem ser identificadas através da avaliação quanto a atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, a β-glucuronidase, luciferase ou genes gfp) que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinante. Tais metodologias de seleção e avaliação são bem conhecidas dos versados na técnica.

Uma planta transgênica contendo uma molécula heteróloga da presente invenção pode ser produzida através de cruzamento seletivo, por exemplo, cruzando sexualmente uma primeira planta parental compreendendo a molécula e uma segunda planta parental, desta maneira produzindo uma pluralidade de primeiras plantas progênies. Uma primeira planta progê-nie pode ser então selecionada, a qual é resistente a um marcador selecio- nável (por exemplo, glifosato, resistência que pode ser conferida à planta progênie pela presente molécula heteróloga). A primeira planta progênie pode então ser autopolinada, desta maneira produzindo uma pluralidade de segundas plantas progênies. Então, uma segunda planta progênie pode ser selecionada, a qual é resistente ao marcador selecionáveí. Essas etapas podem incluir ainda o retrocruzamento da primeira planta progênie ou da segunda planta progênie com uma segunda planta parental ou uma terceira planta parental.

Deve ser também compreendido que duas plantas transgênicas diferentes podem ser também emparceiradas para produzir prole que contém dois genes exógenos, independentemente segregantes, adicionados. Autopolinação de progênie apropriada pode produzir plantas que são homo-zigotas para ambos os genes exógenos, adicionados. Retrocruzamento com uma planta parental e cruzamento com outra linhagem com uma planta não transgênica são também compreendidos, bem como propagação vegetativa. Outros métodos de cruzamento geralmente usados para características e cuituras diferentes são conhecidos na técnica. Retrocruzamento tem sido usado para transferir genes para uma característica simplesmente herdada, altamente herdável, para uma cultivar homozigota desejável ou linhagem de cruzamento, que é a origem recorrente. A planta resultante é esperada ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica dese-jáveí transferida da origem doadora Após o cruzamento inicial, indivíduos possuindo o fenótipo da origem doadora são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzados) com a origem recorrente. A origem resultante é esperada ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejada transferida da origem doadora.

Um ácido nucleico pode ser introduzido em uma área predeterminada do genoma da planta através de recombínação homóloga. Métodos para integrar estavelmente uma sequência de polinucleotídeo dentro de um sítio cromossomal específico de uma célula de planta via recombínação homóloga foram descritos na técnica. Por exemplo, integração específica de sítio conforme descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 2009/0111188 A1 envolve ο uso de recombinantes ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doadora em um-alvo cromos-somal. Ainda, o Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/021207 descreve recombinação homóloga mediada por dedo de zinco integrar estavel-mente uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras dentro de locais específicos do genoma. O uso de recombinases tal como FLP/FRT conforme descrito na Patente U.S. No. 6.720.475 ou CRE/LOX conforme descrito na Patente U.S. No. 5.658.772 pode ser utilizado para integrar estavel-mente uma sequência de polinucleotídeo em um sítio cromossomal específico. Finalmente, o uso de meganucleases para direcionamento de polinucleo-tídeos doadores em um local cromossomal específico foi descrito em Puchta e outros, PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060).

Outros vários métodos para integração específica de sítio dentro de células de planta são geralmente conhecidos e aplicáveis (Kumar e outros, Trends in Plant Sei. 6(4) (2001) pp. 155-159). Ainda, sistemas de recombinação específicos de sítio que foram identificados em vários organismos procarióticos e eucarióticos inferiores podem ser aplicados para uso em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, mas não estão limitados a; o sistema R/RS recombinase do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccha-romyces rouxii (Araki e outros, (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) e o sistema Gin/gix de fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).

Em algumas modalidades, um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 pode ser opcionalmente combinado com outro ácido nucleico na célula e/ou organismo hospedeiro. Por exemplo, em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 pode ser combinado ou "empilhado" com outro que proveja resistência ou tolerância adicional a glifosato ou outro herbicida e/ou outro que proveja resistência a insetos ou doenças selecionados e/ou aumentos nutricionais e/ou características agronômicas aperfeiçoadas e/ou outro que proveja proteínas ou outros produtos úteis em usos em ração, alimento, industrial, farmacêutico ou outros. O "empilhamento" de duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro do genoma de uma planta pode ser realizado, por exemplo, através de cruzamento de planta convencional usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto(s) que contém os ácidos nucleicos, retransformação de uma planta transgênica ou adição de novas características através da integração direcionada através de recombinação homóloga. Ácidos nucleicos que podem ser "empilhados" com um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de i-dentidade com SEQ ID NO:1 incluem, por exemplo e sem limitação: Genes ou Sequência de Codificação (por exemplo, iRNA) que Conferem Resistência a Pestes ou Doença (A) Genes de Resistência à Doença de Planta. Defesas de planta são geralmente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência à doença (R) na planta e o produto de um gene de aviru-lência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para engenheirar plantas que são resistentes a linhagens de patógeno específicas. Exemplos de tais genes incluem o gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones e outros, 1994, Science 266:789), gene PtO do tomate, que codifica uma proteína cinase, para resistência a Pseudomonas syringae pv. tomato (Martin e outros, 1993, Science, 262:1432) e gene RSSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos e outros, 1994 Cell 78:1089). (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma, tal como uma sequência de nucleotídeo de um gene de δ-endotoxina de Bt (Geiser e outros, 1986 Gene 48:109) e um gene inseticida vegetativo (VIP) (vide, por exemplo, Estruch e outros. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. 93:5389-94). Além disso, moléculas de DNA codificando genes de δ-endotoxina podem ser compradas da American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob números de acesso ATCC 40098,67136, 31995 e 31998. (C) Uma lectina, tais como sequências de nucleotídeo de vários genes de lectina de ligação à manose de Clivia miniata (Van Damme e outros, 1994 Plant Molec. Biol. 24:825). (D) Uma proteína de ligação à vitamina, tais como avidina e homólogos de avidina que são úteis como larvicidas contra pestes de inseto. Vide Patente U.S. No. 5.659.026. (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protease ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor da proteinase da cisteína do arroz (Abe e outros, 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor da proteinase do tabaco I (Huub e outros, 1993 Plant Molec. Biol. 21:985) e um inibidor de α-amilase (Sumitani e outros, 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243). (F) Um hormônio ou feromônio específico de inseto tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo, tal como expressão em baculovírus de hormônio esterase juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil (Hammock e outros, 1990 Nature 344:458). (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto que, quando da expressão, rompe a fisiologia da peste afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989) e neurotoxinas paralíticas, específicas de inseto (Patente U.S. No. 5.266.361). (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc., tal como peptídeo insetotóxico de escorpião (Pang, 1992, Gene 116:165). (I) Uma enzima responsável por hiperacúmulo de monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenil-propanoide ou outra molécula não proteína com atividade inseticida. (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nu- clease, uma ciciase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitínase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem, um gene callas (pedido de patente publicado PCT WO93/02197), sequências de codificação de quitínase (que podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob números de acesso 3999637 e 67152), quitínase da tênia do tabaco (Kramer e outros, 1993 Insect Molec. Biol. 23:691) e gene da poli-ubiquitina ubi4-2 da salsa (Kawalleck e outros, 1993 Plant Molec. Biol. 21:673). (K) Uma molécula que estimula transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeo para clones de cDNA da calmodulina de feijão mung (Botella e outros, 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina do milho (Griess e outros., 1994, Plant Physiol. 104:1467). (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Vide Patentes U.S. Nos. 5.659.026 e 5.607.914; a última ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença. (M) Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo lítico cecropina-β (Jaynes e outros, 1993 Plant Sei. 89:43) que torna plantas de tabaco trans-gênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum. (N) Uma proteína invasiva-viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento virais em células de planta transformadas dá resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença realizado pelo vírus do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, bem como por vírus relacionados. Resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da listra do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus etch do tabaco, vírus rattle do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Vide, por exemplo, Beachy e outros (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451. (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina deri- vada do mesmo. Desta maneira, um anticorpo direcionado a uma função metabólica crítica no intestino do inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor e outros. (1994) Abstract #497, Seventh lnt'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzymatic inactivation in transgenic tobacco via production of single-chain antibody fragments. (P) Um anticorpo específico de vírus. Vide, por exemplo, Tavla-doraki e outros (1993) Nature 266:469, que mostra que plantas transgênicas expressando genes de anticorpo recombinantes são protegidas de ataque de vírus. (Q) Uma proteína de parada de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Desta maneira, endo a-1,4-D po-ligalacturonases fúngicas facilitam colonização fúngica e liberação de nutriente da planta através de solubilização de homo-a-1,4-D-galacturonase de parede de célula de planta (Lamb e outros, 1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart e outros. (1992 PlantJ. 2:367). (R) Uma proteína de parada de desenvolvimetno produzida na natureza por uma planta, tal como um gene de inativação de ribossomo de cevada que provê uma resistência alta à doença fúngica (Longemann e outros, 1992). Bio/Technology 10:3305. (S) Interferência de RNA, em que uma molécula de RNA é usada para inibir expressão de um gene-alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é parcialmente ou integralmente de filamento duplo, que dispara uma resposta de silenciamento, resultando em divagem de dsRNA em RNAs de interferência pequenos, que são então incorporados a um complexo de direcionamento que destrói mRNAs homólogos. Vide, por exemplo, Fire e outros, Patente U.S. 5.506.559; Graham e outros 6.573.099.

Genes que Conferem Resistência a um Herbicida (A) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida de imidazolinona, sulfoanilida ou sulfonilureia. Genes exemplares nesta categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee e outros, 1988, EMBO J., 7:1241), que é também conhecida como enzima AHAS (Miki e outros, 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449). (B) Um ou mais genes adicionais codificando resistência ou tolerância a glifosato concedida por genes de EPSP sintase ou aroA mutantes, ou através de inativação metabólica por genes tal como GAT (glifosato ace-tiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos fosfono tal como glufosinato (genes pat e bar, DSM-2) e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e cicloexanodionas (genes de codificação do inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.940.835, que revela a sequência de nucleotí-deo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência a glifosato. Uma molécula de DNA codificando um gene aroA mutante pode ser obtida sob Número de Acesso ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeo do gene mutante é revelada na Patente U.S. No. 4.769.061. O pedido de Patente Europeu No. 0 333 033 e a Pat. U.S. No. 4.975.374 revelam sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tal como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene da fosfinotricinacetil-transferase é provida no Pedido Europeu No. 0 242 246. De Greef e outros (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando atividade de fosfinotricino acetil transferase. Exemplares de genes conferindo resistência a ácidos ariloxifenoxipropiônico e cicloexanodionas, tais como setoxi-dim e haloxifope, são genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall e outros (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435. (C) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que inibe fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (gene da nitrilase). Przibilla e outros (1991) Plant Cell 3:169 descreve o uso de plasmídeos codificando genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Sequências de nucleotídeo para genes da nitrilase são descritas na Patente U.S. No. 4.810.648 e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificando uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes e outros (1992) Biochem. J. 285:173. (D) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que se ligam a hidroxifenilpiruvato dioxigenases (HPPD), enzimas que catalisam a reação em que para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isto inclui herbicidas tais como isoxazois (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Pat. Ü.S. No. 5.424.276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilas (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropii-1-(2-S02CH3- 4-2,3CI2fenil)propano-1,3-diona, triceto-nas (EP625505, EP625508, Pat. U.S. No. 5.506.195), em particular sulcotri-ona e pirazolinatos. Um gene que produz uma abundância em excesso de HPPD em plantas pode prover tolerância ou resistência a tais herbicidas incluindo, por exemplo, genes descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 20030066102. (E) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicidas de fenoxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente da α-cetoglutarato (aad-1), descrito na Patente U.S. No. 7.838.733. (F) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicidas de fenoxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e que pode também conferir resistência ou tolerância a herbicidas piridiloxi auxina, tal como fluorxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetog luta rato (aad-12), descrito no WO 2007/053482 A2. (G) Genes codificando resistência ou tolerância a dicamba (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030135879). (H) Genes provendo resistência ou tolerância a herbicidas que inibem protoporfirinogênio oxidase (PPO) (vide Patente U.S. No. 5.767.373). (I) Genes provendo resistência ou tolerância a herbicidas de triazina (tal como atrazina) e derivados de herbicidas de ureia (tal como diu-ron) que se ligam a proteínas de núcleo de centros de reação de fotossiste-ma II (PS II) (vide Brussian e outros (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245. Genes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Valor A-qreqado (A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, através da transformação de milho ou Brassica com um gene de antissentido ou estearoil-ACP dessaturase para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon e outros, 1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:2624. (B) Teor de fitato menor. (1) Introdução de um gene de codificação de fitase, tal como o gene da fitase de Aspergillus niger (Van Hartingveldt e outros, 1993, Gene 127:87), aumenta a quebra de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. (2) Um gene podería ser introduzido, o qual reduz o teor de fitato. Em milho, isso, por exemplo, poderia ser realizado através de clonagem e então reintrodução de DNA associado com o alelo único que é responsável por mutantes de milho caracterizados por níveis baixos de ácido fítico (Ra-boy e outros, 1990 May dica 35:383). (C) Composição de carboídrato modificada realizada, por e-xemplo, através de transformação de plantas com um gene codificando uma enzima que altera o padrão de ramificação de milho. Exemplos de tais enzimas incluem gene da frutosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza e outros, 1988), J. Bacteriol. 170:810, gene da levansucrase de Bacillus subti-lis (Steinmetz e outros, 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen e outros, 1992 Bio/Technology 10:292), genes da in-vertase do tomate (Elliot e outros, 1993), gene da amilase da cevada (Soga-ard e outros, 1993, J. Biol. Chem. 268:22480) e enzima II de ramificação de amido do endosperma do milho (Fisher e outros, 1993, Plant Physiol. 102:10450). Vários ensaios podem ser empregados com relação à molécula de ácido nucleico de certas modalidades da invenção. As técnicas que se- guem são úteis em uma variedade de situações, e em uma modalidade, são úteis na detecção da presença de molécula de ácido nucleico e/ou do poli-peptídeo codificado em uma célula de planta. Por exemplo, a presença da molécula pode ser determinada de uma variedade de maneiras, incluindo uso de um iniciador ou sonda da sequência, ensaio ELISA para detectar a proteína codificada, um Western blot para detectar a proteína ou um Northern ou Southern blot para detectar RNA ou DNA. Ensaios enzimáticos para detecção de enzima DGT-28 podem ser empregados. Ainda, um anticorpo que pode detectar a presença da proteína DGT-28 pode ser gerado usando procedimentos reconhecidos na técnica. Técnicas adicionais, tais como hi-brídização in situ, tingimento de enzima e imunotingimento, podem ser também usadas para detectar a presença ou expressão do construto recombi-nante em órgãos e tecidos de planta específicos. Um transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios desenvolvimentais ou o transgene pode ser expresso em substancialmente todos os tecidos da planta, substancialmente junto com seu ciclo de vida inteiro. No entanto, qualquer modelo de expressão combinatorial é também aplicável.

Análise Southern é um método de detecção geralmente usado, em que DNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o DNA através de peso molecular e então transferência para membranas de náilon. Ele é então hibridizado com o fragmento de sonda que foi radioativamente marcado com 32P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma solução de SDS.

Da mesma maneira, análise Northern implanta um protocolo similar, em que RNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o RNA através de peso molecular e então transferência para membranas de náilon. Ele é então hibridizado com o fragmento de sonda que foi radioativamente marcado com 32P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma solução de SDS. Análise do RNA (por exemplo, mRNA) isolado dos tecidos de interesse pode indicar níveis de expressão relativos. Tipicamente, se o mRNA estiver presente ou a quanti- dade de mRNA tiver aumentado, pode ser suposto que o transgene correspondente está sendo expresso. Análise Northern, ou outros protocolos analíticos de mRNA, pode ser usada para determinar níveis de expressão de um transgene introduzido ou gene nativo.

Na análise Western, ao invés do isolamento de DNA/RNA, a proteína de interesse é extraída e posta em um gel de acrilamida. A proteína então sofre blott em uma membrana e é contatada com uma substância de marcação. Vide, por exemplo, Hood e outros., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification" Molecular Breeding 3:291-306 (1997); Towbin e outros. (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applicati-ons", Proc Natl Acad Sei USA 76(9): 4350-4354; Renart e outros. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with anti-sera: a method for studying antibody specificity and antigen strueture" Proc Natl Acad Sei USA, 76(7): 3116-3120.

Os presentes ácidos nucleicos, ou segmentos dos mesmos, podem ser usados para projetar iniciadores para amplificação por PCR. Na realização da amplificação por PCR, um certo grau de incompatibilidade pode ser tolerado entre iniciador e molde. Mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em um dado iniciador através de métodos conhecidos de um versado comum na técnica.

Outro exemplo de método de detecção é a técnica de pirosse-quenciamento conforme descrito por Winge (fnnov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, é projetado um oligonucleotídeo que sobrepõe o DNA gnômico adjacente e se insere na junção de DNA. O oligonucleotídeo é hi-bridizado para produto de PCR de filamento único a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionados individualmente e a incorporação resulta em um sinal de luz que é medido. Um sinal de luz indica a presença da sequência de inser- ção/flanqueamento de transgene devido à amplificação, hibridização e extensão de base única ou múltipla bem sucedida.

Sondas fluorescentes (Molecular beacons) foram descritas para uso em detecção de sequência. Em suma, sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada, a qual sobrepõe o genômico de fianqueamento e se insere na junção de DNA. A estrutura única da sonda de FRET resulta em ela conter uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em proximidade grande. A sonda FRET e os iniciadores de POR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de fianqueamento) são ciclizados na presença de polimerase termoestável e dNTPs. Seguindo amplificação por PCR bem sucedida, hibridização da(s) sonda(s) de FRET para a sequência-alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções fluorescentes e de extinção. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica de flanqueamento/de inserção transgênica devido à amplificação e hibridização bem sucedidas.

Ensaio de sonda de hidrólise, de outra maneira conhecida como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de fianqueamento para detecção específica de evento. A sonda FRET e iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genômica de fianqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Hibridização da sonda FRET resulta em divagem e liberação da porção fluorescente para longe da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento/inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedidas. O ELISA ou imunoensaio ligado à enzima é conhecido desde 1971. Em geral, antígenos solubilizados em um tampão são revestidos em uma superfície plástica. Quando soro é adicionado, anticorpos podem se ligar ao antígeno na fase sólida. A presença ou ausência desses anticorpos pode ser demonstrada quando conjugados a uma enzima. Adição do substrato apropriado vai detectar a quantidade de conjugado ligado que pode ser quantificada. Um ensaio ELISA comum é um que usa anticorpos policlonais anti-(proteína) biotinilados e um conjugado de fosfatase alcalina. Por exemplo, um ELISA usado para determinação quantitativa de níveis de lacase pode ser um ensaio sanduíche de anticorpo, que utiliza anticorpos de coelho policlonais obtidos comercialmente. O anticorpo é conjugado a fosfatases alcalinas para detecção. Em outro exemplo, um ensaio ELISA para detectar tripsina ou tripsinogênio usa anticorpos policlonais antitripsina e anti-tripsinogênio biotinilados e um conjugado de estreptavidida-fosfatase alcalina.

Certas modalidades se referem a processos de realização de cruzamentos usando uma planta de uma modalidade da presente invenção como pelo menos uma origem. Por exemplo, modalidades particulares se referem a uma planta híbrida Fi tendo como uma ou ambas as origens qualquer uma das plantas exemplificadas aqui. Outras modalidades se referem à semente produzida por tais híbridos F-ι. Ainda outras modalidades se referem a um método para produção de uma semente híbrida Ft através de cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, origem entre a mesma espécie) e coleta da semente hibridam resultante. Outras modalidades se referem a uma planta exemplificada que é ou uma origem fêmea ou uma origem macho. Características das plantas resultantes podem ser aperfeiçoadas através de consideração cuidadosa das plantas de origem. V/. Tolerância a Glifosato Mediada por DGT-28 Polipeptídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 podem ter atividade enzimática de EPSPS. Desta maneira, polipeptídeos tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1, ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 (por exemplo, SEQ ID NOs:2-4) e um á-cido nucleico que hibridiza para um ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta adstringência podem ser usados em algumas modalidades para conferir tolerância a glifosato a uma célula ou organismo (por exemplo, uma célula de planta ou planta). Provisão de uma planta ou célula de planta que é resistente a formulações herbicidas de glifosato pode ser útil em uma variedade de aplicações, em que essas células de planta tendo tal resistência podem tolerar exposição a uma quantidade suficiente de glifosato que é usado para controlar pelo menos algumas ervas-daninhas em uma área sob cultivo.

Glifosato, uma composição compreendendo N-(fosfonometii)gli-cina, é um componente amplamente usado em herbicidas. Glifosato é tipicamente formulado como um sal em um concentrado líquido aquoso, um concentrado sólido, uma emulsão ou uma microemulsão. Glifosato pode ser aplicado pós-ermegência de plantas da emergência através dos vários estágios de desenvolvimento da planta.

Variedades de planta tolerantes a glifosato usadas em combinação com formulações herbicidas de glifosato se tornaram o programa padrão para tratamento de erva-daninha em produção de cultura nos Estados Unidos e em todo o mundo. A vantagem principal para os cultivadores em usar uma característica de tolerância a glifosato é que ela permite aplicação simples e conveniente de glifosato; um herbicida de pós-emergência, de espectro amplo, para controlar plantas e gramíneas indesejadas (isto é, "ervas-daninhas") com excelente segurança de cultura e menos dependência de aplicações herbicidas pré-planta. Outros benefícios incluem uma melhor a-daptação a sistemas de não cultura e de cultura reduzida. Culturas tolerantes a glifosato expandiram suas opções para tratamento de erva-daninha e tornaram a prática de controle de erva-daninha muito mais fácil, mais barata e mais flexível. Os cultivadores relataram fazer menos viagens nos campos para aplicar herbicidas bem como fazer menos viagens de cultivo, o que polpa combustível e reduz erosão do solo. Culturas tolerantes a glifosato, então, diminuem os riscos ambientais impostos por herbicidas, enquanto ao mesmo tempo aumentando a eficácia de controle de erva-daninha químico necessário.

Desta maneira, algumas modalidades providas aqui controlam seletivamente ervas-daninhas em uma área sob cultivo contendo uma planta compreendendo um polipeptideo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1, um ácido nucleico codificando um polipeptideo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 e/ou um ácido nucleico que hibridiza para um ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta adstringência, em que a planta tem tolerância a glifosato alta quando comparado com uma planta da mesma espécie que não compreende o polipeptideo e/ou ácido(s) nucleico(s). Em alguns exemplos, um método provido aqui compreende aplicação de uma quantidade suficiente de um glifosato herbicida à folhagem da cultura e ervas-daninhas para controlar crescimento das ervas-daninhas.

Modalidades particulares da presente invenção proveem um método para morte ou controle de ervas-daninhas ou vegetação indesejada em uma área sob cultivo contendo uma cultura (por exemplo, uma planta compreendendo um polipeptideo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1, um ácido nucleico codificando um polipeptideo tendo pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO:1 e/ou um ácido nucleico que hibridiza para um ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta adstringência). Em alguns exemplos, o método compreende aplicação de glifosato à cultura e/ou à área sob cultivo; por exemplo, aplicação de uma quantidade do glifosato à folhagem da planta de cultura, e simultaneamente a ervas-daninhas que crescem em proximidade grande a tais plantas, em que a quantidade é suficiente para resultar em controle das ervas-daninhas ou vegetação indesejada, enquanto deixando a planta de cultura substancíalmente sem prejuízo.

Uma composição de glifosato pode ser aplicada a plantas em uma taxa de aplicação suficiente para dar resultados biológicos desejados, por exemplo, controle de crescimento de erva-daninha sem afetar significan-temente plantas de cultura tolerantes a glifosato. Essas taxas de aplicação são geralmente expressas como quantidade de glifosato por área unitária tratada, por exemplo, gramas por hectare (g/ha). O que constitui um "efeito significante" varia de acordo com os padrões e práticas daqueles que inves- tigam, desenvolvem, comercializam a usam composições e a seleção de taxas de aplicação que são significantemente eficazes para uma composição está dentro da habilidade daqueles versados na técnica.

Em certos exemplos, a quantidade da composição de glifosato aplicada por área unitária para dar 85% de controle de uma espécie de erva-daninha conforme medido através de redução do crescimento ou mortalidade é usada para definir uma taxa de aplicação. A seleção de várias taxas de aplicação de herbicida de glifosato suficientes para controlar ervas-daninhas em uma área sob cultivo está dentro da habilidade do cientista agricultural comum. Aqueles versados na técnica vão da mesma maneira reconhecer que condições de planta individuais, condições de clima e crescimento, bem como os ingredientes ativos específicos e sua razão em peso na composição, podem influenciar o grau de eficácia herbicida em uma aplicação particular.

Em algumas modalidades, uma composição de glifosato aquosa pode ser aplicada a tecidos foliares de plantas para matar ou controlar o crescimento de uma ampla variedade de plantas indesejadas, incluindo grama anual e perenial e espécies de erva-daninha de folha larga, através da aplicação aos tecidos foliares das plantas de composições de glifosato a-quosas. A quantidade relativa de glifosato presente em uma composição herbicida compreendida (por exemplo, um concentrado sólido em partícula, concentrado líquido, composição pronta-para-uso e composição de mistura em tanque) pode variar dependendo de muitos fatores incluindo, por exemplo, a espécie de erva-daninha a ser controlada e o método de aplicação. Falando de um modo geral, no entanto, a concentração de glifosato e, opcionalmente, um tensoativo e/ou algum outro adjuvante ou aditivo (conforme descrito em outro ponto aqui) usado na composição herbicida é suficiente para controlar ervas-daninhas dentro de uma área sob cultivo.

Uma composição de pulverização herbicida pode ser aplicada como uma solução ou dispersão aquosa, seja a composição fabricada pronta para aplicação ou resultar da diluição adicional de um concentração de glifosato líquido ou da adição de água a um concentrado de glifosato sólido em partícula. No entanto, o termo "aquoso", conforme aqui usado, inclui composições compreendendo uma quantidade pequena de solvente não aquoso, contanto que o solvente predominante presente seja água. Uma composição de pulverização herbicida pode ser aplicada à folhagem das plantas a serem tratadas através de qualquer um dos métodos apropriados que são bem conhecidos daqueles tendo habilidade na técnica, incluindo técnicas de aplicação aerial e aplicação no solo (por exemplo, um lançamento no solo, um pulverizador de mão e um pavio de corda).

Em alguns exemplos, uma composição de concentrado líquido é formulada para incluir glifosato em uma concentração de pelo menos cerca de 50 gramas, pelo menos cerca de 75 gramas ou pelo menos cerca de 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 ou 700 gramas (equivalente ácido ou a.e.) por litro ou mais. A faixa de concentração de glifosato pode ser, por exemplo, de a partir de cerca de 50 a 680 gramas (a.e.) por litro (gpl), de a partir de cerca de 100 a cerca de 600 gpl, de a partir de cerca de 250 a cerca de 600 gpl e de a partir de cerca de 360 a cerca de 540 gpl.

Quando expresso como uma porcentagem em peso com base no peso total do concentrado de glifosato, um concentrado líquido pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 10% em peso de glifosato (a.e.), pelo menos cerca de 15% em peso e pelo menos cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou 68% em peso ou mais. A faixa de concentração de glifosato pode ser, por exemplo, de a partir de cerca de 10% em peso a cerca de 70% em peso a.e., de a partir de cerca de 20% em peso a cerca de 68% em peso ou de a partir de cerca de 25% em peso a cerca de 45% em peso.

Se o glifosato for aplicado como uma composição pronta-para-uso, a concentração de glifosato pode ser, por exemplo, de a partir de cerca de 1% em peso a cerca de 3% em peso a.e. e de a partir de cerca de 1% em peso a cerca de 2% em peso.

Composições para pulverização podem ser formuladas para a-plicação de, por exemplo, pelo menos cerca de 9,3539 litro (1 galão) de composição de pulverização por hectare (acre), pelo menos cerca de 18,7078, 28,0617, 37,415, 46,7695, 56,1234, 65,4773, 74,8312, 84,1851, 93,539, 102,8929, 112,2468, 121,6007, 130,9546, 140,3085, 149,6624, 159,0163, 168,3706, 177,7241, 187,078 litros/hectare (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 galões por acre) ou mais. O volume de pulverização da composição de pulverização pode variar, por e-xemplo, de a partir de cerca de 9,3539 L (1 galão) a cerca de 935,39 litros por hectare (100 galões por acre), de a partir de cerca de 18,7078 litros (2 galões) a cerca de 374,156 litros por hectare (40 galões por acre) e de a partir de cerca de 18,7078 litros (2 galões) a cerca de 46,7695 litros por hectare (5 galõespor acre) para uma aplicação aerial e de a partir de cerca de 46,7695 litros (5 galões) a cerca de 187,078 litros por hectare (20 galõespor acre) para uma aplicação ao solo.

Em alguns exemplos, uma formulação de concentrado líquido tendo uma fase aquosa em que glífosato está presente predominantemente na forma de um sal e uma fase não aquosa contendo opcionalmente um segundo ingrediente ativo herbicida que é relativamente insolúvel em água pode ser empregada. Tais formulações podem incluir, por exemplo, emulsões (incluindo tipos macroemulsões e microemulsões, água-em-óleo, óleo-em-água e água-em-óleo-em-água), suspensões e suspoemulsões. A fase a-quosa pode compreender em certos casos um componente microencapsula-do (por exemplo, um herbicida microencapsulado). Em formulações tendo uma fase não aquosa, a concentração de glífosato a.e. na composição como um todo pode, não obstante, estar dentro das faixas exemplares particulares mencionadas aqui para formulações de concentrado aquoso.

Formas de sal adequadas de glífosato que podem ser usadas de acordo com qualquer uma das formulações incluem, por exemplo, sais de metal alcalino, por exemplo, sais de sódio e potássio, sais de amônio, sais de diamônio tal como dimetilamônio, sais de alquilamina, por exemplo, sais de dimetilamina e isopropilamina, sais de alcanolamina, por exemplo, sais de etanolamina, sais de alquilsulfônio, por exemplo, sais de trimetilsulfônio, sais de sulfoxônio e misturas ou combinações dos mesmos. Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição: GLYPHOMAX®, GLYPHOMAX® XRT, GLYPHOMAX® PLUS, DURANGO®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAR, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIOACTIVE, ROUNDUP® BIOFOR-CE, RODEO®, POLARIS®, SPARK®, ACCORD® SP, ACCORD® XRT e AC-CORD® CONCENTRATE, todos eles contêm glifosato como seu sal de iso-propilamônio (IPA); ROUNDUP® DRY e RIVAL®, que contêm glifosato como seu sal de amônio; ROUNDUP® GEOFORCE, uma formulação de glifosato de sódio; TOUCHDOWN®, uma formulação de sal de glifosato de trimésio, TOUCH-DOWN® IQ, uma formulação de sal de glifosato de diamônio, TOUCHDOWN® TOTAL IQ, uma formulação de glifosato de potássio e ROUNDUP® WEATHERMAX, uma formulação de glifosato de potássio. Formulações de glifosato podem incluir agentes de segurança, tensoativos e/ou adjuvantes.

Se desejado, o usuário pode misturar um ou mais adjuvantes com uma composição de glifosato e a água de diluição quando preparando uma formulação para aplicação. Tais adjuvantes podem incluir tensoativo e/ou um sal inorgânico adicional (por exemplo, sulfato de amônio) com o objetivo de aumentar mais a eficácia herbicida.

Se desejado, o usuário pode também empregar agentes de segurança apropriados em uma formulação de glifosato para proteger mais plantas e/ou adicionar resistência cruzada a mais herbicidas. Agentes de proteção são agentes químicos que reduzem a fitotoxidez de herbicidas para plantas de cultura através de um mecanismo fisiológico ou molecular, sem comprometer a eficácia de controle de erva-daninha. Agentes de proteção agem tipicamente para aumentar o sistema imune de uma planta através da ativação/expressão de cP450. Agentes de proteção exemplares incluem, por exemplo e sem limitação: benoxacor, cíoquintocete, ciometrinil, diclormida, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, iso- xadifeno, mefenpir, mefenato, anidrido naftálico e oxabetrinil.

Agentes de segurança podem ser usados para a proteção de culturas de forragem de semente grande, por exemplo e sem limitação, milho, sorgo em grão e arroz semeado úmido, contra herbicidas incorporados em pré-planta ou aplicados pré-emergência das famílias tiocarbamato e clo-roacetanilida. Agentes de segurança foram também desenvolvidos para proteger culturas de cereal de inverno tal como trigo contra aplicações pós-emergência de herbicidas de ariloxifenoxipropionato e sulfonilureia. O uso de agentes de proteção para a proteção de milho e arroz contra herbicidas de sulfonilureia, imidazolinona, cicloexanodiona, isoxazol e tricetona é também bem estabelecido.

Ativadores de planta (uma nova classe de compostos que protege plantas através da ativação de seus mecanismos de defesa) podem ser também usados nas presentes modalidades. Ativadores de planta exemplares incluem acibenzolar e probenazol.

As modalidades da presente invenção são ainda definidas nos Exemplos que seguem. Deve ser compreendido que esses Exemplos são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e desses Exemplos, um versado na técnica pode decidir as características essenciais da presente invenção, e sem se afastar do seu espírito e escopo, pode fazer várias mudanças e modificações das modalidades da invenção para adaptá-las para vários usos e condições. Desta maneira, várias modificações das modalidades da invenção, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes àqueles versados na técnica a partir do relatório acima. Tais modificações pretendem também estar dentro do escopo das reivindicações apensas. O que segue é provido a título de ilustração e não pretende limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Materiais e Métodos As modalidades da presente invenção são descritas adicionalmente nos exemplos que seguem, que são oferecidos a título de ilustração e não pretendem limiar a invenção de modo algum.

Uma mutação de aminoácido única (G96A) na enzima 5-enolpi-ruvilchiquimato 3-fosfato sintase (EPSP sintase) de Escheríchia coli pode resultar em insensibilidade a glifosato (Padgette e outros (1991); Eschenburg e outros, (2002); Priestman e outros, (2005); Haghani e outros, (2008)). Embora esta mutação confira tolerância a glifosato, ela é também conhecida afetar de modo adverso a ligação de EPSP sintase com seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP). A mudança resultante em eficiência de ligação de substrato pode tornar uma enzima mutada inadequada para provisão de tolerância a glifosato in planta. O banco de dados NCBI Genbank foi avaliado in silico quanto a sequências de proteína EPSP sintase e polinucleotídeo que contêm naturalmente uma alanina em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase que aquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima (Padgette e outros, (1991); Eschenburg e outros, (2002); Priestman e outros, (2005); Haghani e outros, (2008)).

Uma enzima que foi identificada conter uma alanina natural nesta posição foi DGT-28 (NO. ACC GENBANK: ZP 06917240.1) de Strep-tomyces sviceus ATCC29083. Dados in silico adicionais revelaram três outras enzimas de Streptomyces únicas com homologia maior para DGT-28; DGT-31 (NO. ACC GENBANK: YP_004922608.1); DGT-32 (NO. ACC GENBANK: ZP 04696613); e DGT-33 (NO. ACC GENBANK: NC_010572). Cada uma dessas enzimas contém uma alanina natural em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase àquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima. FIGURA 1.

Devido ao fato das proteínas EPSP sintases de organismos diferentes serem de comprimentos diferentes, a numeração da mutação para a versão de E. coli da enzima EPSP sintase não corresponde necessariamente à numeração da mutação para as enzimas EPSP sintase dos outros organismos. Essas enzimas EPSP sintase identificadas não foram caracterizadas anteriormente com relação à tolerância a glifosato ou afinidade de substrato de PEP. Ainda, essas enzimas EPSP sintase representam uma classe nova de enzimas EPSP sintase e não contêm quaisquer motivos de sequência que tenham sido usados para caracterizar enzimas EPSP sintase Classe I (sequências derivadas de planta descritas adicionalmente na Patente U.S. No. RE39247), II (sequências bacterialmente derivadas descritas adicionalmente na Patente U.S. No. RE39247) e III (sequências bacterialmente derivadas descritas adicionalmente no Pedido de Patente Internacional WO 2006/110586) anterioremente descritas.

As enzimas DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33 novas foram caracterizadas quanto à tolerância a glifosato e afinidade para substrato de PEP através da comparação com enzimas EPSP sintase Classe I. As enzimas Classe I que seguem; DGT-1 de Glycine max, DGT-3 de Brassica na-pus (NO. ACC GENBANK:P 17688) e DGT-7 de Triticum aestivum (NO. ACC GENBANK: EU977181) foram para comparação. As enzimas EPSP sintase Classe I e suas variantes mutantes foram sintetizadas e avaliadas. Uma mutação introduzida nas enzimas EPSP sintase de planta consistia na mutação Glicina para Alanina feita dentro da enzima EPSP sintase em um local similar àquele da mutação G96A da versão de E. coli da enzima. Ainda, mutações Treonina para Isoleucina e Prolina para Serina foram introduzidas nas enzimas EPSP sintase Classe I em posições análogas àquelas de aminoáci-do 97 (T a I) e aminoácido 101 (P a S) na EPSP sintase de E. co// conforme descrito em Funke e outros (2009). A FIGURA 1 mostra um alinhamento de sequência parcial de DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33 com outras enzimas EPSP sintase. Todas as quatro enzimas DGT compartilham uma alanina conservada na posição de aminoácido 96 da enzima EPSP sintase aroA. A localização deste aminoácido é indicada por um asterisco e o resíduo de aminoácido é sublinhado. A FIGURA 2 mostra um alinhamento das enzimas DGT-1, DGT-3 e DGT-7. A localização do resíduo de aminoácido que foi mutado de glicina para alanina é indicada pelo primeiro asterisco. A localização do resíduo de aminoácido que foi mutado de treonina para isoleucina é indicada pelo segundo asterisco. A localização do terceiro resíduo de aminoácido que foi mutado de prolina para serina é indicada pelo terceiro asterisco. Essas mu- tações foram introduzidas em versões diferentes de DGT-1, DGT-3 e DGT-7. As versões diferentes (v1, v2, v3...vN) dos genes que contêm as mutações são descritas em mais detalhes abaixo.

Exemplo 2: Otimização de Sequência para Expressão em Plantas e Bactérias Otimização de Planta. Tendência de códon para dicotiledôneas e monocotiledôneas (milho) foi calculada como a frequência na qual um códon único é usado com relação aos códons para todos os aminoácidos. Tabela 1. Alternativamente, a tendência de códon pode ser calculada como a frequência na qual um códon único é usado para codificar um aminoácido particular, com relação a todos os outros códons para este aminoácido (códons sinônimos). No projeto das regiões de codificação para expressão de planta, os códons primários ("primeira escolha") preferidos pela planta foram determinados, bem como as segunda, terceira, quarta, etc., escolhas de códons preferidos quando escolhas múltiplas existiam.

Análise da sequência de codificação de DGT-28 de S. sviceus revelou a presença de vários motivos de sequência que eram acreditados ser prejudiciais para expressão de planta ótima, bem como uma composição de códon não ótima para expressão em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Tabela 1. Representações de códon sinônimo das regiões de codificação de genes de plantas monocotiledôneas (% milho) e dicotiledôneas (% dicot) são mostradas nas Coluna D, E, I e J. Valores para um conjunto de representação de códon equilibrada-de tendência para um projeto de gene sintético otimizado para planta estão nas Colunas C e H.

Para engenheirar os genes otimizados em planta codificando uma proteína DGT-28, sequências de DNA foram projetadas para codificar as sequências de amínoácido utilizando um código genético redundante estabelecido a partir da tabela de tendência de códon compilada das sequências de codificação de proteína para as plantas hospedeiro particulares. Na Tabela 1, as Colunas D e I apresentam as distribuições (em % de uso para todos os códons para este aminoácído) de códons sinônimos para cada a-minoácido, conforme encontrado nas regiões de codificação de plantas mo-nocotiledôneas (milho). As Colunas e E J apresentam as distribuições (em % de uso para todos os códons para este aminoácído) de códons sinônimos para cada aminoácído, conforme encontrado nas regiões de codificação de plantas dicotiledôneas. Alguns códons sinônimos para alguns aminoácidos são encontrados apenas raramente em genes de planta (por exemplo, CGG). Geralmente, um códon era considerado ser raramente usado se ele for representado em cerca de 10% ou menos do tempo para codificar o ami-noácido relevante em genes de qualquer tipo de planta (indicado por DNU nas Colunas C e H da Tabela 1). Para equilibrar a distribuição das escolhas de códon restantes para um aminoácído, uma representação Ponderada Média para cada códon foi calculada usando a fórmula: % Média Ponderada de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100, (1) em que C1 é o códon em questão e %C2, %C3, etc., representam a média dos valores % para dicotiledôneas de códons sinônimos restantes (valores % médios para os códons relevantes são obtidos das Colunas C e H) da Tabela 1. O valor % Ponderai Médio para cada códon é dado nas Colunas C e H da Tabela 1.

Usando o procedimento acima, uma nova sequência de DNA que codifica essencialmente a sequência de aminoácído da proteína DGT-28 foi projetada para expressão ótima em plantas dicotiledôneas, usando uma distribuição de códon equilibrada de códons frequentemente usados encontrados em genes de planta dicotiledônea. Uma segunda sequência de DNA que codifica essencialmente a sequência de aminoácído da proteína DGT-28 foi projetada par expressão ótima em plantas monocotiiedôneas usando uma distribuição de códon equilibrada de códons frequentemente usados encontrados em genes de planta monocotiledônea. As duas novas sequências de DNA diferiram das sequências de DNA originais codificando dgt-28 pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido) para especificar o aminoácido apropriado em cada posição dentro da sequência de aminoácido da proteína.

Projeto das sequências de DNA otimizadas de planta foi iniciado pela tradução reversa das sequências de proteína da sequência de proteína DGT-28 (No. Acesso Genbank: ZP_06917240.1). A SEQ ID NO:1 sofreu tradução reversa usando uma tabela de tendência de códon de dicotiledônea construída a partir da Tabela 1; Colunas E e J. Uma segunda tradução reversa de SEQ ID NO:1 foi completada usando uma tabela de tendência de códon de monocotiledônea construída a partir da Tabela 1; Colunas Del.

As sequências de tradução reversa iniciais foram então modificadas pelas mudanças de códon de compensação (enquanto retendo a representação de códon ponderada média geral) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzima de restrição, remover estruturas secundárias intrafilamento altamente adequadas e remover outras sequências que poderíam ser prejudiciais para manipulações de clonagem ou superexpres-são do gene engenheirado em plantas. A sequência de DNA foi então novamente analisada quanto a sítios de reconhecimento de enzima de restrição que poderíam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados foram modificados mais através da substituição dos códons relevantes com primeiros, segundos, terceiros ou quartos códons preferidos de escolha. Outros sítios nas sequências que poderíam afetar transcrição ou tradução do gene de interesse incluem as junções exon:íntron (5’ ou 3'), sinais de adição de poli A e sinais de terminação de RNA polimerase. As sequências modificadas foram analisadas adicionalmente e modificadas adicionalmente para reduzir a frequência de dupletos TA ou CG e aumentar a frequência de du-pletos TG ou CT. Em adição a esses dupletos, blocos de sequência que têm mais do que seis resíduos consecutivos de [G+C] ou [A+T] podem afetar transcrição ou tradução da sequência. Desta maneira, esses blocos de sequência foram também modificados através da substituição dos códons da primeira ou segunda escolha, etc, com outros códons preferidos de escolha. Códons raramente usados não foram incluídos a um grau substancial no projeto do gene, sendo usados apenas quanto necessário para acomodar um critério de projeto diferente da composição do códon, per se (por exemplo, adição ou deleção de sítios de reconhecimento de enzima de restrição). A sequência de polinucleotídeo dgt-28 v5 otimizada em planta dicotiledônea, recém-projetada, é listada na SEQ ID NO:2. A sequência de polinucleotídeo dgt-28 v6 otimizada em planta dicotiledônea, recém-projetada, é listada na SEQ ID NO:3, esta sequência foi ligeiramente modificada incluindo uma alanina na segunda posição do aminoácido para introduzir um sítio de enzima de restrição. As sequências de DNA resultantes têm um grau maior de diversidade de códon, uma composição de base desejável, contém sítios de reconhecimento de enzima de restrição estrategicamente posicionados, e não têm sequências que pudessem interferir com transcrição do gene ou tradução do mRNA de produto. Síntese de fragmentos de DNA compreendendo SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3 contendo sequências adicionais, tais como paradas de 6 estruturas (códons de parada localizados em todas as seis estruturas de leitura que são adicionados à extremidade 3’ da sequência de codificação) e um sítio de restrição 5’ para clonagem foi realizada por fornecedores comerciais (DNA2.0, Menlo Park, CA). A molécula de ácido nucleico sintética foi então clonada em vetores de expressão e transformadas em plantas ou bactérias conforme descrito nos Exemplos abaixo.

Estratégias de otimização de códon similares foram usadas para projetar dgt-1, dgt-3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I; P178S), dgt-7 v4 (T168I; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3 e dgt-33 v3. A versão com códon otimizado desses genes é listada como SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 e SEQ ID NO:144, respectivamente.

Otimização bacteriana. Uma nova sequência de DNA que codifi- ca a proteína DGT-28 de SEQ ID NO:1 que é otimizada para expressão em células de Escherichia coli foi projetada. Projeto da sequência de DNA otimizada de E. coli foi iniciado através de tradução reversa da sequência de proteína de SEQ ID NO:1 usando um protocolo de otimização de códon da proprietária da GeneArt (Regensburg, Alemanha). A sequência inicial foi modificada através de mudanças de códon de compensação (enquanto retendo representação ponderada média total) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzima de restrição e remover estruturas intrafilamento secundárias altamente estáveis e outras sequências que poderíam ser prejudiciais para manipulações de clonagem ou expressão do gene engenhei-rado. Um exemplo de tal sequência prejudicial para evitar dentro de uma região de codificação é uma sequência de ligação a RNA ribossomal 16S ("Sequência Shine-Dalgarno") tal como AGGAGG, que poderia codificar, por exemplo, dois aminoácidos de arginina consecutivos, mas que poderia também servir como um sinal de iniciação de tradução intragênico (e então indesejável). A sequência de DNA de dgt-28 de tendência em E. coli (dgt-28 v1) que codifica a proteína de SEQ ID NO:1 é dada como SEQ ID NO:4.

Para facilitar clonagem e assegurar inicio de tradução eficiente, uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição Ndei terminal 5’ foi posta a montante do códon de início de tradução ATG. Também para facilitar clonagem, e assegurar terminação de tradução apropriada, bases codificando dois códons de parada de tradução TAA e um sítio de reconhecimento de enzima de restrição Xhol foram incluídos na extremidade 3’ da região de codificação. Síntese de um fragmento de DNA compreendendo SEQ ID NO:4 foi realizada pelo fornecedor comercial, GeneArt®.

Estratégias de otimização de códon de E. coli similares foram usadas para projetar dgt-1 v5, dgt-1 v6 (G112A), dgt-1 v7 (G112A; P117S), dgt-1 v8 (T1131; P117S), dgt-3 v6 (G105A), dgt-3 v7 (G105A; P112S), dgt-3 v8 (T106I; P112S), dgt-7 v5, dgt-7 v6 (G113A), dgt-7 v7 (G113A; P117S), dgt-7 v8 (T1141; P117S), dgt-32 v5 e dgt-33 v5. As versões de sequência de dgt-1, dgt-3 e dgt-7 foram modificadas através da remoção da sequência de direcionamento a cloroplasto. A versão otimizada no códon de E. coli desses gentes é listada como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente.

Exemplo 3: Vetores para Expressão Bacteriana de Genes de Tolerância a Glifosato Construção de Vetor de Expressão pET, dqt-28 para Expressão emE coli. Para teste in vitro, a sequência de gene otimizada em E. coli dgt-28 (SEQ ID NO:4) foi sintetizada e clonada pela GeneArt® para síntese e clonagem. A sequência de gene dgt-28 v1 sintetizada foi clonada no vetor de expressão pET28 através de sítios de restrição Nde I e Xho I adicionados. A construção resultante introduziu um marcador His 6X N-terminal e foi marcada como pDAB100445. FIGURA 14.

Mutagênese Direcionada a Sítio de dgt-28 v1. Mutagênese direcionada a sítio foi realizada em dgt-28 v1 para avaliar o papel da alanina na posição 84 na provisão de tolerância a glifosato. Esta alanina natural foi mu-tada para glicina para determinar se a mudança podería diminuir a tolerância da enzima a glifosato ou afinidade para PEP. Este resíduo de aminoácido foi selecionado, uma vez que ele correspondia à mutação G96A que foi introduzida na EPSP sintase de E. coli conforme anteriormente descrito. O estojo Quick Change II® da Stratagene® (Santa Clara, CA) foi usado para realizar a mutagênese. Reações de PCR foram ajustadas de acordo com o protocolo QuickChange® usando pDAB100445 (dgt-28 v1) como DNA molde. O construto contendo a sequência de gene dgt-28 v2 mu-tada foi chamado pDAB102946 (FIGURA 15) e confirmado através de se-quenciamento de DNA. Os iniciadores que seguem foram projetados para fazer a mudança de aminoácido: DGT28 MutF (SEQ ID NO:25; 5’ gATgTTTATTgCCgTgATggTggAACCACCgCACgTTTTC) DGT28 MutR (SEQ ID NO:26; 5’ gAAAACgTgCggTggTTCCACCATCACggCAATAAACATC) Uma segunda rodada de mutagênese foi realizada em dgt-28 v2 em uma tentativa em diminuir mais sua tolerância a glifosato. Uma segunda mutação, T172A, foi introduzida no dgt-28 v2 já mutagenizado. A mutação alanina para treonina recíproca de EPSP sintase nesta posição foi previamente descrita em Haghani e outros (2008), em que ela resultou em insensibilidade a glifosato. O resultado final foi a produção de um mutante A84G, T172A duplo que foi chamado dgt-28 v3. Reações de PCR foram ajustadas de acordo com o protocolo QuickChange® usando pDAB102946 (dgt-28 v2) como DNA molde. O construto contendo a sequência de gene de dgt-28 v3 mutada foi chamado pDAB100469 (FIGURA 16). Os iniciadores que seguem foram usados para produzir a mutação T172A: DGT28 Mut2F (SEQ ID NO:27; 5’ gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg) DGT28 Mut2R (SEQ ID NO:28; 5’ CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAgCAgC) Construções adicionais. Vetor de Expressão pET para Expressão em E. coli. Para teste in vitro, as sequências de gene dgt-1 v5, dgt-1 v6, dgt-1 v7, dgt-1 v8, dgt-3 v6, dgt-3 v7 dgt-3 v8, dgt-7 v5, dgt-7 v6, dgt-7 v7, dgt-7 v8, dgt-32 v5 e dgt-33 v5 foram sintetizadas e clonadas (GeneArt®). Os genes sintetizados foram clonados no vetor de expressão pET28. As construções resultantes foram marcadas como pDAB102028 (FIG. 17) contendo dgt-1 v5, pDAB102029 (FIG. 18) contendo dgt-1 v6, pDAB102032 (FIG. 19) contendo dgt-1 v7, pDAB102034 (FIG. 20) contendo dgt-1 v8, pDAB100429 (FIG. 21) contendo dgt-3 v6, pDAB100442 (FIG. 22) contendo dgt-3 v7, pDAB100430 (FIG. 23) contendo dgt-3 v8, pDAB102036 (FIG. 24) contendo dgt-7 v5, pDAB102038 (FIG. 25) contendo dgt-7 v6, pDAB102040 (FIG. 26) contendo dgt-7 v7 e pDAB102042 (FIG. 27) contendo dgt-7 v8.

Clonagem de DGT-32 e DGT-33. Para teste in vitro, os genes o-timizados em planta que seguem, dgt-32 v3 e dgt-33 v2, foram amplificados dos vetores binários pDAB107532 (FIG. 11) e pDAB107534 (FIG. 12), respectivamente. Os conjuntos de iniciador que seguem foram usados: pMALDGT32F (SEQ ID NO:29; CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG) e pMALDGT32R (SEQ ID NO:30; GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG) para dgt-32, e pMALDGT33F (SEQ ID NO:31; CATATGGGTGCAGTTACCGTTATTGA), pMALDGT33R(SEQ ID NO:32; GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC) para dgt-33.

Sequências amplificadas foram então subclonadas em pMAL-c5X de maneira que cada gene era uma fusão em estrutura com uma sequência de codificação malE. Os construtos de expressão finais foram pDAB107713 (FIG. 29) contendo dgt-32 v3 e pDAB107714 (FIG. 30) contendo dgt-33 v3.

Exemplo 4: Ensaio Cinético Enzimático Bioquímico In vitro Superexpressão e Purificação de Enzimas DGT Recombinantes. Proteínas DGT recombinantes foram superexpressas em células Rosetta2® (DE3) (Novagen®, Madison, Wl) dos construtos descritos acima. Uma colônia única foi usada para inocular 50 mL de culturas de inicialização de LB contendo cloranfenicol (25 pg/mL) e canamicina (50 pg/mL) que foram cultivadas da noite para o dia a 37°C. As culturas da noite para o dia foram usadas para inocular 1L de LB contendo cloranfenicol (25 pg/mL) e canamicina (50 pg/mL). As culturas foram cultivadas a 37°C para um O.D.600 - 0,6, então postas em um banho de água gelada por 10 minutos. Expressão das proteínas-alvo foi obtida através da adição de IPTG para uma concentração final de 500 pM.

Indução foi deixada prosseguir da noite para o dia a 20°C seguido por coleta através de centrifugação a 8.000 rpm por 20 minutos. Os péle-tes de célula foram armazenados a -80°C até requeridos para purificação. Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4°C. Péletes de célula de culturas de 1 L foram ressuspensos em 20-30 mL de Tampão A (HEPES 50 mM pH 7,5, KCI 150 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, imidazol 20 mM e glicerol 5%). Coquetel inibidor de protease COMPLETE® (1 comprimido/50 mL, Ro-che, Indianápolis, IN) e lisozima (1 mg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram então adicionados e a suspensão foi agitada por 20 minutos. Lise de célula foi realizada usando um Branson® Sonifier®250 (explosões de 3 x 60 segundos) seguido por remoção dos restos de célula através de centrifuga-ção a 16.000 rpm por 45 minutos.

Enzimas DGT foram purificadas até a homogeneidade em uma etapa através de cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC) usando uma coluna bruta HisTrap FF de 5 mL. A coluna foi equilibrada em Tampão A e a amostra foi carregada no mesmo tampão. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de Tampão A seguido por eluição em um gradiente linear de Tampão B 0-100% (HEPES 50 mM pH 7,5, KCI 200 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, imidazol 500 mM e glicerol 5%) em volumes de 25 colunas. Frações contendo proteína-alvo, conforme julgado através de análise SDS-PAGE, foram concentradas para 2,5 mL usando um dispositivo de ultracentrifugação Millipore equipado com um peso molecular corte de de 10 kDa (MWCO) (Molecular weight cut-off). As enzimas DGT purificadas foram trocadas com tampão usando colunas PD-10 (GE Healthcare) em HEPES 50 mM pH 7,5, KCI 150 mM, DTT 2 mM e glicerol 5% e subsequentemente concentradas ~1 mL. As amostras foram tipicamente diluídas 1:50 e o espectro UV-visível foi registrado a partir de 240-700 nm em um espectrofotômetro UV-visível Cary50® Bio. Um coeficiente de extinção teórico foi então usado para calcular a concentração de proteína com base na absorbância a 280 nm (ExPASy, Geneva, Suíça).

Expressão e Purificação de Fusões de DGT-32 e DGT-33 Re-combinantes. As enzimas DGT-32 e DGT-33 foram construídas para conter um marcador de fusão de maltose localizado no terminal amino da enzima. Células de Escherichia coli transformadas com pDAB107712 (Figura 28), pDAB107713 e pDAB107714 foram isoladas e confirmadas. Uma colônia única de cada linhagem bacteriana foi usada para inocular 50 mL de meio LB contendo 100 pg/mL de carbenicilina e 25 pg/pL de cloranfenicol. A cultura de início foi cultivada da noite para o dia a 37°C e subsequentemente u-sada para inocular 600 mL de meio LB suplementado com glicose 0,2%, 100 pg/pL de carbenicilina e 25 pg/pL de cloranfenicol. As culturas foram cultiva- das a 37°C para um OD6oo = 0,4 momento quando IPTG foi adicionado para uma concentração final de 50 μΜ de ITPG. As culturas foram induzidas por 15 horas a 18°C. No dia seguinte as culturas foram coletadas através de centrifugação a 8.000 rpm por 20 minutos para peletizar as células. A pasta de célula foi armazenada a -80°C até requerida para purificação. Péletes congelados foram ressuspensos em 20-30 mL de tampão A (HEPES 50 mM pH 7,5, KCI 100 mM, EDTA 1 mM, glicerol 5% e DTT 1 mM) e 1 comprimido de inibidor de protease (Roche Complete). Uma vez o pélete tendo sido completamente ressolubilizado, 1 mg/mL de lisozima foi adicionado e a amostra foi misturada a 4°C por 15-20 minutos. Seguindo a incubação com a lisozima, a amostra foi transferida para um tubo de centrífuga de 50 mL e posta em gelo. A amostra foi então sonificada por intervalos de 1 minuto seguido por 4 minutos de esfriamento. Esta etapa foi repetida mais duas vezes por um total de três ciclos de sonificação. Os restos de célula foram removidos através de centrifugação a 16.500 rpm por 45 minutos e o sobrenadante foi carregado em uma alça de injeção de 50 mL. O lisato bruto foi aplicado a uma coluna de amilose, lavado por 7 volumes de coluna com tampão A e eluído em tampão B 100% (Tampão A e maltose 10 mM). A proteína-alvo foi agrupada e concentrada para 2,5 mL usando um centricon MWCO 30 kDa. A proteína purificada teve tampão trocado em HEPES 50 mM pH 7,5, KCI 100 mM e glicerol 5% usando uma coluna de filtragem em gel PD-10. As concentrações de proteína foram determinadas através de ensaio Bradford usando BSA como um padrão. A proteína pura foi congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -80°C.

Caracterização Cinética In vitro de Enzimas DGT de Planta e Bacterianas. As atividades de enzima de DGTs do tipo selvagem (WT) e mu-tantes foram medidas através de produção de fosfato inorgânico (Pj) em um procedimento modificado descrito por Lanzettaa e outros (1979) Anal. Bioch. 100:95-7. Os ensaios foram realizados em formato de placa de 96 cavidades em um total de 50 pL em uma leitora de placa Spectra-Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Ensaios típicos continham HEPES 50 mM pH 7,5, KCI 150 mM, DTT 2 mM e S3P 1 mM. As concentrações de PEP e glifosato foram variadas conforme indicado. Glifosato foi obtido da Sigma como o ácido livre e foi ressuspenso em ddH20. Glifosato foi solubilizado através da adição de KOH até que a mistura estivesse em um pH neutro. Os ensaios foram iniciados através da adição da enzima EGT em concentrações que variaram entre 0,01-1 μΜ. As reações foram terminadas através da adição de 235 μΙ_ de uma mistura 3:1 de solução de verde malaquita:molibdato de amônio. Depois de desenvolvimento de cor completo (~1 minuto), a mudança de absorbância a 660 nm foi registrada e a quantidade de Pi formado foi calculada a partir de uma curva padrão. Reações controle sem enzima foram realizadas para corrigir absorbância de base. Concentrações altas de PEP (> 2 mM) e glifosato (> 30 mM) contribuem uma quantidade significante de absorbância de base usando este método de detecção. Os dados foram a-justados à equação Michaelis-Menten que permitiu a determinação de Km e Vmax (Equação 3) enquanto IC50 foi determinada a partir da Equação 4, em que y é a atividade relativa e s é o coeficiente Hill. Os dados foram analisados usando software GraFit® versão 5 (Erithacus Software Limited, Horley, U.K.). O valor de IC50 para um inibidor competitivo vai mudar dependendo da concentração de substrato, desta maneira os valores de IC50 na Tabela 2 foram obtidos em PEP 1 mM e em PEP 60 μΜ (uma estimativa das concentrações de PEP intracelulares em plantas). Apenas valores IC50 medidos na mesma concentração de PEP devem ser comparados (determinações de Km para DGT-32 e DGT-33 foram feitas em PEP 100 pM). Ainda, valores de IC50 de enzimas altamente tolerantes não puderam ser precisamente determinados através do método de Lanzetta e foram então estimados com base em atividade relativa.

Cinética de DGTs de planta. Duas enzimas com sequências nativas não mutadas, DGT-1 v5 e DGT-7 v5, foram testadas primeiro para es- tabelecer parâmetros de linha de base para sensibilidade a glifosato. Ambas as proteínas mostraram valores Km para PEP (~70 μΜ) e foram sensíveis a glifosato com valores IC50 de ~20 μΜ (Tabela 2) e PEP 1 mM. Conforme observado para DGT-1 v6, DGT-3 v56 e DGT-7 v6, uma mutação por ponto única de G para A melhorou significantemente a tolerância a glifosato (valores de IC5o de 8-21 mM), mas também aumentou a Km para PEP em ~8 vezes. A mutação dupla (GAPS), para todas as DGTs derivadas de planta (DGT-1 v7, DGT-3 v7 e DGT-7 v7), também aumentou a tolerância a glifosato, mas mais uma vez resultou em uma elevação considerável em Km PEP. Tabela 2. Os mutantes de TIPS (DGT-1 v8, DGT-3 v8 e DGT-7 v8) foram tolerantes a concentrações modestas de glifosato (3-6 mM), mas em contraste com os mutantes de GA e GAPS, os níveis de Km permaneceram próximos das proteínas do tipo selvagem entre 60-200 pM. A FIGURA 31 demonstra as mudanças em tolerância a glifosato para DGT-1 (A) e DGT-7 (B) quando da introdução das mutações especificadas. As concentrações de PEP foram mantidas a 1 mM para os experimentos resultando nos dados mostrados na FIGURA 31, que provavelmente levou à IC50 elevada (> 80 mM) para DGT-7 v8. Procedimentos adicionais foram realizados para determinar se níveis menores de PEP alteraram a tolerância relativa a glifosato. Níveis fisiologicamente relevantes de PEP variam de 5-60 pM. Com PEP 60 pM, o valor de IC50 diminuiu significantemente (3,6 mM), sugerindo que a determinação inicial foi influenciada por PEP em excesso, conforme esperado de cinética Michaelis-Menten e registrado na Tabela 2. A FIGURA 31 mostra valores de IC50 obtidos após introdução de várias mutações em DGT-1 (A) e DGT-7 (B) usando PEP 1 mM. Para ambas as curvas de IC50 A e B triângulos fechados representam tipo selvagem, círculos fechados representam mutantes de GA, quadrados abertos representam mutantes de GAPS e quadrados fechados representam mutantes de TIPS.

Tabela 2. Parâmetros cinéticos de estado uniforme para enzimas DGT. Valores de IC50 maiores do que 50 são estimativas devido a limitações do método usado. *IC5o para glifosato foi determinada em PEP 100 pM.

Cinética de DGTs Bacterianas. Das enzimas bacterianas, DGT-28 v1 possui os parâmetros farmacocinéticos gerais mais favoráveis (valores de IC50 kca/Km elevados). A enzima era tolerante a glifosato em concentrações >80 mM e mostrou uma eficiência catalítica de 1,32 x 105 M'1 s"1. A mutação A^G em DGT-28 v2 diminuiu a IC50 para 2,17 mM (em PEP 60 pM) e causou uma ligeira elevação em Km para PEP (161 μΜ). Esta enzima mutante retém a eficiência catalítica alta vista em DGT-28 v1. Mesmo com uma IC50 menor, esta enzima mutada é adequada para provisão de tolerância a glifosato in planta em certas aplicações. Os dados sugerem que nesta nova classe de EPSP sintase, a alanina não é o único determinante para tolerância a glifosato. Para explorar outros determinantes possíveis, uma variante adicional, DGT-28 v3 (mutante duplo A84G T172A), foi construída. Esta enzima exibiu tolerância menor a glifosato com um valor de IC50 de 5,15 mM (em PEP 60 pM). A diminuição em IC50 para DGT-28 v3 foi acompanhada por uma diminuição de 200 vezes em eficiência catalítica, sugerindo que a segunda mutação levou a efeitos não intencionais (Tabela 2). Os homólogos de DGT-28 v1 de identidade maior (identidade de aminoácido -75%), DGT-32 e DGT-33, tinham Km's baixos para PEP (-114 — 139 pM), no entanto, eficiências catalíticas foram 100 vezes menores do que DGT-28 v1. Esta queda em eficiência catalítica é provavelmente derivada da fusão da proteína de ligação de maltose (MBP). As enzimas são também insensíveis a glifosato mostrando valores IC50 maiores do que 50 mM. Como resultado desses ensaios in vitro, que indicou que as várias enzimas DGT proveram tolerância a glifosato, as enzimas DGT foram testadas in planta.

Exemplo 5: Clonagem de Vetores de Transformação de Planta Construção de Vetor Binário de Planta. Métodos de clonagem padrão foram usados na construção de vetores de entrada contendo uma sequência de polinucleotídeo de peptídeo de trânsito de cloroplasto unida a dgt-28 como uma fusão em estrutura. Os vetores de entrada contendo um peptídeo de trânsito (TraP) fundido a dgt-28 foram montados usando a IN-FUSION® Advantage Technology (Clontech, Mountain View, CA). Como um resultado da fusão, o primeiro aminoácido, metionina, foi removido de dgt- 28. Peptídeos de trânsito TraP4 v2 (SEQ ID NO:33), TraP5 v2 (SEQ ID NO:34), TraP8 v2 (SEQ ID NO:35), TraP9 v2 (SEQ ID NO:36), TraP12 v2 (SEQ ID NO:37) e TraP13 v2 (SEQ ID NO:38) foram, cada um, sintetizados através de DNA2.0 (Menlo Park, CA) e fundidos ao fragmento da extremidade 5’ de dgt-28, até e incluindo um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição Accl único.

Plasmídeos binários que continham os vários cassetes de expressão de TraP e dgt-28 foram direcionados pelo promotor de Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AbUbilO v2; Callis e outros (1990) J. Biol. Chem., 265; 12486-12493) e flanqueados pela região não traduzida vinte e três 3’ de estrutura de leitura aberta de Agrobacterium thumefaciens (AtuORF23 3’ UTR v1\ U.S. Pat. No. 5.428.147).

Os cassetes de expressão de TraP e dgt-28 mostrados foram engenheirados usando GATEWAY® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em plantas através de transformação de planta mediada por Agrobacterium. Endonucleases de restrição foram obtidas da New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) e a Ligase de DNA T4 (Invitrogen) foi usada para ligação de DNA. Reações Gateway foram realizadas usando mistura de enzima GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) para montagem de um vetor de entrada em um vetor de destino único que continha o promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca do cassete marcador selecionável (CsVMV v2\ Verdaguer e outros., (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139) — DSM-2 (Pedido Pat. U.S. No. 2007/086813) - "Agrobacterium tumefaciens open reading frame one 3’ untranslated region" (AtuORFI 3’ UTR v6; Huang e outros, (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822). Preparações de plasmídeo foram realizadas usando NUCLEOSPIN® Plasmid Kit (Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, PA) ou o Plasmid Midi Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Fragmentos de DNA foram isolados usando QIAquick® Gel Ex-traction Kit (Qiagen) após eletroforese em gel de agarose Tris-acetato.

Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente avaliadas através de digestão por restrição de DNA miniprep. DNA de plasmídeo de clones selecionados foi sequenciado por um fornecedor de se- quenciamento comercial (Eurofins® MWG Operon, Huntsville, AL). Dados de sequência foram montados e analisados usando o software SEQUENCHER® (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Ml).

Os construtos binários que seguem expressam as várias sequências de gene de fusão TraP:dgt-28: pDAB107527 (FIG. 3) contém TraP4 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:79); pDAB105530 (FIG. 4) contém TraP5 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:80); pDAB105531 (FIG. 5) contém TraP8 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:81); PDAB105532 (FIG. 6) contém TraP9 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:82); pDAB105533 (FIG. 7) contém TraP12 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:83); e pDAB105534 (FIG. 8) contém TraP13 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:84). A sequência dgt-28 v5 de pDAB105534 foi modificada em que o primeiro códon (GCA) foi mudado para (GCT).

Construção de Vetor Binário de Planta Adicional. Estratégias de clonagem similares àquelas descritas acima foram usadas para construir plasmídeos binários que continham dgt-31, dgt-32, dgt-33, dgt-Λ, dgt-3 e dgt-7.

Os genes microbialmente derivados, dgt-31, dgt-32 e dgt-33, foram fundidos com peptídeos de trânsito de cloroplasto diferentes daqueles descritos anteriormente. Os peptídeos de trânsito de cloroplasto que seguem foram usados: TraP14 v2 (SEQ ID NO:39), TraP23 v2 (SEQ ID NO:40), TraP24 v2 (SEQ ID NO:41). pDAB107532 (FIG. 11) contém dgt-32 v3 fundido a TraP14 v2 (SEQ ID NO:42), pDAB107534 (FIG. 12) contém dgt-33 v3 fundido a TraP24 v2 (SEQ ID NO:43) e pDAB1017533 (FIG. 54) contém dgt-33 v1 fundido a TraP23 v2 (SEQ ID NO:143). Os cassetes de expressão de dgt foram dirigidos pelo promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbilO v2) e flanqueados pela região não traduzida vinte e três 3’ de estrutura de leitura aberta de Agrobacterium thmefaciens (AtuORF23 3’ UTR v1). Um cassete marcador selecionável DSM-2 contendo promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV v2) - DSM-2 — região não traduzida um 3’ de estrutura de leitura aberta de Agrobacterium tumefa-ciens (AtuORFI 3’ UTR v6) estava também presente no vetor binário.

Binários adicionais são construídos em que dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33 v2 são fundidos às sequências de peptídeo de trânsito de cloroplas-to anteriormente descritas. Por exemplo, a sequência TraP8 v2 é fundida a dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33 v3 e clonada em vetores binários conforme acima descrito.

Vetores binários contendo os genes Classe I (dgt-1, dgt-3 e dgt-7) foram construídos. Os vetores binários que seguem foram construídos e transformados em plantas: pDAB4104 (FIG. 9), que contém a sequência de dgt-1 v4 conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011/0124503, que é flanqueada pelas sequências de Osmotina de Nicotia-na tabacum conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2009/0064376; pDAB102715 (FIG. 10); pDAB102716 (FIG. 45); pDAB102717 (FIG. 46); epDABI02785 (FIG. 13). Os vários peptídeos de trânsito de cloro-plasto TraP que foram fundidos a dgt-28, dgt-31, dgt-32 e dgt-33 não foram adicionados aos genes Classe I, uma vez que essas sequências derivadas de planta possuem peptídeos de trânsito de cloroplasto de planta nativos. Esses vetores são descritos em mais detalhes na Tabela 3.

Tabela 3. Descrição dos vetores binários que contêm um gene de EPSP sintase Classe I (isto é, dgt-1, dgt-3 ou dgt-7) Exemplo 6: Transformação em Arabidopsis e Seleção Transformação de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis foi transformada usando o método de banho floral de Clough e Bent (1998). Uma colônia de Agrobacterium selecionada contendo um dos plasmídeos binários descritos acima foi usada para inocular uma ou mais pré-culturas de 100 mL de caldo de YEP contendo espectinomicina (100 mg/L) e canamicina (50 mg/L). A cultura foi incubada da noite para o dia a 28°C com agitação constante a 225 rpm. As células foram peletizadas em aproximadamente 5000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante resultante descartado. O pélete de célula foi suavemente suspenso em 400 mL de meio de submersão contendo: 5% (p/v) de sacarose, 10 pg/L de 6-benzilaminopurina e 0,04% de Silwet® L-77. Plantas de aproximadamente 1 mês de vida foram mergulhadas no meio por 5-10 minutos com agitação suave. As plantas foram postas de lado e cobertas com bolsas plásticas transparentes ou opacas por 2-3 horas e então postas de pé. As plantas foram cultivadas a 22°C, com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. Aproximadamente 4 semanas depois do banho, as sementes foram colhidas.

Seleção de Plantas Transformadas. Semente Ti recém-colhida [contendo os cassetes de expressão de dgt e DSM-2] foi deixada secar por 7 dias em temperatura ambiente. Semente Ti foi semeada em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm, cada uma recebendo uma alíquota de 200 mg de semente Τ·\ estratificada (-10.000 sementes) que tinha sido anteriormente suspensa em 40 mL de solução de agarose 0,1% e armazenada a 4°C por 2 dias para completar necessidades de dormência e assegurar germinação de semente síncrona.

Sunshine Mix LP5 foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então deixada drenar pela gravidade. Cada alíquota de 40 mL de semente estratificada foi semeada uniformemente sobre a vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de u-midade por 4-5 dias. As cúpulas foram removidas 1 dia antes da seleção de transformante inicial usando pulverização pós-emergência com glufosinato (seleção do gene DSM-2 co-transformado).

Sete dias após o plantio (DAP) (Days After Planting) e novamente 11 DAP, plantas T1 (cotilédon e estágio 2-4 fl, respectivamente) foram pulverizadas com uma solução 0,2% de herbicida Liberty (200 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de pulverização de 10 mL/bandeja (703 L/ha) usando uma ponteira de pulverização a ar comprimido DeVilbiss para aplicar uma taxa eficaz de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicação. Sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram i-dentificadas 4-7 dias após a pulverização final e transplantadas individualmente em potes de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de plantio em pote (Metro Mix 360). As plantas transplantadas foram cultivadas na estufa (22±5°C, 50±30°C RH, 14 h luz:10 escuro, luz natural + suplementar mínima 500 pE/m2s1). Análise de confirmação molecular foi completada e as plantas Ti sobreviventes confirmaram que o gene de tolerância a glifosato tinha integrado estavelmente no genoma das plantas.

Confirmação molecular. A presença do transgenes dgt-28 e DSM-2 dentro do genoma das plantas de Arabidopsis que foram transformadas com pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533 ou pDAB105534 foi confirmada. A presença dessas sequências de polinu-cleotídeo foi confirmada através de ensaios de sonda de hidrólise, PCR de cassete de expressão de gene (também descrita como PCR de unidade de transcrição de planta — PTU PCR), análise Southern blot e análises de PCR de Transcrição Reversa Quantitativa.

As plantas de Arabidopsis Ti foram inicialmente avaliadas através de um ensaio de sonda de hidrólise, análogo a TAQMAN®, para confirmar a presença dos transgenes DSM-2 e dgt-28. Os eventos foram avaliados através de PCR de cassete de expressão de gene para determinar se o cassete de expressão de dgt integrou completamente aos genomas de planta sem rearranjo. Os dados gerados a partir desses estudos foram usados para determinar o número de cópia de transgene e identificar eventos de Arabidopsis selecionados para autofertilização e avanço para a geração T2. As plantas de Arabidopsis T2 avançadas foram também avaliadas através de ensaios de sonda de hidrólise para confirmar a presença e estimar o número de cópia de genes DSM-2 e dgt dentro do cromossomo da planta. Finalmente, um ensaio Southern blot foi usado para confirmar o número de cópia estimado em um subconjunto das plantas de Arabidopsis T-|.

Ensaios similares foram usados para confirmar a presença do transgene dgt-1 de plantas transformadas com pDAB4101, a presença do transgene dgt-32 transgene de plantas transformadas com pDAB107532, a presença do transgene dgt-33 de plantas transformadas com pDAB107534, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102715, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102716, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102717 e a presença do transgene dgt-7 de plantas transformadas com pDAB102785.

Ensaio de Sonda de Hidrólise. Número de cópia foi determinado em plantas de Arabidopsis Ti e T2 usando o ensaio de sonda de hidrólise descrito abaixo. Plantas com números variáveis de transgenes foram identificadas e avançadas para estudos de tolerância a glifosato subsequentes.

Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 cavidades e liofilizadas por 2 dias. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Seguindo maceração de tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o estojo Biosprint® 96 Plant (Qiagen®, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico foi quantificado através do QUANT-IT® PICO GREEN DNA AS-SAY KIT (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para mais ou menos 2 ng/pL para o ensaio de sonda de hidrólise usando um manuseador de líquido automático BIOROBOT3000® (Qiagen, Germantown, MD). Determinação de número de cópia de transge- ne através do ensaio de sonda de hidrólise foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os ensaios foram projetados para DSM-2, dgt-28 e o gene de referência interna TAFII15 (ID Genbank: NC 003075; Duarte e outros (201) BMC Evol. Biol. 10:61).

Para amplificação, mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em um volume de 10 pL de reação multiplex contendo 0,1 μΜ de cada iniciador para DSM-2 e dgt-28, 0,4 μΜ de cada iniciador para TAFI-115 e 0,2 μΜ de cada sonda. Tabela 4. Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram administradas e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de PCR em tempo real foi realizada usando LightCycler® software release 1.5 usando o módulo quant relativo e é baseada no método AACt. Para isso, uma amostra de DNA genômico de um calibrador de cópia única e checagem de 2 cópias conhecida foram incluídas em cada rodada. Os resultados de número de cópia da avaliação de sonda de hidrólise foram determinados para as plantas de Arabidopsis transgênicas Ti e T2.

Tabela 4. Informação de iniciador e sonda para ensaio de sonda de hidrólise de DSM-2, dgt-28 e gene de referência interna (TAF1I15) Confirmação de integração de dat-28 através de Análise Southern blot. Análise Southern blot foi usada para estabelecer o padrão de integração do fragmento de DNA de filamento T inserido e identificar eventos que continham dgt-28. Os dados foram gerados para demonstrar a integração e a integridade dos insertos de transgene dentro do genoma de Arabi-dopsis. Dados de Southern blot foram usados para identificar integração simples de uma cópia intacta do DNA de filamento T. Análise Southern blot detalhada foi conduzida usando uma sonda amplificação por PCR específica para o cassete de expressão de gene dgt-28. A hibridização da sonda com DNA genômico que tinha sido digerido com enzimas de restrição específicas identificou fragmentos de DNA genômico dos pesos moleculares específicos, cujos padrões foram usados para identificar eventos transgênicos T-ι de inserção simples, comprimento integral, para avanço para a próxima geração.

Amostras de tecido foram coletadas em tubos cônicos de 2 ml_ (Eppendorf®) e liofilizadas por 2 dias. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECKO® e contas de tungstênio. Seguindo maceração do tecido, o DNA genômico foi purificado adicionalmente usando o estojo Qiagen® Genomic Tips. DNA genômico foi quantificado através do estojo de ensaio Quant-IT® Pico Green DNA (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para 4 pg para uma concentração consistente.

Para cada amostra, 4 pg de DNA genômico foram totalmente digeridos com a enzima de restrição Swal (New England Biolabs, Beverly, MA) e incubados a 25°C da noite para o dia, então Nsil foi adicionada à reação e incubada a 37°C por 6 horas. O DNA digerido foi concentrado através de precipitação com Quick Precipitation Solution® (Edge Biosystems, Gaithers-burg, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi então ressuspenso em 25 pL de água a 65°C por 1 hora. Amostras ressuspensas foram carregadas em um gel de agarose 0,8% preparado em TAE 1X e sofreram eletroforese da noite para o dia a 1,1 V/cm em tampão TAE 1X. O gel foi sequencialmente submetido à desnaturação (NaOH 0,2M/NaCI 0,6 M) por 30 minutos e neutralização (Tris-HCl 0,5 M (pH 7,5) / NaCI 1,5 M) por 30 minutos.

Transferência de fragmentos de DNA para membranas de náilon foi realizada passivamente através da ação capilar de solução SSC 20X da noite para o dia através do gel em membrana de transferência IMMOBILON® NY+ (Millipore, Billerica, MA) usando um pavio de papel de cromatografia e toalhas de papel. Seguindo a transferência, a membrana foi rapidamente lavada com SSC 2X, reticulada com o STRATALINKER® 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) e cozida a vácuo a 80°C por 3 horas.

Os blots foram incubados com solução de pré-hibridização (Per-fect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) por 1 hora a 65°C em garrafas redondas de vidro usando uma incubadora de hibridização modelo 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). As sondas foram preparadas a partir de um fragmento de PCR contendo a sequência de codificação inteira. O amplicon de PCR foi purificado usando o estojo de extração em gel QIAEX® e marcado com a32P-dCTP através do estojo de marcação Random RT Iniciador IT® (Stratagene, La Jolla, CA). Os blots foram hibridizados da noite para o dia a 65°C com sonda desnaturada adicionada diretamente ao tampão de hibridização para aproximadamente 2 milhões de contagem por blot por mL. Seguindo hibridização, os blots foram sequencialmente lavados a 65°C com SSX 0,1X / SDS 0,1% por 40 minutos. Finalmente, os blots foram expostos para avaliações de imagem de fósforo de armazenamento e imagens realizadas usando um sistema de imagem Dynamics Storm 860®.

As análises Southern blot completadas neste estudo foram usadas para determinar o número de cópia e confirmar que eventos selecionados continham o transgene dgt-28 dentro do genoma de Arabidopsis.

Confirmação de Cassete de Expressão de Gene dgt-28 através de análise de PCR. A presença do cassete de expressão de gene dgt-28 contido nos eventos de planta T-ι foi detectada por uma reação de PCR de ponto final. Os iniciadores (Tabela 5) específicos para o promotor AtUbilO v2 e regiões AtuORF23 3’ UTR v1 do cassete de expressão de gene dgt-28 foram usados para detecção.

Tabela 5. Iniciadores de oligonucleotídeo usados para confirma- ção do cassete de expressão de gene dgt-28 As reações de PCR requereram um protocolo de ciclização de PCR de três etapas padrão para amplificar o cassete de expressão de gene. Todas as reações de PCR foram completadas usando as condições de PCR que seguem: 94°C por três minutos seguido por 35 ciclos de 94°C por trinta segundos, 60°C por trinta segundos e 72°C por três minutos. As reações foram completadas usando o estojo EX-TAQ® PCR (TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Seguindo o ciclo final, a reação foi incubada a 72°C por 10 minutos. Eletroforese em gel de agarose TAE foi usada para determinar o tamanho do amplicon de PCR. Amplicons de PCR de um tamanho esperado indicaram que um cassete de expressão de gene de comprimento integral estava presente no geno-ma dos eventos de Arabidopsis transgênicos.

Confirmação de Transcrição Relativa de dgt-28 Através de Análise de PCR de Transcrição Reversa Quantitativa. Amostras de tecido de plantas transgênicas dgt-28 foram coletadas em placas de 96 cavidades e congeladas a 80°C. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Seguindo maceração do tecido, o RNA total foi isolado em formato de alto rendimento usando o estojo Qiagen® Rneasy 96 (Qiagen®, German-town, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante que incluía o tratamento Dnasel opcional na coluna. Esta etapa foi subsequentemente seguida por um tratamento Dnasel adicional (Ambion®, Austin, TX) do RNA total eluído. Síntese de cDNA foi realizada usando o RNA total como molde com o estojo High Capacity cDNA Reverse Transcription® (Applied Biosys-tems, Austin, TX) seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante com a adição do oligonucleotídeo, TVN. Quantificação de expressão foi completada através de ensaio de sonda de hidrólise e foi realizada através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os ensaios foram projetados para dgt-28 e o gene de referência interna "proteína desconhecida" (Número Acesso Genbank: AT4G24610) usando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em uma reação singleplex de volume de 10 pL contendo 0,4 μΜ de cada inicia-dor e 0,2 μΜ de cada sonda.

Tabela 6. Iniciadores de PCR usados para análise de PCR de transcrição reversa quantitativa de dgt-28 Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram administradas em triplicata e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Uma reação de transcrição reversa menor foi realizada para cada amostra para assegurar que nenhuma contaminação de gDNA estivesse presente. Análise de dados de PCR em tempo real foi realizada com base no método AACt. Este ensaio foi usado para determinar a expressão relativa de dgt-28 em eventos de Arabidopsis transgênicos que foram determinados ser hemízogotos e homozigotos. Os níveis de transcrição relativos do mRNA dgt-28 variaram de 2,5 vezes a 20,7 vezes mais do que o controle interno. Esses dados indicam que plantas transgênicas dgt-28 continham um cassete de expressão de gene dgt-28 funcional e as plantas eram capazes de transcrição do transgene dgt-28.

Análise Western Blot. DGT-28 foi detectado em amostras de folha obtidas de plantas de Arabidopsis thatiana transgênicas. Extratos de planta de plantas transgênicas dgt-28 e padrões de proteína DGT-28 foram incubados com tampão de amostra NUPAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo DTT a 90°C por 10 minutos e eletroforeticamente separados em gel pré-moldado. Proteínas foram então eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose usando o protocolo do fabricante. Depois de bloqueio com a WESTERNBREEZE® Blocking Míx (Invitrogen) a proteína DGT-28 foi detectada por antissoro anti-DGT-28 seguido por fosfatase anti-coelho de cabra. A proteína detectada foi visualizada através do substrato de quimiolumines-cência BCIP/NBT Western Analysis Reagent (KPL, Gaithersburg, MD). Produção de uma proteína DGT-28 intacta através de Western blot indicou que as plantas transgênicas dgt-28 que foram avaliadas expressavam a proteína DGT-28.

Exemplo 7: Tolerância a Glifosato Plantas de Arabidopsis ^ transgênicas contendo o transgene dgt-28 foram pulverizadas com taxas diferentes de glifosato. Taxas elevadas foram aplicadas neste estudo para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). Uma taxa de uso 1X típica de glifosato que vai controlar Arabidopsis não transformada é 420 g ae/ha. Formulações de glifosato com a adição de sulfato de amônio foram aplicadas às plantas Ti com um pulverizador em faixa calibrado a 187 L/ha. As plantas de Arabidopsis T-ι que foram usadas neste estudo eram de número de cópia variável para o transgene dgt-28. As plantas de Arabidopsis T1 dgt-28 de pouca cópia foram autopolinadas e usadas para produzir plantas T2. A Tabela 7 mostra a comparação de plantas transgênicas dgt-28, atraídas para um gene de resistência a herbicida de glifosato, dgt-1, e controles do tipo selvagem. A Tabela 8 mostra a comparação de dgt-3 e dgt-33 atraídos para um gene de resistência a herbicida de glifosato, dgt-1, e controles do tipo selvagem. A Tabela 9 mostra a comparação das novas enzimas EPSP sintase bacterianas com as enzimas EPSP sintase Classe I e os controles em uma taxa de glifosato de 1.680 g ae/ha.

Resultados de Seleção de Glifosato de Plantas de Arabidopsis dat-28 Transformadas. Os transformantes T1 de Arabidopsis foram primeiro selecionados da base de semente não transformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construto Ti. As plantas Ti selecionadas acima foram molecularmente caracterizadas e plantas representativas com número de cópia variável foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com várias taxas de glifosatos comerciais conforme anteriormente descrito. A resposta dessas plantas é apresentada em termos de lesão visual % 2 semanas após tratamento (WAT) (Weeks After Treatment). Em uma tabela são apresentados dados que mostram plantas individuais exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem, (c.v. Co-lumbia) serviu como um controle sensível a glifosato. O nível de resposta de planta variou. Esta variância pode ser a-tribuída ao fato que cada planta representa um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. Foi notado que algumas plantas que continham o transgene não foram tolerantes a glifosato; uma análise completa para determinar se essas plantas expressavam o transgene não foi completada. É provável que a presença de números altos de cópia do transgene dentro das plantas de Arabidopsis Ti resultou em silenciamento de transgene ou outros efeitos epigené-ticos que resultaram em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.

Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 9 para taxas de glifosato em 1.680 g ae/ha para demonstrar a diferença significante entre as plantas transformadas com dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32 e dgt-33 versus os controles dgt-1 e tipo selvagem. A tolerância provida pela nova EPSP síntase bacteriana variou dependendo da enzima específica. DGT-28, DGT-32 e DGT-33 inesperada- mente proveram tolerância signíficante a glifosato. Os genes dgt forneceram resistência a herbicida a plantas Arabidopsis Ti individuais em todos os pep-tídeos de trânsito testados. Desta maneira, o uso de peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais (isto é, TraP8 — dgt-32 ou TraP8 — dgt-33) proveria proteção contra glifosato com níveis de lesão similares àqueles relatados dentro de um dado tratamento.

Tabela 7. Resposta de Arabidopsis Ti transformada com dgt-28 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação Tabela 8. Resposta de Arabidopsis Tf transformada com dgt-32 e dgt-33 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação Tabela 9. Resposta de Arabidopsis T-ι transformada com dgt-28, dgt-32, dgt-33 e dgt-7 a uma faixa de glifosato aplicado pós-emergência a 1.680 g ae/ha, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação dgt-28 como um Marcador Selecionável. O uso de dgt-28 como um marcador selecionável para agente de seleção de glifosato é testado com as plantas transformadas com Arabidopsis descritas acima. Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis de geração T4 (homozigota para dgt-28) são pulverizadas em aproximadamente 5.000 sementes do tipo selvagem (sensível a glifosato). As sementes são germinadas e mudas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato. Vários tratamentos de glifosato são comparados; cada bandeja de plantas recebe um ou dois momentos de aplicação de glifosato em um dos esquemas de tratamento que seguem: 7 DAP (dias após plantio), 11 DAP ou 7 seguido por 11 DAP. Uma vez que todas as plantas também contêm um gene de resistência a glufosi-nato no mesmo vetor de transformação, plantas contendo dgt-28 selecionadas com glifosato podem ser diretamente comparadas com plantas contendo DSM-2 ou pat selecionadas com glufosinato.

Tratamentos com glifosato são aplicados com uma ponteira de pulverização DeVilbiss® conforme anteriormente descrito. Plantas transgêni-cas contendo dgt-28 são identificadas como "resistentes" ou "sensíveis" 17 DAP. Tratamentos de 26,25-1680 g ae/ha de glifosato aplicado 7 e 11 dias após plantio (DAP) mostram seleção eficaz de plantas Arabidopsis transgê-nicas que contêm dgt-28. Plantas sensíveis e resistentes são contadas e o número de plantas tolerantes a glifosato é verificado se correlacionar com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-28 que são plantadas. Esses resultados indicam que dgt-28 pode ser usado com eficácia como um marcador selecionável alternativo para uma população de Arabidopsis transformada.

Capacidade de herança. Eventos de Arabidopsis Ti transgênicos confirmados foram autopolinados para produzir semente T2. Essas sementes foram testadas na progênie através da aplicação de herbicida Ignite® contendo glufosinato (200 g ae/ha) para 100 irmãs T-ι aleatórias. Cada planta individual T2 foi transplantada para potes de 7,5 cm quadrado antes da aplicação da pulverização (pulverizador em faixa em taxa de aplicação de 187 L/ha). As famílias T-\ (plantas T2) segregam no modelo Resistente 3:Sensível 1 antecipado para um locus único dominantemente herdado com herança Mendeliana conforme determinado através de análise de Chi quadrado (P>0,05). A porcentagem de famílias T-ι que segregaram com a herança Mendeliana esperada é ilustrada na Tabela 10 e demonstra que a característica dgt-28 é passada através de herança Mendeliana para a geração T2. Sementes foram coletadas de 5 a 15 indivíduos T2 (semente T3). Vinte e cinco irmãs T3 de cada uma das 3-4 famílias T2 aleatoriamente selecionadas foram testadas em progênie conforme anteriormente descrito. Os dados não mostraram nenhuma segregação e então demonstraram que dgt-28 e dgt-3 são estavelmente integrados ao cromossomo e herdados de uma maneira Mendeliana por pelo menos três gerações.

Tabela 10. Porcentagem de famílias Ti (plantas T2) segregando como herança Mendeliana única para um teste de progênie de 100 plantas Dados de Arabidopsis T?. As plantas de segunda geração (T2) de eventos de Arabidopsis T-ι selecionados que continham números baixos de cópia do transigente dgt-28 foram caracterizadas adicionalmente quanto à tolerância a glifosato. Glifosato foi aplicado conforme anteriormente descrito. A resposta das plantas é apresentada em termos de lesão visual % 2 semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um his-tograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, tipo selvagem, (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração T2 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas contêm dois alelos diferentes em um locus comparado com plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um locus. Variabilidade de resposta a glifosato é esperada na geração T2 como um resultado da diferença em dosagem de gene para hemizígotos comparado com plantas homozigotas. A variabilidade em resposta a glifosato é refletida no desvio padrão e faixa de resposta.

Na geração T2, ambos os eventos dgt-28 de cópia única e multi-cópia foram caracterizados por tolerância a glifosato. Dentro de um evento, plantas de cópia única mostraram níveis similares de tolerância a glifosato. Dados característicos para um evento T2 de cópia única são apresentados na Tabela 11. Eventos contendo dgt-28 ligado com TraP5 v2 não proveram tolerância robusta a glifosato comparado com os construtos dgt-28 que continham outros peptídeos de trânsito TraP. No entanto, os construtos dgt-28 TraP5 proveram realmente um nível baixo de tolerância a glifosato comparado com o controle Columbia não transformado. Houve casos quando eventos que foram mostrados conter duas ou mais cópias de dgt-28 foram mais suscetíveis a taxas elevadas de glifosato (dados não mostrados). Este aumento em sensibilidade a glifosato é similar aos dados anteriormente descritos para as plantas T1 que também continham números altos de cópia do transgene dgt-28. É provável que a presença de números altos de cópia do transgene dentro das plantas de Arabidopsis resulte em silenciamento de transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultaram em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.

Esses eventos continham dgt-28 ligado com TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) e TraP13 v2 (pDAB105534).

Em adição a dgt-28, eventos de Arabidopsis T2 transformados com dgt-3 são apresentados na Tabela 12. Conforme descrito para os even- tos dgt-28 na Tabela 11, a tabela de dados contém um evento representativo que é característico da resposta a glifosato para cada construto. Para a caracterização de dgt-3, construtos contendo uma PTU única (unidade de transformação de planta) (Píant Transformation Unii) com o gene dgt-3 sendo direcionado pelo promotor AtUbilO (pDAB102716, FIG. 45 e pDAB102715, FIG. 10) foram comparados com construtos com o mesmo gene contendo 2 PTUs do gene (pDAB102719, FIG. 32; pDAB102718, FIG. 33). Os construtos que continham 2 PTU usaram o promotor AtUbilO para direcionar uma cópia do gene e o promotor CsVMV para direcionar a outra cópia. O uso da PTU dupla foi incorporado para comparar as plantas transgênicas dgt-3 com plantas transgênicas dgt-28 que continham duas cópias do transgene. Dados demonstraram que eventos dgt-3 T2 de cópia única com apenas uma PTU eram mais suscetíveis a glifosato do que eventos dgt-28 de cópia única testados, mas eram mais tolerantes do que o controle não transformado. Famílias T-i contendo 2 PTUs do gene dgt-3 proveram um nível maior de tolerância visual a glifosato comparado com os construtos de 1 PTU. Em ambos os casos, as famílias T| foram comparadas com controles dgt-1 e tipo selvagem. Dados de T2 demonstram que dgt-28 provê tolerância robusta como eventos de cópia única.

Tabela 11. Resposta de eventos Arabidopsis T2 individuais contendo dgt-28 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas variáveis, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação Tabela 12. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 selecionados transformados com dgt-3 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas variáveis. Lesão % visual 14 dias após aplicação Dados de Arabidopsis T3. As plantas de terceira geração (T3) de eventos de Arabidopsis T2 selecionados que continham números baixos de cópia do transgene dgt-28 foram caracterizadas quanto à tolerância a glifo-sato. Vinte e cinco plantas por linhagem foram selecionadas com glufosinato conforme anteriormente descrito e linhagens de cada construto testado não segregaram para o gene marcador selecionável. Glifosato foi aplicado conforme descrito anteriormente. A resposta das plantas é apresentada em termos de lesão visual % 2 semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto u-sado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem, (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato.

Tabela 13. Resposta de eventos de Arabidopsis T3 individuais selecionados contendo dgt-28 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas variáveis comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação Seleção de plantas transformadas. Sementes T-\ recém-colhidas [genes dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1] foram deixadas secar em temperatura ambiente e transportadas para Indianápolis para teste. Semente Ti foi semeada em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Cle-arwater, MN), cada uma recebendo alíquotas de 200 mg de semente T-ι es- tratificada (-10.000 sementes) que tinham sido anteriormente suspensas em 40 mL de solução de agarose 0,1% e armazenadas a 4°C por 2 dias para completar as necessidades de dormência e assegurar germinação de semente síncrona.

Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então deixada drenar pela gravidade. Cada alíquota de 40 mL de semente estratificada foi semeada uniformemente na vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de umidade (KORD® Products, Bramalea, On-tário, Canadá) por 4-5 dias. As cúpulas foram removidas uma vez as plantas tendo germinado antes da seleção de transformante inicial usando pulverização de pós-emergência de glufosinato (seleção do gene dsm-2 co-transformado).

Seis dias depois do plantio (DAP) e novamente 10 DAP, plantas Τϊ (cotilédon e estágio 2-4 folhas, respectivamente) foram pulverizadas com uma solução 0,1% de herbicida IGNITE® (280 g ai/L glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de pulverização de 10 mL/bandeja (703 L/ha) usando uma ponteira de pulverização a ar comprimido DeVilbiss® para aplicar uma taxa eficaz de 200 g ae/ha de glufosinato por aplicação. Sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4-7 dias após a pulverização final. Plantas sobreviventes foram transplantadas individualmente em potes de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de uso em pote (Metro Mix 360®). As plantas cresceram na estufa pelo menos 1 dia antes da amostragem de tecido para análises de número de cópia.

Plantas Ti foram amostradas e análises de número de cópia para os genes dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 foram completadas. Plantas T-ι receberam então várias taxas de glifosato de maneira que uma faixa de cópias estava dentre cada taxa. Para Arabidopsis, 26,25 g ae/ha de glifosato é uma dose eficaz para distinguir plantas sensíveis daquelas com níveis significan-tes de resistência. Taxas elevadas foram aplicadas para determinar níveis relativos de resistência (105, 420, 1680 ou 3360 g ae/ha). A Tabela 15 mostra as comparações atraídas para dgt-1.

Todas as aplicações de herbicida glifosato foram feitas através de pulverizador em barra em um volume de pulverização de 187 L/ha. Glifosato usado era a formulação de sal de dimetilamina Durango comercial (480 g ae/L, Dow AgroSciences, LLC). Plantas Ti de poucas cópias que exibiram tolerância ou a glufosinato ou glifosato foram avaliadas adicionalmente na geração T2.

As primeiras transformações de Arabidopsis foram conduzidas usando dgt-31, dgt-32 e gdt-33 v1. Transformantes T1 foram primeiro selecionados da base de semente não transformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construto de T(. Frequência de transformação foi calculada e os resultados de construtos de dgt-31, dgt-32 e dgt-33 T1 são listados na Tabela 14.

Tabela 14. Frequência de transformação de construtos de Arabidopsis dgt-31, dgt-32 e dgt-33 T1 selecionados com glufosinato para seleção do gene marcador selecionável DSM-2 Plantas Τί selecionadas acima foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com várias taxas de glifosato comercial. A Tabela 15 compara a resposta de dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 e genes controle em conferir resistência a glifosato a transformantes de Arabidopsis T-ι. A resposta é apresentada em termos de lesão visual % 2 WAT. Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada tratamento. A faixa de resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, tipo selvagem (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato. O gene DGT-31 (v1) com peptídeo de trânsito TraP23 forneceu tolerância a herbicida leve a plantas de Arabidopsis ΊΡ] individuais comparado com controle negativo, mas o gene exibiu tolerância aperfeiçoada com peptídeo de trânsito TraP8. Ambos o DGT-32 e o DGT-33 demonstraram tolerância robusta a glifosato nas taxas testadas com TraP8 e com seus respectivos peptídeos de trânsito de cloroplasto diferentes (TraP14 e TraP24, respectivamente). Dentro de um dado tratamento, o nível de resposta de planta variou muito, o que pode ser atribuído ao fato que cada planta representa um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. De nota importante, em cada taxa de glifosato testada, havia indivíduos que eram mais tolerantes do que outros. Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 15 para demonstrar a diferença significante entre as plantas transformadas com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 versus os controles dgt-1 v1 e tipo selvagem.

Tabela 15. dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 transformaram resposta de Arabidopsis Ti transformada para uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) ou um controle não transformado. Lesão % visual 2 semanas após tratamento Exemplo 8: dgt-32 e dgt-33 como Marcadores Selecionáveis dgt-32 e dgt-33 v1 são usados como marcadores selecionáveis com glifosato como o agente de seleção. O desempenho desses marcadores é analisado com Arabidopsis transformada. Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis geração T4 (homozigotas para dgt-32 e dgt-33 v1) são espalhadas em aproximadamente 5.000 sementes do tipo selvagem (sensíveis). Vários tratamentos são comparados, cada bandeja de plantas recebendo ou um ou dois momentos de aplicação de glifosato em um dos esquemas de tratamento que seguem: 7 DAP, 11 DAP ou 7 seguido por 11 DAP. Uma vez que todos os indivíduos também contêm o gene dsm-2 no mesmo vetor de transformação, dgt-32 e dgt-33 selecionados com glifosato são capazes de ser diretamente comparados com dsm-2 selecionado com glufosinato.

Os tratamentos são aplicados com ponteira de pulverização De-Vilbiss®. As plantas são identificadas como Resistentes ou Sensíveis 17 DAP. Tratamentos de 26,25 - 280 g ae/ha 2,4-D apficada 7 e 11 dias após plantio (DAP) são igualmente eficazes em frequência de seleção. Esses resultados indicam que dgt-32 e dgt-33 v1 podem ser efetivamente usados como um marcador selecionável.

Capacidade de herança. Uma variedade de eventos Ti foi auto-polinada para produzir semente T2. Essas sementes foram testadas quanto à progênie através da aplicação de IGNITE® (200 g ae/ha) para 100 irmãs T2 aleatórias. Cada planta T2 individual foi transplantada para potes de 7,5 cm quadrado antes da aplicação de pulverização (pulverizador em faixa em taxa de aplicação de 187 L/ha). Famílias Tj (plantas T2) que segregam no modelo Resistente 3:Sensível 1 antecipado para um locus único dominantemente herdado com herança Mendeliana conforme determinado através de análise de Chi quadrado (P>0,05) foram determinadas.

Semente foi coletada de 5 a 15 indivíduos T2 (semente T3). Vinte e cinco irmãs T3 de cada uma das 3 famílias T2 aleatoriamente selecionadas foram testadas quanto à progênie. Dados mostrando nenhuma segregação demonstram que dgt-32 e dgt-33 v1 foram, cada um, estavelmente integrados e herdados de uma maneira Mendeliana por pelo menos três gerações.

Caracterização de Tolerância a Herbicida Adicional de Linhagens de DGT T3. Semente de Arabidopsis de geração T3 é estratificada e semeada em bandejas de seleção. Uma linhagem controle transformada contendo dgt-1 e o controle não transformado são plantadas de uma maneira similar. Mudas são transferidas para potes de 7,62 cm (3 polegadas) individuais na estufa. Todas as plantas são pulverizadas com o uso de um pulverizador em faixa ajustado a 187 L/ha. As plantas são pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de 420-3360 g ae/ha (DURANGO® TMA, Dow AgroSciences). Todas as aplicações são formuladas em água. Cada tratamento é replicado 4 vezes e as plantas são avaliadas em 7 e 15 dias após tratamento.

Exemplo 9: Transformação de Espécies de Cultura Adicionais Soja é transformada com dgt-28, dgt-31, dgt-32 e/ou dgt-33 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para prover níveis altos de resistência ao herbicida glifosato, utilizando um método conhecido daqueles versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo 11 ou Exemplo 13 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.

Algodão é transformado com dgt-28, dgt-31, dgt-32 e/ou dgt-33 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para prover níveis altos de resistência ao herbicida glifosato através da utilização de um método conhecido daqueles versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descritas nos Exemplos 14 da Patente U.S. No. 7.838.733 ou Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.

Canola é transformada com dgt-28, dgt-31, dgt-32 e/ou dgt-33 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para prover níveis altos de resistência ao herbicida glifosato através da utilização de um método conhecido daqueles versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo 26 da Patente U.S. 7.838.733 ou Exemplo 22 da Publicação de Patente Internacional No. WO 2007/053482.

Exemplo 10: Transformação de Milho Construtos de DNA para Transformação de Milho. Métodos de clonagem padrão, conforme acima descrito, foram usados na construção de vetores binários para uso em transformação de milho mediada por Agrobac-terium tumefaciens. A Tabela 16 lista os vetores que foram construídos para transformação de milho. Os elementos de gene que seguem foram usados nos vetores que continham dgt-28\ o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbil; Patente U.S. No. 5.510.474) foi usado para direcionar a sequência de codificação de dgt-28 que é flanqueada pela região não traduzida Lipase 3’ de Zea mays (ZmLip3’UTR; Patente U.S. No. 7179902), o cassete de marcador selecionável consiste no promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays que foi usado para direcionar a sequência de codificação de aad-1 (Patente U.S. No. 7.838.733) que é flanqueada pela região não traduzida Lipase 3’ de Zea mays. A sequência de codificação de aad-1 confere tolerância aos her- bicidas de fenóxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e a herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP).

Os construtos de dgt-28 foram construídos como vetores binários padrão e vetores de sistema superbinário de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tóquio, Japão). Os vetores binários padrão incluem: pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665 e pDAB107665. Os vetores de sistema superbinário de Agrobacterium incluem pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386 e pDAB108387.

Construtos adicionais foram completados, os quais contêm um gene repórter de proteína amarelo fluorescente (yfp: Pedido de Patente U.S. 2007/0298412). pDAB109812 contém um cassete de gene repórter de yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida 3’ per 5 de Zea mays (Zm per 5 3’ UTR; Patente U.S. No. 7179902), o cassete marcador selecíonável consiste no promotor do vírus baciliforme da cana-de-açúcar (SCBV; Patente U.S. No. 5.994.123) que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays. pDAB101556 contém um cassete de yfp que é direcionado pelo promotor da ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida 3’ per 5 de Zea mays, o cassete marcador selecíonável consiste em promotor 1 da Ubiquitina de Zea mays que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays. pDAB107698 contém um cassete de dgt-28 que é direcionado pelo promotor da ubiquitina 1 de Zea mays e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays, um cassete de yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e é flanqueado pela região não traduzida 3’ per 5 de Zea mays, o cassete marcador selecíonável consiste no promotor do vírus baciliforme da cana-de-açúcar que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flaqueando pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays. Todos os três desses construtos são vetores binários padrão.

Tabela 16. Vetores de Transformação de Milho Esterilização de espiga e isolamento de embrião. Para obter embriões imaturos de milho, plantas da linhagem de cruzamento entre a mesma espécie de Zea mays B104 foram cultivadas na estufa e foram auto-polinadas ou sibpolinadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 9-12 dias pós-polinação. No dia experimental, as espigas foram esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de hipoclorito de sódio (5%) e agitadas por 20-30 minutos, seguido por três enxágues em água estéril. Após esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5-2,4 mm) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo meio de infecção líquido (Meio Basal LS, 4,43 gm/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Sacarose, 68,5 gm/L; D(+) Glicose, 36,0 gm/L; 10 mg/L de 2,4-D, 150 pL/L). Para um dado conjunto de experimentos, embriões agrupados de três espigas foram usados para cada transformação. Início de Cultura de Agrobacterium.

Estoques de glicerol de Agrobacterium contendo os vetores de transformação binários descritos acima foram riscados em placas de meio mínimo AB contendo antibióticos apropriados e foram cultivados a 20°C por 3-4 dias. Uma colônia única foi selecionada e riscada em placas YEP contendo os mesmos antibióticos e foi incubada a 28°C por 1-2 dias.

Cultura e Co-cultivo de Agrobacterium. Colônias de Agrobacterium foram pegas da placa YEP, suspensas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL e a densidade celular foi ajustada para OD6oo mm de 0,2-0,4 usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium foram postas em um agitador giratório a 125 rpm, temperatura ambiente, enquanto dissecação de embrião foi realizada. Embriões zigóticos imaturos entre 1,5-2,4 mm de tamanho foram isolados dos grãos de milho esterilizados e postos em 1 mL do meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) foi adicionada a cada tubo e os tubos foram postos em uma plataforma de agitação por 10-15 minutos. Os embriões foram transferidos para meio de co-cultivo (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Mio-inositol, 100,0 mg/L; Hidrolisato enzimático de case-ína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan®, 3,0 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; DMSO, 100 μΜ), orientados com o escutelo virados para cima e incubados a 25°C, sob 24 horas de luz a 50 pmol m"2 seg~1 de intensidade de luz por 3 dias.

Seleção e Regeneração de Calo de Eventos Putativos. Seguindo o período de co-cultivo, os embriões foram transferidos para meio de descanso (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; 1,2,3,5/4,6- Hexaidroxi- cicloexano, 100 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisato enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicam-ba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan 2,30 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicili-na, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubados sob 24 horas de luz a 50 pmol rrf2 seg"1 de intensidade de luz e a 25°C por 3 dias.

Experimentos de resposta de dosagem de inibição de crescimento sugeriram que concentrações de glifosato de 0,25 mM e maiores foram suficientes para inibir crescimento celular na linhagem de milho B104 não transformada. Os embriões foram transferidos para Meio de Seleção 1 contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Mi-o-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisato enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba -KOH 30mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan® 2,30 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenici-lina, 250,0 mg/L) e incubados ou no escuro e/ou sob 24 de luz a 50 pmole m'2 seg"1 de intensidade de luz por 7-14 dias a 28°C.

Calos embriogênicos em proliferação foram transferidos para Meio de seleção 2 contendo glifosato 1,0 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/ 4,6- Hexaidroxicicloexano, 100 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisatos enzi-máticos de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan® 2,30 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/mL AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L; Ácido R-haloxifope 0,1810 mg/L) e foram incubados ou no escuro e/ou sob 24 horas de luz a 50 pmole m"2 seg-1 de intensidade de luz por 14 dias a 28°C. Esta etapa de seleção permitiuque calo transgênico proliferasse e diferenciasse mais. O período de seleção de calo durou três a quatro semanas.

Calos embriogênicos, em proliferação, foram transferidos para meio PreReg contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidroxicicloexano, 100 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,250 gm/L; Hidrolisato enzimá- tico de caseína 50,0 mg/L; NAA-NaOH 0,500 mg/L; ABA-EtOH 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; Sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan® 2 50 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5mg/ml AgNo3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e culturados sob luz por 24 horas a 50 pmole rrf2 seg"1 de intensidade de luz por 7 dias a 28°C.

Calos embriogênicos com broto tipo ramo foram transferidos para Meio de regeneração contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6- Hexaidroxicicloexano, 100,0 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434® 3,00 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; Carbenicilina, 125,0 mg/L ) e culturados sob 24 horas de luz a 50 pmol m"2 seg-1 de intensidade de luz por 7 dias.

Ramos pequenos com brotos primários foram transferidos para meio de enraizamento (MS Salts, 4,33 gm/L; Vitamina MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 1,2,3,5/4,6- Hexaidroxicicloexano, 100 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434® 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) em fi-tobandejas e foram incubados sob 16/8 h de luz/escuro a 140-190 pmole m"2 seg 1 de intensidade de luz por 7 dias a 27°C. Mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto a número de cópia de transgene usando os protocolos descritos acima e transferidas para o solo.

Confirmação molecular da Presença dos Transqenes dat-28 e aad-1 em Plantas de Milho. A presença das sequências de polinucleotídeo dgt-28 e aad-1 foram confirmadas através de ensaios de sonda de hidrólise. Plantas de milho T0 isoladas foram inicialmente avaliadas através de um ensaio de sonda de hidrólise, análogo a Taqman®, para confirmar a presença de transgenes aad-1 e dgt-28. Os dados gerados a partir desses estudos foram usados para determinar o número de cópia de transgene e usados para selecionar eventos de milho transgênicos para retrocruzamento e avanço para a geração Ti.

Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 cavidades, maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de aço inoxidável (Hoover Precision Products, Cumming, GA) em tampão Qiagen® RLT. Seguindo maceração de tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o Biosprint 96® Plant Kit (Qia-gen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico foi quantificado através do estojo de ensaio Quant-IT® Pico Green DNA (Molecular Probes, invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para mais ou menos 2 ng/pL para o ensaio do e sonda de hidrólise usando um manuseador de líquido automático BIORO-BOT3000® (Qiagen, Germantown, MD). Determinação do número de cópia de transgene através de ensaio de sonda de hidrólise, análogo ao ensaio TAQMAN®, foi realizada através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os ensaios foram projetados para aad-1 e dgt-28 e um de gene de referência interna Invertase (No. Acesso Genbank: U16123.1) usando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, India-nápolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em uma reação multiplex de 10 pL de volume contendo 0,4 μΜ de cada iniciador para aad-1 e dgt-28 e 0,2 pM de cada sonda (Tabela 17).

Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram administradas e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR em tempo real foi realizada usando LightCycler® software release 1.5 usando o módulo quant relativo e é baseada no método AACt. Os controles incluíam uma amostra de DNA genômico de um calibrador de cópia única e checagem de duas cópias conhecida que foram incluídas em cada rodada. A Tabela 18 lista os resultados dos ensaios de sonda de hidrólise.

Tabela 17. Sequências de iniciador e sonda usadas para ensaio de sonda de hidrólise de aad-1, dgt-28 e referência interna (Invertase) Tabela 18. Resultados de quantidade de cópia To para eventos dgt-28. Eventos de pouca cópia consistiam em 1-2 cópias transgênicas, números de cópia única são listados em parênteses. Eventos com número de cópia alto continham 3 ou mais cópias de transgene Exemplo 11: Tolerância a Herbicida em Milho Transformado com dgt-28 Eventos de transformação de dgt-28 de Zea mays (To) foram deixados aclimatar na estufa e foram cultivados até que as plantas tivessem realizado transição de condições de cultura de tecido para crescimento em estufa (isto é, 2-4 folhas de aparência normal, novas, tinham emergido da flor). As plantas foram cultivadas a 27°C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuro na estufa. As plantas foram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA® (contendo o herbicida glifosato) com a adição de sulfato de amônio 2% p/p. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverização de barra em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização 50 cm. Plantas T0 foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de 280-4480 g ae/ha de glifosato, que é capaz de lesão significante a linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à linhagem de cruzamento entre a mesma linhagem B104.

Os resultados das plantas de milho dgt-28 To demonstraram que tolerância a glifosato foi obtida em taxas de até 4480 g ae/ha. Um tipo de meio específico foi usado na geração To. Atrofia mínima e crescimento de planta geral de plantas transformadas comparado com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 provê tolerância robusta a glifosato quando ligado aos peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP5, TraP8 e TraP23.

As plantas T0 selecionadas são autopolinadas ou retrocruzadas para caracterização adicional na próxima geração. 100 linhagens de dgt-28 escolhidas contendo as plantas Ti são pulverizadas com 140-1120 g ae/ha de glufosinato ou 105-1680 g ae/ha de glifosato. Ambos os genes marcador de glifosato e resistente a glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Desta maneira, se um gene tolerante a herbicida for selecionado através de pulverização com um herbicida, ambos os genes são acreditados estar presentes. Após 14 DAT, plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que segregaram como um locus único, característica Mendeliana dominante (3R:1S) conforme determinado através de análise de quadrado Chi. Esses dados demonstram que dgt-28 é herdá-vel como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie mono-cotiledônea. Taxas altas de glifosato são aplicadas às sobreviventes T-ι ou Fi para caracterizar mais a tolerância e a proteção que são providas pelo gene dgt-28.

Tolerância a herbicida pós-emerqência em Milho Tn transformado com dgt-28. Eventos T0 de dgt-28 ligado com TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23 foram gerados através de transformação com Agrobacterium e foram deixados aclimatar sob condições de câmara de crescimento controladas até que 2-4 folhas de aparência normal, novas, tivessem emergido da flor. As plantas receberam números de identificação individuais e foram amostradas para análise de número de cópia de ambos o dgt-28 e o aad-2. Com base em análise de número de cópia, as plantas foram selecionadas para análises de expressão de proteína. As plantas foram transplantadas para potes grandes com meio de crescimento novo e cultivadas a 27°C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuro na estufa. As plantas restantes que não foram amostradas quanto à expressão de proteína foram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA® (glifosato) com a adição de sulfato de amônio 2% p/v. Os tratamentos foram distribuídos de maneira que cada agrupamento de planta continha eventos T0 de número de cópia variável. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador em faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização 50 cm. Plantas To foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de 280-4480 g ae/ha de glifosato capaz de lesão significante a linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à linhagem de cruzamento entre a mesma espécie B104. B104 era a base genética dos transformantes.

Resultados de plantas de milho dgt-28 T0 demonstram que tolerância a glifosato foi obtida até 4480 g ae/ha. Tabela 19. Atrofia mínima e crescimento de planta geral de plantas transformadas comparado com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 provê proteção robusta a glifosato quando ligado a TraP5, TraP8 e TraP23.

Tabela 19. Resposta de eventos dgt-28 T0de números de cópia variáveis a taxas de glifosato variando de a partir de 280-4480 g ae/ha + sulfato de amônio 2,0% p/v 14 dias após tratamento Análises de expressão de proteína através de ELISA padrão demonstraram uma faixa média de proteína DGT-28 de 12,6-22,5 ng/cm2 nos construtos testados.

Confirmação de tolerância a qlifosato na qerapão Fi sob condições de estufa. Plantas T0 de cópia única que não foram pulverizadas foram retrocruzadas com a base não transformada B104 para caracterização adicional na próxima geração. Na geração Ti, tolerância a glifosato foi avaliada para confirmar a herança do gene dgt-28. Para plantas T-ι, o herbicida AS-SURE II® (35 g ae/ha quizalofope-metil) foi aplicado no estágio de crescimento V1 para selecionar a proteína AAD-1. Ambos o marcador selecionável e o gene resistente a glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Desta maneira, se um gene for selecionado, ambos os genes são acreditados estar presentes. Após 7 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas e plantas nulas foram removidas da população. Esses dados demonstram que dgt-28 (v1) é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiledônea. As plantas foram amostradas para caracterização de proteína DGT-28 através de ELISA padrão e nível de transcrito de RNA. Plantas resistentes foram pulverizadas com 560-4480 g ae/ha de glifosato conforme anteriormente descrito. Os dados demonstram tolerância robusta de dgt-28 ligado a peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23 até 4480 g ae/ha de glifosato. Tabela 20.

Tabela 20. Resposta de eventos de dgt-28 de cópia única Fi a taxas de glifosato variando de a partir de 560-4480 g ae/ha + sulfato de a-mônio 2,0% 14 dias após tratamento Dados de expressão de proteína demonstram uma faixa de proteína DGT-28 média de 42,2-88,2 ng/cm2 em eventos ΤΊ e construtos testados, estabelecendo expressão de proteína na geração T|.

Caracterização de milho dqt-28 sob condições de campo. Eventos de cópia única foram enviados para um local de campo para criar ambas as sementes hemizigotas híbridas e homozigotas de cruzamento entre a mesma espécie para caracterização adicional. Sementes híbridas foram criadas através do cruzamento de eventos Ti na linhagem de transformação de milho B104 com a linhagem de cruzamento entre a mesma espécie 4XP811 gerando populações híbridas segregando 1:1 (hemizigota:nula) para o evento. As sementes resultantes foram enviadas para 2 locais separados. Um total de cinco eventos de cópia única por construto foi plantado em cada local em um projeto em bloco completo aleatorizado em triplicata. Os campos foram projetados para aplicações de glifosato ocorrerem no estágio de crescimento V4 e um agrupamento separado de plantas a ser aplicado no estágio de crescimento V8. O híbrido convencional 4XP811/B104 foi usado como um controle negativo.

Fileiras experimentais foram tratadas com 184 g ae/ha de AS-SURE II® (106 g ai/L de quizalofope-metila) para eliminar segregantes nulos. Todos os registros experimentais segregaram 1:1 (sensível:resistente) (p=0,05) com relação à aplicação de ASSURE II®. Plantas resistentes selecionadas foram amostradas de cada evento para quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padrão.

Plantas resistentes a quilazofope-metila foram tratadas com o herbicida comercial DURANGO DMA® (480 g ae/L de glifosato) com a adição de sulfato de amônio 2,5% p/v em estágio de crescimento V4 ou V8. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador de barra calibrado para aplicar um volume de 187 L/ha, altura de pulverização de 50 cm. As plantas foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de 1120-4480 g ae/ha de glifosato, capaz de lesão significante a linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à linhagem de cruzamento entre a mesma espécie 4XP811. Avaliações visuais de lesão foram feitas para a porcentagem de clorose visual, porcentagem de necrose, porcentagem de inibição de crescimento e lesão visual total em 7, 14 e 21 DAT (dias após tratamento). As avaliações foram comparadas com as checagens não tratadas para cada linhagem e os controles negativos.

Dados de lesão visual para todos os momentos de avaliação demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de DURANGO DMA® em ambos os locais e momento de aplicação. Eventos representativos para a aplicação V4 são apresentados de um local e estão de acordo com outros eventos, momentos de aplicação e locais. Tabela 21. Um evento do constru-to contendo dgt-28 ligado a TraP23 (pDAB107665) foi tolerante à seleção com ASSURE II® quanto à proteína AAD-1, mas foi sensível a todas as taxas de glifosato aplicado.

Tabela 21. Resposta de eventos de dgt-28 aplicado com uma faixa de glifosato de a partir de 1120-4480 g ae/ha + 2,5% p/v de sulfato de amônio em estágio de crescimento V4 Avaliações adicionais foram feitas durante o estágio de crescimento reprodutivo para a taxa de glifosato de 4480 g ae/ha. Avaliação visual de franjas, momento de polinação e enchimento da espiga foi similar às checagens não tratadas de cada linhagem para todos os construtos, momentos e locais de aplicação. Resultados de quantificação para a proteína DGT-28 demonstraram uma faixa de expressão de proteína média de 186,4-303,0 ng/cm2. Os dados demonstram tolerância robusta de milho transformado com dgt-28 sob condições de campo durante os estágios de crescimento reprodutivo até 4480 g ae/ha de glifosato. Os dados demonstraram também detecção e função de proteína DGT-28 com base em resultados de tolerância à pulverização.

Confirmação de capacidade de herança e tolerância de milho dgt-28 no estado homoziaoto. Sementes da T-iS2 foram plantadas sob condições de estufa conforme anteriormente descrito. As mesmas cinco linhagens de cópia únicas que foram caracterizadas sob condições de campo foram caracterizadas no estado homogêneo. As plantas foram cultivadas até o estágio de crescimento V3 e separadas em três taxas de glifosato variando de 1120-4480 g ae/ha de glifosato (DURANGO DMA®) e quatro réplicas por tratamento. As aplicações foram feitas em um pulverizador em faixa confor- me anteriormente descrito e foram formuladas em sulfato de amônio 20% p/v. Uma aplicação de sulfato de amônio serviu como uma checagem não tratada para cada linhagem. Avaliações visuais foram feitas 7 e 14 dias após tratamento conforme anteriormente descrito. Dados demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato para todos os eventos testados. Tabela 22.

Tabela 22. Resposta de eventos de dgt-28 homozigotos aplicados com uma faixa de glifosato de a partir de 1120-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio A linhagem de pDAB107665 que não foi tolerante sob condições de campo não demonstrou nenhuma tolerância a glifosato e então de acordo com as condições de campo (dados não mostrados). Com a exceção da uma linhagem anteriormente mencionada, todas as réplicas que foram tratadas com glifosato das linhagens não eram sensíveis a glifosato. Desta maneira, os dados demonstraram capacidade de herança para uma população homogênea de milho dgt-28 de uma maneira Mendeliana. Expressão da proteína dgt-28 através de ELISA padrão demonstrou uma faixa de expressão de proteína média de a partir de 27,5-65,8 ng/cm2 nos eventos de cópia única que eram tolerantes a glifosato. Os dados demonstram proteína funcional e estabilidade da proteína DGT-28 através das gerações.

Exemplo 12: Uso de glifosato para tolerância a herbicida pós-emergência como um marcador selecionável Conforme anteriormente descrito, plantas transformadas T0 foram levadas da cultura de tecido e aclimatadas na estufa. Os eventos testados continham dgt-28 ligado a peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP5, TraP8 e TraP23. Foi demonstrado que essas plantas To proveram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato, e plantas não transformadas foram controladas com glifosato em concentrações tão baixas quanto 280 g ae/ha.

Esses dados demonstram que dgt-28 pode ser utilizado como um marcador selecionável usando uma concentração de glifosato variando de a partir de 280-4480 g ae/ha. Várias sementes de linhagens fixadas de milho que continham transgene dgt-28 são salpicadas em várias sementes de milho não transformadas. Essas sementes são plantadas e deixadas crescer para o estágio de desenvolvimento V1-V3, momento quando as plantas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato na faixa de 280-4480 g ae/ha. Seguindo 7-10 dias, plantas sensíveis e resistentes são contadas, e a quantidade de plantas tolerantes a glifosato se relaciona com o número original de semente transgênica contendo o transgene dgt-28 que é plantado.

Exemplo 13: Empilhamento de milho dgt-28 A proteína AAD-1 é usada como o marcador selecionável no milho transformado com dgt-28 para propósitos de pesquisa. O gene aad-1 pode ser também utilizado como uma característica tolerante a herbicida em milho para prover tolerância a 2,4-D robusta até uma aplicação V8 em uma cultura. Quatro eventos dos construtos pDAB107663 (TraP4:.dgt-28), pDAB107664 (TraP8v.dgt-28) e pDAB107666 (TraP5::dg/-28) foram caracterizados quanto à tolerância de uma aplicação de mistura de tanque de glifosato e 2,4-D. O estudo de caracterização foi completado com semente F-i sob condições de estufa. Aplicações foram feitas em um pulverizador de faixa conforme anteriormente descrito nas taxas que seguem: 1120-2240 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120-2240 g ae/ha (seletivo para o gene aad-1) ou uma mistura de tanque de dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram graduadas em 7 e 14 DAT. Resultados de pulverização para aplicações dos herbicidas a 2240 g ae/ha são mostrados na Tabela 23.

Tabela 23. Resposta de milho com aad-1 e dgt-28 F1 pulverizado com 2240 g ae/ha de 2,4-D, glifosato e uma combinação de mistura de tanque dos dois herbicidas 14 dias após tratamento Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser empilhado com sucesso com aad-1, desta maneira aumentando os herbicidas de espectro que podem ser aplicados à cultura de interesse (glifosato + ácidos fenoxía-céticos para dgt-28 e aad-1, respectivamente). Em produção de cultura em que é difícil controlar ervas-daninhas de folha larga ou biotipos de erva-daninha resistentes existem a pilha pode ser usada como um meio de controle de erva-daninha e proteção da cultura de interesse. Características de input ou output adicionais podem ser também empilhadas com o gene dgt-28 em milho e outras plantas.

Exemplo 14: Transformação de Outras Culturas Culturas adicionais são transformadas usando técnicas conhecidas. Para transformação de centeio mediada por Agrobacterium vide, por exemplo, Popelka, J.C., Xu, J., Altpeter, F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye," Transgenic Res. 2003 Oct; 12(5):587-96.). Para transformação de sorgo mediada por Agrobacterium, vide, por exemplo, Zhao e outros, "Agrobacterium-mediated sor-ghum transformation", Plant Mol Biol. 2000 Dez;44(6):789-98. Para transformação de cevada mediada por Agrobacterium vide, por exemplo, Tingay e outros, "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation", The Plant Journal, (1997) 11: 1369-1376. Para transformação de trigo mediada por Agrobacterium vide, por exemplo, Cheng e outros., "Genetic Transforma- tion ofWheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens" , Plant Physiol. 1997 Nov;115(3):971-980. Para transformação de arroz mediada por Agrobacterium vide, por exemplo, Hiei e outros, "Transformation of rice mediated by A-grobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol. 1997 Sep;35(1-2):205-18.

Outras técnicas de transformação (não Agrobacterium) são usadas para transformar dgt-28, dgt-32 ou dgt-33, por exemplo, em Milho (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), Cevada (Hor-deum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Beterrabas açucareira e de mesa (Beta spp.), Cana-de-açúcar (Arenga pinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum e outra spp., Physalis ixocar-pa, Solanum incanum e outra spp. e Cyphomandra betacea), Batata (Sola-num tuberosum), Batata doce (Ipomoea batatas), Centeio (Secale spp.), Pimentas (Capsicum annuum, chinense e frutescens), Alface (Lactuca sativa, perennis e pulchella), Repolho (Brassica spp.), Aipo (Apium graveolens), Beringela (Solanum melongena), Amendoim (Arachis hypogea), Sorgo (Sor-ghum spp.), Aifafa (Medicago sativa), Cenoura (Daucus carota), Feijões (Phaseolus spp. e outros gêneros), Aveias (Avena sativa e strigosa), Ervilhas (Pisum, Vigna e Tetragonolobus spp.), Girassol (Helianthus annuus), Abóbora (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa). Tabaco (Nicotiana spp.), Ara-bidopsis (Arabidopsis thaliana), Grama Turfgrass (Lolium, Agrostis, Poa, Cy-nodon e outros gêneros), Trevo (Trifolium), Ervilhaca (Vicia).

Resistência a glifosato conferida por dgt-28, dgt-32 e dgt-33 aumenta a aplicabilidade de herbicidas de glifosato para uso em estação em muitos sistemas de corte de madeira decídua e perene. Espécies de madeira resisentes a herbicida glifosato aumentam a flexibilidade de uso pós-emergência desses herbicidas sem preocupações com lesão. Desta maneira, dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33 são transformados nas espécies de madeira: carvalho (Alnus spp.), freixo (Fraxinus spp.), espécies aspen e choupo (Po-pulus spp.), faia (Fagus spp.), vidoeiro (Bétula spp.), cerejeira (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), castanheira (Carya spp.), bordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.) e pinheiro (Pinus spp ).

Resistência ao herbicida de glifosato aumenta a aplicabilidade de herbicidas de glifosato para o controle de erva-daninha seletivo em espécies ornamentais e frutíferas. Desta maneira, dgt-28, dgt-32 e dgt-33 são transformados nas espécies ornamentais e frutíferas: rosa (Rosa spp.), sar-ça ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begônia spp.), rododendron (Rhododendron spp.), maçã ácida ou maçã (Malus spp.), pera (Pyrus spp ), pêssego (Prunus spp.) e malmequer (Tagetes spp.).

Exemplo 15: Empilhamento com Outras Características Culturas transgênicas contendo características de resistência a inseto (IR) (Insect Resistance) são prevalentes em plantas de milho, soja e algodão em toda a América do Norte, e uso dessas características está se espalhando por todo o mundo. Culturas transgênicas comerciais cobinando características resisentes a inseto e tolerantes a herbicida (HT) (Herbicide Tolerant) têm sido desenvolvidas por várias companhias de semente. Essas incluem características de Bacillus thuringiensis (por exemplo, toxinas de Bt listadas no website lifesci.sussex.ac.uk, 2006), características de resistência a inseto não-Bt e qualquer uma ou todas as características de HT mencionadas acima. A habilidade em controlar problemas de peste múltiplos através de características de IR é um conceito de produto comercial valioso. No entanto, a conveniência deste conceito de produto será restrita se controle de erva-daninha e controle de inseto forem independentes um do outro.

Dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33, sozinho ou empilhado com uma ou mais características de HT adicionais, sào empilhados com uma ou mais características de input adicionais (por exemplo, resistência a inseto, resistência fúngica ou tolerância a estresse e outros) (vide www.isb.vt.edu). ou através de cruzamento convencional ou em conjunto como um novo e-vento de transformação. Característica(s) de IR é/são empilhadas com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33. Quando da obtenção de uma sequência de codificação de uma característica IR, elementos de expressão (por exemplo, promotor, íntron, 3TJTR, etc) são adicionados e a característica de IR é molecularmente empilhada com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 através de metodologias de DNA recombinante.

As características de IR incluem: Cry1F (Pat. U.S. Nos. 5.126.133; 5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; 6.573.240; e 6.737.273), Cry1A(c) (Pat. U.S. Nos. 6.114.138; 5.710.020; 6.251.656; e 6.229.004), Cry1 F e Cry1A(c) como uma pilha tripla ou com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33, Cry34Ab(1) (Pat. U.S. Nos. 7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246; 6.340.593), Cry35 Ab(1) (Pat. U.S. No. 6.340.593; 7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246) e/ou Cry35Ab(1) e Cry 34Ab(1) como uma pilha tripla com dgt-28, dgt-31, dgt-32 e/ou dgt-33.

Benefícios incluem o controle de erva-daninha aperfeiçoado oferecido por dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33, e descrito em exemplos anteriores, ligado com a habilidade em tratar pestes de inseto e/ou outros estresses agronômicos. Plantas compreendendo tais características empilhadas com dgt-28, dgt-31, dgt-32 e/ou dgt-33 provêem um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aperfeiçoada com a habilidade em controlar flexi-velmente e com custo eficaz qualquer número de questões agronômicas. Características de IR e HT combinadas têm aplicações na maioria das culturas agronômicas e/ou horticulturais/ornamentais e silvicultura. A combinação de dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 e a tolerância a herbicida e resistência a inseto comensuráveis fornecidas por qualquer um dos genes IR de Bt ou não Bt podem ser aplicadas às espécies de cultura listadas aqui. Uso de qualquer um de vários herbicidas comerciais listados aqui em tais culturas é possibilitado por transformação com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 e empilhamento com a característica HT ou característica IR correspondente, ou através de cruzamento convencional ou engenharia genética. Taxas de aplicação específicas de herbicidas representativas dessas químicas são determinadas pelos rótulos de herbicida compilados no livro PCR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados on Une (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer orientações de proteção de cultura comerciais ou acadêmicas tal como o Crop Protection Guide da Agriliance (2005).

Exemplo 16: Característica de DGT Empilhada com uma Característica de AAD em Qualquer Cultura Ao empilhar uma característica de dgt com uma característica de aad (por exemplo, aad-1 descrito na Patente U.S. 7.838.733; ou aad-12 descrito na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482 A2), ou através de cruzamento convencional ou em conjunto como um novo e-vento de transformação, eficácia de controle de erva-daninha, flexibilidade e a habilidade em tratar mudanças de erva-daninha e desenvolvimento de resistência a herbicida são aperfeiçoados.

Transformação de culturas com aad-1 permite que um cultivador aplique seletivamente herbicidas de ariloxialcanoato em culturas monocotile-dôneas. Tais culturas monocotiledôneas terão uma margem maior de segurança para fenoxi auxina. Ainda, fenoxi auxinas podem ser seletivamente aplicadas em culturas dicotiledôneas transformadas com aad-1. Transformação de culturas com aad-12 permite que um cultivador aplique seletivamente herbicidas piridilóxi auxina e ariloxialcanoato em culturas dicotiledôneas para controlar espécies de erva-daninha. Ao empilhar dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 com características de aad-1 ou aad-12, os cultivadores são providos com um espectro mais amplo de herbicidas para o tratamento de ervas-daninhas. Além disso, o uso de combinações de herbicida resulta em mais flexibidade para tratamento de resistência a herbicida dentro de espécies de erva-daninha.

As opções de controle de erva-daninha que seguem são providas para uma planta em que uma característica de dgt e uma característica de aad são empilhadas em qualquer espécie de cultura monocotiledônea ou dicotiledônea: A. Glifosato é aplicado em uma taxa de aplicação pós-emer-gência padrão (420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha) para o controle da maior parte das espécies de erva-daninha de grama e folha larga. As características de dgt podem prover tolerância nessas taxas de aplicação de glifosato. Para o controle de ervas-daninhas de folha larga resistentes a glifosato tais como Conyza canadenses ou ervas-daninhas inerentemente difíceis de controlar com glifosato (por exemplo, Commelina spp.), 280-2240 g ae/ha (por exemplo, 560-1120 g ae/ha) de 2,4-D são aplicados sequencialmente, misturados em tanque ou como uma pré-mistura com gli-fosato para prover controle adicional. Ambos o aad-1 e o aacf-12 proveem tolerância a 2,4-D. Ainda, aad-12 provê tolerância a herbicidas de piridiloxi auxina tal como triclopir e fluroxipir. Os herbicidas de piridiloxi auxina são aplicados para controlar ervas-daninhas de folha larga resistentes a glifosato tais como Conyza canadensis e Commelina spp. Para triclopir, taxas de aplicação variam tipicamente de a partir de 70-1120 g ae/ha, por exemplo, 140-420 g ae/ha. Para fluroxipir, as taxas de aplicação variam tipicamente de a partir de 35-560 g ae/ha, por exemplo, 70-280 ae/ha. B. Glifosato é aplicado em uma taxa de aplicação de pós-emergência padrão (420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha) para o controle da maioria das espécies de erva-daninha de grama e folha larga. Para o controle de espécies de grama resistentes a glifosato tal como Lolium rigidum ou Eleusine indica, 10-200 g ae/ha (por exemplo, 20-100 g ae/ha) de quilazofope são aplicados sequencialmente, misturados em tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para prover controle eficaz. A-ad-1 provê tolerância a quilazofope. Empilhamento de aad-1 em combinação com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 em espécies de cultura resulta em culturas que são tolerantes aos herbicidas descritos acima. C. Glifosato é eficaz no controle de espécies de grama outras que não espécies de erva-daninha de folha larga. Características empilhadas de Aad-1 e dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 permitem a aplicação de taxas eficazes de glifosato para grama (105-840 g ae/ha, por exemplo, 210-420 g ae/ha). 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, por exemplo, 560-1120 g ae/ha) é então aplicado sequencialmente, misturado em tanque ou como uma pré-mistura com taxas eficazes para grama de glifosato para prover controle de erva-daninha de folha larga necessário. Um herbicida AOPP tal como quilazofope a 10-200 g ae/ha (por exemplo, 20-100 g ae/ha e 20-35 g ae/ha) é usado para controle de erva-daninha de grama mais robusto e/ou para retardo do desenvolvimento de gramas resisentes a glifosato. A taxa baixa de glifosato também provê algum benefício para o controle de erva-daninha de folha larga; no entanto, controle principal é de 2,4-D. D. Da mesma maneira, características empilhadas de aad-1 e dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 permitem a aplicação de taxas eficazes de glifosato para grama (105-840 g ae/ha, por exemplo, 210-240 g ae/ha). 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, por exemplo, 560-1120 g ae/ha) é então aplicado sequencialmente, misturado em tanque ou como uma pré-mistura com taxas eficazes de glifosato para grama para prover controle de erva-daninha de folha larga necessário. Triclopyr e fluroxypyr usados nas taxas mencionadas acima são também componentes aceitáveis no regime de tratamento. A taxa baixa de glifosato também provê algum benefício para o controle de erva-daninha de folha larga; no entanto, controle principal é de 2,4-D, triclopir ou fluroxipir.

Uso de um ou mais herbicidas de ariloxi auxina comerciais sozinhos ou em combinação (sequencialmente ou independentemente) é facilitado pela transformação de aad-12 em culturas. Da mesma maneira, o uso de um ou mais herbicidas de fenoxi auxina comerciais sozinhos ou em combinação (sequencialmente ou independemente) com um ou mais herbicidas AOPP comerciais é facilitado por aad-1. Empilhamento de qualquer uma dessas características com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 permite tratamento mais robusto de espécies daninhas. As taxas específicas de utros herbicidas representativos dessas químicas são determinadas pelos rótulos de herbicida compilados no livro CPR (Crop Protection Referencé) ou compilação similar, rótulos compilados on Une (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer orientações de proteção de cultura comerciais ou acadêmicas tal como o Crop Protection Guide da Agriliance (2005).

Exemplo 17: Característica de DGT Empilhada com Característica de AHAS em Qualquer Cultura Características codificando tolerância a herbicida de imidazoli-nona (AHAS) estão atualmente presentes em várias culturas plantadas na América do Norte incluindo, mas não limitado a, milho, arroz, girassol e trigo. Culturas tolerantes a imidazolinona adicionais (por exemplo, algodão e beterraba açucareira) estão sob desenvolvimento. Muitos herbicidas de imidazolinona (por exemplo, imazamox, imazetapir, imazaquina e imazapic) são atualmente usados seletivamente em várias culturas convencionais. O uso de imazetapir, imazamox e do imazapir não seletivo foi facilitado por características de tolerância à imidazolinona tal como AHAS. HTCs tolerantes à imi-dazolinona até agora têm a vantagem de ser não transgênicos. Esta classe química também tem atividade residual no solo significante, desta maneira sendo capaz de prover controle de erva-daninha que vai além do momento de aplicação, diferente de sistemas à base de glifosato ou glufosinato. No entanto, o espectro de ervas-daninhas controladas por herbicida de imidazolinona não é tão amplo quanto glifosato (Agriliance, 2003). Ainda, herbicidas de imidazolinona têm um modo de ação (inibição de acetolactato sintase, ALS) ao qual muitas ervas-daninhas desenvolveram resistência (Heap I (2004). The international survey of herbicide resistant weeds, disponível em www.weedscience.com).

Dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 é empilhado com uma característica de tolerância a imidazolinona, ou através de cruzamento convencional ou em conjunto como um novo evento de transformação, e eficácia de controle de erva-daninha, flexibilidade e habilidade em tratar mudanças de erva-daninha e desenvolvimento de resistência a herbicida são aperfeiçoados.

As opções de controle de erva-daninha que seguem são providas para uma planta em que uma característica de dgt e uma característica de tolerância à imidazolinona são empilhadas em qualquer espécie monoco-tiledônea ou dicotiledônea: A. Imazetapir é aplicado como uma taxa de aplicação de pós-emergência padrão (35 a 280 g ae/ha, por exemplo, 70-140 g ae/ha) para o controle de muitas espécies de erva-daninha de grama e de folha larga. i) Ervas-daninhas de folha larga resistentes a inibidor de ALS tais como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium album (dentre outras, Heap, 2004) são controladas por mistura em tanque de glifosato a 420 até 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha. ii) Espécies de folha larga inerentemente mais tolerantes a herbicidas imidazol tal como Ipomoea spp. são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha. iii) Ervas-daninhas de grama resistentes a inibidor de ALS tais como Sorghum halepense e Lolium spp. são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha. iv) Espécies de erva-daninha de grama inerentemente mais tolerantes (por exemplo, Agropyron repens) são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 até 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g a-e/ha.

Uso de qualquer um dos vários herbicidas de imidazolinonoa comerciais ou herbicida de glifosato, sozinhos ou em combinações múltiplas, é facilitado por transformação de dgt-28 com dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33, e empilhamento com qualquer característica de tolerância à imidazolino-na, ou através de cruzamento convencional ou engenharia genética. Taxas específicas de outros herbicidas representativos dessas químicas são determinadas pelos rótulos de herbicida compilados no livro CPR (Crop Protec-tion Referencé) ou compilação similar, rótulos compilados on tine (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer orientações de proteção de cultura comerciais ou acadêmicas tal como o Crop Protection Guide da Agri-liance (2005).

Exemplo 18: Transformação de Soja Soja transgênica (Gíycine max) contendo um transgene dgt-28 estavelmente integrado foi gerada através de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de nó cotiledonário de soja. Uma linhagem A-grobacteríum desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional foi usada para iniciar transformação.

Transformação mediada por Agrobacterium foi realizada usando um procedimento de nó cotiledonário pela metade modificado de Zeng e outros (Zeng, P., Vadnais, D.A., Zhang, Z., Polacco, J.C. (2004), Plant Cetl Rep., 22(7): 478-482). Em suma, sementes de soja (c.v. Maverick) foram germinadas em meio basal e nós cotiledonários são isolados e infectados com Agrobacterium. Início de broto, alongamento de broto e meio de enraizamento são suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção através de um herbicida foi empregada para inibir o crescimento de brotos não transformados. Brotos selecionados foram transferidos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatação de mudas.

Folinhas terminais de mudas selecionadas foram tratadas topi-camente (técnica de pintura de folha) com um herbicida para avaliar trans-formantes putativos. As mudas avaliadas foram transferidas para a estufa, deixadas aclimatar e então tiveram a folha pintada com um herbicida para reconfirmar tolerância. Essas plantas T0 transformadas putativas foram a-mostradas e análises moleculares foram usadas para confirmar a presença do marcador selecionável herbicida e do transgene dgt-28. Plantas T0 foram deixadas autofertilizar na estufa para produzir semente "TV

Um segundo método de transformação de soja pode ser usado para produzir plantas de soja transgênicas adicionais. Uma linhagem de A-grobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é usada para iniciar transformação.

Transformação mediada por Agrobacterium foi realizada usando um procedimento de metade de semente modificado de Paz e outros (Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T. e Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213). Em suma, sementes de soja maduras foram esterilizadas da noite para o dia com gás de cloro e embebidas com H20 estéril vinte horas antes da transformação de planta mediada por Agrobacterium. As sementes foram cortadas na metade por um corte longitudinal ao longo do hilo para separar a semente e remover o revestimento da semente. O eixo embriônico foi exci-sado e quaisquer ramos/brotos axiais foram removidos do nó cotiledonário. Os explantes de metade da semente resultantes foram infectados com A-grobacterium. Inicio de ramo, alongamento de ramo e meio de enraizamento foram suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção de herbicida foi empregada para inibir o crescimento de ramos não transformados. Ramos selecionados foram transferidos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatação de mudas.

Plantas T0 transformadas putativas foram amostradas e análise molecular foi usada para confirmar a presença do marcador selecionável e do transgene dgt-28. Vários eventos foram identificados como contendo os trangenes. Essas plantas T0 foram avançadas para análise adicional e deixadas autofertilizar na estufa para dar origem à semente "TV

Confirmação de capacidade de herança de dgt-28 para a geração Ti. Capacidade de herança da proteína DGT-28 para a geração Ti foi avaliada em uma de duas maneiras. O primeiro método inclui plantio de semente Ti em meio Metro-mix e aplicação de 411 g ae/ha de IGNITE® 280 SL em plantas germinadas no 1o estágio de crescimento de três folhas. O segundo método consistia em homogeneização de semente para um total de 8 réplicas usando um rolamento e um genogrinder. Testes de fita ELISA para detectar a proteína PAT foram então usados para detectar eventos de herança uma vez que o marcador selecionável estava no mesmo plastídeo que dgt-28. Para qualquer método se uma planta única foi tolerante a glufosinato ou foi detectada com um teste de tira ELISA PAT, o evento demonstrou capacidade de herança para a geração Ti.

Um total de cinco construtos foi avaliado quanto à capacidade de herança conforme anteriormente descrito. Os plasmídeos continham dgt-28 ligado com TraP4, TraP8 e TraP23. Os eventos nos construtos demonstraram 68% de capacidade de herança da proteína PAT:. DGT-28 para a geração T1.

Tolerância a herbicida pós-emergência em soja T-^ transformada com dat-28. Sementes de eventos T-ι que foram determinados ser herdáveis através dos métodos de avaliação anteriormente descritos foram plantadas em meio Metro-mix sob condições de estufa. As plantas foram cultivadas até que o 1o trifoliato fosse totalmente expandido e tratado com 411 g ae/ha de IGNITE® 280 SL para seleção do gene pat conforme anteriormente descrito. Plantas resistentes de cada evento receberam identificadores únicos e a-mostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de glifosato aplicado permitindo um total de 4 réplicas por tratamento quando plantas suficientes existiam. Essas plantas foram comparadas com tabaco Petite havana do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa a 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas de uma faixa de 560-4480 g ae/ha de sal de dimetiamina (DMA) DURANGO®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2% p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias depois do tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação à atrofia visual geral, clorose e necrose. A geração T-, é segregante, então alguma reposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.

Tabela 24. Resultados de pulverização demonstram em 14 DAT (dias após tratamento) tolerância robusta de até 4480 g ae/ha de glifosato de pelo menos um evento de dgt-28 por construto caracterizado. Eventos de cópia única representativos dos construtos proveram, todos, tolerância de até 4480 g ae/ha comparado com o controle negativo Maverick Proteção de dat-28 contra taxas de qlifosato elevadas na geração T2. Um teste de progênie de 45 plantas foi conduzido em duas a cinco linhagens T2 de dgt-28 por construto. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base em análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementes foram plantadas conforme anteriormente descrito. As plantas foram então pulverizadas com 411 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resisentes e sensíveis foram contadas.

Para construtos contendo TraP4 ligado com dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107548), nove de doze linhagens testadas não segregaram, desta ma- neira confirmando linhagens homogêneas na geração T2. Linhagens contendo TraP8 ligado com dgt-28 (pDAB107545) demonstraram duas das quatro linhagens sem quaisquer segregantes e demonstrando herança Mendeliana em pelo menos duas gerações de dgt-28 em soja. Amostras de tecido foram obtidas de plantas resistentes e a proteína DGT-28 foi quantificada através de métodos ELISA padrão. Dados demonstraram uma faixa de proteína DGT-28 média de 32,8-107,5 ng/cm2 para linhagens T2 não segregantes testadas. Linhagens do construto pDAB107553 (TraP23::dgt-28) não foram previamente selecionadas com glufosinato, e a resposta de dose de glifosato foi utilizada ambos para testar homogenosidade e tolerância em taxas elevadas de glifosato. Réplicas das linhagens do construto pDAB107553 foram tolerantes a taxas variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato, e foram então confirmadas ser uma população homogênea e herdável para pelo menos duas gerações.

Taxas de DÜRANGO MDA variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato foram aplicadas a 2-3 sojas trifólias conforme anteriormente descrito. Dados de lesão visual 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram demonstrados na geração Ti.

Tabela 25. Os dados demonstram tolerância robusta do tabaco dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato em duas gerações, comparado com o controle não transformado Exemplo 19: Transformação de Arroz com dgt-28 Em um método exemplar, arroz transgênico (Oryza sativa) contendo um transgene dgt-28 estavelmente integrado é gerado através de transformação mediada por Agrobacterium de sementes de arroz esterilizadas. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é usada para iniciar transformação.

Meios de cultura são ajustados para pH 5,8 com KOH 1 M e solidificados com 2,5 g/l de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Calos em-briogênicos são culturados em placas de Petri de 100 x 20 mm contendo 30 ml de meio semissólido. Mudas de arroz são cultivadas em 50 ml de meio em caixas MAGENTA. Suspensões celulares são mantidas em frascos cônicos de 125 ml contendo 35 mL de meio líquido e giradas a 125 rpm. Indução e manutenção de culturas embriogênicas ocorrem no escuro a 25-26°C e regeneração de planta e cultura de planta integral ocorrem em sala iluminada com um fotoperíodo de 16 h (Zhang e outros, 1996).

Indução e manutenção de calo embriogênico são realizadas em um meio basal NB modificado conforme anteriormente descrito (Li e outros, 1993), em que o meio é adaptado para conter 500 mg/L de glutamina. Culturas em suspensão são iniciadas e mantidas em meio líquido SZ (Zhang e outros, 1998) com a inclusão de 30 g/L de sacarose no lugar de maltose. Meio osmótico (NBO) consistindo em meio NB com a adição de 0,256 M de cada um de manitol e sorbitol. Calo resistente a herbicida é selecionado em meio NB suplementado com o agente seletivo herbicida adequado por 3-4 semanas. Pré-regeneração é realizada em meio (PRH50) consistindo em meio NB com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg/ml de ácido a-naftalenoacético (NAA), 5 mg/l de ácido abscísico (ABA) e herbicida seletivo por 1 semana. Regeneração de mudas segue cultura em meio de regeneração (RNH50) compreendendo meio NB contendo 2,4-D, 0,5 mg/l de NAA e herbicida seletivo até que ramos putativamente transgênicos sejam regenerados. Os ramos são transferidos para meio de enraizamento com sais basais Murashige e Skoog de metade de resistência e vitaminas B5 de Gam-borg, suplementado com sacarose 1% e herbicida seletivo.

Sementes dissecadas maduras de Oryza sativa L. japonica cv Taipei 309 são esterilizadas conforme descrito em Zhang e outros, 1996. Tecidos embriogênicos são induzidos através da cultura de sementes de arroz maduras estéreis em meio NB no escuro. O calo primário de aproximadamente 1 mm de diâmetro é removido do escutelo e usado para iniciar suspensão celular em meio líquido SZ. As suspensões foram então mantidas conforme descrito em Zhang, 1996. Tecidos embriogênicos derivados de suspensão são removidos de cultura líquida 3-5 dias após a subcultura anterior e postos em meio osmótico NBO para formar um círculo de cerca de 2,5 cm de lado a lado em uma placa de Petri e culturados por 4 h antes do bombardeamento. Dezesseis a vinte horas depois do bombardeamento, os tecidos são transferidos de meio NBO para meio de seleção NBH50, assegurando que a superfície de bombardeamento esteja faceando para cima e incubados no escuro por 14-17 dias. Calo recém-formado é então separado dos explantes bombardeados originais e posto próximo do mesmo meio. Seguindo mais 8-12 dias, calo opaco, relativamente compacto, é visualmente identificado e transferido para meio de pré-regeneração PRH50 por 7 dias no escuro. Calo em crescimento, que se torna mais compacto e opaco, é então subculturado em meio de regeneração RNH50 por um período de 14-21 dias sob um fotoperíodo de 16 h. Ramos de regeneração são transferidos para caixas MAGENTA contendo meio MSH50 1/2. Plantas múltiplas regeneradas a partir de um explante único são consideradas irmãs e são tratadas como uma linhagem de planta independente. Uma planta é classificada como positiva para o gene dgt-28 se ela produzir raízes brancas, espessas, e cresce vigorosamente em meio MSH50 1Ζ. Uma vez as mudas tendo atingido o topo das caixas MAGENTA, elas são transferidas para solo em um pote de 6 cm sob umidade 100% por uma semana, e então são levadas para uma câmara de crescimento com um período de luz de 14 h a 30°C e no escuro a 21 °C por 2-3 semanas antes do transplante para potes de 13 cm na estufa. As sementes são coletadas e secas a 37°C por uma semana antes do armazenamento a 4°C.

Análise Tn de arroz dgt-28. Transformantes de arroz transplantados obtidos através de um método de transformação de Agrobacteríum foram transplantados em meio e aclimatados a condições de estufa. Todas as plantas foram amostradas para detecção por PCR de dgt-28 e os resultados demonstram vinte e dois eventos positivos de PCR para pDAB110827 (JvaP8..dgt-28) e um mínimo de dezesseis eventos positivos de PCR para pDAB110828 (TraP23v.dgt-28). Análise Southern para dgt-28 dos eventos positivos para PCR demonstrou eventos simples (1-2 cópias) para ambos os construtos. Expressão de proteína de eventos To selecionados demonstrou faixas de expressão de proteína DGT-28 a partir de abaixo dos níveis de detecção até 130 ng/cm2 Eventos T0 selecionados do construto pDAB110828 foram tratados com 2240 g ae/ha de DURANGO DMA® conforme anteriormente descrito e avaliados 7 e 14 dias depois do tratamento. Os dados demonstraram tolerância robusta para a taxa de glifosato aplicada. Todas as plantas positivas para PCR foram deixadas produzir semente Ti para caracterização adicional.

Capacidade de herança de Dpt-28 em arroz. Um teste de progê-nie de 100 plantas foi conduzido em quatro linhagens T-i de dgt-28 de construto pDAB110827 contendo o peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8. As sementes foram plantadas em potes cheios com meio. Todas as plantas foram então pulverizadas com 560 g ae/ha de DURANGO DMA® para a seleção do gene dgt-28 conforme anteriormente descrito. Depois de 7 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Duas das quatro linhagens testadas para cada construto segregaram como uma característica Mendeliana dominante (3R:1S), de locus único, conforme determinado através de análise de Quadrado Chi. Dgt-28 é um gene de resistência a glifosato herdável em espécies múltiplas.

Tolerância a herbicida pós-emerqência em arroz Ti_ transformado com dgt-28. Plantas resistentes Ti de cada evento usadas no teste de progênie receberam identificadores únicos e foram amostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas para cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Essas plantas foram comparadas contra arroz kitaake do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa ajustado a 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de uma faixa de 560-2240 g ae/ha de DURANGO DMA®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias depois do tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação a atrofiamento visual, clorose e necrose gerais. A geração T1 é segregante, então alguma resposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.

Os resultados de pulverização demonstram em 7 DAT (dias depois do tratamento) que lesão vegetativa mínima para taxas elevadas de glifosato foi detectada (dados não mostrados).

Tabela 26. Dados de lesão visual em 14 DAT demonstram menos do que 15% de lesão visual média até 2240 g ae/ha de glifosato Detecção de proteína DGT-28 foi avaliada para réplicas de todas as quatro linhagens T-\ testadas de pDAB110827. Os dados demonstraram fai- xas de proteína médias DGT-28 de a partir de 20-82 ng/cm2 e 21-209 ng/cm2 para réplicas hemizigotas e homozigotas, respectivamente. Esses resultados demonstraram expressão de proteína estável para a geração Ti e tolerância de arroz dgt-28 até 2240 g ae/ha de glifosato seguindo uma aplicação de 560 g ae/ha de glifosato usado para seleção.

Exemplo 20: Transformação de Grama TurfGrass com dgt-28 Transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens do transgene dgt-28 em grama bentgrass trepadeira é obtida através de calo embriogênico iniciado a partir de sementes {c.v. Penn-A-4). Vide "Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation" (Luo e outros, 2004).

As células de calo são infectadas com uma linhagem de A. tumefaciens carregando um vetor superbinário que contém um transgene resistente a herbicida (por exemplo, dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33) direcionado por um promotor específico monocotiledôneo. A eficiência de transformação estável geral varia de a partir de 18% a 45%. Southern blot e análise genética confirmam integração de transgene dentro do genoma de bentgrass trepadeira e transmissão normal e expressão estável do transgene na geração Ti. Todos os eventos de transformação independentes carregam uma a três cópias do transgene, e a maioria (60-65%) contém apenas uma única cópia do transgene sem quaisquer rearranjos aparentes.

Sementes maduras são descascadas com lixa e a superfície esterilizada em alvejante Clorox® 10% (v/v) (hipoclorito de sódio 6%) mais Tween 20 0,2% (v/v) (Polisorbato 20) com agitação vigorosa por 90 min. Seguindo enxágue cinco vezes em água destilada estéril, as sementes são postas em meio de indução de calo (sais e vitaminans basais MS, 30 g/l de sacarose, 500 mg/l de hidrolisato de caseína, 6,6 mg/l de ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba), 0,5 mg/l de 6-benzilaminopurina (BAP) e 2 g/l de Phyta-gel. O pH do meio é ajustado para 5,7 antes de autoclave a 120°C por 20 min).

As placas de cultura contendo explantes de semente preparados são mantidas no escuro em temperatura ambiente por 6 semanas. Calos embriônicos são visualmente selecionados e subculturados em meio de indução de calo fresco no escuro em temperatura ambiente por 1 semanas antes do cultivo.

Um dia antes da infecção mediada por Agrobacterium, o calo embriogênico é dividido em pedaços de 1 a 2 mm e posto em meio de indução de calo contendo 100 μΜ de acetosiringona. Uma alíquota de 10 pl de suspensão de Agrobacterium (OD=1,0 a 660 nm) que carrega o transgene dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 é então aplicada a cada pedaço de calo, seguido por 3 dias de co-cultivo no escuro a 25°C. O calo é então transformado e culturado por 2 semanas em meio de indução de calo mais 125 mg/ml de cefotaxima e 250 mg/l de carbenicilina para suprimir crescimento bactéria no.

Seleção de plantas transgênicas ocorre quando o calo é levado para meio de indução de calo contendo 250 mg/l de cefotaxima e um herbicida. O material de calo é mantido neste meio por 8 semanas com um intervalo de subcultura de seleção de 3 semanas. O processo de seleção é realizado em temperatura ambiente no escuro.

Para regeneração de planta, os eventos de calo de proliferação resistentes a herbicida são primeiro levados para meio de regeneração (meio basal MS, 30 g/l de sacarose, 100 mg/l de mio-inositol, 1 mg/l de BAP e 2 g/l de Phytagel) suplementado com cefotaxima e um herbicida para seleção. Esses calos são mantidos no escuro em temperatura ambiente por 1 semana e então levados para a luz por 2-3 semanas para desenvolver ramos.

Os ramos desenvolvidos são separados e transferidos para meio de regeneração livre de hormônio contendo um herbicida e cefotaxima para promover crescimento de raiz enquanto mantendo pressão de seleção e suprimindo quaisquer células de Agrobacterium restantes. Plantinhas com raízes bem desenvolvidas (3-5 semanas) são então transferidas para o solo e cultivadas ou na estufa ou no campo.

Plantas transgênicas são mantidas no tempo em um viveiro (3-6 meses) até o solstício de inverno em dezembro. As plantas vernalizadas são então transferidas para a estufa e mantidas a 25°C sob um fotoperíodo de 16/8 h e circundadas por plantas controle não transgênicas que isolam fisicamente as plantas transgênicas de outras fontes de pólen. As plantas transgênicas começam a florescer 3-4 semanas depois de serem levadas de volta para e estufa. Essas plantas são cruzadas com o pólen das plantas controle circundantes. As sementes coletadas de cada planta individual transgênica são germinadas no solo a 25°C e plantas Ti são cultivadas na estufa para análise adicional.

Outras gramas são transformadas com dgt-28 de acordo com o protocolo descrito, incluindo Annual meadowgrass (Poa annua), Bahiagrass, Bentgrass, Bermudagrass, Bluegrass, Bluestems, Brachiaría, Bromegrass, Browntop bent (Agrostis capillaries), Buffalograss, Canary grass, Carpet-grass, Centipedegrass, Chewings fescue (Festuca rubra commutate), Crab-grass, Creeping bent (Agrostis stolonifera), Crested hairgrass (Koeleria ma-crantha), Dallisgrass, Fescue, Festolium, Hard/sheeps fescue (Festuca ovina), Gramagrass, Indiangrass, Johnsongrass, Lovegrass, misturas (Equine, Pasture, etc.), Gramas Nativas, Orchardgrass, Perennial ryegrass (Lolium perenne), Redtop, Rescuegrass, Ryegrass anual e perene, Slender creeping red fescue (Festuca rubra trichophylla), Meadowgrass de caule macio (Poa pratensis), St. Augustine, Strong creeping red fescue (Festuca rubra rubra), Sudangrass, Switchgrass, Tall fescue (Festuca arundinacea), Tufted hairgrass (Deschampsia caespitosa), Turfgrasses, Wheatgrass e Zoysiagrass. Exemplo 21: Transformação de Brassica spp. com Característica de DGT

Um gene dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 conferindo resistência a glifosato é usado para transformar Brassica napus var. Nexera® 710 com transformação mediada por Agrobacterium.

Sementes de Brassica napus são esterilizadas na superfície com alvejante comercial 10% por 10 minutos e enxaguadas 3 vezes com água destilada estéril. As sementes são então postas em uma concentração de metade de meio basal MS (Murashige e Skoog, 1962) e mantidas sob regime de crescimento ajustado a 25°C e um fotoperíodo de 16 h luz/8 h escuro.

Segmentos hipocotiledôneos (3-5 mm) são excisados de mudas de 5-7 dias e postos em meio de indução de calo K1D1 (meio MS com 1 mg/l de quinetina e 1 mg/l de 2,4-D) por 3 dias como pré-tratamento. Os segmentos são então transferidos para placa de Petri e tratados com uma linhagem de Agrobacterium tumefaciens contendo um construto compreendendo dgt-28. A Agrobacterium tumefaciens é cultivada da noite para o dia a 28°C no escuro em um agitador a 150 rpm e subsequentemente ressuspen-sa no meio de cultura.

Depois de 30 minutos de tratamento dos segmentos hipocolile-dôneos com Agrobacterium, esses segmentos são postos de volta no meio de indução de calo por 3 dias. Seguindo co-cultivo, as sementes são postas em K1D1TC (meio de indução de calo contendo 250 mg/l de Carbenicilina e 300 mg/l de Timetina) para uma semana de recuperação. Alternativamente, os segmentos são postos diretamente em meio de seleção K1D1H1 (meio acima com um herbicida). Carbenicilina e Timetina são os antibióticos usados para matar a Agrobacterium. O agente de seleção permite o crescimento das células transformadas.

Amostras de calo de eventos independentes isolados são testadas através de PCR. Amostras que testam positivo quanto à presença de dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33 são confirmadas e avançadas para meio para regeneração. Os segmentos hipocotiledôneos com calo são então postos em meio de regeneração de ramo B3Z1H1 (meio MS, 3 mg/l de benzila-mino purina, 1 mg/l de Zeatina, 0,5 gm/l de MES [ácido 2-(N-morfolíno)etano sulfônico], 5 mg/l de nitrato de prata, herbicida seletivo, Carbenicilina e Ti-mentina). Depois de 3 semanas os ramos começam a regeneração. Segmentos hipocotiledôneos junto com os ramos são transferidos para meio B3Z1H3 (meio MS, 3 mg/l de benzilamino purina, 1 mg/l de Zeatina, 0,5 gm/l de MES [ácido [2-(N-morfolino)etano sulfônico], 5 mg/l de nitrato de prata, herbicida seletivo, Carbenicilina e Timentina) por mais 3 semanas.

Os ramos são excisados de segmentos hipocotiledôneos e transferidos para meio de alongamento de ramo MESH10 (MS, 0,5 gm/l de MES, herbicida seletivo, Carbenicilina, Timentina por 2-4 semanas. Os ramos análogos são culturados para indução de raiz em MSI.1 (MS com 0,1 mg/l de ácido Indolbutírico). Uma vez as plantas tendo estabelecido um sistema de raiz, as plantas são transplantadas para o solo. As plantas são a-climatadas sob condições ambientais controladas em um Conviron® por 1-2 semanas antes da transferência para a estufa.

As plantas T0 transformadas são autopolinadas na estufa para obter semente T-i. Plantas T0 e progênie T-ι são pulverizadas com uma faixa de concentrações de herbicida de glifosato para estabelecer o nível de proteção pelo gene dgt-28, dgt-31, dgt-32 ou dgt-33.

Exemplo 22: Transformação de Tabaco com dgt-28 Pedaços de folha de tabaco (cv. Petit havana) foram transformados usando Agrobacterium tumefaciens contendo o transgene dgt-28. Colônias simples contendo o plasmídeo que contém o transgene dgt-28 foram inoculadas em 4 mL de meio YEP contendo espectinomicina (50 pg/mL) e estreptomicina (125 pg/mL) e incubadas da noite para o dia a 28°C em um agitador a 190 rpm. A cultura de semente 4 mL foi subsequentemente usada para inocular uma cultura de 25 mL do mesmo meio em um frasco balão Er-lenmeyer de 125 mL. Esta cultura foi incubada a 28°C agitando a 190 rpm até atingir um OD60ode ~1,2. Dez ml de suspensão de Agrobacterium foram então postos em placas de Petri® de 60 x 20 mm estéreis.

Pedaços de folha recém-cortados (0,5 cm2) de plantas assepti-camente cultivadas em meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, K.S.) com 30 g/L de sacarose em PhytaTrays® (Sigma, St. Louis, MO) foram embebidos em 10 mL de cultura da noite para o dia de Agrobacterium por alguns minutos, secas com blot em papel filtro estéril e então postos no mesmo meio com a adição de 1 mg/L de ácido indolacético e 1 mg/L de 6-benzilamino purina. Três dias depois, pedaços de folha co-cultivados com Agrobacterium carregando o transgene dgt-28 foram transferidos para o mesmo meio com 5 mg/L de Basta® e 250 mg/L de cefotaxima.

Depois de 3 semanas, mudas T0 individuais foram transferidas para meio MS com 10 mg/L de Basta® e 250 mg/L de cefotaxima por mais 3 semanas antes do transplante para solo e transferência para a estufa. Plantas Tq selecionadas (conforme identificado usando protocolos de análise mo- lecular descritos acima) foram deixadas autopoiinar e semente foi coletada de cápsulas quando elas estavam completamente secas. Mudas "Π foram avaliadas quanto à zigosidade e expressão de gene repórter (conforme descrito abaixo) e plantas selecionadas contendo o transgene dgt-28 foram i-dentificadas.

As plantas foram levadas para a estufa através de lavagem do ágar das raízes, transplante para o solo em potes quadrados de 13,75 cm, colocação do pote em uma bolsa Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), colocação de água da torneira no fundo da bolsa e colocação em luz indireta em uma estufa a 30°C por uma semana. Depois de 3-7 dias, a bolsa foi aberta; as plantas foram fertilizadas e deixadas crescer na bolsa aberta até que as plantas fossem aclimatadas na estufa, momento quando a bolsa foi removida. As plantas foram cultivadas sob condições de estufa aquecida comuns (27°C dia, 24°C noite, 16 horas dia, luz natural mínima + suplementar = 1200 pE/m2s1).

Antes da propagação, plantas To foram amostradas para análise de DNA para determinar o número de cópia de dgt-28 de inserção através de PCR de tempo real. Tecido fresco foi posto em tubos e liofilizado a 4°C por 2 dias. Depois do tecido ter secado totalmente, uma conta de tungstênio (Valenite) foi posta no tubo e as amostras foram submetidas a 1 minuto de trituração a seco usando um moedor de conta Kelco. O procedimento de isolamento de DNA DNeasy® padrão foi então seguido (Qiagen, DNeasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi então tingida com Pico Green (Molecular Probes P7589) e lida no fluorômetro (BioTek®) com padrões conhecidos para obter a concentração em ng/μΙ. Um total de 100 ng de DNA total foi usado como molde. A reação de PCR foi realizada no termocicliza-dor 9700 Geneamp® (Applied Biosystems), através de submissão das amostras a 94°C por 3 minutos e 35 ciclos de 94°C por 30 segundos, 64°C por 30 segundos e 72°C por 1 minuto e 45 segundos seguido por 72°C por 10 minutos. Produtos de PCR foram analisados através de eletroforese em um gel de agarose 1% tingido com EtBr e confirmados através de Southern blots.

Cinco a nove eventos positivos para PCR com 1-3 cópias de ge- ne dgt-28 de 3 construtos contendo uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto diferente (TraP4, TraP8 e TraP23) foram gerados e levados para a estufa.

Todas as plantas positivas para PCR foram amostradas para quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padrão. Proteína DGT-28 foi detectada em todas as plantas positivas para PCR e uma inclinação para um aumento em concentração de proteína foi notada com número de cópia alto de dgt-28.

Capacidade de herança de aad-12 (V1) em tabaco. Um teste de progênie de 100 plantas foi conduzido em cinco linhagens T-t de dgt-28 por construto. Os construtos continham uma das seguintes sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto: TraP4, Trap8 ou TraP23. As sementes foram estratificadas, semeadas e transplantadas com relação muito similar àquela do procedimento de Arabidopsis exemplificado acima, com a exceção que plantas nulas não foram removidas por uma seleção inicial antes do transplante. Todas as plantas foram então pulverizadas com 280 g ae/ha de IG-NITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas.

Quatro das cinco linhagens testadas para cada construto segregaram como uma característica Mendeliana dominante, de locus único (3R:1S), conforme determinado através de análise do quadrado Chi. Dgt-28 é um gene de resistência a glifosato herdável em espécies múltiplas.

Tolerância a herbicida pós-emerqência em tabaco Ti transformado com dgt-28. Plantas resistentes T1 de cada evento usadas no teste de progênie receberam identificadores únicos e amostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Essas plantas foram comparadas contra tabaco Petite havana do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa ajustado a 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de uma faixa de 560-4480 g ae/ha de DURANGO DMA®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2% p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias depois do tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação a atrofiamento, clorose e necrose visuais gerais. A geração Ti é segregante, então alguma resposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.

Resultados de pulverização demonstraram em 7 DAT (dias depois do tratamento) lesão vegetativa mínima para taxas elevadas de glífosa-to que foram detectadas (dados não mostrados). Seguindo 14 DAT, dados de lesão visual demonstram lesão aumentada com eventos de cópia única do construto contendo TraP4 comparado com eventos de cópia única dos construtos TraP8 e TraP23. Tabela 27.

Tabela 27. Em uma taxa de 2240 g ae/ha de glifosato, uma lesão média de 37,5% foi demonstrada com o evento contendo TraP4, em que eventos contendo TraP8 e TraP23 demonstraram uma lesão média de 9,3% e 9,5%, respectivamente.

Esses resultados demonstraram tolerância de dgt-28 até 4480 g ae/ha de glifosato, bem como diferenças em tolerância provida por sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto ligadas ao gene dgt-28.

Proteção de Dgt-28 contra taxas de glifosato elevadas na geração T2. Um teste de progênie de 25 plantas foi conduzido em duas a três linhagens T2 de dgt-28 por construto. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base em análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementas foram estratificadas, semeadas e transplantadas conforme anteriormente descrito. Todas as plantas foram então pulverizadas com 280 g ae/ha de Ignite 280 SL para a seleção de marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Todas as linhagens testadas para cada construto não segregaram, então confirmando linhagens homogêneas na geração T2 e de- monstrando herança Mendeliana em pelo menos duas gerações de dgt-28 em tabaco.

Taxas de DURANGO DMA® variando de 420-3360 g ae/ha de glifosato foram aplicadas a tabaco de 2-3 folhas conforme anteriormente descrito. Dados de lesão visual 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram mostrados na geração T1. Resultados foliares de linhagens de duas cópias do construto contendo TraP4 demonstraram tolerância similar àquela de linhagens de TraP8 e TraP23 de cópia única (dados não mostrados).

Tabela 28. Linhagens de cópia única do construto contendo TraP4 com dgt-28 demonstraram lesão aumentada comparado com linhagens de construtos contendo TraP8 e TraP23 com dgt-28 Os dados demonstraram tolerância robusta de tabaco com dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato em duas gerações comparado com o controle não transformado.

Plantas selecionadas de cada evento foram amostradas antes das aplicações de glifosato para análises da proteína DGT-28 através de ELISA DGT-28 padrão. Dados demonstraram expressão de proteína média DGT-28 das linhagens simples (1-2 cópia) nos construtos variando de 72,8-114,5 ng/cm2. Dados demonstram que dgt-28 é proteína de expressão na geração T2 de tabaco transformado e dados de tolerância confirmam proteína DGT-28 funcional.

Empilhamento de dgt-28 para aumentar espectro de herbicida em tabaco (cv. Petit havana). Plantas dgt-28 (pDAB 107543 e pDAB 107545) e aad-12 v1 (pDAB3278) homozigotas (vide PCT/US2006/042133 para a última) foram ambas reciprocamente cruzadas e semente Fi foi coletada. A semente Fi de dois cruzamentos recíprocos de cada gene foi estratificada e tratada 6 reps de cada cruzamento com 1120 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120 g ae/ha 2,4-D (seletivo para gene aad-12) ou uma mistura de tanque dos dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram graduadas em 14 DAT. Os resultados de pulverização são mostrados na Tabela 29.

Tabela 29. Resposta de aad-12 e dgt-28 Fi Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser empilhado com sucesso com aad-12 (v1), então aumentando os herbicidas de espectro que podem ser aplicados à cultura de interesse (glifosato + ácido fenoxiacético para dgt-28 e add-12, respectivamente). Em produção de cultura em que é difícil controlar ervas-daninhas de folha larga ou biotipos de erva-daninha resistentes existem, a pilha pode ser usada como um meio de controle de erva-daninha e proteção da cultura de interesse. Características de input ou output adicionais poderíam ser também empilhadas com o gene dgt-28. Exemplo 23: Resistência a Glifosato em Trigo Produção de vetores binários codificando DGT-28. Vetores binários contendo cassetes de expressão de DGT-28 e seleção de PAT foram projetados e montados usando habilidades e técnicas geralmente conhecidas no campo. Cada cassete de expressão de DGT-28 continha o promotor, região não traduzida 5’ e íntron do gene da Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e outros, Plant Physiol. 1992, 100 1503-07), seguido por uma sequência de codificação consistindo em um de quatro peptídeos de trânsito (TraP4, TraP8, TraP23 ou TraP5) fundido à extremidade 5’ de uma versão sintética do gene da 5-enolpiruvatochiquimato-3-fosfato sintase (DGT-28), que tinha sido otimizado no códon para expressão em plantas. O cassete de expressão de DGT-28 terminou com uma região não traduzida 3’ (UTR) compreendendo o terminador transcripcional e sítio de poliadenilação de um gene de lipase (Vp1) de Z. mays (Paek e outros, Mol. Cells 1998 30;8(3) 336-42). O cassete de seleção de PAT compreendido do promotor, região não traduzida 5’ e íntron do gene da Actina (Act1) de Oryza sativa (McElroy e outros, The Plant Cell 1990 2(2) 163-171), seguido por uma versão sintética do gene da fosfinotricino acetil transferase (PAT) isolado de Streptomyces viridochromogenes, que tinha sido otimizado no códon para expressão em plantas. O gene de PAT codifica uma proteína que confere resistência a inibidores de glutamina sintetase compreendendo fosfinotricina, glufosinato e bialafos (Wohlleben e outros, Gene 1998, 70(1), 25-37). O cassete de seleção foi terminado com a UTR 3’ compreendendo o terminador transcripcional e sítios de poliadenilação do gene 35s de vírus do mosaico da couve flor (CaMV) (Chenault e outros, Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396). O cassete de seleção foi sintetizado por um vendedor de síntese de gene comercial (GeneArt, Life Technologies) e clonado em um vetor binário da Gateway. Os cassetes de expressão de DGT-28 foram subclonados em pDONR221. O clone ENTRY resultante foi usado em uma reação LR Clonase II (Invitron, Life Technologies) com o vetor binário da Gateway codificando o cassete de expressão de fosfinotricino acetil transferase (PAT). Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente avaliadas através de digestão por restrição de DNA purificado usando endonucleases de restrição obtidas da New England BioLabas (NEB; Ipswich, MA) e Pro-mega (Promega Corporation, Wl). Preparações de DNA de plasmídeo foram realizadas usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) ou o Pure Yield Plasmid Maxiprep System (Promega Corporation, Wl), seguindo as instruções dos fornecedores. DNA de plasmídeo de clones selecionados foi sequenciado usando o protocolo de sequenciamento de ciclo ABI Sanger Sequencing e Bid Dye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, Life Technologies). Dados de sequência foram montados e analisados usando o software SEQUENCHER® (Gene Codes Corporation, Ann. Arbor, Ml).

Os quatro clones de expressão binários resultantes: pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) e pDAS000125 (TraP5-DGT28) foram cada um transfor- mados em linhagem de Agrobacterium tumefaciens EHA105.

Produção de eventos de trigo transqênico com construto de expressão de dqt-28. Plantas de trigo transgênicas expressando um dos quatro construtos de expressão de DGT-28 foram geradas através de transformação mediada por Agrobacterium usando a linhagem de trigo doadora Bob-white MPB26RH, seguindo um protocolo similar a Wu e outros, Transgenic Research 2008, 17:425-436. Eventos transgênicos T0 putativos foram selecionados quanto à tolerância à fosfinotricina (PTT), o fenótipo conferido pelo marcador selecionável PAT e transferidos para o solo. As plantas T0 foram cultivadas sob condições de estufa e semente Ti foi produzida. No geral, cerca de 45 eventos de T0 independentes foram gerados para cada construto de expressão de DGT-28.

Resistência a qlifosato em eventos de trigo dqt-28 de trigo To. Eventos T0 foram deixados aclimatar na estufa e foram cultivados até 2-4 folhas de aparência normal, novas, terem emergido da flor (isto é, plantas que transicionaram de cultura de tecido para condições de cultivo em estufa). As plantas foram cultivadas a 25°C sob 12 horas de luz suplementar na estufa até a maturidade. Uma avaliação inicial de tolerância a glifosato e a-nálise Taqman foi completada em plantas Ti cultivadas sob as mesmas condições que anteriormente descrito. Os dados permitiram que determinação de eventos Ti herdáveis fosse caracterizada adicionalmente. Seis eventos Ti de pouca cópia (1-2 cópias) e dois de cópia múltipla foram replantados sob condições de estufa e cultivados até o estágio de 3 folhas. Plantas T-i foram pulverizadas com uma formulação comercial de glifosato (Durango DMA®) de uma faixa de 420-3360 g ae/ha, que é capaz de lesionar signifi-cantemente linhagens de trigo não transformadas. A adição de sulfato de amônio 2% p/v foi incluída na aplicação. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >75% de lesão ao controle não transformado Bob White MPB26RH. Herbicida foi aplicado.

Neste exemplo, as aplicações de glifosato foram utilizadas para ambas a determinação de segregação do gene dgt-28 na geração T-ι bem como demonstração de tolerância a níveis altos de glifosato. A resposta das plantas é apresentada em termos de uma escala de lesão visual 21 dias a-pós tratamento (DAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo menos do que 25% de lesão visual (4), 25%-50% de lesão visual (3), 50%-75% de lesão visual (2) e mais do que 75% de lesão (1). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada constru-to usado para transformação de trigo. A faixa de classificação de resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Trigo não transformado, do tipo selvagem (c.v. Bob White MPB26RH), serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração Ti plantas hemizi-gotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas vão conter metade da dose do gene que plantas homozigotas, desta maneira variabilidade de resposta a glifosato pode ser esperada na geração T-i.

Os resultados das plantas de trigo dgt-28 Ti demonstraram que tolerância a glifosato foi obtida em taxas de até 3360 g ae/ha com os peptí-deos de trânsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23. Tabela 30. Os dados são de um evento Ti de pouca cópia, mas são representativos da população para cada construto.

Tabela 30. Resposta de eventos de trigo dgt-28 T-, de pouca cópia a glifosato 21 dias após tratamento Em 21 DAT, plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que segregaram como uma característica Mendeliana dominante (3R:1S), de locus único, conforme determinado através de análise de Chi quadrado. Tabela 31. Esses dados demonstram que dgt-28 é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiiedônea.

Tabela 31. Porcentagem de eventos dgt-28 Ti por construto que demonstraram capacidade de herança de uma maneira Mendeliana com base em uma seleção com glifosato em taxas variando de a partir de 420-3360 g ae/ha Confirmação molecular de plantas transqênicas To para integração de T-DNAs codificando DGT-28. DNA genômico foi extraído de material de folha seco por congelamento de todas as plantas de trigo T0 putativas. Tecido de folha recém-coletado foi congelado rapidamente em nitrogênio líquido e seco por congelamento por 24 h em um Labconco Freezone 4.5® (Labconco, Kansas City, MO) a -40°C e 133 x 10 3 mBar de pressão. O material liofilizado foi submetido à extração de DNA usando o estojo DNeasy® Plant DNA Extraction Mini (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. DNA de cada planta T0 foi testado quanto à presença-ausência de linhagem de Agrobacterium tumefaciens de transição e quanto ao número de cópias integradas do T-DNA codificando DGT-28. A presença-ausência de linhagem de A. tumefaciens foi realizada usando um ensaio Taqman® qPCR duplex para amplificar o gene da ubiquitina endógeno (iniciadores a-vançado e reverso e sonda: 5’ GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3’ (SEQ ID NO:85; Iniciador avançado) 5’ CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3’ (SEQ ID NO:86; Iniciador reverso) 5’ TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3’ (SEQ ID NO:87; Sonda) do genoma de trigo e virC de pTiBo542: 5’ CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3’ (SEQ ID NO:88; Iniciador avançado) 5’ CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3’ (SEQ ID NO:89; Iniciador reverso) 5’ TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3’ (SEQ ID NO:90; Sonda). O número de cópias de T-DNA integrado foi estimado usando um ensaio Taqman® qPCR duplex seguindo o procedimento de Livak e S-chmittgen (Methods 2001 25:402-8). O ensaio amplificou o gene da puroin-dolina-b (Pínb) de cópia única endógeno no genoma de trigo hexaploide (Gautier e outros, Plant Science 2000 153, 81-91): 5’ ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3’ (SEQ ID NO:91; Iniciador avançado) 5’ TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3’ (SEQ ID NO:92; Iniciador reverso) 5’ ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3’ (SEQ ID NO:93; Sonda) e a região do promotor da actina Actin (Acf1) presente no T-DNA: 5’ CTCCCGCGCACCGATCTG 3’ (SEQ ID NO:94; Iniciador avançado) 5’ CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3’ (SEQ ID NO:95; Iniciador reverso) 5’ AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3’ (SEQ ID NO:96; Sonda).

Plantas que não amplificaram um produto de virC e das quais produtos corretos foram amplificados com iniciadores para o promotor da ubiquitina e actina do arroz endógenas foram classificadas como transgêni-cas. O número de T-DNA integrado foi estimado de a partir de 2AAc(T), de acordo com Livak e Schmittgen (Methods, 2001, 25:402-8). No geral, cerca de 95% de todas as plantas T0 tinham pelo menos uma cópia integrada do T-DNA. Tabela 32.

Tabela 32. Número de plantas T0 independentes geradas e número estimado de T-DNA integrado codificando DGT-28 Desenvolvimento de ensaios de ziqosidade de PCR para rastre-amento de herança de transqene. As sequências flanqueando os sítios de integração de T-DNA foram identificadas através de digestão de DNA genô- mico purificado com oito endonucleases de restrição, seguido por ligação de adaptadores de filamento duplo específicos para as sobreposições criadas pelas endonucleases de restrição. Seguindo ligação do adaptador, PCR foi realizada com um iniciador biotinilado ou para a extremidade 3’ ou 5’ do T-DNA codificando DGT-28 e um iniciador para cada adaptador. Os produtos de PCR foram capturados e purificados em contas Ampure Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) (Agen-court Bioscience Corporation, Beckman Coulter Company). Uma PCR aninhada foi então realizada e os produtos de amplificação foram sequenciados Sanger usando química BigDye® v3.1 (Applied Biosystems) em uma plataforma de eletroforese capilar automática ABI3730x1®. Análise de sequência realizada usando software Sequencer (GeneCodes, Ann. Arbor, Ml) foi usada para gerar (em que possível) uma sequência de consenso. A sequência de consenso e singulares resultantes foram usados como pesquisas BlastN contra contíguos de sequência de pesquisa de genoma montados para braços de cromossomo classificado por fluxo de variedade de trigo Chinese S-pring (www.wheatqenome.org) para determinar os cromossomos em que integração de T-DNA tinha ocorrido e permitir o projeto de iniciadores específicos de subgenoma para o desenvolvimento de ensaios de zigosidade de PCR.

Dois ensaios de PCR foram desenvolvidos para cada evento transgênico para permitir que herança de transgene fosse rastreada em gerações subsequentes. O primeiro ensaio (daqui em diante referido como PCR out-out) foi projetado para amplificar através do sítio de integração de T-DNA. Amplificação específica de subgenoma neste ensaio foi obtida usando PCR on-off com iniciadores projetados para posicionar a penúltima base (que continha uma ligação fosforotioato) na variação de sequência de nucle-otídeo que distinguia o locus direcionado das cópias duplicadas (ambos homólogos e parálogos) do locus em qualquer outro local no genoma do trigo. O segundo ensaio (daqui em diante referido como PCR in-out) foi projetado para amplificar a partir do T-DNA para a sequência endógena. Este ensaio utilizou um dos iniciadores da PCR out-out e um iniciador projetado para a extremidade 3’ ou 5’ dos T-DNAs codificando DGT-28. Os iniciadores de PCR foram projetados para serem dentre 18 e 27 nucleotídeos de comprimento e terem uma temperatura de fusão de 60 a 65°C, ótima 63°C. Ambos os ensaios de PCR out-out e in-out foram realizados em um volume de reação de 25 pl com dNTP 0,2 mM, tampão de PCR 1x Phusion (New England Biolabs), MgCI2 1,5 mM, polimerase de DNA 0,5U Hotstart Phusion DNA (New England BioLabs), DNA genômico purificado 25 ng e 0,4 μΜ de cada iniciador. Condições de ciclização de PCR foram 98°C por 30 s, então (98°C por 10 s, 65°C por 20 s, 72°C por 60 s) para 40 ciclos. A zigosidade de plantas transgênicas foi designada conforme mostrado na Tabela 33.

Tabela 33. Eventos transgênicos para os quais ensaios de PCR de zigosidade foram desenvolvidos e sequências de iniciador usadas para PCR out-out e in-out Avaliação fenotípica de plantas transqênicas ΊΠ quanto à tolerância a qlifosato. Para determinar se eventos transgênicos com construtos de expressão de DGT-28 exibiam tolerância a glifosato, plantas Ti derivadas de eventos individuais foram fenotipicamente avaliadas sob condições em estufa. Duas avaliações genotípicas foram realizadas. Na primeira avaliação (preliminar), eventos transgênicos (com semente Ti suficiente para ambas as avaliações fenotípicas) foram avaliados quanto à tolerância a glufosinato e glifosato para confirmar expressão de DGT-28 e estabelecer a ordem de classificação para tolerância a herbicida dentre os eventos. Na segunda avaliação (detalhada), eventos transgênicos selecionados foram avaliados quanto à tolerância a glifosato em taxas de dose de pulverização diferentes para estabelecer o nível de tolerância a herbicida conferida nos eventos e entre construtos de expressão de DGT-28.

Doze sementes ΤΊ por evento selecionado e três réplicas (12 sementes cada) da linhagem de trigo doadora não transformada Bobwhite MPB26RH foram semeadas em potes de 85 mm e cultivadas para o estágio de 2 folhas sob condições bem regadas a 25°C com luz suplementar provendo um fotoperíodo de 12 horas. Os potes foram postos em modo aleato-rizado para permitir que efeitos ambientais fossem removidos durante análise dos dados. Os eventos transgênicos evaliados são listados na Tabela 34. No estágio de 2 folhas, todas as plantas Ti e a primeira réplica de 12 plantas de trigo doadoras não transformadas foram pulverizadas glufosinato em uma taxa de dose de 420 g ai/ha. As plantas foram visualmente inspecionadas após quatro dias e plantas representativas capturando a faixa de respostas fenotípicas foram usadas para desenvolver uma escala de classificação de 0 a 6. Tabela 35.

Tabela 34. Eventos transgênicos testados em avaliação preliminar *Com base em ensaio Taqman® qPCR duplex. Pouca cópia e cópia múltipla indica <3 e >4 T-DNA integrado, respectivamente.

Tabela 35. Escala de classificação usada para registrar resposta fenotípica a glufosinato em 4 dias após pulverização Cada planta no teste foi então classificada com relação à escala de classificação, com o classificador "cego" com relação ao genótipo de planta para eliminar influência de classificação. Cinco dias após classificação de glufosinato, todas as plantas T( e as primeira e segunda réplicas das plantas de trigo doadoras não transformadas foram pulverizadas com glífo-sato em uma taxa de dose de 420 g ai/ha. A terceira réplica restante de linhagem de trigo doadora não transformada (total 12 plantas) não foi pulverizada. As plantas foram visualmente inspecionadas em 7, 14 e 21 dias após pulverização. Uma escala de classificação capturando a faixa de respostas fenotípicas foi desenvolvida para cada ponto de tempo e usada para classificar o teste todo. Em cada ponto de tempo, o classificador "cego" com relação ao fenótipo da planta. A escala de classificação em 7 dias após pulverização variou de 0 a 7 (Tabela 36) e de 1 a 4 em 14 e 21 dias após pulverização (Tabela 37). Comprimento da planta, número de rebento de planta e anormalidades morfológicas foram também registrados para cada planta em 14 dias após pulverização com glifosato. Plantas com germinação retardada ou estabelecimento pobre foram excluídas de análises subsequentes.

Tabela 36. Escala de classificação usada para registrar resposta fenotípica a glifosato em 7 dias após pulverização Tabela 37. Escala de classificação usada para registrar resposta fenotípica a glifosato em 14 e 21 dias após pulverização Análise de resposta a glifosato falhou em revelar uma diferença fenotípica clara entre plantas de trigo doadoras não transformadas que fo- ram pulverizadas e plantas doadoras não transformadas que não foram pulverizadas (dados não mostrados). Como uma consequência, a tolerância dos eventos transgênicos a glufosinato não pôde ser avaliada confiavelmen-te. Em contraste, análise de resposta a glifosato em 21 dias após pulverização revelou uma diferença fenotípica clara entre as plantas doadoras não pulverizadas e não transformadas. Tabela 38. Desta maneira, análises quanto à tolerância a glifosato dentre os eventos transgênicos foram baseadas em scores de resposta coletados em 21 dias após pulverização. Um evento transgênico foi considerado exibir tolerância a glifosato quando 4 ou mais das 12 plantas Ti para cada evento tiveram um score de resposta maior do que ou igual a 3. Este critério foi baseado na expectativa que cada evento segregasse 1:2:1 (homozigota presente : hemizigota : homozigota ausente) para o transgene na geração Ti e permitir que eventos com expressão de DGT-28 fraca fossem identificados. Os eventos transgênicos foram classificados ordenados quanto à tolerância a glifosato observada usando um score agregado arbitrário calculado a partir de plantas tolerantes individuais. O score agregado foi calculado a partir de scores de resposta em 14 e 21 dias e altura da planta, número de rebento de planta e anormalidades morfológi-cas registrados em 14 dias após pulverização.

Tabela 38. Resposta fenotípica de plantas de trigo doadoras não transformadas a tratamento herbicida em 21 dias após pulverização No geral, 67 dos 92 eventos transgênicos avaliados mostraram evidência quanto à tolerância a glifosato. Tabela 39. Seis eventos transgênicos estimados ter < 3 cópias integradas do transgene e dois eventos transgênicos estimados ter 4 ou mais transgenes integrados foram selecionados para cada um dos vetores de expressão de DGT-28 para inclusão na segunda avaliação fenotípica (detalhada). *Um score positivo indica tolerância a glifosato maior. O score agregado padronizado para as plantas de trigo doa-doras não transformadas não tratadas foi 12,2.

Avaliação fenotípíca detalhada. Quatro réplicas de 12 sementes Ti por evento selecionado e oito réplicas (12 sementes cada) da linhagem de trigo doadora não transformada Bobwhite MPB26RH foram semeadas em potes de 85 mm e cultivadas para o estágio de 2 folhas sob condições de boa irrigação a 25°C com luz suplementar provendo um fotoperíodo de 12 horas. Os potes foram postos em uma disposição aleatória para permitir que efeitos ambientais fossem removidos durante análise de dados. Os eventos transgênicos avaliados são listados na Tabela 40. No estágio de 2 folhas, comprimento da planta e número de folhas foram registrados para cada planta antes da pulverização com glifosato. As primeira, segunda, terceira e quarta réplicas de plantas T-ι para cada evento selecionado e a linhagem de trigo doadora não transformada foram pulverizadas em uma taxa de dosagem de 420, 840, 1680 e 3360 g ai/ha, respectivamente. As quinta, sexta, sétima e oitava réplicas de linhagem de trigo doadora não transformada (total de 48 plantas) não foram pulverizadas. Em 7, 14 e 21 dias após pulverização, as plantas foram classificadas quanto a comprimento da planta, número de folhas e resposta fenotípíca a glifosato usando a escala de classificação na Tabela 37. Quaisquer anormalidades morfológicas foram também registradas. Para classificação, o classificador era "cego" com relação ao genótipo da planta e taxa de dose de pulverização para prevenir influência na classificação. Plantas com germinação retardada e estabelecimento pobre (critérios: altura da planta < 6 cm) na classificação pré-pulverização foram excluídas de análises subsequentes.

Tabela 40. Eventos transgênicos testados em avaliação fenotípi-ca detalhada *Com base em ensaio Taqman® qPCR duplex. Poucas cópias e cópias múltiplas indicam <3 e >4 T-DNA integrado, respectivamente.

Análise de resposta de glifosato em 7, 14 e 21 dias após pulverização revelou uma diferença fenotípíca de clara entre as plantas de trigo doadoras não transformadas pulverizadas e não pulverizadas. Esta diferenciação foi máxima em 21 dias e foi observada em todas as taxas de dose de glifosato. Tabela 41. Para avaliar a tolerância dos eventos transgênicos a glifosato em cada taxa de dose de pulverização, plantas Ti nulas (isto é, plantas não carregando o transgene) foram excluídas de análises subsequentes. Plantas Ti com um score de resposta de menos do que três em 21 dias após pulverização foram consideradas ter o genótipo nulo. Análise de variância (ANOVA) com base em fenótipos tolerantes revelou um efeito sig-nificante para construto de expressão de DGT-28, evento transgênico e dose de pulverização de glifosato. Tabela 42. No entanto, testes de comparação múltiplos falharam em desvendar interpretação biológica significante para a origem dessas diferenças devido à faixa limitada de scores de resposta (isto é, 1 a 4; Tabela 40) usados para registrar o fenótipo de plantas individuais. Em geral, os oito eventos transgênicos independentes testados para cada construto de expressão de DGT-28 mostraram tolerância similar a glifosato em cada taxa de dose de pulverização, indicando que todos os quatro trans-genes DGT-28 conferiram um fenótipo dominante e que uma cópia única era suficiente para conferir tolerância a glifosato. Cada um dos construtos de expressão DGT-28 revelou tolerância eficaz a pelo menos 3360 g ai/ha de glifosato.

Tabela 41. Resposta fenotípica de plantas de trigo doadoras não transformadas a tratamentos com glifosato diferentes em 21 dias após pulverização Tabela 42. Análise de variância (ANOVA) com base em plantas tolerantes a glifosato Soma de Quadrado Df1 Valor F Pr(>F)2 __________________________Quadrados Médio ______ Réplica 11 1,29 0,12 0,728 0,71181 Vetor 4 139,54 34,88 216,025 2.00E-16*** Código_Evento 29 178,52 6,16 38,122 2.00E-16*** Dose Pulverização 3_______2,14_________0,71________4,417______0,00427** 1Graus de liberdade; 2Estatisticamente significante a 0,001 (***) e 0,01 (**), respectivamente.

Confirmação molecular da presença de T-DNA em plantas Ti tolerantes a glifosato. Os ensaios de zigosidade de PCR desenvolvidos no E-xemplo 2 foram usados para confirmar a presença de T-DNA codificando DGT-28 nas plantas Ti tolerantes a glifosato guardadas para produção de semente T2 (vide Exemplo 6). No geral, testes de zigosidade de PCR foram realizados para 104 plantas T1, das quais 89% foram confirmadas conter pelo menos uma cópia do transgene. Tabela 43. Esses resultados confirmam que a tolerância a glifosato observada foi conferida pela presença de T-DNA codificando DGT-28.

Geração de semente T? para eventos transqênicos tolerantes a qlifosato. Cerca de oitos plantas Ti tolerantes a glifosato foram guardadas das avaliações fenotípicas para os 32 eventos transgênicos que foram selecionados para inclusão na avaliação fenotípica detalhada (Tabela 40). As plantas foram transferidas para potes de 200 mm e cultivadas sob condições de boa irrigação a 25°C com luz suplementar provendo um fotoperíodo de 12 horas. Os espigões em cada planta foram individualmente embalados antes da antese para prevenir cruzamento.

Embora aspectos da invenção tenham sido descritos em certas modalidades, eles podem ser modificados adicionalmente dentro do espírito e escopo da presente descrição. O presente pedido pretende então compreender quaisquer variações, usos ou adaptações de modalidades da invenção usando seus princípios gerais. Ainda, o presente pedido pretende compreender tais afastamentos da presente descrição que estiverem dentro da prática conhecida e comum na técnica à qual essas modalidades pertencem e que se encaixem dentro dos limites das reivindicações apensas.

Claims

1. Molécula de ácido nucleico isolada selecionada do grupo consistindo em: uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3; uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de a-minoácido de SEQ ID NO:1; um ácido nucleico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que hibridiza para outro ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições de alta ads-tringência.

2. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido nucleico compreende uma sequência sintética que foi projetada para expressão em uma planta.

3. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, compreendendo ainda um ácido nucleico codificando um polipeptideo heterólogo.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 3, em que o ácido nucleico é operavelmente ligado a um promotor.

6. Célula hospedeira que contém a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, como um ácido nucleico heterólogo operavelmente ligado a um promotor.

7. Vetor de acordo com a reivindicação 5, em que o promotor é o promotor AtUbil 0.

8. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6, em que a célula hospedeira é uma célula de planta.

9. Planta transgênica, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta que compreende o ácido nucleico como definido na reivindicação 1.

10. Planta transgênica, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta como definida na reivindicação 9, em que a planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta é tolerante a glifosato, quando comparada com uma planta do tipo selvagem da mesma espécie.

11. Planta transgênica, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta como definida na reivindicação 9, em que o ácido nucleico não codifica LGNAAT (SEQ ID NO: 141) e não codifica AL-LMXAPLT, em que X é selecionado do grupo consistindo em alanina, serina e treonina (SEQ ID NO:142).

12. Planta transgênica, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta como definida na reivindicação 9 , em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:1, que quando alinhada com SEQ ID NO:1, compreende uma alanina na posição correspondendo à posição 84 de SEQ ID NO:1 e/ou uma treonina na posição correspondendo à posição 172 de SEQ ID NO:1.

13. Cultura de tecido de células regeneráveis produzidas a partir de planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta como definida na reivindicação 9.

14. Protoplastos produzidos a partir de planta transgênica, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta como definida na reivindicação 9.

15. Cultura de tecido de acordo com a reivindicação 13, em que as células regeneráveis são produzidas a partir de um tipo de tecido selecionado do grupo consistindo em folhas, pólen, embriões, cotilédons, hipocótí-los, células meristemáticas, raízes, ponta de raiz, anteros, flores, ramos e vagens.

16. Planta regenerada a partir da cultura de tecido como definida na reivindicação 13, em que a planta é resistente a glifosato.

17. Planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta como definida na reivindicação 9, em que o genoma compreende uma molécula de ácido nucleico tendo pelo menos 95% de i-dentidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.

18. Método de generação de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta resistente a glifosato, o método compreendendo: transformação da planta, parte da planta, órgão da planta, semente da planta ou célula da planta com a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1; e expressão de um polipeptídoe tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO:1.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a planta transformada, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta é resistente a glifosato.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o polipep-tídeo não compreende LGNAAT (SEQ ID NO:141) e/ou não compreende ALLMXAPLT, em que X é selecionado do grupo consistindo em alanina, se-rina e treonina (SEQ ID NO:142).

21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o polipep-tídeo, quando alinhado com a SEQ ID NO:1, compreende uma alanina na posição correspondendo à posição 84 de SEQ ID NO:1 e/ou uma treonina na posição correspondendo à posição 172 de SEQ ID NO:1.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a molécula de ácido nucleico tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.

23. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a molécula de ácido nucleico compreende SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.

24. Método para controle de ervas-daninhas em uma área sob cultivo contendo plantas resistentes a herbicida, o método compreendendo: plantio de uma planta ou uma semente de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 na área sob cultivo; e aplicação à área sob cultivo de uma quantidade suficiente de herbicida para controlar ervas-daninhas na área sob cultivo sem afetar signi-ficantemente a planta ou semente de planta.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o herbicida é glifosato.

26. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a planta ou semente de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 compreende um segundo ácido nucleico codificando um polipeptídeo heterólogo.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o segundo ácido nucleico compreende aad-1 ou aad-12.

28. Método para conferir resistência a um herbicida em uma planta, o método compreendendo: transformação da planta com um construto de DNA, o dito cons-truto compreendendo um promotor operavelmente ligado com a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1; regeneração de uma planta transformada; e expressão da molécula de ácido nucleico de maneira a produzir um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o herbicida é glifosato.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, em que o construto de DNA compreende uma segunda molécula de ácido nucleico codificando polipeptídeo heterólogo expressável na planta.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que o polipeptídeo heterólogo compreende aad-1 ou aad-2.

32. Planta tendo estavelmente integrado em seu genoma o ácido nucleico como definido na reivindicação 1 como um ácido nucleico heterólogo, em que o ácido nucleico está operavelmente ligado a um promotor.

33. Planta de acordo com a reivindicação 32, em que a planta é uma planta de soja.

34. Planta de acordo com a reivindicação 32, em que a planta é uma planta de milho.

35. Planta de acordo com a reivindicação 32, em que a planta é selecionada do grupo consistindo em trigo, milho, soja, tabaco, braquiária, arroz, milheto, cevada, tomate, maçã, pera, morango, laranja, alfafa, algodão, cenoura, batata, beterrabas açucareiras, inhagem, alface, espinafre, petúnia, rosa, crisântemo, grama turf grass, pinheiro, abeto, plantas de acúmulo de metal pesado, girassol, açafrão, semente de colza e Arabidopsis.

36. Planta de acordo com a reivindicação 32, em que a planta é uma espécie selecionada do grupo consistindo nos gêneros Asparagus, A-vena, Brachiaria, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Helianthus, Lactuca, Lolium, Lyco-persicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Pha-seolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triti-cum, Vi tis, Vigna e Zea.

37. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8, em que a célula de planta não é regenerável para produzir uma planta.

38. Célula de planta como definida na reivindicação 9, em que a célula de planta não é regenerável para produzir uma planta.

39. Método de acordo com a reivindicação 18, em que uma célula de planta que não é regenerável para produzir uma planta é transformada.