KR20140120934A - 신규한 클래스의 글리포세이트 저항성 유전자 - Google Patents

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KR20140120934A
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사티쉬 케이 네어
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

본원은 신규한 클래스의 EPSPS 효소, 및 그를 코딩하는데 유용한 핵산에 관한 것이다.

Description

신규한 클래스의 글리포세이트 저항성 유전자{NOVEL CLASS OF GLYPHOSATE RESISTANCE GENES}
우선권 주장
본원은 2012년 2월 1일 출원된 미국 특허 가출원 제61/593,555호, 및 또한 2012년 4월 14일 출원된 미국 특허 가출원 제61/625,222호의 이익을 주장한다.
37 C.F.R. § 1.821(c) 또는 (e)에 따른 진술 - 서열 목록은 ASCII 텍스트 파일로서 제출하였다.
37 C.F.R. § 1.821(c) 또는 (e)에 따라, ASCII 텍스트 버전의 서열 목록을 담은 파일을 본원과 함께 제출하였다.
기술 분야
본원은 식물 생명공학에 관한 것이다. 일부 실시양태는 N-(포스포노메틸) 글라이신의 대사에 관여하는 신규한 폴리펩티드, 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 그를 확인하기 위한 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태는 상기한 폴리펩티드 및/또는 핵산을 포함하는 식물, 식물 부분, 및 식물 세포에 관한 것이다.
잡초 종은 경작지에서 오랫동안 문제가 되어 왔다. 잡초 방제는 노동 집약적인 작업일 수 있지만, 효율적인 잡초 사멸 화학 제초제의 이용가능성에 의해 더 쉬워지게 되었다. 제초제의 광범위한 사용은 개선된 작물 품종 및 비료와 함께 농업에서 "녹색 혁명"에 유의하게 기여하였다. 특히 유용한 제초제는 광범위 스펙트럼의 제초 활성을 갖는 것이다. 불행하게도, 광범위 스펙트럼의 제초제는 대개 제초제에 노출된 작물 식물에 대해 유해한 효과를 나타낸다. 이 문제를 극복하는 한 가지 방법은 광범위 스펙트럼의 제초제에 견디는 작물 식물을 생산하는 것이다.
광범위 스펙트럼의 제초제의 한 예는 N-포스포노메틸-글라이신 (글리포세이트로서도 공지됨)이다. 글리포세이트는 예를 들어, 무경운 농업 (no-till farming)에서 작물 식재에 앞서 잡초를 방제하기 위해 전세계의 농부들이 광대하게 사용해 왔다. 추가로, 글리포세이트는 생산 주기 또는 윤작 사이에 잡초 및 자생 (volunteer) 식물을 방제하기 위해 효율적인 수단이다. 글리포세이트는 사용 후에 토양에 잔재하지 않고, 농업에서 사용하기 위해 이용가능한 환경적으로 가장 안전하고 광범하게 효과적인 화학 제초제 중 하나인 것으로 널리 알려졌다.
글리포세이트는 쉬킴산 경로를 억제함으로써 식물을 사멸시킨다. 이 경로는 아미노산, 비타민, 및 식물 호르몬을 비롯한 방향족 화합물의 생합성을 일으킨다. 글리포세이트는 효소 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (일반적으로 "EPSP 신타제" 및 "EPSPS"로서 칭함)에 결합하여 그의 활성을 억제함으로써 포스포에놀피루브산 (PEP) 및 3-포스포쉬킴산의 5-에놀피루빌-3-포스포쉬킴산으로의 축합을 차단한다.
불행하게도, 글리포세이트에 대해 자연적으로 견디는 작물 식물을 알려져 있지 않고, 따라서, 경작된 작물에서 잡초 방제를 위한 상기 제초제의 사용은 제한되었다. 글리포세이트-내성 작물 식물을 생산하는 하나의 방법은 유전공학의 기술을 이용하여 EPSPS 유전자의 이종성 글리포세이트-내성 형태를 코딩하는 유전자를 작물 식물 내로 도입하는 것이다. 화학적 돌연변이 유발을 이용하여, EPSPS의 글리포세이트 내성 형태가 박테리아에 도입되었고, 이종성 유전자는 글리포세이트-내성 식물을 생산하기 위해 식물 내로 도입되었다 (예를 들어, 문헌 [Comai et al. (1983) Science 221:370-71] 참조). 이종성 EPSPS 유전자는 목적하는 수준의 내성을 얻기 위해 작물 식물 내에서 과발현될 수 있다.
EPSPS는 각각 βαβαββ-폴딩 (folding) 단위의 3개의 카피를 포함하는 로 2개의 유사한 도메인 (domain)으로 폴딩된다 (문헌 [Stallings et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:5046-50]). Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386, 및 Lys-411은 이. 콜라이 (E. coli)로부터의 EPSPS의 보존된 잔기이다 (문헌 [Schonbrunn et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:1376-80]). EPSPS 활성에 중요한 보존된 잔기는 또한 Arg-100, Asp-242, 및 Asp-384를 포함한다 (문헌 [Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374:253-6]). Arg-27은 S3P에 결합한다 (문헌 [Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302]).
EPSPS 아미노산 코딩 서열의 변경의 결과로서 글리포세이트-내성인 야생형 EPSPS의 변이체가 단리되었다 (문헌 [Kishore and Shah (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:627-63]; [Wang et al. (2003) J. Plant Res. 116:455-60]; [Eschenburg et al. (2002) Planta 216:129-35]). 문헌 [He et al. (2001) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6]에서는 돌연변이 유발 및 이. 콜라이와 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) EPSPS 유전자 사이의 재조합에 의해 증가된 글리포세이트 내성을 갖는 EPSPS 효소를 개발하였고, 위치 42 (T42M) 및 위치 230 (Q230K)에서의 돌연변이가 관찰된 저항성을 책임질 가능성이 있음을 제안하였다. 후속 연구 (문헌 [He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67:1405-9])는 T42M 돌연변이 (트레오닌→메티오닌)가 이. 콜라이 및 에스. 티피무리움 효소 둘 모두의 내성 개선에 충분함을 보여준다.
현재, 당업계에 알려진 EPSPS의 3개의 일차적인 클래스가 존재한다: 클래스 I (글리포세이트 감수성); 클래스 II (PCT 국제 특허 공개 WO2006/012080 A2; [Liang et al. (2009) J. Biotechnol. 144(4):330-6]); 및 클래스 III (PCT 국제 특허 공개 WO2007/0082269 A2; 미국 특허 공개 US 2010/0144530 A1).
관련 기술의 상기한 예 및 이와 관련된 제한은 단지 예시적인 것으로서, 다른 내용을 배제하고자 의도되지 않는다. 관련 기술의 다른 제한은 명세서를 읽음으로써 당업자에게 자명해질 것이다.
발명의 개요
본원에서 보존된 아미노산 서열 모티프 (1차 구조) 및 2차 및 3차 구조적 요소 둘 모두에 의해 확인가능한 신규한 클래스의 EPSPS 효소가 설명된다. 이들 신규한 EPSPS 효소는 "클래스 IV" EPSPS 효소로 언급된다. 일부 실시양태에 따르면, 이들 효소의 구조는 효소(들)을 이종성으로 발현하는 세포 또는 유기체에서 글리포세이트의 대사에 영향을 주기 위해, 예를 들어 세포 또는 유기체에서 글리포세이트 내성을 제공하기 위해서 본원에서 예시된 바와 같이 변경될 수 있다. 특정 실시양태에서, 클래스 IV EPSPS 효소의 보존된 구조적 요소는 트랜스제닉 (transgenic) 유기체 (예를 들어, 식물)에 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 추가의 EPSPS 효소를 확인하기 위해서 이용된다.
따라서, 일부 실시양태는 서열 1, 67, 68, 69, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 동일성을 갖는 단리된 폴리펩티드; 및/또는 서열 170-173을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함한다.
일부 실시양태는 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; 및/또는 서열 170-173을 포함하는 EPSPS 효소를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및/또는 서열 170-173을 포함하는 EPSPS 효소를 코딩하는 핵산은 서열 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 및 169로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5%, 및 적어도 약 99.9% 동일성)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태는 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 및/또는 식물 세포를 포함한다. 일부 실시양태는 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 및/또는 식물 세포를 포함한다.
추가의 실시양태에서, 개시내용은 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 및/또는 식물 세포를 클래스 IV EPSPS를 코딩하는 핵산으로 형질전환하고; 클래스 IV EPSPS를 생산하도록 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 글리포세이트에 저항성인 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 및/또는 식물 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태는 글리포세이트 내성 식물 및 이종성 클래스 IV EPSPS를 발현하는 식물 세포를 포함한다.
일부 실시양태는 클래스 IV EPSPS를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다. 특정 예는는 서열 170-173을 포함하는 EPSPS 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
추가의 실시양태는 글리포세이트-저항성 식물을 포함하는 경작지 또는 경작 영역에서 잡초를 방제하기 위한 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 이종성 클래스 IV EPSPS를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물 또는 식물 종자를 경작지 또는 경작 영역에 식재하고; 식물에 유의한 영향을 주지 않으면서 경작지에서 잡초를 방제하기 위해 충분한 양의 글리포세이트를 경작지 또는 경작 영역에 적용하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 글리포세이트에 저항성인 식물의 조직 배양에서 사용하기 위한 재생가능한 세포에 관한 것이다. 상기 조직 배양은 상기한 글리포세이트-저항성 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생할 수 있고, 또한 글리포세이트-저항성 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있다. 상기 조직 배양에서 재생가능한 세포는 예를 들어 배, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스 (callus), 꽃가루, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 꽃, 종자, 꼬투리, 및 줄기일 수 있다. 특정 실시양태는 상기한 내용에 따라 조직 배양으로부터 재생된 식물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 개시내용은 예를 들어 글리포세이트에 저항성인 식물 세포주를 생산할 때 사용하기 위한, 식물을 생산하기 위해 재생가능하지 않은 세포에 관한 것이다. 다른 실시양태에서, 개시내용은 부분적으로 상기 세포를 포함하는 식물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본원은 경작 영역에 식재된 작물에 대한 다중 제초제의 적용에 관한 것이다. 다중 제초제에 추가로 글리포세이트의 상식을 벗어난 적용은 탄력적인 조합과 경제성이 개선되면서 잡초 방제가 제공되도록 상이한 제초제 특성을 이용한다. 예를 들어, 개별적인 제초제는 경작 영역에서 상이한 수명을 가질 수 있고; 즉, 일부 제초제는 그 영역에 적용된 후에 비교적 긴 시간 동안 존속하여 효과를 보일 수 있는 반면, 다른 제초제는 다른 및/또는 비-활성 화합물로 신속히 붕괴될 수 있다. 특정 실시양태에 따른 개선된 제초제 적용 시스템은 재배자가 특정 상황에서 사용하기 위해 특정 제초제를 적절하게 선택할 수 있도록 글리포세이트 및 다중 제초제의 사용을 허용한다.
일부 실시양태에서, 본원은 아래에서 설명되는 바와 같이, 하나 초과의 제초제 또는 제초제의 클래스 또는 서브클래스에 내성인 식물의 제조 및 사용을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 글리포세이트 및 적어도 하나의 다른 제초제 (또는 제초제의 클래스 또는 서브클래스) 또는 화학물질 (또는 화학물질의 클래스 또는 서브클래스) (예를 들어, 살진균제, 살충제, 식물 성장 조절제 등) 둘 모두에 내성인 식물이 제공된다. 상기 식물은 예를 들어 작물 식물을 다중 제초제로 처리하는 것을 포함하는 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 제초제 또는 제초제의 조합물 (상이한 방식의 제초 활성을 통해 각각 작용하는 제초제의 조합물 포함)을 사용한 처리에 내성인 또는 적어도 하나의 제초제 및 적어도 하나의 다른 화학물질의 조합물을 사용한 처리에 내성인 제초제-저항성 식물을 제공한다. 상기 방식에서, 본 개시내용은 잡초가 선택적으로 방제되는 작물 식물의 개선된 재배 방법을 설명하다.
일부 실시양태에 따른 제초제-저항성 식물은 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 상기 문단에 따라, 식물에 제초제 내성 형질; 곤충 저항성 형질; 작물학적 형질; 질병 저항성 형질; 변형된 지방산 형질; 및 감소된 피테이트 (phytate) 형질로 이루어지는 군으로부터 선택된 형질을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 제3 핵산 분자를 포함하는 식물이 제공된다.
일부 예에서, 제초제-내성 식물은 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산 분자 및 글루포시네이트에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 예는 식물에 제초제 내성 형질; 곤충 저항성 형질; 작물학적 형질; 질병 저항성 형질; 변형된 지방산 형질; 및 감소된 피테이트 형질로 이루어지는 군으로부터 선택된 형질을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제초제-내성 식물을 포함한다.
특정 예에서, 제초제-내성 식물은 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산 분자 및 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 효소 (Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449)로도 알려진 아세토락테이트 신타제 (ALS) (Lee et al. (1988) EMBO J. 7:1241)를 억제하는 제초제에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 예는 식물에 제초제 내성 형질; 곤충 저항성 형질; 작물학적 형질; 질병 저항성 형질; 변형된 지방산 형질; 및 감소된 피테이트 형질로 이루어지는 군으로부터 선택된 형질을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제초제-내성 식물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 비제한적인 예를 들어, 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 추가의 저항성 또는 내성을 제공하기 위해, 선택된 곤충 또는 질병에 대한 저항성을 제공하기 위해, 영양분의 향상을 제공하기 위해, 개선된 작물학적 특징을 제공하기 위해, 및 사료, 식품, 산업적 용도, 제약적 용도, 및/또는 다른 용도에 유용한 단백질 또는 다른 생성물을 제공하기 위해 식물 내에서 임의의 다른 핵산 분자와 조합 (또는 "집적 (stacking"))될 수 있다. 그 예는 식물 게놈 내의 관심있는 2 이상의 핵산의 집적을 포함한다. 상기 "유전자 집적"은 2 이상의 이벤트 (event)를 사용한 통상적인 식물 육종, 관심있는 서열을 함유하는 구축물을 사용한 식물의 형질전환, 트랜스제닉 식물의 재-형질전환, 또는 상동성 재조합을 통한 표적화된 통합에 의한 새로운 형질의 부가를 통해 달성될 수 있다. 상기 집적의 특정 예는 다음의 임의의 조합을 포함한다: dgt-28 핵산; dgt-31 핵산; dgt-32 핵산; dgt-33 핵산; Cry34Ab1 핵산; Cry35Ab1 핵산; Cry1F 핵산; Cry1Ac 핵산; aad-12 핵산; aad-1 핵산; pat 핵산; 및 DSM-2 핵산.
본원에 설명되는 예시적인 측면 및 실시양태에 추가로, 추가의 측면 및 실시양태는 다음 설명을 통해 명백해질 것이다.
서열 목록
서열 목록에서, 17개의 예시적인 클래스 IV EPSPS 단백질에 대한 아미노산 서열이 제시된다.
서열 1은 DGT-28의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 67은 DGT-33의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 68은 DGT-32의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 145는 DGT-31의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168은 예시적인 클래스 IV EPSPS 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.
서열 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 및 169는 클래스 IV EPSPS를 코딩하는 예시적인 핵산을 포함한다.
서열 170은 클래스 IV EPSPS 단백질 TARXLF (여기서, X는 A 또는 G임)을 특징으로 하는 보존된 아미노산 서열을 보여준다.
서열 171은 클래스 IV EPSPS 단백질 EGFXEG (여기서, X는 T 또는 A임)을 특징으로 하는 보존된 아미노산 서열을 보여준다.
서열 172는 클래스 IV EPSPS 단백질 GATTARFLPX1LX2AA (여기서, X1은 T 또는 A이고, X2는 A 또는 V임)을 특징으로 하는 보존된 아미노산 서열을 보여준다.
서열 173은 클래스 IV EPSPS 단백질 FDAS를 특징으로 하는 보존된 아미노산 서열을 보여준다.
도 1(a-g)는 앞서 설명된 3개의 클래스의 EPSPS 효소 (예를 들어, 글리포세이트-감수성 aroA)를 예시적인 클래스 IV EPSPS 효소 (예를 들어, DGT-28, DGT-31, DGT-32, 및 DGT-33) (서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168)와 비교하는 다중 서열 정렬을 포함한다. 보존된 모티프는 정렬 아래에 적색으로 도시한다.
도 2는 예시적인 DGT 효소 (즉, DGT-1, DGT-3, 및 DGT-7)의 정렬을 포함한다. 글라이신에서 알라닌으로 변화된 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치를 제1 별표로 표시한다. 트레오닌에서 이소류신으로 변화된 제2 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치를 제2 별표로 표시한다. 프롤린에서 세린으로 변화된 제3 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치를 제3 별표로 표시한다.
도 3-30은 다양한 예시적인 플라스미드의 지도를 포함한다: pDAB107527 (도 3); pDAB105530 (도 4); pDAB105531 (도 5); pDAB105532 (도 6); pDAB105533 (도 7); pDAB105534 (도 8); pDAB4104 (도 9); pDAB102715 (도 10); pDAB107532 (도 11); pDAB107534 (도 12); pDAB102785 (도 13); pDAB100445 (도 14); pDAB102946 (도 15); pDAB100469 (도 16); pDAB102028 (도 17); pDAB102029 (도 18); pDAB102032 (도 19); pDAB102034 (도 20); pDAB100429 (도 21); pDAB100442 (도 22); pDAB100430 (도 23); pDAB102036 (도 24); pDAB102038 (도 25); pDAB102040 (도 26); pDAB102042 (도 27); pDAB107712 (도 28); pDAB107713 (도 29); 및pDAB107714 (도 30).
도 31은 1 mM PEP를 사용하여 DGT-1 (A) 및 DGT-7 (B) 내에 다양한 돌연변이를 도입한 후에 얻어진 IC50 값을 포함한다. 도 31(A) 및 도 31(B) IC50 곡선 모두에 대해, 닫힌 삼각형은 야생형을 나타내고, 닫힌 원은 GA 돌연변이체를 나타내고, 열린 정사각형은 GAPS 돌연변이체를 나타내고, 닫힌 정사각형은 TIPS 돌연변이체를 나타낸다.
도 32-54는 다양한 예시적인 플라스미드의 지도를 포함한다: pDAB102719 (도 32); pDAB102718 (도 33); pDAB107663 (도 34); pDAB107664 (도 35); pDAB107665 (도 36); pDAB107666 (도 37); pDAB109812 (도 38); pDAB101556 (도 39); pDAB107698 (도 40); pDAB108384 (도 41); pDAB108385 (도 42); pDAB108386 (도 43); pDAB108387 (도 44); pDAB102716 (도 45); 및 pDAB102717 (도 46).
도 55는 SsvESPS 신타제의 고-해상도 모델의 전체적인 구조의 리본 형태를 포함한다. 2개의 리간드 (S3P 및 글리포세이트)는 판 데어 발스 (van der Waals) 구로서 제시된다. Ala-84를 보유하는 내부 나선은 청색으로 제시된다.
도 56은 클래스 IV 내성 효소를 규정하는 차이를 강조하는 이. 콜라이 및 에스. 스비세우스 (S. sviceus) ESPS 신타제의 활성 부위의 근접도를 포함한다. SsvESPS 신타제에서, Ala-84 (제초제에 대한 1차 저항성 결정자)를 보유하는 내부 나선이 글리포세이트 결합 포켓 내로 추가로 들어가 상기 리간드의 결합을 방해함을 주목한다.
I. 개요
N-(포스포노메틸메틸) 글라이신의 대사에 관여하는 신규한 폴리펩티드, 및 그러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 본원에 개시한다. 일부 예에서, 그러한 폴리펩티드는, 폴리펩티드가 예를 들어 그의 천연 기질인 포스포에놀피루베이트 (PEP)와 EPSP 신타제의 결합에 불리한 영향을 미치지 않으면서 이종성으로 발현되는 식물 세포에서 글리포세이트에 대한 내성을 부여한다 (또는 증가시킨다).
II. 용어
본 개시내용의 범위를 추가로 분명하게 나타내기 위해서, 다음의 구체적인 정의, 용어, 및 약어가 제공된다.
구체적으로 달리 규정되지 않으면, 본원에서 사용하는 모든 기술 및 학술 용어는 당업자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 그 용어가 나오는 문맥으로부터 달리 분명하지 않으면, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수 용어는 단수를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 요소 또는 성분에 선행하여 사용되는 부정관사 "a" 및 "an"는 요소 또는 성분의 경우의 수 (즉, 발생)에 대해 비제한적이다. 수치값이 본원에서 제공될 경우 (예를 들어, "약 X 미만", "X 미만", 및 "예를 들어, X1 ... 및 X2"), 범위는 마치 상기 포함된 값 및 범위가 명시적으로 언급된 것처럼 제시된 범위 내에 포함되는 모든 값 및 값의 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포괄하는", "포함하는", "갖는", 및 "함유하는", 및 그의 변형 표현은 제한을 두지 않는 의미이다 (즉, 비-한정적이다). 예를 들어, 일련의 요소를 포함하는 조성 또는 방법은 반드시 해당 요소만으로 제한되는 것은 아니다. 상기 조성 또는 방법은 명시적으로 나열된 또는 조성 또는 방법에 고유한 다른 요소를 포함할 수 있다 (또는 포함하지 않을 수 있다). 추가로, 그 반대 의미로 명시적으로 언급되지 않으면, "또는"은 포괄적인 (및 비포괄적인) 의미로 사용된다. 예를 들어, 조건 "A 또는 B"는 다음의 임의의 내용으로 충족된다: A는 참이고 (또는 존재하고) B는 거짓이고 (또는 존재하지 않고); A는 거짓이고 (또는 존재하지 않고) B는 참이고 (또는 존재하고); A와 B 둘 모두가 참이다 (또는 존재한다).
식물: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "식물"은 전체 식물 및 임의의 후손, 세포, 조직, 또는 식물의 일부를 포함한다. 용어 "식물 부분"은 예를 들어 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는 식물의 임의의 부분(들)을 포함한다: 종자 (성숙 종자 및 미성숙 종자 포함); 식물 삽목 (cutting); 식물 세포; 식물 세포액; 식물 기관 (예를 들어, 꽃가루, 배, 꽃, 열매, 싹, 잎, 뿌리, 줄기, 및 외식편). 식물 조직 또는 식물 기관은 종자, 원형질체, 캘러스, 또는 구조적 또는 기능적 단위로 조직화된 식물 세포의 임의의 다른 군일 수 있다. 식물 세포 또는 조직 배양액은 그로부터 세포 또는 조직을 얻은 식물의 생리학적 및 형태학적 특징을 갖는 식물을 재생할 수 있고, 식물과 실질적으로 동일한 유전자형을 갖는 식물을 재생할 수 있다. 이와 대조적으로, 일부의 식물 세포는 식물을 생산하기 위해 재생될 수 없다. 식물 세포 또는 조직 배양액 내에서 재생가능한 세포는 배, 원형질체, 분열조직 세포, 캘러스, 꽃가루, 잎, 꽃밥, 뿌리, 근단, 수염 (silk), 꽃, 알맹이 (kernel), 이삭 (ear), 속대 (cob), 깍지, 또는 줄기일 수 있다.
식물 부분은 수확가능한 부분 및 자손체 식물의 번식에 유용한 부분을 포함한다. 번식에 유용한 식물 부분은 예를 들어 비제한적으로 종자; 열매; 삽목; 묘목; 괴경; 및 근경을 포함한다. 수확가능한 식물의 일부는 예를 들어 비제한적으로 꽃; 꽃가루; 묘목; 괴경; 잎; 줄기; 열매; 종자; 및 뿌리를 포함하는 임의의 유용한 식물의 일부일 수 있다.
식물 세포는 원형질체 및 세포벽을 포함하는, 식물의 구조적 및 생리학적 단위이다. 식물 세포는 단리된 단일 세포, 또는 세포의 응집체 (예를 들어, 부서지기 쉬운 캘러스 및 배양된 세포)의 형태일 수 있고, 보다 고차원적으로 조직화된 단위 (예를 들어, 식물 조직, 식물 기관, 및 식물)의 일부일 수 있다. 따라서, 식물 세포는 원형질체, 배우체 생산 세포, 또는 전체 식물로 재생할 수 있는 세포 또는 세포의 집단일 수 있다. 따라서, 다수의 식물 세포를 포함하고 전체 식물로 재생할 수 있는 종자는 본원의 실시양태에서 "식물 세포"로 간주된다.
제초제 저항성/내성: 글리포세이트에 대해 저항성 또는 내성인 식물을 언급할 때, 이것은 식물에 대한 일정량의 글리포세이트의 적용이 식물에게 유의한 영향을 주거나 또는 식물을 사멸시킴을 의미하고, 여기서 동일한 종의 야생형 식물은 상기량의 글리포세이트의 적용에 의해 유의한 영향을 받고/받거나 사멸될 것이다. 식물은 특정 제초제에 대해 자연적으로 내성일 수 있거나, 또는 식물은 유전공학, 예컨대 선택적 육종; 유전자 형질전환; 및/또는 식물의 게놈 내의 도입 유전자 (transgene)의 도입의 결과로서 제초제 내성으로 만들 수 있다. "글리포세이트 내성 식물"은 그를 발현하는 이종성 식물 또는 다른 유기체에 제공될 때 제초제 내성을 부여하는 (즉, 식물 또는 다른 유기체를 제초제-내성으로 만드는) 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 함유하는 식물을 의미한다.
글리포세이트에 대해 저항성 또는 내성인 식물은 식물에 대한 글리포세이트의 적용에 대해 일부의 최소 영향을 보일 수 있다. 예를 들어, 식물의 정상적인 성장 및 발달의 변경이 존재할 수 있고, 여기서 식물은 스트레스 또는 질병과 연관된 징후 또는 증상을 보일 수 있다. 글리포세이트에 저항성 또는 내성인 식물에 대한 글리포세이트의 적용에 따른 상기 최소 영향은 글리포세이트에 감수성인 식물에 대한 글리포세이트의 적용에 따른 불리한 영향과 대조적이다. 당업자는 글리포세이트에 저항성인 식물과 글리포세이트에 감수성인 식물을 구분할 수 있다. 글리포세이트 내성을 부여하는 핵산을 포함하는 식물에 대한 글리포세이트의 적용은 글리포세이트에 내성을 부여하는 핵산 분자를 포함하지 않는 동일한 종의 식물에 대한 동일한 양의 글리포세이트의 적용보다 유의하게 더 작은 영향을 야기한다.
제초제 또는 다른 화학물질에 내성인 식물은 적절한 대조 식물에 비해 개선된 내성을 보인다. 제초제 또는 다른 화학물질 처리에 따른 손상은 식물 성장 또는 복지의 임의의 파라미터를 평가함으로써 평가될 수 있다. 상기 파라미터는 당업자에게 알려져 있고, 그의 선택은 당업자의 판단에 따라 실시될 수 있다. 식물 손상은 개개의 식물 또는 식물의 군(들)의 식물 성장 또는 복지에 대한 하나 이상의 적합한 파라미터(들)의 시각적 검사 및/또는 통계적 분석에 의해 평가될 수 있다. 따라서, 손상은 예를 들어 비제한적으로 식물 높이; 식물 중량; 잎 색상; 잎 길이; 개화; 번식력; 수염나옴 (silking); 수확량; 및 종자 생산을 포함하는 파라미터를 평가함으로써 평가될 수 있다. 또한, 손상은 특정 발달 단계 (예를 들어, 수염나옴, 개화, 및 꽃가루 날림)까지 경과한 시간, 또는 식물이 특정 화학물질 및/또는 제초제 처리로부터 회복될 때까지 경과한 시간을 평가함으로써 평가될 수 있다.
손상 평가시에, 통계적 분석 또는 정량적 비교가 가능할 수 있도록 특정 손상 정도에 값이 할당될 수 있다. 특정 손상 정도를 설명하기 위한 값의 범위의 사용은 당업계에 알려져 있고, 임의의 적합한 범위 또는 척도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 제초제 손상 점수 (내성 점수로도 불림)가 할당될 수 있다. 따라서, 제초제 내성은 또한 상기 척도에서 다른 등급에 의해 표시될 수 있고, 여기서 적절한 대조 식물 (또는 대조 식물의 군)은 해당 식물의 군보다 제초제 처리에 반응하여 척도에 대해 통계상 더 낮은 점수를 보인다.
제초제 또는 다른 화학물질에 의해 야기된 손상은 식물을 제초제로 처리한 후 다양한 시간에 평가될 수 있다. 종종, 손상은 대략 대조 식물이 최대 손상을 보이는 시간에 평가된다. 때때로, 손상은 처리가 실시된 크기 또는 시기에 비해 제초제 또는 다른 화학물질로 처리되지 않은 대조 식물이 측정가능하게 성장하고/하거나 발달된 기간이 경과한 후에 평가된다. 손상은 해당 식물을 제초제로 처리하고 임의의 많은 적합한 시간, 예를 들어 12시간; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 및/또는 14일; 3 및/또는 4주; 또는 이보다 긴 시간이 경과한 후에 평가될 수 있다. 시험 및 대조 식물의 처리에 반응한 차이의 검출을 허용한다면, 어떠한 평가 시간도 적합하다.
제초제는 식물에 대한 효과가 없을 때, 식물에 대한 일부 효과를 갖고 식물이 나중에 그로부터 회복될 때, 또는 식물에 유해한 효과를 갖지만 예를 들어 잡초에 대한 특정 제초제의 효과에 의해 상쇄될 때 식물에게 "유의한 영향을 주지" 않는다. 따라서, 예를 들어, 작물 식물은 식물이 적절한 대조 식물 (예를 들어, 동일한 종의 비처리된 식물)에 비해 식물 건강 및/또는 생산성을 나타내는 적어도 하나의 적합한 파라미터의 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만의 감소를 보인다면, 제초제 또는 다른 처리에 의해 "유의한 영향을 받지" 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 식물은 식물이 적절한 대조 식물에 비해 대조 식물이 보인 손상보다 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 또는 1000% 이상 더 작은 손상을 보인다면, 제초제 또는 다른 화학물질에 내성이다. 제초제 또는 다른 처리에 의해 유의한 영향을 받지 않는 작물 식물은 적어도 하나의 파라미터의 감소를 보일 수 있지만, 그 감소는 특성상 일시적이고, 식물은 예를 들어 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 또는 약 6주 내에 충분히 회복한다. 특정 실시양태에서, 제초제 또는 다른 화학물질에 대해 내성인 식물은 식물이 제초제 또는 다른 화학물질의 적용에 의해 유의한 영향을 받지 않는다는 사실을 특징으로 할 수 있다.
식물 건강 및/또는 생산성을 나타내는 적합한 파라미터는 예를 들어 비제한적으로 식물 높이; 식물 중량; 잎 길이; 특정 발달 시기까지 경과한 시간; 개화; 수확량; 및 종자 생산을 포함한다. 파라미터의 평가는 파라미터의 시각적 검사 및/또는 통계적 분석에 의해 수행될 수 있다. 해당 식물 및 대조 식물에서 평가된 후에, 비교는 해당 식물이 제초제 또는 다른 처리에 의해 유의한 영향을 받는지 결정하기 위해 수행될 수 있다.
제초제 (또는 다른 화학물질)에 대한 저항성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 적절한 대조 식물은 추정되는 이종성 제초제 내성 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하지 않는 동일한 종의 식물, 및 추정되는 이종성 제초제 내성 핵산 및/또는 폴리펩티드를 포함하지만 제초제로 처리되지 않은 식물을 포함한다.
제초제: "제초제"는 식물에 일시적이거나 영구적인 손상을 야기하는 화학물질이다. 제초제의 비제한적인 예는 본원의 다른 곳에서 나열되고, 추가로 상세히 논의된다. 제초제는 식물 또는 그의 세포 내로 도입될 수 있거나 또는 도입되지 않으면서 식물 또는 세포에 대해 작용할 수 있다. "활성 성분"은 제제의 식물독성을 책임지는 제초제 제제 내의 화학물질이다. 상업적인 제초제 제제 내의 활성 성분은 제품 라벨 상의 활성 성분으로서 일반적으로 확인된다. 제품 라벨 정보는 미국 환경보호국 (U.S. Environmental Protection Agency)으로부터 이용가능하고, oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own에서 온라인 상으로 업데이트된다. 제품 라벨은 또한 www.cdms.net에서 온라인 상에서 이용가능하다.
제초제에 관하여 사용할 때, 용어 "산 당량"은 제초 활성 모 산으로서의 비율 또는 양을 의미한다.
단리된: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 폴리펩티드)은 성분의 화학적 또는 기능적 변화를 가져오면서 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)으로부터 실질적으로 분리되거나, 별도로 생산되거나, 정제된 것이다 (예를 들어, 핵산은 핵산을 염색체 내의 나머지 DNA에 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있다). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 또한, 이 용어는 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 및 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
핵산: 용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산", 및 "핵산 분자"는 본원에서 교환가능하게 사용되고, 단일 핵산; 복수의 핵산; 핵산 단편, 변이체, 또는 그의 유도체; 및 핵산 구축물 (예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 및 플라스미드 DNA (pDNA))을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 전장 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열, 또는 비번역 5' 및/또는 3' 서열 및 코딩 서열(들)을 비롯한 그의 단편을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 이루어질 수 있고, 이것은 비변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 변형된 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 단일- 및 이중 가닥 DNA; 단일- 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 DNA; 단일- 및 이중 가닥 RNA; 및 단일- 및 이중 가닥 영역의 혼합물인 RNA로 이루어질 수 있다. DNA 및 RNA를 포함하는 혼성체 분자는 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 단일- 및 이중 가닥 영역의 혼합물일 수 있다. 상기 용어는 또한 화학적으로, 효소에 의해, 및 대사적으로 변형된 형태의 뉴클레오티드 또는 핵산을 포함한다.
특이적 DNA는 또한, 서열이 데옥시리보뉴클레오티드 염기-페어링 (pairing)의 규칙에 따라 결정되는 그의 상보체를 의미하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 기능적 생성물 (RNA 또는 폴리펩티드/단백질)을 코딩하는 핵산을 의미한다. 유전자는 기능적 생성물을 코딩하는 서열의 앞 (5' 비-코딩 서열) 및/또는 뒤 (3' 비-코딩 서열)에 조절 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "코딩 서열"은 특이적 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. "조절 서열"은 연관된 코딩 서열의 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 번역에 영향을 주는, 코딩 서열의 상류 (예를 들어, 5' 비-코딩 서열), 내, 또는 하류 (예를 들어, 3' 비-코딩 서열)에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 조절 서열은 예를 들어 비제한적으로 프로모터; 번역 리더 서열; 인트론; 폴리아데닐화 인식 서열; RNA 프로세싱 부위; 이펙터 결합 부위; 및스템-루프 (stem-loop) 구조를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "코돈 축퇴성 (degeneracy)"은 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 특정 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전자 코드의 중복성을 의미한다. 각각의 코돈은 3개의 뉴클레오티드로 이루어지고 DNA를 구성하는 뉴클레오티드는 4개의 특이적 염기로 제한되기 때문에, 뉴클레오티드의 64개의 가능한 조합이 존재하고, 이 중 61개가 아미노산을 코딩한다 (나머지 3개의 코돈은 번역을 종결하는 신호를 코딩한다). 그 결과, 많은 아미노산이 하나 초과의 코돈에 의해 지정된다. 예를 들어, 아미노산 알라닌 및 프롤린은 4개의 삼중자 (triplet)에 의해 코딩되고, 세린 및 아르기닌은 6개에 의해 코딩되는 반면, 트립토판 및 메티오닌은 단지 1개의 삼중자에 의해 코딩된다. 코돈이 어떤 아미노산을 코딩하는지 보여주는 "유전자 코드"는 당업계에 통상적으로 알려져 있다. 이 코드 내의 축퇴성은 DNA에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 변경하지 않으면서 DNA의 염기가 매우 넓은 범위에 걸쳐 상이하도록 허용한다.
본원의 일부 실시양태에서, 숙주 세포 내에서 개선된 발현을 위한 코딩 서열을 설계할 때, 유전자는 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 접근하도록 설계된다. 따라서, 용어 "코돈-최적화된"은 다양한 숙주의 형질전환을 위한 유전자 또는 핵산의 코딩 서열을 의미하고, 여기서 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 숙주 유기체의 일반적인 코돈 사용 빈도를 반영하도록 유전자 또는 코딩 서열 내의 코돈이 변경된다. 예에서, 상기 최적화는 유전자 또는 코딩 서열 내의 적어도 하나, 하나 초과, 또는 유의한 수의 및/또는 모든 코돈을 유기체의 유전자에서 보다 빈번하게 사용되는 하나 이상의 코돈으로 교체하는 것을 포함한다.
많은 유기체는 성장하는 펩티드 사슬에 특정 아미노산의 삽입체를 코딩하는 특정 코돈의 사용을 위한 편향 (bias)을 보인다. 유기체 간의 코돈 선호도, 또는 코돈 편향, 코돈 사용 빈도의 차이는 유전자 코돈의 축퇴성에 의해 제시되고, 많은 유기체 사이에서 잘 정리되었다. 코돈 편향은 종종 메신저 RNA (mRNA)의 번역 효율과 상관관계가 잇고, 이것은 다시 특히 번역되는 코돈의 특성 및 특정 수송 RNA (tRNA) 분자의 이용가능성에 의해 결정된다고 생각된다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세함은 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기초로 하여 제시된 유기체에서의 최적 유전자 발현을 위해 조정되거나 설계될 수 있다.
매우 다양한 동물, 식물 및 미생물 종에서 이용가능한 매우 많은 유전자 서열을 고려하여, 상대적인 코돈 사용 빈도를 계산할 수 있다. 코돈 사용 빈도 표는 예를 들어 인터넷 웹사이트 kazusa.or.jp/codon/에서 이용가능한 "코돈 사용 빈도 데이타베이스"에서 쉽게 이용가능하고, 이들 표는 많은 방식으로 변경될 수 있다 ([Nakamura et al. (2000) Nucl. Acids Res. 28:292] 참조). 코돈 사용 빈도 표를 이용함으로써, 당업자는 제시된 종에 대응하는 빈도를 임의의 제시된 폴리펩티드 서열에 적용하고, 폴리펩티드를 코딩하지만 제시된 종에 대해 최적인 코돈을 사용하는 코돈-최적화된 코딩 영역의 핵산 단편을 생산할 수 있다.
코돈 편향은 단백질 코딩 영역의 평균 염기 조성에 반영된다. 예를 들어, 비교적 낮은 G+C 함량을 갖는 게놈을 갖는 유기체는 동의 코돈의 제3 위치에 A 또는 T를 갖는 보다 많은 코돈을 이용하는 반면에, 보다 높은 G+C 함량을 갖는 것은 제3 위치에 G 또는 C를 갖는 보다 많은 코돈을 이용한다. 또한, mRNA 내의 "마이너 (minor)" 코돈의 존재는 특히 마이너 코돈에 대응하는 하전된 tRNA의 상대적인 풍부도 (abundance)가 낮을 때 그 mRNA의 절대적인 번역 비율을 감소시킬 수 있다고 생각된다. 상기 추론은 개별 마이너 코돈에 의한 번역 속도의 감소가 다수의 마이너 코돈에 대해 적어도 상가적일 것이라는 사실로 확장된다. 따라서, 상대적으로 높은 함량의 마이너 코돈을 갖는 mRNA는 그에 대응하게 낮은 번역 속도를 가질 것이다. 상기 속도는 코딩된 단백질의 그에 대응하게 낮은 수준에 의해 반영될 것이다.
코돈 편향은 단일 코돈이 모든 아미노산에 대한 코돈에 비해 사용되는 빈도로서 계산될 수 있다. 별법으로, 코돈 편향은 단일 코돈이 특정 아미노산의 모든 다른 코돈 (동의 코돈)에 비해 해당 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 빈도로서 계산될 수 있다.
용어 "동일성 비율" (또는 "% 동일성")은 서열을 비교함으로써 결정할 때 2 이상의 폴리펩티드 서열 (또는 폴리뉴클레오티드 서열) 사이의 관계에 관한 것이다. % 동일성은 상기 서열의 스트링 (string) 사이의 일치에 의해 결정될 수 있는, 폴리펩티드 (또는 뉴클레오티드) 서열 사이의 서열 관련성 정도를 표현할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응도를 의미한다. 핵산이든 아미노산 서열이든 두 서열의 % 동일성은 2개의 정렬된 서열 사이의 정확한 일치의 수를 보다 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다 ([Russell and Barton (1994) J. Mol. Biol. 244:332-50] 참조).
핵산 및 아미노산 서열을 정렬하고 동일성을 결정하기 위한 기술은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어 비제한적으로 다음에 제시된 것을 포함한다: [Computational Molecular Biology (1988) (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University, NY]; [Biocomputing: Informatics and Genome Projects (1993) (Smith, D. W., Ed.) Academic, NY]; [Computer Analysis of Sequence Data, Part I (1994) (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania, NJ]; [Sequence Analysis in Molecular Biology (1987) (von Heinje, G., Ed.) Academic, NY]; 및 [Sequence Analysis Primer (1991) (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton, NY]. 2개의 서열 사이의 % 동일성을 결정하기 위한 기술은 mRNA 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 제공하고 및/또는 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 제공하거나 추정하고, 서열(들)을 제2 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 게놈 서열을 상기 방식으로 결정하고 비교할 수 있다.
또한, 핵산 및 아미노산 서열을 정렬하고 동일성을 결정하는 방법은 다양한 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어 프로그램에 포함되어 있다. 서열 정렬 및 % 동일성 계산은 예를 들어 벡터 (Vector) NTI® 스위트 (suite) (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))의 AlignX™ 프로그램 또는 레이저진(LASERGENE)™ 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트 (디엔에이스타 인크. (DNASTAR™ Inc., 미국 위스콘신주 매디슨))의 MegAlign™ 프로그램를 사용하여 수행할 수 있다. 다수의 서열 정렬은 Clustal™ V 및 Clustal™ W ([Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Higgins et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-91])을 비롯한 정렬 알고리즘의 여러 변형을 포함하는 Clustal™ 방법을 사용하여 수행할 수 있다. Clustal™ V에서 다수의 정렬을 위해, 사용될 수 있는 디폴트 (default) 값은 갭 (GAP) 페널티=10 및 갭 길이 페널티=10을 포함한다. Clustal™ W에서 다수의 정렬을 위한 디폴트 파라미터는 (갭 페널티=10, 갭 길이 페널티=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA 전이 가중치=0.5, 단백질 가중치 매트릭스=고넷 시리즈 (Gonnet Series), DNA 가중치 매트릭스=IUB)를 포함한다. Clustal™ 방법에 이용될 수 있는 단백질 서열 사이의 쌍 방식 정렬 및 % 동일성의 계산을 위한디폴트 파라미터는 KTUPLE=1, 갭 페널티=3, 윈도우 (WINDOW)=5, 및 DIAGONALS SAVED=5일 수 있다. 핵산의 경우에, 상기 디폴트 파라미터는 KTUPLE=2, 갭 페널티=5, 윈도우=4, 및 DIAGONALS SAVED=4일 수 있다. Clustal™ 프로그램을 사용한 서열 정렬 후에, 동일한 프로그램으로 "서열 거리" 표를 관찰함으로써 "% 동일성"을 얻는 것이 가능하다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 비제한적으로 적어도 약 55%; 적어도 약 60%; 적어도 약 65%; 적어도 약 70%; 적어도 약 75%; 적어도 약 80%; 적어도 약 85%; 적어도 약 90%; 및 적어도 약 95%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (참조 폴리펩티드; 예를 들어, 클래스 IV EPSPS에 비해)은 참조 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 갖는다. 따라서, 임의의 정수 백분율, 예를 들어, 55% 내지 100%의 동일성, 예를 들어 비제한적으로 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99%의 동일성은 특정 핵산을 설명할 때 유용할 수 있다. 특정 핵산 단편은 상기한 서열 동일성을 가질 뿐만 아니라, 예를 들어 비제한적으로 적어도 50개의 아미노산; 적어도 100개의 아미노산; 적어도 150개의 아미노산; 적어도 200개의 아미노산; 및 적어도 250개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특정 실시양태는 서열 2 또는 3에 적어도 약 80% 동일성 (예를 들어, 적어도 79% 동일성; 적어도 약 80% 동일성; 적어도 약 81% 동일성; 적어도 약 82% 동일성; 적어도 약 83% 동일성; 적어도 약 84% 동일성; 적어도 약 85% 동일성; 적어도 약 86% 동일성; 적어도 약 87% 동일성; 적어도 약 88% 동일성; 적어도 약 89% 동일성; 적어도 약 90% 동일성; 적어도 약 91% 동일성; 적어도 약 92% 동일성; 적어도 약 93% 동일성; 적어도 약 94% 동일성; 적어도 약 95% 동일성; 적어도 약 96% 동일성; 적어도 약 97% 동일성; 적어도 약 98% 동일성; 적어도 약 99% 동일성; 및 적어도 약 99.5% 동일성)을 갖는 핵산을 포함한다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 의미한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나 또는 독립적으로 개발될 수 있다. 서열 분석 소프트웨어의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 프로그램의 GCG 스위트 (위스콘신 패키지 버전 (Wisconsin Package Version) 9.0, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group) (GCG), 미국 위스콘신주 매디슨)); BLASTP™, BLASTN™, 및 BLASTX™ (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10); 디엔에이스타™ (디엔에이스타™, 인크., 미국 위스콘신주 매디슨); 시?처(Sequencher)™ (진 코즈 코퍼레이션 (Gene Codes Corporation, 미국 미시건주 앤 아버)); 및 스미스-워터맨 (Smith-Waterman) 알고리즘 (Pearson (1994) Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.], Meeting Date 1992 (Suhai and Sandor, Eds.), Plenum: New York, NY, pp. 111-20)을 포함하는 FASTA™ 프로그램. 서열 분석 소프트웨어가 여기서 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 분석하기 위해 사용된 경우, 제시된 분석 결과는 달리 특정되지 않으면 언급된 프로그램의 디폴트 값을 사용하여 생성되었다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "디폴트 값"은 처음 초기화될 때 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 본래 부가된 값 또는 파라미터의 세트를 의미한다.
혼성화: 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산은 프로브 서열에 대해 유의한 양의 서열 동일성을 갖는 클로닝된 게놈 DNA 단편 또는 cDNA 단편의 집단 (예를 들어, 선택된 유기체로부터의 게놈 또는 cDNA 라이브러리)에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 "혼성화하는" 프로브로서 사용될 수 있다. 혼성화 프로브는 게놈 DNA 단편; 플라스미드 DNA 단편; cDNA 단편; RNA 단편; PCR 증폭된 DNA 단편; 올리고뉴클레오티드; 또는 다른 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 프로브는 검출가능한 기 (예를 들어, 32P), 또는 임의의 다른 검출가능한 마커로 표지될 수 있다. 따라서, 예를 들어 비제한적으로, 혼성화를 위한 프로브는 본원에서 핵산 (예를 들어, 서열 1에 적어도 약 90% 동일성을 갖는 핵산)에 특이적으로 혼성화하는 합성 올리고뉴클레오티드를 표지함으로써 제조될 수 있다. 혼성화를 위한 프로브의 제조, 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 구축 방법은 당업계에 알려져 있다 (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). 핵산의 혼성화에 대한 자세한 지침은 문헌 [Sambrook et al. (1989), 상기 문헌]; 및 [Ausubel et al. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, Third Edition, Wiley, NY, New York, pp. 2-40]에서 볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산 혼성화 (예를 들어, 증폭된 DNA에 대한)는 샘플 내에서 트랜스제닉 이벤트의 존재를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 그의 단편은 특정 환경 하에서 또 다른 핵산 분자에 "특이적으로 혼성화"할 수 있다. 일부 예에서, 핵산은 엄격한 조건 하에 표적 핵산에 특이적으로 혼성화한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개의 핵산 분자는 2개의 분자가 엄격한 (예를 들어, 고-엄격도) 조건 하에 역평행 (anti-parallel) 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 언급된다.
핵산은 2개의 핵산 분자가 완전한 서열 상보성을 보인다면 또 다른 핵산 분자의 "상보체"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산은 분자 중의 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보성일 때 "완전한 상보성"을 보인다고 언급된다. 완전한 상보성을 보이는 분자는 통상적인 "고-엄격도" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하기에 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 것이다. 통상적인 고-엄격도 조건은 문헌 [Sambrook et al. (1989), 상기 문헌]에 설명되어 있다.
2개의 분자는 이들이 적어도 통상적인 "저-엄격도" 조건 하에서 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 하기에 충분한 안정성으로 서로 혼성화할 수 있다면 "최소 상보성"을 보이는 것으로 언급된다. 통상적인 저-엄격도 조건은 또한 문헌 [Sambrook et al. (1989), 상기 문헌]에 설명되어 있다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서 기능하기 위해서, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열의 최소 상보성을 보일 것만을 필요로 한다.
혼성화의 엄격도에 영향을 주는 인자는 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 온도; pH; 이온 강도; 및 유기 용매 (예를 들어, 포름아미드 및 디메틸술폭시드)의 농도를 포함한다. 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 혼성화 엄격도는 보다 높은 온도, 보다 낮은 이온 강도, 및 보다 낮은 용매 농도에 의해 증가된다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화제, 예컨대 포름아미드의 첨가에 의해 달성할 수 있다.
용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격도 조건"은 문헌 [Sambrook et al. (1989), 상기 문헌 (at 9.52-9.55)]에서 논의된 구체적인 혼성화 절차에 의해 한 핵산의 또 다른 표적 핵산 (즉, 관심있는 특정 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자) 대한 혼성화에 대해 규정된다. 또한, 문헌 [Sambrook et al. (1989) at 9.47-9.52 and 9.56-9.58] 참조.
많은 용도에서 특이성은 혼성화 후 세척 조건에 관련되고, 여기서 인자는 세척 용액의 이온 강도 및 온도를 포함한다. DNA-DNA 혼성체에 대해, 열 융점 (Tm)은 하기 식 (1)로부터 근사치를 계산할 수 있다:
Tm = 81.5℃+16.6 (logM)+0.41(%GC)-0.61(%form)-500/L (1)
여기서, M은 1가 양이온의 몰농도이고, %GC는 DNA 내의 구아노신 및 시토신 뉴클레오티드의 백분율이고, %form은 혼성화 용액 내의 포름아미드의 백분율이고, L은 염기쌍 내의 혼성체의 길이이다 (Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-84).
Tm은 50%의 상보성 표적 서열이 완벽하게 일치된 프로브에 혼성화하는 온도 (특정 이온 강도 및 pH)이다. Tm은 각각의 1%의 불일치에 대해 약 1℃ 감소한다. 따라서, Tm, 혼성화, 및/또는 세척 조건은 목적하는 동일성의 서열이 혼성화하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 90% 동일성을 갖는 서열의 혼성화가 추구될 경우, Tm은 10℃ 감소될 수 있다 (특정 이온 강도 및 pH 하에). 엄격한 조건은 예를 들어 규정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열 및 그의 상보체에 대한 열 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택될 수 있다. 그러나, 매우 엄격한 조건은 Tm보다 1, 2, 3, 또는 4℃ 더 낮은 온도에서의 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 중간 정도의 엄격한 조건은 Tm보다 6, 7, 8, 9, 또는 10℃ 더 낮은 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있고; 낮은 엄격도 조건은 Tm보다 11 내지 20℃ 더 낮은 혼성화 및/또는 세척을 이용할 수 있다.
일부 예에서, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 약 1.5 M Na+ 미만 (예를 들어, 약 0.01 내지 1.0 M Na+)이고, 온도는 짧은 핵산 (예를 들어, 10 내지 50개 뉴클레오티드 길이)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브 (예를 들어, 50개 초과의 뉴클레오티드 길이)에 대해 적어도 약 60℃인 것이다. 예시적인 낮은 엄격도 조건은 37℃에서 30 내지 35% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% 나트륨 도데실 술페이트 (SDS)의 완충제 용액을 사용한 혼성화, 및 50 내지 55℃에서 1X 내지 2X SSC (20X SSC=3.0 M NaCl/0.3 M 시트르산삼나트륨) 내에서의 세척을 포함한다. 예시적인 중등도 엄격도 조건은 37℃에서 40 내지 45% 포름아미드, 1.0 M NaCl, 0.1% SDS 내의 혼성화, 및 55 내지 60℃에서 0.5X 내지 1X SSC 내의 세척을 포함한다. 예시적인 고 엄격도 조건은 약 37℃에서 약 50% 포름아미드, 약 1.0 M Na 염, 약 0.1% SDS 내의 혼성화, 및 약 60 내지 65℃에서 약 0.1X SSC 내의 세척을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 단일 "폴리펩티드", 복수의 "폴리펩티드" 및 그의 단편을 포함한다. 상기 용어는 아미드 결합 (또한 펩티드 결합으로서 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 이루어지는 분자를 의미한다. 용어 "폴리펩티드"는 2 이상의 아미노산의 임의의 사슬 또는 사슬들을 의미하고, 특정 길이 또는 크기의 생성물을 의미하지 않는다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 사슬, 또는 2 이상의 아미노산의 사슬 또는 사슬들을 나타내기 위해 사용되는 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 상기한 용어는 본원에서 "폴리펩티드"와 교환가능하게 사용된다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 단리되거나 또는 재조합 기술에 의해 생산될 수 있지만, 반드시 특정 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 폴리펩티드는 예를 들어 비제한적으로 화학적 합성을 포함하는 임의의 수단으로 생성될 수 있다.
내인성 및 이종성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "천연"은 존재할 경우 그 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드의 형태를 의미한다. 용어 "내인성"은 유기체 내의 또는 유기체의 게놈 내의 그의 천연 위치에 존재하는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드의 폴리 형태를 의미한다.
이와 대조적으로, 용어 "이종성"은 참조 (숙주) 유기체 내의 그의 위치에서 정상적으로 발견되지 않는 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들어, 이종성 핵산은 참조 유기체 내에서 상이한 게놈 위치에서 정상적으로 발견되는 핵산일 수 있다. 추가의 예로서, 이종성 핵산은 참조 유기체에서 정상적으로 발견되지 않는 핵산일 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 포함하는 숙주 유기체는 이종성 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 폴리펩티드를 숙주 유기체 내로 도입함으로써 생산될 수 있다. 특정 예에서, 이종성 폴리뉴클레오티드는 상응하는 천연 폴리뉴클레오티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 코딩 영역, 또는 그의 일부를 포함한다. 특정 예에서, 이종성 유전자는 상응하는 천연 폴리뉴클레오티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 코딩 서열, 또는 그의 일부를 포함한다. 예를 들어, 이종성 유전자는 천연 숙주 내로 재도입된 비-천연 조절 영역을 포함하는 키메릭 (chimeric) 유전자의 일부인 천연 코딩 서열을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 이종성 폴리펩티드는 상응하는 천연 폴리펩티드와 상이한 형태로 공급원 유기체 내로 재도입된 천연 폴리펩티드이다.
이종성 유전자 또는 폴리펩티드는 키메릭 또는 융합 폴리펩티드, 또는 이를 코딩하는 유전자를 생성하기 위해 또 다른 유전자 또는 폴리펩티드에 융합된 기능적 폴리펩티드를 코딩하는 기능적 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 포함하는 유전자 또는 폴리펩티드일 수 있다. 특정 실시양태의 유전자 및 단백질은 특이적으로 예시된 전장 서열 및 일부, 절편, 단편 (연속적인 단편 및 전장 분자에 비해 내부 및/또는 말단 결실 포함), 변이체, 돌연변이체, 키메릭, 및 상기 서열의 융합체를 포함한다.
변형: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변형"은 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 활성을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나 또는 제거하는, 특정 참조 폴리뉴클레오티드의 변화를 의미할 수 있다. 변형은 또한 참조 폴리펩티드의 활성을 감소시키거나, 실질적으로 제거하거나 또는 제거하는, 참조 폴리펩티드의 변화를 의미할 수 있다. 별법으로, 용어 "변형"은 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 활성 증가 또는 향상을 야기하는 참조 폴리뉴클레오티드의 변화, 및 참조 폴리펩티드의 활성 증가 또는 향상을 야기하는 참조 폴리펩티드의 변화를 의미할 수 있다. 상기한 바와 같은 변화는 참조 분자의 일부의 결실; 참조 분자의 돌연변이 유발 (예를 들어, 자연적인 돌연변이 유발, 무작위 돌연변이 유발, 돌연변이 유발 (mutator) 유전자에 의해 유발되는 돌연변이 유발, 또는 트랜스포존 (transposon) 돌연변이 유발을 통한); 참조 분자의 일부의 치환; 참조 분자 내로의 요소의 삽입; 참조 분자의 발현의 하향조절; 참조 분자의 세포내 위치 변경; 참조 분자의 상태 변경 (예를 들어, 참조 폴리뉴클레오티드의 메틸화, 및 참조 분자의 인산화 또는 유비퀴틴화); 참조 분자의 보조인자 제거; 참조 분자를 표적화하는 안티센스 RNA/DNA의 도입; 참조 분자를 표적화하는 간섭 RNA/DNA의 도입; 참조 분자의 화학적 변형; 참조 분자의 공유 변형; UV 또는 X-선 조사를 사용한 참조 분자의 조사; 참조 분자를 변경하는 상동성 재조합; 참조 분자를 변경하는 유사분열 재조합; 참조 분자의 프로모터 교체, 및/또는 이들의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 여러 방법에 의해 이루어질 수 있다.
구체적인 예에서 어떤 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 변형될 수 있는지 결정하는 것은 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열을 상동성 (예를 들어, 상동성 효모 또는 박테리아) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열과 비교하고, 높은 상동성 영역 (보존된 영역) 또는 컨센서스 서열 내에서 이루어진 변형의 수를 최대화함으로써 알 수 있다.
유도체 및 변이체: 용어 "유도체"는 본원에서 사용되는 바와 같이 본원에서 예시된 서열의 변형체를 의미한다. 상기 변형은 작물 종에서 코딩 서열의 기능을 보존하거나, 경미하게 변경하거나, 증가시키는, 본원에 개시된 코딩 서열의 하나 이상의 염기의 치환, 삽입, 및/또는 결실을 포함한다. 상기 유도체는 예를 들어 비제한적으로, 서열 구조를 예측하고 최적화하기 위한 컴퓨터 모델링 기술을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 따라서, 용어 "유도체"는 또한 작물 식물에서 클래스 IV EPSPS를 발현시킬 때 사용하기 위해 동일한, 경미하게 변경된, 또는 증가된 관능기를 가질 수 있도록 본원에 예시된 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 이종성 핵산을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 예를 들어 비제한적으로 재조합 DNA 기술을 사용하여 도입될 수 있는 아미노산 삽입, 결실, 돌연변이, 및/또는 치환에 의해 본원의 예시적인 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드를 의미한다. 어떤 아미노산 잔기가 참조 아미노산 서열 내에서 교체, 부가, 또는 결실될 수 있는지를 결정하는 것은 특정 참조 폴리펩티드의 서열을 상동성 폴리펩티드의 서열과 비교하고 높은 상동성 영역 (보존된 영역) 내에서 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화하거나, 아미노산을 컨센서스 서열로 교체함으로써 알 수 있다. 변이체 폴리펩티드는 치환된 아미노산을 갖지만, 참조 폴리펩티드의 기능적 활성을 계속 보유할 수 있다. "변이체" 유전자는 참조 유전자와 동일한 폴리펩티드 또는 참조 폴리펩티드와 동등한 또는 유사한 활성을 갖는 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변이체 유전자는 변이체 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있고, 재조합 숙주는 변이체 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원의 임의의 예시된 서열의 연속적인 잔기 (아미노산 또는 뉴클레오티드)를 포함하는 변이체 유전자 및 단백질을 구축할 수 있다. 변이체 유전자 또는 단백질은 예를 들어 비제한적으로 예시된 서열 내의 절편 (동일한 크기)에 대응하는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 및 293개의 연속적인 잔기 (아미노산 또는 뉴클레오티드)를 가질 수 있다. 유사한 크기의 절편, 특히 보존된 영역의 절편도 프로브 및/또는 프라이머로서 사용될 수 있다.
많은 수준의 서열 동일성이 참조 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 다른 종으로부터의)를 확인할 때 유용함이 당업자에게 이해된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 비제한적으로 적어도 약 55%; 적어도 약 60%; 적어도 약 65%; 적어도 약 70%; 적어도 약 75%; 적어도 약 80%; 적어도 약 85%; 적어도 약 90%; 및 적어도 약 95%의 서열 동일성 (참조 폴리펩티드; 예를 들어, 클래스 IV EPSPS에 비해)을 갖는 변이체 폴리펩티드는 참조 폴리펩티드와 동일한 또는 유사한 기능을 갖는다.
특정 분자의 연속적인 잔기를 포함하는 변이체 유전자 및 단백질을 설계하고 구축하기 위한 전략은 관심있는 단백질의 구조 (예를 들어, 결정 구조 및/또는 분자 모델로부터의 원자 3-D (3차원) 좌표)를 얻고 조사함으로써 얻을 수 있다. 일부 예에서, 전략은 변형에 이상적인 단백질의 특정 절편, 예컨대 단백질 폴딩 및 본질적인 3-D 구조적 일체성과 관련된 내부 절편이 아니라 표면 노출 절편에 관련될 수 있다. 미국 특허 5,605,793은 예를 들어 무작위 또는 집중 (focused) 단편화 후에 DNA 재조립을 사용함으로써 추가의 분자 다양성을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 이것은 일반적으로 2 이상의 상이한 DNA 분자의 단편 (목적하는 크기의)의 혼합, 이어서 반복된 재생 라운드를 수반하는 유전자 "셔플링 (shuffling)"으로서 칭할 수 있다. 상기 과정은 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 개선할 수 있다. 그 결과는 개선된 활성, 변경된 기질 특이성, 증가된 효소 안정성, 변경된 입체특이성, 또는 다른 특징을 갖는 키메릭 단백질일 수 있다.
아미노산 "치환"은 참조 서열 내의 한 아미노산의, 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로의 교체, 즉, 보존적 아미노산 교체의 결과일 수 있거나 (즉, 보존적 아미노산 치환), 또는 참조 서열 내의 한 아미노산의, 상이한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 아미노산으로의 교체의 결과일 수 있다 (즉, 비-보존적 아미노산 치환). 아미노산은 다음과 같은 구조적 및/또는 화학적 클래스로 분류될 수 있다: 비-극성; 비하전된 극성; 염기성; 및 산성. 따라서, "보존적" 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 또는 양친매성 특성의 유사성을 기초로 하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비-극성 (소수성) 아미노산은 글라이신, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 및 메티오닌을 포함하고; 비하전된 (중성) 극성 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함하고; 양하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신, 및 히스티딘을 포함하고; 음하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다. 별법으로, "비-보존적" 아미노산 치환은 임의의 이들 아미노산의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성, 또는 양친매성 특성의 차이를 선택함으로써 이루어질 수 있다. "삽입" 또는 "결실"은 재조합 단백질에 의해 구조적으로 또는 기능적으로 용인되는 변이의 범위 내에서 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 변이체 단백질은 참조 전장 단백질에 대해 "말단절단"된다. 일부 예에서, 말단절단된 단백질은 참조 단백질의 기능적 활성을 보유한다. "말단절단된" 단백질은 예를 들어 나머지 말단절단된 단백질이 절단 후에 목적하는 활성을 보유하고 보이면서, 일부 단백질이 절단될 수 있음을 의미한다. 절단은 임의의 다양한 프로테아제에 의해 달성할 수 있다. 또한, 효과적으로 절단된 단백질은 제한 엔도뉴클레아제 또는 숙련된 당업자에게 이용가능한 다른 기술을 통해 일부 단백질을 코딩하는 DNA 염기를 코딩 서열로부터 제거하는 분자 생물학 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 말단절단된 단백질은 이종성 시스템, 예를 들어, 이. 콜라이, 바큘로바이러스, 식물-기반 바이러스 시스템, 및 효모에서 발현될 수 있다. 제초제 내성을 부여하는 말단절단된 단백질은 본원에서 설명되는 바와 같은 제초제 내성 생물검정에서 단백질을 발현하는 이종성 시스템을 사용하여 확인될 수 있다. 말단절단된 단백질은 전장 참조 단백질의 기능적 활성을 보유하도록 성공적으로 생산될 수 있음이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, Bt 단백질은 말단절단된 (코어 단백질) 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53(2):242-55]; 및 [Adang et al. (1985) Gene 36:289-300]을 참조한다.
일부 경우에, 특히 식물 내에서 발현을 위해, 말단절단된 단백질을 발현하는 말단절단된 유전자를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 말단절단된 유전자는 예를 들어 전장 단백질의 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%로 이루어진 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
그로부터 변이체 유전자 및 단백질이 설계되는 참조 서열의 기능을 보유하는 변이체 유전자 및 단백질은 예를 들어 재조합 변이체를 활성에 대해 검정함으로써 당업자에 의해 결정될 수 있다. 그러한 활성 검정이 공지되어 있고, 특성화되면, 기능적 변이체의 결정은 단지 일상적인 실험만을 필요로 한다.
효소의 "활성 부위"의 특이적인 변화는 활성 또는 입체특이성에 대한 그의 고유한 기능성에 영향을 주기 위해 이루어질 수 있다 ([Muller et. al. (2006) Protein Sci. 15(6):1356-68] 참조). 예를 들어, 알려진 tauD 구조는 그의 고유한 기질인 타우린에 결합하면서 활성 부위 잔기를 결정하기 위한 모델 디옥시게나제로서 사용될 수 있다 ([Elkins et al. (2002) Biochemistry 41(16):5185-92] 참조). 효소 활성 부위의 서열 최적화 및 설계가능성에 대한 추가의 정보는 문헌 [Chakrabarti et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(34):12035-40]에서 볼 수 있다.
단백질의 다양한 구조적 특성 및 3차원 특징은 단백질의 활성/기능성에 불리한 영향을 미치지 않으면서 변경될 수 있다. 분자의 활성 및/또는 3차원 입체형태에 불리한 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환 ("용인되는" 치환)이 이루어질 수 있다. 또한, 참조 단백질과 서열 수준에서 상이하지만, 동일하거나 유사한 전체적인 본질적인 3차원 구조, 표면 전하 분포 등을 보유하는 변이체 단백질이 설계될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 7,058,515; [Larson et al. (2002) Protein Sci. 11:2804-13]; [Crameri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-8]; [Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51]; [Stemmer (1994) Nature 370:389-91]; [Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-53]; [Crameri et al. (1996) Nat. Med. 2:100-3]; 및 [Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-9]을 참조한다.
발현 구축물 (예를 들어, 클래스 IV EPSPS 발현 구축물)에 사용하기 적합한 5' 또는 3' UTR (예를 들어, 합성 헤어핀 (hairpin))의 컴퓨터에 의한 설계가 또한 수행될 수 있고, 본원의 일부 실시양태의 핵산 내의 요소를 설계하기 위해 사용될 수 있다. 5' 및 3' UTR 유도체 예측 및 평가에 사용하기 위한 컴퓨터 모델링 및 UTR 및 컴퓨터 모델링 기술은 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: MFoLd™ 버전 3.1 (제네틱스 컴퓨터 그룹 (미국 위스콘신주 매디슨)으로부터 이용가능; [Zucker et al. "Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide", in RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999]; [Zucker et al. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-40]; [Zucker et al. "RNA Secondary Structure Prediction", in Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick, and R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, 2000] 참조); 및 소스 코드로서 자유롭게 배포되고 웹사이트 genetics.wustl.edu/eddy/software/에서 다운로드할 수 있는 COVE™ (공분산 모델을 사용한 RNA 구조 분석 (확률적 문맥 자유 문법 (stochastic context free grammar) 방법)) v.2.4.2 (Eddy and Durbin (1994) Nucl. Acids Res. 22:2079-88); 및 또한 자유롭게 배포되고 웹사이트 foldalign.ku.dk/software/index.html에서 다운로드할 수 있는 FOLDALIGN™ ([Gorodkin et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(18):3724-32] 및 [Gorodkin et al. (1997) Proceedings International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5:120-123] 참조).
프로모터: 용어 "프로모터"는 핵산 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 나타낸다. 예들 들어, 제어되는 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래하거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터로부터 유래한 상이한 요소로 이루어지거나, 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 종류에서, 또는 상이한 발생기에, 또는 상이한 환경 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 이해한다. 모든 상기한 프로모터의 예는 알려져 있고, 이종성 핵산의 발현을 제어하기 위해 당업계에서 사용된다. 대부분의 시기에 대부분의 세포 종류 내에서 유전자의 발현을 유도하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로서 칭한다. 또한, 당업계에서 조절 서열의 정확한 경계를 규정하기 위해 시도하였지만 (많은 경우에 성공하지 못함), 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있는 것으로 이해되고 있다. 특정 핵산의 프로모터 활성은 당업계에 친숙한 기술을 이용하여 검정될 수 있다.
작동가능하게 연결된: 용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 핵산 서열의 기능이 또 다른 하나에 의해 영향을 받는, 단일 핵산 상의 핵산 서열들의 회합을 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 그 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다 (예를 들어, 그 코딩 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). 코딩 서열은 조절 서열에 센스 또는 안티센스 배향으로 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현: 용어 "발현"은 본원에서 사용되는 바와 같이, DNA로부터 유래된 센스 (mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 나타낸다. 발현은 또한 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 나타낼 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "과발현"은 동일한 또는 관련 유전자의 내인성 발현보다 더 높은 발현을 나타낸다. 이종성 유전자는 그의 발현이 대등한 내인성 유전자의 발현보다 더 높으면 "과발현된" 것이다.
형질전환: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환"은 유전적으로 안정한 유전을 유도하는, 핵산 또는 단편의 숙주 유기체 내로의 전달 및 통합을 의미한다. 형질전환된 핵산을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉", "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로서 언급된다. 공지된 형질전환 방법은 예를 들어 다음을 포함한다: 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)- 또는 에이. 리조게네스 (A. rhizogenes)-매개 형질전환; 인산칼슘 형질전환; 폴리브렌 형질전환; 원형질체 융합; 전기천공; 초음파 방법 (예를 들어, 소노포레이션 (sonoporation)); 리포좀의 형질전환; 미세주입; 네이키드 (naked) DNA를 사용한 형질전환; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 바이러스 벡터를 사용한 형질전환; 비올리스틱 (biolistic) 형질전환 (미세입자 폭격); 탄화규소 WHISKERS-매개 형질전환; 에어로졸 조사 (aerosol beaming); 및 PEG-매개 형질전환.
도입된: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "도입된" (핵산을 세포 내로 도입하는 측면에서)은 세포의 형질전환, 및 통상적인 식물 육종 기술을 이용하여 수행할 수 있는, 제2 식물이 핵산을 함유하도록 핵산을 포함하는 식물을 제2 식물과 교배하는 것을 포함한다. 상기 육종 기술은 당업계에 알려져 있다. 식물 육종 기술의 논의에 대해서는, 문헌 [Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4th Edition, AVI Publication Co., Westport CT]를 참조한다.
역교배 방법이 핵산을 식물 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 상기 기술은 수 십년 동안 형질을 식물 내로 도입하기 위해 사용되어 왔다. 역교배 (및 다른 식물 육종 방법)에 대한 설명의 예는 예를 들어 문헌 [Poelman (1995), 상기 문헌]; 및 [Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY]에서 볼 수 있다. 예시적인 역교배 프로토콜에서, 관심있는 본래의 식물 ("반복친")은 도입되는 핵산을 보유하는 제2 식물 ("비-반복친")과 교배된다. 상기 교배로부터 생성되는 자손체는 이어서 다시 반복친과 교배되고, 이 과정을 전환되는 식물이 얻어질 때까지 반복하고, 여기서 반복친의 필수적으로 모든 목적하는 형태학적 및 생리학적 특징은 비-반복친으로부터의 핵산에 추가로 전환되는 식물에서 회복된다.
플라스미드/벡터: 본원에서 사용되는 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 세포의 핵심 대사의 일부가 아닌 하나 이상의 유전자(들)를 보유할 수 있는 염색체외 요소를 의미한다. 플라스미드 및 벡터는 일반적으로 환상 이중 가닥 DNA 분자이다. 그러나, 플라스미드 및 벡터는 단일- 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 선형 또는 환상 핵산일 수 있고, 많은 뉴클레오티드 서열이, 프로모터 단편 및 코딩 DNA 서열을 임의의 적절한 3' 비번역된 서열과 함께 세포 내로 도입할 수 있는 특유한 구성체 내로 연결되거나 재조합된, 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 플라스미드 및 벡터는 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 및/또는 파지 또는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
III. 클래스 IV EPSPS-코딩 서열
본원에서 일부 실시양태는 클래스 IV EPSPS 단백질 (예를 들어, 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168)에 적어도 약 90% 동일성 (예를 들어, 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 및 적어도 99% 동일성)을 갖는 단리된 폴리펩티드를 제공한다. 본원에서 일부 실시양태는 자신을 다른 효소와 구별되게 하는, 클래스 IV EPSPS 단백질 내의 특징적인 보존된 구조적 요소인 서열 170-173을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
본원에서 일부 실시양태는 클래스 IV EPSPS 단백질에 적어도 약 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태는 따라서 서열 170-173을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 그러한 핵산은 변형된 글리포세이트 대사가 식물 세포에서 요구되는 임의의 매우 다양한 용도 (예를 들어, 글리포세이트 저항성 도입)에서 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태는 클래스 IV EPSPS 단백질을 코딩하는 천연 핵산 서열에 적어도 약 80% 서열 동일성 (예를 들어, 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 및 적어도 99% 동일성)을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다. 본원에서 예시적인 목적을 위해 제공되는 클래스 IV EPSPS 핵산의 특정 예는 서열 2 및 3 (dgt-28)이다. dgt-28 핵산의 특정 예는 엄격한 (예를 들어, 고도로 엄격한) 조건 하에 서열 2 또는 서열 3을 갖는 핵산에 특이적으로 혼성화하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 코돈-최적화된 클래스 IV EPSPS-코딩 핵산을 제공한다. 예를 들어, 식물에서 이종성 유전자의 높은 발현을 달성하기 위해서, 식물의 세포에서 보다 효율적으로 발현되도록 유전자를 설계하고 재조작하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 전략은 박테리아 유전자가 식물 세포에서 발현되는 것이 요구되는 상황에서 특히 바람직할 수 있다.
따라서, 본원에서 일부의 예는 클래스 IV EPSPS 단백질을 코딩하는 식물-최적화된 유전자, 및 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물에서 최적으로 발현될 수 있고 서열 변형이 번역 또는 전사를 방해하지 않는 DNA 서열을 생성하기 위해 이를 설계하는 방법을 제공한다. 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 둘 모두에서 동일한 클래스 IV EPSPS 단백질의 발현을 위한 최적화된 클래스 IV EPSPS-코딩 유전자의 설계가 본원에서 예시되고, 여기서 dgt-28의 단백질 코딩 영역은 최적 발현을 위해 재조작된다. 본원에서 예시적인 식물-최적화된 dgt-28 핵산은 서열 2 및 서열 3을 포함한다.
쌍떡잎 또는 외떡잎 식물 (예를 들어, 면화, 카놀라, 담배, 옥수수, 대두, 밀 및 벼) 내에서 발현을 위해 클래스 IV EPSPS 단백질을 코딩하는 유전자를 조작하는데 있어서, 유망한 숙주 식물(들)의 코돈 편향은 예를 들어 식물 게놈의 코돈 분포 또는 다양한 식물 유전자의 단백질 코딩 영역에 대한 정보를 발견하기 위해 공개적으로 이용가능한 DNA 서열 데이타베이스의 사용을 통해 결정될 수 있다.
식물 발현을 위한 핵산에서 코딩 영역을 설계하는데 있어서, 식물이 선호하는 1차 ("제1 선택") 코돈을 결정하고, 또한 다수 선택이 존재할 때 제2, 제3, 제4 선택 등의 바람직한 코돈을 결정할 수 있다. 이어서, 동일한 펩티드 (예를 들어, 클래스 IV EPSPS 단백질)의 아미노산 서열을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 설계할 수 있지만, 새로운 DNA 서열은 아미노산 서열 내에 각각의 위치에서 아미노산을 명시하기 위해 식물 (제1 바람직한, 제2 바람직한, 제3 바람직한, 또는 제4 바람직한 등) 코돈의 치환에 의해 원래의 DNA 서열과 상이하다.
이어서, 새로운 서열을 변형에 의해 생성될 수 있는 제한 효소 부위에 대해 분석될 수 있다. 확인된 부위는 코돈을 제1, 제2, 제3, 또는 제4의 선택된 바람직한 코돈으로 교체함으로써 추가로 변형될 수 있다. 관심있는 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 줄 수 있는 서열 내의 다른 부위는 스템-루프 구조, 엑손:인트론 연결부 (5' 또는 3'), 폴리A 부가 신호, 및 RNA 중합효소 종료 신호이고; 이들 부위는 식물 코돈의 치환에 의해 제거할 수 있다. 서열은 TA 또는 CG 이중자의 빈도를 감소시키도록 추가로 분석되고 변형될 수 있다. 이중자에 추가로, 동일한 약 6개 초과의 잔기를 갖는 G 또는 C 서열 블록은 서열의 전사 또는 번역에 영향을 줄 수 있다. 따라서, 상기 블록은 제1 또는 제2 선택 코돈 등을 추가의 바람직한 선택 코돈으로 교체함으로써 변형될 수 있다.
서열 2 (dgt-28 (v5))는 쌍떡잎 식물 내에서 발현을 위해 최적화되었다. 서열 3 (dgt-28 (v6)) 외떡잎 식물 내에서 발현을 위해 최적화되었다. 이들 합성 서열에서 코돈 사용 빈도는 바람직한 코돈 사용 빈도를 기초로 하여 선택하였고; 즉, 각각의 발현 생성물은 외떡잎 또는 쌍떡잎 식물 사용 빈도를 향한 편향을 갖는 코돈에 의해 코딩되고, 유해한 서열 및 불필요한 제한 부위는 DGT-28 폴리펩티드의 전사/번역 효율을 증가시키기 위해 및 DNA 조작 단계를 용이하게 하기 위해 제거되었다.
이와 유사하게, 서열 4 (dgt-28 (v1))의 핵산 분자는 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli) 내에서 발현을 개선하기 위해 최적화되었다. 서열 4에서 코돈 사용 빈도는 바람직한 이. 콜라이 코돈 사용 빈도를 기초로 하여 선택하였고; 발현된 단백질은 이. 콜라이 사용 빈도를 향한 편향을 갖는 코돈에 의해 코딩된다. 재설계 동안, 유해한 서열 및 불필요한 제한 부위는 DGT-28 코딩 서열의 전사/번역 효율을 증가시키기 위해 및 DNA 조작 단계를 용이하게 하기 위해 제거되었다. 따라서, 이. 콜라이에서 서열 4를 포함하는 핵산으로부터 DGT-28의 발현은 예를 들어 DGT-28의 효소에 의한 특성화를 위한 강력한 단백질 발현을 야기할 수 있다.
일단 최적화된 (예를 들어, 식물-최적화된) DNA 서열이 종이 위에, 또는 컴퓨터내 (in silico)에서 설계되면, 실제 DNA 분자는 설계된 서열에 근접하게 서열에 대응하도록 실험실에서 합성될 수 있다. 상기 합성 핵산 분자 분자는 마치 이들이 천연 또는 천연 공급원으로부터 유래된 것처럼 클로닝되고 달리 조작될 수 있다.
본원에서 핵산은 복제 및/또는 발현을 위해 원핵 또는 진핵 세포 내로의 형질전환을 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 원핵 벡터; 예를 들어, 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 진핵 벡터일 수 있다. 본원에서 핵산은 또한 예를 들어 식물 세포 내로의 투여를 위해 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 특정 용도에서, 이. 콜라이에서 기능성인 벡터 (예를 들어, 항체를 생성하기 위한 단백질의 생산, DNA 서열 분석, 삽입체의 구축, 많은 핵산 획득)를 갖는 것이 바람직할 수 있다.
세포 내에서 클래스 IV EPSPS 단백질을 발현하기 위해, 단백질을 코딩하는 핵산은 일반적으로 전사를 유도하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝된다. 적합한 박테리아 및 진핵 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 상기 문헌)]에 설명되어 있다. 본원에서 핵산 발현을 위한 박테리아 발현 시스템, 예를 들어, 이. 콜라이, 바실러스 (Bacillus) 종, 및 살모넬라가 이용가능하다 (Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)). 상기 발현 시스템을 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다. 포유동물 세포, 효모, 및 곤충 세포에 대한 진핵 발현 시스템은 당업자에게 알려져 있고, 또한 상업적으로 이용가능하다.
유전자 정보를 세포 내로 수송하기 위해 사용되는 특정 발현 벡터는 클래스 IV EPSPS 단백질의 의도된 용도 (예를 들어, 식물, 동물, 박테리아, 진균, 및 원생동물 내에서의 발현)와 관련하여 선택된다. 표준 박테리아 및 동물 발현 벡터는 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 공개 20050064474A1 및 국제 특허 공개 WO 05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809에 상세히 설명되어 있다. 표준 형질감염 방법을 사용하여 다량의 단백질을 발현하는 박테리아 세포주를 생산할 수 있고, 이어서 단백질은 표준 기술을 이용하여 정제할 수 있다.
본원에서 핵산의 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터의 선택은 특정 용도에 따라 결정된다. 식물에서 유전자의 발현을 유도하는 많은 프로모터가 본원의 실시양태에서 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 구성적, 화학적으로 조절되는, 유도가능, 조직-특이적, 및 종자-선호 프로모터로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강력한 구성적 프로모터는 DGT-28 단백질의 발현 및 정제를 위해 사용될 수 있다. 식물 프로모터의 비제한적인 예는 에이. 탈리아나 (A. thaliana) 유비퀴틴-10 (ubi-10) (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem., 265: 12486-12493); 에이. 투메파시엔스 만노핀 신타제 (△mas) (페톨리노 (Petolino) 등의 미국 특허 6,730,824); 및/또는 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)로부터 유래된 프로모터 서열을 포함한다.
구성적 프로모터는 예를 들어 코어 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); 벼 액틴 프로모터 (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); 옥수수 유비퀴틴 프로모터 (미국 특허 5,510,474; [Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632] 및 [Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689]); pEMU 프로모터 (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); ALS 프로모터 (미국 특허 5,659,026); 옥수수 히스톤 프로모터 (Chaboute et al. Plant Molecular Biology, 8: 179-191 (1987)) 등을 포함한다.
이용가능한 식물에 적합한 프로모터의 범위는 조직 특이적 및 유도가능 프로모터를 포함한다. 유도가능 조절 요소는 인듀서에 반응하여 하나 이상의 DNA 서열 또는 유전자의 전사를 직접 또는 간접적으로 활성화할 수 있는 것이다. 인듀서의 부재 하에, DNA 서열 또는 유전자는 전사되지 않을 것이다. 일반적으로, 전사를 활성화하기 위해 유도가능 조절 요소에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하고, 이어서 인듀서에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 인듀서는 화학적 작용제, 예컨대 단백질, 대사체, 성장 조절제, 제초제 또는 페놀계 화합물 또는 직접 열, 추위, 염, 또는 독성 요소에 의해 또는 병원체 또는 질병 물질, 예컨대 바이러스의 작용을 통해 간접적으로 부가되는 생리학적 스트레스일 수 있다. 일반적으로, 전사를 활성화하기 위해 유도가능 조절 요소에 특이적으로 결합하는 단백질 인자는 불활성 형태로 존재하고, 이어서 인듀서에 의해 활성 형태로 직접 또는 간접적으로 전환된다. 유도가능 조절 요소를 함유하는 식물 세포는 예컨대 분무, 살수, 가열 또는 유사한 방법에 의해 인듀서를 세포 또는 식물에 외부에서 적용함으로써 노출될 수 있다.
임의의 유도가능 프로모터가 본원의 실시양태에서 사용될 수 있다 (문헌 [Ward et al. Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993)] 참조. 유도가능 프로모터는 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 엑디손 수용체 프로모터 (미국 특허 6,504,082); 구리에 반응하는 ACE1 시스템으로부터의 프로모터 (Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); 벤젠술폰아미드 제초제 완화제 (safener)에 반응하는 옥수수로부터의 In2-1 및 In2-2 유전자 (미국 특허 5,364,780; [Hershey et al., Mol Gen. Genetics 227: 229-237 (1991)] 및 [Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)]); Tn10으로부터의 Tet 리프레서 (repressor) (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991)); 그의 전사 활성이 글루코코르티코스테로이드 호르몬에 의해 유도되는 스테로이드 호르몬 유전자로부터의 프로모터 ([Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991)] 및 [McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247-257]); 발아전 제초제로서 사용되는 소수성 친전자성 화합물에 의해 활성화되는 옥수수 GST 프로모터 (미국 특허 5,965,387 및 국제 특허 출원 공개 WO 93/001294 참조); 및 살리실산에 의해 활성화되는 담배 PR-1a 프로모터 ([Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsuka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System", Biosci Biotechnol Biochem. 2011 Sep 23;75(9): 1796-800] 참조). 관심있는 다른 화학물질-조절 프로모터는 테트라사이클린-유도가능 및 테트라사이클린-억제가능 프로모터를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237], 및 미국 특허 5,814,618 및 5,789,156 참조).
관심있는 다른 조절가능 프로모터는 다음을 포함한다: 각각 그의 전사가 추위 또는 열에 대한 노출에 반응하여 실시될 수 있는 추위 반응성 조절 요소 또는 열 충격 조절 요소 (Takahashi et al., Plant Physiol. 99:383-390, 1992); 혐기성 조건에 의해 유도가능한 알콜 데히드로게나제 유전자의 프로모터 ([Gerlach et al., PNAS USA 79:2981-2985 (1982)]; [Walker et al., PNAS 84(19):6624-6628 (1987)]); 완두콩 rbcS 유전자 또는 완두콩 psaDb 유전자로부터 유래된 광-유도가능 프로모터 (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2):255-265); 광-유도가능 조절 요소 ([Feinbaum et al., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991]; [Lam and Chua, Science 248:471, 1990]; [Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590]; [Orozco et al. (1993) Plant Mol. Bio. 23(6): 1129-1138]); 식물 호르몬 유도가능 조절 요소 ([Yamaguchi-Shinozaki et al., Plant Mol. Biol. 15:905, 1990]; [Kares et al., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990]) 등. 또한, 유도가능 조절 요소는 벤젠술폰아미드 제초제 완화제에 반응하는 옥수수 In2-1 또는 In2-2 유전자의 프로모터 ([Hershey et al., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991]; [Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994]), 및 트랜스포존 Tn10의 Tet 리프레서 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991)일 수 있다.
스트레스 유도가능 프로모터는 다음을 포함한다: 염/물 스트레스-유도가능 프로모터, 예컨대 P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129:81-89); 추위-유도가능 프로모터, 예컨대 cor15a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm et al. (1993) Plant. Mol. Biol. 23: 1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909), 및 ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113:335-45); 가뭄-유도가능 프로모터, 예컨대 Trg-31 (Chaudhary et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57) 및 rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); 삼투압 유도가능 프로모터, 예컨대 Rab17 (Vilardell et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) 및 오스모틴 (Raghothama et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23:1117-28); 열 유도가능 프로모터, 예컨대 열 충격 단백질 ([Barros et al. (1992) Plant Mol. 19:665-75]; [Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338); 및 파슬리 유비퀴틴 프로모터로부터의 열 충격 유도가능 요소 (WO 03/102198). 다른 스트레스-유도가능 프로모터는 다음을 포함한다: rip2 (미국 특허 5,332,808 및 미국 특허 공개 2003/0217393) 및 rd29a (Yamaguchi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). 아그로박테리움 pMAS 프로모터 (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505) 및 아그로박테리움 ORF13 프로모터 (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343)를 포함하는 특정 프로모터는 상처에 의해 유도가능하다.
조직에 바람직한 프로모터는 특정 식물 조직 내에서 향상된 전사 및/또는 발현을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 이들 종류의 프로모터의 예는 종자에 바람직한 발현, 예컨대 파세올린 프로모터 (Bustos et al. 1989. The Plant Cell Vol. 1, 839-853), 및 옥수수 글로불린-1 유전자 (Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 쌍떡잎식물에 대해, 종자에 바람직한 프로모터는 콩 β-파세올린, 나핀, β-콩글라이시닌, 대두 렉틴, 크루시페린 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 외떡잎 식물에 대해, 종자에 바람직한 프로모터는는 옥수수 15 kDa 제인, 22 kDa 제인, 27 kDa 제인, γ-제인, 왁시 (waxy), 쉬렁켄 (shrunken) 1, 쉬렁켄 2, 글로불린 1 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 종자에 바람직한 프로모터는 또한 종자 내의 특이적 조직에 우세하게 유전자 발현을 유도하는 프로모터, 예컨대 γ-제인의 배젖에 바람직한 프로모터, 담배로부터의 미상 (cryptic) 프로모터 (Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), 옥수수로부터의 P-유전자 프로모터 (Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements. Plant Cell 7: 1149-1158, Erratum in Plant Cell 1997, 1:109), 옥수수로부터의 글로불린-1 프로모터 (Belenger and Kriz. 1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972), 및 종자 외피 또는 옥수수 알맹이의 껍질에서의 발현을 유도하는 프로모터, 예를 들어 과피-특이적 글루타민 합성효소 프로모터 (Muhitch et al., 2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872)를 포함한다.
프로모터에 추가로, 발현 벡터는 일반적으로 숙주 세포 (원핵 또는 진핵) 내에서 핵산의 발현을 위해 요구되는 모든 추가의 요소를 함유하는 전사 단위 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는 예를 들어 단백질을 코딩하는 핵산 서열, 및 예를 들어 전사체의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종료, 리보좀 결합 부위, 또는 번역 종료에 필요한 신호에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 카세트의 추가의 요소는 예를 들어 인핸서 및 이종성 스플라이싱 (splicing) 신호를 포함할 수 있다.
벡터의 다른 성분이 또한 유전자의 의도되는 용도에 따라 포함될 수 있다. 그 예는 선택가능한 마커, 표적화 또는 조절 서열, 수송 (transit) 펩티드 서열, 예컨대 최적화된 수송 펩티드 서열 (미국 특허 5,510,471 참조), 안정화 서열, 예컨대 RB7 MAR ([Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol, 34: 687-692] 및 WO9727207 참조) 또는 리더 서열, 인트론 등을 포함한다. 식물 발현 벡터 및 리포터 유전자에 대한 일반적인 설명 및 예는 문헌 [Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al. eds; CRC Press pp. 89-119 (1993)]에서 볼 수 있다.
적절한 발현 벡터의 선택은 숙주, 및 발현 벡터를 숙주 내로 도입시키는 방법에 의존할 것이다. 발현 카세트는 관심있는 이종성 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 식물에서 기능성인 전사 및 번역 종료 영역을 포함할 수 있다. 종료 영역은 관심있는 DNA 서열에 대해 천연일 수 있거나 또는 또 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다. 편리한 종료 영역은 에이. 투메파시엔스의 Ti-플라스미드, 예컨대 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 (nos) 종료 영역으로부터 이용가능하다 ([Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982)] 및 [Shaw et al. (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831-7846(nos)]; 또한 [Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991)]; [Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991)]; [Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149 (1991)]; [Mogen et al. Plant Cell 2: 1261-1272 (1990)]; [Munroe et al. Gene 91 : 151-158 (1990)]; [Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989)]; [Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987)] 참조).
발현 카세트는 5' 리더 서열을 함유할 수 있다. 상기 리더 서열은 번역을 향상시키는 작용을 할 수 있다. 번역 리더는 당업계에 공지되어 있고, 예로서 다음을 포함한다: 피코르나바이러스 리더, EMCV 리더 (뇌심근염 5' 비코딩 영역) (Elroy-Stein et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989)); 포티바이러스 리더, 예를 들어, TEV 리더 (담배 식각 바이러스) (Carrington and Freed, Journal of Virology, 64: 1590-1597 (1990)), MDMV 리더 (옥수수 위축 모자이크 바이러스) (Allison et al., Virology 154:9-20 (1986)); 인간 이뮤노글로불린 중쇄 결합 단백질 (BiP) (Macejak et al. Nature 353:90-94 (1991)); 알팔파 모자이크 바이러스의 코트 단백질 mRNA의 비번역된 리더 (AMV RNA 4) (Jobling et al. Nature 325:622-625 (1987)); 담배 모자이크 바이러스 리더 (TMV) (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, pages 237-256); 및 옥수수 백화 얼룩 바이러스 리더 (MCMV) (Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991). 또한, 문헌 [Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987)]을 참조한다.
또한, 구축물은 번역 및/또는 mRNA 안정성을 향상시키는 서열, 예컨대 인트론을 함유할 수 있다. 상기 인트론의 예는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)의 히스톤 H3.III 변이체의 유전자 II의 제1 인트론이다 (Chaubet et al. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992)).
이종성 뉴클레오티드 서열이 특정 소기관, 특히 색소체, 전분체 (amyloplast), 또는 소포체로 향하거나, 또는 세포의 표면 또는 세포외로 분비되는 것이 바람직한 경우에, 발현 카세트는 추가로 수송 펩티드의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 상기 수송 펩티드는 당업계에 잘 공지되어 있고, 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 아실 담체 단백질, RUBISCO의 작은 서브유닛, 식물 EPSP 신타제 및 헬리안투스 아누우스 (Helianthus annuus)의 수송 펩티드 (르브룬 (Lebrun) 등의 US 특허 5,510,417 참조), 제아 메이즈 (Zea mays) 브리틀(Brittle)-1 엽록체 수송 펩티드 ([Nelson et al. Plant Physiol. 117(4): 1235-1252 (1998)]; [Sullivan et al. Plant Cell 3(12):1337-48]; [Sullivan et al., Planta (1995) 196(3):477-84]; [Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26): 18999-9004]) 등. 추가로, 키메릭 엽록체 수송 펩티드, 예컨대 최적화된 수송 펩티드 (미국 특허 5,510,471 참조)는 당업계에 잘 공지되어 있다. 추가의 엽록체 수송 펩티드는 미국 특허 5,717,084; 5,728,925에서 이전에 설명되었다. 당업자는 생성물을 특정 소기관에서 발현시킬 때 이용가능한 많은 선택 방안을 쉽게 알 것이다. 예를 들어, 보리 알파 아밀라제 서열은 종종 소포체에서의 발현을 유도하기 위해 사용된다 (Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985)).
당업자는 재조합 DNA 기술의 사용이 예를 들어 숙주 세포 내의 핵산 분자의 카피의 수, 핵산 분자가 전사되는 효율, 생성된 전사체가 번역되는 효율, 및 번역후 변형의 효율을 조작함으로써 형질감염된 핵산 분자의 발현의 제어를 개선할 수 있음을 알 것이다. 추가로, 프로모터 서열은 천연 프로모터에 비해 발현 수준을 개선하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 핵산 분자의 발현을 제어하기 위해 유용한 재조합 기술은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 핵산 분자의 하나 이상의 숙주 세포 염색체 내로의 안정한 통합, 벡터 안정성 서열의 플라스미드에 대한 부가, 전사 제어 신호 (예를 들어, 프로모터, 작동유전자, 인핸서)의 치환 또는 변형, 번역 제어 신호 (예를 들어, 리보좀 결합 부위, 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno) 또는 코작 (Kozak) 서열)의 치환 또는 변형, 숙주 세포의 코돈 사용 빈도에 대응하는 핵산 분자의 변형, 및 전사체를 탈안정화시키는 서열의 결실.
형질전환된 세포 또는 조직 또는 식물 부분 또는 식물의 선택을 위한 리포터 또는 마커 유전자가 형질전환 벡터에 포함될 수 있다. 선택가능한 마커의 예는 다음을 포함한다: 항-대사체, 예컨대 제초제 또는 항생제에 대한 저항성을 부여하는 것, 예를 들어, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 디히드로폴레이트 리덕타제 ([Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994]; 또한 [Herrera Estrella et al., Nature 303:209-213, 1983]; [Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991] 참조); 아미노글리코시드 네오마이신, 카나마이신 및 파로마이신에 대한 저항성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 ([Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983] 및 [Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)]); 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 ([Marsh, Gene 32:481-485, 1984]; 또한 [Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985]; [Zhijian et al., Plant Science 108:219-227, 1995] 참조); 세포가 트립토판 대신에 인돌을 이용할 수 있도록 하는 trpB; 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 이용할 수 있도록 하는 hisD (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988); 세포가 만노스를 이용할 수 있도록 하는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 (WO 94/20627); 오르니틴 데카르복실라제 억제제 2-(디플루오로메틸)-DL-오르니틴 (DFMO)에 대한 저항성을 부여하는 오르니틴 데카르복실라제 (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); 및 블라스티시딘 에스 (Blasticidin S)에 대한 저항성을 부여하는 아스페르길루스 테레우스 (Aspergillus terreus)로부터의 데아미나제 (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995).
추가의 선택가능한 마커는 다음을 포함한다: 예를 들어 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 저항성을 부여하는 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), 아트라진에 대한 저항성을 부여하는 돌연변이체 psbA (Smeda et al., Plant Physiol. 103:911-917, 1993), 또는 돌연변이체 프로토포르피리노겐 옥시다제 (미국 특허 5,767,373 참조), 또는 제초제, 예컨대 글루포시네이트에 대한 저항성을 부여하는 다른 마커. 적합한 선택가능한 마커 유전자의 예는 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 클로람페니콜 (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2:987-992, 1983); 스트렙토마이신 (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); 스펙티노마이신 (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5:131-137, 1996); 블레오마이신 (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); 술폰아미드 (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); 브로목시닐 (Stalker et al., Science 242:419-423, 1988); 글리포세이트 (Shaw et al., Science 233:478-481, 1986); 포스피노트리신 (DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518, 1987) 등에 대한 저항성을 코딩하는 유전자.
선택 유전자의 사용을 위한 하나의 선택 방안은 글루포시네이트-저항성 코딩 DNA이고, 하나의 실시양태에서 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터의 제어 하의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (pat), 옥수수 최적화된 pat 유전자 또는 bar 유전자일 수 있다. 이들 유전자는 비알라포스 (bialaphos)에 대한 저항성을 부여한다 ([Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37]; [Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603; 1990]; [Uchimiya et al., BioTechnology 11:835, 1993]; [White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990]; [Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990]; 및 [Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989] 참조). pat 유전자의 한 버전은 미국 특허 6,096,947에 설명되어 있는 옥수수 최적화된 pat 유전자이다.
또한, 마커를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 식물 세포의 확인을 용이하게 하는 마커가 사용될 수 있다. 평가가능한 또는 스크린가능한 마커가 유용하고, 여기서 서열의 존재는 측정가능한 생성물을 생산하고, 식물 세포를 파괴하지 않으면서 생성물을 생산할 수 있다. 그 예는 β-글루쿠로니다제, 또는 uidA 유전자 (GUS) (다양한 색원체 기질이 알려진 효소를 코딩) (예를 들어, US 특허 5,268,463 및 5,599,670); 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901-3907); 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 사용된 마커는 베타-카로틴 또는 프로비타민 A이다 (Ye et al., Science 287:303-305 (2000)). 이 유전자는 쌀의 영양분을 향상시키기 위해 사용되어 왔지만, 이 경우에는 스크린가능한 마커로서 대신 사용되고, 관심있는 유전자에 연결된 유전자의 존재는 제공되는 금색에 의해 검출된다. 유전자가 식물의 영양소에 대한 그의 기여를 위해 사용되는 상황과 달리, 보다 소량의 단백질이 표시 목적을 위해 충분하다. 다른 스크린가능한 마커는 다음을 포함한다: 예를 들어 특히 식물 조직에서 안토시아닌 색소 (적색)의 생산을 조절하는 생성물을 코딩하는 R-유전자좌 유전자 (Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); 플라보노이드 색소의 생합성을 제어하는 유전자, 예컨대 옥수수 C1 유전자 ([Kao et al., Plant Cell (1996) 8:1171-1179]; [Scheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48]) 및 옥수수 C2 (Wienand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); B 유전자 (Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), p1 유전자 ([Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591]; [Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553]; [Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19)]); 브론즈 (bronze) 유전자좌 유전자 ([Ralston et al., Genetics (1988) 119:185-197]; [Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11):1039-1049])를 포함하는 전체적으로 안토시아닌/플라보노이드 유전자 (문헌 [Taylor and Briggs, The Plant Cell (1990)2:115-127]에서의 논의 참조).
적합한 마커의 추가의 예는 다음을 포함한다: 시안 형광 단백질 (CYP) 유전자 ([Bolte et al. (2004) J Cell Science 111:943-54] 및 [Kato et al. (2002) Plant Physiol. 129: 913-42]), 황색 형광 단백질 유전자 (에브로겐 (Evrogen)의 PHIYFP™; [Bolte et al. (2004) J Cell Science 117:943-54] 참조); 그 존재를 예를 들어 X-선 필름, 섬광 계수, 형광 분광광도법, 저조도 비디오 카메라, 광자 계수 카메라 또는 다중웰 광도 측정을 사용하여 검출할 수 있는 루시퍼라제를 코딩하는 lux 유전자 (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); 초록 형광 단백질 (GFP) 유전자 (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5):777-84); 및 마커 유전자로 형질전환된 식물 세포가 적색이고 따라서 시각적으로 선택가능한 DsRed2 (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2):286-293). 추가의 예는 다음을 포함한다: 그에 대한 다양한 색원체 기질 (예를 들어, PADAC, 색원체 세팔로스포린)이 알려진 효소를 코딩하는 β-락타마제 유전자 (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737); 색원체 카테콜을 전환할 수 있는 카테콜 디옥시게나제를 코딩하는 xylE 유전자 (Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80: 1101); α-아밀라제 유전자 (Ikuta et al., Biotech. (1990) 8:241); 및 티로신을, 다시 축합되어 쉽게 검출가능한 화합물 멜라닌을 형성하는 DOPA 및 도파퀴논으로 산화시킬 수 있는 효소를 코딩하는 티로시나제 유전자 (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703). 분명한 사실은, 많은 상기 마커가 이용가능하고 당업자에게 알려져 있다는 것이다.
IV. 클래스 IV EPSPS를 포함하는 세포 및 유기체
일부 실시양태에서, 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 세포 및/또는 유기체 (예를 들어, 식물 세포 또는 식물)가 제공된다. 특정 실시양태에서, 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 세포 및/또는 유기체가 제공된다. 일부 실시양태는 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 세포 및/또는 유기체를 포함한다. 일부 실시양태는 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 세포 및/또는 유기체를 포함한다.
식물 세포, 식물 부분, 및/또는 식물은 당업계에 공지된 이종성 분자를 도입하는 임의의 몇몇 방법에 의해 이종성 폴리펩티드 (예를 들어, 클래스 IV EPSPS) 및/또는 이종성 핵산 (예를 들어, 클래스 IV EPSPS-코딩 핵산)을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 본원의 특정 실시양태에서, 이종성 분자는 예를 들어 비제한적으로 형질전환 및 선택적 육종 (예를 들어, 역교배 육종)으로부터 선택되는 방법에 의해 식물 세포, 식물 부분, 및/또는 식물 내로 도입된다.
임의의 식물 종 또는 식물 세포는 본원의 이종성 폴리펩티드 및/또는 핵산을 포함하도록 유전적으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 그와 같이 유전적으로 변형된 식물 세포는 식물을 생산하도록 재생될 수 없다. 일부 실시양태에서, 본원에 따라 유전적으로 변형된 식물 (예를 들어, 식물 숙주 세포)은 고등 식물, 쌍떡잎 식물, 외떡잎 식물, 소비가능 식물, 작물 식물, 및 그의 오일을 위해 이용되는 식물 (예를 들어, 지방종자 식물)을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 상기 식물은 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 알팔파; 대두; 면화; 평지씨 (카놀라); 아마씨; 옥수수; 벼; 브라키아리아 (brachiaria); 밀; 홍화; 수수; 사탕무; 해바라기; 담배; 및 초본 (예를 들어, 잔디풀 (turf grass)). 특정 예에서, 본원에서 유전적으로 변형된 식물 세포 또는 식물은 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 브라시카 나푸스 (Brassica napus); 인도 겨자 (브라시카 준세아 (Brassica juncea)); 에티오피아 겨자 (브라시카 카리나타 (Brassica carinata)); 순무 (브라시카 라파 (Brassica rapa)); 양배추 (브라시카 올레라세아 (Brassica oleracea)); 글라이신 맥스 (Glycine max); 리눔 우시타티시뭄 (Linum usitatissimum); 제아 메이즈; 카르타무스 팅토리우스 (Carthamus tinctorius); 헬리안투스 아누우스; 니코티아나 타바쿰 (Nicotiana tabacum); 아라비돕시스 탈리아나, 브라질 너트 (nut) (베톨레티아 엑셀사 (Betholettia excelsa)); 피마자 (리시누스 코무니스 (Ricinus communis)); 코코넛 (코커스 누시페라 (Cocus nucifera)); 고수 (코리안드룸 사티붐 (Coriandrum sativum)); 고시퓸 (Gossypium) 종; 땅콩 (아라키스 하이포가에아 (Arachis hypogaea)); 호호바 (시몬드시아 키넨시스 (Simmondsia chinensis)); 기름 야자 (엘라에이스 귀니이스 (Elaeis guineeis)); 올리브 (올레아 유르파에아 (Olea eurpaea)); 오리자 사티바 (Oryza sativa); 호박 (쿠쿠르비타 맥시마 (Cucurbita maxima)); 보리 (호르데움 불가레 (Hordeum vulgare)); 사탕수수 (사카룸 오피시나룸 (Saccharum officinarum)); 트리티쿰 (Triticum) 종 (트리티쿰 두룸 (Triticum durum) 및 트리티쿰 애스티붐 (Triticum aestivum) 포함); 및 개구리밥 (렘나세애 (Lemnaceae) 종). 일부 실시양태에서, 식물은 엘리트 (elite) 재배종, 야생형 재배종, 및 상업적으로 구분가능한 품종에 대해 특정 유전적 배경을 가질 수 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산은 본질적으로 임의의 식물에 목적하는 형질을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 매우 다양한 식물 및 식물 세포 시스템이 클래스 IV EPSPS를 코딩하는 핵산 및 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본원에 설명된 목적하는 생리학적 및 작물학적 특징을 위해 조작될 수 있다. 본원의 실시양태는 당업계에 공지되어 있는 식물의 형질전환 (및 유전적으로 변형된 식물의 생산)을 위한 임의의 많은 방법을 사용할 수 있다. 쌍떡잎 식물, 및 외떡잎 식물에 대한 생물학적 및 물리적 형질전환 프로토콜을 비롯하여 식물 형질전환을 수많은 방법이 개발되었다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:282-6]; [Miki et al. (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (Glick, B. R. and Thompson, J. E., Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 67-88] 참조). 추가로, 식물 세포 및 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은 예를 들어 문헌 [Gruber et al. (1993), 상기 문헌, pp. 89-119]에 설명되어 있다.
핵산을 식물 숙주 세포 내로 도입하기 위해 이용가능한 식물 형질전환 기술은 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 형질전환제로서 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 에이. 리조게네스를 사용한 디스암드 (disarmed) T-DNA에 의한 형질전환; 인산칼슘 형질감염; 폴리브렌 형질전환; 원형질체 융합; 전기천공 (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-505); 초음파 방법 (예를 들어, 소노포레이션); 리포좀의 형질전환; 미세주입; 네이키드 DNA 접촉; 플라스미드 벡터 접촉; 바이러스 벡터 접촉; 비올리스틱 (예를 들어, DNA 입자 폭격 (예를 들어, 문헌 [Klein et al. (1987) Nature 327:70-3] 참조) 및 미세입자 폭격 ([Sanford et al. (1987) Part. Sci. Technol. 5:27]; [Sanford (1988) Trends Biotech. 6:299], [Sanford (1990) Physiol. Plant 79:206]; 및 [Klein et al. (1992) Biotechnology 10:268] 참조); 탄화규소 WHlSKERS-매개 형질전환 (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep. 9:415-8); 나노입자 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 공개 US2009/0104700A1 참조); 에어로졸 조사; 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-매개 흡수. 구체적인 예에서, 이종성 핵산은 직접 식물 세포의 게놈 DNA 내로 도입될 수 있다다.
발현 벡터를 식물 내로 도입시키기 위한 널리 이용되는 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템에 기반한다 [Horsch et al. (1985) Science 227: 1229]. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스는 식물 세포를 유전적으로 형질전환하기 위해 유용한 것으로 공지된 식물 병원성 토양 박테리아이다. 각각 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 식물의 유전자 형질전환을 담당하는 유전자를 보유한다 ( Kado (1991) Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1). 아그로박테리움 벡터 시스템 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달 방법에 관한 상세한 내용은 또한 예를 들어 문헌 [Gruber et al., 상기 문헌], [Miki et al., 상기 문헌], [Moloney et al. (1989) Plant Cell Reports 8:238], 및 미국 특허 4,940,838 및 5,464,763에서 이용가능하다.
형질전환을 위해 아그로박테리움을 사용하는 경우에, 삽입할 DNA는 일반적으로 특수 플라스미드 내로; 중간 벡터 또는 2원 (binary) 벡터 내로 클로닝된다. 중간 벡터는 스스로 아그로박테리움에서 복제할 수 있다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드 (접합)에 의해 에이. 투메파시엔스 내로 전달될 수 있다. 일본 담배 초2원성 (Japan Tobacco Superbinary) 시스템은 그러한 시스템의 한 예이다 (문헌 [Komari et al. (2006) Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343]; [Agrobacterium Protocols, 2nd Edition, Vol. 1, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.15-41]; 및 [Komori et al. (2007) Plant Physiol. 145: 1155-60]에서 검토됨). 2원 벡터는 이. 콜라이 내에서 및 아그로박테리움 내에서 스스로 복제할 수 있다. 2원 벡터는 우측 및 좌측 T-DNA 경계 영역에 끼인 선택 마커 유전자 및 링커 또는 폴리링커를 포함한다. 이들은 아그로박테리움 내로 직접 형질전환될 수 있다 (Holsters, 1978). 아그로박테리움은 vir 영역을 보유하는 플라스미드를 포함한다. Ti 또는 Ri 플라스미드는 또한 T-DNA의 전달에 필요한 vir 영역을 포함한다. 식물 세포 내로 T-DNA의 전달을 위해 vir 영역이 필요하다. 추가의 T-DNA가 함유될 수 있다.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병원성 기능은 세포가 2원 T DNA 벡터 (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-21) 또는 공동-경작 절차 (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-31)를 사용하여 박테리아에 의해 감염될 때 구축물을 함유하는 T-가닥 및 인접한 마커의 식물 세포 DNA 내로의 삽입을 유도할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템이 쌍떡잎 식물을 조작하기 위해 사용된다 ([Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet. 16:357-84]; [Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-41]). 아그로박테리움 형질전환 시스템은 또한 외떡잎 식물 및 식물 세포를 형질전환하고 또한 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다 (미국 특허 5,591,616; 문헌 [Hernalsteen et al. (1984) EMBO J. 3:3039-41]; [Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-4]; [Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-9]; [Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40]; 및 [Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-34] 참조).
본원의 재조합 숙주의 유전자 조작은 표준 유전학 기술 및 스크리닝을 이용하여 수행할 수 있고, 유전자 조작에 적합한 임의의 숙주 세포에서 수행할 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 숙주 세포는 유전자 변형 및/또는 재조합 유전자 발현에 적합한 임의의 유기체 또는 미세유기체 숙주일 수 있다. 일부 실시양태에서, 재조합 숙주는 식물일 수 있다. 본원에 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 비제한적으로 문헌 [Sambrook et al. (1989), 상기 문헌]; [Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]; 및 [Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, New York, NY]에 설명되어 있다.
식물 세포 내로 핵산의 도입 이후, 식물 세포는 성장할 수 있고, 분화 조직, 예컨대 싹 및 뿌리의 발아시에, 성숙 식물이 생성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다수의 식물이 생성될 수 있다. 식물을 재생하기 위한 방법은 당업자에 알려져 있고, 예를 들어 문헌 [Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers] 및 [Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press]에서 볼 수 있다. 본원에서 설명되는 유전적으로 변형된 식물은 발효 배지에서 배양되거나 적합한 배지, 예컨대 토양에서 성장할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고등 식물에 적합한 성장 배지는 토양, 모래, 뿌리 성장을 지지하는 임의의 다른 입자 배지 (예를 들어, 질석, 펄라이트 (perlite) 등) 또는 수경 배양액, 및 고등 식물의 성장을 용이하게 하는 적합한 광, 물 및 영양 보충물을 포함하고 이로 제한되지 않는 식물에 대한 임의의 성장 배지일 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생산되는 형질전환된 식물 세포는 형질전환된 유전자형, 및 따라서 목적하는 표현형을 갖는 전체 식물을 재생하기 위해 배양될 수 있다. 그러한 재생 기술은 조직 배양 성장 배지에서 특정 식물호르몬의 조작, 일반적으로 살생물제 및/또는 목적하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 제초제 마커에 따라 결정된다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생은 문헌 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 설명되어 있다. 재생은 또한 식물 캘러스, 외식편, 기관, 꽃가루, 배 또는 그의 일부로부터 입수할 수 있다. 그러한 재생 기술은 일반적으로 문헌 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에서 설명되어 있다.
다른 실시양태에서, 형질전환된 식물 세포는 식물을 생산하기 위해 재생될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어 관련 표현형, 예를 들어, 제초제 내성을 갖는 식물 세포주를 개발하기 위해 사용될 수 있다.
형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물은 조작된 식물 물질을 형질전환하는 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 코딩되는 형질에 대해 선택하거나 스크리닝함으로써 확인되고 단리될 수 있다. 예를 들어, 선택은 형질전환하는 유전자 구축물이 그에 대한 저항성을 부여하는 억제량의 항생제 또는 제초제를 함유하는 배지 상에서 조작된 식물 물질을 성장시킴으로써 수행할 수 있다. 추가로, 형질전환된 식물 및 식물 세포는 또한 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 임의의 가시적인 마커 유전자 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 또는 gfp 유전자)의 활성을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 상기 선택 및 스크리닝 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본원의 이종성 분자를 함유하는 트랜스제닉 식물은 예를 들어 분자를 포함하는 제1 모 식물, 및 제2 모 식물을 유성 교배하여 다수의 제1 자손체 식물을 생산함으로써 선택적 육종을 통해 생산될 수 있다. 이어서, 선택가능한 마커 (예를 들어, 본원의 이종성 분자에 의해 그에 대한 저항성이 자손체 식물에 부여될 수 있는 글리포세이트)에 저항성인 제1 자손체 식물이 선택될 수 있다. 이어서, 제1 자손체 식물을 자가수정시켜 다수의 제2 자손체 식물을 생산할 수 있다. 이어서, 선택가능한 마커에 저항성인 제2 자손체 식물을 선택할 수 있다. 이들 단계는 제1 자손체 식물 또는 제2 자손체 식물의 제2 모 식물 또는 제3 모 식물에 대한 역교배를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 2개의 상이한 트랜스제닉 식물이 2개의 독립적으로 분리되는 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 자손체를 생산하기 위해 교배될 수 있음이 이해되어야 한다. 적절한 자손체의 자가수정은 2개의 첨가된 외인성 유전자에 대해 동종접합성 (homozygous)인 식물을 생산할 수 있다. 모 식물에 대한 역교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이계 교배도 영양 번식으로서 고려된다. 상이한 형질 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 다른 육종 방법은 당업계에 공지되어 있다. 역교배 육종은 간단하게 유전되고 고도로 유전가능한 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동종접합성 재배종 또는 동계교배 식물주 내로 전달하기 위해 사용되었다. 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 특질 및 1회친 (donor parent)으로부터 전달되는 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 초기 교배 후에, 1회친의 표현형을 갖는 개체 선택되어 반복친에 대해 반복적으로 교배 (역교배)된다. 생성되는 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 특질 및 1회친으로부터 전달되는 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다.
핵산은 또한 상동성 재조합을 통해 식물 게놈의 소정의 영역 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 상동성 재조합을 통해 식물 세포의 특이적 염색체 부위 내에 안정적으로 통합하는 방법은 당업계에서 설명되었다. 예를 들어, US 특허 공개 2009/0111188 A1에 설명된 바와 같은 부위 특이적 통합은 염색체 표적 내로 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 도입을 매개하는 리콤비나제 또는 인테그라제의 사용을 수반한다. 추가로, 국제 특허 출원 WO 2008/021207은 하나 이상의 공여자 폴리뉴클레오티드 서열을 게놈의 특이적 위치 내에 안정적으로 통합하기 위한 아연 핑거 (zinc finger) 매개-상동성 재조합을 설명하고 있다. 리콤비나제, 예컨대 미국 특허 6,720,475에 설명되어 있는 FLP/FRT, 또는 미국 특허 5,658,772에 설명되어 있는 CRE/LOX가 폴리뉴클레오티드 서열을 특정 염색체 부위 내로 안정적으로 통합하기 위해 이용될 수 있다. 마지막으로, 공여자 폴리뉴클레오티드를 특정 염색체 위치 내로 표적화하기 위한 메가뉴클레아제는 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에 설명되어 있다.
식물 세포 내의 부위 특이적 통합을 위한 다른 다양한 방법은 일반적으로 알려져 있고 적용가능하다 (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159). 또한, 여러 원핵 및 하등 진핵 유기체에서 확인된 부위-특이적 재조합 시스템이 식물에서 사용하기 위해 적용될 수 있다. 상기 시스템의 예는 효모 자이고사카로마이세스 로욱시이 (Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 리콤비나제 시스템 (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203), 및 파지 Mu의 Gin/gix 시스템 (Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 클래스 IV EPSPS는 임의로 숙주 세포 및/또는 유기체 내의 또 다른 핵산과 조합될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 클래스 IV EPSPS를 코딩하는 이종성 핵산은 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 추가의 저항성 또는 내성을 제공하는 또 다른 핵산, 및/또는 선택된 곤충 또는 질병에 대한 저항성 및/또는 영양소 향상, 및/또는 개선된 작물학적 특징을 제공하는 또 다른 핵산, 및/또는 사료, 식품, 산업적, 제약 또는 다른 용도에 유용한 단백질 또는 다른 생성물을 제공하는 또 다른 핵산과 조합되거나 "집적"될 수 있다. 식물 게놈 내에서 2개 이상의 관심있는 핵산 서열의 "집적"은 예를 들어 2 이상의 이벤트를 사용한 통상적인 식물 육종, 핵산을 함유하는 구축물(들)을 사용한 식물의 형질전환, 트랜스제닉 식물의 재-형질전환, 또는 상동성 재조합을 통한 표적화된 통합에 의한 새로운 형질의 부가를 통해 달성할 수 있다.
클래스 IV EPSPS를 코딩하는 이종성 핵산이 "집적"될 수 있는 핵산은 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다:
해충 또는 질병에 대한 저항성을 부여하는 유전자 또는 코딩 서열 (예를 들어 iRNA)
A) 식물 질병 저항성 유전자. 식물 방어는 종종 식물 내의 질병 저항성 유전자 (R)의 생성물과 병원체 내의 대응하는 비병원성 (Avr) 유전자의 생성물 사이의 특이적 상호작용에 의해 활성화된다. 식물 변종은 특이적 병원체 균주에 저항성인 식물을 조작하기 위해 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환될 수 있다. 상기 유전자의 예는 클라도스포륨 풀붐 (Cladosporium fulvum)에 저항성인 토마토 Cf-9 유전자 (Jones et al., 1994 Science 266:789), 슈도모나스 시링가에 (Pseudomonas syringae pv. tomato)에 대한 저항성을 위한 단백질 키나제를 코딩하는 토마토 Pto 유전자 (Martin et al., 1993 Science 262: 1432), 및 슈도모나스 시링가에에 대한 저항성을 위한 아라비돕시스 RSSP2 유전자 (Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089)를 포함한다.
(B) 바실러스 투링기엔시스 (Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 이를 모델로 한 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Geiser et al. (1986) Gene 48:109), 및 영양기 살충 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94] 참조). 또한, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection (미국 메릴랜드주 록빌))으로부터, 예를 들어 ATCC 기탁 번호 40098; 67136; 31995; 및 31998 하에 구입할 수 있다.
(C) 렉틴, 예컨대, 몇몇의 클리비아 미니아타 (Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).
(D) 비타민 결합 단백질, 예를 들어 곤충 해충에 대한 유충구충제로서 유용한 아비딘 및 아비딘 상동체. 미국 특허 5,659,026 참조.
(E) 효소 억제제, 예를 들어, 프로테아제 또는 아밀라제 억제제. 상기 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262: 16793), 담배 프로테이나제 억제제 I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), 및 α-아밀라제 억제제 (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)를 포함한다.
(F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 또는 소아 호르몬, 그의 변이체, 이를 기초로 한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제, 예컨대 소아 호르몬의 불활성화제인 클로닝된 소아 호르몬 에스테라제의 바큘로바이러스 발현 (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).
(G) 발현시에 침범된 해충의 생리를 파괴하는 곤충-특이적 펩티드 또는 신경펩티드 (J. Biol. Chem. 269:9). 상기 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (Regan, 1994), 디플롭테라 푼타타 (Diploptera puntata)에서 확인된 알로스타틴 (Pratt, 1989), 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 (미국 특허 5,266,361)를 포함한다.
(H) 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생산되는 곤충-특이적 독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 (Pang, 1992 Gene 116:165).
(I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살충 활성을 갖는 또 다른 비-단백질 분자의 과다축적을 책임지는 효소.
(J) 생물학적 활성 분자의 번역후 변형을 포함하는 변형에 관여하는 효소; 예를 들어 당분해 효소; 단백질 분해 효소; 지질 분해 효소; 뉴클레아제; 시클라제; 트랜스아미나제; 에스테라제; 히드롤라제; 포스파타제; 키나제; 포스포릴라제; 중합효소; 엘라스타제; 키티나제; 또는 글루카나제 (천연에 존재하거나 합성된 것이든 상관없이). 상기 유전자의 예는 칼라제 (callase) 유전자 (PCT 공개 WO93/02197), 키티나제-코딩 서열 (ATCC로부터 기탁 번호 39637 및 67152 하에 얻을 수 있음), 담배 박각시나방 키티나제 (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), 및 파슬리 유비4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673)를 포함한다.
(K) 신호 전달을 자극하는 분자. 상기 분자의 예는 녹두 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) 및 옥수수 칼모둘린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467)을 포함한다.
(L) 소수성 모멘트 (moment) 펩티드. 미국 특허 5,659,026 및 5,607,914 참조; '914 특허는 질병 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드를 개시하고 있다.
(M) 막 투과효소, 채널 형성제, 또는 채널 차단제, 예컨대 트랜스제닉 담배 식물을 슈도모나스 솔라나세아룸 (Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성으로 만들기 위한 세크로핀-β 용해 펩티드 유사체 (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43).
(N) 바이러스-침습성 단백질 또는 이로부터 유래한 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포 내의 바이러스 코트 단백질의 축적은 바이러스 감염 및/또는 그로부터 코트 단백질 유전자가 유래될 수 있는 바이러스에 의한, 및 관련 바이러스에 의한 질병 발생에 대한 저항성을 부여한다. 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스에 대한 코트 단백질-매개 저항성이 형질전환된 식물에 대해 부여되었다 (예를 들어, 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451 참조).
(O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충 내장에서 중요한 대사 기능에 대해 표적화된 항체는 영향받은 효소를 불활성화시키고 곤충을 죽인다. 예를 들어, 문헌 [Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions]에서는 단일쇄 항체 단편의 생산을 통한 트랜스제닉 담배에서 효소 불활성화를 보여준다.
(P) 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 재조합체 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호됨을 보여주는 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469]을 참조한다.
(Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산된 발생 정지 (developmental-arrestive) 단백질. 따라서, 진균 엔도 α-1,4-D-폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화함으로써 진균 콜로니화 및 식물 영양분 방출을 용이하게 한다 (Lamb et al. (1992) Bio/Technology 10:1436). 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특성 결정은 문헌 [Toubart et al. (1992) Plant J. 2:367]에 설명되어 있다.
(R) 식물에 의해 자연에서 생산되는 발생 정지 단백질, 예컨대 진균 질병에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 (Longemann et al., (1992) Bio/Technology 10:3305).
(S) RNA 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하기 위해 사용되는 RNA 간섭. 한 예에서 RNA 분자는 부분적으로 또는 완전히 이중 가닥이고, 침묵화 (silencing) 반응을 촉발하여 dsRNA의 작은 간섭 RNA로의 절단을 유발하고, 이것은 이후에 상동성 mRNA를 파괴하는 표적화 복합체 내로 포함된다 (예를 들어, 파이어 (Fire) 등의 US 특허 6,506,559; 그레이엄 (Graham) 등의 6,573,099 참조).
제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자
(A) 성장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예를 들어, 이미다졸리논 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이 범주 내의 예시적인 유전자는 AHAS 효소 (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449)로도 알려진 돌연변이체 ALS 효소 (Lee et al., 1988 EMBO J. 7:1241)를 코딩한다.
(B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해 부여된, 또는 유전자, 예컨대 GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (pat 및 bar 유전자; DSM-2), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 코딩 유전자)의 대사 불활성화를 통해 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 하나 이상의 추가의 유전자. 예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP의 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있는 미국 특허 4,940,835를 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 기탁 번호 39256 하에 얻을 수 있고, 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 0 333 033 및 미국 특허 4,975,374에는 제초제, 예컨대 L-포스피노트리신에 대한 저항성을 부여하는 글루타민 합성효소 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 포스피노트리신아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 0 242 246에 제시되어 있다. 문헌 [De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61]은 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메릭 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산을 설명하고 있다. 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온, 예컨대 세톡시딤 (sethoxydim) 및 할록시폽 (haloxyfop)에 대한 저항성을 부여하는 유전자의 예는 문헌 [Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435]에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다.
(C) 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 문헌 [Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169]은 돌연변이체 psbA 유전자를 함유하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스 (Chlamydomonas)의 형질전환을 설명하고 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 기탁 번호 53435, 67441 및 67442 하에 이용가능하다. 또한, 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285: 173]에 기재되어 있다.
(D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)가 호모젠티세이트로 전환되는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)에 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이것은 제초제, 예컨대 이속사졸 (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, 미국 특허 5,424,276), 특히 이속사플루톨 (옥수수에 대한 선택적 제초제), 디케토니트릴 (EP496630, EP496631), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3C12페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (EP625505, EP625508, 미국 특허 5,506,195), 특히 술코트리온, 및 피라졸리네이트를 포함한다. 미국 특허 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원 공개 20030066102에 기재된 유전자를 비롯하여 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자는 상기 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공할 수 있다.
(E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하고 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 또한 부여할 수 있는 유전자. 상기 유전자의 예는 미국 특허 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 (aad-1) 유전자를 포함한다.
(F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하고 또한 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루옥시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 상기 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 (aad-12)를 포함한다.
(G) 디캄바에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 미국 특허 공개 20030135879 참조).
(H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (미국 특허 5,767,373 참조).
(I) 포토시스템 II 반응 중심 (PS II)의 코어 단백질에 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 ([Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).
부가가치 형질을 부여하거나 이 형질에 기여하는 유전자
(A) 예를 들어 식물의 스테아르산 함량을 증가시키기 위해 스테아릴-ACP 탈포화효소의 안티센스 유전자로 옥수수 또는 브라시카를 형질전환함으로써 변형된 지방산 대사 ([Knultzon et al. (1992) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624] 참조).
(B) 감소된 피테이트 함량
(1) 피타제 (phytase)-코딩 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 피타제 유전자의 도입 (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)은 피테이트의 파괴를 향상시켜, 보다 유리된 포스페이트를 형질전환된 식물에 부가할 수 있다.
(2) 유전자는 피테이트 함량을 감소시키기 위해 도입될 수 있다. 예를 들어, 옥수수에서, 이것은 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 옥수수 돌연변이체를 책임지는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝한 후 재도입함으로써 달성할 수 있다 (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).
C) 예를 들어 식물을 전분의 분지 패턴을 변경하는 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환함으로써 변형된 탄수화물 조성. 그러한 효소의 예는 다음을 포함한다: 스트렙토코커스 무쿠스 (Streptococcus mucus) 프럭토실트랜스퍼라제 유전자 (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810), 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genet. 200:220), 바실러스 리케니포르미스 (licheniformis) α-아밀라제 (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), 토마토 인버타제 유전자 (Elliot et al., 1993), 보리 아밀라제 유전자 (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), 및 옥수수 배젖 전분 분지 효소 II (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).
본 개시내용의 특정 실시양태의 핵산 분자와 함께 다양한 검정을 이용할 수 있다. 다음 기술이 다양한 상황에서 유용하고, 한 실시양태에서 식물 세포 내에서 핵산 분자 및/또는 코딩된 폴리펩티드의 존재를 검출하는데 유용하다. 예를 들어, 분자의 존재는 서열의 프라이머 또는 프로브, 코딩된 단백질을 검출하기 위한 ELISA 검정, 단백질을 검출하기 위한 웨스턴 (Western) 블롯, 또는 RNA 또는 DNA를 검출하기 위한 노던 (Northern) 또는 서던 (Southern) 블롯을 사용하여 다양한 방식으로 결정될 수 있다. 효소 DGT-28을 검출하기 위한 효소에 의한 검정을 사용할 수 있다. 추가로, DGT-28 단백질의 존재를 검출할 수 있는 항체는 당업계에 인정되는 절차를 이용하여 생성할 수 있다. 추가의 기술, 예컨대 계내 (in situ) 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색이 또한 특이적 식물 기관 및 조직 내에서 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 도입 유전자는 식물의 일부의 조직에서 또는 일부의 발달기에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 도입 유전자는 실질적으로 그의 전체 생활 주기를 따라 실질적으로 모든 식물 조직에서 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 방식도 적용가능하다.
서던 분석은 흔히 사용되는 검출 방법이고, 여기서 DNA는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 분자량에 의해 DNA를 분리하기 위해 아가로스 겔 상에서 분획화한 후, 나일론 막에 전달된다. 이어서, 이것은 32P (또는 다른 프로브 표지)로 방사성 표지된 프로브 단편과 혼성화되고, SDS 용액 내에서 세척한다.
마찬가지로, 노던 분석은 유사한 프로토콜을 이용하고, 여기서 RNA는 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, RNA를 분자량에 의해 분리하기 위해 아가로스 겔 상에서 분획화한 후, 나일론 막에 전달한다. 이어서, 이를 32P (또는 다른 프로브 표지)로 방사성 표지된 프로브 단편과 혼성화되고, SDS 용액 내에서 세척한다. 관심있는 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 분석은 상대적인 발현 수준을 나타낼 수 있다. 일반적으로, mRNA가 존재하거나 mRNA의 양이 증가하면, 대응하는 도입 유전자가 발현되고 있다고 가정할 수 있다. 노던 분석, 또는 다른 mRNA 분석 프로토콜이, 도입된 도입 유전자 또는 천연 유전자의 발현 수준을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
웨스턴 분석에서, DNA/RNA를 단리하는 대신에, 관심있는 단백질을 추출하고, 아크릴아미드 겔 상에 둔다. 이어서, 단백질을 막 상으로 블로팅하고, 표지화 물질과 접촉시킨다. 예를 들어, 문헌 [Hood et al., "Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification" Molecular Breeding 3:291-306 (1997)]; [Towbin et al., (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(9): 4350-4354]; [Renart et al. "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(7): 3116-3120]을 참조한다.
본원에서 핵산, 또는 그의 절편은 PCR 증폭을 위한 프라이머를 설계하기 위해 사용될 수 있다. PCR 증폭을 수행하는데 있어서, 프라이머와 주형 사이의 특정 정도의 불일치는 용인될 수 있다. 돌연변이, 삽입, 및 결실은 당업자에게 알려진 방법에 의해 제시된 프라이머에서 이루어질 수 있다.
검출 방법의 또 다른 예는 문헌 [Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000]에 설명된 파이로시퀀싱 (pyrosequencing) 기술이다. 상기 방법에서, 인접한 게놈 DNA 및 삽입체 DNA 연결과 중복되는 올리고뉴클레오티드가 설계된다. 올리고뉴클레오티드는 관심있는 영역으로부터의 단일 가닥 PCR (삽입된 서열에 하나의 프라이머 및 측면에 인접하는 게놈 서열에 하나의 프라이머) 생성물에 혼성화하고, DNA 중합효소, ATP, 술푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이팅된다. DNTP를 개별적으로 첨가하고, 혼입은 측정되는 광 신호를 생성한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 또는 다중 염기 연장에 의한 도입유전자 삽입체/측면에 인접하는 서열의 존재를 나타낸다.
분자 비콘 (beacon)은 서열 검출에 유용한 것으로 문헌에 기재되어 있다. 간단히 설명하면, 측면에 인접하는 게놈 및 삽입체 DNA 연결과 중복되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 설계된다. FRET 프로브의 특유한 구조는 형광 및 켄칭 (quenching) 모이어티 (moiety)를 매우 근접한 상태로 유지하는 2차 구조를 함유하도록 만든다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열에 하나의 프라이머 및 측면에 인접하는 게놈 서열에 하나의 프라이머)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환된다. 성공적인 PCR 증폭 후에, FRET 프로브의 표적 서열에 대한 혼성화는 프로브 2차 구조를 제거하고 형광 및 켄칭 모이어티를 공간적으로 분리한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 측면에 인접하는 게놈/도입유전자 삽입체 서열의 존재를 나타낸다.
TAQMAN® (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies, 미국 캘리포니아주 포스터 시티))로 알려진 가수분해 프로브 검정은 DNA 서열의 존재를 검출하고 정량하는 방법이다. 간단히 설명하면, FRET 올리고뉴클레오티드 프로브는 도입 유전자 내에 하나의 올리고뉴클레오티드 및 이벤트-특이적 검출을 위해 측면에 인접하는 게놈 서열에 하나의 올리고뉴클레오티드를 갖도록 설계된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입체 DNA 서열에 하나의 프라이머 및 측면에 인접하는 게놈 서열에 하나의 프라이머)는 열안정성 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 순환된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상의 켄칭 모이어티로부터 형광 모이어티의 절단 및 방출을 야기한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 의한 측면에 인접하는/도입 유전자 삽입체 서열의 존재를 나타낸다.
ELISA 또는 효소 연결 면역검정은 1971년 이후에 알려졌다. 일반적으로, 완충제 내에 가용화된 항원을 플라스틱 표면 상에 코팅한다. 혈청을 첨가하면, 항체는 고체상 상의 항원에 부착할 수 있다. 이들 항체의 존재 또는 부재는 효소에 접합될 때 입증될 수 있다. 적절한 기질을 첨가하면 정량할 수 있는 결합된 접합체의 양을 검출할 수 있을 것이다. 일반적인 ELISA 검정은 비오티닐화된 항-(단백질) 폴리클로날 항체 및 알칼리성 포스파타제 접합체를 이용하는 것이다. 예를 들어, 라카제 수준의 정량적 결정을 위해 사용되는 ELISA는 상업적으로 얻은 폴리클로날 토끼 항체를 이용하는 항체 샌드위치 검정일 수 있다. 항체는 검출을 위해 알칼리성 포스파타제에 접합된다. 또 다른 예에서, 트립신 또는 트립시노겐을 검출하기 위한 ELISA 검정은 비오티닐화된 항-트립신 또는 항-트립시노겐 폴리클로날 항체 및 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타제 접합체를 이용한다.
특정 실시양태는 본 개시내용의 한 실시양태의 식물을 적어도 하나의 모 식물로서 사용하는 교배 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 특정 실시양태는 본원에서 예시된 임의의 식물을 하나 또는 둘 모두의 모 식물로서 갖는 F1 교잡 식물에 관한 것이다. 다른 실시양태는 상기 F1 교잡종에 의해 생산된 종자에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 예시된 식물을 상이한 (예를 들어 동계교배 모체) 식물과 교배하고, 생성된 교잡 종자를 수확함으로써 F1 교잡 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시양태는 암 모체 또는 수 모체인 예시된 식물에 관한 것이다. 생성되는 식물의 특징은 모 식물을 충분히 검토함으로써 개선될 수 있다.
V. 클래스 IV EPSPS 효소에 의해 매개되는 글리포세이트 내성
서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드는 EPSPS 효소 활성을 가질 수 있다. 따라서, 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드; 및 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, 서열 2-4)은 일부 실시양태에서 세포 또는 유기체 (예를 들어, 식물 세포 또는 식물)에 글리포세이트 내성을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 글리포세이트 제초제 제제에 저항성인 식물 또는 식물 세포의 제공은 상기 저항성을 갖는 식물 세포가 경작 영역에서 적어도 일부의 잡초를 방제하기 위해 사용되는 충분한 양의 글리포세이트에 대한 노출에 내성일 수 있는 다양한 용도에서 유용할 수 있다.
글리포세이트 (N-(포스포노메틸) 글라이신을 포함하는 조성물)는 제초제에서 널리 사용되는 성분이다. 글리포세이트는 일반적으로 수성 액체 농축물, 고체 농축물, 에멀젼 또는 미세에멀젼 내에 염으로서 제제화된다. 글리포세이트는 발아로부터 식물 발달의 다양한 단계 전체에 걸쳐 식물의 표면 살포 (over-the-top)로 적용될 수 있다.
글리포세이트 제초제 제제와 조합하여 사용되는 글리포세이트 내성 식물 변종은 미국 및 전세계에서 작물 생산에서 잡초 관리를 위한 표준 프로그램이 되어왔다. 글리포세이트 내성 형질을 사용할 때 재배자의 1차적인 이점은 우수한 작물 안전성 및 심기전 제초제 적용에 대한 보다 낮은 의존성과 함께 원치 않는 식물 및 초본 (즉, "잡초")을 방제하기 위해 광범위 스펙트럼의, 발아후 제초제인 글리포세이트의 간단하고 편리한 적용이 가능하다는 것이다. 다른 이점은 무경운 (no-till) 및 감소된 경운 (tillage) 시스템에 대한 보다 우수한 적합성을 포함한다. 글리포세이트 내성 작물은 잡초 관리를 위한 선택 사항을 확장하였고, 잡초 방제 실시를 훨씬 더 용이하고, 비용을 덜 들게 하고 보다 융통성있게 만들었다. 재배자들은 제초제 적용을 위해 경작지를 보다 적게 왕복하고 재배를 위해 보다 적게 왕복함을 보고하였고, 이것은 연료를 절약하고 토양 침식을 감소시킨다. 따라서, 글리포세이트-내성 작물은 제초제에 의해 제기되는 환경적인 위험을 감소시키고, 이와 동시에 필요한 화학적 잡초 방제의 효율을 증가시킨다.
따라서, 본원에서 일부 실시양태는 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드; 및/또는 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물이 존재하는 경작 영역에서 잡초의 선택적 방제를 제공하고, 여기서 식물은 폴리펩티드 및/또는 핵산(들)을 포함하지 않는 동일한 종의 식물에 비해 증가된 글리포세이트 내성을 갖는다. 일부 예에서, 본원에서 제공되는 방법은 잡초의 성장을 제어하기 위해 충분한 양의 제초제 글리포세이트를 작물 잎 및 잡초에 적용하는 것을 포함한다.
본원에서 특정 실시양태는 작물 (예를 들어, 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드; 및/또는 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS에 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 및 서열 170-173을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 식물)이 존재하는 경작 영역에서 잡초 또는 원치 않는 식생을 사멸하거나 방제하기 위한 방법을 제공한다. 일부 예에서, 방법은 글리포세이트를 작물 및/또는 경작 영역에 적용하고; 예를 들어 일정량의 글리포세이트를 작물 식물의 잎에, 및 이와 동시에 상기 식물에 근접하여 성장하는 잡초에 적용하는 것을 포함하고, 여기서 양은 작물 식물은 실질적으로 피해를 보지 않도록 하면서 잡초 또는 원치 않는 식생의 방제를 유도하기에 충분한 양이다.
글리포세이트 조성물은 글리포세이트 내성 작물 식물에 유의한 영향을 미치지 않으면서 목적하는 생물학적 결과, 예를 들어 잡초 성장의 억제를 제공하기에 충분한 적용 비율로 식물에 적용될 수 있다. 이들 적용 비율은 처리된 단위 면적당 글리포세이트의 양, 예를 들어 그램/헥타르 (g/ha)로 표현된다. "유의한 효과"를 이루는 것은 조성물을 조사하고 개발하고 시판하고 사용하는 사람의 표준 및 실무에 따라 상이하고, 조성물에 유의하게 효과적인 적용 비율의 선택은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
특정 예에서, 성장 감소 또는 치사율에 의해 측정되는 잡초 종의 85% 방제를 제공하기 위해 단위 면적당 적용되는 글리포세이트 조성물의 양은 적용 비율을 규정하기 위해 사용된다. 경작 영역에서 잡초를 방제하기 위해 충분한 많은 글리포세이트 제초제 적용 비율의 선택은 통상적인 농업 학자의 기술 범위 내에 있다. 당업자는 마찬가지로 개별적인 식물 상태, 기후 및 성장 조건을 인식할 것이고, 조성물 내의 특정 활성 성분들 및 이들의 중량비는 특정 용도에서 제초 유효성의 정도에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 수성 글리포세이트 조성물은 식물의 잎 조직에 수성 글리포세이트 조성물을 적용함으로써 1년생 및 다년생 초본 및 활엽 잡초 종을 포함하는 매우 다양한 원치 않는 식물을 사멸시키거나 그 성장을 억제하기 위해 식물의 잎 조직에 적용될 수 있다. 고려되는 제초제 조성물 (예를 들어, 입자상 고체 농축물, 액체 농축물, 즉시 사용가능한 (ready-to-use) 조성물, 및 탱크-믹스 (tank-mix) 조성물)에 존재하는 글리포세이트의 상대적인 양은 예를 들어, 방제할 잡초 종 및 적용 방법을 포함하는 많은 인자에 따라 상이할 수 있다. 그러나, 일반적으로 말하면, 글리포세이트의 농도, 및 임의로 계면활성제 및/또는 제초제 조성물에 사용되는 일부의 다른 아주반트 (adjuvant) 또는 첨가제 (본원의 다른 곳에 설명됨)는 경작 영역 내의 잡초를 방제하기 위해 충분하다.
제초제 분무 조성물은 조성물이 즉시 적용을 위해 제조된 것이거나, 또는 액체 글리포세이트 농축물의 추가의 희석 또는 입자상 고체 글리포세이트 농축물에 대한 물의 첨가에 의해 생성되는 것이든, 수용액 또는 수분산액으로서 적용될 수 있다. 그러나, 용어 "수성"은 본원에서 사용되는 바와 같이 존재하는 우세한 용매가 물이라면 일부의 소량의 비-수성 용매를 포함하는 조성물도 포함한다. 제초제 분무 조성물은 공중 적용 및 지상 적용 기술 (예를 들어, 그라운드 붐 (ground boom), 수동 분무기, 및 로프-위크 (rope-wick))을 비롯하여 당업자에게 공지된 임의의 적절한 방법을 통해 처리되는 식물의 잎에 적용될 수 있다.
일부 예에서, 액체 농축물 조성물은 리터당 적어도 약 50 그램, 적어도 약 75 그램, 또는 적어도 약 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 또는 700 그램 (산 당량 또는 a.e.) 또는 그 초과의 농도로 글리포세이트를 포함하도록 제제화된다. 글리포세이트 농도 범위는 예를 들어 리터당 약 50 내지 약 680 그램 (a.e.) (gpl), 약 100 내지 약 600 gpl, 약 250 내지 약 600 gpl, 및 약 360 내지 약 540 gpl일 수 있다.
글리포세이트 농축물의 총 중량을 기준으로 하여 중량 백분율로서 표현할 때, 액체 농축물은 예를 들어 적어도 약 10 wt.% 글리포세이트 (a.e.), 적어도 약 15 wt.%, 및 적어도 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 또는 68 wt.%, 또는 그 초과를 포함할 수 있다. 글리포세이트 농도 범위는 예를 들어 약 10 wt.% 내지 약 70 wt.% a.e., 약 20 wt.% 내지 약 68 wt.%, 또는 약 25 wt.% 내지 약 45 wt.%일 수 있다.
글리포세이트가 즉시 사용가능한 조성물로서 적용될 때, 글리포세이트 농도는 예를 들어 약 1 wt.% 내지 약 3 wt.% a.e., 및 약 1 wt.% 내지 약 2 wt.%일 수 있다.
분무 조성물은 예를 들어 에이커당 적어도 약 1 갤런 (3.78 리터)의 분무 조성물, 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 갤런 (75.7 리터), 또는 그 초과의 조성물의 적용을 위해 제제화될 수 있다. 분무 조성물의 분무 부피는 예를 들어 공중 적용을 위해 에이커당 약 1 갤런 (3.78 리터) 내지 약 100 갤런 (378.5 리터), 에이커당 약 2 갤런 (7.57 리터) 내지 약 40 갤런 (151.41 리터), 및 에이커당 약 2 갤런 (7.57 리터) 내지 약 5 갤런 (18.92 리터), 및 지상 적용을 위해 에이커당 약 5 갤런 (18.92 리터) 내지 약 20 갤런 (75.7 리터)일 수 있다.
일부 예에서, 글리포세이트가 염의 형태로 우세하게 존재하는 수성상, 및 비교적 수불용성인 제2 제초제 활성 성분을 임의로 함유하는 비-수성상을 갖는 액체 농축물 제제가 사용될 수 있다. 상기 제제는 예를 들어 에멀젼 (마크로에멀젼 (macroemulsion) 및 미세에멀젼, 유중수, 수중유 및 수중유중수 종류 포함), 현탁액, 및 서스포에멀젼 (suspoemulsion)을 포함할 수 있다. 비-수성상은 특정 예에서 미세캡슐화된 성분 (예를 들어, 미세캡슐화된 제초제)을 포함할 수 있다. 비-수성상을 갖는 제제에서, 전체로서 조성물 내의 글리포세이트 a.e.의 농도는 여전히 수성 농축물 제제에 대해 본원에서 언급된 특정 예시적인 범위 내에 해당할 수 있다.
임의의 제제에 따라 사용될 수 있는 글리포세이트의 적합한 염 형태는 예를 들어, 알칼리 금속염, 예를 들어 나트륨 및 칼륨 염, 암모늄 염, 이-암모늄 염, 예컨대 디메틸암모늄, 알킬아민 염, 예를 들어 디메틸아민 및 이소프로필아민 염, 알칸올아민 염, 예를 들어 에탄올아민 염, 알킬술포늄 염, 예를 들어 트리메틸술포늄 염, 술폭소늄 염, 및 이들의 혼합물 또는 조합을 포함한다. 글리포세이트의 시판 제제의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다: 글리포맥스(GLYPHOMAX)™, 글리포마즈(GLYPHOMAZ)™ XRT, 글리포맥스™ 플러스 (PLUS), 두랑고(DURANGO)™, 라운드업(ROUNDUP)™ 울트라 (ULTRA), 라운드업™ 울트라마크 (ULTRAMAK), 라운드업™ CT, 라운드업™ 엑스트라 (EXTRA), 라운드업™ 바이오액티브 (BIOACTIVE), 라운드업™ 바이오포스 (BIOFORCE), 로데오(RODEO)™, 폴라리스(POLARIS)™, 스파크(SPARK)™, 어코드(ACCORD)™ SP, 어코드™ XRT, 및 어코드™ 콘센트레이트 (CONCENTRATE) (이 모두는 글리포세이트를 그의 이소프로필암모늄 염 (IPA)으로서 함유함); 라운드업™ 드라이 (DRY) 및 라이벌(RIVAL)™ (글리포세이트를 그의 암모늄 염으로서 함유함); 라운드업™ 지오포스 (GEOFORCE), 나트륨 글리포세이트 제제; 터치다운(TOUCHDOWN)™, 글리포세이트 트리메시움 염 제제, 터치다운™ IQ, 글리포세이트 이암모늄 염 제제, 터치다운™ 토탈 (TOTAL) IQ, 칼륨 글리포세이트 제제, 및 라운드업™ 웨더맥스 (WEATHERMAX), 칼륨 글리포세이트 제제. 글리포세이트 제제는 완화제, 계면활성제, 및/또는 아주반트를 포함할 수 있다.
원하는 경우에, 사용자는 적용을 위해 제제를 제조할 때 하나 이상의 아주반트를 글리포세이트 조성물 및 희석용 물과 혼합할 수 있다. 상기 아주반트는 제초 효능을 보다 향상시킬 목적으로 추가의 계면활성제 및/또는 무기염 (예를 들어, 황산암모늄)을 포함할 수 있다.
원하는 경우에, 사용자는 또한 식물을 추가로 보호하고/하거나 보다 많은 제초제에 대한 교차 저항성을 추가하기 위해 글리포세이트 제제에 적절한 완화제를 사용할 수 있다. 완화제는 잡초 방제 효능을 손상시키지 않으면서 생리학적 또는 분자 메카니즘에 의해 작물 식물에 대한 제초제의 식물독성을 감소시키는 화학적 작용제이다. 완화제는 대개 cP450을 활성화/발현함으로써 식물의 면역 시스템을 증가시키는 작용을 한다. 예시적인 완화제는 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 베녹사코르, 클로퀸토세트, 시오메트리닐, 디클로르미드, 디시클로논, 디에톨레이트, 펜클로라졸, 펜클로림, 플루라졸, 플룩소페님, 푸릴라졸, 이속사디펜, 메펜피르, 메페네이트, 나프탈산 무수물, 및 옥사베트리닐.
완화제는 티오카르바메이트 및 클로로아세트아닐리드 패밀리의 심기 전에 또는 발아 전에 적용되는 제초제에 대해 큰 종자의 초본 작물, 예를 들어 비제한적으로, 옥수수, 알곡용 수수, 및 습식 파종 (wet-sown) 벼를 보호하기 위해 사용될 수 있다. 완화제는 또한 아릴옥시페녹시프로피오네이트 및 술포닐우레아 제초제의 발아후 적용에 대해 겨울 곡물 작물, 예컨대 밀을 보호하기 위해 개발되었다. 술포닐우레아, 이미다졸리논, 시클로헥산디온, 이속사졸, 및 트리케톤 제초제에 대한 옥수수 및 벼의 보호를 위한 완화제의 사용도 잘 확립되어 있다.
식물 활성화제 (그의 방어 메카니즘을 활성화함으로써 식물을 보호하는 새로운 클래스의 화합물)가 또한 본원의 실시양태에서 사용될 수 있다. 예시적인 식물 활성화제는 아시벤졸라 및 프로브나졸을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 다음의 실시예에서 추가로 규정된다. 이들 실시예는 단지 예시로서 제공됨을 이해해야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 확인할 수 있고, 그의 취지와 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 용법 및 조건에 적합하도록 본 발명의 실시양태를 다양하게 변화 및 변형할 수 있다. 따라서, 본원에 제시되고 설명된 것에 추가로 본 발명의 실시양태의 다양한 변형이 상기 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 상기 변형은 또한 첨부된 청구항의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 다음은 예시로서 제공되고, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
본원의 실시양태들은 다음의 실시예에서 추가로 설명되고, 이들 실시예는 예시로서 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하려는 의도는 없다.
에셔리키아 콜라이 5-에놀피루빌쉬키메이트 3-포스페이트 신타제 효소 (EPSP 신타제)에서 단일 아미노산 돌연변이 (G96A)는 글리포세이트 불감수성을 일으킬 수 있다 ([Padgette et al., (1991)]; [Eschenburg et al., (2002)]; [Priestman et al., (2005)]; [Haghani et al., (2008)]). 상기 돌연변이는 글리포세이트에 대한 내성을 부여하지만, EPSP 신타제와 그의 천연 기질, 포스포에놀피루베이트 (PEP)와의 결합에 불리한 영향을 미치는 것으로 또한 알려져 있다. 기질 결합 효율에서 생성되는 변화로 인해 돌연변이된 효소는 글리포세이트에 대한 식물내 (in planta) 내성을 제공하기 위해 적합하지 않게 될 수 있다.
NCBI Genbank 데이타베이스를 EPSP 신타제 효소 내에서, 이. 콜라이 버전의 효소 내로 도입된 G96A 돌연변이와 유사한 위치에서 천연적으로 알라닌을 함유하는 EPSP 신타제 단백질 및 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 컴퓨터내 스크리닝하였다 ([Padgette et al. (1991)]; [Eschenburg et al. (2002)]; [Priestman et al. (2005)]; [Haghani et al. (2008)]).
상기 위치에서 천연 알라닌을 함유하는 것으로 확인된 하나의 효소는 스트렙토마이세스 스비세우스 (Streptomyces sviceus) ATCC29083으로부터의 DGT-28 (GENBANK ACC NO: ZP_06917240.1)이었다. 추가의 컴퓨터내 데이타 마이닝 (mining)으로 DGT-28에 대해 보다 큰 상동성을 갖는 3개의 다른 독특한 스트렙토마이세스 효소를 밝혀냈다; DGT-31 (GENBANK ACC NO: YP_004922608.1); DGT-32 (GENBANK ACC NO: ZP_04696613); 및 DGT-33 (GENBANK ACC NO: NC_010572). 이들 효소는 각각 EPSP 신타제 효소 내에서, 이. 콜라이 버전의 효소 내로 도입된 G96A 돌연변이와 유사한 위치에서 천연 알라닌을 함유한다 (도 1).
상이한 유기체로부터의 EPSP 신타제 단백질은 상이한 길이를 가지므로, 이. 콜라이 버전의 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 번호붙이기는 다른 유기체로부터 EPSP 신타제 효소에 대한 돌연변이의 번호붙이기와 반드시 상응하지는 않는다. 이들 확인된 EPSP 신타제 효소는 글리포세이트 내성 또는 PEP 기질 친화도에 관하여 이전에 특성화되지 않았다. 추가로, 이들 EPSP 신타제 효소는 새로운 클래스의 EPSP 신타제 효소를 나타내고, 이전에 설명된 클래스 I (미국 특허 RE39247에 추가로 설명된 식물 유래 서열), II (미국 특허 RE39247에 추가로 설명된 박테리아 유래 서열), 및 III (국제 특허 출원 WO 2006/110586에 추가로 설명된 박테리아 유래 서열) EPSP 신타제 효소를 특성화하기 위해 사용된 임의의 서열 모티프를 함유하지 않는다.
신규한 DGT-28, DGT-31, DGT-32, 및 DGT-33 효소는 클래스 I EPSP 신타제 효소에 비교한 글리포세이트 내성 및 PEP 기질 친화도를 특징으로 한다. 다음 클래스 I 효소; 글라이신 맥스로부터의 DGT-1, 브라시카 나푸스로부터의 DGT-3 (GENBANK ACC NO: P17688), 및 트리티쿰 애스티붐으로부터 DGT-7 (GENBANK ACC NO: EU977181)이 비교를 위한 것이었다. 클래스 I EPSP 신타제 효소 및 그의 돌연변이 변이체를 합성하고 평가하였다. 식물 EPSP 신타제 효소 내로 도입된 돌연변이는 이. 콜라이 버전의 효소로부터 G96A 돌연변이와 유사한 위치에서 EPSP 신타제 효소 내에 만들어진 글라이신 대 알라닌 돌연변이로 이루어졌다. 추가로, 트레오닌 대 이소류신 및 프롤린 대 세린 돌연변이는 문헌 [Funke et al. (2009)]에 설명된 바와 같이 이. 콜라이의 EPSP 신타제 내의 아미노산 97 (T 대 I) 및 아미노산 101 (P 대 S)과 유사한 위치에서 이들 클래스 I EPSP 신타제 효소 내에 도입되었다.
도 1은 다른 EPSP 신타제 효소에 대한 DGT-28, DGT-31, DGT-32, 및 DGT-33의 부분 서열 정렬을 도시한다. 4개의 모든 DGT 효소는 aroA EPSP 신타제 효소 아미노산 위치 96에서 보존된 알라닌을 공유한다. 상기 아미노산의 위치를 별표로 표시하고, 아미노산 잔기를 밑줄친다.
도 2는 DGT-1, DGT-3, 및 DGT-7 효소의 정렬을 보여준다. 글라이신에서 알라닌으로 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치를 제1 별표로 표시한다. 트레오닌에서 이소류신으로 돌연변이된 아미노산 잔기의 위치를 제2 별표로 표시한다. 프롤린에서 세린으로 돌연변이된 제3 아미노산 잔기의 위치를 제3 별표로 표시한다. 이들 돌연변이를 상이한 버전의 DGT-1, DGT-3, 및 DGT-7에 도입시켰다. 돌연변이를 함유하는 상이한 버전 (v1, v2, v3... vN)의 유전자를 아래에 보다 상세히 설명한다.
실시예 2: 식물 및 박테리아 내에서 발현을 위한 서열의 최적화
식물 최적화. 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물 (옥수수)에 대한 코돈 편향은 단일 코돈이 모든 아미노산에 대한 코돈에 비해 사용되는 빈도로서 계산하였다 (표 1). 별법으로, 코돈 편향은 특정 아미노산의 모든 다른 코돈 (동의 코돈)에 비해 단일 코돈이 해당 아미노산을 코딩하기 위해 사용되는 빈도로서 계산할 수 있다. 식물 발현을 위한 코딩 영역을 설계하는데 있어서, 식물이 선호하는 1차 ("제1 선택") 코돈을 결정하고, 또한 다수 선택이 존재할 때 제2, 제3, 제4 등의 선택의 바람직한 코돈을 결정하였다.
에스. 스비세우스로부터의 DGT-28 코딩 서열의 분석에 의해 최적 식물 발현에 유해한 것으로 생각된 몇몇 서열 모티프, 및 쌍떡잎 및 외떡잎 식물 내에서 발현을 위한 비-최적 코돈 조성의 존재가 밝혀졌다.
Figure pct00001
DGT-28 단백질을 코딩하는 식물-최적화된 유전자를 조작하기 위해, 특정 숙주 식물에 대한 단백질 코딩 서열로부터 편집한 코돈 편향 표로부터 확립된 과잉 유전자 코드를 활용하여, 아미노산 서열을 코딩하도록 DNA 서열을 설계하였다. 표 1에서, 컬럼 D 및 I는 외떡잎 (옥수수) 식물의 코딩 영역에서 발견된 바와 같은, 각각의 아미노산에 대한 동의 코돈의 분포 (해당 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 사용 빈도의 %로)를 제공한다. 컬럼 E 및 J는 쌍떡잎 식물의 코딩 영역에서 발견된 바와 같은, 각각의 아미노산에 대한 동의 코돈의 분포 (해당 아미노산에 대한 모든 코돈에 대한 사용 빈도의 %로)를 제공한다. 일부 아미노산에 대한 일부 동의 코돈은 식물 유전자에서 단지 드물게 발견된다 (예를 들어, CGG). 대체로, 코돈은 약 10% 이하의 횟수로 두 식물 종류의 유전자 내에서 관련 아미노산을 코딩하는 것으로 나타나면 드물게 사용되는 것으로 간주된다 (표 1의 컬럼 C 및 H에서 DNU에 의해 지시됨). 아미노산에 대해 남아있는 코돈 선택의 분포를 균형잡기 위해, 각각의 코돈에 대한 가중 평균 표현을 다음 식을 이용하여 계산하였다:
C1의 가중 평균 % = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + 등) x %C1 x 100 (1)
여기서, C1은 해당 코돈이고, %C2, %C3 등은 표 1의 (관련 코돈에 대한 평균 % 값은 컬럼 C 및 H로부터 취한다) 나머지 동의 코돈의 쌍떡잎식물에 대한 % 값의 평균을 나타낸다.
각각의 코돈에 대한 가중 평균 % 값을 표 1의 컬럼 C 및 H에 제공한다.
상기한 절차를 이용하여, 본질적으로 DGT-28 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 쌍떡잎 식물 유전자에서 발견된 빈번하게 사용된 코돈의 균형잡힌 코돈 분포를 이용하여, 쌍떡잎 식물 내에서 최적의 발현을 위해 설계하였다. 본질적으로 DGT-28 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 제2 DNA 서열을 외떡잎 식물 유전자에서 발견된 빈번하게 사용된 코돈의 균형잡힌 코돈 분포를 이용하여, 외떡잎 식물 내에서 최적의 발현을 위해 설계하였다. 2가지 새로운 DNA 서열은 단백질 아미노산 서열 내에서 각각의 위치에서적절한 아미노산을 명시하기 위해 식물 (제1 바람직한, 제2 바람직한, 제3 바람직한, 또는 제4 바람직한) 코돈의 치환에 의해 dgt-28을 코딩하는 원래의 DNA 서열과 상이하였다.
식물-최적화된 DNA 서열의 설계는 DGT-28 단백질 서열 (Genbank 기탁 No: ZP_06917240.1)의 단백질 서열의 역번역에 의해 개시하였다. 서열 1은 표 1; 컬럼 E 및 J로부터 작성한 쌍떡잎식물 코돈 편향 표를 사용하여 역번역하였다. 서열 1의 제2 역번역은 표 1; 컬럼 D 및 I로부터 작성한 외떡잎식물 코돈 편향 표를 사용하여 완료하였다.
이어서, 제한 효소 인식 부위를 제거하거나 첨가하고, 고도로 안정한 가닥내 2차 구조를 제거하고, 식물 내에서 조작된 유전자의 클로닝 조작 또는 발현에 유해할 수도 있는 다른 서열을 제거하도록 코돈 변화를 보상함으로써 (전체 가중 평균 코돈 표현을 보유하면서) 초기 역번역 서열을 변형시켰다. 이어서, DNA 서열을 변형에 의해 생성될 수도 있는 제한 효소 인식 부위에 대해 재-분석하였다. 확인된 부위를 관련 코돈을 제1, 제2, 제3, 또는 제4 선택의 바람직한 코돈으로 교체함으로써 추가로 변형시켰다. 관심있는 유전자의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 서열 내의 다른 부위는 엑손:인트론 연결부 (5' 또는 3'), 폴리 A 부가 신호, 및 RNA 중합효소 종료 신호를 포함한다. 변형된 서열을 추가로 분석하고, TA 또는 CG 이중자의 빈도를 감소시키기 위해 및 TG 또는 CT 이중자의 빈도를 증가시키기 위해 추가로 변형하였다. 이들 이중자에 추가로, [G+C] 또는 [A+T]의 약 6개 초과의 연속적인 잔기를 갖는 서열 블록이 서열의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 제1 또는 제2 선택 등의 코돈을 다른 바람직한 선택의 코돈으로 교체함으로써 이들 서열 블록을 또한 변형시켰다. 드물게 사용된 코돈은 유전자 설계 내에 실질적인 정도로 포함되지 않았고, 단지 그 자체가 코돈 조성과 상이한 설계 기준을 수용하기 위해 필요할 때에만 사용된다 (예를 들어, 제한 효소 인식 부위의 부가 또는 결실).
새로 설계된 쌍떡잎 식물 최적화된 dgt-28 v5 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 2에 나열한다. 새로 설계된 외떡잎 식물 최적화된 dgt-28 v6 폴리뉴클레오티드 서열을 서열 3에 나열하고; 상기 서열은 제한 효소 부위를 도입하기 위해 제2 아미노산 위치에서 알라닌을 포함함으로써 약간 변형되었다. 생성되는 DNA 서열은 보다 높은 정도의 코돈 다양성, 바람직한 염기 조성을 갖고, 전략적으로 배치된 제한 효소 인식 부위를 함유하고, 유전자의 전사 또는 생성물 mRNA의 번역을 저해할 수도 있는 서열이 결여된다.
추가의 서열, 예컨대 6-프레임 중지 (코딩 서열의 3' 단부에 첨가된 6개의 모든 판독 프레임 내에 위치하는 중지 코돈), 및 클로닝을 위한 5' 제한 부위를 함유하는 서열 2 및 서열 3을 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업 공급자 (DNA2.0, 미국 캘리포니아주 멘로 파크))에 의해 수행되었다. 이어서, 아래 실시예에 설명된 바와 같이 합성 핵산 분자를 발현 벡터 내로 클로닝하고, 식물 또는 박테리아 내로 형질전환시켰다.
dgt-1, dgt-3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I; P178S), dgt-7 v4 (T168I; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3, 및 dgt-33 v3을 설계하기 위해 유사한 코돈 최적화 전략을 사용하였다. 코돈 최적화된 버전의 이들 유전자를 각각 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 및 서열 144로서 나열한다.
박테리아 최적화. 에셔리키아 콜라이 세포 내에서 발현을 위해 최적화된 서열 1의 DGT-28 단백질을 코딩하는 새로운 DNA 서열을 설계하였다. 이. 콜라이-최적화된 DNA 서열의 설계는 진아트 (GeneArt, 독일 레겐스부르크)로부터의 독점 코돈 최적화 프로토콜을 이용하여, 서열 1의 단백질 서열의 역 번역에 의해 개시하였다. 이어서, 제한 효소 인식 부위를 제거하거나 첨가하고, 고도로 안정한 가닥내 2차 구조, 및 조작된 유전자의 클로닝 조작 또는 발현에 유해할 수도 있는 다른 서열을 제거하도록 코돈 변화를 보상함으로써 (전체 가중 평균 코돈 표현을 보유하면서) 초기 서열을 변형시켰다. 코딩 영역 내에서 피하기 위한 상기 유해한 서열의 예는 16S 리보솜 RNA 결합 서열 ("샤인-달가노 서열"), 예컨대 AGGAGG이고, 이것은 예를 들어, 2개의 연속적인 아르기닌 아미노산을 코딩할 수 있지만 유전자내 (및 따라서 바람직하지 않은) 번역 개시 신호로서 작용할 수도 있다. 서열 1의 단백질을 코딩하는 이. 콜라이-편향된 dgt-28 DNA 서열 (dgt-28 v1)을 서열 4로서 제공한다.
클로닝을 용이하게 하고 효율적인 번역 개시를 보장하기 위해, 5' 말단 NdeI 제한 효소 인식 서열을 ATG 번역 출발 코돈의 상류에 배치하였다. 또한 클로닝을 용이하게 하고 적합한 번역 종료를 보장하기 위해, 2개의 TAA 번역 중지 코돈 및 XhoI 제한 효소 인식 부위를 코딩하는 염기를 코딩 영역의 3' 단부에 포함시켰다. 서열 4를 포함하는 DNA 단편의 합성은 상업 공급자, 진아트™에 의해 수행되었다.
dgt-1 v5, dgt-1 v6 (G112A), dgt-1 v7 (G112A; P117S), dgt-1 v8 (T113I; P117S), dgt-3 v6 (G105A), dgt-3 v7 (G105A; P112S), dgt-3 v8 (T106I; P112S), dgt-7 v5, dgt-7 v6 (G113A), dgt-7 v7 (G113A; P117S), dgt-7 v8 (T114I; P117S), dgt-32 v5, 및 dgt-33 v5를 설계하기 위해 유사한 이. 콜라이 코돈 최적화 전략을 사용하였다. dgt-1, dgt-3, 및 dgt-7 서열 버전은 엽록체 표적화 서열의 제거에 의해 변형시켰다. 이들 유전자의 이. 콜라이-코돈 최적화된 버전을 각각 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 19, 서열 20, 서열 21, 서열 22, 서열 23, 및 서열 24로서 나열한다.
실시예 3: 글리포세이트 내성 유전자의 박테리아 발현을 위한 벡터.
이. 콜라이 발현을 위한 pET 발현 벡터, dgt-28의 제작. 시험관내 시험을 위해, dgt-28 v1 이. 콜라이 최적화된 유전자 서열 (서열 4)를 합성 및 클로닝을 위해 진아트™에 의해 합성하고 클로닝하였다. 합성된 dgt-28 v1 유전자 서열을 첨가된 Nde I 및 Xho I 제한 부위를 통해 pET28 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 생성되는 구축물은 N-말단 6X His 태그를 도입하였고, pDAB100445로서 표지하였다 (도 14).
dgt-28 v1의 부위 지정 돌연변이유발. 글리포세이트에 대한 내성을 제공하는데 있어서 위치 84에서 알라닌의 역할을 평가하기 위해 dgt-28 v1에 대해 부위 지정 돌연변이 유발을 수행하였다. 변화가 글리포세이트에 대한 효소의 내성 또는 PEP에 대한 친화도를 저하시킬 것인지 결정하기 위해 상기 천연 알라닌을 글라이신으로 돌연변이시켰다. 상기 아미노산 잔기는 앞서 설명된 바와 같이 이. 콜라이 EPSP 신타제 내로 도입된 G96A 돌연변이와 상응하므로 선택되었다.
퀵 체인지 (Quick Change) II™ 키트 (스트라타젠 (Stratagene)™, 미국 캘리포니아주 산타클라라))를 사용하여 돌연변이 유발을 수행하였다. PCR 반응은 주형 DNA로서 pDAB100445 (dgt-28 v1)을 사용하여 퀵체인지™ 프로토콜에 따라 설정하였다. 돌연변이된 dgt-28 v2 유전자 서열을 함유하는 구축물을 pDAB102946 (도 15)으로 지정하고, DNA 서열결정을 통해 확인하였다. 아미노산 스위치 (switch)를 만들기 위해 다음 프라이머를 설계하였다:
DGT28 MutF (서열 25; 5' gATgTTTATTgCCgTgATggTggAACCACCgCACgTTTTC).
DGT28 MutR (서열 26; 5' gAAAACgTgCggTggTTCCACCATCACggCAATAAACATC).
글리포세이트에 대한 그의 내성을 추가로 저하시키기 위한 시도에서 dgt-28 v2에 대해 제2 라운드의 돌연변이 유발을 수행하였다. 제2 돌연변이, T172A를 이미 돌연변이된 dgt-28 v2에 도입하였다. 상기 위치에서 EPSP 신타제의 상호간 알라닌 대 트레오닌 돌연변이는 문헌 [Haghani et al., (2008)]에서 이전에 설명되었고, 여기서 이것은 글리포세이트에 대한 불감수성을 일으켰다. 최종 결과는 dgt-28 v3으로 지정된 이중 A84G, T172A 돌연변이체의 생산이었다. PCR 반응은 주형 DNA로서 pDAB102946 (dgt-28 v2)을 사용하여 퀵체인지™ 프로토콜에 따라 설정하였다. 돌연변이된 dgt-28 v3 유전자 서열을 함유하는 구축물을 pDAB100469 (도 16)로 지정하였다. 다음 프라이머를 사용하여 T172A 돌연변이를 생산하였다:
DGT28 Mut2F (서열 27; 5' gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg).
DGT28 Mut2R (서열 28; 5' CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAgCAgC).
추가의 구축, 이. 콜라이 발현을 위한 pET 발현 벡터. 시험관내 시험을 위해, dgt-1 v5, dgt-1 v6, dgt-1 v7, dgt-1 v8, dgt-3 v6, dgt-3 v7, dgt-3 v8, dgt-7 v5, dgt-7 v6, dgt-7 v7, dgt-7 v8, dgt-32 v5, 및 dgt-33 v5 유전자 서열을 합성하고 클로닝하였다 (진아트™). 합성된 유전자를 pET28 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 생성되는 구축물을 dgt-1 v5를 함유하는 pDAB102028 (도 17), dgt-1 v6을 함유하는 pDAB102029 (도 18), dgt-1 v7을 함유하는 pDAB102032 (도 19), dgt-1 v8을 함유하는 pDAB102034 (도 20), dgt-3 v6을 함유하는 pDAB100429 (도 21), dgt-3 v7을 함유하는 pDAB100442 (도 22), dgt-3 v8을 함유하는 pDAB100430 (도 23), dgt-7 v5를 함유하는 pDAB102036 (도 24), dgt-7 v6을 함유하는 pDAB102038 (도 25), dgt-7 v7을 함유하는 pDAB102040 (도 26), 및 dgt-7 v8을 함유하는 pDAB102042 (도 27)로 표지하였다.
DGT-32, 및 DGT-33의 클로닝. 시험관내 시험을 위해, 다음 식물 최적화된 유전자; dgt-32 v3, 및 dgt-33 v3을 각각 2원 벡터 pDAB107532 (도 11) 및 pDAB107534 (도 12)로부터 증폭시켰다. 다음 프라이머 세트를 사용하였다:
dgt-32에 대해
pMALDGT32F (서열 29; CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG), 및
pMALDGT32R (서열 30; GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG),
dgt-33에 대해
pMALDGT33F (서열 31; CATATGGGTGCAGTTACCGTTATTGA), 및
pMALDGT33R (서열 32; GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC).
이어서, 증폭된 서열을 pMAL-c5X 내로 서브클로닝하여, 각각의 유전자를 malE 코딩 서열과 인프레임 (in-frame)으로 융합시켰다. 최종 발현 구축물은 dgt-32 v3을 함유하는 pDAB107713 (도 29), 및 dgt-33 v3을 함유하는 pDAB107714 (도 30)이었다.
실시예 4: 시험관내 생화학적 효소적 운동학 검정
재조합 DGT 효소의 과발현 및 정제. 재조합 DGT 단백질을 상기 설명된 구축물로부터 Rosetta2™ (DE3) 세포 (노바겐 (Novagen)™, 미국 위스콘신주 매디슨) 내에서 과발현시켰다. 단일 콜로니를 사용하여, 클로람페니콜 (25 ㎍/mL) 및 카나마이신 (50 ㎍/mL)을 함유하는 LB의 50 mL 스타터 (starter) 배양액을 접종하고, 이를 37℃에서 밤새 배양하였다. 철야 배양액을 사용하여, 클로람페니콜 (25 ㎍/mL) 및 카나마이신 (50 ㎍/mL)을 함유하는 1 L의 LB를 접종하였다. 배양액을 37℃에서 O.D.600 = 0.6로 성장시킨 후, 10분 동안 빙수조 내에 넣었다. 표적 단백질의 발현은 500 μM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하여 달성하였다.
유도를 20℃에서 밤새 진행시킨 후, 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 통해 수거하였다. 세포 펠렛을 정제가 요구될 때까지 -80℃에서 저장하였다. 모든 정제 단계는 4℃에서 수행하였다. 1 L 배양액으로부터 세포 펠렛을 20-30 mL 완충제 A (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 mM 이미다졸, 및 5% 글리세롤) 내에 재현탁하였다. 이어서, 컴플리트(COMPLETE)™ 프로테아제 억제제 칵테일 (1개의 정제/50 mL, 로슈 (Roche, 미국 인디애나주 인디애나폴리스) 및 리소자임 (1 mg/mL, 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스))를 첨가하고, 현탁액을 20분 동안 교반하였다. 세포 용해를 Branson™ Sonifier™ 250 (3 x 60초 버스트 (burst))를 사용하여 수행한 후, 16,000 rpm에서 45분 동안 원심분리에 의해 세포 파편을 제거하였다.
DGT 효소를 5 mL HisTrap FF 조질 컬럼을 사용하여 고정된 금속 친화도 크로마토그래피 (IMAC)를 통해 하나의 단계로 균질성으로 정제하였다. 컬럼을 완충제 A 내에 평형화시키고, 샘플을 동일한 완충제 내에 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 10 컬럼 부피의 완충제 A로 세척한 후, 0-100% 완충제 B (50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM KCl, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 500 mM 이미다졸, 및 5% 글리세롤) 선형 구배 내에서 25 컬럼 부피에 걸쳐 용리시켰다. SDS-PAGE에 의해 판단할 때 표적 단백질을 함유하는 분획을 10 kDa 분자량 컷오프 (cut-off; MWCO)가 장치된 밀리포어 (Millipore) 초원심분리 장치를 이용하여 2.5 mL로 농축하였다. 정제된 DGT 효소를 PD-10 컬럼 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))을 사용하여 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 및 5% 글리세롤 내로 완충제 교환하고, 후속적으로 ~1 mL로 농축하였다. 샘플은 일반적으로 1:50 희석하고, Cary50™ Bio UV-가시광 분광광도계 상에서 240 - 700 nm에서 UV-가시광 스펙트럼을 기록하였다. 이어서, 이론적인 소광 계수를 사용하여, 280 nm에서 흡광도에 기반하여 단백질 농도를 계산하였다 (엑스파시 (ExPASy, 스위스 제네바)).
재조합 DGT-32 및 DGT-33 융합체의 발현 및 정제. DGT-32 및 DGT-33 효소를 효소의 아미노 말단에 위치하는 말토스 융합 태그를 함유하도록 제작하였다. pDAB107712 (도 28), pDAB107713, 및 pDAB107714로 형질전환된 에셔리키아 콜라이 세포를 단리하고, 확인하였다. 각각의 박테리아 균주의 단일 콜로니를 사용하여, 100 ㎍/㎕ 카르베니실린 및 25 ㎍/㎕ 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 50 mL를 접종하였다. 스타터 배양액을 37℃에서 밤새 성장시키고, 후속적으로 이를 사용하여, 0.2% 글루코스, 100 ㎍/㎕ 카르베니실린, 및 25 ㎍/㎕ 클로람페니콜을 보충한 LB 배지 600 mL를 접종하였다. 배양액을 37℃에서 OD600 = 0.4로 성장시켰고, 이 때 IPTG를 50 μM IPTG의 최종 농도로 첨가하였다. 배양액을 15시간 동안 18℃에서 유도하였다. 다음날, 세포를 펠렛화하기 위해 배양액을 8,000 rpm에서 20분 동안 원심분리함으로써 수거하였다. 세포 페이스트를 정제가 요구될 때까지 -80℃에서 저장하였다.
동결된 펠렛을 20-30 mL 완충제 A (50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 및 1 mM DTT) 및 1개의 정제의 프로테아제 억제제 (로슈 컴플리트) 내에 재현탁하였다. 일단 펠렛이 완전히 재가용화되면, 1 mg/mL의 리소자임을 첨가하고, 샘플을 4℃에서 15-20분 동안 혼합하였다. 리소자임과 함께 인큐베이팅한 후, 샘플을 50 mL 원심분리관으로 옮기고 얼음 상에 놓았다. 이어서, 샘플을 1분 간격 동안 초음파분해한 후, 4분 냉각시켰다. 상기 단계를 총 3회의 초음파분해 사이클을 위해 2회 더 반복하였다. 세포 파편을 16,500 rpm에서 45분 동안 원심분리하여 제거하고, 상청액을 50 mL 주입 루프 내로 로딩하였다. 조질 용해물을 아킬로스 컬럼에 적용하고, 완충제 A로 7 컬럼 부피로 세척하고, 100% 완충제 B (완충제 A 및 10 mM 말토스) 내에서 용리시켰다. 표적 단백질을 모으고, 30 kDa MWCO 센트리콘 (centricon)을 이용하여 2.5 mL로 농축하였다. 정제된 단백질을 PD-10 겔 여과 컬럼을 이용하여 50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCl, 및 5% 글리세롤 내로 완충제 교환하였다. 표준물로서 BSA를 사용하는 브래드포드 (Bradford) 검정을 통해 단백질 농도를 결정하였다. 순수한 단백질을 액체 질소 내에 동결시키고, -80℃에서 저장하였다.
식물 및 박테리아 DGT 효소의 시험관내 운동학 특성화. 야생형 (WT) 및 돌연변이체 DGT의 효소 활성은 문헌 [Lanzetta et al. (1979) Anal. Bioch. 100:95-7]에 설명된 변형된 절차로 무기 포스페이트 (Pi) 생산에 의해 측정하였다. 검정은 Spectra-Max 190 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices, 미국 캘리포니아주 서니베일)) 상에서 총 50 ㎕의 96-웰 플레이트 포맷으로 수행하였다. 전형적인 검정은 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 2 mM DTT, 및 1 mM S3P을 함유하였다. PEP 및 글리포세이트 농도는 지시된 대로 다양하였다. 글리포세이트는 시그마로부터 유리산으로서 입수하고, ddH2O 내에 재현탁하였다. 글리포세이트는 혼합물이 중성 pH일 때까지 KOH를 첨가함으로써 가용화시켰다. 검정은 0.01-1 μM 사이의 농도로 DGT 효소의 첨가에 의해 개시하였다. 반응은 말라카이트 그린:몰리브덴산암모늄 용액의 3:1 혼합물 235 ㎕의 첨가에 의해 종료시켰다. 완전한 발색 (~1분) 후에, 660 nm에서 흡광도 변화를 기록하고, Pi의 양을 표준 곡선으로부터 계산하였다. 배경 흡광도에 대해 교정하기 위해 효소가 결여된 대조군 반응을 사용하였다. 고농도의 PEP (> 2 mM) 및 글리포세이트 (> 30 mM)는 상기 검출 방법을 이용할 때 유의한 양의 배경 흡광도에 기여한다. 데이타를 Km 및 Vmax의 결정을 허용하는 미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten) 식에 피팅한 (방정식 3) 반면, IC50은 방정식 4로부터 결정하였고, 여기서 y는 상대 활성이고, s는 힐 (Hill) 계수이다. 데이타를 GraFit™ 버전 5 소프트웨어 (에리카쿠스 소프트웨어 리미티드 (Erithacus Software Limited, 영국 홀리))를 이용하여 분석하였다.
Figure pct00002
Figure pct00003
경쟁적 억제제에 대한 IC50 값은 기질의 농도에 따라서 변화할 것이고, 따라서 표 2의 IC50 값은 1 mM PEP 및 60 μM PEP (식물 내의 세포내 PEP 농도의 추정치)에서 얻었다. 동일한 농도의 PEP에서 측정된 IC50 값이 비교되어야 한다 (DGT-32 및 DGT-33에 대한 Km 결정은 100 μM PEP에서 결정하였다). 추가로, 고도의 내성 효소의 IC50 값은 문헌 [Lanzetta]의 방법에 의해 정확하게 결정될 수 없고, 따라서 상대 활성에 기초하여 추정하였다.
식물 DGT의 운동학. 글리포세이트 감수성에 대한 기준선 파라미터를 확립하기 위해 돌연변이되지 않은 천연 서열을 갖는 2가지 효소, DGT-1 v5 및 DGT-7 v5를 먼저 시험하였다. 두 단백질은 모두 PEP에 대해 낮은 Km 값 (~70 μM)을 나타냈고, 1 mM PEP에서 ~20 μM의 IC50 값으로, 글리포세이트에 대해 감수성이었다 (표 2). DGT-1 v6, DGT-3 v6, 및 DGT-7 v6에 대해 관찰된 바와 같이, G에서 A로의 단일 점 돌연변이는 글리포세이트에 대한 내성을 유의하게 개선하였지만 (8-21 mM의 IC50 값), 또한 PEP에 대한 Km 값을 ~8배 증가시켰다. 모든 식물 유래 DGT (DGT-1 v7, DGT-3 v7, 및 DGT-7 v7)에 대한 이중 돌연변이 (GAPS)는 또한 글리포세이트 내성을 향상시켰지만, 다시 한번 PEP Km의 상당한 상승을 일으켰다 (표 2). TIPS 돌연변이체 (DGT-1 v8, DGT-3 v8, 및 DGT-7 v8)는 보통 농도의 글리포세이트 (3-6 mM)에 대해 내성이었지만, GA 및 GAPS 돌연변이체와는 대조적으로, Km 수준은 60-200 μM으로 야생형 단백질에 가깝게 남았다. 도 31은 명시된 돌연변이의 도입 시에 DGT-1 (A) 및 DGT-7 (B)에 대한 글리포세이트 내성의 이동을 입증한다. PEP 농도는 실험에 대해 1 mM로 유지하였고, 이는 도 31에 제시된 데이타를 생성시켰고, 이것은 아마도 DGT-7 v8에 대한 상승된 IC50 (>80 mM)을 일으켰다. PEP의 수준을 저하시키면 글리포세이트에 대한 상대적인 내성을 변경시키는지 결정하기 위해 추가의 절차를 수행하였다. PEP의 생리학적 관련 수준은 5 - 60 μM 범위이다. 60 μM PEP에서, IC50 값은 유의하게 감소하였고 (3.6 mM), 이것은 미카엘리스-멘텐 운동학으로부터 예상되고 표 2에 나타낸 바와 같이 초기의 결정이 과잉의 PEP에 의해 영향을 받았음을 제안한다.
도 31은 1 mM PEP를 사용하여 DGT-1 (A) 및 DGT-7 (B) 내에 다양한 돌연변이를 도입한 후에 얻어진 IC50 값을 보여준다. A 및 B IC50 곡선 모두에 대해, 닫힌 삼각형은 야생형을 나타내고, 닫힌 원은 GA 돌연변이체를 나타내고, 열린 정사각형은 GAPS 돌연변이체를 나타내고, 닫힌 정사각형은 TIPS 돌연변이체를 나타낸다.
Figure pct00004
박테리아 DGT 의 운동학. 박테리아 효소 중에서, DGT-28 v1은 가장 양호한 전체 운동학 파라미터 (상승된 IC50 및 kcat/Km 값)를 갖는다. 효소는 농도 >80 mM에서 글리포세이트에 내성이었고, 1.32 x 105 M-1s-1의 촉매 효율을 나타냈다. DGT-28 v2에서 A->G 돌연변이는 IC50을 2.17 mM (60 μM PEP에서)로 저하시켰고, PEP에 대한 Km을 약간 상승시켰다 (161 μM). 상기 돌연변이체 효소는 DGT-28 v1에서 보이는 높은 촉매 효율을 보유한다. 심지어 저하된 IC50에서도, 상기 돌연변이된 효소는 식물내 특정 용도에서 글리포세이트에 대한 내성을 제공하기 위해 적합하다. 데이타는 상기 새로운 클래스의 EPSP 신타제 내에서, 알라닌이 글리포세이트에 대한 내성을 위한 유일한 결정자가 아님을 제안한다. 다른 가능한 결정자를 연구하기 위해, 추가의 변이체 DGT-28 v3 (A84G T172A 이중 돌연변이체)를 제작하였다. 상기 효소는 5.15 mM의 IC50 값 (60 μM PEP에서)으로, 글리포세이트에 대한 저하된 내성을 보였다. DGT-28 v3에 대한 IC50의 감소는 촉매 효율의 200배 감소를 동반하였고, 이것은 제2 돌연변이가 의도하지 않은 효과를 일으켰음을 제안한다 (표 2). 보다 높은 동일성 DGT-28 v1 상동체 (~75% 아미노산 동일성), DGT-32 및 DGT-33은 PEP에 대해 낮은 Km (~114 - 139 μM)을 가졌지만, 촉매 효율은 DGT-28 v1보다 100배 더 낮았다. 촉매 효율의 상기 급락은 아마도 말토스 결합 단백질 (MBP) 융합에서 기인한다. 효소는 50 mM를 초과하는 IC50 값을 보이면서 글리포세이트에 대해 또한 불감수성이다. 다양한 DGT 효소가 글리포세이트에 대한 내성을 제공하였음을 나타내는 이들 시험관내 검정의 결과로서, DGT 효소들을 식물내 시험하였다.
실시예 5: 식물 형질전환 벡터의 클로닝
식물 2원 벡터 제작. 인프레임 융합으로서 dgt-28에 연결된 엽록체 수송 펩티드 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 도입 벡터의 제작에서 표준 클로닝 방법을 사용하였다. dgt-28에 융합된 수송 펩티드 (TraP)를 함유하는 도입 벡터는 IN-FUSION™ 어드밴티지 테크놀로지 (Advantage Technology) (클론테크 (Clontech, 미국 캘리포니아주 마운튼뷰))을 이용하여 조립하였다. 융합의 결과로서, 제1 아미노산 메티오닌을 dgt-28로부터 제거하였다. 수송 펩티드 TraP4 v2 (서열 33), TraP5 v2 (서열 34), TraP8 v2 (서열 35), TraP9 v2 (서열 36), TraP12 v2 (서열 37), 및 TraP13 v2 (서열 38)을 각각 DNA2.0 (미국 캘리포니아주 멘로 파크)에 의해 합성하고, 독특한 AccI 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 포함하는, dgt-28의 5' 단부 단편에 융합하였다.
다양한 TraP 및 dgt-28 발현 카세트를 함유한 2원 플라스미드는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 v2; Callis, et al., (1990) J Biol. Chem., 265: 12486-12493)에 의해 구동되고, 아그로박테리움 투메파시엔스 개방 판독 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR v1; 미국 특허 5,428,147)이 측면에 접해있었다.
조립된 TraP 및 dgt-28 발현 카세트를 게이트웨이(GATEWAY)® 기술 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 이용하여 조작하고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환을 통해 식물 내로 형질전환시켰다. 제한 엔도뉴클레아제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England BioLabs; NEB; 미국 매사추세츠주 입시치))로부터 입수하였고, DNA 결찰을 위해 T4 DNA 리가제 (인비트로겐)를 사용하였다. 게이트웨이 (Gateway) 반응은 1개의 도입 벡터를, 선택가능한 마커 카세트 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV v2; Verdaguer et al., (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139) - DSM-2 (미국 특허 출원 2007/086813) - 아그로박테리움 투메파시엔스 개방 판독 프레임 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6; [Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822])를 함유한 단일 목적지 (destination) 벡터 내로 조립하기 위해 게이트웨이® LR 클로나제(CLONASE)® 효소 믹스 (인비트로겐)를 사용하여 수행하였다. 플라스미드 제조는 공급자의 지시에 따라 뉴클레오스핀 (NUCLEOSPIN)® 플라스미드 키트 (마세리-나겔 인크. (Macherey-Nagel Inc., 미국 펜실베니아주 베들레헴)) 또는 플라스미드 미디 키트 (Midi Kit) (퀴아젠 (Qiagen))를 사용하여 수행하였다. DNA 단편을 아가로스 Tris-아세테이트 겔 전기영동 후에 QIAquick™ 겔 추출 키트 (퀴아젠)를 사용하여 단리하였다.
모든 조립된 플라스미드의 콜로니는 미니프렙 (miniprep) DNA의 제한 소화에 의해 초기에 스크리닝하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 상업적인 서열결정 판매사 (유로핀스™ 엠더블유지 오페론 (Eurofins™ MWG Operon), 미국 알라바마주 헌츠빌)에 의해 서열결정하였다. 서열 데이타를 조립하고, 시?처(SEQUENCHER)™ 소프트웨어 (진 코즈 코퍼레이션, 미국 미시건주 앤 아버))를 이용하여 분석하였다.
다음 2원 구축물은 다양한 TraP:dgt-28 융합 유전자 서열을 발현한다: pDAB107527 (도 3)은 TraP4 v2:dgt-28 v5 (서열 79)를 함유하고; pDAB105530 (도 4)은 TraP5 v2:dgt-28 v5 (서열 80)을 함유하고; pDAB105531 (도 5)은 TraP8 v2:dgt-28 v5 (서열 81)을 함유하고; PDAB105532 (도 6)는 TraP9 v2:dgt-28 v5 (서열 82)를 함유하고; pDAB105533 (도 7)은 TraP12 v2:dgt-28 v5 (서열 83)를 함유하고; pDAB105534 (도 8)는 TraP13 v2:dgt-28 v5 (서열 84)를 함유한다. pDAB105534의 dgt-28 v5 서열은s 변형되었고, 여기서 제1 코돈 (GCA)이 (GCT)로 변화되었다.
추가의 식물 2원 벡터 제작. dgt-31, dgt-32, dgt-33, dgt-1, dgt-3, 및 dgt-7을 함유하는 2원 플라스미드를 제작하기 위해 상기 설명된 것과 유사한 클로닝 전략을 사용하였다.
미생물 유래 유전자; dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33을 앞서 설명된 것과 상이한 엽록체 수송 펩티드와 융합시켰다. 다음 엽록체 수송 펩티드를 사용하였다; TraP14 v2 (서열 39), TraP23 v2 (서열 40), TraP24 v2 (서열 41). pDAB107532 (도 11)은 TraP14 v2 (서열 42)에 융합된 dgt-32 v3을 함유하고, pDAB107534 (도 12)는 TraP24 v2 (서열 43)에 융합된 dgt-33 v3을 함유하고, pDAB1017533 (도 54)은 TraP23 v2 (서열 143)에 융합된 dgt-31 v3을 함유한다. dgt 발현 카세트는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 (AtUbi10 프로모터 v2)에 의해 구동되고, 아그로박테리움 투메파시엔스 개방 판독 프레임 23 3' 비번역 영역 (AtuORF23 3' UTR v1)이 측면에 접해있었다. 카사바 잎맥 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV v2) - DSM-2 - 아그로박테리움 투메파시엔스 개방 판독 프레임 1 3' 비번역 영역 (AtuORF1 3' UTR v6)을 함유하는 DSM-2 선택가능한 마커 카세트가 또한 2원 벡터 내에 존재하였다.
추가의 2원 벡터를 제작하였고, 여기서 dgt-31 v3, dgt-32 v3, 및 dgt-33 v3을 앞서 설명된 엽록체 수송 펩티드 서열에 융합시켰다. 예를 들어, TraP8 v2 서열을 dgt-31 v3, dgt-32 v3, 및 dgt-33 v3에 융합시키고, 상기 설명된 바와 같이 2원 벡터 내로 클로닝하였다.
클래스 I 유전자 (dgt-1, dgt-3, 및 dgt-7)를 함유하는 2원 벡터를 제작하였다. 다음 2원 벡터를 제작하고, 식물 내로 형질전환시켰다: pDAB4104 (도 9) (이것은 미국 특허 출원 공개 2011/0124503에 설명된 바와 같은 dgt-1 v4 서열을 함유하고, 미국 특허 출원 공개 2009/0064376에 설명된 바와 같은 니코티아나 타바쿰 오스모틴 (Osmotin) 서열이 측면에 접해있다); pDAB102715 (도 10); pDAB102716 (도 45); pDAB102717 (도 46); 및 pDAB102785 (도 13). dgt-28, dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33에 융합된 다양한 TraP 엽록체 수송 펩티드는 클래스 I 유전자에 첨가되지 않았고, 이것은 이들 식물 유래 서열이 천연 식물 엽록체 수송 펩티드를 갖기 때문이다. 이들 벡터를 표 3에 추가로 상세히 설명한다.
Figure pct00005
실시예 6: 아라비돕시스 내로 형질전환 및 선택
아라비돕시스 탈리아나 형질전환. 아라비돕시스를 화아 침지 (floral dip) 방법 (Clough and Bent (1998))을 이용하여 형질전환시켰다. 상기 설명된 2원 플라스미드 중 하나를 함유하는 선택된 아그로박테리움 콜로니를 사용하여 스펙티노마이신 (100 mg/L) 및 카나마이신 (50 mg/L)을 함유하는 YEP 브로쓰 (broth)의 하나 이상의 100 mL 예비-배양액에 접종하였다. 배양액을 225 rpm에서 일정하게 교반하면서 28℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 세포를 실온에서 10분 동안 약 5000 xg에서 펠렛화하고, 생성되는 상청액을 폐기하였다. 세포 펠렛을 5% (w/v) 수크로스, 10 ㎍/L 6-벤질아미노퓨린, 및 0.04% Silwet™ L-77를 함유하는 400 mL 침액 (dunking) 배지 내에 부드럽게 재현탁하였다. 약 1월령의 식물을 부드럽게 교반하면서 5-10분 동안 배지 내로 침지시켰다. 식물을 옆으로 뉘이고 투명한 또는 불투명한 플라스틱 백으로 2-3시간 동안 덮은 후, 직립으로 놓았다. 식물을 16-시간 명/8-시간 암의 광주기로 22℃에서 성장시켰다. 침지 약 4주 후에, 종자를 수확하였다.
형질전환 식물의 선택. 새로 수확한 T1 종자 [dgt 및 DSM-2 발현 카세트를 함유하는]를 실온에서 7일 동안 건조시켰다. 각각 휴면 요건을 완료하고 동시적인 종자 발아를 보장하기 위해 앞서 40 mL의 0.1% 아가로스 용액에 현탁시키고 2일 동안 4℃에서 저장시킨 층적시킨 (stratified) T1 종자 (~10,000 종자)의 200 mg 분취액을 넣음으로써, T1 종자를 26.5 x 51-cm 발아 트레이에 파종하였다.
선샤인 믹스 (Sunshine Mix) LP5를 미세한 질석으로 덮고, 호그랜드 (Hoagland) 용액으로 젖을 때까지 저면관수한 후, 중력 배수시켰다. 층적시킨 종자의 각각의 40 mL 분취액을 피펫을 사용하여 질석 상에 균등하게 파종하고, 가습 돔 (humidity dome)으로 4-5일 동안 덮었다. 글루포시네이트 발아후 분무 (동시-형질전환된 DSM-2 유전자에 대해 선택하는)를 이용하는 초기 형질전환체 선택의 1일 전에 돔을 제거하였다.
식재 7일 후 (DAP: day after planting) 및 다시 11 DAP에, T1 식물 (각각 자엽 및 2-4-엽기)에 적용당 280 g ai/ha 글루포시네이트의 효과적인 비율을 전달하기 위해 데빌비스 (DeVilbiss) 압축 공기 분무 팁 (tip)을 사용하여 10 mL/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피에서 0.2% 용액의 리버티 (Liberty) 제초제 (200 g ai/L 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언시스 (Bayer Crop Sciences, 미국 미주리주 캔자스 시티)을 분무하였다. 생존체 (활발히 성장하는 식물)은 최종 분무 4-7일 후에 확인되었고, 식재용토 (메트로 믹스 (Metro Mix) 360)를 사용하여 준비한 3-인치 (7.62-센티미터) 화분에 개별적으로 이식하였다. 이식된 식물을 가습 돔으로 3-4일 동안 덮고, 이전처럼 22℃ 성장 챔버에 두거나 직접 온실로 옮겼다. 돔을 후속적으로 제거하고, 식물을 온실에서 길렀다 (22±5℃, 50±30% RH, 14 h 명: 10 암, 최소 500 μE/m2s1 천연 + 보충 광). 글리포세이트 내성 유전자가 식물의 게놈 내로 안정적으로 통합되었는지 확인하기 위해 분자 확인 분석을 생존 T1 식물에 대해 완료하였다.
분자 확인. pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533, 또는 pDAB105534로 형질전환된 아라비돕시스 식물의 게놈 내의 dgt-28 및 DSM-2 도입 유전자의 존재를 확인하였다. 이들 폴리뉴클레오티드 서열의 존재는 가수분해 프로브 검정, 유전자 발현 카세트 PCR (식물 전사 단위 PCR - PTU PCR로도 설명됨), 서던 블롯 분석, 및 정량적 역전사 PCR 분석을 통해 확인하였다.
T1 아라비돕시스 식물은 초기에 DSM-2 및 dgt-28 도입 유전자의 존재를 확인하기 위해 TAQMAN™과 유사하게 가수분해 프로브 검정을 통해 스크리닝하였다. 이벤트는 dgt 발현 카세트가 재배열되지 않으면서 식물 게놈 내로 완전히 통합되었는지 결정하기 위해서 유전자 발현 카세트 PCR을 통해 스크리닝하였다. 이들 연구로부터 생성된 데이타를 사용하여 도입 유전자 카피수를 결정하고, 자가 수정 및 T2 세대로의 진행을 위해 선택된 아라비돕시스 이벤트를 확인하였다. 진행된 T2 아라비돕시스 식물을 또한 식물 염색체 내의 DSM-2 및 dgt 유전자의 존재를 확인하고 카피수를 예측하기 위해 가수분해 프로브 검정을 통해 스크리닝하였다. 마지막으로, 서던 블롯 검정을 사용하여 T1 아라비돕시스 식물의 하위세트에 대해 추정된 카피수를 확인하였다.
pDAB4101로 형질전환된 식물로부터 dgt-1 도입 유전자의 존재, pDAB107532로 형질전환된 식물로부터 dgt-32 도입 유전자의 존재, pDAB107534로 형질전환된 식물로부터 dgt-33 도입 유전자의 존재, pDAB102715로 형질전환된 식물로부터 dgt-3 도입 유전자의 존재, pDAB102716으로 형질전환된 식물로부터 dgt-3 도입 유전자의 존재, pDAB102717로 형질전환된 식물로부터 dgt-3 도입 유전자의 존재, 및 pDAB102785로 형질전환된 식물로부터 dgt-7 도입 유전자의 존재를 확인하기 위해 유사한 검정을 사용하였다.
가수분해 프로브 검정. 카피수는 아래에서 설명되는 가수분해 프로브 검정을 사용하여 T1 및 T2 아라비돕시스 식물에서 결정하였다. 상이한 수의 도입 유전자를 갖는 식물을 확인하고, 후속적인 글리포세이트 내성 연구를 진행하였다.
조직 샘플을 96-웰 플레이트에 수집하고 2일 동안 동결건조시켰다. 조직 침연 (maceration)은 KLECO™ 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크. (Environ Metal INC., 미국 오레곤주 스위트 홈))를 사용하여 수행하였다. 조직 침연 이후, 게놈 DNA를 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 바이오스프린트(Biosprint)™ 96 식물 키트 (퀴아젠™, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 고효율 (high-throughput) 방식으로 단리하였다. 게놈 DNA는 QUANT-IT™ 피코 그린 (PICO GREEN) DNA 검정 키트 (몰레큘라 프로브스 (Molecular , 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드))에 의해 정량하였다. 정량된 게놈 DNA를 바이오로봇(BIOROBOT)3000™ 자동화 액체 취급기 (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 가수분해 프로브 검정을 위해 약 2 ng/㎕로 조정하였다. 가수분해 프로브 검정에 의한 도입 유전자 카피수 결정은 라이트사이클러(LIGHTCYCLER)® 480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science, 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 검정은 DSM-2, dgt-28 및 내부 참조 유전자인 TAFII15 (Genbank ID: NC 003075; [Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol, 10:61])에 대해 설계하였다.
증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브 매스터 믹스 (Master mix) (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, DSM-2 및 dgt-28에 대한 0.1 μM의 각각의 프라이머, TAFII15에 대한 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 다수의 반응물 내에 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 4). 형광 획득과 함께 60℃에서 40초 동안 연장하면서 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플에 대해 실험을 실시하고, 평균한 사이클 역치 (Ct) 값을 각각의 샘플의 분석을 위해 사용하였다. 실시간 PCR 데이타의 분석은 상대적인 퀀트 모듈 (quant module)을 이용하여 라이트사이클러™ 소프트웨어 릴리스 1.5를 사용하여 수행하였고, 이것은 △△Ct 방법을 기초로 한다. 이를 위해서, 단일 카피 교정기 (calibrator) 및 알려진 2 카피 검사 (check)로부터의 게놈 DNA의 샘플을 각각의 실행에 포함시켰다. 가수분해 프로브 스크린의 카피수 결과를 T1 및 T2 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에 대해 결정하였다.
Figure pct00006
서던 블롯 분석을 통한 dgt -28 통합 확인. 서던 블롯 분석은 삽입된 T-가닥 DNA 단편의 통합 패턴을 확립하고 dgt-28을 함유한 이벤트를 확인하기 위해 사용하였다. 데이타는 아라비돕시스 게놈 내의 도입 유전자 삽입체의 통합 및 일체성을 입증하기 위해 생성되었다. 서던 블롯 데이타는 T-가닥 DNA의 무손상 카피의 간단한 통합을 확인하기 위해 사용하였다. 상세한 서던 블롯 분석은 dgt-28 유전자 발현 카세트에 특이적인 PCR 증폭된 프로브를 사용하여 수행하였다. 특정 제한 효소로 소화된 게놈 DNA와 프로브의 혼성화는 그의 패턴이 전체 길이, 다음 세대로 진행을 위한 간단한 삽입 T1 트랜스제닉 이벤트를 확인하기 위해 사용되는 특정 분자량의 게놈 DNA 단편을 확인하였다.
조직 샘플을 2 mL 원추형 튜브 (에펜도르프(Eppendorf)™) 내에 수집하고, 2일 동안 동결건조시켰다. 조직 침연을 KLECKO™ 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드를 사용하여 수행하였다. 조직 침연 이후, 게놈 DNA를 CTAB 단리 절차를 이용하여 단리하였다. 게놈 DNA를 퀴아젠™ 게노믹 팁스 (Genomic Tips) 키트를 사용하여 추가로 정제하였다. 게놈 DNA를 Quant-IT™ 피코 그린 DNA 검정 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 의해 정량하였다. 정량된 게놈 DNA를 일관된 농도를 위해 4 ㎍로 조정하였다.
각각의 샘플에 대해, 4 ㎍의 게놈 DNA를 제한 효소 SwaI (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 미국 매사추세츠주 베벌리)으로 완전히 소화시키고, 25℃에서 밤새 인큐베이팅한 후, NsiI를 반응액에 첨가하고 37℃에서 6시간 동안 인큐베이팅하였다. 소화시킨 DNA를 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 Quick Precipitation Solution™ (엣지 바이오시스템 (Edge Biosystem, 미국 메릴랜드주 게이터스버그))을 사용한 침전에 의해 농축하였다. 이어서, 게놈 DNA를 25 ㎕의 물 내에 65℃에서 1시간 동안 재현탁하였다. 재현탁시킨 샘플을 1X TAE 내에 제조된 0.8% 아가로스 겔 상에 로딩하고, 1X TAE 완충제 내에서 1.1 V/cm에서 밤새 전기영동시켰다. 겔을 순차적으로 30분 동안 변성 (0.2 M NaOH/0.6 M NaCl), 30분 동안 중화 (0.5 M Tris-HCl (pH 7.5)/1.5 M NaCl)에 적용하였다.
DNA 단편의 나일론 막으로의 전달은 크로마토그래피 페이퍼 위크 (paper wick) 및 페이퍼 타월을 사용함으로써 처리된 이모빌론(IMMOBILON)™ NY+ 전달 막 (밀리포어 (Millipore, 미국 매사추세츠주 빌러리카)) 상에 밤새 겔을 통해 20 X SSC 용액을 수동 위킹 (wicking)함으로써 수행하였다. 전달 후에, 막을 2X SSC로 잠깐 동안 세척하고, 스트라타링커(STRATALINKER)™ 1800 (스트라타젠, 미국 캘리포니아주 라홀라)와 가교결합시키고, 80℃에서 3시간 동안 진공소성하였다.
블롯을 모델 400 혼성화 인큐베이터 (로빈스 사이언티픽 (Robbins Scientific, 미국 캘리포니아주 서니베일))를 사용하여 유리 롤러 병에서 예비-혼성화 용액 (Perfect Hyb plus, 시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스)과 함께 1시간 동안 65℃에서 인큐베이팅하였다. 프로브는 저너체 코딩 서열을 함유하는 PCR 단편으로부터 제조하였다. PCR 앰플리콘 (amplicon)을 QIAEX™ II 겔 추출 키트를 이용하여 정제하고, 무작위 RT 프라임 (Prime) IT™ 표지 키트 (스트라타젠, 미국 캘리포니아주 라홀라)를 통해 α32P-dCTP로 표지하였다. 블롯을 약 2백만 개/블롯/mL로 혼성화 완충제에 직접 첨가된 변성된 프로브와 함께 65℃에서 밤새 혼성화하였다. 혼성화 이후, 블롯을 65℃에서 0.1X SSC/0.1% SDS로 40분 동안 순차적으로 세척하였다. 마지막으로, 블롯을 저장 인광 영상화 (storage phosphor imaging) 스크린에 노출시키고, 몰레큘라 다이나믹스 스톰 (Molecular Dynamics Storm) 860™ 영상화 시스템으르 사용하여 영상화하였다.
상기 연구에서 완료된 서던 블롯 분석은 카피수를 결정하고, 선택된 이벤트가 아라비돕시스의 게놈 내에 dgt-28 도입 유전자를 함유함을 확인하기 위해서 사용되었다.
PCR 분석을 통한 dgt-28 유전자 발현 카세트. T1 식물 이벤트에 함유된 dgt-28 유전자 발현 카세트는 종점 PCR 반응에 의해 검출하였다. dgt-28 유전자 발현 카세트의 AtUbi10 프로모터 v2 및 AtuORF23 3'UTR v1 영역에 특이적인 프라이머 (표 5)를 검출을 위해 사용하였다.
Figure pct00007
PCR 반응은 유전자 발현 카세트를 증폭하기 위해 표준 3 단계 PCR 순환 프로토콜을 필요로 하였다. 모든 PCR 반응은 다음 PCR 조건을 이용하여 완료하였다: 94℃ 3분, 이어서 94℃ 30초, 60℃ 30초, 및 72℃ 3분의 35 사이클. 반응은 제조자의 지시에 따라 EX-TAQ™ PCR 키트 (다까라 바이오테크놀로지 인크. (TaKaRa Biotechnology Inc. 일본 시가현 오츠))를 사용하여 완료하였다. 최종 사이클 이후에, 반응액을 72℃에서 10분 동안 인큐베이팅하였다. TAE 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 앰플리콘 크기를 결정하였다. 예상된 크기의 PCR 앰플리콘은 전장 유전자 발현 카세트가 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트의 게놈 내에 존재함을 나타내었다.
정량적 역전사 PCR 분석을 통한 dgt-28 상대적 전사 확인. dgt-28 트랜스제닉 식물의 조직 샘플을 96-웰 플레이트 내에 수집하고, 80℃에서 동결하였다. 조직 침연은 KLECO™ 조직 분쇄기 및 텅스텐 비드 (엔비론 메탈 인크., 미국 오레곤주 스위트 홈)를 사용하여 수행하였다. 조직 침연 이후, 총 RNA는 컬럼에 대한 선택적인 DnaseI 처리를 포함하는 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 퀴아젠™ Rneasy 96 키트 (퀴아젠™, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 고효율 방식으로 단리하였다. 상기 단계 후에, 용리시킨 총 RNA를 추가의 DnaseI (암비온(Ambion)™, 미국 텍사스주 오스틴)으로 처리하였다. cDNA 합성은 올리고뉴클레오티드 TVN을 첨가하면서 제조자가 제안하는 절차에 따라 고용량 cDNA 역전사™ 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 미국 텍사스주 오스틴)를 사용하고 주형으로서 총 RNA를 사용하여 수행하였다. 발현의 정량은 가수분해 프로브 검정에 의해 완료하였고, 라이트사이클러®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 검정은 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 dgt-28 및 내부 참조 유전자 "미지의 단백질" (Genbank 기탁 번호: AT4G24610)에 대해 설계하였다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브 매스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 단일 반응물 내에 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 6).
Figure pct00008
형광 획득과 함께 60℃에서 40초 동안 연장하면서 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플에 대해 실험을 3중으로 실시하고, 평균한 사이클 역치 (Ct) 값을 각각의 샘플의 분석을 위해 사용하였다. gDNA 오염이 존재하지 않도록 보장하기 위해 마이너스 역전사 반응을 각각의 샘플에 대해 실시하였다. 실시간 PCR 데이타 분석은 △△Ct 방법에 기반하여 수행하였다. 상기 검정은 반접합성 (hemizygous) 및 동종접합성인 것으로 결정된 트랜스제닉 아라비돕시스 이벤트에서 dgt-28의 상대적인 발현을 결정하기 위해 사용하였다. dgt-28 mRNA의 상대적인 전사 수준은 내부 대조군보다 2.5배 내지 207.5배 더 높았다. 이들 데이타는 dgt-28 트랜스제닉 식물이 기능적 dgt-28 유전자 발현 카세트를 함유하고, 식물이 dgt-28 도입 유전자를 전사할 수 있었음을 나타내었다.
웨스턴 블로팅 분석. DGT-28은 트랜스제닉 아라비돕시스 탈리아나 식물로부터 얻은 잎 샘플 내에서 검출되었다. dgt-28 트랜스제닉 식물로부터의 식물 추출액 및 DGT-28 단백질 표준물을 DTT를 함유하는 NUPAGE® LDS 샘플 완충제 (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)와 함께 90℃에서 10분 동안 인큐베이팅하고, 아크릴아미드 프리캐스트 (precast) 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. 이어서, 단백질을 제조자의 프로토콜을 이용하여 니트로셀룰로스 막 상으로 전기적으로 전달하였다. 웨스턴브리즈(WESTERNBREEZE)® 차단 믹스 (Blocking Mix) (인비트로겐)를 사용하여 차단한 후, 항-DGT-28 항혈청, 이어서 염소 항-토끼 포스파타제에 의해 DGT-28 단백질을 검출하였다. 검출된 단백질을 화학발광 기질 BCIP/NBT 웨스턴 분석 시약 (KPL, 미국 메릴랜드주 게이터스버그)에 의해 시각화하였다. 웨스턴 블롯을 통한 무손상 DGT-28 단백질의 생산은 검정된 dgt-28 트랜스제닉 식물이 DGT-28 단백질을 발현함을 나타내었다.
실시예 7: 글리포세이트 내성
dgt-28 도입 유전자를 함유하는 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 식물에 상이한 비율의 글리포세이트를 분무하였다. 저항성의 상대적인 수준을 결정하기 위해서 상승된 비율을 상기 연구에 적용하였다 (105, 420, 1,680 또는 3,360 g ae/ha). 글리포세이트의 전형적인 1X 재배지 사용 비율은1120 g ae/ha. 상기 연구에 사용된 T1 아라비돕시스 식물의 dgt-28 도입 유전자의 카피수는 상이하였다. 낮은 카피 dgt-28 T1 아라비돕시스 식물을 자가수분시키고 T2 식물을 생산하기 위해 사용하였다. 표 7은 글리포세이트 제초제 내성 유전자가 존재하는 dgt-28 트랜스제닉 식물, dgt-1, 및 야생형 대조군의 비교를 보여준다. 표 8은 글리포세이트 제초제 내성 유전자가 존재하는 dgt-32, 및 dgt-33을 dgt-1, 및 야생형 대조군과 비교한 것을 보여준다. 표 9는 신규한 박테리아 EPSP 신타제 효소를 클래스 I EPSP 신타제 효소 및 글리포세이트 비율 1,680 g ae/ha의 대조군과 비교한 것을 보여준다.
형질전환된 dgt-28 아라비돕시스 식물의 글리포세이트 선택의 결과. 아라비돕시스 T1 형질전환체를 먼저 글루포시네이트 선택 방식을 사용하여 형질전환되지 않은 종자의 배경으로부터 선택하였다. 3개의 플랫 (flat) 또는 30,000개의 종자를 각각의 T1 구축물에 대해 분석하였다. 상기 선택된 T1 식물을 분자 수준에서 특성화하였고, 높은 카피수 식물을 후속적으로 개별적인 화분에 이식하고, 앞서 설명된 바와 같이 다양한 비율의 시판 글리포세이트로 분무하였다. 상기 식물의 반응은 처리 2주 후 (weeks after treatment; WAT)에 가시적인 손상 % 측면에서 제시된다. 데이타는 손상이 없거나 미약한 손상 (<20%), 중등도 손상 (20-40%), 또는 심한 손상 (>40%)을 보이는 개별 식물을 보여주는 표에 제시된다. 산술 평균 및 표준 편차를 아라비돕시스 형질전환을 위해 사용된 각각의 구축물에 대해 제시된다. 개별적인 반응의 범위가 또한 각각의 비율 및 형질전환에 대해 마지막 컬럼에 표시된다. 야생형의 비-형질전환된 아라비돕시스 (c.v. 콜럼비아 (Columbia))는 글리포세이트 감수성 대조군으로 기능하였다.
식물 반응의 수준은 다양하였다. 상기 차이는 각각의 식물이 독립적 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서 관심있는 유전자의 카피수가 식물마다 상이하다는 사실에 의한 것일 수 있다. 도입 유전자를 함유한 일부의 식물이 글리포세이트에 내성이 아니었고; 이들 식물이 도입 유전자를 발현하는지 결정하기 위한 철저한 분석이 완료되지 않았음을 유의한다. T1 아라비돕시스 식물 내의 높은 카피수의 도입 유전자의 존재는 dgt-28 도입 유전자의 존재에도 불구하고 글리포세이트에 대한 감수성을 유발하는 도입 유전자 침묵화 또는 다른 후생적 효과를 야기할 가능성이 있다.
전체 집단 손상 비율 평균을 dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32, 및 dgt-33 대 dgt-1 및 야생형 대조군으로 형질전환된 식물 사이의 유의한 차이를 입증하기 위해 1,680 g ae/ha의 글리포세이트 비율에 대해 표 9에 제시한다.
신규한 박테리아 EPSP 신타제에 의해 제공된 내성은 특정 효소에 따라 상이하였다. DGT-28, DGT-32, 및 DGT-33은 예상치 않게 글리포세이트에 대한 유의한 내성을 제공하였다. dgt 유전자는 시험된 모든 수송 펩티드에 걸쳐 개별적인 T1 아라비돕시스 식물에 제초제 내성을 부여하였다. 따라서, 추가의 엽록체 수송 펩티드 (즉, TraP8 - dgt-32 또는 TraP8 - dgt-33)의 사용은 제시된 처리 내에서 보고된 유사한 손상 수준으로 글리포세이트에 대한 보호를 제공할 것이다.
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Figure pct00013
선택가능한 마커로서 dgt-28. 글리포세이트 선택제에 대해 선택가능한 마커로서 dgt-28의 사용은 상기 설명된 아라비돕시스 형질전환된 식물로 시험한다. 약 50개의 T4 세대 아라비돕시스 종자 (dgt-28에 대해 동종접합성)를 약 5,000개의 야생형 (글리포세이트에 감수성인) 종자와 섞었다. 종자를 발아시키고, 묘목에 선택된 용량의 글리포세이트를 분무하였다. 여러 글리포세이트 처리를 비교하였다; 각각의 트레이의 식물에게 다음 처리 방식 중의 하나를 통해 글리포세이트를 1회 또는 2회 적용하였다: 7 DAP (식재 후 일수), 11 DAP, 또는 7 이어서 11 DAP. 모든 식물은 또한 동일한 형질전환 벡터에 글루포시네이트 저항성 유전자를 함유하기 때문에, 글리포세이트로 선택된 dgt-28 함유 식물은 글루포시네이트로 선택된 DSM-2 또는 pat 함유 식물과 직접 비교할 수 있다.
글리포세이트 처리는 앞서 설명된 바와 같이 데빌비스™ 분무 팁을 사용하여 적용하였다. dgt-28을 함유하는 트랜스제닉 식물은 "저항성" 또는 "감수성" 17 DAP로 확인된다. 식재 후 7 및 11일 (DAP)에 적용된 26.25-1680 g ae/ha 글리포세이트는 dgt-28을 함유하는 트랜스제닉 아라비돕시스 식물에 대한 효과적인 선택을 보인다. 감수성 및 내성 식물을 계수하고, 글리포세이트 내성 식물의 수는 식재된 dgt-28 도입 유전자를 함유하는 트랜스제닉 종자의 원래의 수와 상관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 dgt-28이 형질전환된 아라비돕시스의 집단에 대한 또 다른 선택가능한 마커로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
유전가능성. 확인된 트랜스제닉 T1 아라비돕시스 이벤트를 자가수분시켜 T2 종자를 생산하였다. 이들 종자는 글루포시네이트를 함유하는 이그나이트(Ignite)™ 제초제 (200 g ae/ha)를 100개의 무작위 T2 자매체 (sibling)에 적용함으로써 자손체에 대해 시험하였다. 각각의 개별적인 T2 식물을 분무 적용 (187 L/ha 적용 비율의 트랙 분무기) 전에 7.5-cm 정사각형 화분에 식재하였다. T1 패밀리 (T2 식물)는 카이 (Chi) 제곱 분석 (P > 0.05)에 의해 결정할 때 멘델 유전 (Mendelian inheritance)으로 우성 유전되는 단일 유전자좌에 대한 예상된 3 저항성: 1 감수성 모델로 분리되었다. 예상된 멘델 유전으로 분리된 T1 패밀리의 백분율을 표 10에 예시하고, 이것은 dgt-28 형질이 멘델 유전을 통해 T2 세대로 전달됨을 입증한다. 종자를 5 내지 15개의 T2 개체로부터 수집하였다 (T3 종자). 각각의 3-4회 무작위 선택된 T2 패밀리로부터의 23개의 T3 자매체를 앞서 설명된 바와 같이 자손체에 대해 시험하였다. 데이타는 분리되지 않음을 보여주었고, 따라서 dgt-28 및 dgt-3이 염색체 내에 안정적으로 통합되고, 멘델 유전 방식으로 적어도 3개의 세대로 유전됨을 입증하였다.
Figure pct00014
T 2 아라비돕시스 데이타. 낮은 카피수의 dgt-28 도입 유전자를 함유한 선택된 T1 아라비돕시스 이벤트의 제2 세대 식물 (T2)을 글리포세이트 내성에 대해 추가로 특성화하였다. 글리포세이트를 앞서 설명된 바와 같이 적용하였다. 식물의 반응은 처리 2주 후 (WAT)에 가시적인 손상 % 측면에서 제시된다. 데이타는 손상이 없거나 미약한 손상 (<20%), 중등도 손상 (20-40%), 또는 심한 손상 (>40%)을 보이는 개별 식물의 막대그래프로서 제시된다. 산술 평균 및 표준 편차를 아라비돕시스 형질전환을 위해 사용된 각각의 구축물에 대해 제시된다. 개별적인 반응의 범위가 또한 각각의 비율 및 형질전환에 대해 마지막 컬럼에 표시된다. 야생형의 비-형질전환된 아라비돕시스 (cv. 콜럼비아)는 글리포세이트 감수성 대조군으로 기능하였다. T2 세대에서, 반접합성 및 동종접합성 식물이 각각의 이벤트에 대해 시험하기 위해 이용가능하고, 따라서 시험된 글리포세이트의 각각의 비율에 대해 포함되었다. 유전자좌에서 동일한 2개의 대립유전자를 함유하는 동종접합성 식물에 비해, 반접합성 식물은 유전자좌에 2개의 상이한 대립유전자를 함유한다. 글리포세이트에 대한 반응의 차이는 동종접합성 식물에 비해 반접합성 식물에 대한 유전자 용량의 차이의 결과로서 T2 세대에서 예상된다. 글리포세이트에 대한 반응의 차이는 표준 편차 및 반응 범위에 반영된다.
T2 세대에서, 단일 카피 및 다중-카피 dgt-28 이벤트 둘 모두를 글리포세이트 내성에 대해 특성화하였다. 이벤트 내에서, 단일 카피 식물은 글리포세이트에 대한 유사한 수준의 내성을 보였다. 단일 카피 T2 이벤트에 대한 특징적인 데이타를 표 11에 제시한다. TraP5 v2와 연결된 dgt-28을 함유하는 이벤트는 다른 TraP 수송 펩티드를 함유한 dgt-28 구축물에 비해 강력한 글리포세이트 내성을 제공하지 않았다. 그러나, dgt-28 TraP5 구축물은 비-형질전환된 콜럼비아 대조군에 비해 낮은 수준의 글리포세이트 내성을 제공하였다. 2 이상의 카피의 dgt-28을 함유하는 것으로 밝혀진 이벤트가 상승된 비율의 글리포세이트에 대해 보다 감수성인 예가 존재하였다 (데이타를 제시하지 않음). 글리포세이트에 대한 감수성의 상기 증가는 또한 높은 카피수의 dgt-28 도입 유전자를 함유한 T1 식물에 대해 앞서 설명된 데이타와 유사하다. 아라비돕시스 식물 내의 높은 카피수의 도입 유전자의 존재는 dgt-28 도입 유전자의 존재에도 불구하고 글리포세이트에 대한 감수성을 유발하는 도입 유전자 침묵화 또는 다른 후생적 효과를 야기할 가능성이 있다.
상기 이벤트는 TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) 및 TraP13 v2 (pDAB105534)와 연결된 dgt-28을 함유하였다.
dgt-28에 추가로, dgt-3으로 형질전환된 T2 아라비돕시스 이벤트가 표 12에 제시된다. 표 11에서 dgt-28 이벤트에 대해 설명된 바와 같이, 데이타 표는 각각의 구축물의 글리포세이트에 대한 반응에 특징적인 대표적인 이벤트를 포함한다. dgt-3 특성화를 위해, dgt-3 유전자가 AtUbi10 프로모터 (pDAB102716, 도 45 및 pDAB102715, 도 10)에 의해 구동되는 단일 PTU (식물 형질전환 단위)를 함유하는 구축물을 동일한 유전자가 유전자의 2 PTU (pDAB102719, 도 32; pDAB102718, 도 33)를 함유하는 구축물과 비교하였다. 2 PTU를 함유한 구축물은 한 카피의 유전자를 구동하기 위한 AtUbi10 프로모터 및 다른 카피를 구동하기 위한 CsVMV 프로모터를 이용하였다. 이중 PTU의 사용은 dgt-3 트랜스제닉 식물을 2개의 카피의 도입 유전자를 함유한 dgt-28 트랜스제닉 식물과 비교하기 위해 포함되었다. 데이타는 단일 PTU만을 갖는 단일 카피 T2 dgt-3 이벤트가 시험된 단일 카피 dgt-28 이벤트보다 글리포세이트에 보다 감수성이지만 비-형질전환된 대조군보다는 더 내성임을 입증하였다. dgt-3 유전자의 2 PTU를 함유하는 T1 패밀리는 1 PTU 구축물에 비해 글리포세이트에 대한 보다 높은 수준의 가시적인 내성을 제공하였다. 두 경우 모두에서, T1 패밀리는 dgt-1 및 야생형 대조군과 비교되었다. T2 데이타는 dgt-28이 단일 카피 이벤트로서 강력한 내성을 제공함을 입증한다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
T 3 아라비돕시스 데이타. 낮은 카피수의 dgt-28 도입 유전자를 함유한 선택된 T1 아라비돕시스 이벤트의 제3 세대 식물 (T2)을 글리포세이트 내성에 대해 추가로 특성화하였다. 글리포세이트를 앞서 설명된 바와 같이 적용하였다. 식물의 반응은 처리 2주 후 (WAT)에 가시적인 손상 % 측면에서 제시된다. 데이타는 손상이 없거나 미약한 손상 (<20%), 중등도 손상 (20-40%), 또는 심한 손상 (>40%)을 보이는 개별 식물의 막대그래프로서 제시된다. 산술 평균 및 표준 편차를 아라비돕시스 형질전환을 위해 사용된 각각의 구축물에 대해 제시된다. 개별적인 반응의 범위가 또한 각각의 비율 및 형질전환에 대해 마지막 컬럼에 표시된다. 야생형의 비-형질전환된 아라비돕시스 (cv. 콜럼비아)는 글리포세이트 감수성 대조군으로 기능하였다. T3 세대에서, 반접합성 및 동종접합성 식물이 각각의 이벤트에 대해 시험하기 위해 이용가능하고, 따라서 시험된 글리포세이트의 각각의 비율에 대해 포함되었다. 유전자좌에서 동일한 2개의 대립유전자를 함유하는 동종접합성 식물에 비해, 반접합성 식물은 유전자좌에 2개의 상이한 대립유전자를 함유한다. 글리포세이트에 대한 반응의 차이는 동종접합성 식물에 비해 반접합성 식물에 대한 유전자 용량의 차이의 결과로서 T3 세대에서 예상된다. 글리포세이트에 대한 반응의 차이는 표준 편차 및 반응 범위에 반영된다.
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
형질전환된 식물의 선택. 새로 수확한 T1 종자 [dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33 v1 유전자]를 실온에서 건조시키고, 시험을 위해 미국 인디애나주로 수송하였다. 각각 휴면 요건을 완료하고 동시적인 종자 발아를 보장하기 위해 앞서 40 mL의 0.1% 아가로스 용액에 현탁시키고 2일 동안 4℃에서 저장한 층적시킨 T1 종자 (~10,000 종자)의 200 mg 분취액을 넣음으로써, T1 종자를 26.5 x 51-cm 발아 트레이 (티.오. 플라스틱스 인크. (T.O. Plastics Inc., 미국 미네소타주 클리어워터)) 내에 파종하였다.
선샤인 믹스 LP5 (선 그로 호티컬쳐 인크. (Sun Gro Horticulture Inc., 미국 워싱턴주 벨레뷰))를 미세한 질석으로 덮고, 호그랜드 용액으로 젖을 때까지 저면관수한 후, 중력 배수시켰다. 층적시킨 종자의 각각의 40 mL 분취액을 피펫을 사용하여 질석 상에 균등하게 파종하고, 가습 돔 (코드™ 프로덕츠 (KORD™ Products, 캐나다 온타리오주 브라말레아))으로 4-5일 동안 덮었다. 글루포시네이트 발아후 분무 (동시-형질전환된 dsm-2 유전자에 대해 선택하는)를 사용하는 초기 형질전환체 선택 전에 일단 식물이 발아된 후에 돔을 제거하였다.
식재 6일 후 (DAP) 및 다시 10 DAP에, T1 식물 (각각 자엽 및 2-4-엽기)에 적용당 200 g ae/ha 글루포시네이트의 효과적인 비율을 전달하기 위해 데빌비스™ 압축 공기 분무 팁을 사용하여 10 mL/트레이 (703 L/ha)의 분무 부피에서 0.1% 용액의 이그나이트™ 제초제 (280 g ai/L 글루포시네이트, 바이엘 크롭 사이언시스 (미국 미주리주 캔자스 시티)을 분무하였다. 생존체 (활발히 성장하는 식물)은 최종 분무 4-7일 후에 확인되었다. 생존 식물을 식재용토 (메트로 믹스 360™)를 사용하여 준비한 3-인치 (7.62-센티미터) 화분에 개별적으로 이식하였다. 식물을 카피수 분석을 위해 조직 샘플을 채취하기 전에 적어도 1일 동안 온실에서 키웠다.
T1 식물을 샘플링하고, dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33 v1 유전자에 대한 카피수 분석을 완료하였다. 이어서, T1 식물을 각각의 비율에 일정 범위의 카피가 존재하도록 다양한 비율의 글리포세이트를 할당하였다. 아라비돕시스에 대해, 26.25 g ae/ha 글리포세이트가 감수성 식물을 유의한 수준의 저항성을 갖는 것과 구분하기에 효과적인 용량이다. 상대적인 저항성 수준을 결정하기 위해 상승된 비율을 적용하였다 (105, 420, 1680, 또는 3360 g ae/ha). 표 15는 dgt-1과 비교한 결과를 보여준다.
모든 글리포세이트 제초제 적용은 187 L/ha 분무 부피로 트랙 분무기를 사용하여 시행하였다. 사용된 글리포세이트는 시판되는 두랑고 (Durango) 디메틸아민 염 제제 (480 g ae/L, 다우 아그로사이언시스 (Dow AgroSciences), LLC)이었다. 글루포시네이트 또는 글리포세이트에 내성을 보인 낮은 카피 T1 식물은 T2 세대에서 추가로 이용되었다.
제1 아라비돕시스 형질전환은 dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33 v1을 사용하여 수행하였다. T1 형질전환체를 먼저 글루포시네이트 선택 방식을 이용하여 형질전환되지 않은 종자의 배경으로부터 선택하였다. 3개의 플랫 또는 30,000개의 종자를 각각의 T1 구축물에 대해 분석하였다. 형질전환 빈도를 계산하고, T1 dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33 구축물의 결과를 표 14에 나열한다.
Figure pct00023
상기 선택된 T1 식물을 이어서 개별적인 화분에 이식하고, 다양한 비율의 시판 글리포세이트를 분무하였다. 표 15는 글리포세이트 저항성을 아라비돕시스 T1 형질전환체에 부여하는 dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33 v1 및 대조군 유전자의 반응을 비교해 보여준다. 반응은 2 WAT에 가시적인 손상 % 측면에서 제시된다. 데이타는 손상이 없거나 미약한 손상 (<20%), 중등도 손상 (20-40%), 또는 심한 손상 (>40%)을 보이는 개별 식물의 막대그래프로서 제시된다. 산술 평균 및 표준 편차가 각각의 처리에 대해 제시된다. 개별적인 반응의 범위가 또한 각각의 비율 및 형질전환에 대해 마지막 컬럼에 표시된다. 야생형의 비-형질전환된 아라비돕시스 (cv. 콜럼비아)는 글리포세이트 감수성 대조군으로 기능하였다. 수송 펩티드 (TraP23)와 함께 DGT-31 (v1) 유전자는 음성 대조군에 비해 근소한 제초제 내성을 개별적인 T1 아라비돕시스 식물에 부여하였다. DGT-32 및 DGT-33은 둘 모두 그 각각의 엽록체 수송 펩티드 (각각 TraP14 및 TraP24)와 함께 시험된 비율에서 글리포세이트에 대한 강력한 내성을 보였다. 제시된 처리 내에서, 식물 반응의 수준은 매우 다양하였고, 이것은 각각의 식물이 독립적 형질전환 이벤트를 나타내고, 따라서 관심있는 유전자의 카피수가 식물마다 상이하다는 사실에 의한 것일 수 있다. 중요한 사실은, 시험된 각각의 글리포세이트 비율에서 다른 개체보다 더 내성을 보인 개체들이 존재한다는 것이었다. 전체 집단 손상 비율 평균을 dgt-31, dgt-32, 및 dgt-33 v1 대 dgt-1 v1 또는 야생형 대조군으로 형질전환된 식물 사이의 유의한 차이를 입증하기 위해 표 15에 제시한다.
Figure pct00024
Figure pct00025
실시예 8: 선택가능한 마커로서 dgt-32 및 dgt-33.
dgt-32 및 dgt-33 v1은 글리포세이트를 선택제로서 사용할 때 선택가능한 마커로서 사용된다. 이들 마커의 성능은 형질전환된 아라비돕시스로 분석하였다. 약 50개의 T4 세대 아라비돕시스 종자 (dgt-32 및 dgt-33 v1에 대해 동종접합성)를 약 5,000개의 야생형 (감수성) 종자와 섞었다. 여러 처리를 비교하였고, 각각의 트레이의 식물에게 다음 처리 방식 중의 하나를 통해 글리포세이트를 1회 또는 2회 적용하였다: 7 DAP, 11 DAP, 또는 7 이어서 11 DAP. 모든 개별 식물은 또한 동일한 형질전환 벡터에 dsm-2를 함유하기 때문에, 글리포세이트로 선택된 dgt-32 및 dgt-33은 글루포시네이트로 선택된 dsm-2와 직접 비교할 수 있다.
처리는 데빌비스™ 분무 팁을 사용하여 적용하였다. 식물은 내성 또는 감수성 17 DAP로 확인되었다. 식재 7 및 11일 후 (DAP) 적용된 26.25 - 280 g ae/ha 2,4-D의 처리는 선택 빈도에서 동등하게 효과적이다. 이들 결과는 dgt-32 및 dgt-33 v1이 선택가능한 마커로서 효과적으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
유전가능성. 다양한 T1 이벤트를 자가수분시켜 T2 종자를 생산하였다. 이들 종자는 이그나이트™ 제초제 (200 g ae/ha)를 100개의 무작위 T2 자매체에 적용함으로써 자손체에 대해 시험하였다. 각각의 개별적인 T2 식물을 분무 적용 (187 L/ha 적용 비율의 트랙 분무기) 전에 7.5-cm 정사각형 화분에 식재하였다. 카이 제곱 분석 (P > 0.05)에 의해 결정할 때 멘델 유전으로 우성 유전되는 단일 유전자좌에 대한 예상된 3 저항성: 1 감수성 모델로 분리되는 T1 패밀리 (T2 식물)가 결정되었다.
종자를 5 내지 15개의 T2 개체로부터 수집하였다 (T3 종자). 각각의 3회 무작위 선택된 T2 패밀리로부터의 25개의 T3 자매체를 자손체에 대해 시험하였다. 분리되지 않음을 보여주는 데이타는 dgt-32 및 dgt-33 v1이 각각 안정적으로 통합되고, 멘델 유전 방식으로 적어도 3개의 세대로 유전됨을 입증하였다.
T 3 DGT 식물주의 추가의 제초제 내성 특성화. T3 세대 아라비돕시스 종자를 층적시키고, 선택 트레이 내로 파종하였다. dgt-1로 형질전환된 대조군 식물주 및 비-형질전환된 대조군을 유사한 방식으로 식재하였다. 묘목을 온실에서 개별적인 3-인치 (7.62-센티미터) 화분에 옮겼다. 모든 식물에 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기를 사용하여 분무하였다. 식물에 420-3360 g ae/ha로부터 일정 범위의 글리포세이트 (두랑고™ DMA, 다우 아그로사이언시스)를 분무하였다. 모든 적용물은 물 내에 제제화되었다. 각각의 처리는 4회 반복하고, 식물을 처리 7 및 14일 후에 평가하였다.
실시예 9: 추가의 작물 종의 형질전환
대두를 PCT 국제 미국 특허 공개 WO 2007/053482의 실시예 11 또는 실시예 13에 설명된 바와 실질적으로 동일한 기술을 사용하여 제초제 글리포세이트에 대한 높은 수준의 저항성을 제공하기 위해 dgt-28, dgt-32, 및/또는 dgt-33 (엽록체 수송 펩티드가 존재하거나 존재하지 않음)으로 형질전환시켰다.
면화를 미국 특허 7,838,733의 실시예 14, 또는 PCT 국제 특허 공개 WO 2007/053482의 실시예 12에 설명된 바와 실질적으로 동일한 기술을 사용하여 제초제 글리포세이트에 대한 높은 수준의 저항성을 제공하기 위해 dgt-28, dgt-32, 및/또는 dgt-33 (엽록체 수송 펩티드가 존재하거나 존재하지 않음)로 형질전환시켰다.
카놀라를 미국 특허 7,838,733의 실시예 26, 또는 PCT 국제 특허 공개 WO 2007/053482의 실시예 22에 설명된 바와 실질적으로 동일한 기술을 사용하여 제초제 글리포세이트에 대한 높은 수준의 저항성을 제공하기 위해 dgt-28, dgt-32, 및/또는 dgt-33 (엽록체 수송 펩티드가 존재하거나 존재하지 않음)으로 형질전환시켰다.
실시예 10: 옥수수 형질전환
옥수수 형질전환을 위한 DNA 구축물. 상기 설명한 바와 같은 표준 클로닝 방법을 옥수수의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환에 사용하기 위한 2원 벡터의 제작에서 사용하였다. 표 16은 옥수수 형질전환을 위해 제작한 벡터를 나열한다. 다음 유전자 요소가 dgt-28을 함유하는 벡터에 사용되었다; 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터 (ZmUbi1; 미국 특허 5,510,474)는 제아 메이즈 리파제 3' 비번역 영역 (ZmLip 3'UTR; 미국 특허 7179902)이 측면에 접해있는 dgt-28 코딩 서열을 구동하기 위해 사용되었고, 선택가능한 마커 카세트는 제아 메이즈 리파제 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 aad-1 코딩 서열 (미국 특허 7,838,733)을 구동하기 위해 사용된 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터로 이루어진다. aad-1 코딩 서열은 페녹시 옥신 제초제, 예컨대, 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 및 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 내성을 부여한다.
dgt-28 구축물을 표준 2원 벡터 및 아그로박테리움 초2원성 시스템 벡터 (저팬 토바코 (Japan Tobacco, 일본 도꾜))로서 제작하였다. 표준 2원 벡터는 pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665, 및 pDAB107665를 포함한다. 아그로박테리움 초2원성 시스템 벡터는 pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386, 및 pDAB108387을 포함한다.
황색 형광 단백질 (yfp; 미국 특허 출원 2007/0298412) 리포터 유전자를 함유하는 추가의 구축물이 완료되었다. pDAB109812는 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고, 제아 메이즈 per 5 3' 비번역 영역 (Zm per5 3'UTR; 미국 특허 7179902)이 측면에 접해있는 yfp 리포터 유전자 카세트를 함유하고, 선택가능한 마커 카세트는 aad-1의 발현을 구동하기 위해 사용되고 제아 메이즈 리파제 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 사탕수수 간균형 (bacilliform) 바이러스 프로모터 (SCBV; 미국 특허 5,994,123)로 이루어진다. pDAB101556은 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고 제아 메이즈 per 5 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 yfp 카세트를 함유하고, 선택가능한 마커 카세트는 aad-1의 발현을 구동하기 위해 사용되고 제아 메이즈 리파제 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터로 이루어진다. pDAB107698은 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고 제아 메이즈 리파제 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 dgt-28 카세트, 제아 메이즈 유비퀴틴 1 프로모터에 의해 구동되고 제아 메이즈 per 5 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 yfp 카세트를 함유하고, 선택가능한 마커 마커 카세트는 aad-1의 발현을 구동하기 위해 사용되고 제아 메이즈 리파제 3' 비번역 영역이 측면에 접해있는 사탕수수 간균형 바이러스 프로모터로 이루어진다. 3개의 모든 이들 구축물은 표준 2원 벡터이다.
Figure pct00026
이삭 멸균 및 배 단리. 옥수수 미성숙 배를 얻기 위해, 제아 메이즈 동계교배 식물주 B104의 식물을 온실 내에서 성장시키고, 이삭을 생산하기 위해 자가 또는 동계 수분시켰다. 이삭을 수분 약 9-12일 후에 수확하였다. 실험일에, 이삭을 차아염소산나트륨 (5%)의 20% 용액에 침지하여 표면 멸균하고, 20-30분 동안 진탕한 후, 멸균수로 3회 세정하였다. 멸균 후, 미성숙 접합체 배 (1.5-2.4 mm)를 각각의 이삭으로부터 무균 상태로 절제하고, 액체 감염 배지 (LS 기초 배지, 4.43 gm/L; N6 비타민 용액 [1000X], 1.00 mL/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 수크로스, 68.5 gm/L; D(+) 글루코스, 36.0 gm/L; 10 mg/ml of 2,4-D, 150 ㎕/L)을 함유하는 미세-원심분리관 내로 무작위로 분배하였다. 제시된 세트의 실험에 대해, 3개의 이삭으로부터 모은 배를 각각의 형질전환을 위해 사용하였다.
아그로박테리움 배양 개시:
상기 설명된 2원 형질전환 벡터를 함유하는 아그로박테리움의 글리세롤 원액을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 도말하고, 20℃에서 3-4일 동안 성장시켰다. 단일 콜로니를 집고, 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 상에 도말하고, 28℃에서 1-2일 동안 인큐베이팅하였다.
아그로박테리움 배양 및 공동-경작. 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 취하고, 50 mL 일회용 튜브 내의 10 mL의 감염 배지 내에 현탁시키고, 세포 밀도를 분광광도계를 사용하여 0.2-0.4의 OD600 nm로 조정하였다. 아그로박테리움 배양액을 125 rpm, 실온에서 회전 진탕기에 놓고, 배 절제를 수행하였다. 크기가 1.5-2.4 mm인 미성숙 접합체 배를 멸균된 옥수수 알맹이로부터 단리하고, 1 mL의 감염 배지에 넣고, 동일한 배지로 1회 세척하였다. 아그로박테리움 현탁액 (2 mL)을 각각의 튜브에 첨가하고, 튜브를 진탕기 플랫폼에 10-15분 동안 두었다. 배를 공동-경작 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 카제인 효소적 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바 (Dicamba)-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔(Gelzan)™, 3.00 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNO3, 15.0 mg/L; DMSO, 100 μM) 상으로 옮기고, 소순판 (scutellum)이 위를 향하도록 만들고, 25℃에서 50 μmole m-2 sec-1 광 강도의 24시간 광 하에 3일 동안 인큐베이팅하였다.
캘러스 선택 및 추정되는 이벤트의 재생. 공동-경작 기간 이후, 배를 선택제가 없는 휴지 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소적 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 50 μmole m-2 sec-1 광 강도의 24시간 광 하에 25℃에서 3일 동안 인큐베이팅하였다.
성장 억제 용량 반응 실험은 0.25 mM 이상의 글리포세이트 농도가 형질전환되지 않은 B104 옥수수 식물주에서 세포 성장을 억제하기에 충분함을 시사하였다. 배를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 선택 1 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소적 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮기고, 암소에서 및/또는 50 μmole m-2 sec-1 광 강도의 24시간 광 하에 7-14일 동안 28℃에서 인큐베이팅하였다.
증식하는 배 형성 캘러스를 1.0 mM 글리포세이트를 함유하는 선택 2 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.500 gm/L; 카제인 효소적 가수분해물 100.0 mg/L; 30 mM 디캄바-KOH, 3.3 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/mL AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L; R-할록시포프 산 0.1810 mg/L) 상으로 옮기고, 암소에서 및/또는 50 μmole m-2 sec-1 광 강도의 24시간 광 하에 14일 동안 28℃에서 인큐베이팅하였다. 상기 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 보다 증식하고 분화하도록 허용하다. 캘러스 선택 기가은 3 내지 4주 지속된다.
증식하는 배 형성 캘러스를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 PreReg 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; L-프롤린, 350.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 0.250 gm/L; 카제인 효소적 가수분해물 50.0 mg/L; NAA-NaOH 0.500 mg/L; ABA-EtOH 2.50 mg/L; BA 1.00 mg/L; 수크로스, 45.0 gm/L; 겔잔™ 2.50 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 8.5 mg/ml AgNO3, 1.00 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮기고, 50 μmole m-2 sec-1 광 강도의 24시간 광 하에 7 동안 28℃에서 배양하였다.
싹-유사 눈 (bud)을 갖는 배 형성 캘러스를 0.5 mM 글리포세이트를 함유하는 재생 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 1,2,3,5/4,6- 헥사히드록시시클로헥산, 100.0 mg L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검 (Gellan Gum) G434™ 3.00 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml L; 카르베니실린, 125.0 mg/L) 상으로 옮기고, 50 μmole m-2 sec-1 광 강도의 24시간 광 하에 7일 동안 배양하였다.
1차 뿌리가 존재하는 작은 싹을 식물트레이 내의 착근 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 1,2,3,5/4,6- 헥사히드록시시클로헥산, 100 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검 G434™ 3.00 gm/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 140-190 μmole m-2 sec-1 광 강도에서 16/8 hr 명/암 하에 7일 동안 27℃에서 인큐베이팅하였다. 추정되는 트랜스제닉 묘목을 상기 설명된 프로토콜을 이용하여 도입 유전자 카피수에 대해 분석하고, 토양으로 옮겼다.
옥수수 식물 내의 dgt-28 및 aad-1 도입 유전자 존재의 분자 확인. dgt-28 및 aad-1 폴리뉴클레오티드 서열의 존재는 가수분해 프로브 검정을 통해 확인하였다. 단리된 T0 옥수수 식물을 aad-1 및 dgt-2 도입 유전자의 존재를 확인하기 위해 TAQMAN™과 유사한 가수분해 프로브 검정을 통해 초기에 스크리닝하였다. 이들 연구로부터 생성된 데이타를 사용하여 도입 유전자 카피수를 결정하고, 역교배 및 T1 세대로의 진행을 위한 트랜스제닉 옥수수 이벤트를 선택하기 위해 사용하였다.
조직 샘플을 96-웰 플레이트에 수집하고, 조직 침연은 KLECO™ 조직 분쇄기 및 퀴아젠™ RLT 완충제 내의 스테인레스 스틸 비드 (후버 프리시젼 프로덕츠 (Hoover Precision Products, 미국 조지아주 커밍))를 사용하여 수행하였다. 조직 침연 이후, 게놈 DNA를 제조자가 제안하는 프로토콜에 따라 바이오스프린트 96™ 식물 키트 (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 고효율 방식으로 단리하였다. 게놈 DNA는 Quant-IT™ 피코 그린 DNA 검정 키트 (몰레큘라 프로브스, 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)에 의해 정량하였다. 정량된 게놈 DNA는 바이오로봇3000™ 자동화 액체 취급기 (퀴아젠, 미국 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 가수분해 프로브 검정을 위해 약 2 ng/㎕로 조정하였다. TAQMAN® 검정과 유사한 가수분해 프로브 검정에 의한 도입 유전자 카피수 결정은 라이트사이클러®480 시스템 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)을 사용하여 실시간 PCR에 의해 수행하였다. 검정은 라이트사이클러® 프로브 디자인 소프트웨어 2.0을 사용하여 aad-1, dgt-28 및 내부 참조 유전자 인버타제 (Genbank 기탁 No: U16123.1)에 대해 설계하였다. 증폭을 위해, 라이트사이클러®480 프로브 매스터 믹스 (로슈 어플라이드 사이언스, 미국 인디애나주 인디애나폴리스)를, aad-1 및 dgt-28에 대한 0.4 μM의 각각의 프라이머 및 0.2 μM의 각각의 프로브를 함유하는 10 ㎕ 부피의 다수의 반응물 내에 1X 최종 농도로 제조하였다 (표 17).
형광 획득과 함께 60℃에서 40초 동안 연장하면서 2-단계 증폭 반응을 수행하였다. 모든 샘플에 대해 실험을 실시하고, 평균한 사이클 역치 (Ct) 값을 각각의 샘플의 분석을 위해 사용하였다. 실시간 PCR 데이타의 분석은 상대적인 퀀트 모듈을 이용하여 라이트사이클러™ 소프트웨어 릴리스 1.5를 사용하여 수행하였고, 이것은 △△Ct 방법을 기초로 한다. 대조군은 각각의 실행시에 포함된 단일 카피 교정기 및 알려진 2 카피 체크로부터의 게놈 DNA의 샘플을 포함하였다. 표 18은 가수분해 프로브 검정의 결과를 나열한다.
Figure pct00027
Figure pct00028
실시예 11: dgt-28 형질전환된 옥수수에서 제초제 내성
제아 메이즈 dgt-28 형질전환 이벤트 (T0)를 온실에서 순응시키고, 식물이 조직 배양으로부터 온실 성장 조건으로 이행될 때까지 (즉, 2-4개의 새로운, 정상으로 보이는 잎이 윤생체로부터 출현함) 성장시켰다. 식물을 온실에서 27℃에서 16시간 명:8시간 암 조건 하에 성장시켰다. 이어서, 식물을 2% w/v 황산암모늄를 부가한 두랑고 DMA™ (제초제 글리포세이트 함유)의 시판 제제로 처리하였다. 제초제 적용은 분무 부피 187 L/ha, 분무 높이 50 cm에서 트랙 분무기로 실시하였다. T0 식물에 형질전환되지 않은 옥수수 식물주에 유의한 손상을 야기할 수 있는 280 - 4480 g ae/ha 글리포세이트에서 글리포세이트를 분무하였다. 치사 용량은 B104 동계교배체에 >95% 손상을 야기하는 비율로서 규정된다.
T0 dgt-28 옥수수 식물의 결과는 글리포세이트에 대한 내성이 4480 g ae/ha 이하의 비율에서 달성됨을 보여주었다. 특정 배지 종류가 T0 세대에 사용되었다. 비-형질전환된 대조군에 비해 형질전환된 식물의 최소 발육 저지 (stunting) 및 전체 식물 성장은 dgt-28이 TraP5, TraP8, 및 TraP23 엽록체 수송 펩티드에 연결될 때 글리포세이트에 대한 강력한 내성을 제공함을 입증하였다.
선택된 T0 식물은 다음 세대에서 추가의 특성화를 위해 자가수정되거나 역교배되었다. T1 식물을 함유하는 100개의 선택된 dgt-28 식물주에 140-1120 g ae/ha 글루포시네이트 또는 105-1680 g ae/ha 글리포세이트를 분무하였다. 선택가능한 마커 및 글리포세이트 저항성 유전자 둘 모두 동일한 플라스미드 상에서 제작하였다. 따라서, 하나의 제초제 내성 유전자가 제초제 분무에 의해 선택될 경우, 두 유전자가 존재할 것으로 생각된다. 14 DAT에, 카이 제곱 분석에 의해 결정되는 바와 같이 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질 (3R:1S)로서 분리되는 식물주의 비율을 결정하기 위해 내성 및 감수성 식물을 계수하였다. 이들 데이타는 dgt-28이 외떡잎식물 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능함을 입증한다. dgt-28 유전자에 의해 제공된 내성 및 보호를 추가로 특성화하기 위해, 증가된 비율의 글리포세이트를 T1 또는 F1 생존체에 적용하였다.
dgt-28 형질전환된 T 0 옥수수에서 발아후 제초제 내성. TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23과 연결된 dgt-28의 T0 이벤트를 아그로박테리움 형질전환에 의해 생성하고, 2-4개의 새로운, 정상으로 보이는 잎이 윤생체로부터 출현할 때까지 제어된 성장 챔버 조건 하에 순응시켰다. 식물에 개별 식별 번호를 배정하고, dgt-28 및 aad-1 둘 모두의 카피수 분석을 위해 샘플링하였다. 카피수 분석에 기초하여, 식물을 단백질 발현 분석을 위해 선택하였다. 식물을 새로운 성장 배지가 담긴 더 큰 화분에 이식하고, 온실에서 27℃에서 16시간 명:8시간 암 조건 하에 성장시켰다. 이어서, 단백질 발현을 위해 샘플링되지 않은 나머지 식물을 2% w/v 황산암모늄을 부가한 두랑고 DMA™ (글리포세이트)의 시판 제제로 처리하였다. 처리제는 각각의 식물의 군이 상이한 카피수의 T0 이벤트를 함유하도록 분배하였다. 제초제 적용은 분무 부피 187 L/ha, 분무 높이 50 cm에서 트랙 분무기로 실시하였다. T0 식물에 형질전환되지 않은 옥수수 식물주에 유의한 손상을 야기할 수 있는 280 - 4480 g ae/ha 글리포세이트에서 글리포세이트를 분무하였다. 치사 용량은 B104 동계교배체에 >95% 손상을 야기하는 비율로서 규정된다. B104는 형질전환체의 유전적 배경이었다.
T0 dgt-28 옥수수 식물의 결과는 글리포세이트에 대한 내성이 4480 g ae/ha 이하에서 달성됨을 보여주었다 (표 19). 비-형질전환된 대조군에 비해 형질전환된 식물의 최소 발육 저지 및 전체 식물 성장은 dgt-28이 TraP5, TraP8, 및 TraP23에 연결될 때 글리포세이트에 대한 강력한 보호를 제공함을 입증하였다.
Figure pct00029
표준 ELISA에 의한 단백질 발현 분석은 시험한 구축물에 걸쳐 12.6 - 22.5 ng/cm2의 DGT-28 단백질의 평균 범위를 입증하였다.
온실 조건 하에 F 1 세대에서 글리포세이트 내성의 확인. 분무하지 않은 단일 카피 T0 식물을 다음 세대에서 추가의 특성화를 위해 비-형질전환된 배경 B104에 역교배시켰다. T1 세대에서, 글리포세이트 내성은 dgt-28 유전자의 유전가능성을 확인하기 위해 평가하였다. T1 식물에 대해, 제초제 어슈어 (ASSURE) II™ (35 g ae/ha 퀴잘로포프-메틸)을 AAD-1 단백질을 선택하기 위해 V1 성장기에 적용하였다. 선택가능한 마커 및 글리포세이트 저항성 유전자 둘 모두 동일한 플라스미드 상에 제작하였다. 따라서, 하나의 유전자가 선택될 경우, 두 유전자가 존재할 것으로 생각된다. 7 DAT에, 내성 및 감수성 식물을 계수하고, 무효의 (null) 식물을 집단으로부터 제거하였다. 이들 데이타는 dgt-28 (v1)이 외떡잎식물 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능함을 입증한다. 식물을 표준 ELISA 및 RNA 전사체 수준에 의한 DGT-28 단백질의 특성화를 위해 샘플링하였다. 저항성 식물에 앞서 설명된 바와 같이 560-4480 g ae/ha 글리포세이트를 분무하였다. 데이타는 4480 g ae/ha 글리포세이트 이하까지, 엽록체 수송 펩티드 TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23에 연결된 dgt-28의 강력한 내성을 입증한다 (표 20).
Figure pct00030
단백질 발현 데이타는 T1 이벤트 및 시험된 구축물에 걸쳐 42.2 - 88.2 ng/cm2의 평균 DGT-28 단백질을 보여주고, 이것은 T1 세대에서 단백질 발현의 확립을 제시한다.
경작지 조건 하에서의 dgt-28 옥수수의 특성화. 추가의 특성화를 위한 교잡 반접합성 및 동계교배 동종접합성 종자를 모두 생성하기 위해 단일 카피 T1 이벤트를 경작 부지로 보냈다. 교잡 종자는 옥수수 형질전환 식물주 B104 내의 T1 이벤트를 동계교배 식물주 4XP811와 교배하여 이벤트에 대해 1:1 (반접합성:무효)로 분리되는 교잡 집단을 생성함으로써 생성하였다. 생성되는 종자는 2개의 별개의 장소로 수송하였다. 구축물당 총 5개의 단일 카피 이벤트를 완전 임의 블록 설계로 각각의 장소에 삼중으로 식재하였다. 경작지는 V4 성장기에 글리포세이트를 적용하고 별개의 식물군에 대해 V8 성장기에 적용하도록 설계하였다. 4XP811/B104 통상적인 교잡종을 음성 대조군으로 사용하였다.
실험 열 (row)을 무효의 분리 개체를 제거하기 위해 184 g ae/ha 어슈어 II™ (106 g ai/L 퀴잘로포프-메틸)로 처리하였다. 모든 실험 대상은 어슈어 II™ 적용에 대해 1:1 (감수성:내성)으로 분리되었다 (p=0.05). 선택된 저항성 식물은 표준 ELISA에 의해 DGT-28 단백질의 정량을 위해 각각의 이벤트로부터 샘플링하였다.
퀴잘로포프-메틸 저항성 식물을 V4 또는 V8 성장기에2.5% w/v 황산암모늄을 부가한 시판 제초제 두랑고 DMA™ (480 g ae/L 글리포세이트)로 처리하였다. 제초제 적용은 부피 187 L/ha, 50 cm 분무 높이를 전달하도록 보정된 붐 분무기를 사용하여 수행하였다. 식물에 형질전환되지 않은 옥수수 식물주에 유의한 손상을 야기할 수 있는 1120 - 4480 g ae/ha 글리포세이트에서 글리포세이트를 분무하였다. 치사 용량은 4XP811 동계교배체에 >95% 손상을 야기하는 비율로서 규정된다. 가시적인 손상 평가는 7, 14 및 21 DAT (처리 후 일)에 가시적인 황백화의 비율, 괴사의 비율, 성장 억제의 비율 및 총 가시적인 손상에 대해 시행하였다. 평가를 각각의 식물주 및 음성 대조군에 대한 비처리된 검사와 비교하였다.
모든 평가 타이밍에 대한 가시적인 손상 데이타는 장소 및 적용 타이밍 둘 모두에서 4480 g ae/ha 두랑고 DMA™ 이하까지 강력한 내성을 입증하였다. V4 적용을 위한 대표적인 이벤트는 하나의 장소로부터 제시되고, 다른 이벤트, 적용 타이밍 및 장소와 일치하였다 (표 21). TraP23 (pDAB107665)와 연결된 dgt-28을 함유하는 구축물로부터의 한 이벤트는 AAD-1 단백질에 대한 어슈어 II™ 선택에 내성이지만, 모든 비율의 적용된 글리포세이트에 대해 감수성이었다.
Figure pct00031
추가의 평가는 4480 g ae/ha 글리포세이트 비율에 대해 번식 성장기 동안 실시하였다. 옥수수 수염 (tassel), 수분 타이밍 및 이삭 충전의 가시적인 평가는 모든 구축물, 적용 타이밍 및 장소에 대해 각각의 식물주의 비처리된 검사와 유사하였다. DGT-28 단백질에 대한 정량 결과는 186.4 - 303.0 ng/cm2의 평균 단백질 발현을 보여주었다. 데이타는 4480 g ae/ha 글리포세이트 이하까지 번식 성장기를 통해 경작지 조건 하에 dgt-28 형질전환된 옥수수의 강력한 내성을 입증한다. 데이타는 또한 분무 내성 결과를 기초로 하여 DGT-28 단백질 검출 및 기능을 입증하였다.
동종접합성 상태에서 dgt-28 옥수수의 유전가능성 및 내성의 확인. T1S2로부터의 종자를 앞서 설명된 바와 같이 온실 조건 하에 식재하였다. 경작지 조건 하에 특성화된 동일한 5개의 단일 카피 식물주를 균질한 상태에서 특성화하였다. 식물을 V3 성장기까지 성장시키고, 1120-4480 g ae/ha 글리포세이트 (두랑고 DMA™) 범위의 3개 비율의 글리포세이트 및 처리당 4중으로 분리하였다. 적용은 앞서 설명된 바와 같이 트랙 분무기로 실시하고, 2.0% w/v 황산암모늄 내에 제제화하였다. 황산암모늄의 적용은 각각의 식물주에 대한 비처리된 검사로서 기능하였다. 가시적인 평가를 앞서 설명된 바와 같이 처리 7 및 14일 후에 실시하였다. 데이타는 시험된 모든 이벤트에 대해 4480 g ae/ha 글리포세이트 이하까지 강력한 내성을 입증하였다 (표 22).
Figure pct00032
경작지 조건 하에 내성이 아닌 pDAB107665로부터의 식물주는 글리포세이트에 대한 내성을 보이지 않았고, 따라서 경작지 관찰과 일치하였다 (데이타를 제시하지 않음). 앞서 언급된 하나의 식물주를 제외하고, 식물주로부터의 글리포세이트로 처리된 모든 반복시험체는 글리포세이트에 대해 감수성이 아니었다. 따라서, 데이타는 dgt-28 옥수수의 균질한 집단의 멘델 유전 방식의 유전가능성을 보여준다. 표준 ELISA에 의한 DGT-28 단백질의 발현은 글리포세이트에 내성인 단일 카피 이벤트에 걸쳐 27.5 - 65.8 ng/cm2의 평균 단백질 발현을 보였다. 데이타는 세대에 걸쳐 DGT-28 단백질의 기능적 단백질 및 안정성을 입증한다.
실시예 12: 선택가능한 마커로서 글리포세이트의 발아후 제초제 내성의 용도
앞서 설명된 바와 같이, T0 형질전환된 식물을 조직 배양액으로부터 분리하고, 온실에서 순응시켰다. 시험된 이벤트는 TraP5, TraP8, 및 TraP23 엽록체 수송 펩티드에 연결된 dgt-28을 함유하였다. 상기 T0 식물은 4480 g ae/ha 글리포세이트 이하까지 강력한 내성을 제공하였고, 비-형질전환된 식물은 280 g ae/ha의 낮은 농도에서 글리포세이트로 방제되었음이 입증되었다. 이들 데이타는 dgt-28이 280 - 4480 g ae/ha의 글리포세이트 농도를 사용하여 선택가능한 마커로서 이용될 수 있음을 입증한다.
dgt-28 도입 유전자를 함유하는 옥수수의 고정된 식물주로부터의 많은 종자를 많은 비-형질전환된 옥수수 종자 내에 섞었다. 종자를 식재하고, V1-V3 발달기로 성장시키고, 이 때 묘목에 280 - 4480 g ae/ha의 글리포세이트 선택 용량을 분문하였다. 7-10일 후에, 감수성 및 내성 식물을 계수하였고, 글리포세이트 내성 식물의 양은 식재된 dgt-28 도입 유전자를 함유하는 트랜스제닉 종자의 원래의 수와 연관성이 있었다.
실시예 13: dgt-28 옥수수의 집적
AAD-1 단백질을 연구 목적을 위해 dgt-28 형질전환된 옥수수에 선택가능한 마커로서 사용하였다. aad-1 유전자는 또한 작물에서 V8 적용까지 강력한 2,4-D 내성을 제공하기 위해 옥수수에서 제초제 내성 형질로서 이용될 수 있다. 구축물 pDAB107663 (TraP4::dgt-25), pDAB107664 (TraP8::dgt-28) 및 pDAB107666 TraP5::dgt-28)로부터의 4개의 이벤트를 글리포세이트 및 2,4-D의 탱크 혼합 적용의 내성에 대해 특성화하였다. 특성화 연구는 온실 조건 하에서 F1 종자를 사용하여 완료하였다. 적용은 다음 비율로 앞서 설명된 바와 같이 트랙 분무기를 사용하여 실시하였다: 1120-2240 g ae/ha 글리포세이트 (dgt-28 유전자에 대해 선택적), 1120-2240 g ae/ha 2,4-D (aad-1 유전자에 대해 선택적), 또는 설명된 비율의 두 제초제의 탱크 혼합물. 식물을 7 및 14 DAT에 평가하였다. 2240 g ae/ha에서 제초제의 적용을 위한 분무 결과를 표 23에 제시한다.
Figure pct00033
결과는 dgt-28이 aad-1과 성공적으로 집적되고, 따라서 관심있는 작물에 적용될 수 있는 스펙트럼 제초제 (각각 dgt-28 및 aad-1에 대해 글리포세이트 + 페녹시아세트산)를 증가시킬 수 있음을 확인해준다. 방제가 어려운 활엽 잡초 또는 저항성 잡초 생물형이 존재하는 작물 생산에서, 집적물이 잡초 방제 및 관심있는 작물의 보호 수단으로서 사용될 수 있다. 추가의 투입 또는 생산 형질이 또한 옥수수 및 다른 식물에서 dgt-28 유전자와 집적될 수 있다.
실시예 14: 다른 작물의 형질전환
공지의 기술을 이용하여 추가의 작물을 형질전환시켰다. 호밀의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye", Transgenic Res. 2003 Oct;12(5):587-96]을 참조한다. 수수의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Zhao et al., "Agrobacterium-mediated sorghum transformation," Plant Mol Biol. 2000 Dec;44(6):789-98]을 참조한다. 보리의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Tingay et al., "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation", The Plant Journal, (1997) 11: 1369-1376]을 참조한다. 밀의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Cheng et al., "Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens", Plant Physiol. 1997 Nov; 115(3):971-980]을 참조한다. 벼의 아그로박테리움-매개 형질전환에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens", Plant Mol. Biol. 1997 Sep;35(1-2):205-18]을 참조한다.
다른 (비-아그로박테리움) 형질전환 기술은 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33을, 예를 들어 옥수수 (제아 메이즈), 밀 (트리티쿰 종), 벼 (오리자 종 및 지자니아 (Zizania) 종), 보리 (호르데움 종), 면화 (아브로마 아우구스타 (Abroma augusta) 및 고시퓸 종), 대두 (글라이신 맥스), 사탕무우 및 채소용 비트 (table beet) (베타 (Beta) 종), 사탕수수 (아렌가 피나타 (Arenga pinnata)), 토마토 (리코페르시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum) 및 다른 종, 피살리스 익소카르파 (Physalis ixocarpa), 솔라눔 인카눔 (Solanum incanum) 및 다른 종 및 시포만드라 베타세아 (Cyphomandra betacea)), 감자 (솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum)), 고구마 (이포모에아 바타타스 (Ipomoea batatas)), 호밀 (세칼레 (Secale) 종), 고추 (캅시쿰 아누움 (Capsicum annuum), 치넨세 (chinense), 및 프루테센스 (frutescens)), 상추 (락투카 사티바 (Lactuca sativa), 페레닌스 (perennis), 및 풀첼라 (pulchella)), 양배추 (브라시카 종), 셀러리 (아피움 글라베올렌스 (Apium graveolens)), 가지 (솔라눔 멜롱게나 (Solanum melongena)), 땅콩 (아라키스 히포게아 (Arachis hypogea)), 수수 (소르검 (Sorghum) 종), 알팔파 (메디카고 사티바 (Medicago sativa)), 당근 (다우쿠스 카로타 (Daucus carota)), 콩 (파세올루스 (Phaseolus) 종 및 다른 속), 귀리 (아베나 사티바 (Avena sativa) 및 스트리고사 (strigosa)), 완두콩 (피숨 (Pisum), 비그나 (Vigna), 및 테트라고놀로부스 (Tetragonolobus) 종), 해바라기 (헬리안투스 아누우스 (Helianthus annuus)), 호박 (쿠쿠르비타 종), 오이 (쿠쿠미스 사티바 (Cucumis sativa)), 담배 (니코티아나 종), 아라비돕시스 (아라비돕시스 탈리아나), 잔디풀 (롤륨 (Lolium), 아그로스티스 (Agrostis), 포아 (Poa), 시노돈 (Cynodon), 및 다른 속), 클로버 (트리폴륨 (Trifolium)), 살갈귀 (비시아 (Vicia)) 내로 형질전환시키기 위해 사용된다.
dgt-28, dgt-32, 및 dgt-33에 의해 부여되는 글리포세이트 저항성은 많은 낙엽성 및 상록 수목 재배 시스템에서 제철 (in-season) 사용을 위한 글리포세이트 제초제의 적용성을 증가시킨다. 글리포세이트 제초제 저항성 수목 종은 손상 우려 없이 이들 제초제의 표면 살포 적응성을 증가시킨다. 따라서, dgt-28, dgt-32, 및/또는 dgt-33은 다음 수목 종 내로 형질전환된다: 오리나무 (알누스 (Alnus) 종), 물푸레나무 (프락시누스 (Fraxinus) 종), 사시나무 및 포플러 종 (포풀루스 (Populus) 종), 너도밤나무 (파구스 (Fagus) 종), 자작나무 (베툴라 (Betula) 종), 체리 (프루누스 (Prunus) 종), 유칼립투스 나무 (유칼립투스 (Eucalyptus) 종), 히코리 (카리아 (Carya) 종), 단풍나무 (에이서 (Acer) 종), 오크 (쿼쿠스 (Quercus) 종), 및 소나무 (피누스 (Pinus) 종).
글리포세이트 제초제 내성은 관상 및 열매 맺는 종에서 선택적인 잡초 방제를 위한 글리포세이트 제초제의 적용성을 증가시킨다. 따라서, dgt-28, dgt-32, 및/또는 dgt-33은 다음과 같은 관상 및 열매 맺는 종 내로 형질전환된다: 장미 (로사 (Rosa) 종), 버닝 부쉬 (burning bush) (유오니무스 (Euonymus) 종), 페튜니아 (페튜니아 (Petunia) 종), 베고니아 (베고니아 (Begonia) 종), 진달래속 (로도덴드론 (Rhododendron) 종), 크랩애플 (crabapple) 또는 사과 (말루스 (Malus) 종), 배 (피루스 (Pyrus) 종), 복숭아 (프루누스 종), 및 마리골드 (타게테스 (Tagetes) 종).
실시예 15: 다른 형질과의 집적
곤충 저항성 (IR) 형질을 함유하는 트랜스제닉 작물은 북미 전체에 걸쳐 옥수수, 대두, 및 면화 식물에서 널리 퍼져 있고, 상기 형질의 사용 빈도는 전세계적으로 확대되고 있다. 곤충 저항성 및 제초제 내성 (HT) 형질을 조합한 상업적인 트랜스제닉 작물이 다수의 종자 회사에서 개발되었다. 이들은 바실러스 투링기엔시스 형질 (예를 들어, 웹사이트 lifesci.sussex.ac.uk, 2006에 나열된 Bt 독소), 비-Bt 곤충 저항성 형질, 및 상기 언급한 임의의 또는 모든 HT 형질을 포함한다. IR 형질을 통해 다수의 해충 문제를 해결하는 능력은 가치있는 상업적인 제품 개념이다. 그러나, 상기 제품 개념의 편의성은 잡초 방제 및 곤충 방제가 서로 독립적일 경우 제한될 것이다.
단독으로 또는 하나 이상의 추가의 HT 형질과 집적된 Dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33을 통상적인 육종을 통해 또는 신규한 형질전환 이벤트로서 함께 하나 이상의 추가의 투입 형질 (예를 들어, 곤충 저항성, 진균 저항성, 또는 스트레스 내성 등) (www.isb.vt.edu 참조)과 집적시켰다. IR 형질(들)을 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33과 집적어도. IR 형질의 코딩 서열을 얻은 후, 발현 요소 (예를 들어, 프로모터, 인트론, 3'UTR 등)를 부가하고, IR 형질을 재조합 DNA 방법을 통해 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33과 분자적으로 집적시켰다.
IR 형질은 다음을 포함한다: Cry1F (미국 특허 5,126,133; 5,188,960; 5,691,308; 6,096,708; 6,573,240; 및 6,737,273), Cry1A(c) (미국 특허 6,114,138; 5,710,020; 6,251,656; 및 6,229,004), Cry1F 및 Cry1A(c) (dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33과의 삼중 집적물로서), Cry34Ab(1) (미국 특허 7,323,556; 7,897,342; 7,888,495; 7,875,430; 7,932,033; 7,956,246; 6,340,593), Cry35 Ab(1) (미국 특허 미국 특허 6,340,593; 7,323,556; 7,897,342; 7,888,495; 7,875,430; 7,932,033; 7,956,246), 및/또는 Cry35Ab(1) 및 Cry34Ab(1) (dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33과의 삼중 집적물로서).
이익은 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33에 의해 제공되고 곤충 해충 및/또는 다른 작물학적 스트레스를 처리하는 능력과 연결된 선행 실시예에서 설명된 개선된 잡초 방제를 포함한다. dgt-28, dgt-32, 및/또는 dgt-33과 집적된 상기 형질을 포함하는 식물은 임의의 많은 작물학적 문제를 탄력적이고 비용 효과적으로 제어하는 능력을 개선된 작물 품질의 완전한 작물학적 패키지에 제공한다. 조합된 IR 및 HT 형질은 대부분의 작물학적 및 원예/관상 작물 및 삼림 관리에서 적용된다.
dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33, 및 임의의 수의 Bt 또는 비-Bt IR 유전자에 의해 제공되는 적합한 제초제 내성 및 곤충 저항성의 조합은 본원에 나열한 작물 종에 적용될 수 있다. 상기 작물에서 본원에 나열된 임의의 다양한 시판 제초제의 사용은 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33 형질전환 및 통상적인 육종 또는 유전공학에 의해 대응하는 HT 형질 또는 IR 형질과의 집적에 의해 가능해진다. 상기 화학을 대표하는 제초제의 구체적인 적용 비율은 CPR (Crop Protection Reference) 서적 또는 유사한 편집에서 편집된 제초제 라벨, 온라인에서 편집된 라벨 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp), 또는 임의의 상업적인 또는 학술적인 작물 보호 지침, 예컨대 문헌 [Crop Protection Guide from Agriliance (2005)]에 의해 결정된다.
실시예 16: 임의의 옥수수에서 AAD 형질과 집적된 DGT 형질
dgt 형질을 통상적인 육종을 통해 또는 함께 신규한 형질전환 이벤트로서 aad 형질 (예를 들어, 미국 특허 7,838,733에 기재된 aad-1; 또는 PCT 국제 특허 공개 WO 2007/053482 A2에 기재된 aad-12)과 집적함으로써, 잡초 방제 효능, 탄력성, 및 잡초 이동을 처리하는 능력 및 제초제 내성 발생이 개선된다.
작물을 aad-1로 형질전환시키면 재배자는 아릴옥시알카노에이트 제초제를 외떡잎 작물에 선택적으로 적용할 수 있다. 상기 외떡잎 작물은 보다 높은 페녹시 옥신 안전성 범위를 가질 것이다. 추가로, 페녹시 옥신을 선택적으로 aad-1로 형질전환된 쌍떡잎 작물에 적용할 수 있다. 작물을 aad-12로 형질전환시키면 재배자는 잡초 종을 방제하기 위해 피리딜옥시 옥신 및 아릴옥시알카노에이트 제초제를 쌍떡잎 작물에 선택적으로 적용할 수 있다. dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33을 aad-1 또는 aad-12 형질과 집적함으로써, 재배자에게 잡초 관리를 위한 보다 광범위 스펙트럼의 제초제가 제공된다. 또한, 제초제 조합을 사용하면, 잡초 종 내의 제초제 내성을 처리하기 위한 보다 많은 탄력성을 얻을 수 있다.
dgt 형질 및 aad 형질이 임의의 외떡잎 또는 쌍떡잎 작물 종에서 집적된 식물에 대한 다음과 같은 잡초 방제 방법이 제공된다:
A. 글리포세이트는 대부분의 초본 및 활엽 잡초 종의 방제를 위해 표준 발아후 적용 비율 (420 내지 2160 g ae/ha, 예를 들어, 560 내지 1120 g ae/ha)에서 적용한다. dgt 형질은 글리포세이트의 상기 적용 비율에서 내성을 제공할 수 있다. 글리포세이트 저항성 활엽 잡초, 예를 들어 코니자 카나덴시스 (Conyza canadensis) 또는 글리포세이트를 사용하여 방제하기가 본질적으로 어려운 잡초 (예를 들어, 코멜리나 (Commelina) 종)의 방제를 위해, 280-2240 g ae/ha (예를 들어, 560-1120 g ae/ha)의 2,4-D가 추가의 방제를 제공하기 위해서 순차적으로, 탱크 혼합되거나, 또는 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용된다. aad-1 및 aad-12 둘 모두는 2,4-D에 대한 내성을 제공한다. 추가로, aad-12는 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 트리클로피르 및 플루옥시피르에 대한 내성을 제공한다. 피리딜옥시 옥신 제초제는 코니자 카나덴시스 및 코멜리나 종과 같은 글리포세이트 저항성 활엽 잡초를 방제하기 위해 적용된다. 트리클로피르의 경우, 적용 비율은 일반적으로 70-1120 g ae/ha, 예를 들어, 140-420 g ae/ha이다. 플루옥시피르의 경우, 적용 비율은 일반적으로 35-560 g ae/ha, 예를 들어, 70-280 ae/ha이다.
B. 글리포세이트는 대부분의 초본 및 활엽 잡초 종의 방제를 위해 표준 발아후 적용 비율 (420 내지 2160 g ae/ha, 예를 들어, 560 내지 1120 g ae/ha)에서 적용된다. 글리포세이트 내성 초본 종, 예들 들어 롤륨 리기둠 (Lolium rigidum) 또는 엘류신 인디카 (Eleusine indica)의 방제를 위해, 10-200 g ae/ha (예를 들어, 20-100 g ae/ha) 퀴잘로포프가 효과적인 방제를 제공하기 위해서 순차적으로, 탱크 혼합되거나, 또는 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용된다. Aad-1은 퀴잘로포프에 대한 내성을 제공한다. 작물 종에서 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33과 조합된 aad-1의 집적은 상기 설명된 제초제에 내성인 작물을 생성한다.
C. 글리포세이트는 활엽 잡초 종 이외의 다른 초본 종 방제에 효과가 있다. Aad-1 및 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33 집적 형질은 초본-효과적인 비율의 글리포세이트 (105-840 g ae/ha, 예를 들어, 210-420 g ae/ha)의 적용을 허용한다. 2,4-D (280-2240 g ae/ha, 예를 들어, 560-1120 g ae/ha)가 이어서 필요한 활엽 잡초 방제를 제공하기 위해서 순차적으로, 탱크 혼합되거나, 또는 초본-효과적인 비율의 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용된다. 10-200 g ae/ha (예를 들어, 20-100 g ae/ha and 20-35 g ae/ha)에서 퀴잘로포프와 같은 AOPP 제초제는 보다 강력한 초본 잡초 방제를 위해 및/또는 글리포세이트 저항성 초본의 발생 지연을 위해 사용된다. 낮은 비율의 글리포세이트도 활엽 잡초 방제에 일부의 이점을 제공하지만; 1차 방제는 2,4-D에 의한 것이다.
D. 마찬가지로, aad-12 및 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33 집적 형질은 초본-효과적인 비율의 글리포세이트 (105-840 g ae/ha, 예를 들어, 210-420 g ae/ha)의 적용을 허용한다. 2,4-D (280-2240 g ae/ha, 예를 들어, 560-1120 g ae/ha)는 이어서 필요한 활엽 잡초 방제를 제공하기 위해서 순차적으로, 탱크 혼합되거나, 또는 초본-효과적인 비율의 글리포세이트와의 예비혼합물로서 적용된다. 상기 언급된 비율에서 사용되는 트리클로피르 및 플루옥시피르가 또한 처리 방법에 허용되는 성분이다. 낮은 비율의 글리포세이트도 활엽 잡초 방제에 일부의 이점을 제공하지만; 1차 방제는 2,4-D, 트리클로피르, 또는 플루옥시피르에 의한 것이다.
하나 이상의 시판 아릴옥시 옥신 제초제를 단독으로 또는 조합하여 (순차적으로 또는 독립적으로) 사용하는 것은 작물 내로의 aad-12 형질전환에 의해 용이해진다. 마찬가지로, 하나 이상의 시판 페녹시 옥신 제초제를 단독으로 또는 하나 이상의 시판 AOPP 제초제와 조합하여 (순차적으로 또는 독립적으로) 사용하는 것은 aad-1에 의해 용이해진다. 상기 형질과 dgt-28, dgt-32, 또는 dgt-33의 집적은 잡초 종의 보다 강력한 처리를 허용한다. 상기 화학을 대표하는 제초제의 구체적인 적용 비율은 CPR (Crop Protection Reference) 서적 또는 유사한 편집에서 편집된 제초제 라벨, 온라인에서 편집된 라벨 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp), 또는 임의의 상업적인 또는 학술적인 작물 보호 지침, 예컨대 문헌 [Crop Protection Guide from Agriliance (2005)]에 의해 결정된다.
실시예 17: 임의의 옥수수에서 AHAS 형질과 집적된 dgt-28
이미다졸리논 제초제 내성 (AHAS)을 코딩하는 형질은 현재 옥수수, 벼, 해바라기, 및 밀을 포함하고 이로 제한되지 않는, 북미 지역에 식재된 많은 작물에 존재한다. 추가의 이미다졸리논 내성 작물 (예를 들어, 면화 및 사탕무우)이 개발되고 있다. 많은 이미다졸리논 제초제 (예를 들어, 이마자목스, 이마제타피르, 이마자퀸, 및 이마자픽)는 현재 다양한 통상적인 작물에서 선택적으로 사용된다. 이마제타피르, 이마자목스, 및 비-선택적 이마자피르의 사용은 AHAS와 같은 이미다졸리논 내성 형질을 통해 용이해졌다. 현재까지 이미다졸리논 내성 HTC는 비-트랜스제닉이라는 이점을 갖는다. 상기 화학 클래스는 또한 유의한 토양 잔류 활성을 갖고, 따라서 글리포세이트 또는 글루포시네이트-기반 시스템과 달리 적용 타이밍을 넘어 연장되는 잡초 방제를 제공할 수 있다. 그러나, 이미다졸리논 제초제에 의해 방제되는 잡초의 스펙트럼은 글리포세이트만큼 넓지 않다 (Agriliance, 2003). 추가로, 이미다졸리논 제초제는 많은 잡초에서 저항성이 발생한 작용 방식 (아세토락테이트 신타제 ALS의 억제)을 갖는다 ([Heap I (2004). The international survey of herbicide resistant weeds], www.weedscience.com에서 이용가능).
Dgt-28은 통상적인 육종을 통해 또는 함께 신규한 형질전환 이벤트로서 이미다졸리논 내성 형질과 집적되고, 잡초 방제 효능, 탄력성, 및 잡초 이동을 처리하는 능력 및 제초제 저항성 발생이 개선된다.
dgt 형질 및 이미다졸리논 내성 형질이 임의의 외떡잎 또는 쌍떡잎 작물 종에서 집적된 식물에 대한 다음과 같은 잡초 방제 방법이 제공된다:
A. 이마제타피르는 많은 초본 및 활엽 잡초 종의 방제를 위해 표준 발아후 적용 비율 (35 내지 280 g ae/ha, 예를 들어, 70-140 g ae/ha)로 적용된다.
i) ALS-억제제 저항성 활엽 잡초, 예를 들어 아마란투스 루디스 (Amaranthus rudis), 암브로시아 트리피다 (Ambrosia trifida), 체노포듐 알붐 (Chenopodium album) (특히, [Heap, 2004])은 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 예를 들어, 560 내지 1120 g ae/ha에서 탱크 혼합함으로써 방제된다.
ii) 이미다졸리논 제초제에 본질적으로 보다 내성인 활엽 종, 예를 들어 이포모에아 종은 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 예를 들어, 560 내지 1120 g ae/ha에서 탱크 혼합함으로써 방제된다.
iii) ALS-억제제 저항성 초본 잡초, 예를 들어 소르검 할레펜세 (Sorghum halepense) 및 롤륨 종은 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 예를 들어, 560 내지 1120 g ae/ha에서 탱크 혼합함으로써 방제된다.
iv) 본질적으로 내성인 초본 잡초 종 (예를 들어, 아그로피론 레펜스 (Agropyron repens))은 글리포세이트를 420 내지 2160 g ae/ha, 예를 들어, 560 내지 1120 g ae/ha에서 탱크 혼합함으로써 방제된다.
단독으로 또는 다수의 조합으로 임의의 다양한 시판 이미다졸리논 제초제 또는 글리포세이트 제초제는 dgt-28 형질전환 및 통상적인 육종 또는 유전공학에 의한 임의의 이미다졸리논 내성 형질과의 집적에 의해 용이해진다. 상기 화학을 대표하는 다른 제초제의 구체적인 적용 비율은 CPR (Crop Protection Reference) 서적 또는 유사한 편집에서 편집된 제초제 라벨, 온라인에서 편집된 라벨 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp), 또는 임의의 상업적인 또는 학술적인 작물 보호 지침, 예컨대 문헌 [Crop Protection Guide from Agriliance (2005)]에 의해 결정된다.
실시예 18: 대두 형질전환
안정적으로 통합된 dgt-28 도입 유전자를 함유하는 트랜스제닉 대두 (글라이신 맥스)는 대두 자엽절 외식편의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 생성된다. 기능적 dgt-28을 함유하는 2원 벡터를 보유하는 디스암드 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.
아그로박테리움-매개 형질전환은 문헌 [Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482)]의 변형된 1/2-자엽절 절차를 이용하여 수행한다. 간단히 설명하면, 대두 종자 (cv. 매버릭 (Maverick))를 기초 배지에서 발아시키고, 자엽절을 분리하고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 싹 개시, 싹 성장, 및 착근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충하였다. 제초제를 통한 선택은 비-형질전환된 싹의 성장을 억제하기 위해 사용하였다. 선택된 싹을 뿌리 발생을 위해착근 배지에 옮긴 후, 묘목의 적응을 위해 토양 믹스에 옮겼다.
선택된 묘목의 말단 소엽을 추정되는 형질전환체에 대해 스크리닝하기 위해 제초제로 국소적으로 (잎 칠하기 (paint) 기술) 처리하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮기고, 순응시킨 후, 내성을 재확인하기 위해 제초제를 잎에 칠하였다. 이들 추정되는 형질전환된 T0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 제초제 선택가능한 마커, 및 dgt-28 도입 유전자의 존재를 확인하였다. T0 식물을 온실에서 자가수정시켜 T1 종자를 생산하였다.
제2 대두 형질전환 방법을 추가의 트랜스제닉 대두 식물을 생산하기 위해 사용할 수 있다. 기능적 dgt-28을 함유하는 2원 벡터를 보유하는 디스암드 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.
아그로박테리움-매개 형질전환은 문헌 [Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213)]의 변형된 1/2-종자 절차를 이용하여 수행한다. 간단히 설명하면, 성숙 대두 종자를 염소 기체를 사용하여 밤새 멸균하고, 아그로박테리움-매개 식물 형질전환 20시간 전에 멸균 H2O를 스며들게 하였다. 종자를 분리하고 종자 외피를 제거하기 위해 종자를 배꼽 (hilum)을 따라 종방향 절단에 의해 절반으로 절단하였다. 배축을 절제하고, 임의의 축방향 (axial) 싹/눈을 자엽절로부터 제거하였다. 생성되는 1/2의 종자 외식편을 아그로박테리움으로 감염시켰다. 싹 개시, 싹 성장, 및 착근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴 및 반코마이신을 보충하였다. 제초제를 통한 선택은 비-형질전환된 싹의 성장을 억제하기 위해 사용하였다. 선택된 싹을 뿌리 발생을 위해 착근 배지에 옮긴 후, 묘목의 적응을 위해 토양 믹스에 옮겼다.
선택된 묘목의 말단 소엽을 추정되는 형질전환체에 대해 스크리닝하기 위해 제초제로 국소적으로 (잎 칠하기 기술) 처리하였다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮기고, 순응시킨 후, 내성을 재확인하기 위해 제초제를 잎에 칠하였다. 이들 추정되는 형질전환된 T0 식물을 샘플링하고, 분자 분석을 사용하여 선택가능한 마커, 및 dgt-28 도입 유전자의 존재를 확인하였다. 여러 이벤트가 도입 유전자를 함유하는 것으로 확인되었다. 이들 T0 식물을 추가의 분석을 위해 사용하고, 온실에서 자가수정시켜 T1 종자를 생산하였다.
dgt-28의 T 1 세대로의 유전가능성의 확인. DGT-28 단백질의 T1 세대로의 유전가능성을 두 방법 중의 하나로 평가하였다. 제1 방법은 T1 종자를 메트로-믹스 (Metro-mix) 배지 내에 식재하고, 411 g ae/ha 이그나이트™ 280 SL을 발아한 식물에 제1 3엽 성장기에 적용하는 것을 포함하였다. 제2 방법은 볼 베어링 (ball bearing) 및 제노그라인더 (genogrinder)를 사용하여 총 8개의 반복시험체에 대해 종자를 균질화하는 것으로 이루어졌다. 이어서, PAT 단백질에 대해 검출하기 위한 ELISA 스트립 (strip) 시험이, 선택가능한 마커가 dgt-28과 동일한 플라스미드 상에 존재하기 때문에 유전가능한 이벤트를 검출하기 위해 사용되었다. 어느 방법이든 단일 식물이 글루포시네이트에 내성이거나 PAT ELISA 스트립 시험으로 검출될 경우, 이벤트는 T1 세대로의 유전가능성을 보인 것이다.
총 5개의 구축물을 앞서 설명된 바와 같이 유전가능성에 대해 스크리닝하였다. 플라스미드는 TraP4, TraP8 및 TraP23과 연결된 dgt-28을 함유하였다. 구축물에 걸쳐 이벤트는 PAT::DGT-28 단백질의 T1 세대로의 68% 유전가능성을 보였다.
dgt-28 형질전환된 T 1 대두에서 발아후 제초제 내성. 앞서 설명된 스크리닝 방법에 의해 유전가능성인 것으로 결정된 T1 이벤트로부터의 종자를 온실 조건 하에 메트로-믹스 배지에 식재하였다. 식물을 제1 3엽이 충분히 확대할 때까지 성장시키고, 앞서 설명된 바와 같이 pat 유전자의 선택을 위해 411 g ae/ha 이그나이트™ 280 SL로 처리하였다. 각각의 이벤트로부터 저항성 식물에게 특유한 식별자를 부여하고, dgt-28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이타는 적용되는 각각의 비율의 글리포세이트에 2개의 반접합성 및 2개의 동종접합성 반복시험체를 할당하여 충분한 식물이 존재할 때 처리당 총 4개의 반복시험체를 허용하기 위해 사용되었다. 이들 식물을 야생형 페티트 하바나 (Petite havana) 담배와 비교하였다. 모든 식물을 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기로 분무하였다. 식물에게 560-4480 g ae/ha 두랑고™ 디메틸아민 염 (DMA)을 분무하였다. 모든 적용물은 2% w/v 황산암모늄 (AMS)을 첨가하면서 물 내에 제제화되었다. 식물을 처리 7 및 14일 후에 평가하였다. 식물에게 전체 가시적인 발육 저지, 황백화, 및 괴사에 대한 손상 등급을 부여하였다. T1 세대는 분리되고, 따라서 일부의 가변적인 반응이 접합성의 차이 때문에 예상된다.
Figure pct00034
T 2 세대에서 상승된 글리포세이트 비율에 대한 dgt -28 보호. 45개의 식물 자손체 시험을 구축물당 2 내지 5개의 dgt-28의 T2 식물주에 대해 수행하였다. 동종접합성 식물주는 선행 세대에서 완료된 접합성 분석을 기초로 하여 선택하였다. 종자를 앞서 설명된 바와 같이 식재하였다. 이어서, 앞서 설명된 바와 같이 pat 선택가능한 마커의 선택을 위해 식물에 411 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 분무하였다. 3 DAT에, 내성 및 감수성 식물을 계수하였다.
dgt-28과 연결된 TraP4를 함유하는 구축물 (pDAB107543 및 pDAB107548)에 대해, 시험된 12개의 식물주 중에서 9개는 분리되지 않아, T2 세대에서 균질한 식물주가 확인되었다. dgt-28과 연결된 TraP8을 함유하는 식물주 (pDAB107545)는 4개의 식물주 중 분리 개체가 없는 2개를 보였고, 대두에서 dgt-28의 적어도 2개의 세대를 통한 멘델 유전을 입증하였다. 조직 샘플을 저항성 식물로부터 채취하고, DGT-28 단백질을 표준 ELISA 방법에 의해 정량하였다. 데이타는 시험된 비-분리 T2 식물주에 대해 32.8 - 107.5 ng/cm2의 평균 DGT-28 단백질을 보여주었다. 구축물 pDAB107553 (Trap23::dgt-28)로부터의 식물주는 글루포시네이트로 앞서 선택되지 않았고, 글리포세이트의 용량 반응은 균질성 및 상승된 비율의 글리포세이트에 대한 내성을 시험하기 위해 이용되었다. 구축물 pDAB107553으로부터의 식물주의 반복시험체는 560-4480 g ae/ha 글리포세이트의 범위에 내성이고, 따라서 균질한 집단이고 적어도 2개의 세대에 유전가능함이 확인되었다.
560-4480 g ae/ha 글리포세이트의 두랑고 DMA의 비율을 앞서 설명된 바와 같이 2-3 3엽 대두에 적용하였다. 14 DAT의 가시적인 손상 데이타는 T1 세대에서 입증된 내성 결과를 확인해주었다
Figure pct00035
실시예 19: dgt-28을 사용한 벼의 형질전환
예시적인 형질전환 방법에서, 안정적으로 통합된 dgt-28 도입 유전자를 함유하는 트랜스제닉 벼 (오리자 사티바)는 멸균된 벼 종자의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 생성된다. 기능적 dgt-28을 함유하는 2원 벡터를 보유하는 디스암드 아그로박테리움 균주를 사용하여 형질전환을 개시하였다.
배양 배지의 pH를 1 M KOH를 사용하여 5.8로 조정하고, 2.5 g/l 피타겔 (Phytagel) (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스)로 고화시켰다. 배 형성 캘러스를 30 ml 반고체 배지가 담긴 100 x 20 mm 페트리 접시에서 배양하였다. 벼 묘목을 마젠타 (MAGENTA) 상자 내의 50 ml 배지에서 성장시켰다. 세포 현탁액을 35 mL 액체 배지가 담긴 125 ml 원뿔형 플라스크에서 유지하고, 125 rpm에서 회전시켰다. 배 형성 배양액의 유도 및 유지는 암소에서 25-26℃에서 시행하고, 식물 재생 및 전체 식물 배양은 16-h 광주기를 갖는 조명실에서 실시하였다 (Zhang et al. 1996).
배 형성 캘러스의 유도 및 유지는 이전에 설명된 바와 같이 (Li et al. 1993) 변형된 NB 기초 배지 상에서 수행하였고, 여기서 배지는 500 mg/L 글루타민을 함유하도록 조정되었다. 현탁 배양을 개시하고, 말토스 대신에 30 g/L 수크로스가 포함된 SZ 액체 배지 (Zhang et al. 1998)에서 유지하였다. 삼투 배지 (NBO)는 각각 0.256 M의 만니톨 소르비톨이 첨가된 NB 배지로 이루어졌다. 제초제 저항성 캘러스는 적절한 제초제 선택제가 보충된 NB 배지 상에서 3-4주 동안 선택하였다. 예비-재생은 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D), 1 mg/l α-나프탈렌아세트산 (NAA), 5 mg/l 아브시스산 (ABA) 및 선택적 제초제가 존재하는 NB 배지로 이루어진 배지 (PRH50) 상에서 1주 동안 수행하였다. 묘목의 재생은 추정되는 트랜스제닉 싹이 재생될 때까지 2,4-D, 0.5 mg/l NAA, 및 선택적 제초제를 함유하는 NB 배지를 포함하는 재생 배지 (RNH50) 상에서 배양함으로써 실시하였다. 싹을 1% 수크로스 및 선택적 제초제가 보충된, 1/2 강도의 무라시게 (Murashige) 및 스쿡 (Skoog) 기초 염 및 감보르그 (Gamborg)의 B5 비타민이 존재하는 착근 배지로 옮겼다.
오리자 사티바 엘. 자포니카 (L. japonica) cv. 타이페이 (Taipei) 309의 성숙 건조 종자를 문헌 [Zhang et al. 1996]에 기재된 바와 같이 멸균하였다. 배 형성 조직을 멸균 성숙 벼 종자를 NB 배지 상에서 암소에서 배양함으로써 유도하였다. 직경 약 1 mm의 1차 캘러스를 소순판로부터 제거하고, SZ 액체 배지 내에 세포 현탁을 개시하기 위해 사용하였다. 이어서, 현탁액을 [Zhang 1996]에 설명된 바와 같이 유지하였다. 현탁-유도 배 형성 조직을 선행 계대배양 3-5일 후에 액체 배양액으로부터 제거하고, 페트리 접시에 약 2.5 cm의 원을 형성하도록 NBO 삼투 배지에 넣고, 폭격 전에 4 h 동안 배양하였다. 폭격 16 내지 20시간 후에, 폭격된 표면이 위로 향하도록 보장하면서 조직을 NBO 배지로부터 NBH50 선택 배지 상으로 전달하고, 암소에서 14-17일 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 새로 형성된 캘러스를 본래의 폭격된 외식편으로부터 분리하고, 동일한 배지 부근에 두었다. 추가의 8-12일 후에, 비교적 치밀한, 불투명한 캘러스가 가시적으로 확인되었고, 7일 동안 암소에서 PRH50 예비-재생 배지로 옮겼다. 치밀하고 불투명해진 성장하는 캘러스를 이어서 14-21일의 기간 동안 16-h 광주기 하에 RNH50 재생 배지 상에 계대배양하였다. 재생하는 싹을 1/2 MSH50 배지를 함유하는 마젠타 상자로 옮겼다. 단일 외식편으로부터 재생된 다수의 식물은 자매체로 간주되고, 하나의 독립적 식물 식물주로서 처리하였다. 식물이 두껍고 흰 뿌리를 생산하고 1/2 MSH50 배지에서 왕성하게 성장하면, 식물을 dgt-28 유전자에 대해 양성으로 평가하였다. 묘목이 마젠타 상자의 상부에 도달하면, 1주일 동안 100% 습도 하에 6-cm 화분 내의 토양으로 옮긴 후, 2-3주 동안 30℃의 14-h 명 주기 및 21℃에서 암소에서 성장 챔버로 보낸 후, 온실 내의 13-cm 화분에 이식하였다. 종자를 수집하고 37℃에서 1주 동안 건조한 후, 4℃에서 저장하였다.
dgt-28 벼의 T 0 분석. 아그로박테리움 형질전환을 통해 생산된 이식된 벼 형질전환체를 배지에 이식하고, 온실 조건에 순응시켰다. 모든 식물을 dgt-28의 PCR 검출을 위해 샘플링하였고, 그 결과는 pDAB110827 (TraP8::dgt-28)에 대해 22개의 PCR 양성 이벤트 및 pDAB110828 (TraP23::dgt-28)에 대해 최소 16개의 PCR 양성 이벤트를 보였다. PCR 양성 이벤트의 dgt-28에 대한 서던 분석은 두 구축물에 대한 간단한 (1-2 카피) 이벤트를 보여주었다. 선택된 T0 이벤트의 단백질 발현은 검출 수준 미만으로부터 130 ng/cm2의 DGT-28 단백질 발현 범위를 보였다. 구축물 pDAB110828로부터 선택된 T0 이벤트를 앞서 설명된 바와 같이 2240 g ae/ha 두랑고 DMA™으로 처리하고, 처리 7 및 14일 후에 평가하였다. 데이타는 적용된 글리포세이트의 비율에 대한 강력한 내성을 입증하였다. 모든 PCR 양성 식물은 추가의 특성화를 위해 T1 종자를 생산하도록 하였다.
벼에서 dgt-28 유전가능성. 100개의 식물 자손체 시험을 엽록체 수송 펩티드 TraP8을 함유하는 구축물 pDAB110827로부터의 dgt-28의 4개의 T1 식물주에 대해 수행하였다. 종자를 배지를 채운 화분에 식재하였다. 이어서, 모든 식물에 앞서 설명된 바와 같이 dgt-28 유전자의 선택을 위해 560 g ae/ha 두랑고 DMA™을 분무하였다. 7 DAT에, 내성 및 감수성 식물을 계수하였다. 각각의 구축물에 대해 시험된 4개의 식물주 중에서 2개가 카이 제곱 분석에 의해 결정될 때 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질 (3R:1S)로서 분리되었다. dgt-28은 다수의 종에서 유전가능한 글리포세이트 저항성 유전자이다.
dgt-28 형질전환된 T 1 벼에서 발아후 제초제 내성. 자손체 시험에 사용된 각각의 이벤트로부터의 T1 저항성 식물에게 특유한 식별자를 제시하고, dgt-28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이타는 적용되는 각각의 비율의 글리포세이트에 2개의 반접합성 및 2개의 동종접합성 반복시험체를 할당하여 처리당 총 4개의 반복시험체를 허용하기 위해 사용되었다. 이들 식물을 야생형 키타아케 (kitaake) 벼와 비교하였다. 모든 식물을 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기로 분무하였다. 식물에게 560-2244 g ae/ha 두랑고 DMA™을 분무하였다. 모든 적용물은 2% w/v 황산암모늄 (AMS)을 첨가하면서 물 내에 제제화되었다. 식물을 처리 7 및 14일 후에 평가하였다. 식물에게 전체 가시적인 발육 저지, 황백화, 및 괴사에 대한 손상 등급을 부여하였다. T1 세대는 분리되고, 따라서 일부의 가변적인 반응이 접합성의 차이 때문에 예상된다.
분무 결과는 7 DAT (처리 후 일)에 상승된 비율의 글리포세이트에 대한 최소 생장 손상이 검출됨을 보여준다 (데이타를 제시하지 않음).
Figure pct00036
DGT-28의 단백질 검출을 pDAB110827로부터 시험된 모든 4개의 T1 식물주로부터의 반복시험체에 대해 평가하였다. 데이타는 각각 반접합성 및 동종접합성 반복시험체에 대해 20-82 ng/cm2 및 21-209 ng/cm2의 DGT-28 평균 단백질 범위를 보여주었다. 상기 결과는 선택을 위해 사용된 560 g ae/ha 글리포세이트의 적용 후에 2240 g ae/ha 글리포세이트 이하까지 dgt-28 벼의 내성 및 T1 세대로의 안정한 단백질 발현을 입증하였다.
실시예 20: dgt - 28를 사용한 잔디풀의 형질전환
덩굴 벤트그래스 (bentgrass)에서 dgt-28 도입 유전자의 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 유전자 형질전환은 종자 (cv. Penn-A-4)로부터 개시된 배 형성 캘러스를 통해 달성된다 (["Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation" (Luo et. at, 2004)] 참조).
캘러스 세포를 외떡잎 특이적 프로모터에 의해 구동되는 제초제-내성 도입 유전자 (예를 들어 dgt-28)를 함유하는 초2원성 벡터를 보유하는 에이. 투메파시엔스 균주로 감염시켰다. 전체 안정한 형질전환 효율 범위는 18% 내지 45%이었다. 서던 블롯 및 유전자 분석은 덩굴 벤트그래스 게놈 내의 도입 유전자 통합 및 T1 세대에서 도입 유전자의 정상적인 전달 및 안정한 발현을 확인해준다. 모든 독립적 형질전환 이벤트는 도입 유전자의 1 내지 3개의 카피를 보유하고, 대다수 (60-65%)는 명백한 재배열 없이 단지 단일 카피의 도입 유전자만을 함유한다.
사포로 성숙 종자의 껍질을 벗기고, 90 min 동안 격렬하게 진탕하면서 10% (v/v) 클로록스(Clorox)™ 표백제 (6% 차아염소산나트륨) + 0.2% (v/v) 트윈 (Tween) 20 (폴리소르베이트 20) 내에서 표면 멸균하였다. 멸균 증류수로 5회 세정한 후, 종자를 캘러스-유도 배지 (MS 기초 염 및 비타민, 30 g/l 수크로스, 500 mg/l 카제인 가수분해물, 6.6 mg/l 3,6-디클로로-o-아니스산 (디캄바), 0.5 mg/l 6-벤질아미노퓨린 (BAP) 및 2 g/l 피타겔. 배지의 pH는 120℃에서 20 min 동안 고압살균 전에 5.7로 조정됨)) 상에 두었다.
제조된 종자 외식편이 존재하는 배양 플레이트를 암소에서 실온에서 6주 동안 유지하였다. 배 형성 캘러스를 가시적으로 선택하고, 공동-경작 전에 암소에서 실온에서 1주 동안 새로운 캘러스-유도 배지 상에 계대배양하였다.
아그로박테리움 매개된 감염 1일 전에, 배 형성 캘러스를 1 내지 2 mm 조각으로 나누고, 100 μM 아세토시링곤을 함유하는 캘러스-유도 배지에 놓았다. 이어서, dgt-28 도입 유전자를 보유하는 아그로박테리움 현탁액의 10 ㎕ 분취액 (660 nm에서 OD=1.0)을 각각의 캘러스 조각에 적용한 후, 3일 동안 암소에서 25℃에서 공동-경작하였다. 이어서, 박테리아 성장을 억제하기 위해 125 mg/l 세포탁심 및 250 mg/l 카르베니실린을 포함하는 캘러스-유도 배지 상에 캘러스를 옮기고 2주 동안 배양하였다.
트랜스제닉 식물의 선택은 캘러스를 250 mg/l 세포탁심 및 제초제를 함유하는 캘러스-유도 배지로 옮길 때 이루어진다. 캘러스 물질을 3주의 선택 계대배양 간격으로 8주 동안 상기 배지에서 유지하였다. 선택 공정은 실온에서 암소에서 수행한다.
식물 재생을 위해, 증식하는 제초제-내성 캘러스 이벤트를 먼저 세포탁심, 및 선택을 위한 제초제가 보충된 재생 배지 (MS 기초 배지, 30 g/l 수크로스, 100 mg/l 미오-이노시톨, 1 mg/l BAP 및 2 g/l 피타겔)로 옮겼다. 이들 캘러스를 암소에서 실온에서 1주 동안 유지한 후, 싹을 발생시키기 위해 2-3주 동안 명소로 옮겼다.
발생한 싹을 분리하고, 선택압을 유지하고 임의의 남아있는 아그로박테리움 세포를 억제하면서 뿌리 성장을 촉진하기 위해 제초제 및 세포탁심을 함유하는 호르몬-미함유 재생 배지로 옮겼다. 이어서, 뿌리가 자라 발달한 묘목 (3-5주)을 토양으로 옮기고, 온실 또는 경작지에서 성장시켰다.
트랜스제닉 식물을 12월의 동지까지 묘목장에서 야외에서 유지하였다 (3-6개월). 이어서, 춘화 처리된 (vernalized) 식물을 온실로 옮기고 16/8 h 광주기 하에 25℃에서 유지하고, 트랜스제닉 식물을 다른 꽃가루 공급원으로부터 물리적으로 분리시키는 비-트랜스제닉 대조 식물로 둘러쌌다. 트랜스제닉 식물은 온실로 다시 옮긴지 3-4주 후에 개화가 시작되었다. 이들 식물을 둘러싸는 대조군 식물로부터의 꽃가루와 이계 교배시켰다. 각각의 개별 트랜스제닉 식물로부터 수집한 종자를 토양에서 25℃에서 발아시키고, T1 식물을 추가의 분석을 위해 온실에서 성장시켰다.
설명된 프로토콜에 따라 다음과 같은 초본을 비롯한 다른 초본을 dgt-28로 형질전환시켰다: 일년생 미도우그래스 (meadowgrass) (포아 아누아 (Poa annua)), 바히아그래스 (Bahiagrass), 벤트그래스, 버뮤다그래스 (Bermudagrass), 블루그래스 (Bluegrass), 블루스템 (Bluestems), 브라키아리아 (Brachiaria), 브로메그래스 (Bromegrass), 브라운탑 벤트 (Browntop bent) (아그로스티스 카필라리스 (Agrostis capillaries)), 버팔로그래스 (Buffalograss), 카나리 그래스 (Canary Grass), 카페트그래스 (Carpetgrass), 센티페데그래스 (Centipedegrass), 츄잉스 페스큐 (Chewings fescue) (페스투카 루브라 코무타테 (Festuca rubra commutate)), 크라브그래스 (Crabgrass), 크리핑 벤트 (Creeping bent) (아그로스티스 스톨로니페라 (Agrostis stolonifera)). 크레스테드 헤어그래스 (Crested hairgrass) (코엘레리아 마크란타 (Koeleria macrantha)), 달리스그래스 (Dallisgrass), 페스큐 (Fescue), 페스톨륨 (Festolium), 하드/쉽스 (Hard/sheeps) 페스큐 (페스투카 오비나 (Festuca ovina)), 그라마그래스 (Gramagrass), 인디안그래스 (Indiangrass), 존슨그래스 (Johnsongrass), 러브그래스 (Lovegrass), 혼합 초본 (말 (Equine), 초지 등), 천연 초본, 오차드그래스 (Orchardgrass), 다년생 라이그래스 (ryegrass) (롤륨 페렌네 (Lolium perenne), 레드탑 (Redtop), 레스큐그래스 (Rescuegrass), 1년생 및 다년생 라이그래스 (Ryegrass), 가느다란 크리핑 레드 세스큐 (Slender creeping red fescue) (페스투카 루브라 트리코필라 (Festuca rubra trichophylla)), 줄기가 매끄러운 미도우그래스 (포아 프라텐시스 (Poa pratensis)), 세인트 오거스틴 (St. Augustine), 강한 크리핑 레드 세스큐 (Strong creeping red fescue) (페스투카 루브라 루브라 (Festuca rubra rubra)), 수단그래스 (Sudangrass), 스위치그래스 (Switchgrass), 큰 페스큐 (Tall fescue) (페스투카 아룬디나세아 (Festuca arundinacea)), 촘촘한 헤어그래스 (Tufted hairgrass) (데샴프시아 카에스피토사 (Deschampsia caespitosa)), 잔디풀, 휘트그래스 (Wheatgrass), 및 조이시아그래스 (Zoysiagrass).
실시예 21: dgt-28을 사용한 브라시카 종의 형질전환
글리포세이트에 대한 저항성을 부여하는 dgt-28 유전자는 아그로박테리움-매개 형질전환을 사용하여 브라시카 나푸스 변종 넥세라(Nexera)™ 710을 형질전환시키기 위해 사용한다.
브라시카 나푸스 종자를 10% 시판 표백제로 10분 동안 표면-멸균하고, 멸균증류수로 3회 세정하였다. 이어서, 종자를 1/2 농도의 MS 기초 배지 (Murashige and Skoog, 1962)에 넣고, 25℃, 및 16 hrs 명/8 hrs 암의 광주기로 설정된 성장 방식 하에 유지하였다.
배축 절편 (3-5 mm)을 5 - 7일령 묘목으로부터 절제하고, 3일 동안 예비-처리로서 캘러스 유도 배지 K1D1 (1 mg/l 키네틴 및 1 mg/l 2,4-D를 함유하는 MS 배지) 상에 두었다. 이어서, 절편을 페트리 플레이트에 옮기고, dgt-28을 포함하는 구축물을 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주로 처리하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스를 150 rpm의 진탕기에서 암소에서 28℃에서 밤새 성장시킨 후, 배양 배지 내에 재현탁하였다.
배축 절편을 아그로박테리움으로 30 min 처리한 후, 이들 절편을 3일 동안 캘러스 유도 배지 상에 다시 두었다. 공동-경작 후에, 절편을 회수를 위해 1주 동안 K1D1TC (250 mg/l 카르베니실린 및 300 mg/l 티멘틴을 함유하는 캘러스 유도 배지)에 두었다. 교대로, 절편을 직접 선택 배지 K1D1H1 (제초제가 존재하는 상기 배지) 상에 두었다. 카르베니실린 및 티멘틴은 아그로박테리움을 사멸시키기 위해 사용된 항생제이다. 선택제는 형질전환된 세포의 성장을 허용한다.
단리된 독립적 이벤트로부터의 캘러스 샘플을 PCR에 의해 시험하였다. dgt-28의 존재에 대해 양성으로 시험된 샘플을 확인하고, 재생을 위해 배지로 옮겼다. 이어서, 굳어진 배축 절편을 B3Z1H1 (MS 배지, 3 mg/l 벤질아미노퓨린, 1 mg/l 제아틴, 0.5 gm/l MES [2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산], 5 mg/l 질산은, 선택적 제초제, 카르베니실린 및 티멘틴) 싹 재생 배지에 두었다. 3주 후에 싹이 재생되기 시작하였다. 싹을 따른 배축 절편을 추가로 3주 동안 B3Z1H3 배지 (MS 배지, 3 mg/l 벤질아미노퓨린, 1 mg/l 제아틴, 0.5 gm/l MES [2-(N-모르폴리노) 에탄 술폰산], 5 mg/l 질산은, 선택적 제초제, 카르베니실린 및 티멘틴)에 옮겼다.
싹을 배축 절편으로부터 절제하고, 2-4주 동안싹 신장 배지 MESH10 (MS, 0.5 gm/l MES, 선택적 제초제, 카르베니실린, 티멘틴)에 옮겼다. 신장된 싹을 뿌리 유도를 위해 MSI.1 (0.1 mg/l 인돌부티르산이 존재하는 MS)에 배양하였다. 식물에 뿌리 시스템이 확립되면, 식물을 토양에 이식하였다. 식물을 온실에 옮기기 전에 1-2주 동안 콘비론(Conviron)™에서 제어된 환경 조건 하에 순응시켰다.
형질전환된 T0 식물을 온실에서 T1 종자를 얻기 위해 자가수분시켰다. T0 식물 및 T1 자손체에게 dgt-28 유전자에 의한 보호 수준을 확립하기 위해서 일정 범위의 글리포세이트 제초제 농도를 분무하였다.
실시예 22: dgt-28을 사용한 담배의 형질전환
담배 (cv. 페티트 하바나) 잎 조각을 dgt-28 도입 유전자를 함유하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 사용하여 형질전환시킨다. dgt-28 도입 유전자를 함유하는 플라스미드를 보유하는 단일 콜로니를 스펙티노마이신 (50 ㎍/mL) 및 스트렙토마이신 (125 ㎍/mL)을 함유하는 4 mL의 YEP 배지에 접종하고, 190 rpm의 진탕기에서 28℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 후속적으로 4 mL 종자 배양액을 사용하여, 125 mL의 배플이 있는 얼렌마이어 (baffled Erlenmeyer) 플라스크 내의 동일한 배지의 배양액 25 mL을 접종하였다. 상기 배양액을 OD600이 ~1.2에 도달할 때까지 190 rpm에서 진탕하면서 28℃에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 10 mL의 아그로박테리움 현탁액을 멸균 60 x 20 mm 페트리(Petri)™ 접시에 넣었다.
PhytaTrays™ (시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스)에서 30 g/L 수크로스가 존재하는 MS 배지 (파이토테크놀로지 랩스 (Phytotechnology Labs), 미국 캔자스주 쇼니 미션)에서 무균 상태로 성장한 식물로부터 새로 절단한 잎 조각 (0.5 cm2)을 수 분 동안 아그로박테리움의 10 mL의 철야 배양액에 담그고, 멸균 필터지로 빨아들여 말린 후, 1 mg/L 인돌아세트산 및 1 mg/L 6-벤질아미노퓨린을 첨가한 동일한 배지에 두었다. 3일 후에, dgt-28 도입 유전자를 보유하는 아그로박테리움과 공동-경작된 잎 조각을 5 mg/L 바스타(Basta)™ 및 250 mg/L 세포탁심이 존재하는 동일한 배지로 옮겼다.
3주 후에, 개별 T0 묘목을 10 mg/L 바스타™ 및 250 mg/L 세포탁심이 존재하는 MS 배지에 옮기고, 추가로 3주 후에 토양에 이식하고 온실로 옮겼다. 선택된 T0 식물 (상기 설명된 분자 분석 프로토콜을 이용하여 확인함)을 자가수분시키고, 종자를 완전히 건조된 종자낭으로부터 수거하였다. T1 묘목을 접합성 및 리포터 유전자 발현 (아래에서 설명되는 바와 같은)에 대해 스크리닝하였고, dgt-28 도입 유전자를 함유하는 선택된 식물을 확인하였다.
식물은 아가를 뿌리로부터 세척하고, 13.75 cm 정사각형 화분 내의 토양으로 이식하고, 화분을 집록(Ziploc)® 백 (에스씨 존슨 & 선, 인크. (SC Johnson & Son, Inc.)) 내에 넣고, 백의 기부 내로 수돗물을 공급하고, 30℃ 온실 내에서 1주 동안 간접광 하에 두어 온실로 옮겼다. 3-7일 후에, 백을 열고, 식물을 수정시키고, 식물이 온실에 순응할 때까지 열린 백에서 성장시킨 후, 백을 제거하였다. 식물을 통상적인 따뜻한 온실 조건 (27℃ 주간, 24℃ 야간, 16시간 명, 최소 천연 + 보충 광 = 1200 μE/m2s1) 하에 성장시켰다.
번식 전에, T0 식물을 실시간 PCR에 의해 삽입체 dgt-28 카피수를 결정하기 위한 DNA 분석을 위해 샘플링하였다. 새로운 조직을 튜브에 넣고, 4℃에서 2일 동안 동결건조시켰다. 조직이 완전히 건조된 후에, 텅스텐 비드 (Valenite)를 튜브 내에 넣고, 켈코 (Kelco) 비드 밀 (bead mill)을 사용하여 샘플을 1분 건조 연마하였다. 이어서, 표준 DNeasy™ DNA 단리 절차를 수행하였다 (퀴아젠, DNeasy 69109). 이어서, 추출한 DNA의 분취액을 피코 그린 (몰레큘라 프로브스 P7589)으로 염색하고, 농도 (ng/㎕)를 얻기 위해 공지의 표준물을 사용하여 형광계 (바이오테크(BioTek)™)로 판독하였다. 총 100 ng의 총 DNA를 주형으로서 사용하였다. PCR 반응은 샘플을 94℃에서 3분 동안, 및 94℃ 30초, 64℃ 30초, 및 72℃ 1분 45초의 35 사이클, 및 이어서 72℃에서 10분 동안 적용함으로써 9700 Geneamp™ 열순환기 (어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행하였다. PCR 생성물을 EtBr로 염색한 1% 아가로스 겔 상의 전기영동에 의해 분석하고, 서던 블롯에 의해 확인하였다.
상이한 엽록체 수송 펩티드 서열 (TraP4, TraP8 및 TraP23)을 함유하는 3개의 구축물로부터 1-3 카피의 dgt-28 유전자를 갖는 5 내지 9개의 PCR 양성 이벤트를 재생하고, 온실로 옮겼다.
모든 PCR 양성 식물을 표준 ELISA에 의해 DGT-28 단백질의 정량을 위해 샘플링하였다. DGT-28 단백질은 모든 PCR 양성 식물에서 검출되었고, 단백질 농도가 증가하는 경향이 dgt-28의 카피수가 증가함에 따라 관찰되었다.
담배에서 aad-12 (v1) 유전가능성. 구축물당 dgt-28의 5개의 T1 식물주에 대해 100 식물 자손체 시험을 수행하였다. 구축물은 다음 엽록체 수송 펩티드 서열 중의 하나를 함유하였다: TraP4, TraP8 또는 TraP23. 종자를 층적시키고, 파종하고, 상기 예시된 아라비돕시스 절차와 매우 유사하게 이식하되, 무효의 식물은 이식 전에 초기 선택에 의해 제거되지 않았다. 이어서, 앞서 설명된 바와 같이 pat 선택가능 마커의 선택을 위해 모든 식물에 280 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 분무하였다. 3 DAT에, 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다.
각각의 구축물에 대해 시험된 5개의 식물주 중에서 4개가 카이 제곱 분석에 의해 결정될 때 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질 (3R:1S)로서 분리되었다. dgt-28은 다수의 종에서 유전가능한 글리포세이트 저항성 유전자이다.
dgt-28 형질전환된 T 1 담배에서 발아후 제초제 내성. 자손체 시험에 사용된 각각의 이벤트로부터의 T1 저항성 식물에게 특유한 식별자를 제시하고, dgt-28 유전자의 접합성 분석을 위해 샘플링하였다. 접합성 데이타는 적용되는 각각의 비율의 글리포세이트에 2개의 반접합성 및 2개의 동종접합성 반복시험체를 할당하여 처리당 총 4개의 반복시험체를 허용하기 위해 사용되었다. 이들 식물을 야생형 페티트 하바나 담배와 비교하였다. 모든 식물을 187 L/ha로 설정된 트랙 분무기로 분무하였다. 식물에게 560-4480 g ae/ha 두랑고 DMA™을 분무하였다. 모든 적용물은 2% w/v 황산암모늄 (AMS)을 첨가하면서 물 내에 제제화되었다. 식물을 처리 7 및 14일 후에 평가하였다. 식물에게 전체 가시적인 발육 저지, 황백화, 및 괴사에 대한 손상 등급을 부여하였다. T1 세대는 분리되고, 따라서 일부의 가변적인 반응이 접합성의 차이 때문에 예상된다.
분무 결과는 7 DAT (처리 후 일)에 상승된 비율의 글리포세이트에 대한 최소 생장 손상이 검출됨을 보여준다 (데이타를 제시하지 않음). 14 DAT에, 가시적인 손상 데이타는 구축물 TraP8 및 TraP23으로부터의 단일 카피 이벤트에 비해 TraP4를 함유하는 구축물의 단일 카피 이벤트에서 증가된 손상을 보여주었다 (표 27).
Figure pct00037
상기 결과는 4480 g ae/ha 글리포세이트 이하까지 dgt-28의 내성, 및 dgt-28 유전자에 연결된 엽록체 수송 펩티드에 의해 제시되는 내성의 차이를 보여주었다.
T 2 세대에서 상승된 글리포세이트 비율에 대한 dgt-28 보호. 구축물당 dgt-28의 2 내지 3개의 T2 식물주에 대해 25 식물 자손체 시험을 수행하였다. 동종접합성 식물주를 선행 세대에서 완료된 접합성 분석을 기초로 하여 선택하였다. 종자를 앞서 설명된 바와 같이 층적시키고, 파종하고, 이식하였다. 이어서, 앞서 설명된 바와 같이 pat 선택가능한 마커의 선택을 위해 모든 식물에 280 g ae/ha 이그나이트 280 SL을 분무하였다. 3 DAT에, 내성 및 감수성 식물을 계수하였다. 각각의 구축물에 대해 시험된 모든 식물주는 분리되지 않았고, 따라서 T2 세대에서 균질한 식물주를 확인하고 담배에서 dgt-28의 적어도 2개의 세대를 통한 멘델 유전을 입증하였다.
420-3360 g ae/ha 글리포세이트의 두랑고 DMA™의 비율을 앞서 설명된 바와 같이 2-3 잎 담배에 적용하였다. 14 DAT에 가시적인 손상 데이타는 T1 세대에서 입증된 내성 결고를 확인해주었다. TraP4를 함유하는 구축물로부터의 2 카피 식물주로부터의 잎 결과는 단일 카피 TraP8 및 TraP23 식물주와 유사한 내성을 입증하였다 (데이타를 제시하지 않음).
Figure pct00038
데이타는 비-형질전환된 대조군에 비해 2개의 세대를 통해 3360 g ae/ha 글리포세이트 이하까지 dgt-28 담배의 강력한 내성을 입증하였다.
각각의 이벤트선택된 식물을 표준 DGT-28 ELISA에 의한 DGT-28 단백질의 분석을 위해 글리포세이트 적용 전에 샘플링하였다. 데이타는 구축물에 걸친 간단한 (1-2 카피) 식물주의 DGT-28 평균 단백질 발현이 72.8-114.5 ng/cm2임을 입증하였다. 데이타는 dgt-28이 형질전환된 담배의 T2 세대에서 단백질을 발현함을 보여주고, 내성 데이타는 기능적 DGT-28 단백질을 확인해준다.
제초제 스펙트럼을 증가시키기 위한 dgt-28의 집적. 동종접합성 dgt-28 (pDAB107543 및 pDAB107545) 및 aad-12 v1 (pDAB3278) 식물 (PCT/US2006/042133 참조) 둘 모두를 상호 교배하고, F1 종자를 수집하였다. 각각의 유전자의 2개의 상호 교배로부터 얻은 F1 종자를 층적시키고, 각각의 교배의 처리된 6개의 반복시험체를 1120 g ae/ha 글리포세이트 (dgt-28 유전자에 대해 선택적), 1120 g ae/ha 2,4-D (aad-12 유전자에 대해 선택적), 또는 설명된 비율의 두 제초제의 탱크 혼합물로 처리하였다. 식물을 14 DAT에 평가하였다. 분무 결과를 표 29에 제시한다.
Figure pct00039
결과는 dgt-28이 aad-12 (v1)과 성공적으로 집적되고, 따라서 관심있는 작물에 적용될 수 있는 스펙트럼 제초제 (각각 dgt-28 및 aad-12에 대해 글리포세이트 + 페녹시아세트산)를 증가시킬 수 있음을 확인해준다. 방제가 어려운 활엽 잡초 또는 저항성 잡초 생물형이 존재하는 작물 생산에서, 집적물이 잡초 방제 및 관심있는 작물의 보호 수단으로서 사용될 수 있다. 추가의 투입 또는 생산 형질이 또한 dgt-28 유전자와 집적될 수 있다.
실시예 23: 밀에서 글리포세이트에 대한 저항성
DGT-28을 코딩하는 2원 벡터의 생산. 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 기능 및 기술을 사용하여 DGT-28 발현 및 PAT 선택 카세트를 함유하는 2원 벡터를 설계하고 조립하였다. 각각의 DGT-28 발현 카세트는 제아 메이즈로부터의 유비퀴틴 (Ubi) 유전자의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (Toki et al. Plant Physiology 1992, 100 1503-07), 이어서 합성 버전의 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 유전자 (DGT-28)의 5' 단부에 융합된 4개의 수송 펩티드 (TraP4, TraP8, TraP23 또는 TraP5) 중 하나로 이루어진 코딩 서열 (식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화됨)을 함유하였다. DGT-28 발현 카세트는 제아 메이즈로부터의 전사 종료자 및 리파제 유전자 (Vp1)의 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' 비번역 영역 (UTR)으로 끝났다 (Paek et al., Mol Cells 1998 30;8(3) 336-42). PAT 선택 카세트는 오리자 사티바로부터의 액틴 (Act1) 유전자의 프로모터, 5' 비번역 영역 및 인트론 (McElroy et al., The Plant Cell 1990 2(2) 163-171), 이어서 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes)로부터 단리된 합성 버전의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자 (식물 내에서 발현을 위해 코돈 최적화됨)를 포함하였다. PAT 유전자는 포스피노트리신, 글루포시네이트, 및 비알라포스를 포함하는 글루타민 합성효소의 억제제에 대한 저항성을 부여하는 단백질을 코딩한다 (Wohlleben et al. Gene 1988, 70(1), 25-37). 선택 카세트는 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV)로부터의 전사 종료자 및 35s 유전자의 폴리아데닐화 부위를 포함하는 3' UTR로 끝났다 (Chenault et al. Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396).
선택 카세트는 상업적인 유전자 합성 판매사 (진아트 (GeneArt), 라이프 테크놀로지스)에 의해 합성되었고, 게이트웨이-구동 2원 벡터 내로 클로닝되었다. DGT-28 발현 카세트를 pDONR221 내로 서브클로닝하였다. 생성되는 ENTRY 클론을 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 발현 카세트를 코딩하는 게이트웨이-구동 2원 벡터와 함께 LR 클로나제 II (인비트로겐, 라이프 테크놀로지스) 반응에 사용하였다. 모든 조립된 플라스미드의 콜로니를 초기에 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (NEB; 미국 매사추세츠주 입시치) 및 프로메가 (Promega (프로메가 코포레이션 (Promega Corporation, 미국 위스콘신주))로부터 입수한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하는 정제된 DNA의 제한 소화에 의해 스크리닝하였다. 플라스미드 DNA 제조는 공급자의 지시에 따라 QIAprep 스핀 (Spin) 미니프렙 키트 (퀴아젠, 독일 힐덴) 또는 퓨어 일드 (Pure Yield) 플라스미드 맥시프렙 (Maxiprep) 시스템 (프로메가 코포레이션, 미국 위스콘신주)를 사용하여 수행하였다. 선택된 클론의 플라스미드 DNA를 ABI 생거 서열결정 (Sanger Sequencing) 및 빅 다이 터미네이터 (Big Dye Terminator) v3.1 사이클 서열결정 프로토콜 (어플라이드 바이오시스템즈, 라이프 테크놀로지스)을 사용하여 서열결정하였다. 서열 데이타를 조립하고, 시?처™ 소프트웨어 (진 코즈 코퍼레이션, 미국 미시건주 앤 아버))를 이용하여 분석하였다.
생성되는 4개의 2원 발현 클론, 즉 pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) 및 pDAS000125 (TraP5-DGT28)을 각각 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 EHA105 내로 형질전환시켰다.
dgt-28 발현 구축물을 사용한 트랜스제닉 밀 이벤트. 4개의 DGT-28 발현 구축물 중 하나를 발현하는 트랜스제닉 밀 식물은 문헌 [Wu et al. Transgenic Research 2008, 17:425-436]과 유사한 프로토콜에 따라 공여자 밀 식물주 밥화이트 (Bobwhite) MPB26RH를 사용하여 아그로박테리움-매개 형질전환에 의해 생성하였다. 추정되는 T0 트랜스제닉 이벤트를 PAT 선택가능한 마커에 의해 부여되는 표현형인 포스피노트리신 (PPT) 내성에 대해 선택하고, 토양으로 옮겼다. T0 식물을 온실 제한 조건 하에서 성장시키고, T1 종자를 생산하였다. 총 약 45개의 독립적 T0 이벤트가 각각의 DGT-28 발현 구축물에 대해 생성되었다.
T 0 밀 dgt-28 밀 이벤트에서 글리포세이트 저항성. T0 이벤트를 온실에서 순응시키고, 2-4개의 새로운, 정상으로 보이는 잎이 윤생체로부터 출현할 때까지 성장시켰다 (즉, 식물이 조직 배양으로부터 온실 성장 조건으로 이행됨). 식물을 성숙할 때까지 온실에서 12시간의 보충 광원 하에 25℃에서 성장시켰다. 글리포세이트 내성의 초기 스크리닝 및 Taqman 분석은 앞서 설명된 바와 동일한 조건 하에 성장한 T1 식물에 대해 완료하였다. 데이타는 추가로 특성화될 유전가능한 T1 이벤트의 결정을 허용하였다. 6개의 낮은 카피 (1-2 카피) 및 2개의 다중-카피 T1 이벤트를 온실 조건 하에 재식재하고, 3엽기까지 성장시켰다. T1 식물에 글리포세이트의 시판 제제 (두랑고 DMA™)를 420 - 3360 g ae/ha로 분무하였고, 이것은 형질전환되지 않은 밀 식물주에 대해 유의한 손상을 야기할 수 있다. 2% w/v 황산암모늄의 첨가는 적용에 포함되었다. 치사 용량은 밥 화이트 MPB26RH 비-형질전환된 대조군에 >75% 손상을 야기하는 비율로서 규정된다. 제초제를 적용하였다.
본 실시예에서, 글리포세이트 적용은 T1 세대에서 dgt-28 유전자의 분리를 결정하고 증가하는 수준의 글리포세이트에 대한 내성을 입증하기 위해 이용되었다. 식물의 반응은 처리 21일 후 (DAT)에 가시적인 손상의 규모의 측면에서 제시된다. 데이타는 25% 미만의 가시적인 손상 (4), 25%-50% 가시적인 손상 (3), 50%-75% 가시적인 손상 (2) 및 75% 초과의 손상 (1)을 보이는 개체의 막대그래프로서 제시된다. 산술 평균 및 표준 편차가 밀 형질전환을 위해 사용된 각각의 구축물에 대해 제시된다. 또한, 개별 반응의 평가 범위가 각각의 비율 및 형질전환에 대해 마지막 컬럼에 표시된다. 야생형, 비-형질전환된 밀 (c.v. 밥화이트 MPB26RH)을 글리포세이트 감수성 대조군으로 사용하였다. T1 세대에서, 반접합성 및 동종접합성 식물이 각각의 이벤트에 대한 시험에 이용가능하였고, 따라서 시험된 각각의 비율의 글리포세이트에 대해 포함되었다. 반접합성 식물은 동종접합성 식물의 유전자 용량의 1/2을 함유할 것이고, 따라서 글리포세이트에 대한 반응의 가변성은 T1 세대에서 예상될 수 있다.
T1 dgt-28 밀 식물의 결과는 글리포세이트에 대한 내성이 엽록체 수송 펩티드 TraP4, TraP5, TraP8 및 TraP23과 함께 3360 g ae/ha 이하에서 달성됨을 보여주었다 (표 30). 데이타는 낮은 카피 T1 이벤트에 대한 것이지만, 각각의 구축물에 대한 집단을 대표한다.
Figure pct00040
21 DAT에, 카이 제곱 분석에 의해 결정될 때 단일 유전자좌, 우성 멘델 형질 (3R:1S)로서 분리되는 식물주의 비율을 결정하기 위해 저항성 및 감수성 식물을 계수하였다 (표 31). 이들 데이타는 dgt-28이 외떡잎 종에서 강력한 글리포세이트 저항성 유전자로서 유전가능함을 입증하였다.
Figure pct00041
DGT -28을 코딩하는 T- DNA 의 통합에 대한 T 0 트랜스제닉 식물의 분자적 확인. 게놈 DNA를 모든 추정되는 T0 밀 식물의 동결건조된 잎 물질로부터 추출하였다. 새로 수확한 잎 조직을 액체 질소 내에 급속 동결시키고, -40℃ 및 133 x 10-3 mBar 압력에서 랍콘코 프리존 (Labconco Freezone) 4.5® (랍콘코 (Labconco, 미국 미주리주 캔자스 시티))에서 24 h 동안 동결 건조시켰다. 동결건조시킨 물질에 대해 제조자의 지시에 따라 DNeasy® 식물 DNA 추출 미니 키트 (퀴아젠)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
각각의 T0 식물로부터의 DNA를 이어지는 (carryover) 아그로박테리움 투메파시엔스 균주의 존재 여부에 대해 및 DGT-28을 코딩하는 T-DNA의 통합된 카피의 수에 대해 시험하였다. 에이. 투메파시엔스 균주의 존재 여부 시험은 밀 게놈으로부터의 내인성 유비퀴틴 유전자, 및 pTiBo542로부터의 virC를 증폭시키기 위해 이중 Taqman® qPCR 검정을 이용하여 수행하였다
- 유비퀴틴 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브:
5' GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3' (서열 85; 정방향 프라이머)
5' CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3' (서열 86; 역방향 프라이머)
5' TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3' (서열 87; 프로브)
- virC에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브:
5' CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3' (서열 88; 정방향 프라이머)
5' CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3' (서열 89; 역방향 프라이머)
5' TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3' (서열 90; 프로브).
통합된 T-DNA 카피의 수는 문헌 [Livak and Schmittgen (Methods 2001 25:402-8)]의 절차에 따라 이중 Taqman® qPCR 검정을 이용하여 추정하였다. 검정은 헥사플로이드 밀의 D-게놈 내의 내인성 단일-카피 퓨로인돌린-b (Pinb) 유전자 (Gautier et al. Plant Science 2000 153, 81-91) 및 T-DNA에 존재하는 액틴 (Act1) 프로모터의 영역을 증폭하였다
- Pinb 유전자에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브:
5' ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3' (서열 91; 정방향 프라이머)
5' TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3' (서열 92; 역방향 프라이머)
5' ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3 ' (서열 93; 프로브)
Act1 프로모터의 영역에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브:
5' CTCCCGCGCACCGATCTG 3' (서열 94; 정방향 프라이머)
5' CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3' (서열 95; 역방향 프라이머)
5' AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3' (서열 96; 프로브).
virC로부터의 생성물을 증폭하지 않고 그로부터 정확한 생성물이 내인성 유비퀴틴에 대한 프라이머 및 벼 액틴 프로모터를 사용하여 증폭된 식물은 트랜스제닉으로 분류하였다. T-DNA의 수는 문헌 [Livak and Schmittgen (Methods 2001 25:402-8)]에 따라 2△△c(T)로부터 추정하였다. 총, 약 95%의 모든 T0 식물은 T-DNA의 적어도 하나의 통합된 카피를 가졌다 (표 32).
Figure pct00042
도입 유전자 유전을 추적하기 위한 PCR 접합성 검정의 개발. T-DNA 통합 부위의 측면에 인접하는 서열은 8개의 제한 엔도뉴클레아제를 사용한 정제된 게놈 DNA의 소화, 이어서 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생성된 오버행 (overhang)에 특이적인 이중-가닥 어댑터 (adapter)의 결찰에 의해 확인하였다. 어댑터 결찰 후에, DGT-28을 코딩하는 T-DNA의 3' 또는 5' 단부에 대한 비오티닐화된 프라이머 및 각각의 어댑터에 대한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 생성물을 포획하고, 앰퓨어 (Ampure) 고상 가역적 고정 (Solid Phase Reversible Immobilization) (SPRI) 비드 (아겐코트 바이오사이언스 코퍼레이션 (Agencourt Bioscience Corporation), 베크만 쿨터 컴퍼니 (Beckman Coulter Company)) 상에서 정제하였다. 이어서, 네스티드 (nested) PCR을 수행하였고, 증폭 생성물은 ABI3730xl® 자동화 모세관 전기영동 플랫폼에서 빅다이(BigDye)® v3.1 케미스트리 (chemistry) (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 생거 서열결정하였다. 시?처 소프트웨어 ((진 코즈 (Gene Codes, 미국 미시건주 앤 아버))를 이용하여 수행된 서열 분석이 (가능한 경우에) 컨센서스 서열을 생성하기 위해 사용되었다. 생성되는 컨센서스 서열 및 단독개체 (singleton)를, T-DNA 통합이 발생하는 염색체를 결정하고 PCR 접합성 검정의 개발을 위한 서브-게놈-특이적 프라이머의 설계를 가능하게 하기 위해 밀 품종 차이니즈 스프링 (Chinese Spring) (www.wheatgenome.org)의 유동 분류 염색체 아암 (arm)의 조립된 게놈 조사 서열 콘티그 (contig)에 대한 BlastN 질의 (query)로서 사용하였다.
도입 유전자 유전성을 후속 세대에서 추적할 수 있는 각각의 트랜스제닉 이벤트에 대한 2개의 PCR 검정을 개발하였다. T-DNA 통합 부위를 가로질러 증폭하기 위한 제1 검정 (이하 아웃-아웃 (out-out) PCR로서 칭한다)을 설계하였다. 본 검정에서 서브-게놈-특이적 증폭은 끝에서 두 번째의 (penultimate) 염기 (포스포르티오에이트 연결을 함유함)를, 표적화된 유전자좌를 밀 게놈 내의 다른 부위의 유전자좌의 이중 (동조 (homoeologous) 및 이원성 (paralogous)) 카피와 구별하는 뉴클레오티드 서열 변이 상에 위치하도록 설계된 프라이머를 사용한 온-오프 (on-off) PCR을 사용하여 달성하였다. T-DNA로부터 내인성 서열로 증폭시키기 위해 제2 검정 (이하 인-아웃 (in-out) PCR로서 칭한다)을 설계하였다. 상기 검정은 아웃-아웃 PCR 검정으로부터의 프라이머 중의 하나 및 DGT-28을 코딩하는 T-DNA의 3 또는 5' 단부에 대한 프라이머를 이용하였다. PCR 프라이머는 길이가 18 내지 27개 뉴클레오티드이고 60 내지 65℃, 최적 63℃의 융점을 갖도록 설계하였다. 아웃-아웃 및 인-아웃 PCR 검정은 모두 0.2 mM dNTP, 1x 퓨전 (Phusion) PCR 완충제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), 1.5 mM MgCl2, 0.5U 핫스타트 (Hotstart) 퓨전 DNA 중합효소 (뉴 잉글랜드 바이오랩스), 25 ng의 정제된 게놈 DNA 및 0.4 μM의 각각의 프라이머가 존재하는 25 ㎕ 반응 부피에서 수행하였다. PCR 순환 조건은 98℃ 30s, 이어서 (98℃ 10s, 65℃ 20s, 72℃ 60s)의 40 사이클이었다. 트랜스제닉 식물의 접합성은 표 33에 제시된 바와 같이 부여되었다.
Figure pct00043
Figure pct00044
글리포세이트 내성에 대한 트랜스제닉 식물의 표현형 평가. DGT-28 발현 구축물을 갖는 트랜스제닉 이벤트가 글리포세이트 내성을 보이는지 결정하기 위해, 개별 이벤트로부터 유래된 T1식물을 온실 제한 조건 하에서 표현형에 따라 평가하였다. 2가지 표현형 스크린을 수행하였다. 제1 (예비) 스크린에서, 트랜스제닉 이벤트 (두 표현형 스크린에 대해 충분한 T1 종자를 갖는)는 DGT-28 발현을 확인하기 위해 및 이벤트들 사이에서 제초제 내성에 대한 순위 (rank order)를 확립하기 위해 글루포시네이트 및 글리포세이트 내성에 대해 평가하였다. 제2 (상세한) 스크린에서, 선택된 트랜스제닉 이벤트는 이벤트 내에서 및 DGT-28 발현 구축물 사이에서 부여된 제초제 내성의 수준을 확인하기 위해 상이한 분무 적용 비율에서 글리포세이트 내성에 대해 평가하였다.
선택된 이벤트당 12개의 T1 종자 및 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물주 밥화이트 MPB26RH의 3개의 반복시험체 (각각 12개의 종자)를 85 mm 화분에 파종하고, 12시간 광주기를 제공하는 보충 조명을 조사하면서 25℃에서 잘 급수된 조건 하에 2엽기로 성장시켰다. 화분을 환경 효과가 데이타 분석 동안 제거되도록 무작위 방식으로 배치하였다. 스크리닝된 트랜스제닉 이벤트를 표 34에 나열한다. 2엽기에서, 모든 T1 식물 및 12개의 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물의 제1 반복시험체에게 글루포시네이트를 420 g ai/ha의 적용 비율로 분무하였다. 식물을 4일 후에 시각적으로 검사하고, 표현형 반응 범위를 나타내는 대표적인 식물을 0 내지 6의 평가 척도를 개발하기 위해 사용하였다 (표 32).
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
이어서, 시험에서 각각의 식물을 평가 척도에 비해 채점하였고, 평가자는 평가 편향을 배제하기 위해 식물 유전자형에 대해 "알지 못한 상태"로 평가하였다. 글루포시네이트 평가 5일 후에, 모든 T1 식물 및 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물의 제1 및 제2 반복시험체에게 420 g ai/ha의 적용 비율로 글리포세이트를 분무하였다. 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물주의 남아있는 제3 반복시험체 (총 12개의 식물)는 분무하지 않았다. 식물을 분무 7, 14 및 21일 후에 시각적으로 검사하였다. 표현형 반응 범위를 나타내는 평가 척도를 각각의 시점에 대해 개발하여 전체 시험을 평가하기 위해 사용하였다. 각각의 시점에서, 평가자는 식물 유전자형에 대해 "알지 못한 상태"로 평가하였다. 분무 7일 후에 평가 척도는 0 내지 7이었고 (표 36), 분무 14 및 21일 후에 1 내지 4이었다 (표 37). 또한, 식물 길이, 새싹 수 및 형태학적 이상을 글리포세이트 분무 14일 후에 각각의 식물에 대해 기록하였다. 지연 발아 또는 불량한 확립을 보인 식물은 후속 분석으로부터 제외하였다.
Figure pct00050
Figure pct00051
글루포시네이트 반응의 분석은 분무한 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물과 분무하지 않은 형질전환되지 않은 공여자 식물 사이에 명백한 표현형 차이를 밝히지 못하였다 (데이타를 제시하지 않음). 결과적으로, 글루포시네이트에 대한 트랜스제닉 이벤트의 내성은 신뢰할 수 있을 정도로 평가될 수 없었다. 이와 대조적으로, 분무 21일 후에 글리포세이트 반응의 분석은 분무한 및 분무하지 않은 형질전환되지 않은 공여자 식물들 사이에서 명백한 표현형 차이를 보여주었다 (표 38). 따라서, 트랜스제닉 이벤트 중에서 글리포세이트 내성에 대한 분석은 분무 21일 후에 수집한 반응 점수를 기초로 하였다. 트랜스제닉 이벤트는 그 이벤트에 대해 12개의 T1 식물 중의 4개 이상이 3 이상의 반응 점수를 가질 때 글리포세이트 내성을 보이는 것으로 간주하였다. 상기 기준은 각각의 이벤트가 T1 세대에서 도입 유전자에 대해 1:2:1 (동종접합성 존재:반접합성:동종접합성 부재)로 분리되고 약한 DGT28 발현을 보이는 이벤트가 확인될 수 있다는 예상을 기초로 하였다. 트랜스제닉 이벤트는 개별적인 내성 식물로부터 계산된 임의의 응집체 점수를 이용하여 관찰된 글리포세이트 내성에 대해 순위를 매겼다. 응집체 점수는 14 및 21일에서 반응 점수 및 분무 14일 후에 기록된 식물 길이, 새싹 수 및 형태학적 이상으로부터 계산하였다.
Figure pct00052
스크리닝된 92개의 트랜스제닉 이벤트 중 총 67개가 글리포세이트 내성에 대한 증거를 보였다 (표 39). 도입 유전자의 ≤3의 통합된 카피를 갖는 것으로 추정된 6개의 트랜스제닉 이벤트 및 4개 이상의 통합된 도입 유전자를 갖는 것으로 추정된 2개의 트랜스제닉 이벤트를 제2 (상세한) 표현형 스크린에 포함시키기 위해 각각의 DGT-28 발현 벡터에 대해 선택하였다.
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
상세한 표현형 스크린. 선택된 이벤트당 12개의 T1 종자의 4개의 반복시험체 및 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물주 밥화이트 MPB26RH의 8개의 반복시험체 (각각 12개의 종자)를 85 mm 화분에 파종하고, 12시간 광주기를 제공하는 추가의 조명을 조사하면서 25℃에서 잘 급수된 조건 하에 2엽기로 성장시켰다. 화분을 환경 효과가 데이타 분석 동안 제거되도록 무작위 방식으로 배치하였다. 스크리닝된 트랜스제닉 이벤트를 표 40에 나열한다. 2엽기에서, 식물 길이 및 잎의 수를 글리포세이트 분무 전에 각각의 식물에 대해 기록하였다. 각각의 선택된 이벤트 및 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물주에 대한 T1 식물의 제1, 제2, 제3 및 제4 반복시험체에게 각각 420, 840, 1680 및 3360 g ai/ha의 적용 비율로 분무하였다. 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물주의 제5, 제6, 제7 및 제8 반복시험체 (총 48개의 식물)은 분무하지 않았다. 분무 7, 14 및 21일 후에, 식물을 표 37의 평가 척도를 사용하여 식물 길이, 잎의 수 및 글리포세이트에 대한 표현형 반응을 평가하였다. 임의의 형태학적 이상도 기록하였다. 평가를 위해, 평가자는 평가 편향을 방지하기 위해 식물 유전자형 및 분무 적용 비율에 대해 "알지 못한 상태"로 평가하였다. 분무전 평가에서 지연 발아 및 불량한 확립 (기준: 식물 길이 <6 cm)을 보인 식물은 후속적인 분석으로부터 제외하였다.
Figure pct00059
분무 7, 14 및 21일 후에 글리포세이트 반응의 분석은 분무한 및 분무하지 않은 형질전환되지 않은 공여자 밀 식물들 사이에서 명백한 표현형 차이를 보여주었다. 상기 차이는 21일에서 최대였고, 모든 글리포세이트 적용 비율에서 관찰되었다 (표 41). 각각의 분무 적용 비율에서 글리포세이트에 대한 트랜스제닉 이벤트의 내성을 평가하기 위해, 무효의 T1 식물 (즉, 도입 유전자를 보유하지 않은 식물)은 후속적인 분석으로부터 제외하였다. 분무 21일 후에 3 미만의 반응 점수를 갖는 T1 식물은 무효의 유전자형을 갖는 것으로 간주하였다. 내성 표현형을 기초로 한 변량 분석 (ANOVA)은 DGT-28 발현 구축물, 트랜스제닉 이벤트 및 글리포세이트 분무 용량에 대한 유의한 효과를 보여주었다 (표 42). 그러나, 다수의 비교 시험은 개별 식물의 표현형을 기록하기 위해 사용된 제한된 범위의 반응 점수 (즉, 1 내지 4; 표 37) 때문에 이들 차이의 기원에 대한 유의미한 생물학적 해석을 밝혀내지 못하였다. 일반적으로, 각각의 DGT-28 발현 구축물에 대해 시험된 8개의 독립적 트랜스제닉 이벤트는 각각의 분무 적용 비율에서 글리포세이트에 대한 유사한 내성을 보였고, 이것은 4개의 모든 DGT-28 도입 유전자가 우성 표현형을 부여하였고, 글리포세이트 내성을 부여하기 위해 단일 카피가 충분함을 나타낸다. 각각의 DGT-28 발현 구축물은 적어도 3360 g ai/ha 글리포세이트에 대한 효과적인 내성을 보였다.
Figure pct00060
Figure pct00061
글리포세이트 내성 T 1 식물에서 T- DNA 존재의 분자적 확인. 실시예 2에서 개발된 PCR 접합성 검정을 T2 종자 생산을 위해 저장된 글리포세이트 내성 T1 식물에서 DGT-28을 코딩하는 T-DNA의 존재를 확인하기 위해 사용하였다 (실시예 6 참조). 종합적으로, PCR 접합성 시험을 104개의 T1 식물에 대해 수행하였고, 이 중 89%가 적어도 하나의 카피의 도입 유전자를 함유하는 것으로 확인되었다 (표 43). 이들 결과는 관찰된 글리포세이트 내성이 DGT-28을 코딩하는 T-DNA의 존재에 의해 부여되었음을 확인한다.
Figure pct00062
글리포세이트 내성 트랜스제닉 이벤트를 위한 T 2 종자의 생성. 약 8개의 글리포세이트 내성 T1 식물을 상세한 표현형 스크린에 포함시키기 위해 선택한 32개 트랜스제닉 이벤트에 대한 표현형 스크린으로부터 구하였다 (표 43). 식물을 200 mm 화분에 옮기고, 12시간 광주기를 제공하는 추가의 조명을 조사하면서 25℃에서 잘 급수된 조건 하에 2엽기로 성장시켰다. 각각의 식물 상의 이삭을 이계 교배를 방지하기 위해 개화 전에 개별적으로 봉투에 넣었다.
실시예 24: 스트렙토마이세스 스비세우스 5-에놀피루빌쉬키메이트 3-포스페이트 신타제 (SsvESPS 신타제)의 결정화 및 모델링
단백질 정제 및 결정화. 재조합 SsvESPS 신타제의 클로닝, 발현 및 정제는 다음과 같이 달성할 수 있다. 간단히 설명하면, SsvESPS 신타제에 대한 과발현 플라스미드를 캄피턴트 (competent) 이. 콜라이 Rosetta2 균주 내로 형질전환시키고, 18℃에서 16시간 동안 0.2 mM의 IPTG를 첨가하여 재조합 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 및 용해 완충제 - 20 mM Tris (pH 8.0), 500 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 0.1%의 양성이온성 세제 (DDM (도데실 말토시드) 또는 DM (데실 말토시드): β 아노머 (anomer)의 순도 > 98% 및 1% 미만의 아노머 오염물) 내에 재현탁하였다. C5 아베스틴 (Avestin) 세포 균질화기를 통해 다수 통과시켜 세포를 용해시키고, 용해물을 초원심분리에 의해 청정화하였다. 용해물을 용해 완충제 내에 평형화시킨 5 mL Ni-NTA 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 30 mM 이미다졸을 보충한 용해 완충제로 광범하게 세척하고, 200 mM 이미다졸까지 선형 구배에 의해 용리시켰다. SDS-PAGE에 의해 판단할 때 순수한 단백질 분획을 모으고, 20 mM Tris (pH 8.9), 300 mM NaCl 및 0.1% DM/DDM 내에서 12시간 동안 투석하였다. 트롬빈 (1 단위/mg의 단백질)을 사용한 소화에 의해 헥사히스티딘 태그를 제거한 후, 20 mM HEPES (pH 7.5), 300 mM KCl, 1 mM β-머캅토에탄올 및 0.05% DM/DDM 내에서 이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 75 16/60, 지이 헬쓰케어)를 수행하였다. 아미콘 (Amicon) 원심분리 필터를 사용하여 단백질을 농축하였다.
초기 결정화 조건은 상업적으로 이용가능한 및 사내 작성한 결정화 매트릭스 및 액적 (sitting drop) 증기 확산법을 이용하는 희소 행렬 (sparse matrix) 방법을 이용하여 확립하였다. 간단히 설명하면, 8 mg/mL 농도 (2 mM 쉬키메이트 3-포스페이트 및 2 mM 글리포세이트를 보충한 0.05% DM/DDM 및 20 mM HEPES (pH 7.5), 300 mM KCl, 1 mM β-머캅토에탄올의 완충제 내에)의 단백질 샘플의 50-나노리터 액적을 동일 부피의 저장기 모액과 혼합하였다. 초기 결정은 침전제로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 성장시켰고, 10일 내에 그들의 최대 크기로 성장하였다. 데이타 수집에 앞서, 결정을 25% 글리세롤을 보충한 결정화 모액으로 구성된 동결방지 용액 내에 잠깐 동안 담근 후, 액체 질소 내에 직접 침지에 의해 유리화하였다.
기결정 및 구조 결정. 결정학 데이타를 MAR 전하 결합 (charged couple) 장치 검출기를 사용하여 삽입 장치 싱크로트론 (synchrotron) 공급원 (LS-CAT, Sector 21 ID-D, 어드밴스드 포톤 소스 (Advanced Photon Source, 미국 일리노이주 아르곤))에서 수집하였다. 데이타를 색인하고, HKL2000 패키지 ([Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., and Chruszcz, M. (2006) HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 859-866] 참조)를 이용하거나 XDS ([Kabsch, W. (2010) Xds, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-132] 참조)를 이용하여 채점하였다. 초기 결정학 기는 CCP4 스위트의 프로그램 ([Winn, M. D., Ballard, C. C, Cowtan, K. D., Dodson, E. J., Emsley, P., Evans, P. R., Keegan, R. M., Krissinel, E. B., Leslie, A. G., McCoy, A., McNicholas, S. J., Murshudov, G. N., Pannu, N. S., Potterton, E. A., Powell, H. R., Read, R. J., Vagin, A., and Wilson, K. S. (2011) Overview of the CCP4 suite and current developments, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61, 235-242] 참조)에서 시행된 PHASER 소프트웨어 ([McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C, and Read, R. J. (2007) Phaser crystallographic software, J Appl Crystallogr 40, 658-674] 참조)를 이용하여 탐색 프로브로서 생성된 (아래 참조) SsvESPS 신타제의 상동성 모델을 사용하는 분자 치환 방법을 이용하여 결정하였다. 주쇄 및 측쇄 원자의 재-제작은 두 자동화 절차 (ARP/wARP) ([Langer, G., Cohen, S. X., Lamzin, V. S., and Perrakis, A. (2008) Automated macromolecular model building for X-ray crystallography using ARP/wARP version 7, Nature protocols 3, 1171-1179] 참조), 및 XtalView ([McRee, D. E. (1999) XtalView/Xfit--A versatile program for manipulating atomic coordinates and electron density, Journal of structural biology 125, 156-165] 참조) 또는 COOT ([Emsley, P., and Cowtan, K. (2004) Coot: model-building tools for molecular graphics, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132] 참조)를 이용하는 수동 간섭을 사용하여 수행한다. 결정학 세부화는 수동 모델 제작의 라운드와 혼용하여, REFMAC ([Murshudov, G. N., Vagin, A. A., and Dodson, E. J. (1997) Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240-255] 참조)를 사용할 것이다. 유리 R 인자의 계산에서 5%의 데이타를 사용하여, 모델 제작 및 세부화 전체에서 교차검증이 일상적으로 사용된다 ([Kleywegt, G. J., and Brunger, A. T. (1996) Checking your imagination: applications of the free R value, Structure 4, 897-904] 참조). 모델의 입체화학은 PROCHECK ([Laskowski, R. A., Rullmannn, J. A., MacArthur, M. W., Kaptein, R., and Thornton, J. M. (1996) AQUA and PROCHECK-NMR: program for checking the quality of protein structures solved by NMR, Journal of biomolecular NMR 8, 477-486] 참조)를 이용하여 세부화의 과정 전체에서 모니터링하고, 최종 결정학 좌표는 MOLPROBITY ([Davis, I. W., Murray, L. W., Richardson, J. S., and Richardson, D. C. (2004) MOLPROBITY: structure validation and all-atom contact analysis for nucleic acids and their complexes, Nucleic Acids Res 32, W615-619] 참조)을 이용하여 검증한다.
SsvESPS 신타제의 상동성 모델링. SsvESPS 신타제의 1차 서열을 BLAST 및 PSI-BLAST를 이용하여 Protein Data Bank에 대한 질의로서 사용하였다. 다음 종으로부터의 상동성 효소의 결정 구조를 검색하였다: 브이. 콜레라 (V. cholera) (PDB 코드: 3NVS; 160 정렬된 잔기에 걸쳐 39% 서열 동일성), 이. 콜라이 (1G6S; 158 정렬된 잔기에 걸쳐 38% 서열 동일성), 엠. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) (2BJB; 150 정렬된 잔기에 걸쳐 36% 서열 동일성), 씨. 부르네티 (C. burnetii) (3ROI; 117 정렬된 잔기에 걸쳐 28% 서열 동일성), 및 아그로박테리움 종 (2GGA: 116 정렬된 잔기에 걸쳐 27% 서열 동일성). 모든 이들 구조로부터의 원자 좌표를 수동으로 겹치고 (COOT를 이용하여), 상동성 모델링을 위한 최상의 주형을 결정하기 위해 활성 부위를 시각적으로 검사하였다. 모델링을 위해 2개의 평행 방안을 이용하였다: "최상의" 주형 (활성 부위 잔기의 수동 정렬에 의해 결정할 때)을 사용하는 SWISS-MODEL, 및 PHYRE2를 사용하는 멀티-주형 모델링 ([Bennett-Lovsey, R. M., Herbert, A. D., Sternberg, M. J., and Kelley, L. A. (2008) Exploring the extremes of sequence/structure space with ensemble fold recognition in the program Phyre, Proteins 70, 611-625] 참조)을 이용한 단일 주형 기반 방안. 멀티-주형 절차를 위해, 총 338개의 상이한 완전한 또는 부분 모델 (10-50의 E-값 컷오프를 갖는)을 2차 구조 예측을 위한 PSI-BLAST에서 슈도(pseudo)-다중 서열 정렬을 위해 모았다.
상위 11개의 주형은 ESPS 신타제의 상동체로 이루어지고, IF3-수퍼패밀리의 단백질은 다음 순위 주형을 구성한다. 쉬키메이트 3-포스페이트 및 글리포세이트 둘 모두에 대한 유망한 자세를 확인하기 위해, 3DLigandSite 서버 ([Wass, M. N., Kelley, L. A., and Sternberg, M. J. (2010) 3DLigandSite: predicting ligand-binging sites using similar structures, Nucleic Acids Res 38, W469-473] 참조)를 사용하여 리간드에 대한 결합 부위를 확인하였다. 필요하다면, 이상적인 결합 길이, 각으로부터의 편차를 감소시키기 위해, 및 방향족 잔기의 평면성을 유지하기 위해 개별 모델 구조를 에너지 최소화 프로토콜의 라운드로 처리하였다. 모델의 신뢰성은 예측된 국소 오차 (local error)에 플롯을 통해 및 대략 동일한 크기의 단백질의 모델에 대해 예상된 표준화된 QMEAN4 Z-점수 ([Benkert, P., Kunzli, M, and Schwede, T. (2009) QMEAN server for protein model quality estimation, Nucleic Acids Res 37, W510-514] 참조)를 사용함으로써 평가하였다. 생성되는 모델에 대해, 90% 초과의 주쇄 원자가 100% 정확도를 가지면서 모델링될 수 있었다.
SsvESPS 신타제의 상동성 모델. 최상의 상동성 모델은 PHYRE2에서 시행된 멀티-주형 방안을 이용하여 유도하였다. 상기 모델에 대해, 90% 초과의 주쇄 및 측쇄 원자가 정확도를 가지면서 모델링될 수 있었다. 상동성 모델의 라만찬드란 (Ramachandran) 지도는 가장 선호된 영역 내에 89%의 잔기를 보여주고, 추가의 9.7%는 추가의 허용된 영역 내에 있었다. 2개의 잔기 (Ala-255 및 Ala-314)는 허용되지 않은 영역 내에 있지만, 이들 잔기는 활성 부위에서 먼 루프 내에 위치한다. 상동성 모델의 타당성은 2차 구조적 요소에 의해 제약되지 않는 루프 영역 내에 위치하는 잔기를 포함하여, 서열 정렬의 갭이 있는 (gapped) 영역 내에 위치하는 잔기가 라만찬드란 한계 내에 잘 들어가는 비틀림각을 가지면서 모델링된다는 사실에 의해 확인된다.
증가된 글리포세이트 내성에 대한 분자학 기초. 아그로박테리움 종으로부터의 글리포세이트-내성 (클래스 II) 5-에놀피루빌쉬키메이트 3-포스페이트 신타제 (라운드업 레디 (Roundup Ready) 식물 내로 조작된 저항성 결정자)의 생화학적 및 생물물리학적 특성화에 앞서, 활성 부위에서 작은 변화가 상기 효소에서 제초제 내성을 책임질 수 있음이 확립되었다. 구체적으로, 아그로박테리움 종 ESPS 신타제 내에서 Ala-100 잔기가 글리포세이트-감수성 (클래스 I) 이. 콜라이 효소 내의 동등한 위치에서 발견되는 Gly (Gly-96) 대신에 치환된다. 감수성 이. 콜라이 ESPS 신타제의 공동-결정 구조에서 글리포세이트는 연장된 방식으로 균형잡는 반면, 아그로박테리움 종 ESPS 신타제에서 Ala-100의 측쇄와의 입체 충돌은 제초제의 압축을 일으키고, 이것은 내성을 초래한다. 이. 콜라이 효소를 사용한 구조/기능 연구는 Gly-96의 Ala로의 돌연변이가 글리포세이트 저항성을 일으킴을 보여주었다.
ESPS 신타제 구조에서, Ala-100 (Gly-96) 잔기는 글리포세이트-결합 부위에 인접한 긴 내부-나선의 출발 단부에 위치한다. 글리포세이트 감수성 클래스 I EPSP 신타제에서, 상기 언급된 Gly96Ala 돌연변이에 추가로, 글리포세이트 내성은 Thr97Ile, Pro101Leu/Thr/Ala/Ser을 비롯한 상기 나선 내의 잔기의 돌연변이에 의해 유도될 수 있다. 심지어 이들 잔기 중 일부는 글리포세이트-결합 부위로부터 10Å 넘게 떨어져 있지만, 이들 잔기에서의 변경은 Gly-96을 보유한 나선의 배향에서 이동을 일으키고, 이것은 증가된 글리포세이트 내성을 설명한다.
SsvESPS의 고-해상도 상동성 모델에서, 상기 Gly 잔기는 Ala-84로 변경되었다. 추가로, Ala-84를 보유하는 내부 나선 (도 55)을 활성 부위 내로 더욱 멀리 밀려진다. 상기 이동은 다음 변화의 결과이다: 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Ala-98은 Thr-86으로 교체되고; 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Met-99는 Ala-87로 교체되고; 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Pro-101은 Phe-89로 교체되고; 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Ala-103은 Pro-91로 교체되고; 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Ala-105는 Leu-93으로 교체되고; 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Leu-106은 Ala-94로 교체된다. 이들 아미노산은 도 1b에서 모티프 III을 나타낸다.
Met-53 (이. 콜라이 ESPS 신타제)에서 Phe-44 (모티프 II, 도 1a)로, 및 Leu-115 (이. 콜라이 ESPS 신타제)에서 Phe-103 (모티프 IV, 도 1b)로를 비롯하여, 상기 나선을 지지하는 잔기에서 추가의 보상적인 변화가 존재한다. 마지막으로, 보다 작은 Ala-17 (모티프 I, 도 1a) 및 Gly-43 (모티프 II, 도 1a)을 이용한 이. 콜라이 ESPS 신타제에서 Asn-26 및 His-52의 교체는 글리포세이트-결합 부위 내부로 상기 내부 나선을 더욱 이동시키는 공간을 생성한다. 상기 나선의 반대편에서, 이. 콜라이 ESPS 신타제 잔기 Leu-30 및 Met-178은 Phe-21 (모티프 I, 도 1a) 및 Leu-167에 의해 교체되어, 상기 나선을 결합 부위 내로 추가로 밀어 넣는다. 이들 변화는 상기 내부 나선의 배향의 유의한 이동을 일으키고, 이것은 다시 글리포세이트를 유의하게 가로막는다. 결과적으로, SsvESPS 신타제에서 Ala84Gly 돌연변이는 감수성 표현형을 일으키지 않았고, 이것은 상기 잔기를 보유하는 내부 나선이 여전히 글리포세이트 결합을 허용하기에는 활성 부위 내부로 너무 멀리 이동될 것이기 때문이다. 구조 예측은 항정 상태 운동학 및 IC50 연구에 의해 입증되었고, 여기서 DGT-28v2 (Ala84Gly)는 글리포세이트에 대한 높은 수준의 내성을 보유한다.
본 발명의 측면들이 특정 실시양태에서 설명되었지만, 이들은 본원의 취지와 범위 내에서 추가로 변형될 수 있다. 따라서, 본원은 그의 일반적인 원리를 사용하는 본 발명의 실시양태의 임의의 변동, 사용, 또는 개작을 포괄하는 것으로 의도된다. 추가로, 본원은 이들 실시양태가 속하고 첨부된 특허청구범위의 제한 내에 있는는 당업계의 공지되거나 관습적인 실시 내에서 본원으로부터의 그러한 일탈을 포괄하는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow Agrosciences Justin M. Lira Rob Cicchillo Satish Nair <120> NOVEL CLASS OF GLYPHOSATE RESISTANCE GENCES <130> 2971-P11743US (73728) <160> 173 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> Streptomyces sviceus <400> 1 Met Arg Gly Met Pro Ala Leu Ser Leu Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr 1 5 10 15 Ala Arg Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ala Ala Asp Gly Val Thr Thr Leu 20 25 30 Val Arg Pro Leu Arg Ser Asp Asp Thr Glu Gly Phe Ala Glu Gly Leu 35 40 45 Val Arg Leu Gly Tyr Arg Val Gly Arg Thr Pro Asp Thr Trp Gln Val 50 55 60 Asp Gly Arg Pro Gln Gly Pro Ala Val Ala Glu Ala Asp Val Tyr Cys 65 70 75 80 Arg Asp Gly Ala Thr Thr Ala Arg Phe Leu Pro Thr Leu Ala Ala Ala 85 90 95 Gly His Gly Thr Tyr Arg Phe Asp Ala Ser Pro Gln Met Arg Arg Arg 100 105 110 Pro Leu Leu Pro Leu Ser Arg Ala Leu Arg Asp Leu Gly Val Asp Leu 115 120 125 Arg His Glu Glu Ala Glu Gly His His Pro Leu Thr Val Arg Ala Ala 130 135 140 Gly Val Glu Gly Gly Glu Val Thr Leu Asp Ala Gly Gln Ser Ser Gln 145 150 155 160 Tyr Leu Thr Ala Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Thr Arg Gln Gly Leu 165 170 175 Arg Ile Arg Val Thr Asp Leu Val Ser Ala Pro Tyr Val Glu Ile Thr 180 185 190 Leu Ala Met Met Arg Ala Phe Gly Val Glu Val Ala Arg Glu Gly Asp 195 200 205 Val Phe Val Val Pro Pro Gly Gly Tyr Arg Ala Thr Thr Tyr Ala Ile 210 215 220 Glu Pro Asp Ala Ser Thr Ala Ser Tyr Phe Phe Ala Ala Ala Ala Leu 225 230 235 240 Thr Pro Gly Ala Glu Val Thr Val Pro Gly Leu Gly Thr Gly Ala Leu 245 250 255 Gln Gly Asp Leu Gly Phe Val Asp Val Leu Arg Arg Met Gly Ala Glu 260 265 270 Val Ser Val Gly Ala Asp Ala Thr Thr Val Arg Gly Thr Gly Glu Leu 275 280 285 Arg Gly Leu Thr Ala Asn Met Arg Asp Ile Ser Asp Thr Met Pro Thr 290 295 300 Leu Ala Ala Ile Ala Pro Phe Ala Ser Ala Pro Val Arg Ile Glu Asp 305 310 315 320 Val Ala Asn Thr Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Leu Glu Ala Cys Ala 325 330 335 Glu Asn Leu Arg Arg Leu Gly Val Arg Val Ala Thr Gly Pro Asp Trp 340 345 350 Ile Glu Ile His Pro Gly Pro Ala Thr Gly Ala Gln Val Thr Ser Tyr 355 360 365 Gly Asp His Arg Ile Val Met Ser Phe Ala Val 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ctggtggata tcgtgcaact 660 acgtatgcta tagaacccga cgcaagtact gcttcttact tcttcgcagc tgctgctttg 720 actcctggag ctgaagtgac tgtacctggg ttaggcacgg gagcacttca aggagatttg 780 ggatttgtag atgtcttaag gagaatggga gccgaggtgt ccgtaggagc tgatgcaacc 840 actgttagag gaactggtga attgcgtggc cttacagcca acatgagaga cataagtgat 900 acgatgccga ccctcgctgc aatagcaccc tttgctagtg ctccagttag aatcgaggat 960 gttgccaaca ctcgtgtcaa agaatgtgac agacttgagg cttgtgcaga gaaccttagg 1020 aggttgggag taagggttgc aacgggtccg gactggattg agatacaccc tggtccagct 1080 actggtgctc aagtcacaag ctatggtgat cacagaattg tgatgtcatt tgcagtgact 1140 ggacttcgtg tgcctgggat cagcttcgac gaccctggct gtgttcgtaa gacttttcct 1200 gggtttcacg aggctttcgc agaattgagg cgtggcattg ggagctga 1248 <210> 3 <211> 1251 <212> DNA <213> Streptomyces sviceus <400> 3 atggcaagag ggatgccagc cttgtcgctg cctggctcaa agtcgatcac ggctagagca 60 ctctttctcg cagcagcagc cgacggagtc accacgcttg tgagaccgct gcggtcagac 120 gacaccgagg gttttgcgga aggcctcgtc agactgggct atcgggttgg gaggactccc 180 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gagtgagagt cgcaactggt ccagactgga tcgagatcca ccctggtcca 1080 gctactggag cgcaagtcac aagctatggc gaccatagga ttgttatgtc attcgcagtg 1140 accggactca gagttcctgg gatctctttc gacgaccctg gttgcgtgcg gaaaacgttc 1200 cctggcttcc acgaggcatt tgcggagctg cggagaggaa ttggttcctg a 1251 <210> 4 <211> 1248 <212> DNA <213> Streptomyces sviceus <400> 4 atgcgtggta tgcctgcact gagcctgcct ggtagcaaaa gcattaccgc acgtgcactg 60 tttctggctg cagcagcaga tggtgttacc accctggttc gtcctctgcg ttctgatgat 120 accgaaggtt ttgcagaagg tctggttcgt ctgggttatc gtgttggtcg tacaccggat 180 acctggcaag ttgatggtcg tccgcagggt ccggcagttg ccgaagcaga tgtttattgc 240 cgtgatggtg caaccaccgc acgttttctg ccgaccctgg cagcagccgg tcatggcacc 300 tatcgttttg atgcatctcc gcagatgcgt cgtcgtccgc tgctgccgct gtctcgtgca 360 ctgcgtgatc tgggtgttga tctgcgtcat gaagaagcag aaggtcatca tccgctgacc 420 gttcgtgcag ccggtgttga aggtggtgaa gtgaccctgg atgccggtca gagcagccag 480 tatctgaccg cactgctgct gctgggtccg ctgacacgtc agggtctgcg tattcgtgtt 540 accgatctgg ttagcgcacc gtatgtggaa attaccctgg caatgatgcg tgcatttggt 600 gttgaagttg cacgtgaagg tgatgttttt gttgttccgc ctggtggtta tcgcgcaacc 660 acctatgcaa ttgaaccgga tgcaagcacc gcaagctatt tttttgcagc agcagccctg 720 acaccgggtg cagaagttac cgttcctggt ctgggcacag gtgcactgca gggtgatctg 780 ggatttgttg atgttctgcg tcgtatgggt gccgaagtta gcgttggtgc agatgccacc 840 accgttcgtg gtacaggtga actgcgtggt ctgaccgcaa atatgcgtga tattagcgat 900 accatgccga cactggctgc aattgcaccg tttgcaagcg caccggttcg tattgaagat 960 gttgccaaca cccgtgttaa agaatgtgat cgtctggaag catgtgcaga aaatctgcgt 1020 cgtctgggcg ttcgtgttgc aaccggtccg gattggattg aaattcatcc gggtccggca 1080 accggtgcac aggttaccag ctatggtgat catcgtatcg ttatgagctt tgcagttacc 1140 ggtctgcgtg ttccgggtat tagctttgat gatccgggtt gtgttcgtaa aacctttccg 1200 ggttttcatg aagcttttgc agaactgcgt cgtggtattg gtagctaa 1248 <210> 5 <211> 1599 <212> DNA <213> Glycine max <400> 5 atggctcaag tctcccgtgt tcacaatctt gctcagtcaa cccaaatctt tggacattca 60 agcaactcaa acaaactgaa gtctgtgaat tctgtctcac ttcgcccacg cctttgggga 120 gcatccaaga 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180 cctgtaaagg ttacagcctc tgtgtccacg agtgaaaagg caagcgagat cgtcttacaa 240 ccgattagag aaatctctgg gcttatcaag ttgcctggct ccaaatcact ctccaatagg 300 atacttcttt tggctgcact gagtgaaggc acaactgttg tggacaactt gctcaactcc 360 gatgatatca actacatgct tgacgccttg aagaagttag gactcaatgt ggagagagat 420 agcgttaaca atcgtgctgt cgtagaagga tgtggtggca tctttcctgc atctctggat 480 tctaagagcg acatcgagct ttacttgggc aatgctgcaa cagccatgag accgttaact 540 gctgctgtta ccgcagctgg aggaaatgct agttatgtgc ttgatggtgt tccaagaatg 600 agggaaaggc caatagggga tttggtcgtc ggactgaaac agctcggtgc tgacgttgaa 660 tgtactttag gcacaaactg tcctcccgtg cgtgttaacg caaatggtgg actgcctggt 720 ggaaaggtca agttgtctgg ctccatttcc agtcaatacc ttacggcttt gctcatggct 780 gcaccacttg ccttaggtga tgtggagatt gagatcattg acaagctcat atctgttccg 840 tacgtggaaa tgacacttaa gctgatggaa agattcggag tttcagccga acattccgat 900 agctgggatc gtttctttgt aaagggtggg cagaagtaca agtctcctgg caatgcttat 960 gtggaaggtg acgcttcttc agctagttac ttcttggctg gtgcagccat aactggcgag 1020 acagttaccg 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ccaaatcact ctccaatagg 300 atacttcttt tggctgcact gagtgaaggc acaactgttg tggacaactt gctcaactcc 360 gatgatatca actacatgct tgacgccttg aagaagttag gactcaatgt ggagagagat 420 agcgttaaca atcgtgctgt cgtagaagga tgtggtggaa tctttcctgc atctctggat 480 tctaagagcg acatcgagct ttacttgggc aatgctgcaa cagccatgag atccttaact 540 gctgctgtta ccgcagctgg tggaaatgct agttatgtgc ttgatggtgt tccaagaatg 600 agggaaaggc caatagggga tttggtcgtc ggactcaaac agctcggtgc tgacgttgaa 660 tgtactttag gcacaaactg tcctcccgtg cgtgttaacg caaatggtgg actgcctggt 720 ggaaaagtca agttgtctgg ctccatttcc agtcaatacc ttacggcttt gctcatggct 780 gcaccacttg ccttaggtga tgtggagatt gagatcattg acaagctcat atctgttccg 840 tacgtggaaa tgacacttaa gctgatggaa agattcggag tttcagccga acattccgat 900 agctgggatc gtttctttgt aaagggaggg cagaagtaca agtctcctgg aaacgcatac 960 gtggaaggtg acgcttcttc agctagttac ttcttggctg gtgcagccat aactggcgag 1020 acagttaccg tggaaggatg cggaactacc agcctccaag gtgatgtcaa gttcgcagag 1080 gtgttggaaa agatggggtg caaagtttcc tggacagaga actcagttac 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sequence <400> 103 tagttcccct gtcgtgtgca aa 22 <210> 104 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 104 caacagcagc ctcaccaatc ac 22 <210> 105 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 105 caagaacggt gctccttttt taag 24 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 106 agcccttcct ctgcatcctt a 21 <210> 107 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 107 ggctgtgttg cacacaaata gaga 24 <210> 108 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 108 cagcagcacg gtaggtagat tgt 23 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 109 ccgataagac ggcaactgat taaa 24 <210> 110 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 110 aggctggctt ctagtggaag gag 23 <210> 111 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 111 gggtttccgg ctggagacg 19 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 112 ccaaaagcaa ttttcgttat aagatgcc 28 <210> 113 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 113 ccagataatc tgtgggctcc tg 22 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 114 gcagcagctt gccttaagca 20 <210> 115 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 115 tgcttgtttc tgttgtcatc ataggtt 27 <210> 116 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 116 catttgttgg gtttccacgt acg 23 <210> 117 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 117 gagcgcggct aaaggtcaaa ac 22 <210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 118 ccgatttaca tggacttgat ggagt 25 <210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 119 ggtttgttga atccctctgt tggt 24 <210> 120 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 120 gccgcctcca gtgagtgttg ctgcttgtgt ag 32 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 121 gggtctgccc aatgaagcga 20 <210> 122 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 122 gccgcctcca taatgtgtga gtagttccca gataagg 37 <210> 123 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 123 gccgcctcca gtgagtgttg ctgcttgtgt ag 32 <210> 124 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 124 ccaaataata agtgagagag gggcat 26 <210> 125 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 125 gccgcctcca taatgtgtga gtagttccca gataagg 37 <210> 126 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 126 caacagcagc ctcaccaatc ac 22 <210> 127 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 127 gccgcctcca taatgtgtga gtagttccca gataagg 37 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 128 agcccttcct ctgcatcctt a 21 <210> 129 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 129 gccgcctcca taatgtgtga gtagttccca gataagg 37 <210> 130 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 130 cagcagcacg gtaggtagat tgt 23 <210> 131 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 131 gccgcctcca gtgagtgttg ctgcttgtgt ag 32 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 132 aggctggctt ctagtggaag gag 23 <210> 133 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 133 gccgcctcca taatgtgtga gtagttccca gataagg 37 <210> 134 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 134 ccaaaagcaa ttttcgttat aagatgcc 28 <210> 135 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 135 gccgcctcca gtgagtgttg ctgcttgtgt ag 32 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 136 gcagcagctt gccttaagca 20 <210> 137 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 137 gccgcctcca taatgtgtga gtagttccca gataagg 37 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 138 catttgttgg gtttccacgt acg 23 <210> 139 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 139 gccgcctcca gtgagtgttg ctgcttgtgt ag 32 <210> 140 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide primer sequence <400> 140 ccgatttaca tggacttgat ggagt 25 <210> 141 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide sequence <400> 141 Leu Gly Asn Ala Ala Thr 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Polypeptide sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be Ala, Ser, or Thr <400> 142 Ala Leu Leu Met Xaa Ala Pro Leu Thr 1 5 <210> 143 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DGT-31 and TRAP23 construct <400> 143 atggcacaga tcaacaagtc tgctaatggg gttaggaacg cttcactgat aagcaacttc 60 tccaataccc gtcaagccaa atcccctttc tccctctcat gcggaacaag actgaagaac 120 agcagcagag gtttgaagaa ggtggcagtt aggctcattg gctcccgtgt caaagtgtct 180 gcctcaatga ctgtgattga catccctggc tcaaagtcag ttactgccag agcattgttc 240 ctcgcagcag ctgctgatgg cactacaact cttttgagac ctcttcacag cgatgacacg 300 gaaggcttca ctgagggtct cactcgtttg ggatacgcag tggttagaga acccgatagg 360 tggcacatag aaggacgtcc ctccggtcca gcagcagcag atgcagaagt tcactgtagg 420 gacggtgcta caactgctcg ctttcttcca acccttgcag ctgctgctgc ctccggaacg 480 tatcgtttcg acgcatcagc tcagatgagg cgtagacccc tcgctcccct cacggaagct 540 cttagaacac ttggagtgga ccttaggcat gatggagctg aaggccacca ccccttgaca 600 attcaagcct ctggtgttaa gggtggagga cttacgctcg acgctggtga gtcatctcag 660 tacttgacag ctctgctcat gcttggtcct ctgaccgcag agggactgag aatagaagtt 720 acggagcttg tctctgctcc ttatgtggag atcacccttg caatgatgag aggctttggt 780 gtggaggttg ttagggaggg gaatactttc actgtgcctc ctggaggtta cagagctaca 840 acttatgcca tagaaccgga cgcaagcaca gcttcctact tctttgcagc agcagccctc 900 actgggaggg aagtgacggt gcctggcttg ggcactggag cacttcaagg tgatcttagg 960 ttcacggagg tcctcagaag gatggacgct gatgttcgca caacgtccga ctctacaaca 1020 gtgcgctcag atggtcgcct tgctgggttg actgtcaaca tgagggacat aagcgacaca 1080 atgccaacac tggcagctat agctccgtac gcaagctcac cagttaggat cgaggatgtc 1140 gcaaacaccc gtgtgaagga atgtgatagg ctggaggctt gcgctcagaa tctccgctca 1200 atgggcatca ccgttcgcac tggaccagat tggattgaga tccatcctgg gactcctaga 1260 ccgaccgaga tagccacaca cggtgatcat agaatcgtca tgtcatttgc cgtggctgga 1320 cttagaaccc ctgggatgtc ttacgatgac cctggctgcg ttcgcaagac ttttcctcgt 1380 tttcatgaag agtttgcagc cttcgtggag cgctcatccg ctggagagtg a 1431 <210> 144 <211> 1245 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> DGT-31 v3 nucleotide <400> 144 atgactgtga ttgacatccc tggctcaaag tcagttactg ccagagcatt gttcctcgca 60 gcagctgctg atggcactac aactcttttg agacctcttc acagcgatga cacggaaggc 120 ttcactgagg gtctcactcg tttgggatac gcagtggtta gagaacccga taggtggcac 180 atagaaggac gtccctccgg tccagcagca gcagatgcag aagttcactg tagggacggt 240 gctacaactg ctcgctttct tccaaccctt gcagctgctg ctgcctccgg aacgtatcgt 300 ttcgacgcat cagctcagat gaggcgtaga cccctcgctc ccctcacgga agctcttaga 360 acacttggag tggaccttag gcatgatgga gctgaaggcc accacccctt gacaattcaa 420 gcctctggtg ttaagggtgg aggacttacg ctcgacgctg gtgagtcatc tcagtacttg 480 acagctctgc tcatgcttgg tcctctgacc gcagagggac tgagaataga agttacggag 540 cttgtctctg ctccttatgt ggagatcacc cttgcaatga tgagaggctt tggtgtggag 600 gttgttaggg aggggaatac tttcactgtg cctcctggag gttacagagc tacaacttat 660 gccatagaac cggacgcaag cacagcttcc tacttctttg cagcagcagc cctcactggg 720 agggaagtga cggtgcctgg cttgggcact ggagcacttc aaggtgatct taggttcacg 780 gaggtcctca gaaggatgga cgctgatgtt cgcacaacgt ccgactctac aacagtgcgc 840 tcagatggtc gccttgctgg gttgactgtc aacatgaggg acataagcga cacaatgcca 900 acactggcag ctatagctcc gtacgcaagc tcaccagtta ggatcgagga tgtcgcaaac 960 acccgtgtga aggaatgtga taggctggag gcttgcgctc agaatctccg ctcaatgggc 1020 atcaccgttc gcactggacc agattggatt gagatccatc ctgggactcc tagaccgacc 1080 gagatagcca cacacggtga tcatagaatc gtcatgtcat ttgccgtggc tggacttaga 1140 acccctggga tgtcttacga tgaccctggc tgcgttcgca agacttttcc tcgttttcat 1200 gaagagtttg cagccttcgt ggagcgctca tccgctggag agtga 1245 <210> 145 <211> 414 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> DGT-31 protein <400> 145 Met Thr Val Ile Asp Ile Pro Gly Ser Lys Ser Val Thr Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ala Ala Ala Ala Asp Gly Thr Thr Thr Leu Leu Arg Pro 20 25 30 Leu His Ser Asp Asp Thr Glu Gly Phe Thr Glu Gly Leu Thr Arg Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Val Val Arg Glu Pro Asp Arg Trp His Ile Glu Gly Arg 50 55 60 Pro Ser Gly Pro Ala Ala Ala Asp Ala Glu Val His Cys Arg Asp Gly 65 70 75 80 Ala Thr Thr Ala Arg Phe Leu Pro Thr Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ser 85 90 95 Gly Thr Tyr Arg Phe Asp Ala Ser Ala Gln Met Arg Arg Arg Pro Leu 100 105 110 Ala Pro Leu Thr Glu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Val Asp Leu Arg His 115 120 125 Asp Gly Ala Glu Gly His His Pro Leu Thr Ile Gln Ala Ser Gly Val 130 135 140 Lys Gly Gly Gly Leu Thr Leu Asp Ala Gly Glu Ser Ser Gln Tyr Leu 145 150 155 160 Thr Ala Leu Leu Met Leu Gly Pro Leu Thr Ala Glu Gly Leu Arg Ile 165 170 175 Glu Val Thr Glu Leu Val Ser Ala Pro Tyr Val Glu Ile Thr Leu Ala 180 185 190 Met Met Arg Gly Phe Gly Val Glu Val Val Arg Glu Gly Asn Thr Phe 195 200 205 Thr Val Pro Pro Gly Gly Tyr Arg Ala Thr Thr Tyr Ala Ile Glu Pro 210 215 220 Asp Ala Ser Thr Ala Ser Tyr Phe Phe Ala Ala Ala Ala Leu Thr Gly 225 230 235 240 Arg Glu Val Thr Val Pro Gly Leu Gly Thr Gly Ala Leu Gln Gly Asp 245 250 255 Leu Arg Phe Thr Glu Val Leu Arg Arg Met Asp Ala Asp Val Arg Thr 260 265 270 Thr Ser Asp Ser Thr Thr Val Arg Ser Asp Gly Arg Leu Ala Gly Leu 275 280 285 Thr Val Asn Met Arg Asp Ile Ser Asp Thr Met Pro Thr Leu Ala Ala 290 295 300 Ile Ala Pro Tyr Ala Ser Ser Pro Val Arg Ile Glu Asp Val Ala Asn 305 310 315 320 Thr Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Leu Glu Ala Cys Ala Gln Asn Leu 325 330 335 Arg Ser Met Gly Ile Thr Val Arg Thr Gly Pro Asp Trp Ile Glu Ile 340 345 350 His Pro Gly Thr Pro Arg Pro Thr Glu Ile Ala Thr His Gly Asp His 355 360 365 Arg Ile Val Met Ser Phe Ala Val Ala Gly Leu Arg Thr Pro Gly Met 370 375 380 Ser Tyr Asp Asp Pro Gly Cys Val Arg Lys Thr Phe Pro Arg Phe His 385 390 395 400 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Phe Pro Gly Phe His 385 390 395 400 Glu Glu Phe Gly Ala Leu Arg Ala Arg Leu 405 410 <210> 147 <211> 1233 <212> DNA <213> Streptomyces davawensis <400> 147 atgccagttg ccgacatccc cggttccaag tccatcaccg cgcgcgccct cttcctggcg 60 gcggcggccg acggagtcac caccctcgtt cggccgctgc ggtcggacga caccgagggc 120 ttcgccgagg ggctggcccg gctcgggtac cgcgtcggga ggaccccgga cagctggcag 180 gtggacggcc gcccgcaggg ccccgcggtc gccgaggcgg acgtctactg ccgggacggc 240 gcgacgaccg cccgcttcct gccgacgctg gccgccgccg gccacggcac ctaccgcttc 300 gacgcctccg agcagatgcg ccgccgcccg ctgctgccgc tcacccgggc cctgcgcgag 360 ctgggcgtgg acctgcggca cgaggagcgg gacggccacc acccgctgac cgtgcgggcg 420 gccggggtcg cgggcggcga ggtgacgctg gacgccggac agtcctcgca gtacctgacc 480 gccctgctgc tgctcggccc gctcaccgag aagggcctgc gcatccatgt caccgacctg 540 gtctcggtgc cgtacatcga gatcaccctc gcgatgatgc gggcgttcgg ggtggaggtg 600 accagggaag gccatgactt cgtcgtcccg ccgggcggct accgcgccac cacctacgcc 660 atcgaacccg acgcctccac ctccagctac ttcttcgccg ccgcggccct ctccggtggc 720 gaggtgaccg tgccgggtct cggtgagggc gcgctccagg gcgacctggg cttcgtcgac 780 gtactgcgcc ggatgggcgc cgaggtggag atcggcgcgg accgcaccac ggtccgcggc 840 accggcgaac tgcgcggcct caccgtcaac atgcgggaca tctccgacac catgcccacc 900 ctcgccgcca tcgccccctt cgcctcgggg ccggtgcgca tcgaggacgt cgccaacacc 960 cgggtgaagg agtgcgaccg cctggaggcc tgcgcggaga acctgcggcg gctcggcgtg 1020 cgggtggaga cgggccccga ctggatcgag atccaccccg gcgccacccc cacaggcgcg 1080 gagatcaaga cctacggcga ccaccgcatc gtcatgtcct tcgccgtcac cggcctccgc 1140 gtgcccggta tttcgttcga cgaccccggc tgcgtccgca agactttccc cggtttccac 1200 gaggagttcg gggcgctgcg cgcgcggttg tga 1233 <210> 148 <211> 412 <212> PRT <213> Streptomyces turgidiscabies <400> 148 Met Ala Val Val Glu Ile Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ala Ala Ala Ala Asp Gly Val Thr Thr Leu Val Arg Pro 20 25 30 Leu Arg Ser Asp Asp Ser Glu Gly Phe Ala Glu Gly Leu Val Gly Leu 35 40 45 Gly Tyr Arg Val Gly Arg Thr Pro Gly Ala Trp Gln Ile Asp Gly Arg 50 55 60 Pro Gln Gly Pro Ala Ala Thr 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cgaccaccgc atcgtcatgt ccttcgcggt gaccggcctg 1140 cgcacacccg ggatcacctt cgacgacccg gggtgcgtac gcaagacgtt ccccgggttc 1200 cacgaggcgt tcggagagct gaggcgggta ctgggctag 1239 <210> 150 <211> 423 <212> PRT <213> Streptomyces acidiscabies <400> 150 Met Pro Leu Val Asp Ile Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ala Ala Ala Ala Asp Gly Val Thr Thr Leu Val Arg Pro 20 25 30 Leu Arg Ser Asp Asp Ser Glu Gly Phe Ala Glu Gly Leu Ser Ser Leu 35 40 45 Gly Tyr Arg Val Gly Arg Ala Pro Asp Val Trp Gln Val Asp Gly Arg 50 55 60 Pro Gln Gly Pro Ala Val Thr Asp Val Asp Val Tyr Cys Arg Asp Gly 65 70 75 80 Ala Thr Thr Ala Arg Phe Leu Pro Thr Leu Ala Ala Ala Gly His Gly 85 90 95 Thr Phe Arg Phe Asp Ala Ser Pro Gln Met Arg Arg Arg Pro Leu Leu 100 105 110 Pro Leu Thr Arg Ala Leu Arg Asp Leu Gly Val Asp Leu Arg His Glu 115 120 125 Asp Ala Glu Gly His His Pro Leu Thr Val Asn Ala Ala Gly Val Glu 130 135 140 Gly Gly Glu Val Val Leu Asp Ala Gly Gln Ser Ser Gln Tyr Leu Thr 145 150 155 160 Ala Leu 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tccaccgggg cgctctcggg cctcaccgtc aacatgcgcg acatctccga caccatgccg 900 accctggccg ccgtcgcacc gttcgcctcc tcgcccgtac ggatcgagga cgtcgccaac 960 acccgggtca aggagtgcga ccggctggag gcctgcgcgc ggaacctgcg cgccatgggc 1020 gtcaccgtgc acaccggccc cgactggacc gagatccacc ccggcacccc ccggcccgcc 1080 gagatcacca cgttcggcga ccaccgcatc gtgatgtcgt tcgcggtcgc ggcgctgcgc 1140 gtgcccggcg tcacctacga cgaccccggc tgcgtccgca agacgttccc cgagttccac 1200 gaggtcttcg cccggttcgc cgcggaaggc gccggctga 1239 <210> 158 <211> 413 <212> PRT <213> Streptomyces globisporus C-1027 <400> 158 Met Ser Val Ile Asp Ile Pro Gly Ser Lys Ser Val Thr Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ala Ala Ala Ala Asp Gly Thr Thr Thr Leu Leu Arg Pro 20 25 30 Leu Arg Ser Asp Asp Thr Glu Gly Phe Ala Glu Gly Leu Lys Ser Leu 35 40 45 Gly Tyr Ala Val Glu Gln Glu Ala Asp Arg Trp Arg Val Gln Gly Arg 50 55 60 Pro Ala Gly Pro Ala Ala Asp Asp Ala Asp Val Tyr Cys Arg Asp Gly 65 70 75 80 Ala Thr Thr Ala Arg Phe Leu Pro Thr Leu Val Ala Ala Ala Ala Ser 85 90 95 Gly Thr 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cgtgctgcgc ggaccgctgg tctcggacga ctccgagggc 120 ttcgcggagg gcctgatcac cctcggctac caggtcgaac ggggcccgga cgcctggacg 180 atcaccggcc gccccgaggg cccggccgtc aacgaggcgg acgtctactg ccgggacggc 240 gcgacgaccg cgcgcttcct gcccgcgctc gccgccgccg gacacggcct gttccgcttc 300 gacgcctccg cgcagatgcg ccgccgcccg ctcggcccgc tcacccgcgc cctgcgcgac 360 ctcggcgtcg acctcaccca ccaggaagaa gagggccacc acccgctgac cgtgcgggcc 420 gcgggcatca agggcggcca ggtcacgctg gacgccgggc tgtcgtccca gttcctgacc 480 gcgctgctgc tcctcgcccc gctcaccgag gaggggctgc ggatcaccgt gaccgacctg 540 gtctcggtgc cgtacgtgga gatcaccctc gtcatgatgc gccgcttcgg cgtcgagacg 600 gtccgcgagg gcgacacctt cgtcgtgccg cccggcggtt accgggccac cgactacccg 660 gtcgaaccgg acgcctccac ggcgagttac ttcctggccg ccgccgcgct caccggacgc 720 cgcgtcaccg tgcccgggct cggcgccggt tcgctccagg gcgatctgcg cttcgccgag 780 gtgctgcggt cgatgggcgc cgaggtgacg ctcacccgcg actcggtgac cgtcaccggc 840 gccgacggcg gccggctgcg cggactcacc gtgaacatgc gggacatctc cgacaccgtt 900 cccaccctcg ccgccatcgc ccccttcgcg gacgggccgg tacgcatcga ggacgtctac 960 aacacccgga tcaaggagtg cgaccggctc gacgcctgcg ccgagaacct gcgcgccctc 1020 ggcgtcccgg tcgccaccgg acgcgactgg atcgagatcc gcccggcccg ccccgccgcc 1080 gcccgcatcg cctgccgtgg cgaccaccgc atcgccatgt ccttcagcgt caccggcctg 1140 cgcacccccg gcatcaccct cgacgacccc gggtgcgtca agaagacgtt ccccggcttc 1200 cacgaggcgc tcgccgcgct gcggacagcc tgggaaacgg agtga 1245 <210> 168 <211> 410 <212> PRT <213> Kitasatospora setae KM-6054 <400> 168 Met Ser Leu Val Glu Ile Pro Gly Ser Lys Ser Val Thr Ala Arg Ala 1 5 10 15 Leu Phe Leu Ala Ala Ala Ala Asp Gly Val Thr Thr Leu Val Arg Pro 20 25 30 Leu Ala Ser Asp Asp Thr Glu Gly Phe Thr Glu Gly Leu Arg Ala Leu 35 40 45 Gly Tyr Gln Val Glu Arg Ala Glu Arg Glu Trp Arg Ile Thr Gly Arg 50 55 60 Pro Gln Gly Pro Gly Val Asp Gly Ala Ser Val Phe Cys Arg Asp Gly 65 70 75 80 Ala Thr Thr Ala Arg Phe Leu Pro Thr Leu Ala Ala Ala Gly His Gly 85 90 95 Thr Phe His Phe Asp Ala Ser Glu Gln Met Arg Arg Arg Pro Leu Gly 100 105 110 Pro Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asp Leu Gly Val Arg Leu Glu His Arg 115 120 125 Gly Ala Glu Gly His His Pro Leu Ser Ile Glu Ala Ser Gly Val Glu 130 135 140 Gly Gly Glu Val Thr Leu Asp Ala Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Leu Thr 145 150 155 160 Ala Leu Leu Leu Leu Gly Pro Leu Thr Arg Thr Gly Leu Arg Ile His 165 170 175 Val Thr Asp Leu Val Ser Ala Pro Tyr Ile Glu Ile Thr Leu Ala Met 180 185 190 Met Arg Ser Phe Gly Val Glu Val Ala Arg Glu Gly Asn Val Phe Asp 195 200 205 Val Pro Ala Gly Gly Tyr Thr Ala Ala Arg Tyr Pro Val Glu Pro Asp 210 215 220 Ala Ser Thr Ala Ser Tyr Phe Phe Ala Ala Ala Ala Leu Thr Gly Arg 225 230 235 240 Glu Val Thr Val Pro Gly Leu Gly Arg Gly Ala Leu Gln Gly Asp Leu 245 250 255 Lys Phe Val Glu Val Leu Glu Arg Leu Gly Ala Lys Val Glu Ile Gly 260 265 270 Thr Asp Ala Thr Thr Val Thr Gly Gly Thr Leu Thr Gly Gly Thr Val 275 280 285 Asn Met Arg Asp Ile Ser Asp Thr Met Pro Thr Leu Ala Ala Ile Ala 290 295 300 Pro Phe Ala Ser Gly Pro Ile Arg Ile Glu Asp Val Tyr Asn Thr Arg 305 310 315 320 Val Lys Glu Cys Asp Arg Leu Asp Ala Cys Ala Asp Asn Leu Arg Arg 325 330 335 Gln Gly Ile Asp Val Ala Thr Gly Arg Asp Trp Ile Glu Ile Arg Pro 340 345 350 Gly Ser Pro Lys Pro Val Glu Ile Glu Thr His Gly Asp His Arg Ile 355 360 365 Val Met Ser Phe Ala Val Ala Gly Leu Arg Thr Pro Gly Thr Ser Tyr 370 375 380 Asp Asp Pro Gly Cys Val Arg Lys Thr Phe Pro Gly Phe His Asp Ala 385 390 395 400 Phe Ala Ala Trp Ala Ala Gln Pro Glu Gly 405 410 <210> 169 <211> 1233 <212> DNA <213> Kitasatospora setae KM-6054 <400> 169 gtgtcgctgg tcgagatccc cggttcgaag tcggtcacgg cgcgcgcgct gttcctggcc 60 gccgcggcgg acggggtcac caccctggtg cggccgctgg cgtcggacga caccgagggc 120 ttcaccgagg gcctgcgcgc cctcggctac caggtggagc gcgccgagcg ggagtggcgg 180 atcaccggcc gcccgcaggg ccccggcgtc gacggcgcct cggtgttctg ccgggacggc 240 gcgaccaccg cccgcttcct gccgacgctg gccgccgccg ggcacggcac cttccacttc 300 gacgcctccg agcagatgcg ccgccgcccg ctcggcccgc tcaccaccgc gctgcgcgac 360 ctcggcgtcc ggctggagca ccgcggcgcc gagggccacc acccgctgag catcgaggcg 420 tccggcgtcg agggcggcga ggtcacgctc gacgccgggc tgtcctcgca gtacctgacg 480 gcgctgctgc tgctcggccc gctgacccgc accggcctgc ggatccacgt caccgacctg 540 gtctccgcgc cgtacatcga gatcaccctg gcgatgatgc gcagcttcgg cgtcgaggtc 600 gcccgcgagg ggaacgtgtt cgacgtcccg gccggcggct acaccgccgc ccggtacccg 660 gtcgagccgg acgcctccac cgcctcgtac ttcttcgccg ccgccgcgct gaccggccgc 720 gaggtgaccg tccccggcct cgggcgcggc gcgctccagg gcgacctgaa gttcgtcgag 780 gtgctggagc ggctcggcgc gaaggtcgag atcggcactg acgccaccac cgtcaccggc 840 ggcaccctga ccggcggcac cgtcaacatg cgcgacatct ccgacaccat gccgacgctc 900 gccgcgatcg ccccgttcgc ctccggcccg atccggatcg aggacgtcta caacacccgg 960 gtcaaggagt gcgaccggct ggacgcctgc gccgacaacc tgcgccgcca gggcatcgac 1020 gtcgccaccg gccgggactg gatcgagatc cgccccggca gcccgaagcc ggtcgagatc 1080 gagacccacg gcgaccaccg gatcgtgatg tccttcgcgg tggccggcct gcgcaccccc 1140 ggcaccagct acgacgaccc gggctgcgtc cgcaagacct tccccggctt ccacgacgcg 1200 ttcgccgcct gggccgccca gcccgagggc tga 1233 <210> 170 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Class IV EPSPS protein conserved amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is T or A <400> 170 Thr Ala Arg Xaa Leu Phe 1 5 <210> 171 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Class IV EPSPS protein conserved amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X is T or A <400> 171 Glu Gly Phe Xaa Glu Gly 1 5 <210> 172 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Class IV EPSPS protein conserved amino acid sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X is T or A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X is A or V <400> 172 Gly Ala Thr Thr Ala Arg Phe Leu Pro Xaa Leu Xaa Ala Ala 1 5 10 <210> 173 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Class IV EPSPS protein conserved amino acid sequence <400> 173 Phe Asp Ala Ser 1

Claims (37)

  1. 클래스 IV EPSPS 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 클래스 IV EPSPS 폴리펩티드가 서열 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 및 168로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 클래스 IV EPSPS와 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 클래스 IV EPSPS 폴리펩티드가 서열 170 내지 173을 포함하는 것인 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 클래스 IV EPSPS 폴리펩티드가 폴리펩티드 내의 글리포세이트 결합 부위에 인접한 내부 α-나선을 포함하고, 내부 α-나선은 클래스 I EPSPS 폴리펩티드에 비해 활성 부위 내로 밀려들어가, 글리포세이트 포스포네이트를 가리는 것인 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 서열 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167 및 169로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열에 적어도 80% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  6. 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 벡터.
  8. 제6항에 있어서, 핵산의 코딩 서열이 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것인 벡터.
  9. 이종성 핵산으로서 제1항에 따른 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
  10. 제8항에 있어서, 프로모터가 AtUbi10 프로모터인 벡터.
  11. 제9항에 있어서, 식물 세포인 숙주 세포.
  12. 제1항에 따른 핵산을 포함하는 트랜스제닉 (transgenic) 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포.
  13. 제12항에 있어서, 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 및/또는 식물 세포가 동일한 종의 야생형 식물에 비해 글리포세이트에 내성인 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포.
  14. 제12항에 있어서, 핵산이 LGNAAT (서열 141)를 코딩하지 않고, ALLMXAPLT (여기서, X는 알라닌, 세린, 및 트레오닌으로 이루어지는 군으로부터 선택됨) (서열 142)를 코딩하지 않는 것인 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포.
  15. 제12항에 따른 트랜스제닉 식물, 식물 부위, 식물 기관, 식물 종자, 및/또는 식물 세포로부터 생산된 재생가능한 세포의 조직 배양액.
  16. 제12항에 따른 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포로부터 생산된 원형질체.
  17. 제15항에 있어서, 재생가능한 세포가 잎, 꽃가루, 배, 자엽, 배축, 분열조직 세포, 뿌리, 근단, 꽃밥, 꽃, 줄기 및 꼬투리로 이루어지는 군으로부터 선택된 조직 종류로부터 생산되는 것인 조직 배양액.
  18. 글리포세이트에 저항성인, 제15항에 따른 조직 배양액으로부터 재생된 식물.
  19. 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포를 제1항에 따른 핵산 분자로 형질전환시키고;
    클래스 IV EPSPS 폴리펩티드를 발현시키는 것
    을 포함하는, 글리포세이트에 저항성인 트랜스제닉 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포를 생성하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 형질전환된 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포가 글리포세이트에 저항성인 방법.
  21. 이종성 핵산으로서 제1항에 따른 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 종자를 경작 영역에 식재하고;
    식물 또는 식물 종자에 유의한 영향을 주지 않으면서 경작 영역에서 잡초를 방제하기 위해 충분한 양의 제초제를 경작 영역에 적용하는 것
    을 포함하는, 제초제-저항성 식물을 함유하는 경작 영역에서 잡초를 방제하기 위한 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제초제가 글리포세이트인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제1항에 따른 이종성 핵산 분자를 포함하는 식물 또는 식물 종자가 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산을 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제2 핵산이 aad-1 또는 aad-12를 포함하는 것인 방법.
  25. 식물을 제1항에 따른 핵산과 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 구축물로 형질전환시키고;
    형질전환된 식물을 재생시키고;
    핵산 분자를 발현시켜 클래스 IV EPSPS 폴리펩티드를 생산하는 것
    을 포함하는, 식물에서 제초제에 대한 저항성을 부여하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 제초제가 글리포세이트인 방법.
  27. 제25항에 있어서, DNA 구축물이 식물 내에서 발현가능한 이종성 폴리펩티드를 코딩하는 제2 핵산 분자를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 이종성 폴리펩티드가 aad-1 또는 aad-12를 포함하는 것인 방법.
  29. 프로모터에 작동가능하게 연결된 제1항에 따른 핵산이 이종성 핵산으로서 게놈 내로 안정적으로 통합된 식물.
  30. 제29항에 있어서, 대두 식물인 식물.
  31. 제29항에 있어서, 옥수수 식물인 식물.
  32. 제29항에 있어서, 밀, 옥수수, 대두, 담배, 브라키아리아 (Brachiaria), 벼, 기장, 보리, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지, 알팔파, 면화, 당근, 감자, 사탕무우, 얌, 상추, 시금치, 페튜니아, 장미, 국화, 잔디풀 (turf grass), 소나무, 전나무, 가문비나무, 중금속 축적 식물, 해바라기, 홍화, 평지씨, 및 아라비돕시스 (Arabidopsis)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 식물.
  33. 제29항에 있어서, 속 아스파라구스 (Asparagus), 아베나 (Avena), 브라키아리아, 브라시카 (Brassica), 시트러스 (Citrus), 시트룰러스 (Citrullus), 캅시쿰 (Capsicum), 쿠쿠르비타 (Cucurbita), 다우쿠스 (Daucus), 에리게론 (Erigeron), 글라이신 (Glycine), 고시퓸 (Gossypium), 호르데움 (Hordeum), 헬리안투스 (Helianthus), 락투카 (Lactuca), 롤륨 (Lolium), 리코페르시콘 (Lycopersicon), 말루스 (Malus), 마니호트 (Manihot), 니코티아나 (Nicotiana), 오리코프라그무스 (Orychophragmus), 오리자 (Oryza), 페르세아 (Persea), 파세올루스 (Phaseolus), 피숨 (Pisum), 피루스 (Pyrus), 프루누스 (Prunus), 라파누스 (Raphanus), 세칼레 (Secale), 솔라눔 (Solanum), 소르검 (Sorghum), 트리티쿰 (Triticum), 비티스 (Vitis), 비그나 (Vigna), 및 제아 (Zea)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 종인 식물.
  34. 제9항에 있어서, 식물을 생산하도록 재생가능하지 않은 것인 숙주 세포.
  35. 제12항에 있어서, 식물을 생산하도록 재생가능하지 않은 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포.
  36. 제19항에 있어서, 식물을 생산하도록 재생가능하지 않은 식물, 식물 부분, 식물 기관, 식물 종자, 또는 식물 세포가 형질전환되는 것인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 핵산의 코딩 서열이 식물 내에서의 발현을 위해 설계된 합성 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
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