CN101886088B

CN101886088B - 转基因构建体和转基因植物

Info

Publication number: CN101886088B
Application number: CN 200910139099
Authority: CN
Inventors: 严海芹; 孙义成; 李燕; 王忆平
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2009-05-15
Filing date: 2009-05-15
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2029-05-15
Also published as: CN101886088A

Abstract

本发明涉及转基因构建体和转基因植物。所述转基因构建体用于在植物中表达草苷膦耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，所得转基因植物表现出草苷膦耐受性。

Description

转基因构建体和转基因植物

技术领域

一般地，本发明涉及分子生物学和转基因植物领域。具体地，本发明涉及用于在植物细胞中表达草苷膦(glyphosate)耐受型5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyrul-shikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)的转基因构建体、包含所述转基因构建体的重组载体、以及用所述转基因构建体或重组载体转化的宿主细胞、转基因植物细胞和转基因植物及其制备方法。本发明还涉及赋予植物以草苷膦耐药性的方法。

背景技术

EPSPS是芳香族氨基酸合成途径中的关键酶，存在于植物和细菌中。草苷膦，即N-膦酰甲基甘氨酸，是一种广谱、高效的发芽后除草剂。它是EPSPS合成底物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争性抑制剂，可阻断PEP和3-磷酸莽草酸这两种底物在EPSPS催化下向5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸莽草酸的转化，从而阻断芳香族氨基酸合成前体—莽草酸的合成途径，导致植物和细菌死亡。

植株对草苷膦的耐药性可通过向它们的基因组稳定引入草苷膦耐受型EPSPS编码基因而获得。目前已知的草苷膦耐受型EPSPS基因主要有两大类：I类(例如US 4,971,908；US 5,310,667；US 5,866,775等)和II类(例如US5,627,061；US 5,633,435等)，它们都已成功导入植物基因组中，获得了具有草苷膦耐受性的植物细胞，以及完整的植株。

本发明的目的是稳定或提高EPSPS转基因在植物细胞中的表达，从而获得能耐受草苷膦的转基因植物。

发明内容

本发明提供了一种分离的多核苷酸，其以从5’到3’的方向包含编码叶绿体转运肽(chloroplast transfer peptide，CTP)的核苷酸序列和编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述编码CTP的核苷酸序列是编码拟南芥EPSPS CTP的核苷酸序列，例如序列表中序列7所示序列。在另一个实施方案中，所述编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列是编码恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)EPSPS即AroA的核苷酸序列，例如序列9或10所示序列。

或者，可以对编码CTP的核苷酸序列和/或编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，例如一个或几个密码子(即核苷酸三联体)的缺失和/或添加和/或替代。在一个实施方案中，所述修饰是沉默的，例如经过修饰的编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列相同的EPSPS。在一个具体的实施方案中，所述修饰是为了植物密码子偏爱性和/或减少核酸二级结构而进行的密码子优化。在另一个实施方案中，所述修饰是保守的，例如经过修饰的编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS变体，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。本发明还涵盖非沉默的或非保守的修饰。

又或者，可以对编码CTP的核苷酸序列和/或编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，例如一个或几个密码子(即核苷酸三联体)的缺失和/或添加和/或替代。在一个实施方案中，对编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，经过修饰的核苷酸序列与编码草苷膦耐受型EPSPS的天然核苷酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的核苷酸序列同源性或同一性。在一个具体的实施方案，所述经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列相同的EPSPS。在另一个具体的实施方案中，所述经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS变体，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。在另一个实施方案中，对编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS变体，所述EPSPS变体的氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS的天然氨基酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同源性或同一性，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。

又或者，可以对编码CTP的核苷酸序列和/或编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，例如一个或几个密码子(即核苷酸三联体)的缺失和/或添加和/或替代。在一个实施方案中，对编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，经过修饰的核苷酸序列与编码草苷膦耐受型EPSPS的天然核苷酸序列的片段(例如至少约10个、约15个、约20个、约25个、约50个、约75个、约100个、约125个、约150个、约175个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400个、约450个、约500个或更多连续核苷酸的片段)在严格条件(例如很低的、低的、中等的、高的、或很高的严格条件)下发生杂交。在一个具体的实施方案，所述经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列相同的EPSPS。在另一个具体的实施方案中，所述经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS变体，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。在另一个实施方案中，对编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列进行修饰，经过修饰的核苷酸序列编码氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同的EPSPS变体，所述EPSPS变体的氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS的天然氨基酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同源性或同一性，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。

本发明提供了一种融合蛋白，其以从N端到C端的方向包含CTP和草苷膦耐受型EPSPS。在一个实施方案中，所述CTP是拟南芥EPSPS CTP，例如序列表中序列6所示序列。在另一个实施方案中，所述草苷膦耐受型EPSPS是恶臭假单胞菌EPSPS即AroA的氨基酸序列，例如序列8所示序列。

或者，可以对CTP的氨基酸序列和/或草苷膦耐受型EPSPS的氨基酸序列进行修饰，例如一个或几个氨基酸残基的缺失和/或添加和/或替代。在一个实施方案中，所述修饰是保守的，例如经过修饰的草苷膦耐受型EPSPS的氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS天然氨基酸序列不同，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。在一个具体的实施方案中，所述EPSPS变体的氨基酸序列与草苷膦耐受型EPSPS的天然氨基酸序列具有约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的氨基酸序列同源性或同一性，且所述EPSPS变体具有与天然EPSPS相同或相当的EPSPS活性和草苷膦耐受性。本发明还涵盖非保守的修饰。

本发明还提供了一种核酸构建体，其包含本发明的分离的多核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸构建体是表达盒。本发明还提供了一种重组载体，其包含本发明的分离的多核苷酸，或包含本发明的核酸构建体。在一个实施方案中，所述重组载体是重组克隆质粒或重组表达质粒。本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，或包含本发明的核酸构建体，或包含本发明的重组载体。在一个实施方案中，所述宿主细胞是原核宿主细胞，例如细菌宿主细胞。在一个具体的实施方案中，所述细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)宿主细胞。在另一个具体的实施方案中，所述细菌宿主细胞是农杆菌宿主细胞，诸如根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)宿主细胞。

本发明还提供了一种转基因植物细胞和转基因植物，其包含本发明的分离的多核苷酸，或包含本发明的核酸构建体，或包含本发明的重组载体，或包含本发明的宿主细胞。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸整合在所述转基因植物细胞的基因组中。在一个实施方案中，所述植物或所述植物细胞是农作物，包括粮食作物和经济作物。在一个实施方案中，所述植物或所述植物细胞是例如选自下组的植物或植物细胞：稻(Oryza，包括OryzasativaL.)、小米(Setaria italicaL.)、小麦(Triticum，包括Triticum sestivumL.)、大麦(Hordeum，包括Hordeum vulgare L.)、燕麦(Avena，包括Avena sativaL.)、高梁(Sorghum，包括Sorghum bicolor L.)、玉米(Zea，包括Zea may L.)、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、大豆(Glycine，包括Glycine max L.)、花生(Arachis，包括Arachis hypogaea L.)、向日葵(Helianthus，包括Helianthusannuus L.)、棉花(Gossypium，包括Gossypium hirsutum L.)、苜蓿(Medicago，包括Medicago sativa L.)、烟草(Nicotiana，包括Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassica campestris L.)、青菜(Brassica chinensis L.)、甘蓝(Brassicaoleracea L.)、花椰菜(Brassica oleracea var.botrytis L.)、卷心菜(Brassicaoleracea var.capitata L.)等。在一个实施方案中，所述转基因植物细胞和转基因植物具有对草苷膦的耐受性。

本发明还提供了制备本发明的转基因植物细胞和转基因植物的方法，其包括将本发明的分离的多核苷酸、核酸构建体、重组载体或重组宿主细胞导入植物细胞的步骤。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸整合在所述转基因植物细胞的基因组中。在一个实施方案中，所述转基因植物细胞和转基因植物具有对草苷膦的耐受性。

本发明还提供了赋予植物细胞或植物以草苷膦耐受性的方法，其包括将本发明的分离的多核苷酸、核酸构建体、重组载体或重组宿主细胞导入植物细胞的步骤。在一个实施方案中，本发明的分离的多核苷酸整合在所述转基因植物细胞的基因组中。

附图说明

图1是转基因表达盒的示意图。LB，T-DNA的左边界；RB，T-DNA的右边界；Pnos，胭脂碱合成酶基因Nos的启动子；P35S，烟草花叶病毒的35S启动子，即CaMV35S启动子；Tnos，胭脂碱合成酶基因Nos的启动子；NptII，新霉素磷酸转移酶II基因；CTP，来源于拟南芥的EPSP合酶的叶绿体前导肽的编码序列；n-EPSPS，来源于恶臭假单胞菌的EPSP合酶的编码序列；o-EPSPS，密码子优化后的EPSP合酶的编码序列(根据双子叶植物的密码子偏爱性而设计的人工合成序列)。

图2显示了转基因烟草与野生型烟草喷洒草苷膦除草剂后的生长状况。A：转基因烟草，B：野生型烟草。

图3显示了转基因烟草的PCR检测。泳道1-6：依次为2323-4/5/15/16/20/23；泳道M：DNA标志物DL2000；泳道WT：野生型对照烟草。

图4显示了转基因烟草的Southern印迹检测。泳道1-4：依次为2323-4/5/15/16；泳道5：野生型对照烟草。

图5显示了转基因烟草的RT-PCR检测。泳道M：DNA标志物DL2000；泳道WT：野生型对照烟草；泳道1-6：依次为2323-4/5/15/16/20/23。

图6显示了转基因烟草的密码子优化前后的RT-PCR检测。泳道1：密码子优化的转基因烟草2323-4；泳道2：密码子优化的转基因烟草2323-4中的肌动蛋白内参；泳道3：密码子未优化的转基因烟草2349-2中的肌动蛋白内参；泳道4：密码子未优化的转基因烟草2349-2。

图7显示了转基因烟草的EPSPS蛋白的Western印迹检测。泳道1：恶臭假单胞菌的EPSPS；泳道2-7：依次为2323-4/5/15/16/20/23；泳道8：非转基因烟草对照；泳道M：蛋白质标志物。

图8显示了野生型烟草的草苷膦耐受性测定。野生型烟草种子在含有不同浓度草苷膦的平板上的萌芽情况：从左到右，草苷膦的浓度依次为0mM，0.05mM，0.1mM，0.2mM和0.5mM。

图9显示了转基因烟草T0代种子萌发测定。A：不含草苷膦的MS平板上的种子萌芽情况；B：含1mM草苷膦的MS平板上的种子萌芽情况。每块平板的左半边为空载体对照烟草，右半边为耐受草苷膦的转基因烟草。

图10显示了转基因烟草T0代种子萌发测定：a.草苷膦浓度为0mM时，转基因烟草的幼苗均能萌芽生长b.草苷膦浓度为10mM时，转基因烟草的部分幼苗耐受草苷膦。

图11显示了转基因烟草T1代的PCR检测。泳道1-10：转基因烟草的T1代植株；泳道M：DNA标志物DL2000；泳道12：非转基因烟草对照；泳道13：质粒阳性对照。

发明详述

定义

本文中“序列同源性或同一性％”是指通过序列对比，并且必要时插入空隙以获得同源性或同一性的最大百分比(而且，在计算序列同一性％时不考虑任何保守替代)，候选序列中相同于目标序列的氨基酸残基的百分数。此处所述序列包括氨基酸序列和核苷酸序列。可使用本领域已知的各种方法测定序列同源性或同一性百分比，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可以确定用于序列对比的具体参数，以及全长序列的最大比较所需的任何算法。

杂交反应的“严格性”可以由本领域普通技术人员容易的确定，而且通常根据探针长度、洗涤温度和盐浓度凭经验计算。一般而言，较长的探针要求较高的温度以正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常依赖于当互补链存在于低于其解链温度的环境中时变性DNA重新退火的能力。探针和可杂交序列之间的期望同一性程度越高，可使用的相对温度也越高。结果是，推断出较高相对温度将趋向于使反应条件更为严格，而较低温度也就较不严格。关于杂交反应严格性的其它细节和解释，参见Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers(1995)。

“高严格性条件”通过如下各项定义：(1)采用低离子强度和高温进行清洗；0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，于50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂；50％(v/v)甲酰胺及0.1％牛血清清蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5及750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，于42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5x SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH 6.8)，0.1％焦磷酸钠，5xDenhardt氏溶液，超声处理的鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸右旋糖苷，于42℃，及于42℃在0.2x SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中清洗，接着于55℃在含EDTA的0.1x SSC中进行高严格性清洗。

“中等严格条件”可以如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，New York，Cold Spring Harbor Press(1989)中所述鉴定，包括于37℃在含20％甲酰胺，5x SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt氏溶液，10％硫酸右旋糖苷，和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育过夜，接着于约37-50℃在1x SSC中清洗滤膜。技术人员将认识到如何在必要时调整温度、离子强度等以适应诸如探针长度等因素。

本文中“核酸构建体”与“转基因构建体”同义，指单链或双链核酸分子，这些分子分离自天然基因或已经过改变而含有以自然界不存在的方式而结合和并列的核酸片段。当核酸构建体含有表达本发明EPSPS所需的所有调控序列时，术语“核酸构建体”与“表达盒”是同义词。

本文中“调控序列”包括表达本发明多肽所必需的或有利的所有元件。每一种调控序列既可以是编码该多肽的核酸序列天然具有的，也可以是外来的。这种调控序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、和转录终止子。调控序列最少应包括启动子、以及转录和翻译终止信号。为了导入特异的限制性酶切位点以有助于调控序列和编码异源多肽的核酸序列的编码区进行连接，可以制备带有接头的调控序列。

本文中“可操作地连接”定义为使本发明的分离的核酸序列与相对于该序列同源或异源的任何其它序列相连，从而使它们作为一个整体能编码一种产物。需要时，可通过一定方式，如通过限制性内切酶的酶切而使它们分离。这里所述的同源或异源序列可以是任何序列，如能指导本发明所述分离的核酸序列在特定宿主细胞中表达的任何调控序列，或与本发明所述分离的核酸序列共同编码一种融合蛋白的序列，等等。

本文中“宿主细胞”包括任何能接受本发明所述分离的核酸序列，或能接受含有该序列的构建体或载体，并使该序列稳定维持在细胞内的细胞。宿主细胞包含了本发明所述分离的核酸序列后，能获得由该序列编码的性状或特征。

EPSPS

本发明的一个方面涉及耐受草苷膦且具有EPSPS活性的蛋白质，例如恶臭假单胞菌的EPSPS，即AroA，例如序列表中的序列8。

本发明还涉及上述蛋白质的变体或突变体，其中所述变体或突变体的氨基酸序列相对于本文所述氨基酸序列有一个或几个氨基酸的取代、缺失和/或添加，但该变体或突变体仍耐受草苷膦且具有EPSPS活性。所述氨基酸的取代、缺失和/或添加都是本领域常规技术可以完成的。优选这种氨基酸变化为：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

保守取代的实例是在下列氨基酸组内发生的取代：碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特定活性的那些氨基酸取代在本领域内是众所周知的，并且已由，例如，N.Neurath和R.L.Hill在1979年纽约学术出版社(Academic Press)出版的Protein中进行了描述。最常见的互换有Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Tyr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，和Asp/Gly，以及它们相反的互换。

对于本领域的技术人员而言很明显，这种取代可以在对分子功能起重要作用的区域之外发生，而且仍产生活性多肽。对于由本发明的分离的核酸序列编码的多肽，其活性必需的并因此选择不被取代的氨基酸残基，可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(如参见， Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。后一技术是在分子中每一个带正电荷的残基处引入突变，检测所得突变分子的草苷膦耐受型EPSPS活性，从而确定对该分子活性而言重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可以通过其三维结构的分析来测定，这种三维结构可由核磁共振分析、结晶学或光亲合标记等技术测定(参见，如de Vos等，1992，Science 255：306-312；Smith等，1992，J.Mol.Biol 224：899-904；Wlodaver等，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

本发明还涉及与本文所述氨基酸序列(例如序列8所示氨基酸序列)具有一定同源性或同一性的氨基酸序列，如同源性或同一性为至少约50％，优选至少约60％，优选至少约65％，优选至少约66％，优选至少约67％，优选至少约68％，优选至少约69％，优选至少约70％，优选至少约71％，优选至少约72％，优选至少约73％，优选至少约74％，优选至少约75％，优选至少约76％，优选至少约77％，优选至少约78％，优选至少约79％，更优选至少约80％，更优选至少约81％，更优选至少约82％，更优选至少约83％，更优选至少约84％，更优选至少约85％，更优选至少约86％，更优选至少约87％，更优选至少约88％，更优选至少约89％，更优选至少约90％，更优选至少约91％，更优选至少约92％，更优选至少约93％，更优选至少约94％，最优选至少约95％，最优选至少约96％，最优选至少约97％，最优选至少约98％，最优选至少约99％，只要具有所述氨基酸序列的蛋白为草苷膦耐受型EPSPS蛋白，该序列就属于本发明的范围。

本发明还涉及如下的蛋白质，其具有含本文所述氨基酸序列(例如序列8所示氨基酸序列)之EPSPS的活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少100％。

本发明的另一方面涉及编码耐受草苷膦且具有EPSPS活性的蛋白质(例如恶臭假单胞菌的EPSPS，即AroA)的多核苷酸，例如序列表中的序列9或10。

本发明还涉及上述多核苷酸的变体或突变体，其中所述变体或突变体的核苷酸序列相对于本文所述核苷酸序列有一个或几个三联体密码子的取代、缺失和/或添加，但该变体或突变体仍编码耐受草苷膦且具有EPSPS活性的蛋白质。所述三联体密码子的取代、缺失和/或添加都是本领域常规技术可以完成的。优选这种三联体密码子变化导致如下的氨基酸变化：小的特性改变，即不显著影响蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常约1-30个氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一个甲硫氨酸残基；小的连接肽，例如约20-25个残基长。

本发明还涉及与本文所述核苷酸序列(例如序列9或10所示核苷酸序列)具有一定同源性或同一性的核苷酸序列，如同源性或同一性为至少约65％，优选至少约66％，优选至少约67％，优选至少约68％，优选至少约69％，优选至少约70％，优选至少约71％，优选至少约72％，优选至少约73％，优选至少约74％，优选至少约75％，优选至少约76％，优选至少约77％，优选至少约78％，优选至少约79％，更优选至少约80％，更优选至少约81％，更优选至少约82％，更优选至少约83％，更优选至少约84％，更优选至少约85％，更优选至少约86％，更优选至少约87％，更优选至少约88％，更优选至少约89％，更优选至少约90％，更优选至少约91％，更优选至少约92％，更优选至少约93％，更优选至少约94％，最优选至少约95％，最优选至少约96％，最优选至少约97％，最优选至少约98％，最优选至少约99％，只要具有所述核苷酸序列的多核苷酸编码草苷膦耐受型EPSPS蛋白，该序列就属于本发明的范围。

本发明还涉及如下的多核苷酸，其编码的蛋白质具有含本文所述氨基酸序列(例如序列8所示氨基酸序列)之EPSPS的活性的至少20％，优选至少40％，更优选至少60％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少100％。

本发明所述分离的多核苷酸可按照本领域众所周知的方法从自然界克隆而获得。克隆方法可包括：限制酶切割并分离含有编码目标蛋白的核酸序列的预期核酸片段，将该片段插入载体分子中，将该重组载体掺入到宿主细胞中，从而使该核酸序列的多个拷贝或克隆在该宿主细胞中复制。但是，更简便的方法是，根据在此公开的核苷酸序列，用自动核苷酸合成仪(如AppliedBiosystems公司的ABI394 DNA合成仪)合成所述序列，或参照2000年10月4日公开的中国专利申请99103472.4的方法，分别合成上述核酸序列的片段，然后用常规连接酶和载体将这些片段连接成完整序列。

本发明的核酸序列可以是基因组序列、cDNA序列、RNA序列、半合成的序列、完全人工合成的序列或其任何组合物。

当合适时，可以优化编码EPSPS的核苷酸序列，以提高在植物中的表达。换言之，可以使用植物偏爱的密码子来合成编码EPSPS的核苷酸序列，以提高表达。参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。合成植物偏爱型基因的方法是本领域公知的。参见例如美国专利号5,380,831；5,436,391；及Murray等，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498。

还可以为了降低核酸的二级结构而优化编码EPSPS的核苷酸序列，从而提高基因的表达。

核酸构建体或转基因构建体

本发明的另一方面涉及核酸构建体。

在一个实施方案中，所述核酸构建体用于在植物细胞中表达草苷膦耐受型EPSPS并将所表达的草苷膦耐受型EPSPS定位于叶绿体。当目标基因不是在叶绿体中表达时，核酸构建体将额外包含编码叶绿体转运肽的核苷酸序列，以指导目标基因产物到达叶绿体。此类叶绿体转运肽是本领域已知的。参见例如von Heijne等，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；及Shah等，(1986)Science 233：478-481。其它转运肽包括美国申请号20020073443和美国申请号20020178467中所述的转运肤。在其它实施方案中，目标基因可以被靶向定位到细胞外或其它的细胞内组分处，例如核、线粒体或内质网。

靶向叶绿体的序列是本领域已知的，包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的叶绿体小亚基(de Castro Silva Filho等，(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780；Schnell等，(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342)；EPSPS(Archer等，(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810)；色氨酸合酶(Zhao等，(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087)；质体蓝素(Lawrence等，(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363)；和捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa等，(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999)。还参见von Heijne等，(1991)PlantMol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等，(1987)Plant Physiol.84：965-968；Romer等，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；及Shah等，(1986)Science233：478-481。

转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530；Svab和Maliga，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917；Svab和Maliga，(1993)EMBO J.12：601-606。

在一个实施方案中，本发明的核酸构建体以从5’到3’的方向包含编码CTP的核苷酸序列和编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列。例如，所述编码CTP的核苷酸序列可以是编码拟南芥EPSPS CTP的核苷酸序列，例如序列表中的序列6。例如，所述编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列可以是编码恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA的核苷酸序列，例如序列表中的序列9或10。

本发明的核酸构建体还可含有能使上述序列在所选宿主细胞中表达所必需的调控序列。所述调控序列与上述分离的核酸序列在核酸构建体中可操作地连接。

调控序列可以是启动子序列，包括介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的、及杂合的启动子，而且可以从编码细胞外或细胞内多肽的基因中得到，这些多肽可以与该细胞同源或不同源。众多用于原核细胞的启动子为本领域所熟知。

调控序列也可以是适当的转录终止序列，即被本文所述的宿主细胞识别以终止转录的序列。该终止序列与编码多肽的核酸序列的3’端可操作地连接。任何在宿主细胞中有功能的终止子都可以在本发明中使用。

调控序列可以是适当的前导序列，即mRNA上对细胞的翻译很重要的非翻译区。前导序列与编码多肽的核酸序列的5’端可操作地连接。任何在宿主细胞中有功能的前导序列都可以在本发明中使用。

调控序列也可以是聚腺苷酸化序列。该序列与核酸序列的3’端可操作地连接，而且当转录时，被细胞作为信号来识别，从而将聚腺苷酸残基加到转录出的mRNA上。任何在该细胞中有功能的聚腺苷酸化序列都可以在本发明中使用。

核酸构建体还可以包括一个或几个这样的核酸序列，这些核酸序列编码一个或几个有利于指导异源多肽表达的因子，例如，转录激活因子(如反式作用因子)、伴侣蛋白和加工型蛋白酶。任何在宿主细胞特别是细菌细胞和植物细胞中有效的因子都可以在本发明中使用。编码一个或几个这些因子的核酸不一定与编码异源多肽的核酸序列串联。

重组载体或重组表达载体

可以将上述各种核酸和调控序列连接在质粒或病毒等常规载体上，产生本发明的“重组表达载体”，所用方法是本领域技术人员所熟知的(可参见J.Sambrook，E.F.Fritsch和T. Maniatus，1989，Molecullar Cloning，laboratorymannual，第2版，Cold Spring，NY)。所述载体可以包含一个或几个便利的限制性内切酶位点。载体的选择通常取决于载体与所用宿主细胞的兼容性。所述载体可以是线性或闭合环状质粒。这样的载体可以是自主复制型载体，即，以染色体外实体的形式存在的载体，其复制独立于染色体的复制，如质粒(一种染色体外元件)，微型染色体，或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何手段。或者，所述载体也可在导入细胞后，整合到基因组中并随染色体一起复制。载体系统可以是单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(它们共同包含目标核酸序列)，或是转座子。

在载体向细胞基因组整合的情况中，该载体可以包含指导该载体通过同源重组整合入细胞基因组的附加核酸序列。这些附加的核酸序列能够使该载体在染色体的精确位置整合入基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选包含足够数量的核酸，例如100至1500个碱基对，优选400至1500个碱基对，最优选800至1500个碱基对，它们与其相应的靶序列高度同源以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与细胞基因组中靶序列同源的任何序列。而且，这些整合元件可以是非编码或编码型核酸序列。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合入细胞的基因组中。

在自主复制的情况中，该载体可以进一步包含使该载体能在细菌细胞和植物细胞中自主复制的复制起始点。

宿主细胞

本发明还涉及含有本发明核酸序列的重组“宿主细胞”。可将含有本发明核酸序列的核酸构建体或载体引入宿主细胞中，使本发明的核酸序列整合至染色体上或使载体自主复制，从而本发明的核酸序列得以在该宿主细胞中稳定表达，导致赋予该宿主细胞抗草苷膦的抗性。

宿主细胞可以是原核生物如细菌的细胞，但更优选真核生物如植物的细胞。

常用的细菌细胞有革兰氏阳性细菌如芽孢杆菌的细胞，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌的细胞。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞大肠杆菌的细胞。

将表达载体引入细菌宿主细胞可通过原生质体转化(如Chang和Cohen，1979，分子普通遗传学168：111-115)，利用感受态细胞(如Young和Spizizin，1961，J.Bacteriol.81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，J.Mol.Biol.56：209-221)，通过电穿孔(如Shigekawa和Dower，1988，Biotech.6：742-751)，或通过接合作用(如Koehler和Thorne，1987，J.Bacteriol.169：5771-5278)而实现。

转基因植物

将异源DNA导入植物细胞后，可以通过本领域已知的多种方法来确认异源基因在植物基因组中的整合。

PCR测定法：可以使用对目标基因或土壤杆菌载体背景等特异性的寡核甘酸引物来进行PCR，用以筛选植物细胞中是否存在所整合的基因的。

Southern测定法：可以通过基因组DNA的Southern印迹测定法来确认植物转化。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分开，并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后根据标准技术，用例如放射标记的靶DNA片段探查膜或印迹，以确认所导入的外源基因在植物基因组中的整合。

RT-PCR测定法：可以通过总RNA的RT-PCR测定法来确认异源基因在转基因植物中的转录。

Western印迹测定法：可以对转基因植物进行Western印迹，其中使用能结合草苷膦抗性蛋白上的一个或几个表位的抗体。

实施例1：恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA的克隆、表达和纯化

本实施例中使用了已经在申请号为02117991.3的中国专利申请中公开的质粒pKU2002，它是包含恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA野生型核苷酸序列(SEQ ID NO：9)的pUC18衍生质粒。

根据质粒pKU2002上EPSPS基因aroA的核苷酸序列，设计并合成了5’端引物1(5’-cat gcc atg gAA GTA ACA ATA CAG CCC GGA G-3’，SEQ IDNO：1)和3’端引物2(5’-gtt act cga gTG AGA AAT TAA ATT GAT GGT TT-3’，SEQ ID NO：2)(其中下划线标示了在aroA核苷酸序列的侧翼添加的供克隆用的NcoI和XhoI限制性位点)。以质粒pKU2002为模板，用引物1和引物2通过PCR扩增aroA核苷酸序列。PCR条件为：94℃预变性10分钟；然后是30个循环的94℃1分钟、50℃1分钟、72℃2分钟；最后是72℃再延伸10分钟。将所得PCR产物用限制性内切核酸酶NcoI和XhoI消化后连接入表达载体pET-28a(+)(Novagen)，所得质粒命名为pKU2364。

将质粒pKU2364通过氯化钙法转化入大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。将携带质粒pKU2364的大肠杆菌BL21(DE3)接种入300mL补充有25mg/L卡那霉素的LB液体培养基，于37℃振荡培养至OD₆₀₀达到约0.8。加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养3小时。

将培养物于室温以8000rpm离心10分钟，丢弃上清液，并将菌体沉淀物重悬于30mL含0.1mM DTT的Tris-HCl pH 7.0。超声处理后，使用HisTrap HP试剂盒(Amersham Biosciences)依照制造商的说明书分离和纯化蛋白质。所得蛋白质即为恶臭假单胞菌EPSPS。

实施例2：针对恶臭假单胞菌EPSPS的多克隆抗体的制备

给家兔免疫接种如实施例1所述制备的恶臭假单胞菌EPSPS蛋白。4次免疫(第一次使用弗氏完全佐剂，其余使用弗氏不完全佐剂)和1次加强免疫(使用弗氏不完全佐剂)(各次免疫的时间间隔为10天)后，采集血液并制备抗血清。

实施例3：转基因构建体的构建

为了在植物中表达EPSPS基因aroA，设计并构建了转基因构建体(见图1)。一方面，根据植物密码子偏好性以及核酸二级结构预测，对EPSPS基因aroA的核苷酸序列进行了密码子优化，用以提高EPSPS基因aroA在植物中的表达水平和消除可能的核酸二级结构。另一方面，为了将在细胞中生成的AroA蛋白质引导至叶绿体，将拟南芥EPSPS CTP编码序列(SEQ ID NO：7)连接在经过密码子优化的AroA编码序列(SEQ ID NO：10)的5’端。

将人工合成的全长编码序列(包含拟南芥EPSPS CTP核苷酸序列和经过密码子优化的恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA核苷酸序列)通过限制性位点BamHI和SacI连接入植物表达载体pBI121(Clontech)，所得质粒命名为pKU2323。包含拟南芥EPSPS CTP核苷酸序列和未经优化的恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA核苷酸序列(SEQ ID NO：9)的质粒命名为pKU2349。

实施例4：转基因植物的构建

1.制备感受态根瘤农杆菌

将根瘤农杆菌LBA4404(Life Technologies)在补充有50mg/L链霉素和50mg/L利福平的LB板上于28℃活化培养48小时。挑取单菌落，接种入3mL补充有50mg/L链霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基，于28℃振荡培养过夜。将培养物按照1∶100的比例接种入20mL补充有50mg/L链霉素和50mg/L利福平的LB液体培养基，于28℃振荡培养至OD₆₀₀达到约0.6。将培养物在冰上放置10分钟，然后于4℃以5000rpm离心10分钟，丢弃上清液，将菌体沉淀物重悬于预冷的2mL 0.2M CaCl₂和2mL 0.1M MgSO₄。将细菌悬浮液在冰上放置30分钟，然后于4℃以5000rpm离心10分钟，丢弃上清液，将菌体沉淀物重悬于预冷的0.5mL 0.2M CaCl₂和0.5mL 0.1M MgSO₄，即得感受态细胞。

2.用重组质粒转化感受态农杆菌

将2ul pKU2323质粒DNA(1ug/ul)添加至200ul感受态细胞，轻轻混匀，在冰上放置30分钟。将细菌悬浮液在液氮中冷激1分钟，然后立即在42℃水浴中热激90秒，再然后立即在冰上放置5分钟。将细菌悬浮液接种入800ul未补充抗生素的LB液体培养基，于28℃复苏4-6小时。取适量细菌悬浮液涂布到补充有50mg/L链霉素、50mg/L利福平和25mg/L卡那霉素的LB板上，将板于28℃温育2天。

从平板上挑取单菌落，接种入1mL补充有50mg/L链霉素、50mg/L利福平和25mg/L卡那霉素的LB液体培养基，于28℃振荡培养过夜。将培养物接种入50ml上述培养基，并培养至OD₆₀₀达到约0.5(大约3-4小时)。将培养物以5000rpm离心10分钟，丢弃上清液，将菌体沉淀物重悬于适量MS培养基(Gibco BRL；还可参见Murashige和Skoog，1962)，使得OD₆₀₀为0.2-0.3。

3.用转化农杆菌叶盘法感染烟草

取烟草(Nicotiana tabacum L.cv.W38)(由北京大学林忠平教授馈赠)颜色鲜绿的幼嫩叶片，将其剪成0.8cmx0.8cm的碎片，并在上述细菌悬浮液中浸泡15分钟。将浸泡过的叶片摆放在MS₁培养基(MS培养基补加1mg/L 6-苄基腺嘌呤和0.1mg/L萘乙酸)上，于25℃在黑暗中温育60小时。然后，清洗烟草叶片，并转移到MS₂培养基(MS培养基补加1mg/L 6-苄基腺嘌呤、0.1mg/L萘乙酸、300mg/L头孢霉素和200mg/L卡那霉素)上，于25℃在光照下温育16小时。2周后可见愈伤组织形成，3周后可见分化芽长出。待芽长到1cm左右时，将其切下，并转移到MS培养基_1/2(MS培养基补加0.1mg/L萘乙酸、300mg/L头孢霉素和200mg/L卡那霉素)上进行生根培养，约1-2周后生出不定根。等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗去附着的固体培养基，移入栽培土(北京凯茵有机肥有限责任公司)中，在温室(25℃，16小时光照/8小时黑暗)中培养。

实施例5：转基因植物的草甘膦抗性测定法-叶片喷洒测定法

温室中栽培的转基因烟草长到6-8片叶期时，喷洒草苷膦除草剂。本实验所用的草苷膦除草剂为Roundup，即41％草苷膦异丙胺盐水剂(由美国孟山都公司赠送)。将Roundup稀释100倍，均匀喷洒于烟草叶片上(喷药量为每公顷使用Roundup 3L左右)。此后观察烟草生长情况。

1-3天后野生型对照植株(n＝5)表现出受害症状，茎尖和部分叶片开始萎蔫；之后严重萎蔫并失去绿色，表现出枯黄，一周后全部死亡(见图2)。经空载体pBI121转化的空白对照植株的生长情况出与野生型对照植株类似。32株转基因植株中有6株(编号为2323-4，2323-5，2323-15，2323-16，2323-20，2323-23)正常生长，其余逐渐死亡。

通过包含经过密码子优化的pKU2323的农杆菌介导的转化得到的转基因植株为2323系列；而通过包含未经密码子优化的pKU2349的农杆菌介导的转化得到的转基因植株为2349系列。

实施例6：转基因植物的PCR测定法、Southern印迹测定法和RT-PCR测定法

1.烟草叶片基因组DNA的提取

遵循Murray和Thompson(1980)修改而成的CTAB法自烟草叶片提取基因组DNA。将植物材料在黑暗中放置24小时，以降低淀粉含量。剪取大约100mg叶片，置于研钵中。倒入液氮，将叶片研成粉末。将叶片粉末转移至1.5ml离心管中，添加600ul含2％巯基乙醇的CTAB提取缓冲液，混匀。将管在65℃水浴中温育1-1.5小时。待冷却至室温后，添加600ul 24∶1混合的氯仿∶异戊醇，混匀，直到叶片粉末由绿转白。于室温以13,000rpm离心10分钟，取出上层水相。将水相再用等体积的24∶1混合的氯仿∶异戊醇抽提一次后，以13,000rpm离心6分钟。取出上层水相，添加2倍体积的无水乙醇以沉淀DNA。将DNA沉淀物用70％乙醇洗涤，晾干。添加适量的含RNA酶的无菌去离子水以溶解DNA沉淀物。

2.PCR测定法

根据密码子优化后的EPSPS基因aroA的核苷酸序列(包括拟南芥EPSPSCTP的核苷酸序列)设计了5’端引物3(5’-ATG GCG CAA GTT AGC AGAATC-3’，SEQ ID NO：3)和3’端引物4(5’-TCA TGA GAA GTT GAA TTGATG-3’，SEQ ID NO：4)。以如上制备的烟草叶片基因组DNA为模板，用引物3和4实施PCR。PCR条件如下：94℃预变性5分钟；然后是30个循环的94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟；最后是72℃再延伸10分钟。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

如图3所示，6株耐受草苷膦的转基因烟草(编号为2323-4、2323-5、2323-15、2323-16、2323-20、和2323-23)都得到了长度约为1.5kb的PCR扩增产物，表明转基因构建体ctp::aroA已经整合到烟草基因组中。

3.Southem印迹测定法

取50ug PCR阳性转基因烟草的基因组DNA，用限制性内切核酸酶EcoRI消化。将酶切后的DNA进行0.8％琼脂糖凝胶电泳，并通过毛细管法转移到Hybond^TM-N+膜上。

以pKU2323质粒DNA为模板，用引物3和引物5(5’-CAAATG TGG AAGAAT TTC ATC-3’，SEQ ID NO：5)实施PCR，得到了615bp的扩增产物，具体包括整个CTP和AroA前130个氨基酸的编码序列。使用高效DNA地高辛标记和检测试剂盒(DIG-High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I)(Roche)依照制造商的说明书给PCR产物标记上地高辛，并依照常规方法于42℃进行杂交反应。

如图4所示，在耐受草苷膦的转基因烟草中，目的基因在烟草基因组中只有一个拷贝，而在WT对照烟草植株中未杂交到目的基因。

4.RT-PCR测定法

选取100mg新鲜叶片，使用RNAprep纯植物总RNA提取试剂盒(Tiangen)依照制造商的说明书提取RNA。使用M-MLV逆转录酶(Promega)依照制造商的说明书制备cDNA后，用引物3和4实施PCR。PCR条件如下：94℃预变性5分钟；然后是30个循环的94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟；最后是72℃再延伸10分钟。通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

如图5所示，6株耐受草苷膦的转基因烟草(编号为2323-4、2323-5、2323-15、2323-16、2323-20、和2323-23)都得到了长度约为1.5kb的RT-PCR扩增产物，表明转基因在转基因烟草中进行了有效地转录。

如图6所示，RT-PCR测定法还还表明，经过密码子优化的转基因显著地提高了该转基因的mRNA在转基因烟草中的稳定性。

实施例7：转基因植物的Western印迹测定法

取100mg新鲜的烟草叶片，加入液氮充分研磨，将粉末转移入2ml离心管。待液氮完全挥发后，加入200ul蛋白质提取缓冲液(0.25M Tris-HCl pH 6.8，8％巯基乙醇，20％甘油，8％SDS)，振荡混匀后于100℃温育8分钟。将混合物以12000rpm离心15分钟，取出上清液，即为叶片蛋白质粗品。

依照常规技术制备SDS-PAGE凝胶，其中上层浓缩胶浓度为5％，下层分离胶浓度为16％。将蛋白质进行SDS-PAGE后，转印迹至硝酸纤维素膜上。将膜与1∶2000稀释的家兔抗EPSPS多克隆抗血清杂交。然后，将抗体-抗原复合物与1∶3000稀释的偶联有辣根过氧化物酶的山羊抗家兔IgG(Promega)反应以形成三元复合物。添加DAB溶液(PIERCE)以显色。

如图7所示，EPSPS蛋白的分子量为大约47kDa。在耐受草苷膦的转基因烟草中检测到了EPSPS蛋白。在不耐受草苷膦的转基因烟草中，虽然通过PCR检测到了aroA基因的存在，但是通过Western检测不到EPSPS蛋白(结果未显示)。

实施例8：转基因植物T1代幼苗的草甘膦抗性测定法-种子萌发测定法

为了检测EPSPS基因aroA在传代过程中的可遗传性和稳定性，对T0代植株的种子进行了种子萌发测定法，检测T1代幼苗对草苷膦的耐受性。

如图8所示，预实验确定了使野生型烟草完全白化死亡的最低草苷膦浓度为0.5mM。将转基因烟草T0代植株的种子表面灭菌(70％乙醇30秒，20％次氯酸钠溶液30分钟，无菌水洗涤数次)，接种于含不同浓度(0、0.1mM和1mM)草苷膦(Sigma)的MS培养基上，于25℃在黑暗中培养3天以萌发，再转为光照条件培养，3-4周后观察幼苗生长情况。

如图9所示，当草苷膦浓度为1mM时，多数2323系转基因烟草的种子很好地萌芽和生长；而空载体对照烟草的种子萌芽但不能存活，慢慢白化死亡。当草苷膦浓度为0mM时，2323系转基因烟草和空载体对照烟草的种子均很好地萌芽和生长。如图10所示，当草苷膦浓度为10mM时，T1代幼苗仍能够萌芽生长。

另外，在含有草苷膦的平板上，耐受草苷膦的转基因植株种子的萌发表现出两种情况：除了多数种子能够很好的萌发和生长；还有少数种子表现出类似空对照植株种子的状况，即能发芽但不能生长而是慢慢地白化死亡。表1是对6株耐受草苷膦的转基因烟草的种子萌芽和生长的数学统计结果。其中，同一植株的T1幼苗对草苷膦表现出耐受性与敏感性的比例接近3∶1，符合孟德尔遗传定律(Mendelian Law)。

表1：转基因植株的T1代幼苗对草苷膦的耐受性和敏感性

Figure DEST_PATH_RE-GA20172578200910139099201D00201

对T1代幼苗长成的植株如上所述进行了PCR检测。如图10所示，PCR结果表明对草苷膦耐受的幼苗中能检测到目的片段的存在；对草苷膦敏感的幼苗中则未检测到目的片段的存在。

序列表

<110>北京大学

<120>转基因构建体和转基因植物

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

CAT GCC ATG GAA GTA ACA ATA CAG CCC GGA G

<210>2

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

GTT ACT CGA GTG AGA AAT TAA ATT GAT GGT TT

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

ATG GCG CAA GTT AGC AGA ATC

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

TCA TGA GAA GTT GAA TTG ATG

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

CAA ATG TGG AAG AAT TTC ATC

<210>6

<211>75

<212>PRT

<213>拟南芥

<220>

<223>拟南芥EPSPS叶绿体转运肽的氨基酸序列

<400>6

MAQVSRICNG VQNPSLISNL SKSSQRKSPL SVSLKTQQHP RAYPISSSWG LKKSGMTLIG

SELRPLKVMS SVSTA

<210>7

<211>225

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<223>拟南芥EPSPS叶绿体转运肽的核苷酸序列

<400>7

ATGGCGCAAG TTAGCAGAAT CTGCAATGGT GTGCAGAACC CATCTCTTAT CTCCAATCTC

TCGAAATCCA GTCAACGCAA ATCTCCCTTA TCGGTTTCTC TGAAGACGCA GCAGCATCCA

CGAGCTTATC CGATTTCGTC GTCGTGGGGA TTGAAGAAGA GTGGGATGAC GTTAATTGGC

TCTGAGCTTC GTCCTCTTAA GGTCATGTCT TCTGTTTCCA CGGCG

<210>8

<211>431

<212>PRT

<213>恶臭假单胞菌

<220>

<223>恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA编码的氨基酸序列

<400>8

EKVTIQPGDL TGIIQSPASK SSMQRACAAA LVAKGISEII NPGHSNDDKA ARDIVSRLGA

RLEDQPDGSL QITSEGVKPV APFIDCGESG LSIRMFTPIV ALSKEEVTIK GSGSLVTRPM

DFFDEILPHL GVKVKSNQGK LPLVIQGPLK PADVTVDGSL SSQFLTGLLL AYAAADASDV

AIKVTNLKSR PYIDLTLDVM KRFGLKTPEN RNYEEFYFKA GNVYDETKMQ RYTVEGDWSG

GAFLLVAGAI AGPITVRGLD IASTQADKAI VQALMSANAG IAIDAKEIKL HPADLNAFEF

DATDCPDLFP PLVALASYCK GETKIKGVSR LAHKESDRGL TLQDEFGKMG VEIHLEGDLM

RVIGGKGVKG AEVSSRHDHR IAMACAVAAL KAVGETTIEH AEAVNKSYPD FYSDLKQLGG

VVSLNHQFNF S

<210>9

<211>1293

<212>DNA

<213>恶臭假单胞菌

<220>

<223>恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA的野生型核苷酸序列

<400>9

ATGCAAGTAA CAATACAGCC CGGAGATCTG ACTGGAATTA TCCAGTCACC CGCTTCAAAA

AGTTCGATGC AGCGAGCTTG TGCTGCTGCA CTGGTTGCAA AAGGAATAAG TGAGATCATT

AATCCCGGTC ATAGCAATGA TGATAAAGCT GCCAGGGATA TTGTAAGCCG GCTTGGTGCC

AGGCTTGAAG ATCAGCCTGA TGGTTCTTTG CAGATAACAA GTGAAGGCGT AAAACCTGTC

GCTCCTTTTA TTGACTGCGG TGAATCTGGT TTAAGTATCC GGATGTTTAC TCCGATTGTT

GCGTTGAGTA AAGAAGAGGT GACGATCAAA GGATCTGGAA GCCTTGTTAC AAGACCAATG

GATTTCTTTG ATGAAATTCT TCCGCATCTC GGTGTAAAAG TTAAATCTAA CCAGGGTAAA

TTGCCTCTCG TTATACAGGG GCCATTGAAA CCAGCAGACG TTACGGTTGA TGGGTCCTTA

AGCTCTCAGT TCCTTACAGG TTTGTTGCTT GCATATGCGG CCGCAGATGC AAGCGATGTT

GCGATAAAAG TAACGAATCT CAAAAGCCGT CCGTATATCG ATCTTACACT GGATGTGATG

AAGCGGTTTG GTTTGAAGAC TCCCGAGAAT CGAAACTATG AAGAGTTTTA TTTCAAAGCC

GGGAATGTAT ATGATGAAAC GAAAATGCAA CGATACACCG TAGAAGGCGA CTGGAGCGGT

GGTGCTTTTT TACTGGTAGC GGGGGCTATT GCCGGGCCGA TCACGGTAAG AGGTTTGGAT

ATAGCTTCGA CGCAGGCTGA TAAAGCGATC GTTCAGGCTT TGATGAGTGC GAACGCAGGT

ATTGCGATTG ATGCAAAAGA GATCAAACTT CATCCTGCTG ATCTCAATGC ATTTGAATTT

GATGCTACTG ATTGCCCGGA TCTTTTTCCG CCATTGGTTG CTTTGGCGTC TTATTGCAAA

GGAGAAACAA AGATCAAAGG CGTAAGCAGG CTGGCGCATA AAGAAAGTGA CAGAGGATTG

ACGCTGCAGG ACGAGTTCGG GAAAATGGGT GTTGAAATCC ACCTTGAGGG AGATCTGATG

CGCGTGATCG GAGGGAAAGG CGTAAAAGGA GCTGAAGTTA GTTCAAGGCA CGATCATCGC

ATTGCGATGG CTTGCGCGGT GGCTGCTTTA AAAGCTGTGG GTGAAACAAC CATCGAACAT

GCAGAAGCGG TGAATAAATC CTACCCGGAT TTTTACAGCG ATCTTAAACA ACTTGGCGGT

GTTGTATCTT TAAACCATCA ATTTAATTTC TCA

<210>10

<211>1293

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>恶臭假单胞菌EPSPS基因aroA的经过密码子优化的核苷酸序列

<400>10

GAGAAAGTGA CAATCCAACC AGGAGATCTG ACCGGAATCA TCCAATCACC AGCTTCAAAA

AGCTCCATGC AaaGAGCTTG TGCTGCTGCt tTGGTTGCtA AgGGAATttc TgaaATtATT

AAcCCaGGTC ATAGCAAcGA TGATAAgGCT GCtAGaGATA TTGTtAGCaG aCTTGGTGCt

AGaCTTGAAG ATCAaCCTGA TGGTTCTTTG CAaATtACtt cTGAAGGaGT tAAgCCTGTt

GCTCCTTTcA TTGAtTGCGG TGAATCTGGT TTgtcTATta GaATGTTcAC TCCaATTGTT

GCtTTGtcTA AgGAAgaaGT GACtATtAAg GGATCTGGAA GCCTTGTTAC tAGACCAATG

GATTTCTTcG ATGAAATTCT TCCaCATtTg GGTGTtAAgG TTAAgTCTAA CCAaGGTAAg

TTGCCTtTgG TTATtCAaGG aCCATTGAAg CCAGCtGAtG TTACtGTTGA TGGaTCtTTg

TCTTCTCAaT TCCTTACtGG TTTGTTGCTT GCtTAcGCtG CtGCtGATGC tAGCGATGTT

GCtATtAAgG TtACtAActT gAAgAGCCGT CCaTAcATtG ATCTTACttT GGATGTGATG

AAGaGaTTcG GTTTGAAGAC TCCaGAGAAc aGAAACTAcG AAgaaTTcTA cTTCAAgGCt

GGaAAcGTtT AcGATGAAAC tAAgATGCAA aGATACACCG TtGAAGGaGA tTGGAGCGGT

GGTGCTTTcT TgtTGGTtGC tGGaGCTATT GCtGGaCCaA TtACtGTtAG AGGTTTGGAT

ATtGCTTCGA CtCAaGCTGA TAAgGCtATt GTTCAaGCTT TGATGtcTGC tAACGCtGGT

ATTGCtATTG ATGCtAAgga aATtAAgCTT CATCCTGCTG ATtTgAAcGC tTTcGAATTc

GATGCTACTG ATTGCCCaGA TCTTTTcCCa CCATTGGTTG CTTTGGCtTC TTAcTGCAAg

GGAGAAACtA AGATtAAgGG aGTtAGCAGa tTGGCtCATA AgGAAtcTGA tAGAGGATTG

ACttTGCAaG AtgaaTTCGG aAAgATGGGT GTTGAAATtC ACCTTgaaGG AGATtTGATG

aGaGTGATtG GAGGaAAgGG aGTtAAgGGt GCTGAAGTTt cTTCAAGaCA CGATCATaGa

ATTGCtATGG CTTGCGCtGT GGCTGCTTTg AAgGCTGTGG GTGAAACtAC CATtGAACAT

GCtGAAGCtG TGAAcAAgTC tTACCCaGAT TTcTACAGCG ATCTTAAgCA ACTTGGaGGT

GTTGTtTCTT TgAACCATCA ATTcAAcTTC TCA

Claims

1.一种分离的多核苷酸，其以从5’到3’的方向由编码CTP的核苷酸序列和编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列组成，其中所述编码CTP的核苷酸序列是编码拟南芥EPSPS CTP的核苷酸序列，且所述编码草苷膦耐受型EPSPS的核苷酸序列是编码恶臭假单胞菌EPSPS的核苷酸序列，且其中所述拟南芥EPSPS CTP的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，所述恶臭假单胞菌EPSPS的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。

2.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述编码拟南芥EPSPS CTP的核苷酸序列是SEQ ID NO：7。

3.权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述编码恶臭假单胞菌EPSPS的核苷酸序列是SEQ ID NO：9。

4.权利要求1或2所述的多核苷酸，其中所述编码恶臭假单胞菌EPSPS的核苷酸序列是经过密码子优化的编码恶臭假单胞菌EPSPS的核苷酸序列。

5.权利要求4所述的多核苷酸，其中所述经过密码子优化的编码恶臭假单胞菌EPSPS的核苷酸序列是SEQ ID NO：10。

6.一种核酸构建体，其包含权利要求1-5任一项所述分离的多核苷酸。

7.一种重组载体，其包含权利要求1-5任一项所述分离的多核苷酸，或包含权利要求6所述的核酸构建体。

8.一种重组宿主细胞，其包含权利要求1-5任一项所述分离的多核苷酸，或包含权利要求6所述的核酸构建体，或包含权利要求7所述的重组载体，且其中所述重组宿主细胞为细菌细胞。

9.权利要求8的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为农杆菌。

10.权利要求9的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为根瘤农杆菌。

11.权利要求8的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为大肠杆菌。

12.制备转基因植物细胞和转基因植物的方法，其包括将权利要求1-5任一项所述分离的多核苷酸、权利要求6所述的核酸构建体、权利要求7所述的重组载体、或权利要求8-10任一项所述的重组宿主细胞导入植物细胞的步骤。

13.赋予植物细胞或植物以草苷膦耐受性的方法，其包括将权利要求1-5任一项所述分离的多核苷酸、权利要求6所述的核酸构建体、权利要求7所述的重组载体、或权利要求8-10任一项所述的重组宿主细胞导入植物细胞的步骤。

14.一种融合蛋白，其以从N端到C端的方向由CTP和草苷膦耐受型EPSPS组成，其中所述CTP是拟南芥EPSPS CTP，且所述草苷膦耐受型EPSPS是恶臭假单胞菌EPSPS，且其中所述拟南芥EPSPS CTP的氨基酸序列为SEQ ID NO：6，所述恶臭假单胞菌EPSPS的氨基酸序列为SEQ ID NO：8。