MX2014009343A - Plantas resistentes al glifosato y metodos asociados. - Google Patents

Plantas resistentes al glifosato y metodos asociados.

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Justin M Lira
Robert M Cicchillo
Carla Yerkes
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Dow Agrosciences Llc
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Abstract

La presente descripción se refiere a ciertos polipéptidos derivados de enzimas DGT procariotas y ácidos nucleicos útiles en la codificación de los mismos.

Description

PLANTAS RESITENTES AL GLIFOSATO Y MÉTODOS ASOCIADOS Reclama Prioridad Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense Serial No. 61 /593,555 presentada el 01 de febrero de 2012 y tambien para la Solicitud de Patente Provisional Estadounidense Serial No. 61 /625,222, presentada el 17 de abril de 2012.
Declaración de Acuerdo con 37 C.F.R. § 1.821 (c) o (e) - el Listado de Secuencias Presentarse como Archivo de Texto ASCII De conformidad con 37 C. F.R. § 1 .821 (c) o (e) , un archivo que contiene una versión de texto ASCI I del Listado de Secuencias se ha presentado concomitante con esta solicitud .
Campo de la Invención La presente descripción trata de la bioteenología vegetal. Casos particulares relacionados con los polipéptidos nuevos involucrados en el metabolismo de N-(fosfonometil) glicina, un ácido nucleico que codifica tales polipéptidos. Casos particulares relacionados con plantas, partes de la planta y células vegetales que comprenden polipéptidos y/o ácidos nucleicos anteriores.
Antecedentes de la Invención Las diferentes especies de maleza siempre han sido un problema en los campos cultivados. Aunque el control de la maleza puede ser una operación intensa, ésta se ha visto facilitada gracias a la disponibilidad de herbicidas qu ímicos que acaban con ésta. El uso de herbicidas, junto con variedades mejoradas de cultivo y fertilizantes, implica una importante contribución a la "revolución verde" en la agricultura. Son especialmente útiles los herbicidas que poseen un amplio espectro de actividad herbicida. Desafortunadamente, los herbicidas de amplio espectro tienen un efecto perjudicial en los cultivos expuestos al herbicida. Una manera de solucionar este problema sería produciendo plantas de cosecha tolerantes a un amplio espectro de herbicidas.
Un ejemplo de herbicida de amplio espectro es N-fosfonometilglicina, también conocido como glifosato. El glifosato ha sido muy usado por los agricultores de todo el mundo para controlar la maleza antes de la siembra, por ejemplo, en la agricultura sin labranza. Además, el glifosato es un medio eficaz para controlar la maleza entre los ciclos de producción y rotaciones de la cosecha. El glifosato no se transmite a los suelos después de su uso y es considerado como u no de los herbicidas qu ímicos más seguros para el medio ambiente y más efectivos disponibles para su uso en la agricultura.
El glifosato mata las plantas inhibiendo la vía metabólica del ácido siqu ímico. Esta vía lleva a una biosíntesis de componentes aromáticos, incluyendo aminoácidos, vitaminas y hormonas vegetales. El glifosato bloquea la condensación de ácido fosfoenolpirúvico (PEP por sus siglas en ingles) y ácido 3-fosfosiquímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfosiquímico uniéndose a una actividad inhibidora de la síntesis de la enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato, comúnmente conocida como "síntesis EPSP" y "EPSPS".
Desafortunadamente, no se conoce ningún cultivo vegetal naturalmente tolerante al glifosato y por lo tanto, el uso de tal herbicida para el control de la maleza en campos cultivados, está limitado. Un método para producir un cultivo tolerante al glifosato es introduciendo un gen que codifica una forma de gen EPSPS tolerante al glifosato en la planta de cultivo usando la téenica de ingeniería genética. Usando mutagénesis química, se han producido EPSPS en bacterias tolerantes al glifosato y los genes heterólogos fueron introducidos en las plantas para producir plantas tolerantes al glifosato. Ver, por ejemplo, Comai et al. (1983) Science 221 :370-71 . Los genes EPSPS heterólogos pueden estar sobreexpresados en las plantas de cultivo para obtener el nivel de tolerancia deseado.
Los ejemplos anteriores de las técnicas y limitaciones relacionadas están pensados para ser ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de las técnicas relacionadas resultarán evidentes para los expertos tras leer las especificaciones.
Breve Descripción de la Invención En la presente se describen los polipéptidos aislados con al menos 90% de identidad a SEC I D No. : 1 y ácidos nucleicos que codifican un polipeptido con al menos 90% de identidad a SEC I D No. : 1 ( or ejemplo. , SEC ID No. : 2-4) . También se describen plantas, partes de plantas, órganos vegetales, semillas y células vegetales que comprenden un polipéptido heterólogo con al menos 90% de identidad a SEC I D No. : 1 .
Algunas modalidades incluyen una planta, una parte de una planta, un órgano vegetal, una semilla y/o una célula vegetal que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 90% de identidad a SEC ID No. : 1 . En particular, el ácido nucleico heterólogo comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 80% de identidad de secuencia a SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3. Algunas modalidades incluyen una planta, una parte de una planta , un órgano vegetal, una semilla y/o una célula vegetal que comprende un ácido nucleico heterólogo que hibridiza a otro ácido nucleico teniendo SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3 bajo condiciones exigentes. Ejemplos: la planta, parte de una planta, el órgano vegetal , la semilla y/o la célula vegetal que comprende un ácido nucleico heterólogo que hibridiza a otro ácido nucleico con SEC I D No. : 2: o SEC I D No. : 3 bajo condiciones exigentes, comprende un polipéptido codificado por el ácido nucleico heterólogo que confiere tolerancia al glifosato (o aumenta la tolerancia al glifosato) a la planta, parte de la planta, órgano vegetal , semilla y/o célula vegetal.
En modalidades adicionales, la descripción se refiere con los métodos de generar una planta, parte de una planta, órgano vegetal, semilla y/o celula vegetal resistente al glifosato que comprende: transformar una planta, parte de una planta , órgano vegetal , semilla y/o célula vegetal con un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 90% de identidad a SEC ID No. : 1 ; y q ue expresa el ácido nucleico para producir el polipéptido con al menos 90% de identidad a SEC I D No. : 1 .
Otras modalidades incluyen vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 90% de identidad a SEC ID No. : 1 . Ejemplos incluyen vectores que comprenden un ácido nucleico que codifica un polipéptido con al menos 95% de identidad a SEC I D No. : 1 . Por ejemplo, un vector puede comprender una secuencia de ácido nucleico con al menos 90% de identidad a SEC ID No.: 2 o SEC I D No. : 3.
Modalidades particulares incluyen plantas y células vegetales tolerantes al glifosato que cuentan con un polipéptido heterólogo con al menos 90% de identidad a SEC ID No. : 1 .
Modalidades adicionales incluyen métodos para controlar la maleza en un campo o área bajo cultivo que contiene plantas resistentes al glifosato. Tal método comprende: plantar una planta o semilla que comprenda un ácido nucleico que codifique un polipéptido heterólogo con al menos 90% de identidad SEC I D No. : 1 en el campo o área de cultivo y aplicar en tal campo o área, suficiente glifosato para controlar la maleza sin afectar demasiado a la planta.
En algunas modalidades, la descripción se refiere a las celulas regenerables para su uso en el cultivo de tejidos de plantas resistentes a glifosato. Tal cultivo de tejidos podría regenerar plantas con características fisiológicas o morfológicas de las anteriores plantas resistentes al glifosato y también regenerar plantas con el mismo genotipo de las plantas resistentes al glifosato. Las células regenerables en tales cultivos de tejidos podrían ser, por ejemplo, embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, flores, semillas, vainas y tallos. Modalidades particulares se refiere con plantas regeneradas a través de un cultivo de tejido de acuerdo con lo anterior.
En algunas modalidades, la presente descripción hace referencia a las células que no son regenerables para producir plantas, por ejemplo, para su uso en la producción de líneas celulares de plantas resistentes al glifosato. En otra modalidad , la descripción hace referencia a las plantas que comprenden en parte tales células.
En determinadas modalidades, la presente descripción hace referencia a la aplicación de múltiples herbicidas a cosechas plantadas en un área bajo cultivo. La aplicación excesiva de glifosato, además de múltiples herbicidas, aprovecha las distintas propiedades herbicidas, de forma que se obtiene control de las semillas con una combinación mejorada de flexibilidad y economía . Por ejemplo, los herbicidas individuales pueden poseer distintas longevidades en el área bajo cultivo, es decir, algunos herbicidas pueden persistir y ser efectivos durante un periodo de tiempo relativamente prolongado una vez aplicados en el área , mientras que otros pueden degradarse en otros y/o en compuestos no activos. Un sistema de aplicación de herbicida mejorado de acuerdo con determinada modalidad permite el uso de glifosato y múltiples herbicidas, de forma que el productor puede adaptar la selección de herbicidas concretos para su uso en una situación determinada.
En otras modalidades, la presente descripción refiere a los metodos y composición para hacer y usar una planta tolerante a más de un herbicida o clase o subclases de herbicida, como se describe a continuación . En modalidades particulares, la planta es tolerante al glifosato y a otro herbicida (o clase o subclase de herbicida) o producto químico (o clase o subclase de producto qu ímico) ( por ejemplo, fungicidas, insecticidas, reguladores de crecimiento de plantas y similares). Tales plantas pueden usarse, por ejemplo, en métodos que comprendan tratamiento de cultivo con varios herbicidas. Por lo tanto, la descripción proporciona plantas resistentes a herbicidas que toleran el tratamiento con un herbicida o combinación de herbicidas (incluyendo una combinación de herbicidas que actúan de un modo diferente) o que toleran el tratamiento con una combinación de al menos un herbicida y un producto qu ímico. De esta manera, se describen métodos mejorados de cultivo de plantas en los que la maleza está selectivamente controlada.
Una planta resistente a herbicidas, de acuerdo con algunas modalidades, puede comprender una molecula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo que confiere tolerancia al glifosato y u na molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2 ,4-D) . De acuerdo con los párrafos anteriores, se proporcionan plantas que comprenden al menos una tercera molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que proporciona a la planta un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia al herbicida , resistencia a insectos; un rasgo agronómico; resistencia a enfermedades, un rasgo modificado de ácido graso y un rasgo de fitato reducido.
En algunos ejemplos, la planta resistente a herbicidas comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al glifosato y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia al glufosinato. Algunos ejemplos incluyen plantas resistentes a herbicidas que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que proporciona a la planta un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia al herbicida, resistencia a insectos; un rasgo agronómico; resistencia a enfermedades, un rasgo modificado de ácido graso y un rasgo de fitato reducido.
En algu nos ejemplos en particular, la planta resistente a herbicidas comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipeptido que confiere tolerancia al glifosato y una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que confiere tolerancia a un herbicida que inhibe la acetolactato sintasa (ALS por sus siglas en inglés) (Lee et al. (1988) EM BOJ . 7: 1241 ) , también conocida como acetohidroxiácido sintasa (AHAS por sus siglas en inglés) (Miki et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449). Algunos ejemplos incluyen plantas resistentes a herbicidas que comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que proporciona a la planta un rasgo seleccionado del grupo que consiste de tolerancia al herbicida, resistencia a insectos; un rasgo agronómico; resistencia a enfermedades, un rasgo modificado de ácido graso y un rasgo de fitato reducido.
En algunas modalidades, el ácido nucleico puede combinarse (o "apilarse") en una planta con cualquier otra molécula de ácido nucleico y sin limitación para proporcionar una resistencia o tolerancia adicional al glifosato u otro herbicida, para proporcionar, entre otras cosas resistencia a ciertos insectos o enfermedades, mejoras nutricionales, características agronómicas mejoradas, una proteína u otro producto útil en usos alimenticios, industriales, farmacéuticos u otros. Los ejemplos incluyen el apilamiento de dos o más ácidos nucleicos dentro del genoma de una planta. Este "apilamiento de genes" puede conseguirse a través de un cultivo tradicional de plantas usando dos o más casos, la transformación de una planta con un constructo q ue contiene las secuencias de interes, la retransformación de una planta transgénica, o la adición de nuevos rasgos a través de la integración dirigida a través de una recombinación homologa. Ejemplos de tal apilamiento incluyen una combinación de lo siguiente: un ácido nucleico dgt28 un ácido nucleico Cry34Ab1 ; un ácido nucleico Cry35Ab1 ; un ácido nucleico Cry1 F; un ácido nucleico Cryl Ac; un ácido nucleico aad-12 ; un ácido nucleico aacf-1 ; un ácido nucleico paf; y un ácido nucleico DSM-2.
Además de los aspectos ejemplares y casos descritos anteriormente , otros aspectos y casos serán evidentes tras el estudio de las siguientes descripciones.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1 I ncluye una alineación de la secuencia parcial de ejemplares de enzimas sintasa EPSP (es decir. , DGT-28, DGT-32, DGT-33, y otros) . Estos tres ejemplares de enzimas DGT comparten una alanina conservada en la posición del aminoácido de la enzima sintasa 96 EPSP aroA. La ubicación de este aminoácido se indica mediante un asterisco y el residuo de aminoácido está subrayado.
Figura 2 Incluye un alineación del ejemplar de la enzima DGT (es decir , DGT-1 , DGT-3, y DGT-7). La ubicación del residuo del aminoácido mutado que fue cambiado de una glicina a una alanina está indicada con el primer asterisco. La ubicación del residuo del segundo aminoácido mutado que fue cambiado de una n treonina a una isoleucina está indicada con el segundo asterisco. La ubicación del residuo del tercer aminoácido mutado que fue cambiado de una prolina a una serina está indicada con el tercer asterisco. 5 Figuras 3-30 I ncluye mapas de varios plásmidos ejemplares: pDAB107527 (Figura 3); pDAB105530 (Figura 4); pDAB105531 (Figura 5); pDAB105532 (Figura 6); pDAB105533 (Figura 7) ; pDAB 105534 (Figura 8); pDAB4104 (Figura 9); pDAB102715 (Figura 10); pDAB 107532 (Figura 1 1 ); pDAB 107534 (Figura 12); ío pDAB 102785 (Figura 13); pDAB 100445 (Figura 14) ; pDAB102946 (Figura 15); pDAB 100469 (Figura 16) ; pDAB102028 (Figura 17); pDAB1 02029 (Figura 18); pDAB102032 (Figura 19); pDAB 102034 (Figura 20); pDAB 100429 (Figura 21 ); pDAB 100442 (Figura 22) ; pDAB 100430 (Figura 23) ; pDAB 102036 (Figura 24) ; pDAB102038 15 (Figura 25); pDAB 102040 (Figura 26) ; pDAB102042 (Figura 27) ; pDAB107712 (Figura 28); pDAB107713 (Figura 29); and pDAB 107714 (Figura 30).
Figura 31 I ncluye valores IC50 obtenidos tras la introducción de varias mutaciones en DGT-1 (A) y DGT-7 (B) usando 1 mM 20 PEP. Para la Figura 31 (A) y Figura 31 (B) curvas IC5o, los triángulos cerrados representan el tipo salvaje, los círculos cerrados representan mutantes GA, los cuadrados abiertos representan mutantes GAPS y los cuadrados cerrados representan mutantes TI PS. 5 Figuras 32-46 I ncluye mapas de varios plásmidos ejemplares: pDAB 102719 (Figura 32); pDAB102718 (Figura 33); pDAB 107663 (Figura 34); pDAB107664 (Figura 35); pDAB 107665 (Figura 36); pDAB 107666 (Figura 37); pDAB 109812 (Figura 38) ; pDAB 101556 (Figura 39) ; pDAB 107698 (Figura 40) ; pDAB108384 (Figura 41 ); pDAB 108385 (Figura 42); pDAB108386 (Figura 43); pDAB1 08387 (Figura 44); pDAB102716 (Figura 45); pDAB 102717 (Figura 46); pDAB 1 10828 (Figura 47); pDAB 1 10827 (Figura 48) ; pDAB 107545 (Figura 49) ; pDAB 107548 (Figura 50) ; pDAB 107553 (Figura 51 ); pDAB 102792 (Figura 52); pDAB 107602 (Figura 53); and pDAB107533 (Figura 54) .
Descripción Detallada de la Invención /. Descripción General En el presente documento se dan a conocer polipeptidos nuevos que actúan en el metabolismo de la N-(fosfonometil) glicina, y los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos. En algunos ejemplos, tales polipéptidos confieren tolerancia (o aumentan la tolerancia) al glifosato en una célula de una planta, con una expresión heteróloga del polipéptido, por ejemplo sin afectar adversamente la unión de EPSP sintasa con su sustrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP por sus siglas en inglés).
II. Términos A fin de aclarar más detalladamente el alcance de esta descripción, se proporcionan las siguientes definiciones, términos y abreviaturas específicos.
A menos que se defina específicamente de otro modo, todos los terminos téenicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado que usualmente les asigna experto en la técnica. A menos que resulte claro de algún otro modo en el contexto en que aparecen , los términos en singular incluyen el plural y se entiende que los términos en plural incluyen el singular. Por lo tanto, los artículos indefinidos “un" y “una” usados antes de un elemento o componente no son restrictivos respecto de la cantidad de instancias del elemento o componente. En aquellos casos en que se indican intervalos numéricos ( por ejemplo, “menos que aproximadamente de X”, “menos que X”, y “por ejemplo, Xi ... y X2”), se entiende que los intervalos incluyen todos los valores e intervalos de valores dentro del intervalo indicado, como si estos valores e intervalos incluidos hubiesen sido indicados expresamente.
Como se entiende en el presente documento, los términos “comprende”, “incluye", “tiene” y “contiene”, y las variaciones de estos, no son restrictivos (es decir, no son exclusivos) . Por ejemplo, una composición o un método que comprende una lista de elementos no se limita solamente a tales elementos. Tal composición o método puede incluir (o puede no incluir) otros elementos no enumerados de manera expresa o inherentes a la composición o método. Asimismo, a menos que se indique expresamente lo contrario, la conjunción “o” se usa en sentido inclusivo (y no es exclusiva) . Por ejemplo, una condición “A o B” se satisface por medio de cualquiera de los siguientes: A es verdadero (o está presente) y B es falso (o no está presente) , A es falso (o no está presente) y B es verdadero (o está presente) , y tanto A como B son verdaderos (o están presentes).
Planta: en el presente documento, el termino “planta” incluye una planta entera y todos sus descendientes, células, tejidos o partes de una planta. El término “partes de plantas" incluye todas las partes de una planta, incluidos, a modo de ejemplo y sin limitaciones: semillas (incluidas semillas maduras y semillas inmaduras), un corte de una planta, una célula de una planta, un cultivo de una célula de una planta, un órgano de una planta ( por ejemplo, polen, embriones, flores, frutos, brotes, hojas, raíces, tallos y explantes). Un tejido de una planta u órgano de una planta puede ser una semilla, protoplasto, callo o cualquier otro grupo de células de planta que esté organizado en una unidad estructural o funcional . Una célula o un cultivo de tejido de una planta tener capacidad para regenerar una planta que tenga las características fisiológicas y morfológicas de las planta de la que se obtuvo la célula o tejido, y de regenerar una planta que tenga sustancialmente el mismo genotipo que tal planta. En contraposición, algunas células de planta no tienen la capacidad de ser regeneradas para producir plantas. Las células regenerables de una célula o un cultivo de tejido de una planta pueden ser embriones, protoplastos, células meristemáticas, callos, polen, hojas, anteras, raíces, puntas de raíces, estigmas, flores, núcleos, espigas, mazorcas, cáscaras o tallos.
Las partes de plantas incluyen partes cosechables y partes útiles para la propagación de progenie de plantas. Las partes de plantas que son útiles para la propagación incluyen, a modo de ejemplo y sin limitaciones: semillas, frutos, un recorte, una plántula y un rizoma. Una parte cosechable de una planta puede ser cualquier parte útil de una planta, incluidos, a modo de ejemplo y sin limitaciones: flores, polen, plántulas, tuberculos, hojas, tallos, frutos, semillas y raíces.
Una célula de una planta es la unidad estructural y fisiológica de la planta, que comprende un protoplasto y una pared celular. Una célula de una planta puede tener la forma de una célula única aislada o de un conjunto de células (por ejemplo, un callo friable y una célula cultivada) y puede ser parte de una unidad organizada superior (por ejemplo, un tejido de una planta, órgano de una planta y planta) . Por lo tanto, una célula de una planta puede ser un protoplasto, una célula productora de gametos o una célula o un grupo de células que pueden regenerarse en una planta nueva. En este sentido, una semilla, que comprende múltiples células de planta y puede regenerarse en una planta entera, se considera una “célula de planta” en las modalidades en el presente documento.
Resistencia/tolerancia a los herbicidas: cuando se indica que las plantas son resistentes o tolerantes al glifosato, significa que la aplicación de una cantidad determinada de glifosato en la planta no la afecta de manera significativa o la mata, mientras que una planta de tipo silvestre de la misma especie se vería afectada de manera significativa o moriría a causa de la aplicación de esa cantidad de glifosato. Una planta puede ser naturalmente tolerante a un herbicida en particular, o una planta puede considerarse tolerante a un herbicida como resultado de ingeniería genética, como por ejemplo, cría selectiva, transformación genética y/o la introducción de un transgén dentro del genoma de la planta. La frase “planta resistente al glifosato” se refiere a una planta que contiene un polipéptido o molécula de ácido nucleico que confiere tolerancia al herbicida cuando se administra a una planta heteróloga u otro organismo que la expresa (es decir, hace que la planta u otro organismo sea tolerante al herbicida) .
Una planta que es resistente o tolerante al glifosato puede mostrar algunos efectos mínimos debido a la aplicación de glifosato a la planta. Por ejemplo, puede haber una alteración en el crecimiento o desarrollo normal de la planta, por el cual la planta puede demostrar señales o síntomas que se refieren con el estrés o una enfermedad. Tales impacto mínimo resultante de la aplicación de glifosato en las plantas que son resistentes o tolerantes al glifosato contrasta con el efecto adverso que causa la aplicación de glifosato en plantas que son susceptibles a este. Una persona experta en la materia puede distinguir entre las plantas que son resistentes al glifosato y las plantas que son susceptibles al glifosato. La aplicación de glifosato a las plantas que comprenden un ácido nucleico que confiere resultados de tolerancia al glifosato ocasiona un efecto mucho menor que la aplicación de la misma cantidad de glifosato a un planta de la misma especie que no comprende un ácido nucleico que confiere tolerancia al glifosato.
Una planta que es tolerante a un herbicida u otro producto químico muestra una mejor tolerancia que una planta de control apropiada. Los daños resultantes del tratamiento con un herbicida u otro producto qu ímico se pueden evaluar considerando cualquier parámetro de crecimiento o bienestar de las plantas. Tales parámetros son conocidos para expertos en la téenica, y su selección queda a discreción de la persona experta. El daño ocasionado a la planta se puede evaluar por inspección visual y/o análisis estadístico de un parámetro adecuado o más de crecimiento o bienestar de la planta en plantas individuales o un grupo o grupos de plantas. Por lo tanto, el daño se puede evaluar considerando parámetros que incluyen , a modo de ejemplo y sin limitaciones: altura de la planta, peso de la planta, color de las hojas, largo de las hojas, floración , fertilidad , formación de estigmas, rendimiento y producción de semillas. Los daños también se pueden evaluar estudiando el plazo transcurrido hasta una etapa determinada del desarrollo ( por ejemplo, formación de estigmas, floración y liberación de polen) o el plazo transcurrido hasta que la planta se ha recuperado del tratamiento con un producto químico y/o herbicida especifico.
Al hacer evaluaciones de daños, se pueden asignar valores a determinados grados de daños a fin de poder realizar un análisis estadístico o comparaciones cuantitativas. El uso de intervalos de valores para describir grados particulares de daño resulta conocido en la materia, y se puede usar cualquier intervalo o escala adecuados. Por ejemplo, se pueden asignar puntajes de daños por herbicidas (tambien denominados puntajes de tolerancia). Asimismo, la tolerancia a un herbicida se puede indicar por medio de otras clasificaciones de esta escala, en las que una planta de control apropiada (o g rupo de plantas de control) exhibe un puntaje estadísticamente más bajo en la escala en respuesta a un tratamiento con herbicida que un grupo de plantas sujeto.
Los daños causados por un herbicida u otro producto químico se pueden evaluar en diferentes momentos después de que una planta ha sido tratada con un herbicida. A menudo, los daños se evalúan aproximadamente mismo momento en que la planta de control exhibe el daño máximo. A veces, los daños se evalúan después de un plazo durante el cual una planta de control que no se trató con un herbicida u otro producto químico ha crecido y/o se ha desarrollado de manera mensurable en comparación con el tamaño que ten ía o la etapa en que se encontraba cuando se administró el tratamiento. Los daños se pueden evaluar a diferentes intervalos adecuados, como a las 12 horas, a los 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13 y/o 14 días, a las 3 y/o 4 semanas o a intervalos más prolongados, despues de que una planta sujeto ha sido tratada con herbicida. Cualquier plazo de evaluación es adecuado, siempre que permita detectar una diferencia en la respuesta al tratamiento de las plantas de prueba y de control.
Un herbicida no “afecta de manera significativa” una planta cuando no tiene ningún efecto en la planta, cuando tiene un cierto efecto en la planta del cual está después se recupera o bien cuando tiene un efecto en la planta que es perjudicial pero que se ve compensado, por ejemplo, con el efecto del herbicida específico en las malezas. Por lo tanto, por ejemplo, una planta de cultivo puede no verse “afectada de manera significativa” por un herbicida u otro tratamiento si la planta demuestra una disminución de menos de aproximadamente 25%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 15% , menos de aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 9% , menos de aproximadamente 8% , menos de aproximadamente 7% , menos de aproximadamente 6% , menos de aproximadamente 5% , menos de aproximadamente 4% , menos de aproximadamente 3% , menos de aproximadamente 2% o menos de aproximadamente 1 % en por lo menos un parámetro adecuado que sea indicativo de la salud y/o reproductividad de la planta, en comparación con una planta de control apropiada ( por ejemplo, una planta no tratada de la misma especie) . En modalidades específicas, una planta es tolerante a un herbicida u otro producto químico si muestra daños en comparación con una planta de control apropiada que sean menores que los daños que muestra la planta de control en por lo menos el 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000% o más. Una s planta de cultivo que no se vea afectada de manera significativa por un herbicida u otro tratamiento puede mostrar una disminución en por lo menos un parámetro, pero la disminución es de índole temporal, y la planta se recupera por completo en el plazo de, por ejemplo, aproximadamente de una semana, ío aproximadamente de dos semanas, aproximadamente de tres semanas, aproximadamente de 4 semanas o aproximadamente de 6 semanas. En modalidades específicas, una planta que es tolerante a un herbicida u otro producto químico se puede caracterizar por el hecho de que la planta no se vea afectada de 15 manera significativa por la aplicación del herbicida u otro producto químico.
Los parámetros adecuados que son indicativos de la salud y/o productividad de la planta incluyen, a modo de ejemplo y sin limitaciones: altura de la planta, peso de la planta , largo de las 0 hojas, plazo transcurrido hasta una etapa específica del desarrollo, floración, rendimiento y producción de semillas. La evaluación de un parámetro se puede efectuar por medio de inspección visual y/o por medio del análisis estadístico del parámetro. U na vez que este se evalúa en una planta sujeto y una 5 planta de control, se puede hacer una comparación para determinar si la planta sujeto se ve afectada de manera significativa por el herbicida y otro tratamiento.
Entre las plantas de control apropiadas que se pueden usar para determinar la resistencia a un herbicida (u otro producto químico) se incluyen plantas de la misma especie que no comprenden u n ácido nucleico y/o polipeptido heterólogo putativo de tolerancia al herbicida y plantas que comprenden el ácido nucleico y/o polipéptido heterólogo putativo de tolerancia al herbicida pero que no han sido tratadas con el herbicida.
Herbicida : Un “herbicida” es un producto químico que causa lesiones temporales o permanentes a una planta. En otras partes del presente documento se enumeran y tratan con más detalle algunos ejemplos no excluyentes de herbicidas. Un herbicida se puede incorporar en una planta o sus células, o bien puede actuar sobre la planta o las células sin que se lo incorpore. Un “ingrediente activo” es un producto químico de la fórmula de un herbicida que es responsable de la fitotoxicidad de la fórmula. Los ingredientes activos de las fórmulas de los herbicidas comerciales se identifican por lo general como un ingrediente activo en la etiqueta del prod ucto. La información de las etiq uetas de producto está disponible en la U .S. Environmental Protection Agency, y se actualiza en Internet en oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own. La información de las etiquetas de producto también está disponible en I nternet en www.cdms. net.
Cuando se usa en relación con un herbicida, el termino “equivalente ácido” se refiere a la tasa o cantidad como ácido original activo del herbicida.
Aislado: Un componente biológico “aislado” (como un ácido nucleico o polipéptido) se ha separado sustancialmente, producida aparte de, o purificado lejos de otros componentes biológicos de la célula del organismo en que el componente se presenta en forma natural (es decir, otros ADN y ARN cromosómicos o extracromosómicos, y proteínas) que produce un cambio qu ímico o funcional en el componente ( por ejemplo, un ácido nucleico se puede aislar de un cromosoma rompiendo los enlaces químicos entre el ácido nucleico y el ADN restante en el cromosoma) . Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas que se han “aislado” incluyen moléculas de ácido nucleico y proteínas purificadas por medio de métodos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos y proteínas preparados por una expresión recombinante en una célula huésped , así como moléculas de ácido nucleico, proteínas y péptidos sintetizados por métodos químicos. Ácido nucleico: Los términos “polinucleótido”, “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico” se usan en el presente como equivalentes, y comprenden un ácido nucleico único, ácidos nucleicos múltiples, un fragmento, variante o derivado de un ácido nucleico y constructo de ácido nucleico (por ejemplo, ARN mensajero [mARN] o ADN plasmídico [pADN]) . Un polinucleótido o ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótido de una secuencia de cADN de longitud completa, o un fragmento de esta, incluidas secuencias no traducidas de 5' y/o 3' y una secuencia o secuencias de codificación . Un polinucleótido o ácido nucleico 5 puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótidos, que pueden incluir ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos no modificados o ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos modificados. Por ejemplo, un polinucleótido o ácido nucleico puede estar compuesto por ADN ío de cadena única y doble, ADN que es una mezcla de regiones de cadena única y de cadena doble, ARN de cadena única y doble y ADN que es una mezcla de regiones de cadena única y de cadena doble. Las moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN pueden ser de cadena única, de cadena doble o una mezcla de 15 regiones de cadena única y de cadena doble. Los términos precedentes también incluyen formas modificadas químicamente, enzímáticamente o metabólicamente de un polinucleótido o ácido nucleico.
Se entiende que un ADN específico se refiere también al 20 complemento de este, cuya secuencia se determina conforme a las reglas de apareamiento de base de los desoxirribonucleótidos.
Como se usa en el presente documento, el término “gen” se refiere a un ácido nucleico que codifica un producto funcional (ARN o polipéptido/proteína) . Un gen puede incluir secuencias 5 reguladoras anteriores (secuencias no codificantes de 5') y/o posteriores (secuencias no codificantes de 3') a la secuencia que codifica el producto funcional.
Como se usa en el presente documento, el termino “secuencia de codificación” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido específica. Una “secuencia reguladora” se refiere a una secuencia de nucleótido situada después ( por ejemplo, secuencias no codificantes de 5'), dentro de o antes de ( or ejemplo, secuencias no codificantes de 3') una secuencia de codificación, que incluyen en la transcripción, procesamiento o estabilidad del ARN , o traducción de la secuencia de codificación referida. Las secuencias reguladoras incluyen , a modo de ejemplo y sin limitaciones: promotores, secuencias líder de traducción , intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN , sitios de unión de efectores y estructuras de bucle con tallo.
Como se usa en el presente documento, el término “degeneración de codón” se refiere a una redundancia en el código genético que permite la variación de una secuencia específica de nucleótido sin afectar la secuencia de aminoácido del polipéptido codificado. Dado que cada codón consta de tres nucleótidos, y que los nucleótidos que comprenden ADN están restringidos a cuatro bases específicas, hay 64 posibles combinaciones de nucleótidos; 61 de estas codifican aminoácidos (los tres codones restantes codifican señales que finalizan la traducción). Por lo tanto, muchos aminoácidos están designados por más de un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina están codificados por cuatro tripletes, la serina y la arginina por seis, mientras que el triptófano y la metionina están codificados por solo un triplete. El "código genetico” que muestra qué codones codifican cada aminoácido resulta conocido para expertos en la téenica. La degeneración de este permite que las bases de un ADN varíen dentro de un amplio intervalo sin alterar la secuencia de aminoácidos de las proteínas codificadas por el ADN .
En algunas modalidades en el presente, cuando se diseña una secuencia de codificación para mejorar la expresión en una célula huésped , el gen se diseña de manera tal que la frecuencia de uso de codones en esta se aproxime a la frecuencia del uso de codón preferido de la célula huésped . Por consiguiente, el término “optimización por codones” se refiere a genes o secuencias de codificación de ácidos nucleicos para la transformación de diversos huéspedes, en la que los codones del gen o secuencia de codificación se han modificado para reflejar el uso de codón típico del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ácido nucleico. En los ejemplos, tal optimización incluye el reemplazo de por lo menos uno de los codones, más de un codón , una cantidad importante de codones y/o todos los codones del gen o secuencia de codificación con un codón o más que usan más frecuentemente en los genes de tal organismo.
Muchos organismos presentan sesgo en el uso de codones específicos para codificar para la inserción de un aminoácido en particular en una cadena de peptidos en crecimiento. La preferencia de codones, o sesgo en el uso de codones (es decir, las diferencias en el uso de codones entre organismos) es posible gracias a la degeneración del código genético, y está bien documentada entre muchos organismos. El sesgo en el uso de codones a menudo se refiere a la eficiencia de la traducción del ARN mensajero (mARN) , que a su vez se cree que depende, entre otras cosas, de las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de moléculas específicas de ARN de transferencia (tARN). La predominancia de los tARN seleccionados en una célula generalmente refleja los codones usados más frecuentemente en la síntesis de péptidos. Por consiguiente, los genes se pueden ajustar o diseñar para la expresión óptima del gen en un organismo dado sobre la base de la optimización de codones.
Considerando la gran cantidad de secuencias de genes disponibles para una amplia variedad de especies de animales, plantas y microbios, se pueden calcular las frecuencias relativas de uso de codones. Hay tablas de uso de codones disponibles, por ejemplo, en la base de datos de uso de codones (“Codon Usage Database") disponible en I nternet en kazusa.or.jp/codon/; estas tablas se pueden adaptar de diversas maneras. Ver Nakamura et al. (2000) Nucí. Acids Res. 28:292. Usando una tabla de uso de codones, un experto en la teenica puede aplicar las frecuencias correspondientes a una especie dada a cualquier secuencia de polipéptidos dada, para diseñar y producir un 5 fragmento de ácido nucleico sintético de una región de codificación optimizada por codones que codifica el polipéptido, pero usando los codones óptimos para la especie.
El sesgo de uso de codones se refleja en la composición base media de las regiones de codificación de proteínas. Por ío ejemplos, los organismos que tienen genomas con contenidos de G + C bajos usan más codones que tienen A o T en la tercera posición de codones sinónimos, mientras que aquellos que tienen contenidos de G + C más altos usando más codones que tienen G o C en la tercera posición . Asimismo, se cree que la presencia de 15 codones “menores” dentro de un mARN puede recudir la tasa de traducción absoluta de tal mARN, especialmente cuando la abundancia relativa del tARN cargado correspondiente al codón menor es baja. De este razonamiento puede inferirse que la disminución de la tasa de traducción por los codones menores 0 individuales sería por lo menos aditiva para codones menores múltiples. Por lo tanto, los mARN que tienen contenidos relativamente altos de codones menores tendrían las correspondientes tasas de traducción bajas. Esta tasa se podría reflejar en niveles correspondientemente bajos de la proteína 5 codificada.
El sesgo de uso de codón se puede calcular como la frecuencia en que se usa un único codón en relación con los codones para todos los aminoácidos. Como alternativa, tal sesgo se puede calcular como la frecuencia con que se usa un único codón para codificar un aminoácido en particular en relación con todos los restantes codones para tal aminoácido (codones sinónimos) .
El termino “porcentaje de identidad” (o % de identidad) se refiere a una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos (o secuencias de polinucleótidos), según se determine por medio de la comparación de secuencias. El porcentaje de identidad puede expresar el grado de relación de secuencias entre secuencias de polipéptidos (o polinucleótidos), según se determine por la comcidencia entre las cadenas de tales secuencias. En general, la identidad se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente. El porcentaje de identidad de dos secuencias, ya sean secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas divididas por la longitud de las secuencias más cortas y multiplicadas por 100. Ver Russell y Barton (1994) J . Mol. Biol. 244:332-50.
Las téenicas para linear secuencias de ácido nucleído y aminoácidos y para determinar la identidad son bien conocidas entre expertos en la teenica, e incluyen, a modo de ejemplo y sin limitaciones, aquellas indicadas en : Computational Molecular Bioloqy (1988) (Lesk, A. M . , Ed .) Oxford University, NY; Biocomputina: Informatics and Genome Proiects (1993) (Smith , D. W. , Ed .) Academic, NY; Computer Analvsis of Seouence Data.
Part I (1994) (Griffin , A. M . , y Griffin, H . G . , Eds.) Humania, NJ ; Seouence Analvsis in Molecular Bioloqy (1987) (von Heinje, G. , Ed.) Academic, NY; y Seouence Analvsis Primer (1991 ) (Gribskov, M . y Devereux, J. , Eds.) Stockton , NY. U na técnica para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias puede incluir proporcionar la secuencia de nucleótido de un mARN o gen y/o proporcionar o inferir la secuencia de aminoácido codificada y comparar la secuencia con una segunda secuencia de nucleótido y/o aminoácido. Las secuencias genómicas también se pueden determinar y comparar de este modo.
Además, varios programas de software de computación públicamente disponibles incluyen métodos para alinear secuencias de ácido nucleico y aminoácidos y determinar la identidad. Se pueden realizar alineamientos de secuencias y cálculos de porcentaje de identidad usando, por ejemplo, el programa Alig nX™ de la suite Vector NTI® (I nvitrogen, Carlsbad , CA) o el programa MegAlign™ de la suite LASERGENE™ de computación para biomformática (ADNSTAR™ Inc. , Madison , Wl) . Se pueden realizar múltiples alineamientos de secuencias usando el método Clustal™, que abarca diversas variedades de un algoritmo de alineamiento, incluidos Clustal™ V y Clustal™ W (Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5: 151 -3; Higgins et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8: 189-91 ). Para los alineamientos múltiples en Clustal™ V, los valores por defecto que se pueden usar incluyen GAP PENALTY (Penalización de espacio) = 10 y GAP LENGTH PENALTY (Penalización de longitud de espacio) = 10. Los parámetros por defecto para los alineamientos múltiples en Clustal™ W incluyen (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 0.2, Delay Divergen Seqs(%) (Retardo secuencias divergentes) = 30, ADN Transition Weight [Peso ADN transición] = 0.5, Protein Weight Matrix [Matriz de pesos de proteínas] = Serie Gonnet, ADN Weight Matrix [Matriz de pesos de ADN] = I UB) . Los parámetros de alineamientos para alineamiento por pares y cálculo de porcentaje de identidad entre secuencias de proteínas que se pueden usar en un metodo Clustal™ son KTU PLE = 1 , GAP PENALTY = 3, WI N DOW =5 y DIAGONALS SAVED = 5. Para los ácidos nucleicos estos parámetros pueden ser KTUPLE = 2, GAP PENALTY = 5, WI NDOW=4 y DIAGONALS SAVED=4. Después de alinear las secuencias usando un programa Clustal™, se puede obtener un “porcentaje de identidad” visualizando la tabla de “distancias entre secuencias” del mismo programa.
En algunas modalidades, un ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene una identidad de secuencia (cuando se compara con un polipéptido de referencia; por ejemplo, un polipeptido DGT) de, por ejemplo y sin limitarse: al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60% , al menos aproximadamente 65% , al menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 75% , al menos aproximadamente 80% , al menos aproximadamente 85% , al menos aproximadamente 90% , y al menos aproximadamente 95% , tiene la misma función o similar que el polipéptido de referencia. Por consiguiente, cualquier porcentaje entero de identidad de entre, por ejemplo, del 55% al 100% puede ser útil en la descripción de ácidos nucleicos especiales en el presente escrito, por ejemplo y sin limitación : 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62 , 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72 , 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99% . Algunos fragmentos de ácido nucleico no sólo tienen la identidad de la secuencia anterior, sino que pueden codificar un polipéptido que tiene, por ejemplo y sin limitación : al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos, al menos 150 aminoácidos, al menos 200 aminoácidos y al menos 250 aminoácidos. Los cuerpos especiales incluyen un ácido nucleico que tiene al menos una identidad de aproximadamente 90% de SEC I D No. : 1 (por ejemplo, una identidad de aproximadamente 89%; una identidad de aproximadamente 90%; una identidad de aproximadamente 91 % ; una identidad de aproximadamente 92%;una identidad de aproximadamente 93%; una identidad de aproximadamente 94% ; una identidad de aproximadamente 95%; una identidad de aproximadamente 96%; una identidad de aproximadamente 97% ; una identidad de aproximadamente 98%; una identidad de aproximadamente 99% ; y una identidad de aproximadamente 99.5%;) .
El termino "software de análisis de secuencia" se refiere a un algoritmo computacional o programa de software que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El "software de análisis de secuencias" puede adquirirse en el mercado o desarrollarse de forma independiente. Los ejemplos no limitantes de software de análisis de secuencia incluyen : la suite de programas GCG (Wisconsin Package Versión 9,0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison , Wl); BLASTP™, BLASTN™ y BLASTX™ (Altschul et al (1990) J . Mol . Biol. 215:403 10); ADNSTAR™ (ADNSTAR™ , I nc. Madison , Wl); Sequencher™ (Gene Codes Corporation , Ann Arbor, MI) , y el programa FASTA™ que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (Pearson (1994) Comout. Methods Genome Res. fProc. I nt. Svmp.l. fecha de reunión, 1992 (Suhai y Sandor, Eds.), Plenum: New York, NY, páginas 1 1 1 -20). Donde el software de análisis de secuencia se ha usado para analizar una secuencia de nucleótidos o aminoácidos del presente trabajo, los resultados del análisis que se muestran se han generado usando los valores por defecto del programa de referencia, a menos que se especifique lo contrario. Como se usa aquí, el término "valores por defecto" se refiere a un conjunto de valores o parámetros que originalmente se carga con el software de análisis de secuencia cuando se inicializa por primera vez.
Hibridación : Un ácido nucleico que comprende toda o parte de una secuencia de nucleótidos puede ser usado como una sonda que “híbrida” selectivamente a secuencias de nucleótidos presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (por ejemplo, genómico o bibliotecas de ADNc a partir de un organismo seleccionado) que tienen una cantidad significativa de identidad de secuencia a la de secuencia de la sonda. Una sonda de hibridación puede ser un fragmento de ADN genómico, un fragmento de ADN plasmídico, un fragmento de ADNc, un fragmento de ARN, un fragmento de ADN amplificado mediante PCR, un oligonucleótido, u otro polinucleótido ; una sonda puede marcarse con un grupo detectable (por ejemplo, 32P ), o con cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo y sin limitación, una sonda de hibridación puede hacerse mediante el etiquetado de un oligonucleótido sintetico que en el presente trabajo se híbrida específicamente a un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico que tiene al menos un 90% de identidad de la SEC ID No. : 1 ). Los métodos para la preparación de sondas de hibridación , y para la construcción de ADNc y bibliotecas genómicas, son conocidos en la materia . Sambrook et al. (1989) Molecular Clonina : A Laboratorv Manual, Segunda Edición , Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY. Una guía extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos se puede encontrar en Sambrook et al. (1989) , supra, y Ausubel et al. (1997) Short Protocols in Molecular Bioloav. Tercera Edición , Wilcy, Nueva York, Nueva York, páginas 2-40.
En algunos cuerpos, la hibridación de ácido nucleico (por ejemplo, al ADN amplificado) se puede usar para identificar la presencia de un evento transgenico en una muestra. Las moléculas de ácido nucleico o fragmentos de las mismas son capaces de "hibridar específicamente" a otra molécula de ácido nucleico en algunas circunstancias. En algunos ejemplos, un ácido nucleico híbrida específicamente a un ácido nucleico meta en condiciones estrictas. Como se usa aqu í, dos moléculas de ácido nucleico se dice que son capaces de hibridarse específicamente entre sí si las dos moléculas son capaces de formar una estructura anti-paralela de doble hélice de ácido nucleico en condiciones estrictas (por ejemplo, alta rigurosidad) .
Un ácido nucleico se dice que es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si las dos moléculas de ácido nucleico exhiben complementariedad de secuencia completa. Como se usa en este trabajo, los ácidos nucleicos se dice que presentan "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra . Las moléculas que exhiben complementariedad completa generalmente se hibridan entre sí con una estabilidad suficiente que les permitirá permanecer unidas entre sí bajo condiciones de "alta rigurosidad" convencionales. Estas condiciones son descritas por Sambrook et al. (1989), supra.
Dos moleculas se dice que presentan "complementariedad mínima" si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad como para permitir que permanezcan unidas entre sí al menos bajos condiciones de "baja rigurosidad" convencionales. Estas condiciones también son descritas por Sambrook et al. (1989) , supra. Para que una molécula de ácido nucleico pueda servir de cebador o sonda, sólo es necesario exponer la complementariedad mínima de la secuencia para poder formar una estructura estable de doble hélice bajo concentraciones concretas de solvente y sal.
Los factores que afectan a la rigurosidad de la hibridación son bien conocidos por expertos en la téenica e incluyen , por ejemplo: temperatura, pH , fuerza iónica y concentración de disolventes orgánicos (por ejemplo, formamida y dimetilsulfóxido). Como es conocido por expertos en la técnica, la rigurosidad de hibridación se incrementa por temperaturas más altas, menor fuerza iónica, y concentraciones más bajas de disolvente. Las condiciones restrictivas también se pueden alcanzar con la adición de agentes desestabilizantes como la formamida.
El concepto "condiciones rigurosas" o "condiciones de rigurosidad" se define con respecto a la hibridación de un ácido nucleico a otro ácido nucleico meta (es decir, a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia particular de nucleótidos de interes) mediante el procedimiento específico de hibridación descrito en Sambrook et al. (1 989) , supra (at 9.52-9.55) . Ver también Sambrook et al. (1989) en 9.47-9.52 y 9.56-9.58.
La especificidad en muchas aplicaciones se refiere con las condiciones de lavados post-hibridación, en los que se incluyen factores como la fuerza iónica y temperatura de la solución de lavado. Para los híbridos ADN-ADN, el punto de fusión térmico (Tm) se puede aproximar a partir de la ecuación : Tm = 81.5°C + 16.6 (logM)+0.41 (%GC)-0.61 (%form)-500/l, (1 ) donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN , %form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación , y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Meinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-84.
La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y u n pH determinados) en donde el 50% de una secuencia complementaria meta híbrida a una sonda perfectamente emparejada. El Tm se reduce aproximadamente 1 °C por cada 1 % de emparejamiento equívoco. Por lo tanto, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para las secuencias de la identidad deseada que se van a hibridar. Por ejemplo, si se busca la hibridación de las secuencias con 90% de identidad , el Tm se puede disminuir 10°C (bajo una fuerza iónica y un pH determinado) . Las condiciones restrictivas pueden seleccionarse por ejemplo, para ser aproximadamente 5°C inferiores al punto de fusión termico (Tm) para una secuencia específica y su complemento, bajo una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente restrictivas pueden usar una hibridación y/ o lavado 1 , 2, 3, o 4°C por debajo de la Tm; las condiciones moderadamente restrictivas pueden usar una hibridación y / o lavado 6, 7, 8, 9, o 10°C por debajo de la Tm, las condiciones de baja rigurosidad pueden usar una hibridación y / o lavado de entre 1 1 a 20°C por debajo de la Tm.
En algunos ejemplos, las condiciones restrictivas son aquellas en las que la concentración de sal es inferior a aproximadamente 1 .5 MNa+ (por ejemplo, entre un 0.01 y un 1 .0M Na+) en un pH entre 7.0 y 8.3, y la temperatura es de al menos unos 30°C para los ácidos nucleicos cortos (por ejemplo, entre 10 y 50 nucleótidos de longitud) y de al menos unos 60°C para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleótidos de longitud) . Las condiciones de baja rigurosidad incluyen a modo de ejemplo la hibridación con una solución reguladora/amortiguador de entre 30% y 35% de formamida, 1.0M NaCI, 0.1 % de dodecilsulfato de sodio (SDS) a 37°C , y un lavado en 1 X a 2X SSC (20X SSC = NaCI 3.0M / 0.3. M citrato trisodio) entre 50 y 55°C. Las condiciones de rigurosidad moderada incluyen a modo de ejemplo la hibridación en formamida entre 40 y 45%, 1 .0M NaCI, 0.1 % de SDS a 37°C , y un lavado en 0.5 X a 1 X SSC entre 55°C y 60°C . Las condiciones de alta rigurosidad incluyen a modo de ejemplo la hibridación en formamida al 50% , un 1 .0 de sal MNa, un 0.1 % de SDS a aproximadamente 37°C, y un lavado en un 0.1 X SSC entre 60°C y 65°C aproximadamente.
Como se usa aquí, el termino "polipéptido" incluye un polipéptido en singular, polipéptidos en plural, y fragmentos de los mismos. Este término se refiere a una molécula compuesta por monómeros (aminoácidos) linealmente unidos por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos) . El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica o el tamaño del producto. Por consiguiente, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, proteína, cadena de aminoácidos, y cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido", y en el presente trabajo los términos anteriores se usan indistintamente como "polipéptido". Un polipéptido puede ser aislado de una fuente biológica natural o producida por teenología recombinante, pero un polipéptido específico no se traduce necesariamente a partir de un ácido nucleico específico. Un polipéptido puede ser generado mediante cualquier manera apropiada, incluyendo, por ejemplo y sin limitación , la síntesis qu ímica.
Endógeno y heterólogo: como se usa aqu í, el término "nativo" se refiere a la forma de un polinucleótido, gen o polipéptido que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras, si está presente. El término "endógeno" se refiere a la forma nativa del polinucleótido, gen o polipéptido en su ubicación natural en el organismo o en el genoma del organismo.
En contraste, el término "heterólogo" se refiere a un polinucleótido , gen o polipéptido que no se encuentra normalmente en su ubicación en el organismo de referencia (huésped) . Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico que se encuentra normalmente en el organismo de referencia en una ubicación genómica diferente. A modo de ejemplo adicional , un ácido nucleico heterólogo puede ser un ácido nucleico que no se encuentra normalmente en el organismo de referencia. Un organismo huésped que consta de un polinucleótido, gen o polipéptido heterólogo puede ser producido mediante la introducción del polinucleótido , gen o polipéptido heterólogo en el organismo huésped . En ejemplos particulares, un polinucleótido heterólogo consta de una secuencia codificante nativa, o parte de la misma, que es reintroducida en un organismo fuente en una forma que es diferente a la del polinucleótido nativo correspondiente. En ejemplos concretos, un gen heterólogo consta de una secuencia codificante nativa, o parte de la misma, que es reintroducida en un organismo fuente en una forma que es diferente a la del gen nativo correspondiente. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una secuencia codificante nativa que es una porción de un gen quimérico que incluye regiones reguladoras no nativas y que se vuelve a introducir en el huesped nativo. En ejemplos concretos, un polipéptido heterólogo es un polipéptido nativo que se vuelve a introducir en un organismo fuente en una forma que es diferente a la del polipéptido nativo correspondiente.
Un gen o polipéptido heterólogo puede ser un gen o polipéptido que consta de una secuencia de ácidos nucleicos o polipéptido fu ncional que codifica un polipéptido funcional que está fusionado con otros genes o polipéptidos para producir un polipéptido quimérico o de fusión , o un gen que codifica el mismo. Los genes y proteínas de cuerpos particulares incluyen secuencias y porciones de longitud completa, segmentos, fragmentos (incluidos los fragmentos contiguos y supresiones internas y/ o terminales en comparación con las moléculas de longitud completa) , variantes, mutantes, quiméricos y fusiones específicamente ejemplificados de estas secuencias.
Modificación : Como se usa en el presente trabajo, el término “modificación” puede referirse a un cambio en un polinucleótido de referencia particular que tiene como resultado una actividad reducida, eliminada sustancialmente, o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Una modificación también puede referirse a un cambio en un polipéptido de referencia que tiene como resultado una actividad reducida, eliminada sustancialmente, o eliminada del polipéptido de referencia. Alternativamente, el término “modificación” puede referirse a un cambio en un polinucleótido de referencia que tiene como resultado un aumento de la actividad de un polipeptido codificado por el polinucleótido de referencia, así como un cambio en un polipéptido de referencia que resulta en un aumento de la actividad de la polipéptido de referencia. Cambios como los anteriores pueden ser realizados mediante uno de los varios métodos bien conocidos en este campo, entre los que se incluyen , por ejemplo y sin limitación: borrar una parte de la molécula de referencia, mutar la molécula de referencia (por ejemplo, a través de la mutagénesis espontánea, a través de la mutagénesis aleatoria, a través de la mutagénesis causada por genes mutadores, o a través de la mutagénesis con transposones), sustituir una parte de la molécula de referencia , insertar un elemento en la molécula de referencia, disminuir la expresión de la molécula de referencia; alterar la ubicación celular de la molécula de referencia; alterar el estado de la molécula de referencia (por ejemplo, a través de la metilación de un polinucleótido de referencia, y a través de la fosforilación o ubiquitinación de un polipéptido de referencia) , eliminar un cofactor de la molécula de referencia, introducir un ARN/ADN antisentido dirigido a la molécula de referencia , introducir un ARN/ADN de interferencia dirigido a la molécula de referencia; modificar químicamente la molécula de referencia; modificar covalentemente la molécula de referencia; irradiar la molécula de referencia con radiación UV o rayos X; recombinación homologa que altera la molecula de referencia; recombinación mitótica que altera la molécula de referencia; sustituir el promotor de la molécula de referencia, y / o combinaciones de cualquiera de los métodos anteriores.
La orientación para determinar qué nucleótidos o residuos de aminoácidos pueden ser modificados en un ejemplo concreto se puede encontrar mediante la comparación de la secuencia del polinucleótido o polipéptido de referencia con la secuencia de los polinucleótidos o polipéptidos (por ejemplo, levadura homologa o bacteriana) homólogos, y maximizando el número de las modificaciones realizadas en regiones de alta homología (regiones conservadas) o secuencias de consenso.
Derivativo y variante: el término “derivado”, como se usa aqu í, se refiere a una modificación de una secuencia de ejemplo del presente trabajo. Tales modificaciones incluyen la sustitución, inserción y/ o supresión de una o más bases de una secuencia de codificación del presente trabajo que preserva, altera ligeramente o aumenta la función de la secuencia de codificación en una especie de cultivo. Tales derivados puede determinarlos fácilmente cualquier experto en la téenica, por ejemplo y sin limitación , mediante el uso de técnicas de modelado por ordenador para predecir y optimizar la estructura de secuencia. Así, el término “derivado” incluye también ácidos nucleicos heterólogos que constan de una secuencia que tiene una identidad de secuencia sustancial con una secuencia ejemplar en el presente trabajo, de tal manera que puede que tengan la misma, o ligeramente alterada o aumentada funcionalidad de uso en expresar el DGT-28 en una planta de cultivo.
Como se viene usando en el presente documento, el termino "variante" se refiere a un polipéptido que se diferencia de un polipéptido de muestra, como se presenta aquí, por inserciones, deleciones, mutaciones y/o sustituciones de aminoácidos, como podría presentarse usando, por ejemplo, y sin ningún tipo de limitación , téenicas del ADN recombinante. La orientación a la hora de determinar qué residuos de aminoácidos pueden ser reemplazados, añadidos o eliminados dentro de una secuencia de aminoácidos de referencia, puede encontrarse al comparar la secuencia del polipéptido de referencia con la de otros polipéptidos homólogos y minimizando el número de cambios realizados en la secuencia de aminoácidos en regiones con alta homología (regiones conservadas), o bien , reemplazando aminoácidos con una secuencia consenso. U n polipéptido variante puede haber sustituido aminoácidos y, aun así, conservar la misma actividad funcional que el polipéptido de referencia. Los genes "variantes" se componen de una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo polipéptido como un gen de referencia o un polipéptido equivalente que tiene una actividad equivalente o similar a la del polipéptido de referencia.
En algunas modalidades, los genes variantes pueden usarse para producir proteínas variantes y los huespedes recombinantes pueden usarse para producir las proteínas variantes. Por ejemplo, los genes y las proteínas variantes pueden unirse de manera que contengan residuos contiguos (de aminoácidos o nucleótidos) de cualquiera de las secuencias ejemplificadas en este documento. Un gen o proteína variante puede tener, por ejemplo, y sin limitación: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272 , 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282 , 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291 , 292 y 293 residuos contiguos (de aminoácidos o nucleótidos) q ue se correspondan con un segmento (del mismo tamaño) de la secuencia ejemplificada. Los segmentos con un tamaño similar, especialmente aquellos de las regiones conservadas, pueden usarse tambien como sondas y/o cebadores.
Aquellos expertos en la téenica, deducirán que altos niveles de identidad de secuencia son útiles a la hora de identificar polipéptidos (por ejemplo de otras especies) que tienen igual o similar función o actividad que un polipéptido de referencia. En algunas modalidades, un polipéptido variante que tenga una identidad de secuencia (en comparación con un polipéptido de referencia ; por ejemplo un polipéptido DGT-28) de, por ejemplo, y sin limitación: al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60% , al menos aproximadamente 65% , al menos aproximadamente 70% , al menos aproximadamente 75% , al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85% , al menos aproximadamente 90%, y al menos aproximadamente 95% , tiene la misma función o similar que el polipéptido de referencia.
Las estrategias para diseñar y construir genes y proteínas variantes que se compongan de residuos contiguos de una molécula concreta pueden determinarse obteniendo y examinando la estructura de una proteína de interés (por ejemplo coordenadas de una estructura atómica 3-D [tridimensional] de una estructura cristalina y/o un modelo molecular) . En algunos ejemplos, una estrategia puede ir dirigida a determinados segmentos de una proteína que sean idóneos para su modificación, como los segmentos expuestos en la superficie, y no segmentos internos, ya que conllevan, estos últimos, plegamiento de proteínas e integridad estructural esencial 3-D. La patente de los EE. U U . No. 5.605.793, por ejemplo, está referida a los metodos para generar diversidad molecular adicional usando el reensamble del ADN tras fragmentaciones aleatorias o dirigidas. Este procedimiento es conocido como "transposición genética" que, generalmente, implica el mezclar fragmentos (del tamaño que se desee) de dos o más moléculas de ADN , seguidas de varias secuencias de renaturalización . Este proceso puede mejorar la actividad de una proteína codificada por un gen sujeto. El resultado una proteína quimérica que haya mejorado su actividad , alterado el sustrato específico, aumentado su estabilidad enzimática, alterado su estereoespecificidad y otra serie de características .
U na "sustitución" de aminoácidos, puede ser el resultado de haber reemplazado un aminoácido en una secuencia de referencia por otro aminoácido que tenga una estructura y/o propiedades químicas similares (por ejemplo sustitución conservadora de aminoácidos) , o puede ser el resultado de haber reemplazado un aminoácido en una secuencia de referencia por un aminoácido que tenga una estructura y/o propiedades químicas diferentes (por ejemplo sustitución no conservadora de aminoácidos) . Los aminoácidos pueden dividirse en las siguientes categorías y/o estructuras qu ímicas: no polares, polares sin carga, básicos y ácidos. En consecuencia, las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos pueden realizarse sobre la base de comcidencias en polaridad , carga, solubilidad, hidrofobicidad , hidrofilicidad o sobre la naturaleza antipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen la glicina, alanina, leucina, isoleucina , valina , prolina , fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares sin carga incluyen la serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen la arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen el ácidos aspártico y el ácido glutámico. De manera alternativa, las sustituciones "no conservadoras" de aminoácidos pueden realizarse eligiendo las diferencias en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y en la naturaleza antipática de cualquiera de estos aminoácidos. Las "inserciones" o "deleciones" pueden estar dentro del Intervalo de variación si son estructural o funcionalmente toleradas por las proteínas recombinantes.
En alg unas modalidades, una proteína variante es "truncada" con respecto de una proteína de longitud completa de referencia. En algunos ejemplos, la proteína truncada conserva la actividad funcional de la proteína de referencia . Por proteína "truncada" se entiende que una parte de la proteína puede haberse dividido, por ejemplo, conservando y mostrando la proteína fragmentada sobrante la actividad deseada tras la fragmentación. La fragmentación puede conseguirse por medio de varias proteasas. Es más, pueden producirse con éxito proteínas fragmentadas usando téenicas de biología molecular, en las que las bases del ADN que codifican una porción de la proteína son eliminadas del código de secuencia, bien sea por medio de la digestión con endonucleasas restrictiva o por medio de otras técnicas que conozca el experto en la técnica. Una proteína truncada puede expresarse en un sistema heterólogo, como E. coli, baculovirus, sistemas virales basados en plantas y levadura. Las proteínas truncadas que presentan tolerancia a los herbicidas pueden confirmarse usando el sistema heterólogo que expresa la proteína en un ensayo biológico de tolerancia al herbicida, como se describe en este estudio. Dentro de esta disciplina, es sabido que se pueden producir satisfactoriamente proteínas truncadas de manera que conserven la misma actividad funcional que la proteína de longitud completa de referencia. Por ejemplo, las proteínas Bt pueden usarse en forma truncada (nucleoproteína); Ver, por ejemplo, Hofte y Whitelcy (1989) Microbiol. Rev. 53(2):242-55; y Adang et al. (1985) Gene 36:289-300.
En algunos casos, especialmente en la expresión genética en plantas, puede ser ventajoso usar genes truncados que expresen proteínas truncadas. Los genes truncados pueden codificar un polipeptido compuesto, por ejemplo, del 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82 , 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92 , 93, 5 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de la proteína de longitud completa.
Los genes y proteínas variantes que conservan la función de la secuencia de referencia a partir de la cual fueron diseñados, pueden ser determinados por una persona con conocimientos en esta ciencia; por ejemplo, evaluando las variantes recombinantes ío para la actividad . Si esta evaluación de la actividad se conoce y está descrita , entonces para la determinación de las variantes funcionales se precisan únicamente experimentos rutinarios.
Pueden realizarse cambios específicos en el centro activo de una enzima para afectar a su funcionalidad inherente respecto 15 a su actividad o estereoespecificidad . Ver Muller et. al. (2006) Protein Sci. 15(6): 1356-68. Por ejemplo, la estructura de la proteína Tau D se ha usado como dioxigenasa de muestra para determinar residuos de centros activos mientras permanece unida a su sustrato inherente, la taurina. Ver Elkins et al. (2002) 20 Biochemistry 41 (16):5185-92. Para más información en relación a la secuencia de optimización y designabilidad de la enzima, los centros activos se pueden encontrar en Chakrabarti et al. (2005) Proc. Nati. Acad . Sci. USA 102(34): 12035-40.
Pueden modificarse varias propiedades estructurales y 5 rasgos tridimensionales de una proteína sin afectar de manera negativa a la actividad/funcionalidad de la proteina . Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden hacerse de manera que no afecten negativamente a la actividad y/o a la configuración tridimensional de la molecula (sustituciones "toleradas"). Las proteínas variantes pueden diseñarse también de manera que difieran en el nivel de secuencia de la proteína de referencia, pero que conserven la misma o parecida estructura tridimensional esencial en su conjunto, distribución de carga superficial y aspecto Ver, ejemplo, Patente Estadounidense 7,058,515; Larson et al. (2002) Protein Sci. 1 1 :2804-1 3; Crameri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-8; Ste mer (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91 : 10747-51 ; Stemmer (1994) Nature 370:389-91 ; Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-53; Crameri et al. ( 1996) Nat. Prom. 2: 100-3; and Crameri et al. (1996) Nat. Biotechnol . 14: 315-9.
El diseño computacional de 5'-UTR y 3'-UTR (por ejemplo horquillas sintéticas) que son adecuadas para su uso en un constructo de expresión (por ejemplo constructo de expresión DGT-28), y puede también llevarse a cabo y usarse para diseñar elementos dentro de los ácidos nucleicos de ciertas muestras. Los modelos computacionales, UTRs y las téenicas de diseño computacional que se usan en la predicción/evaluación de derivadas de 5'-UTR y 3'-UTR incluyen , por ejemplo, y sin limitaciones: M FoLd™ versión 3.1 (disponible en Genetics Corporation Group, Madison, Wisconsin; ver Zucker et al.
“Algorithms and Thermodynamics for ARN Secondary Structure Prediction : A Practical Guide,” en ARN Biochemistry and Biotechnoloav. 1 1 -43, J . Barciszewski & B. F.C. Clark, eds. , NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, N L, 1999; Zucker et al. (1999) J . Mol. Biol . 288:91 1 -40; Zucker et al. “ARN Secondary Structure Prediction ,” en Current Protocols in Nucleíc Acid Chemistrv. S. Beaucage, D. E. Bergstrom, G . D. Glick, and R.A. Jones. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. Nueva York: John Wilcy & Sons, 1 1 .2.1 -1 1 .2.10, 2000; y COVE™ (ARN structure analysis using covariance models (stochastic context free grammar methods)) v.2.4.2, (Eddy and Durbin (1994) Nucí . Acids Res. 22:2079-88), que se distribuye gratuitamente como código fuente y puede descargarse accediendo a la página web genetics.wustl.edu/eddy/software/; y FOLDALIGN™ ( ver Gorodkin et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(18):3724-32 y Gorodkin et al. (1997) Proceedings I nternational Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB International Conference on I ntelligent Systems for Molecular Biology 5: 120-123), distribuido tambien gratu itamente y disponible para su descarga en la página web, foldalign .ku.dk/software/ index.html .
Promotor: El término "promotor" hace referencia a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresión de un código de secuencia de ácido nucleico o ARN funcional. En los ejemplos, el código de secuencia controlado está situado a 3' de una secuencia promotora . Un promotor puede derivar en su totalidad de u n gen nativo y puede estar compuesto por diversos elementos que procedan de promotores distintos que se encuentran en la naturaleza, o bien, un promotor puede incluso comprimir segmentos sinteticos de ADN . Aquellos expertos en la téenica, sabrán que distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, en distintas etapas de su desarrollo o como respuesta a diversas condiciones medioambientales o psicológicas. Ejemplos de todos los promotores descritos hasta ahora son bien conocidos, y se usan en la ciencia de controlar la expresión de los ácidos nucleicos heterólogos. A los promotores que dirigen la expresión de un gen en muchos tipos de células y en la mayoría de los casos, se los conoce como "promotores constitutivos". Asimismo, mientras ha habido personas que han tratado de delimitar (en muchos casos sin éxito) los límites exactos de las secuencias reguladoras, ha llegado finalmente a entenderse que fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener la misma actividad promotora. La actividad promotora de un ácido nucleico concreto puede analizarse usando técnicas que le sean conocidas a la persona encargada del análisis.
Operacionalmente ligado: El concepto "operacionalmente ligado" hace referencia a una asociación de secuencias de ácidos nucleicos en la que una de tales secuencias puede afectar la función de otra. Por ejemplo, un promotor está operacionalmente ligado a un código de secuencia cuando el promotor es capaz de afectar a la expresión de ese código de secuencia (por ejemplo si el código de secuencia se encuentra bajo el control transcripcional del promotor). U n código de secuencia puede ser operacionalmente ligado a una secuencia reguladora con orientación sentido o antisentido.
Expresión: El termino "expresión", como se usa aquí, puede referirse a la transcripción y acumulación estable del ARN sentido (ARNm) o antisentido derivado de un ADN . Expresión también puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido. Como se usa aquí, el término "sobreexpresión" se refiere a la expresión que es más alta que la expresión endógena del mismo gen o un gen referido. Así, un gen heterólogo se "sobreexpresa" si su expresión es mayor que la de un gen endógeno comparable.
Transformación : Como se usa aquí, el término "transformación" se refiere a la transferencia y la integración de un ácido nucleico o un fragmento del mismo en un organismo huésped, resultando en una herencia genéticamente estable. Los organismos huéspedes que contienen un ácido nucleico transformante se conocen como organismos "transgénicos", "recombinantes" o "transformados". Los métodos conocidos de transformación incluyen, por ejemplo: Transformación mediada de Agrobacterium tumefaciens - o A. rhizogenes ; transformación de fosfato de calcio; transformación de polibreno; fusión de protoplastos; electroporación ; métodos ultrasónicos (por ejemplo, sonoporación); transformación de liposoma; micromyección; transformación con ADN desnudo; transformación con vectores plasmídicos; transformación con vectores virales; transformación biolística (bombardeo con micropartículas); transformación mediada por WH ISKERS de carburo de silicio; aerosol radiante; y transformación mediada por PEG .
Introducido: Como se usa aquí, el término "introducido" (en el contexto de la introducción de un ácido nucleico en una célula) incluye la transformación de una célula, así como el cruce de una planta que comprende el ácido nucleico con una segunda planta, de tal manera que la segunda planta contiene el ácido nucleico, como se puede realizar usando téenicas convencionales de fitomejoramiento. Tales técnicas son conocidas en el ámbito. Para una discusión de técnicas de mejora vegetal, ver Poehlman (1995) Breeding Field Crops. 4a edition, AVI Publication Co. , Westport CT.
Los métodos de retrocruzamiento se pueden usar para introducir un ácido nucleico en una planta. Esta técnica ha sido usada durante décadas para introducir rasgos en plantas. Un ejemplo de una descripción de retrocruzamiento (y otras metodolog ías de fitomejoramiento) se puede encontrar en , por ejemplo, Poelman (1995), supra ; and Jensen (1988) Plant Breeding Methodoloqy. Wilcy, New York, NY. En un ejemplo de protocolo de retrocruzamiento, una planta originaria de interés ("padre recurrente") se cruza con una segunda planta ("padre no recurrente") que lleva el un ácido nucleico a ser introducido. La progenie resultante de este cruce se cruzó de nuevo con el progenitor recurrente, y el proceso se repitió hasta que se obtuvo una planta convertida, en que esencialmente todas las características deseadas morfológicas y fisiológicas del progenitor recurrente se recuperan en la planta convertida, además del ácido nucleico del padre no recurrente.
Plásmido / vector: Los terminos "plásmido" y "vector", como se usa en la presente, se refieren a un elemento cromosómico extra que puede llevar uno o más genes que no son parte del metabolismo central de la célula. Los plásmidos y vectores son típicamente moléculas de ADN de doble cadena circulares. Sin embargo, los plásmidos y vectores pueden ser ácidos nucleicos lineales o circulares, de una sola o de doble cadena de ADN o ARN , y pueden ser derivados de cualquier fuente, en la que un número de secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única, que es capaz de introducir un fragmento promotor y una secuencia de ADN que se codifica junto con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula. En los ejemplos, plásmidos y vectores pueden incluir secuencias de replicación autónoma, secuencias de genoma de integración , y / o secuencias de nucleótidos o fagos.
III. DGT-28 y secuencias de codificación de DGT-28 Algunas modalidades aquí proporcionan un polipéptido aislado que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad (por ejemplo, 89% , al menos 90%, al menos 91 % , al menos 92% , al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, y al menos 99% de identidad) a la SEC ID No.: 1. Tal polipéptido se conoce aquí como polipéptido DGT-28. Algunas modalidades aquí proporcionan un ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 90% de identidad con la SEC ID No.: 1.
Ejemplos particulares de tal ácido nucleico se denominan aquí ácido nucleico "dgt-28". Los ácidos nucleicos dgt-28 pueden ser útiles en cualquiera de una amplia variedad de aplicaciones (por ejemplo, la introducción de resistencia a glifosato) en la que se desea un metabolismo del glifosato modificado en una célula vegetal.
Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos dgt-28 proporcionados para fines ilustrativos en este documento son las SEC ID No.: 2 y 3. Por consiguiente, algunas modalidades proporcionan un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia (por ejemplo, 79%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, y la identidad de al menos 99%) a la SEC ID No.: 2 o SEC ID No.: 3, en los cuales el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad con la SEC I D No. : 1 . Ejemplos particulares de ácidos nucleicos dgt-28 incluyen ácidos nucleicos que se hibridan específicamente a un ácido nucleico con la SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3 bajo condiciones severas (por ejemplo muy severas) .
En algunas modalidades, se proporcionan ácidos nucleicos dgt-28 de codón optimizado. Por ejemplo, para obtener una elevada expresión de un gen heterólogo en una planta, puede ser deseable diseñar y someter a re-ingeniería al gen, para que se exprese más eficientemente en una celula vegetal. Esta estrategia puede ser particularmente deseable en la circunstancia en la que se desea que un gen bacteriano se exprese en una célula vegetal .
Por lo tanto, algunos ejemplos del presente documento proporcionan un gen vegetal-optimizado que codifica una proteína DGT-28, y los métodos para el diseño de los mismos, para generar una secuencia de ADN que se puede expresar de manera óptima en las plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas, y en donde las modificaciones de la secuencia no obstaculicen la traducción o la transcripción. El diseño de un gen dgt-28 para la expresión de la misma proteína DGT-28 tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas se ejemplifica en este documento por medio de la re-ingeniería de la región de este gen que codifica proteínas para una óptima expresión . Aquí los ácidos nucleicos dgt-28 ejemplares optimizados para plantas incluyen SEC ID No. : 2 y SEC I D No. : 3.
Al usar metodos de ingeniería para obtener un gen que codifica la expresión de una proteína DGT-28 para su expresión en plantas dicotiledóneas o monocotiledóneas (por ejemplo, algodón , cañóla, tabaco, maíz, soja, trigo y arroz), el sesgo del codón de la futura planta huésped puede determinarse, por ejemplo, a través del uso de bases de datos de secuencias de ADN disponibles al público para encontrar información sobre la distribución de los codones de los genomas vegetales o las regiones codificadoras de proteínas de varios genes vegetales.
En el diseño de las regiones de codificación en un ácido nucleico para la expresión de una planta, deben determinarse los codones principales ("primera opción") preferidos por la planta , como puede ser la segunda, tercera, cuarta, etcétera, elección de codones preferidos cuando existen múltiples opciones. Una nueva secuencia de ADN puede ser diseñada que codifica la secuencia de aminoácidos del péptido mismo (por ejemplo, una proteína DGT-28), pero la nueva secuencia de ADN se diferencia de la secuencia de ADN original mediante la sustitución de codones de la planta (primera preferida, segundo preferida, tercera preferidas, o cuarta preferidas, etcétera) para especificar el aminoácido en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos.
La nueva secuencia puede ser analizada para determinar si hay sitios de restricción enzimática que pueden haberse creado al realizar las modificaciones. Los sitios identificados pueden modificarse más aún al reemplazar los codones con codones preferidos de primera, segunda, tercera o cuarta elección. Otros sitios en la secuencia que pueden afectar la transcripción o traducción del gen de interes son las estructuras del tallo-bucle, uniones exón :intrón (5' o 3'), señales adicionales poli A, y señales de terminación de ARN polimerasa; estos sitios pueden quitarse por medio de la sustitución de codones vegetales. La secuencia puede ser analizada y modificada más aún para reducir la frecuencia de dobletes TA o CG . Además de dobletes, bloques de secuencia G o C que tienen más de unos seis residuos iguales pueden afectar la transcripción o traducción de la secuencia. Por tanto, estos bloques se pueden modificar reemplazando los codones de primera o segunda elección , etcétera, por el próximo codón preferido de elección .
SEC ID No.: 2 ( dgt-28 (v5)) se optimizó para su expresión en plantas dicotiledóneas. SEC I D No. : 3 ( dgt-28 (v6)) se optimizó para su expresión en plantas monocotiledóneas. El uso de codones en estas secuencias sintéticas se seleccionan en base al uso de codones preferido, es decir, los productos de expresión de cada uno están codificadas por codones que tienen un sesgo hacia su uso en las monocotiledóneas o las dicotiledóneas, y las secuencias perjudiciales y sitios de restricción superfluos se eliminaron para aumentar la eficiencia de la transcripción / traducción del polipéptido DGT-28 y para facilitar las etapas de la manipulación del ADN.
Del mismo modo, la molecula de ácido nucleico de la SEC I D No. : 4 (dgfí-28 (v1 )) se ha optimizado para mejorar la expresión en Escherichia coli. El uso de codones en la SEC ID No. : 4 se seleccionó basándose en el uso de codones preferido E. coli, la proteína expresada es codificada por los codones que tienen un sesgo hacia el uso de E. coli. Durante el rediseño, secuencias perjudiciales y sitios de restricción superfluos fueron eliminados para aumentar la eficacia de la transcripción / traducción de la secuencia de codificación DGT-28 y para facilitar las etapas de manipulación del ADN . Así, la expresión de DGT-28 a partir de un ácido nucleico que comprende la SEC ID No. : 4 en E. coli puede resultar en la robusta expresión de proteínas, por ejemplo, para la caracterización enzimática de DGT-28.
Una vez que una secuencia optimizada de ADN optimizado (por ejemplo, optimizada en una planta) ha sido diseñada en el papel, o in silico, las moléculas reales de ADN se pueden sintetizar en el laboratorio como para corresponder precisamente a la secuencia de la secuencia diseñada. Tales moléculas sintéticas de moléculas de ácido nucleico pueden ser clonadas y manipuladas como si se derivaran de fuentes naturales o nativas.
Un ácido nucleico aquí puede ser clonado dentro de un vector para la transformación en células procariotas o eucariotas para replicación y / o expresión . Los vectores pueden ser vectores procariotas; por ejemplo, plásmidos, o vectores transportadores, vectores de insectos, o vectores eucarióticos. Un ácido nucleico en el presente documento tambien puede ser clonado en un vector de expresión , por ejemplo, para la administración a una célula vegetal . En ciertas aplicaciones, puede ser preferible tener vectores que son funcionales en E. coli (por ejemplo, producción de proteínas para la producción de anticuerpos, análisis de secuencia de ADN, construcción de insertos, obtener cantidades de ácidos nucleicos).
Para expresar una proteína DGT-28 en una célula, un ácido nucleico que codifica la proteína normalmente se subclonó en un vector de expresión que contiene un promotor para la transcripción directa. Adecuados promotores bacterianos y eucariotas son bien conocidos en la téenica y se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2 a ed 1989; 3 a ed, 2001..); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual ( 1990) , y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y otros, supra.). Los sistemas de expresión bacterianos para expresar un ácido nucleico aquí están disponibles en, por ejemplo, E. coli, Bacillus sp. , and Salmonella (Palva y otros. , Gene 22:229-235 ( 1983)). Kits para tales sistemas de expresión están disponibles comercialmente. Sistemas de expresión eucarióticos para células de mamíferos, levaduras, y células de insecto son bien conocidos por los expertos en la técnica y están también disponibles comercialmente.
El vector de expresión particular usado para transportar la información genetica en la célula se selecciona con respecto al uso previsto de la proteína DGT-28 (por ejemplo, la expresión en plantas, animales, bacterias, hongos y protozoos) . Los vectores estándar de expresión bacterianos y animales son conocidos en la téenica y se describen en detalle, por ejemplo, Publicación de Patente Estadounidense 20050064474A1 y Publicaciones de Patentes Internacionales WO 05/084190, W005/014791 y W003/080809. Los métodos estándar de transfección se pueden usar para producir líneas de células bacterianas que expresan grandes cantidades de proteína, que puede después purificarse usando técnicas estándar.
La selección de un promotor usado para dirigir la expresión de un ácido nucleico en este documento depende de la aplicación particular. Se pueden usar en modalidades en este documento un número de promotores que dirigen la expresión de un gen en una planta. Tales promotores se pueden seleccionar de entre promotores constitutivos, qu ímicamente regulados, inducidles, tejido específicos, y preferidos de las semillas. Por ejemplo, un promotor constitutivo fuerte adecuado para la célula huésped puede usarse para la expresión y purificación de proteínas DGT-28. Los ejemplos no limitantes de promotores de plantas incluyen secuencias promotoras derivadas de A. thaliana ubiquitina-10 (ubi-10) (Callis y otros, 1990, J. Biol. Chem. , 265: 12486-12493); A. tumefaciens manopina sintasa (Amas) (Petolino y otros, Patente Estadounidense No. 6,730,824.), y / o del virus del mosaico de las nervaduras de la yuca (CsVMV por sus siglas en ingles) (Verdaguer y otros, 1996, Plant Molecular Biology 31 : 1 129-1 1 39.) · Los promotores constitutivos incluyen , por ejemplo, el virus núcleo del mosaico de la coliflor promotora 35S (Odell y otros. (1985) Nature 313:810-812); Promotor de la actina del arroz (McEIroy y otros. (1990) Plant Cell 2: 163-171 ); el promotor de ubiquitina del maíz (Patente Estadounidense Número 5,510,474; Christensen y otros (1989) Plant Mol Biol.12:619-632 y Christensen y otros. (1992) Plant Mol Biol. 18:675-689); promotor pEM U (Last y otros. (1991 ) Theor. Appl . Genet. 81 :581 -588) ; promotor ALS (Patente Estadounidense No. 5,659,026); promotor de la histona del maíz (Chabouté y otros. Plant Molecular Biology, 8: 179-191 (1 987)) ; y otros similares.
El Intervalo de promotores de plantas compatibles disponibles incluye tejido específico y promotores inducibles. Un elemento regulador inducible es uno que es capaz de activar directa o indirectamente la transcripción de una o más secuencias de ADN o genes en respuesta a un inductor. En la ausencia de un inductor las secuencias de ADN o genes no serán transcritos. Típicamente, el factor proteína que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva, que después es convertida directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. El inductor puede ser un agente químico como una proteína, metabolito, regulador de crecimiento, herbicida o compuesto fenólico o un estres fisiológico impuesto directamente por calor, frío, sal o elementos tóxicos o indirectamente mediante la acción de un agente patógeno o enfermedad como un virus. Típicamente, el factor proteína que se une específicamente a un elemento regulador inducible para activar la transcripción está presente en una forma inactiva que después es convertida directa o indirectamente en la forma activa por el inductor. Una célula de planta que contiene un elemento regulador inducible puede estar expuesta a un inductor aplicando externamente el inductor a la célula o planta como por pulverización, riego, calentamiento o métodos similares.
Cualquier promotor inducible puede usarse en modalidades en este documento. Ver Ward y otros. Plant Mol . Biol. 22: 361 -366 (1993). Los promotores inducibles incluyen, por ejemplo y sin limitación : los promotores de los receptores de la ecdisona (Patente Estadounidense No. 6,504,082); promotores del sistema ACE 1 que responden al cobre (Mett y otros PNAS 90: 4.567-4.571 (1993)) ; I n 2- 1 y I n 2 -2 gen del maíz que responde a protectores herbicidas de bencenosulfonamida (Patente Estadounidense No. 5,364, 780; Hershey y otros, Mol Gen. Genetics 227: 229-237 (1991 ) y Gatz y otros, Mol Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)) ; represor Tet de Tn 10 (Gatz y otros, Mol. Gen . Genet. 227: 229-237 ( 1991 ) ; promotores de un gen de la hormona esteroide, la actividad transcripcional de la cual es inducida por una hormona glucocorticosteroide, Schena y otros, Proc Nati Acad Sci USA 88: 10421 ( 1991 ) y McNellis y otros, (1998) Plant J . 14 (2):247-257; el promotor GST del maíz, que es activado por compuestos electrofílicos hidrófobos que se usan como herbicidas de pre-emergencia (ver la Patente Estadounidense No. 5,965,387 y la solicitud de Publicación de Patente Internacional No. WO 93/001294); y el promotor del tabaco PR-1 a, que es activado por ácido salicílico (ver Ono S, Kusama M , Ogura R, Hiratsuka K. , “Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1 a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Repórter System ,” Biosci Biotechnol Biochem . 201 1 Sep 23;75(9): 1796-800) . Otros promotores de interes regulados qu ímicamente incluyen promotores inducibles por tetracielina y reprimibles por tetraciclina-(ver, por ejemplo, Gatz y otros. , ( 1991 ) Mol. Gen . Genet. 227:229-237, y Patentes Estadounidenses Nos. 5,814,618 y 5,789, 156).
Otros promotores regulables de interés incluyen un elemento regulador sensible al frío o un elemento regulador de choque térmico, cuya transcripción puede efectuarse en respuesta a la exposición al frío o calor, respectivamente (Takahashi y otros. , Plant Physiol . 99:383 -390, 1992) , el promotor del gen de la alcohol deshidrogenasa (Gerlach y otros, PNAS USA 79:2981 -2985 (1982) . ; . Walker y otros, PNAS 84 (19):6624-6628 (1987)), inducible por condiciones anaerobias, el promotor inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante o gen psaDb del guisante (Yamamoto y otros. (1997) Plant J. 12 (2):255-265 ); un elemento regulador inducible por la luz (Feinbaum y otros., Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991;Lam y Chua, Ciencia 248:471, 1990; Matsuoka y otros. (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco y otros. (1993) Plant Mol. Bio. 23 (6):1129-1138); un elemento regulador inducible por una hormona vegetal (Yamaguchi-Shinozaki y otros, Plant Mol. Biol. 15:905, 1990;Kares y otros., Plant Mol. Biol. 15:225, 1990), y similares. Un elemento regulador inducible tambien pueden ser los genes promotores del maíz I n 2- 1 o ln2-2, que responden a protectores herbicidas de bencenosulfonamida (Hershey y otros., Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz y otros., Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), y el Tet represor del transposon Tn10 (Gatz y otros., Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991).
Los promotores inducible por estrés incluyen promotores ¡nducibles por el estrés sal / agua como P5CS (Zang y otros. (1997) Plant Sciences 129:81-89); promotores ¡nducibles por el frío, como cor15a (Hajela y otros. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm y otros. (1993) Plant Mol Biol 23:1073-1077), wsc120 (Ouellet y otros. (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci 7 (Kirch y otros. (1997) Plant Mol Biol. 33:897-909), y ci21A (Schneider y otros. (1997) Plant Physiol. 113:335-45); promotores ¡nducibles por la sequía, como Trg-31 (Chaudhary y otros (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57) y rd29 (Kasuga y otros. (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); promotores ¡nducibles osmóticamente, como Rab17 (Vilardell y otros. (1991 ) Plant Mol Biol 17:985-93) y osmotina (Raghothama y otros. (1993) Plant Mol Biol 23: 1 1 17-28); promotores inducibles por el calor, como proteínas de choque termico (Barros y otros. (1992) Plant Mol. 19:665-75; Marrs y otros. (1993) Dev. Genet. 14:27-41 ), smHSP (Waters y otros. (1996) J. Experimental Botany 47:325-338), y el elemento inducible por el choque térmico a partir del promotor de ubiquitina del perejil (WO 03/102198) . Otros promotores inducibles por el estrés incluyen rip2 (Patente Estadounidense No. 5,332,808 y Publicación Estadounidense No. 2003/0217393) y RD29A (Yamaguchi-Shinozaki y otros. (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331 -340). Algunos promotores son inducibles por heridas, incluso el promotor de Agrobacterium PMAS (Guevara-Garcia y otros. (1993) Plant J . 4 (3):495-505) y el promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen y otros. , (1997) Mol. Gen . Genet. 254 (3):337-343).
Promotores preferidos por los tejidos pueden ser usados para apuntar a una mayor transcripción y / o expresión en un tejido de planta particular. Ejemplos de estos tipos de promotores incluyen la expresión preferida de la semilla, como la proporcionada por el promotor de faseolina (Bustos y otros.1989. The Plant Cell Vol . 1 , 839-853) , y el gen de la globulina-1 del maíz, Belanger, y otros. 1991 Genetics 129:863-972. Para dicotiledóneas, los promotores de semilla preferidos incluyen , pero no se limitan a , la b-faseolina del poroto, napina, b- conglicinina, lectina de la soja, cruciferina , y similares. Para monocotiledóneas, los promotores preferidos de semilla incluyen , pero no se limitan a los del maíz 15 kDa, 22 kDa zeína, 27 kDa zeína, g-zeína, ceroso, reducido 1 , reducido 2, globulina 1 , 5 etcetera. Los promotores preferidos de semilla también incluyen aquellos promotores que dirigen la expresión génica predominantemente a tejidos específicos dentro de la semilla como, por ejemplo, el promotor del endospermo preferido de la y- zeína, el promotor críptico del tabaco (Fobert y otros. 1994. ío Marcado con T-ADN de un promotor críptico específico de la cubierta de la semilla en el tabaco. Plant J . 4: 567-577), el promotor del gen P del maíz (Chopra y otros. 1996. Alelos del gen P del ma íz con especificidades tisulares distintas codifican las proteínas homologas Myb con reemplazos de terminales C. Plant 15 Cell 7: 1 149-1 158, Erratum in Plant Ce 11.1997 , 1 : 109), el promotor globulina-1 del maíz (Belenger y Kriz.1991 . Bases moleculares para el polimorfismo alélico del gen de la globulina-1 del maíz. Genetics 129: 863-972) , y los promotores que dirigen la expresión de la cubierta de la semilla o el casco de granos de maíz, por 20 ejemplo, el promotor específico del pericarpio de la glutamina sintetasa (Muhitch y otros, 2002 Isolation of a Promoter Sequence From the Glutamine Synthetasei-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163:865-872) . 25 Además del promotor, un vector de expresión contiene típicamente una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico en celulas huésped, ya sean procariotas o eucariotas. Un casete de expresión típico contiene por lo tanto un promotor ligado operativamente, por ejemplo, a una secuencia de ácidos nucleicos que codifican la proteína , y señales requeridas, por ejemplo, para la poliadenilación eficiente del transcrito, terminación de la transcripción, sitios de unión de ribosomas, o terminación de la traducción . Elementos adicionales de la casete pueden incluir, por ejemplo, potenciadores y señales heterólogas de empalme.
Otros componentes del vector pueden estar incluidos, también según el uso previsto del gen. Los ejemplos incluyen marcadores seleccionables, de focalización o de secuencias reguladoras, secuencias como la secuencia del péptido de tránsito optimizado (ver la Patente Estadounidense No. 5,510,471 ), secuencias estabilizantes como RB7 MAR (ver Thompson and Myatt, (1997) Plant Mol. Biol. , 34: 687-692 y WO9727207) o secuencias líderes, intrones, etcétera. descripciones generales y ejemplos de vectores de expresión de plantas y genes reporteros pueden ser encontrados en Gruber, y otros. , “Vectors for Plant Transformaron” in Methods in Plant Molecular Bioloav and Biotechnoloqy Glick y otros eds; CRC Press pp. 89-1 19 (1993).
La selección de un vector de expresión apropiado dependerá del huesped y del método de introducción del vector de expresión en el huésped. El casete de expresión puede incluir, en el extremo 3’de una secuencia de nucleótidos heterólogos de interés, una región de terminación transcripcional y traducción funcional en plantas. La región de terminación puede ser nativa con la secuencia de ADN de interés o puede ser derivada de otra fuente. Regiones de terminación convenientes están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, como las regiones de terminación de la octopina sintasa y de la nopalina sintasa (nos) (Depicker y otros., Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) and Shaw y otros. (1984) Nucleic Acids Research vol 12, N ° 20 pp7831-7846 (NOS)); ver también Guerineau y otros. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon y otros. Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen y otros. Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe y otros. Gene 91:151-158 (1990); Bailas y otros. Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi y otros. Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987).
Un casete de expresión puede contener una secuencia líder 5'. Tales secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción son conocidos en la téenica e incluyen a modo de ejemplo, los líderes de picornavirus, líder de EMCV (encefalomiocarditis región 5' no codificante), Elroy-Stein y otros. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989); líderes potivirus, por ejemplo, líder de TEV (Virus del Grabado del Tabaco) Carrington y Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), MDMV líder (virus del mosaico enano del maíz) , Allison y otros, Virology 154:9-20 (1986); inmunoglobulina humana de cadena pesada de la proteína de unión (BiP), Macejak y otros. Nature 353:90-94 (1991 ); líder no traducido del ARNm de la proteína de la cubierta del virus del mosaico de la alfalfa (AMV ARN 4), Jobling y otros. Nature 325:622-625 (1987); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), Gallie y otros. (1989) Molecular Biology of ARN , páginas 237-256, y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) Lommel y otros. Virology 81 :382-385 (1991 ). Ver tambien Della-Cioppa y otros. Plant Physiology 84 :965-968 (1987).
El constructo también puede contener secuencias que potencian la estabilidad de la traducción y / o ARNm como intrones. Un ejemplo de uno de tales intrones es del primer intrón del gen de la histona I I variante H3. I II de Arabidopsis thaliana.
Chaubet y otros. Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992) .
En aquellos casos en los que es deseable tener el producto expresado de la secuencia del nucleótido heterólogo dirigida a un orgánulo particular, particularmente el plástido, amiloplasto, o al retículo endoplásmico, o secretado en la superficie de la célula o extracelularmente, el casete de expresión puede comprender además una secuencia codificante para un péptido de tránsito. Tales péptidos de tránsito son bien conocidos en la téenica e incluyen , pero no están limitados a, el péptido de tránsito para la proteína transportadora de acilo, la subunidad pequeña de RUBI SCO , la sintasa vegetal EPSP y Helianthus annuus (ver Lebrun y otros. Patente Estadounidense No. 5,510,41 7) , Zea mays Brittle-1 chloroplast transit peptide (Nelson y otros. Plant 5 Physiol 1 17(4) : 1235- 1252 (1998); Sullivan y otros. Plant Cell 3( 12) : 1337-48 ; Sullivan y otros. , Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan y otros. , J. Biol. Chem . (1992) 267(26): 18999-9004) y similares. Además, los péptidos quiméricos de tránsito al cloroplasto son conocidos en la téenica, como el péptido de ío tránsito optimizado (ver, Patente Estadounidense No. 5,510,471 ) .
Se han descrito péptidos de tránsito al cloroplasto adicionales en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,717,084; 5,728,925. Una persona experto en la técnica fácilmente comprenderá las muchas opciones disponibles para expresar un producto a un orgánulo en 15 particular. Por ejemplo, la secuencia de la alfa amilasa de la cebada se usa a menudo para dirigir la expresión al retículo endoplásmico. Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731 -3738 (1985).
Los expertos en la técnica comprenderán que el uso de tecnolog ías de ADN recombinante pueden mejorar el control de la 0 expresión de moléculas de ácido nucleico transfectadas mediante la manipulación de, por ejemplo, el número de copias de las moléculas de ácido nucleico dentro de la célula huésped , la eficiencia con la que estas moléculas de ácidos nucleicos se transcriben, la eficiencia con la que los transcritos resultantes se 5 traducen, y la eficiencia de las modificaciones post- traduccionales. Además, la secuencia promotora puede manipularse geneticamente para mejorar el nivel de expresión en comparación con el promotor nativo. Las téenicas recombinantes útiles para controlar la expresión de moléculas de ácido nucleico incluyen , pero no se limitan a, la integración estable de las moléculas de ácidos nucleicos en uno o más cromosomas de la célula huésped , adición de secuencias de estabilidad de vectores a plásmidos, sustituciones o modificaciones de señales de control de transcripción (por ejemplo, promotores, operadores, potenciadores), sustituciones o modificaciones de señales de control de traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosomas, o secuencias de Shine-Dalgarno o de Kozak), modificación de moléculas de ácido nucleico que corresponden al uso del codón de la célula huésped , y la supresión de secuencias que desestabilizan transcripciones.
Los genes indicadores o marcadores para la selección de células transformadas o tejidos o partes de plantas o plantas pueden ser incluidos en los vectores de transformación. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen aquellos que confieren resistencia a los anti-metabolitos como herbicidas o antibióticos, por ejemplo, la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato (Reiss, Plant Physiol. Meijer y otros, Plant Mol Biol 16:807-820, 1991 ); neomicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EM BO J . 2:987-995, 1983 y Fralcy y otros Proc Nati Acad Sci USA 80:4803 (1983)) ; la higromicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a la higromicina (Marsh, Gene 32:481 -485, 1984, ver tambien Waldron y otros, Plant Mol. Biol. 5: 103-108, 1985; Zhijian y otros, Plant Science 108:219-227, 1995) ; trpB, que permite a las células usar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a las células usar histinol en lugar de histidina (Hartman , Proc Nati Acad Sci, USA 85:8047, 1988); manosa-6-fosfato isomerasa que permite a las células usar mañosa (WO 94/20627) ; ornitina descarboxilasa, que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2 (difluorometil)-DL ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, En : Current Communications in Molecular Biology, Coid Spring Harbor Laboratory ed); y la deaminasa del Aspergillus terreus, que confiere resistencia a la blasticidina S (Tamura, Biosci . Biotechnol . Biochem. 59:2336-2338, 1995).
Los marcadores seleccionables adicionales incluyen, por ejemplo, una acetolactato sintasa muíante, que confiere resistencia a la imidazolinona o sulfonilurea (Lee y otros. , EMBO J . 7: 1241 -1248, 1988), un mutante psbA, que confiere resistencia a la atrazina (Smeda y otros. , Plant Physiol . 103:91 1 -91 7, 1993), o un mutante de la oxidasa del protoporfirinogen (ver la patente Estadounidense 5,767,373) , o de otros marcadores que confieren resistencia a un herbicida como el glufosinato. Ejemplos de genes marcadores seleccionables incluyen, pero no están limitados a, genes que codifican resistencia al cloranfenicol (Herrera Estrella y otros, EM BO J . 2:987-992 , 1983 ); estreptomicina (Jones y otros, Mol. Gen . Genet. 210:86-91 , 1987); espectinomicina (Bretagne-Sag nard y otros. , Transgenic Res. 5: 131 -137, 1996); bleomicina (Hille y otros, Plant Mol . Biol. 7: 171 -176); sulfonamida 5 (Guerineau y otros, Plant Mol. Biol . 15: 127-136, 1990) ; bromoxinil (Stalker y otros, Science 242:419-423, 1988); glifosato (Shaw y otros, Science 233:478-481 , 1986) ; fosfinotricina (DeBlock y otros. , EMBO J. 6:2513-2518, 1987) , y similares.
Una de las opciones para el uso de un gen selectivo es un ío ADN que codifica la resistencia al glufosinato y en una modalidad puede ser la fosfinotricina acetil transferasa ( pat ), gen pat o gen bar optimizados del maíz bajo el control del promotor del virus de las nervaduras de la yuca. Estos genes confieren resistencia a bialafos. Ver, (ver, Wohlleben y otros, (1988) Gene 70: 25-37); 15 Gordon-Kamm y otros, Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya y otros, Biotechnology 1 1 :835, 1993; White y otros. , Nucí. Acids Res. 18: 1062, 1990; Spencer y otros. , Theor. Appl . Genet. 79:625-631 , 1990; y Anzai y otros. , Mol. Gen . Gen. 219:492, 1989). Una versión del gen pat es el gen pat optimizado del maíz, que se 20 describe en la Patente Estadounidense No. 6,096,947.
Además, pueden usarse marcadores que faciliten la identificación de una celula vegetal que contiene el polinucleótido que codifica el marcador. Son útiles los marcadores puntuables o rastreables, en los cuales la presencia de la secuencia produce 25 un producto medióle y puede producir el producto sin destrucción de la celula vegetal. Los ejemplos incluyen una b-glucuronidasa, o gen uidA (GUS), que codifica una enzima para la que diversos sustratos cromogénicos son conocidos (por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 5,268 ,463 y 5,599,670); la cloranfenicol 5 acetil transferasa (Jefferson y otros. The EMBO Journal vol. 6 No. 13 pp. 3901 -3907); y fosfatasa alcalina . En una modalidad preferida, el marcador usado es el beta-caroteno o provitamina A (Ye y otros, Science 287:303-305-(2000)). El gen ha sido usado para mejorar la nutrición de arroz, pero en este caso se usa como ío un marcador detectable, y la presencia del gen ligado a un gen de interés se detecta por el color dorado que proporciona. A diferencia de la situación en la que se usa el gen para su aporte nutricional a la planta, una cantidad más pequeña de las proteínas es suficiente para los propósitos de marcación. Otros 15 marcadores detectables tamizables incluyen los genes antocianina / flavonoides en general (ver la discusión en Taylor y Briggs, The Plant Cell (1990) 2: 1 15-127) incluso, por ejemplo, un gen R-locus, que codifica un producto que regula la producción de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales 20 (Dellaporta y otros. , in Ch romosome Structure and Function .
Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds. , pp. 263- 282 (1988)); los genes que controlan la biosíntesis de pigmentos flavonoides, como el gen C 1 del maíz (Kao y otros. , Plant Cell (1996) 8: 1 1 71 -1 179; Scheffler y otros. Mol. Gen. Genet. (1994) 25 242 :40-48) y C2 del maíz (Wienand y otros. , Mol. Gen . Genet. (1986) 203:202-207); el gen B (Chandler y otros. , Plant Cell (1989) 1 : 1 175-1 183) , el gen p1 (Grotewold y otros, Proc. Nati. Acad. Sci USA (1991 ) 88:4587-4591 ; Grotewold y otros. , Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko y otros. , Plant Mol . Biol. (1999) 5 39: 1 1 -19) ; los genes del locus bronce (Ralston y otros, Genetics (1988) 1 19: 185-197; Nash y otros, Plant Cell (1990) 2 (1 1 ) : 1039- 1049), entre otros.
Otros ejemplos de marcadores apropiados incluyen la proteína fluorescente cian del gen (CYP) (Bolte y otros (2004) J . ío Cell Science 1 1 7: 943-54 y Kato y otros. (2002) Plant Physiol 129: 913-42), el gen de la proteína fluorescente amarilla (PHIYFP™ de Evrogen; ver Bolte y otros. (2004) J. Cell Science 1 1 7: un gen lux, que codifica una luciferasa, la presencia de la cual puede ser detectada mediante, por ejemplo, películas de rayos X, 15 contadores de centelleo, espectrofotometría fluorescente, cámaras de vídeo de poca luz, cámaras de conteo de fotones o luminometría de múltiples pocilios (Teeri y otros (1989) EM BO J . 8:343) ; un gen (GFP) de una proteína verde fluorescente (Sheen y otros. , Plant J . (1995) 8(5):777-84); y DsRed2 con el cual las 20 celulas vegetales transformadas con el gen marcador son de color rojo, y por tanto detectables a simple vista (Dietrich y otros. (2002) Biotechniques 2(2):286-293) . Otros ejemplos adicionales incluyen un gen para la b-lactamasa (Sutcliffe, Proc. Nat'l. Acad. Sci. U .S.A. (1978) 75:3737), que codifica una enzima con varios 25 sustratos cromógenos conocidos (por ejemplo, PADAC , una cefalosporina cromógena); un gen xylE (Zukowsky y otros. , Proc. Nat'l. Acad . Sci . U.S.A. (1983) 80: 1 101 ), que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir a los catecoles cromógenos: un gen a-amilasa (Ikuta y otros. , Biotech . (1990) 8:241 ); y un gen de la tirosinasa (Katz y otros, J . Gen. Microbiol (1983.).129:2703), que codifica una enzima capaz de oxidar la tirosina a DOPA y dopaqumona, que a su vez se condensa para formar el compuesto melanina fácilmente detectable. Evidentemente, muchos de tales marcadores están disponibles y son conocidos por los expertos en la teenica.
IV. Las células y los organismos que comprenden DGT-28 En algunas modalidades, se proporciona una célula u organismo (por ejemplo, una célula vegetal o planta) que comprende un polipéptido heterólogo con al menos 90% de identidad con la SEC ID No. : 1. En modalidades particulares, una célula u organismo está previsto que comprenda un ácido nucleico heterólogo que codifique un polipéptido con al menos 90% de identidad con la SEC I D No. : 1 ; por ejemplo, un ácido nucleico dgt-28. Algunas modalidades incluyen una célula u organismo que comprenda un ácido nucleico heterólogo que se híbrida con otro ácido nucleico que contenga SEC I D No. : 2 o SEC ID No. : 3 bajo condiciones de alta rigurosidad.
Una célula de planta, parte de planta o la planta puede modificarse genéticamente para comprender un polipéptido heterólogo (por ejemplo, una proteína DGT-28) o un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, un ácido nucleico dgt-28) por cualquiera de los diferentes metodos para introducir una molécula heteróloga que se conozca en el oficio. En modalidades particulares en este documento, una molécula heteróloga se introduce en una célula de planta, parte de planta o la planta por un método seleccionado, por ejemplo, pero sin limitarse a: transformación y cría selectiva (por ejemplo, cría en cruzamiento retrógrado).
Cualquier especie de planta o célula de planta puede modificarse genéticamente para comprender un polipéptido heterólogo o un ácido nucleico en este documento. En otras modalidades, la célula de la planta modificada genéticamente no tiene la capacidad de regeneración para producir una planta. En algunas modalidades, las plantas que se modifican genéticamente de acuerdo con la presente descripción (por ejemplo, las células de la planta huésped) incluye, pero no se limita a, una planta superior, una planta dicotiledónea, plantas monocotiledóneas, una planta consumible, una planta de cultivo y una planta que se utilice por sus aceites (por ejemplo, una planta oleaginosa). Tales plantas incluyen, por ejemplo y sin limitación : alfalfa, soja, algodón, semilla de colza (cañóla) , semilla de lino, maíz, arroz; brachiaria ; trigo, cártamo, sorgo, remolacha azucarera, girasol, tabaco y pastos (por ejemplo, el césped) . En ejemplos particulares, una célula vegetal o planta genéticamente modificada en este documento incluye, por ejemplo, pero sin limitarse a: Brassica napus, mostaza india ( Brassica júncea), mostaza etíope ( Brassica carínate ), nabo ( Brassica rapa) , repollo ( Brassica olerácea) , Glycine max, Linum usitatissimum, Zea mays, Carthamus tinctorius, Helianthus annuus, Nicotiana tabacum; Arabidopsis thaliana, la nuez de Brasil (Betholettia excelsa), ricino ( Ricinus communis), coco ( Cocus nucífera), cilantro ( Coriandrum sativum) Gossypium spp, man í ( Arachis hypogaea) , jojoba (S immondsia Chinensis) , aceite de palma (Elaeis guiñeeis ), olivo ( Olea eurpaea), Oryza sativa, calabaza ( Cucúrbita maxima), cebada ( Hordeum vulgare), caña de azúcar ( Saccharum officinarum), Triticum spp (incluyendo Triticum durum y Triticum aestivum) y lenteja de agua ( Lemnaceae sp. ) . En algunas modalidades, la planta podría tener antecedentes genéticos particulares en cuanto a cultivares de élite, cultivares de tipo salvaje y las variedades comercialmente distinguibles.
Los ácidos nucleicos que se introducen en una célula vegetal podrían usarse para conferir rasgos deseados en esencialmente cualquier planta. Una amplia variedad de plantas y sistemas de células vegetales podrían manipularse para obtener las características fisiológicas y agronómicas deseadas descritas en este documento usando un ácido nucleico que codifique un polipéptido DGT y diversos métodos de transformación. Las modalidades en este documento podrían usar cualquiera de los muchos métodos para la transformación de plantas (y la producción de plantas modificadas genéticamente) que se conocen en el oficio. Se han desarrollado numerosos metodos para la transformación de plantas, incluyendo protocolos de transformación biológica y física para las plantas dicotiledóneas, así como para las plantas monocotiledóneas (Vea, por ejemplo, Goto-Fumiyuki et al. (1999) Nat. Biotechnol. 1 7:282-6; Miki et al. (1993) Methods in Plant Molecular Bioloav and Biotechnoloav (Métodos en biología molecular y bioteenología de las plantas) (Glick, B. R. y Thompson , J . E. , Eds.) , CRC Press, Inc. , Boca Ratón , FL, pp . 67-88). Además, se describen los vectores y los métodos de cultivo in vitro para las células vegetales y transformación y regeneración de tejidos de plantas, por ejemplo, en Gruber et al. (1993), supra, en págs. 89-1 19.
Las técn icas de transformación de plantas disponibles para introducir un ácido nucleico en una célula vegetal huésped incluyen , por ejemplo, pero no se limitan a: la transformación con ADN-T desarmado usando Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes como agente de transformación , transfección con fosfato de calcio, transformación con polibreno; fusión de protoplastos, electroporación (D'Hallum et al. (1992) Célula vegetal 4: 1495 505); métodos ultrasónicos (por ejemplo, sonoporación) , transformación de liposoma; micromyección , contacto con el ADN desnudo, contacto con vectores plasmídicos, contacto con vectores virales; biolística (por ejemplo, bombardeo de partículas de ADN (ver, por ejemplo, Klein et al. (1987) Naturaleza 327:70-3) y bombardeo de micropartículas (Sanford et al. (1987) Parí. Sci. Technol. 5:27; Sanford (1988) Trends Biotech . 6:299, Sanford (1990) Physiol. Plant 79:206; and Klein et al. 1992) Biotechnology 10:268); transformación con WH ISKERS de carburo de silicio (Kaeppler et al. (1990) Rep. de celulas vegetales 9:41 5-8); transformación de nanopartículas (ver, por ejemplo, Publicación de Patente Estadounidense No.
US2009/01 04700A1 ); aerosol radiante y captación con polietilenglicol (PEG por sus siglas en inglés). En ejemplos específicos, un ácido nucleico heterólogo puede introd ucirse directamente en el ADN genómico de una célula vegetal.
Un método ampliamente usado para introducir un vector de expresión en una planta se basa en el sistema natural de transformación de Agrobacterium. Horsch et al. (1985) Science 227: 1229. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias terrestres patógenas vegetales conocidas por ser útiles para transformar genéticamente las células vegetales. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables de la transformación genética de la planta. Kado ( 1991 ) Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1 . Detalles relativos a los sistemas de vector Agrobacterium y métodos para transferencia de genes con Agrobacterium también están disponibles en , por ejemplo, Gruber et al, supra, Miki et al, supra, Moloncy et al. (1989) Plant Cell Reports (Informes de células vegetales) 8:238, y la Patente Estadounidense No. 4,940,838 y 5,464,763.
Si se usa Agrobacterium para la transformación , el ADN que se insertará típicamente se clona en plásmidos especiales, ya sea en un vector intermedio o en un vector binario. Los vectores intermedios no pueden replicarse en Agrobacterium. El vector intermedio podría transferirse a A. tumefaciens mediante un plásmido auxiliar (conjugación). El sistema superbinario de The Japan Tobacco es un ejemplo de tal sistema (revisado por Komari et al. (2006) Methods in Molecular Bioloqy (Metodos en biolog ía molecular) (K. Wang, ed .) No. 343; Agrobacterium Protocols (Protocolos de Agrobacterium) . 2da Edición , Vol. 1 , Humana Press I nc. , Totowa, NJ , pp.15-41 ; y Komori et al. (2007) Plant Physiol. 145: 1 155-60). Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como en Agrobacterium. Los vectores binarios comprenden un gen marcador de selección y un enlazador o polienlazador, que están enmarcados por las regiones de los bordes derecho e izquierdo del ADN-T. Se pueden transformar directamente en Agrobacterium (Holsters, 1978) . El Agrobacterium comprende un plásmido que lleva una región vir. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir necesaria para la transferencia del ADN-T. La región vir es necesaria para la transferencia del ADN-T en la célula vegetal. Puede contener ADN-T adicional.
Las funciones de virulencia del huésped de Agrobacterium tumefaciens dirigirán la inserción de una hebra T que contiene el marcador de constructo y adyacente en el ADN de la célula vegetal cuando la célula está infectada por las bacterias usando un vector binario de ADN-T (Bevan (1984) Nuc Acid Res. 12 :871 1 21 ) o el procedimiento de cocultivo (Horsch et al. (1985) Ciencia 227: 1229-31 ) . Por lo general , el sistema de transformación de Agrobacterium se usa para diseñar plantas dicotiledóneas. Bevan et al. ( 1982) Ann . Rev. Genet 16:357-84; Rogers et al. ( 1986) Methods Enzymol . 1 18:627-41 . El sistema de transformación de Agrobacterium tambien podría usarse para transformar, así como transferir, los ácidos nucleicos a las plantas monocotiledóneas y las células vegetales. Vea la Patente Estadounidense No. 5,591 ,616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3:3039-41 ; Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 31 1 :763-4; Grimslcy et al. (1987) Nature 325: 1677-9; Boulton et al. (1989) Plant Mol . Biol. 12:31 -40; and Gould et al. (1991 ) Plant Physiol. 95:426-34.
Las manipulaciones genéticas de un huésped recombinante en el presente se pueden realizar usando téenicas y pruebas estándar de genética, y se pueden llevar a cabo en cualquier célula huésped que sea adecuada para la manipulación genética. En algunas modalidades, una célula huésped recombinante podría ser cualquier organismo o microorganismo huésped adecuado para la modificación genética o expresión de genes recombinantes. En algunas modalidades, un huésped recombinante podría ser una planta. El ADN recombinante estándar y las técnicas de clonación molecular usadas aqu í son bien conocidas en el oficio y se describen en, por ejemplo, pero no limitado a: Sambrook et al. (1989), supra\ Silhavy et al. (1984) Experimente with Gene Fusions (Experimentos con fusiones de genes) , Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY; y Ausubel et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en la biología molecular) , Greene Publishing Assoc. y Wilcy-l nterscience, New York, NY.
Despues de la introducción de un ácido nucleico en una célula vegetal , se puede cultivar la célula vegetal, y al aparecer el tejido diferenciador, como brotes y raíces, es posible generar las plantas maduras. En algunas modalidades, es posible generar una pluralidad de plantas. Las metodologías para regenerar plantas son conocidas en el hacer habitual del oficio y se pueden encontrar, por ejemplo, en Plant Cell and Tissue Culture (La célula vegetal y el cultivo de tejidos), 1994, Vasil and Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers y en : Plant Cell Culture Protocols (Protocolos de cultivo de la célula vegetal) (Methods in Molecular Biology (Métodos en la Biología Molecular) 1 1 1 , 1999 Hall Eds Humana Press) . Las plantas modificadas genéticamente que se describen en este documento se pueden cultivar en un medio de fermentación o hacer crecer en un medio adecuado como el suelo. En algunas modalidades, un medio de crecimiento adecuado para las plantas superiores puede ser cualquier medio de crecimiento para plantas, incluyendo, pero no limitado a, tierra, arena, cualquier otro medio particulado que soporte el crecimiento de la raíz (por ejemplo, vermiculita, perlita, etcétera) o cultivo hidropónico, así como una luz adecuada, agua y suplementos nutricionales que facilitan el crecimiento de la planta superior.
Las células vegetales transformadas q ue se producen por cualquiera de las téenicas de transformación anteriores se pueden cultivar para regenerar una planta entera que posea el genotipo transformado y, por tanto, el fenotipo deseado. Tales técnicas de regeneración se basan en la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, típicamente dependen de un marcador biocida o herbicida que se ha introducido junto con las secuencias de nucleótidos deseadas. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados se describe en Evans, et al. , "Protoplasts Isolation and Culture” (Aislamiento y cultivo de protoplastos) en Handbook of Plant Cell Culture (Manual de cultivo de células vegetales), pp 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; y Binding , Regeneration of Plants, Plant Protoplasts (Regeneración de plantas, Protoplastos vegetales), pp. 21 -73, CRC Press, Boca Ratón, 1985. La regeneración también puede obtenerse a partir de callos de plantas, explantes, órganos, polen , embriones o partes de los mismos. Tales técnicas de regeneración se describen generalmente en Klee et al. ( 1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.
En otra modalidad, las células transformadas de la planta no tienen la capacidad de regeneración para producir una planta . Tales células pueden usarse , por ejemplo, para desarrollar una celula de planta que disponga del fenotipo pertinente como, por ejemplo, resistencia al herbicida.
Una célu la vegetal, callo, tejido o planta transformada puede identificarse y aislarse mediante la selección o cribado del material de la planta transgénica para los rasgos codificados por los genes marcadores presentes en el ADN transformante. Por ejemplo, la selección se puede realizar mediante el cultivo del material de planta transgénica, en medios que contienen una cantidad inhibidora del antibiótico o herbicida al cual la construcción del gen transformador confiere resistencia. Además, las plantas transformadas y las células vegetales también pueden identificarse mediante la detección de las actividades de cualquiera de los genes marcadores visibles (por ejemplo, la b-glucuronidasa , genes de luciferasa , o de gfp) que pudieran estar presentes en los constructos de ácidos nucleicos recombinantes. Tal selección y las metodolog ías de detección son bien conocidas para los expertos en la téenica.
Una planta transgénica que contiene una molécula heteróloga en el presente puede producirse a través de reproducción selectiva, por ejemplo, cruzando sexualmente una primera planta parental que contenga la molécula con una segunda planta parental, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de primera progenie. Una planta de primera progenie se seleccionará posteriormente, esta debe ser resistente a un marcador seleccionable (por ejemplo, glifosato, resistencia que se le pueda conferir a la planta progenie mediante la molecula heteróloga aq uí descrita). La planta de primera progenie puede entonces auto-fecundarse, produciendo de ese modo una pluralidad de plantas de segunda progenie. Después, una planta de segunda progenie puede seleccionarse, esta debe ser resistente al marcador seleccionable. Estas etapas pueden incluir además el retrocruzamiento de la planta de primera progenie o la planta de segunda progenie a la segunda planta parental o una tercera planta parental.
También debe entenderse que dos plantas transgénicas diferentes también pueden acoplarse para producir descendencia que contenga dos genes exógenos, agregados, independientemente segregantes. La autofecundación de la progenie apropiada puede producir plantas que son homocigóticas para los genes tanto exógenos como añadidos. El retrocruzamiento a una planta parental y el cruzamiento de especies distintas con una planta no transgénica también se contemplan , ya que es una propagación vegetativa. Otros métodos de reproducción usados comúnmente para diferentes rasgos y cosechas se conocen en el oficio. El retrocruzamiento se ha usado para transferir genes para un rasgo heredado de manera sencilla y altamente heredable en un cultivar homocigótico deseable o línea pura, que es el padre recurrente. La planta resultante se espera que tenga los atributos del padre recurrente (por ejemplo, cultivar) y el rasgo deseable transferido desde el padre donante. Despues del cruce inicial , los individuos que posean el fenotipo del padre donante se seleccionan y cruzan repetidas veces (cruzamiento retrógrado) con el padre recurrente. El padre resultante se espera que tenga los atributos del padre recurrente (por ejemplo, cultivar) y el rasgo deseable transferido desde el padre donante.
Un ácido nucleico también se puede introducir en un área predeterminada del genoma de la planta a través de la recombinación homologa. Dentro de la téenica se han descrito los métodos para integrar de manera estable una secuencia de polinucleótidos dentro de un sitio cromosómico específico de una célula vegetal mediante la recombinación homologa. Por ejemplo, la integración específica del sitio, como se describe en la Publicación de la Solicitud de la Patente Estadounidense No. 2009/01 1 1 188 A1 , implica el uso de recombinasas o integrasas para mediar la introducción de una secuencia de polinucleótido donante en un objetivo cromosómico. Además, La Solicitud de Patente I nternacional No. WO 2008/021207, describe la recombinación homologa con dedo de zinc para integrar de manera estable una o más secuencias de polinucleótidos donantes dentro de las ubicaciones específicas del genoma. El uso de recombinasas, como FLP/FRT que se describe en la Patente Estadounidense No. 6,720,475, o CRE/LOX que se describe en la Patente de Estadounidense No. 5,658, 772, se puede usar para integrar de manera estable una secuencia de polinucleótido en un sitio cromosómico específico. Finalmente, el uso de meganucleasas para dirigirse a los polinucleótidos donantes en una ubicación cromosómica específica se describe en Puchta et al. , PNAS USA 93 (1996) pp 5055-5060).
Otros metodos diferentes para la integración específica del sitio dentro de las células vegetales se conocen y aplican de manera general. (Kumar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001 ) pp. 155-159) . Además, los sistemas de recombinación específicas al sitio que se han identificado en varias organismos procariotas y eucariotas inferiores se pueden aplicar para su uso en plantas. Ejemplos de tales sistemas incluyen, pero no se limitan a el sistema recombinasa R/RS del plásmido pSR1 de la levadura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J . Mol . Biol . 182 : 191 -203), y Gin/gix system of phage Mu (Maeser y Kahlmann ( 1991 ) Mol. Gen . Genet. 230: 170-176).
En algunas modalidades, un ácido nucleico heterólogo que codifique un polipéptido con al menos 90% de identidad con la SEC ID No. : 1 se puede combinar opcionalmente con otro ácido nucleico en la célula u organismo huésped. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el ácido nucleico heterólogo que codifica un polipéptido con al menos 90% de identidad con SEC I D No. : 1 se puede combinar o "apilar" con otro que proporcione una resistencia o tolerancia adicional al glifosato u otro herbicida , u otro que proporcione resistencia a insectos o enfermedades seleccionadas, o mejoras nutricionales, o mejora de las características agronómicas, u otro que proporcione las proteínas u otros productos útiles en la alimentación , alimentos, usos industriales, farmaceuticas o de otra índole. El "apilamiento" de dos o más secuencias de ácido nucleico de interés dentro de un genoma vegetal se puede conseguir, por ejemplo, mediante el cultivo tradicional de plantas usando dos o más eventos, la transformación de una planta con un constructo que contiene los ácidos nucleicos, retransformación de una planta transgénica o la adición de nuevos rasgos a través de la integración dirigida mediante recombinación homologa.
Los ácidos nucleicos que pueden “apilarse” con una codificación de ácido nucleico heteróloga, un polipéptido que tiene al menos un 90% de identidad de SEC I D No. : 1 incluyen , por ejemplo pero sin limitarse a: Genes o Secuencia de codificación (por ejemplo ¡ARN) que confieren resistencia a pestes o enfermedades (A) Genes resistentes a enfermedades de plantas. Las defensas de las plantas suelen activarse mediante interacción específica entre el producto del gen de resistencia a la enfermedad (R) en la planta y el producto del gen de la anti virulencia correspondiente (Avr) en el patógeno. Una variedad de planta puede transformarse con un gen de resistencia clonado para crear plantas que sean resistentes a cepas patógenas específicas. Ejemplos de tales genes incluyen, el gen Cf-9 del tomate para la resistencia a Cladosporium fulvum (Jones et al. , 1994 Science 266:789), el gen Pto del tomate, qge incluye una proteína cinasa para resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al. , 1993 Science 262: 1432) , y el gen Arabidopsis RSSP2 para la resistencia a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al. , 1994 Cell 78: 1089) .
(B) Una proteína del Bacillus thuringiensis, un derivado de ello o un polipeptido sintético modelado del mismo, como una secuencia nucleótida de un gen Bt d-endotoxina (Geiser et al. , 1986 Gene 48: 109), y un gen de insecticida vegetativo (VI P) (ver, por ejemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Nati. Acad . Sci. 93:5389- 94). Además, la codificación de los genes de las moléculas de ADN d-endotoxina puede comprarse de la American Type Culture Collection [ATCC] (Rockville, Md.) , bajo los números de acceso 40098, 67136, 31995 y 31998 de la ATCC .
(C) Una lectina como las secuencias nucleótidas de varios genes Olivia miniata de lectina de unión a mañosa (Van Damme et al . , 1994 Plant Molec. Biol . 24:825).
(D) Una proteína vinculante de vitamina, como avidina y sus homólogos, que son útiles como larvicidas contra pestes de insectos. Ver Patente Estadounidense No. 5,659,026.
(E) Un inhibidor de enzima, por ejemplo, un inhibidor de proteasa o un inhibidor de amilasa. Ejemplos de tales genes incluyen el inhibidor de proteinasa cisteína del arroz (Abe et al . , 1987 J . Biol. Chem. 262: 16793), un inhibidor de proteinasa del tabaco I (Huub et al. , 1993 Plant Molec. Biol. 21 :985) , y un inhibidor de a-amilasa (Sumitani et al. , 1993 Biosci. Biotech . Biochem. 57: 1243).
(F) Una hormona o feromona específica de insecto como ecdisteroide y hormona juvenil, una variante de ella, una mimetica basada en la misma o un antagonista o agonista de ella como la expresión de baculovirus de esterasa de hormona juvenil clonada, un desactivador de hormona juvenil (Hammock et al. , 1990 Nature 344:458).
(G) Un péptido o neuropéptido específico del insecto que, al expresarse, interrumpe la fisiología de la peste afectada (J . Biol. Chem. 269:9). Los ejemplos de tales genes incluyen un receptor de hormona diurética de insecto (Regan, 1994) , una alostatina identificada en Diploptera punctata (Pratt, 1989) , y neurotoxinas paralíticas específicas del insecto (Patente Estadounidense No. 5,266,361 ).
(H) Un veneno específico de insecto producido en la naturaleza por una serpiente, una avispa, etcétera, como un péptido insectotóxico de escorpión (Pang, 1992 Gene 1 16: 165).
(I) Una enzima responsable de una hiperacumulación de monoterpeno, un sesquiterpeno, un esteroide, ácido hidroxámico, un derivado de fenilpropanoide u otra molécula no proteica con actividad insecticida.
(J) Una enzima involucrada en la modificación, incluyendo la modificación de una molécula biológicamente activa, por ejemplo, enzima glicolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una cielasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa , una fosfatase, una qumasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una Chitinasa y una glucanasa, ya sean naturales o sinteticas. Ejemplos de tales genes incluyen, un gen callas (solicitud de la publicación de PCT WO93/02197), secuencias de codificación de Chitinasa (que pueden obtenerse, por ejemplo, de la ATCC bajo los números de acceso 3999637 y 67152), Chitinasa anquilostoma del tabaco (Kramer et al. , 1993 Insect Molec. Biol. 23:691 ) , y gen ubi4-2 poliubiquitina del perejil (Kawalleck et al. , 1993 Plant Molec. Biol. 21 :673) .
(K) Una molécula que estimula la transducción de señales. Ejemplos de tales moléculas incluyen secuencias nucleótidas para clones cADN calmodulina de frijoles Chinos (Botella et al. , 1994 Plant Molec. Biol . 24:757) y una secuencia nucleótida de clon cADN calmodulina del maíz (Griess et al. , 1994 Plant Physiol. 104: 1467) .
(L) Un péptido de momento hidrofóbico. Ver Patentes Estadounidenses Nos. 5,659,026 y 5,607,914; esta última enseña los péptidos sintéticos antimicrobial que confieren resistencia a la enfermedad.
(M) Una permeasa de membrana, un formador de canal o bloqueador de canal, como un análogo de péptido lítico cecropin-b (Jaynes et al. , 1993 Plant Sci. 89:43) que hace resistentes a las plantas de tabaco transgénico para Pseudomonas solanacearum.
(N) Una proteína viral invasiva o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de recubrimiento viral en celulas de planta transformadas imparten resistencia a la infección virósica y/o desarrollo de enfermedad efectuado por el virus de cual deriva el gen de proteína que recubre, al igual que los virus referidos. Se ha conferido la resistencia de la proteína por medio del recubrimiento a plantas transformadas contra el virus mosaico de la alfalfa, virus mosaico del pepino, virus cepa del tabaco, virus X de la papa, virus Y de la papa, virus etch del tabaco, virus cascabeleo del tabaco y virus mosaico del tabaco. Consulte, por ejemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol . 28:451 .
(O) Un anticuerpo específico de insecto o una inmunotoxina derivada del mismo. Así, un anticuerpo orientado a una función metabólica crítica en las entrañas del insecto desactivaría a la enzima afectada, matando al insecto. Por ejemplo, Taylor et al . (1994) Abstract #497, Seventh I nt'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions shows enzymatic inactivation in transgénic tobáceo via production of single-chain antibody fragments.
(P) Un anticuerpo específico de virus. Consulte, por ejemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469, que muestra que las plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes están protegidas contra ataques de virus.
(Q) Una proteína de desarrollo lento producida en la naturaleza por un patógeno o parásito. Así, la poligalacturonasas fúngicas a-1 ,4-D facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes de planta al solubilizar la pared celular de la planta galacturonasa homo-a-1 ,4-D (Lamb et al. , 1992) Bio/Technology 10: 1436. La clonación y caracterización de un gen que codifica un proteína inhibidora de endopoligalacturonasa del frijol es descrita por Toubart et al . (1992 Plant J . 2:367) .
(R) Una proteína de desarrollo lento producida en la naturaleza por una planta, como el gen de desactivación de ribosoma de la cebada que entrega una resistencia superior a las enfermedades fúngicas (Longemann et al. , 1992) . Bio/Technology 10:3305.
(S) I nterferencia de ARN , en la que una molecula de ARN se usa para inhibir la expresión del gen objetivo. Una molécula de ARN en un ejemplo es parcial o totalmente trenzada, lo qué activa una respuesta silenciosa, resultando en una grieta de dsARN en pequeños ARN interferentes, que son incorporados en un complejo de objetivos que destruye los ARN homólogos. Consulte, por ejemplo, Fire et al. , Patente Estadounidense No. 6,506,559; Graham et al. 6,573,099.
Genes que confieren resistencia a un herbicida (A) Genes que codifican resistencia o tolerancia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristema, como una imidazalinona, sulfonanilida o herbicida sulfonilurea . Genes ilustrativos en este código de categoría para una enzima ALS muíante (Lee et al. , 1988 EMBOJ . 7: 1241 ), que también se conoce como enzima AHAS (Miki et al . , 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449) .
(B) U no o más genes adicionales que codifiquen resistencia o tolerancia al glifosato impartido por la sintasa EPSP mutante y genes aroA, o mediante la desactivación metabólica por parte de genes como GAT (acetiltransferasa de glifosato) o GOX (oxidasa de glifosato) y otros compuestos fosfono como glufosinato (genes pat y bar DSM-2), y ácidos ariloxifenoxipropiónicos y ciclohexandionas (genes codificadores del inhibidor ACCase) . Consulte, por ejemplo, Patente Estadounidense No. 4,940,835, que describe la secuencia nucleótida de una forma de EPSP que puede conferir resistencia al glifosato. Una molecula de ADN que codifica un gen aroA mutante puede obtenerse bajo el número de acceso 39256 de ATCC , y la secuencia nucleótida del gen mutante se describe en Patente Estadounidense No. 4,769,061 . La aplicación de Patente Europea No. 0 333 033 y la Patente Estadounidense No. 4,975,374, muestran secuencias de nucleótidos de genes de sintetasa de glutamina que confieren resistencia a herbicidas como L-fosfinotricina. La secuencia nucleótida del gen de fosfinotricinacetil-transferasa está publicada en la Solicitud Europea No. 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 describe la producción de plantas transgénicas que expresa la codificación de los genes quiméricos bar para la actividad de fosfinotricina acetil transferasa. Los genes ilustrativos que confieren resistencia a los ácidos ariloxifenoxipropiónicos y ciclohexandionas, como setoxidim y haloxifop, son los genes Accl-S1 , Accl-S2 y Accl-S3 descritos por Marshall et al . (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
(C) Genes que codifican resistencia o tolerancia a un herbicida que inhibe la fotosíntesis, como la triazina ( psbA y gs+ genes) y un benzonitrilo (gen nitrilasa) . Przibilla et al . ( 1991 ) Plant Cell 3: 169 describe el uso de plásmidos que codifican genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Las secuencias nucleótidas para genes de nitrilasa se describen en Patente Estadounidense No. 4,810,648, y las moleculas de ADN que contienen estos genes están disponibles bajo los números de acceso 53435, 67441 y 67442 de ATCC. La clonación y expresión de la codificación del ADN para una glutationa S-transferasa se describe en Hayes et al. (1992) Biochem. J . 285: 173.
(D) Los genes que codifican resistencia o tolerancia a un herbicida que unido a hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD por sus siglas en inglés) , enzimas que catalizan la reacción en la que el para-hidroxifenilpiruvato (HPP por sus siglas en inglés) se transforma en homogentisato. Esto incluye herbicidas como isoxazoles (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482 , EP682659, Patente Estadounidense No. 5,424,276) , en particular isoxaflutola, que es un herbicida selectivo para el maíz, dicetonitrilos (EP496630, EP496631 ) , en particular 2-ciano-3-ciclopropil-1 -(2-S02CH3-4-CF3 fenil)propano-1 ,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1 -(2-S02CH 3-4-2, 3CI2fe ni l)propano-1 ,3-diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Patente Estadounidense No. 5.506.195), en particular sulcotriona, y pirazolinatos. U n gen que produce una superabundancia de H PPD en plantas puede brindar tolerancia o resistencia a tales herbicidas, incluyendo, por ejemplo, a los genes descritos en Patentes Estadounidenses Nos. 6,268,549 y 6,245,968, y Aplicación de Patente, Publicación No. 20030066102.
(E) Genes que codifican resistencia o tolerancia a herbicidas fenoxi auxinas, como ácido 2 ,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y que también pueden transferir resistencia o tolerancia a herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP). Ejemplos de tales genes incluyen el gen de la enzima a-quetoglutarato-dependiente dioxigenasa ( aad-1 ), descritos en Patente Estadounidense No. 7,838,733.
(F) Genes que codifican resistencia o tolerancia a herbicidas fenoxi auxinas, como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y que también pueden conferir resistencia o tolerancia a herbicidas de piridiloxi auxina, como fluroxipir o triclopir. Ejemplos de tales genes incluyen el gen de la enzima dioxigenasa dependiente de a-quetoglutarato ( aad-12 ), descritos en WO 2007/053482 A2.
(G) Genes que codifican resistencia o tolerancia a dicamba ( consulte , por ejemplo, Publicación de Patente Estadounidense No. 20030135879).
(H) Genes que brindan resistencia o tolerancia a herbicidas que inhiben la protoporfirinogen oxidasa (PPO) (consulte Patente Estadounidense No. 5,767,373) . (1) Genes que brindan resistencia o tolerancia a herbicidas triazina (como atrazina) y herbicidas derivados de urea (como diuron) que se unen a las proteínas núcleo de los centros de 5 reacción del fotosistema I I (PS I I) (Consulte Brussian et al. , ( 1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245.
Genes que confieren o contribuyen a un rasgo con valor agregado (A) Metabolismo de ácidos grasos modificado, por ejemplo, ío transformando el maíz o Brassica con un gen antisentido o desaturasa estearoil-ACP para incrementar el contenido de ácido esteárico de la planta (Knultzon et al. , 1992) Proc. Nat. Acad . Sci . USA 89:2624.
(B) Contenido de fitato disminuido 15 (1 ) I ntroducción de un gen codificador de fitasa, como el gen de fitasa Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87) , mejora la disociación de fitato, agregando más fosfato libre a la planta transformada . (2) Se puede introducir un gen que reduzca el contenido de 0 fitato. En maíz, esto, por ejemplo, puede lograrse clonando y despues reintroduciendo ADN asociado con el alelo simple que es responsable de los mutantes de maíz caracterizados por bajos niveles de ácido fítico (Raboy et al. , 1990 Maydica 35:383).
(C) Composición de carbohidrato modificada efectuada, por 5 ejemplo, transformando plantas con una codificación de gen para una enzima que altere el patrón de ramificación del almidón . Ejemplos de tales enzimas incluyen, gen de fructosiltransferasa Streptococcus mucus (Shiroza et al. , 1988) J . Bacteriol. 1 70:810, gen de levansucrasa Bacillus subtilis (Steinmetz et al. , 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), Bacillus licheniformis a-amilasa (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), genes de tomate invertasa (Elliot et al. , 1993) , gen amilasa de cebada (Sogaard et al. , 1993 J . Biol. Chem. 268:22480), y enzima de ramificación del almidón de endosperma I I (Fisher et al. , 1993 Plant Physiol. 102: 10450) .
Se pueden usar varios ensayos en conexión con la molecula de ácido nucleico de ciertas modalidades de la descripción. Las siguientes téenicas son útiles en una variedad de situaciones, y en una modalidad, son útiles para detectar la presencia de la molécula de ácido nucleico y/o del polipéptido codificado en una célula de planta . Por ejemplo, la presencia de la molécula puede determinarse en una variedad de formas, incluyendo el uso de una sonda o cebador de la secuencia, el ensayo ELI SA para detectar la proteína codificada, una transferencia Western para detectar la proteína o un Northern o transferencia Southern para detectar ARN o ADN . Se pueden usar ensayos enzimáticos para detectar enzima DGT-28. También, se puede generar un anticuerpo que pueda detectar la presencia de la proteína DGT-28 usando procedimientos reconocidos por la técnica. Técnicas adicionales, como la hibridización in situ, manchado de enzima e inmunomanchado, también puede usarse para detectar la presencia u expresión de la construcción recombinante en órganos y tejidos específicos de la planta. U n transgen puede expresarse selectivamente en algunos tejidos de la planta o en algunas etapas de desarrollo, o el transgén puede expresarse en sustancialmente todos los tejidos de la planta, sustancialmente a lo largo de su vida. Sin embargo, también se aplica cualquier modo de expresión combinatoria.
El análisis Southern es un método de detección usado comúnmente, en el cual en ADN se corta con restricción endonucleasa y fraccionado en un gel agarosa para separar el ADN mediante peso molecular y después transferirlo a membranas de nylon . Después se hibridiza con el fragmento de sonda que se etiquetó radioactivamente con 32P (u otras etiquetas de sonda) y lavado en una solución SDS .
Similarmente el análisis Northern usa un protocolo similar, en donde el ARN se corta con restricción endonucleasa y fracciona en un gel agarosa para separar el ARN mediante peso molecular y después transferirlo a membranas de nylon. Después se hibridiza con el fragmento de sonda que se etiquetó radioactivamente con 32P (u otras etiquetas de sonda) y lavado en una solución SDS. El análisis de ARN ( por ejemplo, mARN) aislado de los tejidos de interés puede indicar niveles de expresión relativos. Por lo general si el mARN está presente o la cantidad de mARN aumentó, puede asumirse que el transgén correspondiente está siendo expresado. El análisis Northern , u otros protocolos analíticos de mARN puede usarse para determinar los niveles de expresión de un transgen introducido o gen nativo.
En el análisis Western, en lugar de aislar el ADN/ARN , la proteína de interés se extrae y ubica en un gel acrilamida. La proteína se transfiere a una membrana y contactada con una sustancia clasificada. Consulte por ejemplo, Hood et al. , “Commercial Production of Avidin from Transgénic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purificaron” Molecular Breeding 3:291 -306 (1997) ; Towbin et al, (1979) “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications” Proc Nati Acad Sci USA 76(9): 4350-4354; Renart et al. “Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure” Proc Nati Acad Sci USA 76(7): 31 16-3120.
Los ácidos nucleicos aqu í, o segmentos de los mismos, pueden usarse para diseñar cebadores para amplificación PCR. Al realizar la amplificación PCR, puede tolerarse un cierto grado de desajuste entre el cebador y la plantilla. Las mutaciones, inserciones y eliminaciones pueden producirse en un cebador dado mediante métodos conocidos por un artesano habilidoso.
Otro ejemplo de método de detección es la téenica de pirosecuenciado como la describe Winge (Innov. Pharma. Tech . 00: 18-24, 2000) . En este método, se diseña un oligonucleótido que solapa al ADN genómico adyacente e inserta una unión de ADN . El oligonucleótido se hibridiza a un producto PCR de una sola cepa desde la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica de flanco) e incubado en presencia de una polimerasa de ADN , ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se agregan DNTP individualmente y la incorporación resulta en una señal leve que se mide. Una señal leve indica la presencia de una secuencia de flanco/inserto de transgén debido a una amplificación exitosa, hibridización y extensión de base múltiple.
Se describieron las balizas moleculares para uso en detección de secuencia. Escuetamente, una sonda oligonucleótido FRET está diseñada para que solape al genoma de flanco e inserte la unión de ADN . La única estructura de la sonda FRET resulta en la contención de una estructura secundaria que mantiene las fracciones de enfriamiento y fluorescencia en la cercan ía. La sonda FRET y los cebadores PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserto y uno en la secuencia genómica de flanco) se cielan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Tras una exitosa amplificación PCR, la hibridización de la sonda FRET a la secuencia objetivo resulta en la eliminación de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de las fracciones de enfriamiento y fluorescencia. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia de inserto de transgén/genómica debido a la amplificación e hibridización exitosa .
El ensayo de sonda de hidrólisis, también conocido como TAQ MAN® (Life Technologies, Foster City, C a I if . ) , es un método para detectar y cuantificar la presencia de una secuencia de ADN . Brevemente, una sonda de oligonucleótido FRET está diseñada con un oligo dentro del transgén y uno en la secuencia genómica de flanco para detección de evento específico. La sonda FRET y los cebadores PCR (un cebador en la secuencia de ADN de inserto y uno en la secuencia genómica de flanco) se cielan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridización de la sonda FRET resulta en una grieta y liberación de la fracción fluorescente de la fracción de enfriamiento de la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia insertada de transgén/de flanco debido a la amplificación e hibridización exitosa.
ELISA o inmunoensayo vinculado a la enzima se conoces desde el año 1971 . En general , los antígenos solubilizados en una solución amortiguadora son revestidos en una superficie plástica. Cuando se agrega suero, los anticuerpos pueden unirse al antígeno en la fase sólida. La presencia o ausencia de estos anticuerpos puede demostrarse cuando se conjuga a una enzima. Agregar el sustrato adecuado detectará la cantidad de conjugado unido que puede cuantificarse. Un ensayo ELISA común es aquel que usa anticuerpos policlonales anti (proteína) biotinilada. Por ejemplo, ELI SA usado para determinación cuantitativa de niveles de lacasa puede ser un ensayo sándwich de anticuerpo que usa anticuerpos de conejo policlonales obtenidos comercíalmente. El anticuerpo se conjuga a fosfatasas alcalinas para su detección . En otro ejemplo, un ensayo ELI SA para detectar tripsina o tripsinógeno usa anticuerpos policlonales antitripsinógeno o antitripsina y conjugado de fosfatasa alcalina estreptavidina .
Ciertas modalidades se refieren al proceso de hacer cruces usando una planta de una modalidad de esta descripción como al menos un padre. Por ejemplo, las modalidades particulares se refieren a una planta híbrida F T que tenga uno o ambos padres como los aquí especificados. Otras modalidades se refieren con la semilla producida por tales híbridos F T Otra modalidad se refiere al metodo de producir una semilla híbrida F! cruzando una planta ejemplificada con una planta diferente (por ejemplo, origen endocrino) y cosechar la semilla híbrida resultante. Otras modalidades se refieren a una planta ejemplificada que es padre hembra o macho. Las características de las plantas resultantes pueden mejorarse mediante una consideración cuidadosa de las plantas padres.
V. Tolerancia al glifosato mediada por DGT-28 Los polipéptidos que tengan al menos un 90% de secuencia de identidad de SEC I D No. : 1 pueden tener actividad enzimática EPSPS. Por lo tanto, los polipéptidos que tienen al menos un 90% de identidad de SEC I D N o . : 1 , ácidos nucleicos que codifican a un polipéptido que tengan al menos un 90% de identidad de SEC I D No. : 1 (por ejemplo, SEC I D Nos. : 2-4), y ácidos nucleicos que se hibridan en un ácido nucleico que tenga SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3 bajo condiciones de alta rigurosidad pueden usarse en algunas modalidades para entregar tolerancia al glifosato a una célula u organismo ( por ejemplo, una célula de una planta o una planta). Siempre que una planta o una célula de una planta sean resistentes a fórmulas herbicidas de glifosato puede ser útil en una variedad de aplicaciones, donde esas células de planta que tengan tal resistencia puedan tolerar la exposición a una cantidad suficiente de glifosato que se usa para controlar al menos algunas malezas en un área bajo cultivo.
El glifosato, una composición que contiene N- (fosfonometil) glicina, es un componente muy usado en herbicidas. El glifosato se formula como una sal en concentrado líquido acuoso, un concentrado sólido, una emulsión o una microemulsión . El glifosato puede aplicarse sobre las plantas desde su nacimiento y a lo largo de las diferentes etapas del desarrollo de la planta.
Las variedades de plantas tolerantes al glifosato usadas en combinación con las formulaciones herbicidas de glifosato se convirtieron en el programa estándar para el manejo de malezas en la producción de cultivos en Estados Unidos de América y en todo el mundo. La principal ventaja para los productores al usar plantas resistentes al glifosato es que permite aplicación simple y conveniente del glifosato, un espectro amplio, herbicida post aparición , para controlar plantas y pastos no deseados ( por ejemplo, “malezas”) con excelente seguridad del cultivo y menor dependencia de aplicaciones herbicidas previas a la planta. Otros beneficios incluyen una mejor adecuación a sistemas de labranza red ucidos. Los cultivos resistentes al glifosato expandieron las opciones para el manejo de malezas y facilitó mucho el control de malezas, ya que es más barato y más flexible. Los productores informaron que realizan menos recorridas por el campo para aplicar herbicidas y menos viajes de cultivo, que ahorra combustible y reduce la erosión del suelo. Los cultivos resistentes al glifosato, por lo tanto, reducen los riesgos ambientales planteados por los herbicidas, mientras que incrementa la eficacia del control químico de malezas necesario.
Por consiguiente, algunas modalidades aquí funcionan para controlar malezas selectivamente en un área bajo cultivo que contenga una planta con un polipeptido que tenga al menos un 90% de identidad de SEC I D No. : 1 , un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga al menos un 90% de identidad de SEC ID No. : 1 , y/o un ácido nucleico que se híbrida a un ácido nucleico que tenga SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3 bajo condiciones de alta rigurosidad, en donde la planta incrementó su resistencia al glifosato cuando se la compara con una planta de la misma especia que no tenga ácido nucleico y/o polipéptido. En algunos ejemplos, un método provisto aquí comprende la aplicación de suficiente cantidad de glifosato herbicida al follaje del cultivo y malezas para controlar el crecimiento de la maleza.
Las modalidades particulares aquí, proporciona un metodo para matar o controlar malezas o vegetación no deseada en un área de cultivo que contenga un cultivo (por ejemplo, una planta que contenga un polipéptido que tenga al menos un 90% de identidad de SEC I D No. : 1 , un ácido nucleico que codifique un polipéptido que tenga al menos un 90% de identidad de SEC I D No. : 1 , y/o un ácido nucleico que se híbrida a un ácido nucleico que tenga SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3 bajo condiciones de alta rigurosidad). En algunos ejemplos, el método comprende la aplicación de glifosato al cultivo y/o al área de cultivo, por ejemplo, aplicar una cantidad de glifosato al follaje de la planta cultivada y simultáneamente a las malezas que crecen cerca de ella, donde la cantidad es suficiente para que controle las malezas o la vegetación no deseada, mientras deja la planta cultivada sustancialmente ilesa.
U na composición de glifosato puede aplicarse a plantas a un índice de aplicación suficiente para entregar resultados biológicos deseados, por ejemplo, control de crecimiento de malezas sin afectar significativamente a las plantas cultivadas resistentes al glifosato. Estas tasas de aplicación se expresan por lo general como cantidad de glifosato por unidad de área tratada, por ejemplo, gramos por hectárea (g/ha). Lo que constituye un “efecto significativo” varía según las normas y prácticas de quienes investigan, desarrollan, comercializan y usan l io composiciones y la selección de índices de aplicación que son significativamente efectivas para una composición está dentro de la habilidad de aquellos que son capaces en la teenica.
En ciertos ejemplos, la cantidad de composición de glifosato aplicada por unidad de área para dar un 85% de control de una especie de maleza como la medida por la reducción del crecimiento o mortalidad se usa para definir un índice de aplicación. La selección de un número de índices de aplicación de herbicida glifosato suficiente para controlar malezas en un área de cultivo está dentro de la habilidad de un científico agricultor ordinario. Aquellos expertos en la técnica reconocerán del mismo modo que las condiciones de planta individuales, el clima y las condiciones de crecimiento, junto con los ingredientes activos específicos y su índice de peso en la composición, puede influenciar el grado de efectividad del herbicida en una aplicación particular.
En algu nas modalidades, una composición de glifosato acuoso puede aplicarse a los tejidos foliares de plantas para matar o controlar el crecimiento de una amplia variedad de plantas no deseadas, incluyendo pasto anual o perenne y especies de malezas de hoja ancha, aplicando composiciones de glifosato acuoso a los tejidos foliares de plantas. La cantidad relativa de glifosato presente en una composición herbicida contemplada ( por ejemplo, un concentrado sólido particulado, concentrado líquido, composición lista para usar y composición de mezcla en tanque) puede variar dependiendo de muchos factores, incluyendo, por ejemplo, la especie de maleza a controlar y el metodo de aplicación . Generalmente hablando, sin embargo, la concentración de glifosato y opcionalmente un surfactante y/o algún otro adyuvante o aditivo (como se describió en otro lado aquí) usado en la composición herbicida es suficiente para controlar malezas dentro de un área de cultivo.
Una composición herbicida de pulverizador puede aplicarse como una solución acuosa o dispersión , mientras la composición se fabrica lista para aplicación o los resultados de la posterior disolución de un concentrado de glifosato líquido o la adición de agua a un concentrado de glifosato sólido particulado. Sin embargo, el término “acuoso” como se usa aquí, incluye composiciones que comprenden una pequeña cantidad de solvente no acuoso, siempre que el solvente predominante sea agua . Una composición de pulverizador herbicida puede aplicarse al follaje de plantas a tratar mediante cualquiera de los métodos adecuados que son bien conocidos por aquellos que tienen habilidad en la téenica, incluyendo técnicas de aplicación aérea y terrestres (por ejemplo, barra pulverizadora terrestre, un pulverizador manual, y un aplicador de mecha) .
En algunos ejemplos, una composición de concentrado líquido se formula para incluir al glifosato en una concentración de al menos aproximadamente de 50 gramos, al menos aproximadamente de 75 gramos, o al menos aproximadamente de 100, 125, 150 , 175, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 o 700 gramos (equivalente ácido o a.e.) por litro o más. El Intervalo de concentración de glifosato puede ser, por ejemplo, desde aproximadamente de 50 a cerca de 680 gramos (a.e.) por litro (gpl) desde aproximadamente de 100 a cerca de 600 gpl, desde aproximadamente de 250 a cerca de 600 gpl y desde aproximadamente de 360 a cerca de 540 gpl.
Cuando se expresa como un porcentaje en peso basado en el peso total del concentrado del glifosato, un concentrado líquido puede tener, por ejemplo, al menos cerca de 10% en peso de glifosato (a.e.), al menos aproximadamente de 15% en peso, y al menos un 20, 21 , 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29, 30, 31 , 32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52 , 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62 , 63, 64, 65, 66, 67, o 68% en peso o más. El Intervalo de concentración de glifosato puede ser, por ejemplo desde cerca del 10% en peso hasta aproximadamente de 70% en peso a.e. desde cerca del 20% en peso hasta aproximadamente de 68% en peso o desde cerca de 25% en peso hasta aproximadamente de 45% en peso.
Si se aplica el glifosato como una composición lista para usarse, la concentración del glifosato puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 % en peso hasta cerca del 3% en peso a.e. y desde cerca del 1 % en peso hasta el 2% en peso.
Las composiciones de los pulverizadores puede formularse para aplicación de por ejemplo, al menos cerca de 1 galón de composición de pulverizador por acre, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 galones por aere y más. El volumen de pulverización de la composición de pulverizador puede variar, por ejemplo de aproximadamente de 1 galón hasta cerca de 100 galones, de aproximadamente de 2 galones hasta cerca de 40 galones por acre y desde aproximadamente de 2 galones hasta aproximadamente de 5 galones por acre para aplicación de aerea, y desde 5 galones hasta cerca de 20 galones por acre para aplicación terrestre.
En algunos ejemplos, una formulación de concentrado líquido que tenga una fase acuosa donde el glifosato esté presente predominantemente en la forma de una sal y una fase no acuosa que contenga opcionalmente un segundo ingrediente herbicida activo que sea relativamente insoluble en agua puede usarse. Tales formulaciones pueden incluir por ejemplo, emulsiones (incluyendo macroemulsiones y microemulsiones, agua en aceite, aceite en agua y tipos en agua) suspensiones y suspoemulsiones. La fase no acuosa puede comprender en ciertas instancias un componente microencapsulado ( por ejemplo, un herbicida microencapsulado) . En formulaciones que tengan fase no acuosa, la concentración de glifosato a.e. en la composición como un todo puede sin embargo estar dentro de los Intervalo s ejemplares particulares recitados aquí para formulaciones de concentrado acuosa.
Las formas de sal adecuadas de glifosato que pueden usarse según cualquiera de las formulaciones incluyen , por ejemplo, sales metálicas alcalinas, por ejemplo, sales de sodio y potasio, sales de amonio, sales de di-amonio como dimetilamonio, sales alcalinas, por ejemplo, dimetilamina y sales de isopropilamina, sales alcanolamina, por ejemplo, sales de etanolamina, sales de alquilsulfonio, por ejemplo, sales de trimetilsulfonio, sales de sulfoxonio y mezclas o combinaciones del tipo. Algunos ejemplos de formulaciones comerciales de glifosato incluyen sin restricción : GLYPHOMAX™, GLYPHOMAX™ XRT, GLYPHOMAX™ PLUS, DU I NTERVALO ™, ROU N DU P™ ULTRA, ROU N DUP™ U LTRAMAK, ROU N DU P™ CT, ROUN DU P™ EXTRA, ROU N DUP™ BIOACTIVE, ROU NDUP™ BIOFORCE, RODEO™, POLARIS™ , SPARK™ , ACCORD™ SP, ACCORD™ XRT, y ACCORD™ CONCENTRATE, todos los cuales contienen glifosato en su sal de isopropilamonio (I PA); ROUNDUP™ DRY y RIVAL™, que contienen glifosato como su sal de amonio; ROU NDUP™ GEOFORCE, una formulación de glifosato de sodio; TOUCH DOWN™, una formulación de sal de glifosato trimesio, TOUCH DOWN™ IQ , una formulación de sal de glifosato de diamonio, TOUCHDOWN™ TOTAL IQ , una formulación de glifosato potásico, y RUNDU P™ WEATH ERMAX, una formulación de glifosato potásico. Las formulaciones de glifosato pueden incluir agentes de seguridad , surfactantes y/o adyuvantes.
Si se desea, el usuario puede mezclar uno o más adyuvantes con una composición de glifosato y el agua de la disolución cuando prepara una formulación para aplicar. Tales adyuvantes pueden incluir surfactante adicional y/o una sal inorgánica ( por ejemplo, sulfato de amonio) con el objetivo de mejorar más la eficacia del herbicida.
Si lo desea, el usuario puede tambien usar agentes de seguridad adecuados en la formulación de glifosato para proteger más a las plantas y/o agregar resistencia cruzada a más herbicidas. Los agentes de seguridad que reducen la fitotoxicidad de herbicidas para las plantas cultivadas mediante un mecanismo molecular o fisiológico, sin comprometer la eficacia del control de malezas. Los agentes aseguradores suelen actuar para incrementar el sistema inmunológ ico de la planta activando/expresando cP450. Los agentes aseguradores ejemplares incluyen sin limitarse a: benoxacor, cloqumtocet, ciometrinil, diclormida, diciclonona, dietolato, fenclorazole, fenclorim, flu razol, fluxofenim, furilazol, isoxadifen , mefenpir, mefenato, anh ídrido naftálico y oxabetrinil.
Los agentes aseguradores pueden usarse para proteger cultivos de pasto de muchas semillas, por ejemplo y sin limitarse a, maíz, sorgo de grano y arroz húmedo sembrado, contra herbicidas aplicados antes de la aparición e incorporados antes de la planta de las familias de tiocarbonato y cloroacetanilida.
Los agentes aseguradores tambien se desarrollaron para proteger los cultivos de cereal invernales como el trigo, contra aplicaciones de post-emergencia de herbicidas sulfonilurea y ariloxifenoxipropionato. El uso de agentes aseguradores para la protección del maíz y el arroz contra herbicidas de sulfonilurea, imidazolinona, ciclohexandiona, isoxazolo y tricetona también está bien establecido.
Los activadores de planta (una nueva clase de componentes que protegen a las plantas activando sus mecanismos de defensa) también pueden usarse en las modalidades aqu í descritas. Los activadores de plantas ejemplares incluyen acibenzolar y probenazola.
Las modalidades de la invención presente se definen más en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos se dan solamente como ilustración . Desde la discusión anterior y de estos ejemplos, una persona hábil en la téenica puede determinar las características esenciales de esta invención y sin apartarse del espíritu y el alcance, puede realizar diferentes cambios y modificaciones de las modalidades de la invención para adaptarla a los múltiples usos y condiciones. Así , las diferentes modificaciones de las modalidades de la invención, además de las mostradas y descritas aqu í, serán aparentes a aquellos hábiles en la técnica a partir de la siguiente descripción. Tales modificaciones también están intencionadas para que entren en el alcance de las declaraciones anexadas. Lo siguiente se incluye como ilustración y no limita el alcance de la invención .
Ejemplos Ejemplo 1 : Materiales y metodos Las modalidades de la presente publicación se describen 5 con mayor profundidad en los siguientes ejemplos, que se ofrecen como ilustración y no limitan la invención de cualquier manera.
Una mutación de aminoácido simple (G96A) en la enzima 5- enolpiruvil shikimato-3- fosfato sintasa (EPSPS) de Escherichia coli puede resultar en insensibilidad al glifosato (Padgette et al., ío (1991 ); Eschenburg et al. , (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al., (2008)). Mientras que esta mutación confiere resistencia al glifosato, también se la conoce por afectar negativamente a la unión de sintasa EPSP con su sustrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP) . El cambio resultante en la i5 eficiencia de unión de sustrato puede resultar en una enzima mutada no apta para dar resistencia in planta al glifosato.
La base de datos de NCBI Genbank se buscó in silico para proteína de sintasa EPSP y secuencias polinucleótidos que contienen naturalmente una alanina en una posición análoga 0 dentro de la enzima EPSP sintasa como la mutación G96A que se introdujo en la versión E. coli de la enzima (Padgette et al., (1991 ); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al. , (2008)).
U na enzima que se identificó como que contiene una alanina 5 natural en esta posición fue DGT-28 (G EN BANK ACC NO: ZP_06917240.1 ) de Streptomyces sviceus ATCC29083. Mayor búsqueda de información in silico describió otras tres enzimas Streptomyces únicas con mayor homología a DGT-28; DGT-31 (GENBAN K ACC NO: YP_004922608 .1 ) ; DGT-32 (GENBAN K ACC NO: ZP_04696613); y DGT-33 (GENBAN K ACC NO: NC_010572) . Cada una de estas enzimas contiene una alanina natural en una posición análoga dentro de la enzima de sintasa EPSP como la de la mutación G96A que se introdujo en la versión £. coli de la enzima. Figura 1 .
Debido a que las proteínas de sintasa EPSP de los distintos organismos son de largos diferentes, el número de la mutación para la versión E. coli de la enzima de sintasa EPSP no necesariamente corresponde con el número de la mutación para las enzimas de sintasa EPSP de los otros organismos. Estas enzimas de sintasa EPSP identificadas no se caracterizaron previamente en relación a resistencia al glifosato o afinidad al sustrato PEP. Incluso, estas enzimas de sintasa EPSP representan una nueva clase de enzimas de sintasa EPSP y no contienen motivos de secuencia que se hayan usado para caracterizar los descritos previamente Clase I (secuencias de planta derivadas descritas con mayor detalle en la Patente Estadounidense No. RE39247), I I (secuencias derivadas de bacterias descritas con mayor profundidad en la Patente Estadounidense No. RE39247) , y II I (secuencias derivadas de bacterias descritas con mayor profundidad en la Solicitud de Patente International WO 2006/1 10586) enzima de sintasa EPSP.
Las nuevas enzimas DGT-28, DGT-31 , DGT-32, y DGT-33 se caracterizaron como resistentes al glifosato y con afinidad al sustrato PEP en comparación con las enzimas de sintasa EPSP de Clase I . Las siguientes enzimas de Clase I ; DGT-1 de Glycine max, DGT-3 de Brassica napus (GEN BANK ACC NO: P17688) , y DGT-7 de Triticum aestivum (GENBANK ACC NO: EU977181 ) se usaron para comparación . Las enzimas de sintasa EPSP de Clase I y las variantes mutantes en adelante se sintetizaron y evaluaron . U na mutación introducida en las enzimas de sintasa EPSP de la planta consistió con la mutación de glicina a alanina realizada dentro de la enzima de sintasa EPSP en una ubicación similar a la de la mutación G96A de la versión E. cotí de la enzima. Además, se introdujeron mutaciones de Treonina a Isoleucina y Prolina a Serina dentro de estas enzimas de sintasa EPSP de Clase I en posiciones análogas a las del aminoácido 97 (T a I) y aminoácido 101 (P a S) en la sintasa EPSP de E. coli como se describe en Funke et al., (2009).
Figura 1 muestra una alineación parcial de secuencia de DGT-28, DGT-31 , DGT-32 , y DGT-33 a otras enzimas de sintasa EPSP. Las cuatro enzimas DGT comparten una alanina conservada en la posición 96 de aminoácido aroA de la enzima de sintasa EPSP. La ubicación de este aminoácido está indicada por un asterisco y el residuo del aminoácido está subrayado.
Figura 2 muestra la alineación de las enzimas DGT-1 , DGT- 3, y DGT-7. La ubicación del residuo de aminoácido que se mutó de glicina a alanina se indica con el primer asterisco. La ubicación del residuo de aminoácido que se mutó de treonina a isoleucina se indica con el segundo asterisco. La ubicación del tercer residuo de aminoácido que se mutó de prolina a serina se indica con el tercer asterisco. Estas mutaciones se introdujeron en diferentes modalidades de DGT-1 , DGT-3, y DGT-7. Las diferentes modalidades (v1 , v2, v3... vN) de los genes que contienen las mutaciones se describen con mayor detalle a continuación .
Ejemplo 2: Optimización de la Secuencia para la Expresión en Plantas y Bacteria Optimización de Plantas. El codón parcial para dicotiledóneas y monocotiledóneas (maíz) fue calculado como la frecuencia en la cual un único codón es usado relativamente a los codones para todos los aminoácidos. Tabla 1. Alternativamente, el codón parcial puede ser calculado como la frecuencia en la cual un solo codón es usado para codificar un aminoácido en particular, relativo a todos los otros codones para el aminoácido en cuestión (condones sinónimos) . En el diseño de las regiones de codificación para la expresión en plantas, el codón primario ("la primera elección") preferido por la planta fueron determinados, así como el segundo, tercero, cuarto, etcetera; y son elecciones de los codones preferidos cuando múltiples elecciones existen.
Análisis de la secuencia de codificación DGT-28 desde S. sviceus describió la presencia de varias secuencias de motivos que pueden ser perjudiciales a la óptima expresión de la planta, así como la composición de un codón no-óptimo para la expresión en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas.
Tabla 1 . La representación del codón sinónimo de las regiones codificadoras de los genes de plantas monocotiledóneas (maíz%) y d icotiledóneas (dicot %) , se encuentran en las columnas D, E, I y J . Los valores de un conjunto de representaciones del codón parcialmente equilibrado para un gene sintetico optimizado para planta se encuentran en las columnas C y H .
DNU = No usar Para diseñar los genes optimizados de plantas que codifican una proteína DGT-28, las secuencias de ADN fueron diseñadas para codificar las secuencias de aminoácidos, usando un código redundante genetico establecido desde la tabla parcial de codones compilada a partir de la proteína de las secuencias de codificación, para las plantas huéspedes particulares. En la Tabla 1 , las columnas D y I presentaron las distribuciones (en % de uso de todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentran en las regiones codificantes de plantas monocotiledóneas (maíz). Las columnas E y J presentaron las distribuciones (en % de uso de todos los codones para ese aminoácido) de codones sinónimos para cada aminoácido, como se encuentran en las regiones codificantes de plantas dicotiledóneas. Algunos codones sinónimos, para algunos aminoácidos, raramente se encuentran en los genes de plantas 5 (por ejemplo, CGG). Por lo general, un codón es considerado que se usa raramente, si está representado en aproximadamente de 10% o menos del tiempo para codificar el aminoácido correspondiente en los genes de cualqu ier tipo de planta (indicado por DNU en las columnas C y H de la Tabla 1 ) . Para ío equilibrar la distribución de las elecciones de codones restantes para un aminoácido, una representación promedio para cada codón se calculó usando la fórmula: Promedio Ponderado % de C1 = 1 /( % C 1 +%C2 +%C3 + etcetera) x % C 1 x 100, (1 ) 15 donde C 1 es el codón en cuestión , y % C2, % C3, etcétera, representan el promedio de los valores de % para dicots de los condones sinónimos restantes (valor % promedio para codones relevantes son tomados de las Columnas C y H) de Tabla 1 .
El % del valor medio ponderado para cada codón se da en 20 las columnas C y H de la Tabla 1 .
Usando el procedimiento anterior, una nueva secuencia de ADN que codifica esencialmente la secuencia de aminoácidos de la proteína DGT-28, fue diseñado para la expresión óptima en plantas dicotiledóneas, usando una distribución equilibrada de 25 codones usados con frecuencia encontrados en genes de plantas dicotiledóneas. Una segunda secuencia de ADN que codifica esencialmente la secuencia de aminoácidos de la proteína DGT-28 fue diseñado para la expresión óptima en plantas dicotiledóneas, usando una distribución equilibrada de codones usados con frecuencia encontrados en genes de plantas monocotiledóneas. Las dos nuevas secuencias de ADN difieren de las secuencias originales de ADN que codifican el dgt-28 por la sustitución de la planta (primera , segunda, tercera, o cuarta elección de preferencia) para especificar codones del aminoácido apropiados en cada posición dentro de la secuencia de aminoácidos de proteínas.
Diseño de las secuencias de ADN optimizados de plantas se iniciaron por la traducción-invertida de las secuencias de la proteína DGT-28 (Numero de Acceso Genbank: ZP_06917240.1 ). SEC ID No. : 1 fue traducido invertidamente usando una tabla parcial de codón dicotiledónea construida a partir de la Tabla 1 , columnas E y J . Una segunda traducción invertida de SEC I D No. : 1 se completó usando una tabla parcial de codones monocotiledóneas construida a partir de la Tabla 1 ; Columnas D e I.
Las secuencias iniciales de traducción invertida fueron modificados por medio de la compensación en los cambios del codón (manteniendo al mismo tiempo la representación global media ponderada), quitando o agregando sitios de reconocimiento de enzimas de restricción , y eliminando estructuras secundarias intracatenarias altamente estables y otras secuencias que podrían ser perjudiciales para manipulaciones de clonación o expresión del gen modificado en plantas. La secuencia de ADN se volvió a analizar para los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que podrían haberse creado por las modificaciones. Los sitios identificados fueron modificados mediante la sustitución de los codones relevantes con codones de primera elección , o de segunda, tercera , o cuarta preferencia. Otros sitios en las secuencias que podrían afectar a la transcripción o traducción del gen de interes, incluyen el exón : cruces de intrones (5' o 3'), poli A señales de adición, y los señales de terminación de ARN polimerasa. Las secuencias modificadas fueron analizadas y modificadas aún más para reducir la frecuencia de TA o dobletes CG, y para aumentar la frecuencia de dobletes TG o CT. Además de estos dobletes, los bloques de secuencia que tienen más de seis residuos consecutivos de [G + C] o [A + T] pueden afectar a la transcripción o traducción de la secuencia. Por lo tanto, estos bloques de secuencias también se modificaron mediante la sustitución de los codones de la primera o segunda elección , etcétera; con otros codones preferidos de elección. Codones raramente usados no se incluyeron en un grado sustancial en el diseño de genes, se usa sólo cuando sea necesario para dar cabida a un criterio de diseño diferente de composición de codones, per se (por ejemplo, adición o eliminación de sitios de reconocimiento de enzimas de restricción).
El recien diseñado, secuencia optimizada de poli nucleótidos dgt-28 v5 de planta dicotiledónea optimizada , está enumerada en la SEC I D No. :2. El recién diseñado, secuencia optimizada de poli nucleótidos dgt-28 v6 de planta monocotiledónea, está enumerada en la SEC I D No. :3; esta secuencia se modificó ligeramente mediante la inclusión de una alanina en la segunda posición del amino ácido para introducir un sitio de enzima de restricción. Las secuencias de ADN resultantes tienen un mayor grado de diversidad de codones, una composición de bases deseable, contiene sitios de reconocimiento de enzimas de restricción estratégicamente ubicados, y carece de secuencias que pueden interferir con la transcripción del gen, o con la traducción del producto ARNm .
Síntesis de fragmentos de ADN que comprenden SEC I D No.: 2 y SEC I D No. : 3 contienen secuencias adicionales, como marcos-de-6-paradas (codones de parada situados en los seis marcos de lectura que se agregan al extremo 3' de la secuencia codificante), y un sitio 5' de restricción para la clonación fueron realizados por proveedores comerciales (ADN2.0, Menlo Park, CA). La molécula de ácido nucleico sintética se clonó después en vectores de expresión y transformada en plantas o bacterias como se describe en los Ejemplos a continuación .
Estrateg ias similares de optimización de los codones fueron usadas para diseñar dgt- 1, dgt-3 v2 (G 1 73A), dgt-3 v3 (G 173A; P 178S) , dgt-3 v4 (T174I ; P178S), dgt-7 v4 (T168I ; P172S) , dgt-32 v3, dgt-33 v3, y dgt-33 v3. La versión del codón optimizado de estos genes son listados como SEC I D No. : 5, SEC ID No. : 6, SEC ID No. : 7, SEC I D No. : 8, SEC I D No. : 9, SEC I D No. : 10, SEC I D No. : 1 1 , and SEC I D No. : 144, respectivamente.
Optimización Bacteriana Una nueva secuencia de ADN que codifica la proteína DGT-28 de SEC I D No. : 1 que esta optimizada para la expresión en celulas in Escherichia coli fue diseñada. Diseño de la secuencia optimizada del ADN del E. cob-de fue iniciada por traducción inversa de la secuencia de la proteína de SEC I D No. : 1 , usando una propiedad de un protocolo de optimización del codón de GeneArt (Regensburg, Alemania). La secuencia inicial fue optimizada por medio de la compensación en los cambios del codón (manteniendo al mismo tiempo la representación global media ponderada), quitando o agregando sitios de reconocimiento de enzimas de restricción , y eliminando estructuras secundarias intracatenarias altamente estables y otras secuencias que podrían ser perjudiciales para manipulaciones de clonación o expresión del gen modificado. Un ejemplo de tal secuencia perjudicial para evitar dentro de una región de codificación es una secuencia de unión a ARN ribosómico 16S (secuencia "Shine-Dalgarno") , como AGGAGG, lo que podría codificar, por ejemplo, dos aminoácidos consecutivos de arginina, pero que también podría servir como un señal intragénica (y por lo tanto indeseable) de iniciación de traducción. La secuencia de ADN E. coli- parcial dgt- 28 {dgt- 28 vD que codifica la proteína de SEC ID No.: 1 se da como SEC ID No.: 4.
Para facilitar la clonación y para asegurar la iniciación de la traducción eficiente, una secuencia de reconocimiento al terminal 5’ de la enzima de restricción Ndel se coloca al inicio de la traducción ATG codón. Tambien para facilitar la clonación, y para asegurar la adecuada traducción en la terminación, las bases que codifican a dos traducciones TAA paran a los codones y un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción Xhol se incluyeron en el extremo 3' de la región codificante. Síntesis de un fragmento de ADN que contiene SEC ID No.: 4 fue efectuado por el proveedor comercial, GeneArt™.
Estrategias similares a la optimización del codón E. coli fueron usados para diseñar dgt-1 v5, dgt-1 v6 (G112A), dgt-1 v7 (G112A; P117S), dgt-1 v8 (T113I; P117S), dgt-3 v6 (G105A), dgt-3 v7 (G105A; P112S), dgt-3 v8 (T106I; P112S), dgt-7 v5, dgt-7 v6 (G113A), dgt-7 v7 (G113A; P117S), dgt-7 v8 (T114I; P117S), dgt-32 v5, y dgt-33 v5. Las secuencias de las modalidades dgt-1, dgt-3, y dgt-7 fueron modificadas por la extracción de la secuencia de dirección al cloroplasto. La versión del codón-E. coli optimizado de estos genes son listados como SEC ID No.: 12, SEC ID No.: 13, SEC ID No.: 14, SEC ID No.: 15, SEC ID No.: 16, SEC ID No.: 17, SEC ID No.: 18, SEC ID No.: 19, SEC ID No.: 20, SEC ID No.: 21, SEC ID No.: 22, SEC ID No.: 23, y SEC ID No.: 24, respectivamente.
Ejemplo 3: Vectores para la Expresión Bacteriana de Genes de Tolerancia a Glifosato Construcción del Vector de la Expresión pET, dat-28 para la Expresión E. coli Para pruebas in vitro , la secuencia del gene optimizado dgt-28 v1 E. coli (SEC ID No. : 4) fue sintetizado y clonado por GeneArt™. La secuencia de genes sintetizada dgt-28 v1 fue clonada al vector de la expresión pET28 vía la adición de sitios de restricciones de Nde I y Xho I. La construcción resultante presentó una N-terminal 6X H is y se marcó como pDAB100445. Figura 14.
Mutaqenesis dirigida al sitio de la dat-28 v1. Mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo en dgt-28 v1 para evaluar el papel de la alanina en la posición 84 en la prestación de tolerancia al glifosato. Esta alanina natural fue mutada a glicina para determinar si el cambio reduciría la tolerancia de la enzima a glifosato o afinidad por el PEP. Este residuo de aminoácido fue seleccionado, ya que corresponde con la mutación G96A que se introdujo en la síntesis EPSP de £. coli como se ha descrito previamente.
El kit Quick Change I I™ de Stratagene™ (Santa Clara, CA) fue usado para efectuar la mutagénesis. Las reacciones PCR fueron establecidas de acuerdo al protocolo QuickChange™ usando pDAB100445 ( dgt-28 vD como ADN modelo. La construcción que contiene la secuencia del gen mutado dgt-28 v2 fue designada pDAB102946 (Figura 15) y confirmada vía secuenciación de ADN . Los siguientes cebadores se diseñaron para hacer el cambio de aminoácidos: DGT28 MutF (SEC I D No. : 25; 5’ gATgTTTATTgCCgTgATggT ggAACCACCgCACgTTTTC) DGT28 MutR (SEC I D No. : 26; 5’ gAAAACgTgCggTggTTCCACCAT CACggCAATAAACATC) U na segunda ronda de mutagenesis se llevó a cabo en dgt-28 v2 en un intento de reducir aún más su tolerancia al glifosato. Una segunda mutación T1 72A, fue presentado a la ya mutagenizada dgt-28 v2. La alanina recíproca a la mutación de treonina de la EPSP sintetiza en esta posición , se ha descrito anteriormente en Haghani et al., (2008) , que dio lugar a la insensibilidad a glifosato. El resultado final fue la producción de un A84G doble, T1 72A muíante que fue designado como dgt-28 v3. Las reacciones PCR fueron establecidas de acuerdo al protocolo QuickChange™ usando pDAB100445 ( dgt-28 v2) como ADN modelo. La construcción que contiene la secuencia del gen mutado dgt-28 v3 fue designado pDAB 100469 (Figura 16). Los siguientes cebadores fueron usados para producir la mutación T172A: DGT28 M ut2F (SEC ID No. : 27; 5’ gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg) DGT28 Mut2R (SEC I D No. : 28; 5’ CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAgCAgC) Construcciones Adicionales. Vector de Expresión PET para la Expresión de E. Coli. Para pruebas in vitro, las secuencias de genes dgt-1 v5, dgt- 1 v6, dgt- 1 v7, dgt-1 v8, dgt-3 v6, dgt-3 v7, dgt-3 v8, dgt-7 v5, dgt-7 v6, dgt-7 v7, dgt-7 v8, dgt-32 v5, and dgt-33 v5 fueron sintetizadas y clonadas (GeneArt™). Los genes sintetizados fueron clonados en el vector de expresión pET28. Las construcciones resultantes fueron etiquetadas como PDAB102028 (Figura 17) que contiene dgt- 1 v5, pDAB102029 (Figura 18) que contiene dgt- 1 v6, pDAB102032 (Figura 19) que contiene dgt- 1 v7, pDAB102034 (Figura 20) que contiene dgt- 1 \/8, pDAB 100429 (Figura 21 ) que contiene dgt-3 v6 , pDAB100442 (Figura 22) q ue contiene dgt-3 v7, pDAB 100430 (Figura 23) que contiene dgt-3 v8, pDAB102036 (Figura 24) que contiene dgt-7 v5, pDAB 102038 (Figura 25) que contiene dgt-7 v6, pDAB102040 (Figura 26) que contiene dgt-7 v7, y pDAB102042 (Figura 27) que contiene dgt-7 v8.
Clonación de DG-32, y DGT-33. Para pruebas in vitro, los siguientes genes de optimización a plantas; dgt-32 v3, y dgt-33 v3 fueron amplificados fuera de los vectores binarios pDAB107532 (Figura 11 ) y pDAB107534 (Figura 12), respectivamente. Los siguientes grupos cebadores fueron usados: pMALDGT32F (SEC ID No. : 29; catatgaccgttattgaaattccggg) y pMALDGT32R (SEC I D No. : 30; gatatcctattattaacgaccttccag) para dgt-32 , y pMALDGT33F (SEC ID No. : 31 ; catatgggtgcagttaccgttattga), pMALDGT33R (SEC I D No. : 32; gatatcctattattatgcctgcggac) para dgt-33.
Entonces, secuencias amplificadas fueron subclonadas al pMAL-c5X para que cada gene fuese una fusión dentro del marco con la secuencia codificada malE. Las expresiones finales construidas fueron pDAB107713 (Figura 29) que contenían dgt-32 v3, y pDAB107714 (Figura 30) que conten ían dgt-33 v3.
Ejemplo 4: Ensayo Cinético In-Vitro Bioquímico Enzimático La Sobreexpresión Y Purificación De Enzimas Recombinantes DGT. Las proteínas recombinantes DGT fueron sobreexpuestas en células Rosetta2™ (DE3) (Novagen™, Madison, Wl) a partir de las construcciones descritas anteriormente. U na única colonia fue usada para inocular 50 mi culturas iniciales de LB, conteniendo cloranfenicol (25 mg/ml) y kanamicina (50 pg/ml), las cuales fueron cultivadas durante la noche a una temperatura de 37°C . Las culturas nocturnas fueron usadas para inocular 1 L de LB conteniendo cloranfenicol (25 pg/ml) y kanamicina (50 pg/ml). Las culturas fueron cultivadas a una temperatura de 37°C para un O . ?.boo = 0.6 y entonces ubicadas en agua helada por 10 minutos. La expresión de las proteínas objetivas fue lograda por medio de la adición de I PTG a una concentración final de 500 pM.
La inducción fue permitida para continuar durante la noche a una temperatura de 20°C , seguida por la cosecha vía centrifugación a 8,000 rpm durante 20 minutos. Los sedimentos celulares se almacenaron a -80°C hasta que sea necesario para la purificación. Todas las etapas de purificación fueron llevadas a cabo a una temperatura de 4°C. Los sedimentos celulares de culturas de 1 L fueron resuspendidas en el amortiguador A de 20-30 mi (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 20 mM imidazol, y 5% glicerol). El Cocktail inhibidor de la proteasa COMPLETE™ (1 tableta/50 mi , Roche, Indianapolis, I N) y lisozima ( 1 mg/ml, Sigma-Aldrich , St. Louis, MO) fueron adicionados y la suspensión fue mezclada por 20 minutos. La lisis celular se realizó con un Branson™ Sonifier™ 250 (3 x 60 segundos) seguida por la eliminación de los restos celulares por centrifugación a 16,000 rpm durante 45 minutos.
Enzimas DGT se purificaron hasta homogeneidad en una sola etapa a traves de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (I MAC) usando una columna cruda H isTrap 5 mi FF. La columna fue equilibrada en el amortiguador A y la muestra fue cargada en el mismo amortiguador. La columna entonces fue lavada con una columna de 10 volúmenes del amortiguador A, seguida por la evolución en un amortiguador B a 0-100% (50 mM H EPES pH 7.5, 200 mM KCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, 500 mM imidazol, y 5% glicerol) de gradiente linear sobre 25 volúmenes de columna. Las fracciones conteniendo las proteínas objetivas, así como juzgadas por el análisis SDS-PAGE, fueron concentradas a 2.5 mi usando un dispositivo Millipore de ultracentrifugación equipado con un 10 kDA de peso molecular de corte (MWCO) . Las enzimas DGT purificadas fueron intercambiadas en el amortiguador usando columnas PD-10 (GE Healthcare) a 50 mM H EPES pH 7.5, 150 mM KCI, 2 mM DTT, y 5% glicerol y subsecuentemente concentradas ~1 mi. Las amuestras fueron típicamente diluidas 1 :50 y el espectro UV-visible fue registrado a partir de 240-700 en un espectrofotómetro Cary50™ Bio UV-visible. Un coeficiente de extinción teórico se usó a continuación para calcular la concentración de proteínas basada en la absorbancia a 280 nm (ExPASy, Geneva, Suiza) .
Expresión v Purificación de Recombinantes DGT-32 v Fusiones DGT-33. Las enzimas DGT-32 y DGT-33 fueron construidas para contener la fusión de maltosa localizada en el termino del aminoácido de la enzima. Células Escherichia coli transformadas con pDAB 107712 (Figura 28), pDAB 107713, y pDAB107714 fueron aisladas y confirmadas. Una sola colonia de cada cepa bacteriana se usó para inocular 50 mi de LB conteniendo 100 mg/pL de carbenicilina y 25 pg/p L de cloranfenicol. El cultivo Iniciador se cultivó durante la noche a 37°C y posteriormente, se usó para inocular 600 mi de LB suplementado con 0.2% de glucosa, 100 pg/pL de carbenicilina, y 25 pg/p L de cloranfenicol. Las culturas fueron cultivadas a 37°C a un O D6OO = 0.4 y en ese momento, I PTG fue agregado a la concentración final de 50 pM I PTG . Las culturas fueron inducidas por 15 horas a 18°C . Al día siguiente las culturas fueron cosechadas por medio de la centrifugación a 8,000 rpm durante 20 minutos para sedimentar las células. La pasta celular se almaceno a -80°C hasta que sea necesaria la purificación .
Gránulos congelados se resuspendieron en 20-30 mi del amortiguador A (50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCI, 1 mM EDTA, 5% glicerol , y 1 mM DTT) y 1 tableta de inhibidor de la proteasa (Roche Complete). Una vez que el sedimento se resolubilizó completamente a 1 mg/ml de lisozima fue agregado y la muestra se mezcló a 4°C durante 15-20 minutos. Despues de la incubación con la lisozima de la muestra se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 mi y se colocó en hielo. La muestra fue entonces sometida a ultrasonidos por intervalos de 1 minuto, seguidos por 4 minutos de refrigeración . Esta etapa fue repetida dos o más veces, llegando a un total de tres ciclos de ultrasonidos. Los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 16,500 rpm durante 45 minutos y el sobrenadante se cargó en un circuito de inyección de 50 mi. El l isado bruto fue aplicado a una columna de amilosa, la cual fue lavada por 7 volúmenes de columna con amortiguador A, y se eluyó en 100% amortiguador B (amortiguador A y 10 mM de maltosa). La proteína objetivo fue reunida y se concentrada a 2.5 mi usando un centricón 30 kDa MWCO. La proteína purificada fue el amortiguador intercambiado a 50 mM HEPES pH 7.5, 100 mM KCI, y 5% glicerol usando una columna de gel de filtración PD-10. Las concentraciones de la proteína fueron determinadas vía el ensayo Bradford usando BSA como predefinición . La proteína pura fue congelada en nitrógeno líquido y almacenado a -80°C .
Caracterización Cinética In Vitro De La Planta Y Las Enzimas Bacterianas DGT. Las actividades enzimáticas de dgts de tipo salvaje (WT) y mutantes DGTs fueron medidos por la producción de fosfato inorgánico (P¡) en un procedimiento mod ificado descrito por Lanzetta et al. (1979) Anal. Bioch . 100:95-7. Ensayos fueron llevados a cabo en 96 pocilios en formato de placa con un total de 50, en un lector de placas Spectra-Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Ensayos típicos conten ían 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCI, 2 mM DTT, y 1 mM S3P. Concentraciones de PEP y glifosato fueron variadas como indicadas. Glifosato fue obtenido de Sigma como el ácido libre y fue resuspendido en ddH2O. Glifosato fue solubilizado por la adición de KOH hasta que la mezcla llego a un pH neutro. Ensayos fueron iniciados por la adición de la enzima DGT en concentraciones que varían entre 0.01 -1 mM. Las reacciones fueron finalizadas por la adición de 235 mL de una mezcla 3: 1 de verde malaquita: solución de molibdato de amonio. Despues del desarrollo completo del color (~1 minuto) , el cambio de la absorción en 660 nm fue registrado y el valor de P¡ formado fue calculado desde una curva predefinida. Las reacciones controladas q ue no tenían enzimas fueron usadas para corregir absorbancia de fondo. Altas concentraciones de PEP (>2 mM) y glifosato (>30 mM) contribuyeron un valor importante de absorbancia de fondo usando este método de detección . La información digitada a la ecuación Michaelis-Meten , la cual permitió la determinación de Km y Vmax (Ecuación 3) mientras que el IC50 fue determinado en la Ecuación 4, donde y es la actividad relativa y s es el coeficiente Hill . La información fue analizada usando el software GraFit™ versión 5 (Erithacus Software Limited , Horlcy, U .K.). - (4) El valor IC50 para un inhibidor competitivo cambiara dependiendo de la concentración del substrato, por la tanto los valores de IC50 en la Tabla 2 fueron obtenidos en 1 mM PEP y en 60 mM PEP (una estimativa de las concentraciones del PEP intracelular en plantas). Únicamente los valores IC50 medidos en la misma concentración de PEP deben ser comparados (determinaciones Km para DGT-32 y DGT-33 fueron determinadas en 100 mM PEP). Adicionalmente, los valores IC5o altamente tolerantes a enzimas no pudieron ser determinados correctamente por el metodo Lanzetta y por lo tanto, fueron estimados tomando en base la actividad relativa.
Cinética de las Plantas DGTs. Dos enzimas con secuencias nativas no-mutables, DGT-1 v5 y DGT-7 v5, fueron probadas primeramente para establecer los parámetros base para la sensibilidad del glifosato. Ambas proteínas mostraron un bajo valor Km para PEP (~70 mM) y estaban sensibles al glifosato con valores IC50 de ~20 mM (Tabla 2) en 1 mM PEP. Como fue observado para DGT-1 v6, DGT-3 v6 y DGT-7 v6, un único punto de mutación de G a A mejoró significativamente la tolerancia al glifosato (valores IC50 de 8-21 mM) pero tambien aumentaron el Km por PEP ~8-veces. La mutación doble (GAPS), para todos los DGT derivados de plantas (DGT-1 v7, DGT-3 v7, y DGT-7 v7), también mejoró la tolerancia al glifosato pero una vez más resulto en un considerable aumento en el PEP Km. Tabla 2. Los TI PS mutantes (DGT-1 v8, y DGT-7 v8) fueron tolerantes a concentraciones modestas de glifosato (3-6 mM) pero en contraste al GA y GAPS mutantes, los niveles de Km permanecieron cerca del tipo-salvaje de proteínas entre 60-200 mM . Figura 31 demuestra los cambios en la tolerancia de glifosato para DGT-1 (A) y DGT-7 (B) sobre la introducción de las mutaciones especificadas. La concentración PEP fue mantenida a 1 mM para los experimentos resultando en la información exhibida in Figura 31 , que probablemente condujo al elevado IC5o (>80mM) para DGT-7 v8. Más procedimientos fueron llevados a cabo para determinar si los niveles más bajos de PEP alteraron la tolerancia relativa al glifosato. Los niveles fisiológicos relevantes del PEP varían entre 5-60 mM . Con 60 mM PEP, el valor IC disminuyo significativamente (3.6 mM) sugiriendo que la determinación inicial fue influenciada por el exceso de PEP, como era esperado de la cinética Michaelis-Meten e indicado en Tabla 2.
Figura 31 exhibe los valores obtenidos después de la introducción de varias mutaciones dentro del DGT-1 (A) y DGT-7 (B) usando 1 mM PEP. Para ambos, A y B , la curva del IC50 con triángulos cerrados representan el tipo-salvaje, círculos cerrados representan GA mutantes, cuadrados abiertos representan GAPS mutantes y cuadrados cerrados representan TIPS mutantes.
Tabla 2. Estado estacionario, parámetros cineticos de las enzimas DGT. Los valores de IC50 mayor que 50 son estimaciones debido a las limitaciones del método usado. *IC50 para glifosato fue determinado en 100 mM PEP.
La Cinetica Bacteriana de DGTs. De las enzimas bacterianas, el DGT-28 v1 posee los parámetros cinéticos generales más favorables (IC50 Elevado y los valores kcat/Km). La enzima fue tolerante a glifosato en concentraciones >80 mM y exhibió una eficiencia catalítica de 1 .32 x 10s M 1 s 1. La mutación A_»G en DGT-28 v2 disminuyó el IC50 a 2.1 7 mM (en 60 mM PEP) y causó una leve elevación en el Km para PEP (161 mM). Esta enzima mutante sostiene la alta eficiencia catalítica en DGT-28 v1 . Aún con un IC50 reducido, esta enzima mutante es adecuada para proveer una tolerancia al glifosato in planta en ciertas aplicaciones. La información sugiere que en esta nueva clase de síntesis EPSP, la alanina no es la única determinante para la tolerancia al glifosato. Para explorar otros determinantes posibles una variante adicional fue construida , DGT-28 v3 (A84G T172A doble mutante) . Esta enzima exhibió una tolerancia reducida al glifosato con un valor IC5o de 5.15 mM (en 60 mM PEP). La reducción en I C50 por DGT-28 v3 fue acompañada por un aumento de eficiencia catalítica de 200 veces, sugiriendo que la segunda mutación llevo efectos no intencionados (Tabla 2). La mayor identidad de DGT-28 v1 homologa (~75% identidad amino ácida), DGT-32 y DGT-33, tienen un bajo Km’s para PEP (-1 14 - 1 39 pM) , pero la eficiencia catalítica fue 100 menor a la DGT-28 v1 . Esta caída en eficiencia catalítica es probablemente derivada de la fusión de la proteína de unión con la maltosa. Las enzimas también son insensibles al glifosato mostrando valores de IC5o mayores a 50 mM . Como resultado de estos ensayos in vitro, que indicaron varias enzimas DGT que proporcionaron la tolerancia al glifosato, las enzimas DGT fueron probadas in planta.
Ejemplo 5: Clonación de vectores de transformación de plantas Vector de Construcción de planta binaria. Se usaron metodos de clonación estándar en la construcción de vectores de entrada que contienen una secuencia de polinucleótido péptido de tránsito de cloroplasto unido a dgt-28 como estructura de fusión Los vectores de entrada que contiene un péptido de tránsito (TRAP) fusionados a dgt-28 fueron ensamblados usando la I n-Fusion™ Advantage (Clontech , Mountain View, CA). Como resultado de la fusión , el primer aminoácido, metionina, se eliminó de dgt-28. Péptidos de tránsito Tra P4 v2 (SEC ID No. : 33), T raP5 v2 (SEC I D No. : 34), TraP8 v2 (SEC I D No. : 35) , TraP9 (SEC I D No. : 38) fueron sintetizados cada uno por ADN2.0 (Menlo Park, CA) y fusionados a fragmento finales de 5’ de dgt-28, hasta e incluyendo un único sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de Accl.
Plásmidos binarios que contenían varias Trap y casetes de expresión de dgt-28 fueron impulsados por el promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbM O v2 ; Callis, et al , (1990) J . Biol. Chem. , 265: 12486-12493) y flanqueados por los Agrobacterium tumefaciens abren una región no traducida de estructura de lectura de veintitres 3' (AtuORF23 3’ UTR v 1 ; Patente Estadounidense No. 5,428, 147) .
La Trap montada y las casetes de expresión de dgt-28 fueron diseñadas usando Gateway® Technology (I nvitrogen , Carlsbad, CA) y se transformaron en plantas a través de la transformación de plantas mediante Agrobacterium. Las endonucleasas de restricción se obtuvieron del New England Biolabs (laboratorio de biolog ía de Nueva Inglaterra (N EB; Ipswich , MA) y se usó ligasa de ADN T4 (I nvitrogen) para la ligadura de ADN. Reacciones de entrada se realizaron usando Gateway® LR Clonase® enzyme mix (I nvitrogen) para el montaje de un vector de entrada en un único vector de destino, que contenía el seleccionable promotor del mosaico vírico de la mandioca del casete marcador (CsVMV v 2; Verdaguer et al, (1996) Plant Mol. Biol., 31 : 1 129-1 139) - DSM-2 (Solicitud de Patente Estadounidense No. 2007/086813) - Agrobacterium tumefaciens abren una región no traducida de estructura de lectura de 3' (AtuORF I 3’ UTR v6; Huang et al., ( 1990) J. Bacteriol. 172 : 1814-1822). Preparaciones de plásmidos se realizaron usando NucleoSpin® Plasmid Kit (Machercy-Nagel I nc. , Bethlehem, PA) o el Midi Kit plásmido (Qiagen) siguiendo las instrucciones de los proveedores. Los fragmentos de ADN fueron aislados usando Q IAquick™ Kit de Gel de Extraction (Qiagen) después de la electroforesis de gel de agarosa de tris-acetato.
Colonias de todos los plásmidos montados fueron examinados inicialmente por digestión de restricción de ADN miniprep. El ADN plasmídico de los clones seleccionados se secuenciaron por un proveedor comercial de secuenciación (MWG Eurofins™ Operon, Huntsville, AL). Los datos de secuencia fueron reunidos y analizados mediante el software Sequencher™ (Gene Codes Corp. , Ann Arbor, M I) .
Las construcciones binarias siguientes expresan las diversas TraP: secuencias de genes de fusión dgt-28: pDAB 107527 (Figura 3) contiene TraP4 v2 dgt-28 v5 (SEC I D No. : 79); pDAB 105530 (Figura 4) contiene TraP5 v2: dgt-28 v5 (SEC ID No.: 80) ; pDAB105531 (Figura 5) contiene TraP8 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No. : 81 ); pDAB 105532 (Figura 6) contiene TraP9 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No. : 82); pDAB105533 (Figura 7) contiene TraP12 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No. : 83); y pDAB105534 (Figura 8) contiene TraP13 v2: dgt-28 v5 (SEC I D No.: 84). La secuencia dgt-28 v5 de pDAB105534 fue modificada en donde el primer codón (gca) se cambió a (gct).
Adicional Vector de Construcción de planta binaria Estrategias de clonación similares a las descritas anteriormente se usaron para construir los plásmidos binarios que contienen dgt-31, dgt- 32, dgt- 33, dgt- , dgt-3 y dgt-7.
Los genes derivado de microbios; dgt-3, dgt-32, y dgt-33, se fusionaron con diferentes péptido de tránsito del cloroplasto que el descrito anteriormente. Los péptidos de tránsito de cloroplasto siguientes se usaron ; TraP14 v2 (SEC ID No. : 39), TraP23 v2 (SEC ID No. : 40), TraP24 v2 (SEC I D No. : 41 ) . pDAB 107532 (Figura 1 1 ) contiene dgt-32 v3 fusionado a TraP14 v2 (SEC I D No. : 42), pDAB 107534 (Figura 12) contiene dgt-33 v3 fusionado a TraP24 v2 (SEC I D No. : 43) , y pDAB1017533 (Figura 54) contiene 5 dgt-33 vi fusionado a TraP23 v2 (SEC ID No. : 143). Los casetes de expresión de dgt fueron impulsados por el promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbM O v2) y flanqueados por los Agrobacterium tumefaciens abren una región no traducida de estructura de lectura de veinte y tres 3' ío (AtuORF23 3’ UTR v1 ). Un casete de marcador seleccionable de DSM-2 que contiene promotor mosaico vírico de la mandioca (CsVMV v2) - DSM-2 - Agrobacterium tumefaciens abren una región no traducida de estructura de lectura de 3' (AtuORFI 3’ UTR v6) tambien estaba presente en el vector binario. 15 Binarios adicionales se construyen en donde dgt-31 v3, dgt- 32 v3, y DGT-33 v3 se fusionan con las anteriormente descritas secuencias de péptido de tránsito de cloroplasto. Por ejemplo, la secuencia de TRAP8 v2 se fusiona a dgt-31 v3, dgt-32 v3, y dgt- 33, y se clonan en vectores binarios como los descritos 20 anteriormente .
Los vectores binarios que contienen los genes de clase I ( dgt- 1 , dgt-3, y dgt- 7) fueron construidos. Los vectores binarios siguientes expresan las diversas TraP: secuencias de genes de fusión dgt-28: pDAB4104 (Figura 9), que contiene la secuencia 25 dgt-1 v4 como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 201 1 /0124503 de, que está flanqueada por las secuencias de Nicotiana tabacum osmotin como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 2009/0064376; pDAB 102715 (Figura 10) ; 5 pDAB 102716 (Figura 45); pDAB 10271 7 (Figura 46); y pDAB102785 (Figura 13). Los diversos peptidos de tránsito de cloroplasto de Trap que se fusionaron a dgt-28, dgt-31 , dgt-32 y dgt-33 no se han añadido a los genes de clase I , ya que estas secuencias derivadas de plantas poseen péptidos tránsito del ío cloroplasto de plantas nativas. Estos vectores se describen con más detalle en la Tabla 3.
Tabla 3. Descripción de los vectores binarios que contienen un gen clase I de sintasa de EPSP (es decir, dgt-1 , dgt-3, o dgt- 7) . 25 Ejemplo 6: Transformación en Arabidopsis y Selección Transformación Arabidoosis thaliana. Arabidopsis se transformó usando el metodo de inmersión floral de Clough y Bent (1998). Una colonia de Agrobacterium seleccionada que contiene uno de los plásmidos binarios descritos anteriormente se usó para inocular uno o más pre-cultivos de caldo YEP de 100 mi que contiene espectinomicina (100 mg /I) y kanamicina (50 mg / I). El cultivo se incubó durante la noche a 28°C con agitación constante a 225 rpm. Las células se sedimentaron a aproximadamente 5000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente, y se descartó el sobrenadante resultante. El sedimento celular se resuspendió suavemente en un medio de 400 mi de Dunking que contiene: 5% (w/v) sacarosa, 10 mg/L 6-benzylaminopurine, y 0.04% Silwet™ L-77. Plantas aproximadamente de 1 mes de edad se sumergieron en el medio durante 5-10 minutos con agitación suave. Las plantas fueron colocadas de lado y cubiertas con bolsas de plástico transparentes u opacas durante 2-3 horas, y después se coloca en posición vertical. Las plantas se cultivaron a 22°C, con luz durante 1 6 horas / 8 horas a oscuro. Aproximadamente 4 semanas después de la inmersión , las semillas se cosecharon.
Selección de plantas transformadas. Semillas recién cosechadas T [que contiene dgt y casetes de expresión DSM-2] se dejaron secar durante 7 días a temperatura ambiente. Semillas T1 se sembraron en bandejas de germinación de 26,5 x 51 -cm, recibiendo cada uno una parte alícuota de 200 mg de semillas T1 estratificadas (~10,000 semillas) que había sido previamente suspendida en 40 mi de solución al 0.1 % de agarosa y se almacenó a 4°C durante 2 d ías para completar los requisitos de latencia y garantizar la germinación sincronizada de las semillas.
Sunshine Mix LP5 estaba cubierto con vermiculita fina y sub-irrigación con solución de Hoagland hasta su humidificación , despues ocurrió el drenaje por gravedad. Cada parte alícuota de 40 mi de semilla estratificada se sembró uniformemente sobre la vermiculita con una pipeta y se cubrió con cubiertas de humidificación durante 4-5 días. Las cubiertas se eliminaron 1 día antes de la selección inicial transformante usando una pulverización de post-emergencia glufosinato (seleccionar para el DSM-2 gen co-transformado).
Siete d ías después de la siembra (DAP) y de nuevo 1 1 DAP, plantas T1 (cotiledón y etapa 2-4-LF, respectivamente) se pulverizaron con una solución de 0.2% de herbicida Liberty (200 g ai / L glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) en un volumen de pulverización de 10 mi / bandeja (703 L / ha) usando una boquita de pulverización DeVilbiss de aire comprimido para proporcionar una tasa efectiva de 280 g de glufosinato ai / ha por aplicación . Las sobrevivientes (plantas en crecimiento activo) se identificaron 4-7 días después de la pulverización final y se trasplantaron individualmente en potes de 3 pulgadas (7.62 cm) preparados por medio de macetas (Metro Mix 360). La plantas trasplantadas se cultivaron en el invernadero (22 ± 5°C , 50 ± 30% HR, 14 horas luz: 10 oscuridad, mínimo 500 naturales pE/m2s1 + luz suplementaria). El análisis de confirmación molecular se completó en las plantas T1 supervivientes para confirmar que el 5 gen de tolerancia al glifosato se había integrado de forma estable en el genoma de las plantas.
Confi rmación Molecular. La presencia del dgt-28 y de los transgenes DSM-2 sin el genoma de las plantas Arabidopsis que fueron transformados con pDAB107527, pDAB105530, ío pDAB 105531 , pDAB 105532, pDAB 105533, o pDAB105534 fue confirmado. La presencia de estas secuencias de polinucleótidos que se confirmó a través de ensayos con sondas de hidrólisis, la casete de expresión de genes de PCR (también descrito como unidad de transcripción de planta PCR - PTU PCR), análisis de 15 transferencia Southern y análisis cuantitativos de PCR de transcripción inversa.
Las plantas T1 de Arabidopsis fueron seleccionados inicialmente mediante un ensayo de sonda de hidrólisis, análoga a TAQMAN™, para confirmar la presencia de DSM-2 y transgénes 20 DGT-28. Eventos se cribaron a través de PCR de casete de expresión gen para determinar si el casete de expresión de dgt está completamente integrado en los genomas de las plantas sin reordenamiento. Los datos generados a partir de estos estudios se usaron para determinar el número de copias de transgénes e 25 identificar algunos eventos de Arabidopsis para la autofecundación y el avance de la generación T2. Las avanzadas plantas T2 de Arabidopsis tambien fueron examinados a través de ensayos con sondas de hidrólisis para confirmar la presencia y estimar el número de copias de los genes DSM-2 y de dgt dentro del cromosoma de la planta. Finalmente, un ensayo de transferencia Southern se usa para confirmar el número de copias estimado en un subconjunto de las plantas T1 de Arabidopsis.
Ensayos similares se usaron para confirmar la presencia de transgén DGT-1 de plantas transformadas con pDAB4101 , la presencia del transgén dgt-32 a partir de plantas transformadas con pDAB107532, la presencia del transgén dgt-33 a partir de plantas transformadas con pDAB107534, la presencia de la dgt-3 transgén de plantas transformadas con pDAB102715, la presencia de la dgt-3 transgén de plantas transformadas con pDAB102716, la presencia del transgén dgt-3 de plantas transformadas con pDAB 102717, y la presencia del transgén dgt-7 desde plantas transformadas con pDAB 102785.
Prueba de sonda Hidrólisis. Número de copias se determinó en las plantas T y T2 de Arabidopsis usando la prueba de sonda de hidrólisis descrita a continuación . Las plantas con números variables de transgénes se identificaron y se adelantaron para posteriores estudios de tolerancia al glifosato.
Las muestras de tejido se recogieron en placas de 96 pocilios y se liofilizó durante 2 días. La maceración del tejido se realizó con un pulverizador de tejido KLECO™ y los granos de tungsteno (Environ Metal I nc. , Sweet Home, Oregón) . Despues de la maceración del tejido, el ADN genómico se aisló con alto rendimiento usando el kit Plant Biosprint™ 96 (Qiagen™, Germantown , M D) según el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico se cuantifica mediante kit de prueba de Quant-IT™ Pico Green ADN (Sondas Moleculares, Invitrogen, Carlsbad, CA) . ADN genómico fue cuantificado a aproximadamente de 2 ng / I para la prueba de sonda de hidrólisis usando un manipulador de líquidos automatizado BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown , M D) . Determinación de número de Copia Transgéne mediante el ensayo de hidrólisis de la sonda se realizó por PCR en tiempo real usando el LightCycler® 480 sistema (Roche Ciencias Aplicadas, I ndianápolis, IN). Los ensayos fueron diseñados para el DSM-2, dgt-28 y el gen de referencia interna , TAFI I 15 (GenBank ID: NC 003075; Duarte et al., (201 ) BMC Evo!. Biol. , 10:61 ). \ Para amplificación, LIGHTCYCLER®480 Sondas Master Mix (Roche Applied Science, Indianápolis, I N) se preparó a una concentración final 1 X en un volumen de reacción múltiplex 10 pL que contiene 0.1 mM de cada cebador para DSM-2 y 28-dgt, 0.4M de cada cebador para TAFI I 15 y 0.2 mM de cada sonda. Tabla 4. Una reacción de dos etapas de amplificación se realizó con una extensión a 60°C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras fueron realizadas y la media de los valores de ciclo umbral (Ct) se usaron para el análisis de cada muestra. El análisis de datos PCR en tiempo real se realizó usando el software 1 .5 liberación LightCycler™ usando el módulo de quant relativo y se basa en el metodo AACt. Para esto, una 5 muestra de ADN genómico a partir de un único calibrador de copia y un control conocido de copia 2 se incluyeron en cada ejecución . Los resultados de número de copias de la pantalla de sonda de hidrólisis se determinaron para las plantas T1 y T2 de Arabidopsis transgénicas. ío Tabla 4. Información de cebador y de sonda para el ensayo de sonda de hidrólisis DS -2, dgt-28 y el gen de referencia interna (TAFI I 15). de Transferencia Southern Análisis de transferencia Southern se usó para establecer el patrón de integración del fragmento de hebra-T de ADN insertado e identificar los eventos que conten ían DGT-28. Los datos fueron generados para demostrar la integración y la integridad de las inserciones de transgenes en el genoma de Arabidopsis. Los datos de transferencia Southern se usaron para identificar la simple integración de una copia intacta del ADN de la hebra T. El análisis detallado de transferencia Southern se llevó a cabo usando una sonda amplificada de PCR especifica para el casete de expresión del gen dgt-28. La hibridación de la sonda con el ADN genómico que había sido digerido con fragmentos de ADN genómico de enzimas identificadas de restricción específica, los patrones que se usaron para identificar la longitud completa, eventos T1 transgénicas de simples inserción para el avance a la siguiente generación .
Las muestras de tejido se recogieron en 2 mi de tubos cónicos (Eppendorf™) y se liofilizó durante 2 días. La maceración del tejido se realizó con un pulverizador de tejido KLECKO™ y granos de tungsteno. Después de la maceración del tejido, el ADN genómico se aisló usando un procedimiento de aislamiento de CTAB. El ADN genómico fue purificado usando el kit de Tips genómicos de Qiagen™. El ADN genómico se cuantifica mediante kit de prueba de Quant-IT™ Pico Green ADN (Sondas Moleculares, I nvitrogen, Carlsbad, CA) . ADN genómico cuantificado se ajustó a 4 mg para una concentración constante.
Para cada muestra, 4 pg de ADN genómico se digirió completamente con la enzima de restricción Swal (New England Biolabs, Beverlcy, MA) y se incubaron a 25°C durante la noche, despues Nsil se añadió a la reacción y se incubaron a 37°C durante 6 horas. El ADN digerido se concentró por precipitación con solución de precipitación Quick™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) según el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico se resuspendió después en 25 mL de agua a 65°C durante 1 hora. Muestras resuspendidas se cargaron en un gel de agarosa 0.8% preparado en 1 X TAE y sometidas a electroforesis durante la noche a 1 .1 V / cm en 1 X amortiguador TAE. El gel fue sometido de forma secuencial a la desnaturalización (0.2M NaOH / NaCI 0.6M) d urante 30 minutos, y la neutralización (0.5M Tris-HCI (pH 7.5) / NaCI 1 .5M) durante 30 minutos.
La transferencia de fragmentos de ADN a membranas de nylon se llevó a cabo por solución capilaridad pasiva 20 X SSC durante la noche a través del gel sobre I M MOBI LON tratada™ NY + transferencia de la membrana (M illipore, Billerica, MA) mediante el uso de una mecha de papel de cromatografía y toallas de papel. Después de la transferencia, la membrana se lavó brevemente con 2X SSC, reticulado con el Stratalinker™ 1800 (Stratagene, La Jolla, CA), y el vacío al horno a 80°C durante 3 horas.
Las transferencias se incubaron con solución de pre hibridación (Hyb Perfect plus, Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora a 65°C en frascos rotatorios de vidrio usando un modelo 400 de incubadora hibridación (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA) . Las sondas se prepararon a partir de un fragmento de PCR que contiene la secuencia codificadora completa. La amplificación de PCR se purificó usando el kit de extracción de gel Q IAEX™ I I y se marcaron con a32P-dCTP a traves del kit Random Prime RT IT™ (Stratagene, La J o 11 a , CA). Las transferencias se hibridaron durante la noche a 65°C con sonda desnaturalizada añadió directamente al amortiguador de hibridación a aproximadamente 2 millones de conteos por transferencia por mi . Después de la hibridación , las transferencias se lavaron secuencialmente a 65°C con 0.1 X SSC / 0.1 % SDS durante 40 minutos. Por último, las transferencias fueron expuestos a pantallas de imágenes de almacenamiento de fósforo y usando sistema de formación de imágenes de Molecular Dynamics Storm 860™.
Los análisis de transferencia Southern completados en este estudio se usaron para determinar el número de copias y confirmar que los eventos seleccionados conten ían el transgén dgt-28 dentro del genoma de Arabidopsis.
Confirmación de casete de expresión de dat-28 vía Análisis de PCR. La presencia de expresión de la casete del gen dgt-28 contenida en los eventos de plantas T1 fue detectada por un punto final de reacción de PCR. Los cebadores (Tabla 5) específico para el promotor AtUbil O v2 y regiones v1 AtuORF23 UTR 3’del casete de expresión del gen dgt-28 fueron usados para la detección .
Tabla 5. Los cebadores de oligonucleótidos usados para la confirmación de casete de expresión del gen dgt-28.
Las reacciones de PCR se requieren un estándar de protocolo de tres etapas de ciclo de PCR para amplificar el casete de expresión de gen . Todas las reacciones de PCR se realizaron usando las siguientes condiciones de PCR: 94°C durante tres minutos, seguido por 35 ciclos de 94°C durante treinta segundos, 60°C durante treinta segundos, y 72°C durante tres minutos. Las reacciones se terminaron mediante el kit EX-TAQ™ PCR (Takara Biotechnology Inc. Otsu , Shiga, Japón) según las instrucciones del fabricante. Despues del ciclo final, la reacción se incubó a 72°C durante 10 minutos. La electroforesis de gel TAE de agarosa se usó para determinar el tamaño del amplicón de PCR. Amplicones de PCR de un tamaño esperado indicó la presencia de un casete de expresión de longitud completa del gen, estaban presente en el genoma de los eventos de Arabidopsis transgénicos.
Confirmación relativa de la transcripción de dgt-28 a traves del análisis de transcripción cuantitativa reversa de PCR. Las muestras de tejido de plantas transgénicas dgt-28 se recogieron en placas de 96 pocilios y se congelaron a 80°C. La maceración del tejido se realizó con un pulverizador de tejido KLECO™ y granos de tungsteno (Environ Metal I nc. , Sweet Home, Oregón) . Después de la maceración del tejido, el ARN total se aisló en formato de alto rendimiento usando el kit Plant Biosprint™ 96 (Qiagen™, Germantown, M D) según el protocolo sugerido por el fabricante que incluye el tratamiento opcional DNasel en la columna. Esta etapa fue seguido posteriormente por un adicional tratamiento de ADNasa I (Ambion™, Austin , TX) del total de los eluídos ARN . La síntesis de ADNc se realizó usando el total de ARN como molde con el kit de la transcripción inversa de alta capacidad de cADN™ (Applied Biosystems, Austin , TX) según la téenica recomendada por el fabricante con la adición del oligonucleótido, TVN . Cuantificación de la expresión se completó mediante el ensayo de hidrólisis de la sonda y se realizó por PC R en tiempo real usando el LightCycler ® 480 sistema (Roche Ciencias Aplicadas, I ndianápolis, IN). Los ensayos fueron diseñados por el dgt-28 y el gen de referencia interna, TAFI I 1 5 (GenBank I D: AT4G24610) usando el Software Probe Design 2.0 LIGHTCYCLER®. Para amplificación , Sondas Master Mix LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, I ndianápolis, I N) se preparó a una concentración final 1 X en un volumen de reacción múltiplex 10 mL que contiene 0.4 pM de cada cebador y 0.2 pM de cada sonda. Tabla 6.
Tabla 6. Los cebadores PCR usados para el análisis de la transcripción inversa cuantitativa PCR de dgt-28.
Se realizó una reacción de amplificación de dos etapas con una extensión de 60°C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras se realizaron por triplicado y se usaron los valores medios del ciclo umbral (Ct) para el análisis de cada muestra. Se realizó una reacción de transcripción inversa menos para cada muestra para asegurarse que no se encontraba presente contaminación alguna del gADN . Se realizó un análisis de los datos PCR en tiempo real basándose en el metodo OTDD. Este ensayo se usó para determinar la expresión relativa de eventos dgt-28 en Arabidopsis transgénica que se determinaron eran hemicigóticos y homocigóticos. Los niveles de transcripción relativos del mARN dgt-28 varían desde un pliegue de 2.5 a un pliegue de 207.5 mayor que el control interno. Estos datos indican que las plantas transgénicas dgt-28 contenían una casete de expresión genética funcional del dgt-28 y que las plantas eran capaces de transcribir el transgén dgt-28.
Análisis de Transferencia Western. Se detectó DGT-28 en muestras de hojas obtenidas de plantas Arabidopsis thaliana transgénicas. Los extractos de plantas procedentes de plantas transgénicas dgt-28 y los estándares de proteína DGT-28 se incubaron con una solución amortiguada de muestra N UPAGE® LDS (Invitrogen , Carlsbad , CA) que contenía DTT a 90°C durante 10 minutos y se separó electroforéticamente en un gel prefabricado de acrilamida. Posteriormente las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa usando el protocolo del fabricante. Tras bloquearlo con la mezcla de bloqueo WESTERNBREEZE® (Invitrogen) se detectó la proteína DGT-28 mediante un antisuero anti-DGT-28 seguido por antifosfatasa de cabra anti-conejo. La proteína detectada se visualizó mediante el reactivo de análisis Western BCIP/NBT de sustrato de quimioluminiscencia (KPL, Gaithersburg, MD). La producción de proteína DGT-28 intacta vía Transferencia Western indicaba que las plantas transgenicas dgt-28 que fueron sometidas al ensayo expresaban la proteína DGT-28.
Ejemplo 7: Tolerancia al glifosato Las plantas transgénicas T t Arabidopsis que contenían el transgén dgt-28 fueron pulverizadas con diferentes tasas de glifosato. Se aplicaron tasas elevadas en este estudio para determinar los niveles de resistencia relativos (105, 420, 1 ,680 o 3,360 g ae/ha). Una tasa de uso 1 X típica de glifosato que controlará la Arabidopsis es 420 g ae/ha. Las formulaciones de glifosato con la incorporación de sulfato de amonio se aplicaron a las plantas con un rociador automático calibrado en 187 L/ha. Las plantas T·i Arabidopsis que se usaron en este estudio presentaban un número de copias variable del transgén dgt-28. Las plantas con una copia baja de dgt-28 T Arabidopsis presentaban autopolinización y se usaban para producir plantas T2. La tabla 7 muestra la comparación de plantas transgénicas dgt-28, extraídas de un gen con resistencia a herbicidas con glifosato, dgt- 1 , y controles de plantas naturales. La tabla 8 muestra la comparación de plantas transgénicas dgt-32, y dgt-33 extraídas de un gen con resistencia a herbicidas con glifosato, dgt- 1 , y controles de plantas naturales. La tabla 9 muestra la comparación de enzimas sintasa EPSP bacterianas nuevas con enzimas sintasa Clase I EPSP y los controles con una tasa de glifosato de 1 ,680 g ae/ha.
Resultados de la selección de glifosato de plantas dat-28 Arabidopsis transformadas. Se seleccionaron en primer lugar los transformantes del Arabidopsis Ti a partir de la naturalidad de semillas sin transformar usando un esquema de selección de glufosinato. Se analizaron tres planos o 30, 000 semillas de cada elemento Ti . Las plantas T arriba seleccionadas estaban caracterizadas molecularmente y el número de plantas con copias se trasplantó posteriormente a macetas individuales y se pulverizaron con varias tasas de glifosato comercial descrito previamente. La respuesta de estas plantas se presenta en terminos de % de lesiones visuales 2 semanas después del tratamiento (WAT por sus siglas en inglés). Los datos se presentan en una tabla que muestra las plantas individuales que no presentan lesiones o lesiones pequeñas (<20%), lesiones moderadas (20-40%) o lesiones graves (>40%) . Se presenta una media aritmética y una desviación estándar de cada elementos usado para la transformación de Arabidopsis. La variedad en la respuesta individual se indica asimismo en la última columna de cada tasa y transformación. La Arabidopsis natural, no transformada (c.v. Columbia) funcionaba como control sensible al glifosato.
El nivel de respuesta de la planta varía. Esta variación puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente y así el número de copias del gen de interés varía de planta a planta. Se observó que algunas plantas que contenían el transgén no toleraban el glifosato; no se completó un análisis completo para determinar si estas plantas expresaban el transgen . Es probable que la presencia de un número de copias elevado del transgén en las plantas T-, Arabidopsis provocara un silenciamiento del transgén u otros efectos epigenéticos que provocaron sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt-28.
Se presenta una media de lesiones de la población general según tasas en la Tabla 9 para tasas de glifosato de 1 ,680 g ae/ha para demostrar la notable diferencia entre las plantas transformadas con dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32, y dgt-33 frente a los controles dgt-1 y naturales.
La tolerancia que ofrece las sintasas bacterianas nuevas EPSP varía dependiendo de las enzima específica. DGT-28, DGT-32 , y DGT-33 inesperadamente ofrecieron una notable tolerancia al glifosato. Los genes dgt impartían resistencia al herbicida a plantas individuales Ti Arabidopsis en todos los péptidos de tránsito probados. Como tales, el uso de péptidos de tránsito para su importación a cloroplastos adicionales ( esto es, TraP8 - dgt-32 o TraP8 - dgt-33) ofrecerían protección al glifosato con niveles de lesiones similares a los reportados dentro del tratamiento dado.
Tabla 7. La respuesta del dgt-28 transformado TT Arabidopsis a una diversidad de tasas de glifosatos aplicados post-emergencia, en comparación con una población de dgt- 1 (T4) resistente a los homocigotos, y un control no transformado. % de visuales a 14 días tras la aplicación.
Tabla 8. La respuesta del dgt-32, y dgt-33 transformado T? Arabidopsis a una diversidad de tasas de glifosatos aplicados post-emergencia, en comparación con una población de dgt-1 (T4) resistente a los homocigotos, y un control no transformado. % de lesiones visuales a 14 d ías tras la aplicación .
Tabla 9. La respuesta del dgt-28, dgt-32, dgt-33, dgt-3, y dgt-7 transformado T 1 Arabidopsis al glifosatos aplicados post emergencia a 1 ,680, en comparación con una población de dgt-1 (T4) resistente a los homocigotos, y un control no transformado. % de lesiones visuales a 14 días tras la aplicación . dat-28 como un marcador seleccionable. El uso de dgt- 28 como un marcador seleccionable como agente de selección de glifosato se probó con las plantas transformadas Arabidopsis descritas arriba. Aproximadamente se mezclaron 50 semillas T4 de generación Arabidopsis (homocigotas para dgt-28) en aproximadamente 5,000 semillas naturales (sensibles al glifosato). Las semillas se germinaron y las plántulas se pulverizaron con una dosis seleccionada de glifosato. Se compararon varios tratamientos de glifosato; cada bandeja de plantas recibió bien una o dos temporalizaciones de aplicación de glifosato en uno de los siguientes programas de tratamiento: 7 DAP (d ías tras su plantación), 1 1 DAP o 7 seguido de 1 1 DAP. Como todas las plantas asimismo contenían un gen de resistencia al glifosato en el mismo vector de transformación , que contenían las plantas seleccionadas con glifosato dgt-28 se pudieron comparar directamente con plantas seleccionadas con glufosinato que conten ían DSM-2 o pat.
Los tratamientos con glifosinato se aplican con una punta de pulverizador DeVilbiss™, como se ha descrito previamente. Las plantas transgenicas que contienen dgt-28 se identifican como "resistentes" o "sensibles" a 17 DAP. Los tratamientos de glifosato 26.25-1680 g ae/ha que se aplican 7 y 1 1 días después de la plantación (DAP) muestras una selección efectiva de plantas transgénicas Arabidopsis que contienen dgt-28. Se contaron las plantas sensibles y resistentes y se descubrió que el número de plantas sensibles al glifosato se refiere a con el número original de semillas transgénicas que contenían el transgén dgt-28 que se plantó. Estos resultados indican que el dgt-28 se puede usar de forma efectiva como un marcador seleccionable alternativo para una población de Arabidopsis transformadas.
Heredabilidad. Los eventos de T ·, Arabidopsis transgénicos confirmados se autopolinizaron para producir semillas T2. Se probó a la progenie de estas semillas aplicando el herbicida Ignite™ que contiene glufosinato (200 g ae/ha) en 100 descendientes T2 aleatorias. Cada planta individual T2 se trasplantó a macetas de 7.5 cm2 antes de la aplicación de la pulverización (pulverizadores a una tasa de aplicación de 187 L/ha) . Las familias T·i (plantas T2) se separaron en Resistentes 3 anticipadas: 1 modelo sensible para un único locus predominantemente heredado con herencia mendeliana como lo determina el análisis Chi cuadrado (P > 0.05). El porcentaje de familias T·\ que se separaron con la herencia mendeliana esperada aparece ¡lustrado en la Tabla 10, y demuestra que la característica dgt-28 se transmite vía herencia mendeliana a la generación de T2. Se recogieron semillas desde 5 a 15 individuos de T2 (semillas T3). Veinticinco hermanas de T3 de cada 3-4 5 familias de T2 seleccionadas aleatoriamente se probaron de forma progenica como se ha descrito previamente. Los datos no mostraron ninguna separación y así demostraron que dgt-28 y dgt-3 se integran de forma estable con el cromosoma y se heredan de forma mendeliana en al menos tres generaciones ío Tabla 10. Porcentaje de familias T (plantas T2) que se separan como herencia simple mendeliana en una prueba de progenie de 100 plantas. 25 Datos de T Arabidopsis. Las plantas de segunda generación (T2) de eventos seleccionados T2 Arabidopsis que contenían unos números bajos de copias del transgén dgt-28 se caracterizaron más por su tolerancia al glifosato. Se seleccionaron veinticinco plantas por línea con glufosinato, como se ha descrito anteriormente, y líneas de cada constructo probado no se segregaron para el gen marcador seleccionable. El glifosato se aplicó como se describe anteriormente. La respuesta de estas plantas se presenta en términos de % de lesiones visuales 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos se presentan en una histograma de individuos que no presentan lesiones o lesiones pequeñas (<20%), lesiones moderadas (20-40%) o lesiones graves (>40%). Se presenta una media aritmética y una desviación estándar de cada elemento usado para la transformación de Arabidopsis. La variedad en la respuesta individual se indica asimismo en la última columna de cada tasa y transformación. El Arabidopsis natural sin-transformar (cv. Columbia) sirvió como un control sensible al glifosato. En la generación T2 se dispon ían de plantas hemicigotos y homocigotos para las pruebas en cada evento y por lo tanto, se incluyeron para cada tasa de glifosato ensayada. Las plantas hemicigotas contienen dos alelos diferentes en un solo lugar, en comparación con las plantas homocigóticas que contienen los mismos dos alelos en un lugar. La variabilidad de la respuesta a glifosato se espera en la generación T2, como resultado de la diferencia en la dosis genica para hemicigotos en comparación con las plantas homocigotas. La variabilidad en la respuesta a glifosato se refleja en la desviación estándar y la amplitud de respuesta.
En la generación T2 tanto los eventos de una única copia como los de multicopia de dgt-28 se caracterizaron por la tolerancia al glifosato. Dentro de un evento, las plantas con una única copia mostraron niveles de tolerancia similares al glifosato. Los datos característicos de los eventos de una única copia de T2 se presentan en la Tabla 11 . Aquellos eventos que contenían dgt-28 vinculados con TraP5 v2 no ofrecieron una gran tolerancia al glifosato en comparación con los elementos dgt-28 que conten ían otros péptidos de tránsito TraP. No obstante, los elementos TraP5 dgt-28 ofrecieron un nivel bajo de tolerancia al glifosato en comparación con el control Columbia sin transformar. Hubo ejemplos en donde se demostró que los eventos que conten ían dos o más copias de dgt-28 era más susceptibles de presentar tasas elevadas de glifosato (los datos no lo confirman) . Este incremento en la sensibilidad al glifosato es similar a los datos descritos previamente en las plantas T·, que asimismo contenían un alto número de copias del transgén dgt-28. Es probable que la presencia de un número de copias elevado del transgén en las plantas Arabidopsis provocara una silenciación del transgén u otros efectos epigenéticos que provocaron sensibilidad al glifosato, a pesar de la presencia del transgén dgt- 28.
Estos eventos contenían dgt-28 vinculado con TraP5 v2 (pDAB1 05530), TraP 12 v2 (pDAB 105533) y TraP13 v2 (pDAB1 05534) .
Además de dgt-28, los eventos T2 Arabidopsis transformados con dgt-3 se presentan en la Tabla 12. Al igual que se describe para los eventos de dgt-28 en la Tabla 11 , la tabla de datos contiene un evento representativo que es característico de la respuesta al glifosato de cada elemento. Para la caracterización del dgt-3 los elementos que contenían una PTU única (unidad de transformación de plantas) con el gen dgt-3 impulsado por el promotor AtUbil O (pDAB102716, Figura 45 y pDAB 10271 5, Figura 10) se compararon con elementos con el mismo gen que contenían 2 PTU del gen (pDAB102719, Figura 32; pDAB102718, Figura 33). Los elementos que conten ían 2 PTU usaban el promotor AtUbi l O para impulsar una copia del gen y el promotor CsVMV para impulsar la otra copia. Se incorporó el uso del PTU doble para comparar las plantas transgenicas con dgt-3 con las plantas transgénicas con dgt-28 que contenían dos copias del transgén. Los datos demostraron que los eventos de una única copia de T2 dgt-3 con un ún ico PTU eran más susceptibles al glifosato que aquellos eventos de una sola copia de dgt-28 probados, pero eran más tolerantes que los del control sin transformar. Las familias de Ti que contenían 2 PTU del gen dgt-3 ofrecieron un mayor nivel de tolerancia visual al glifosato en comparación con los elementos de 1 PTU . En ambos ejemplos, se compararon las familias de T con cfgM y con controles naturales. Los datos de T2 demuestran que el dgt-28 ofrece una gran tolerancia al igual que los eventos de una única copia.
Tabla 11 Respuesta de los eventos individuales seleccionados de T2 Arabidopsis que contienen dgt-28 al glifosato aplicado post-emergencia a tasas variables, en comparación con una población de dgt- 1 (T4) resistente al homocigoto, y control sin transformar. % de lesiones visuales a 14 días tras la aplicación .
Tabla 12. Respuesta de los eventos seleccionados de T2 Arabidopsis transformados con dgt-3 al glifosato aplicado postemergencia a tasas variables. % de lesiones visuales a 14 días tras la aplicación.
Datos de Arabidopsis T Las plantas de tercera generación (T3) de eventos de Arabidopsis T2 seleccionados que conten ían un bajo número de copias del transgen dgt- 28 se caracterizan además por su tolerancia al glifosato. Veinticinco plantas por hilera se seleccionaron con glufosinato, como se ha descrito, y las hileras de cada constructo examinado no se segregaron para el gen marcador seleccionable. Se aplicó glifosato según se describió anteriormente. La respuesta de las plantas se presenta en términos de % de lesión visual 2 semanas después del tratamiento (WAT). Los datos se presentan como un histograma de los individuos que exhiben pocas o ninguna lesión (<20%), lesión moderada (20-40%) , o lesión grave (>40%). Se presentan una media aritmética y desviación estándar para cada constructo usado para la transformación de Arabidopsis. También se indica en la última columna el Intervalo en respuesta individual para cada tasa y transformación. La Arabidopsis no-transformada (cv. Columbia) tipo silvestre sirvió como un control sensible al glifosato.
Tabla 13. Respuesta de eventos individuales de Arabidopsis T3 seleccionados que contienen dgt-28 al glifosato aplicado post emergencia a diferentes tasas, en comparación con una población resistente homocigota dgt- 1 (T4) y un control no transformado. Porcentaje de lesión visual 14 días después de la aplicación .
Selección de plantas transformadas. Semillas T [dgt-31, dgt-32, y dgt-33 gen v 1 ] recien cosechadas se dejaron secar a temperatura ambiente y se enviaron a Indianápolis para pruebas. Las semillas Ti fueron sembrada en bandejas de germinación de 26.5 x 51 cm (T.O . Plastics I nc. , Clearwater, MN), cada una recibiendo alícuotas de 200 mg de semillas Ti estratificadas (~ 10,000 semillas) que habían sido previamente suspendidas en 40 mi de solución de agarosa al 0.1 % y almacenadas a 4°C 5 durante 2 días para completar ios requisitos de latencia y asegurar una germinación síncrona de las semillas.
Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture I nc. , Bellevue, WA) fue cubierta con vermiculita fina y subirrigada con solución de Hoagland hasta humedecerse, despues se le dejó drenar por ío gravedad. Cada alícuota de 40 mi de semilla estratificada fue sembrada de forma uniforme sobre la vermiculita con una pipeta y cubierta con domos de humedad (Kord™ Products, Bramalea, Ontario, Canadá) durante 4 a 5 días. Los domos fueron retirados una vez que las plantas habían germinado, antes de la selección 15 de transformante inicial usando pulverización post-emergencia de glufosinato (seleccionando para el gen dsm-2 co-transformado).
Seis días después de la siembra (DAP) y nuevamente 10 DAP, las plantas Ti (cotiledón y etapa 2-4-lf, respectivamente) fueron pulverizadas con una solución al 0.1 % de herbicida 20 Ignite™ (280 g ai/l de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) a un volumen de pulverización de 10 ml/bandeja (703 l/ha) usando una punta de pulverización de aire comprimido DeVilbiss™ para entregar una tasa efectiva de 200 g a.e./ha de glufosinato por aplicación. Los sobrevivientes (plantas en 25 crecimiento activo) fueron identificados de 4 a 7 días después de la pulverización final. Las plantas sobrevivientes fueron trasplantadas individualmente en macetas de 3 pulgadas preparadas con medio de cultivo (Metro Mix 360™). Las plantas criadas en el invernadero al menos 1 d ía antes de la toma de 5 muestras de tejidos para el análisis de número de copias.
Se tomaron muestras de plantas T-, y se completaron los análisis de número de copias para el gen dgt-31 , dgt-32, y dgt-33 v1. Las plantas T, fueron después asignadas a diferentes tasas de glifosato de modo que hubo una variedad de copias entre cada ío tasa. Para Arabidopsis, 26.25 g a.e./ha de glifosato es una dosis eficaz para distinguir las plantas sensibles de aquellas con niveles de resistencia significativos. Se aplicaron tasas elevadas para determinar los niveles relativos de resistencia (105, 420, 1680, o 3360 g a.e./ha) . La Tabla 15 muestra las comparaciones 15 hechas a dgt- 1.
Todas las aplicaciones de herbicida de glifosato fueron hechas con pulverizador de pista en un volumen de pulverización de 187 l/ha. El glifosato usado fue de la formulación sal dimetilamina DURANGO comercial (480 g a.e./l, Dow 20 AgroSciences, LLC). Se accedió además a plantas T-, de copia baja que exhibieron tolerancia al glufosinato o glifosato en la generación T2.
Las primeras transformaciones de Arabidopsis se realizaron usando dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1. Los transformantes T^ fueron 25 seleccionados primero desde el fondo de las semillas no transformadas usando un esquema de selección de glufosinato. Se analizaron Tres pisos o 30,000 semillas para cada constructo T . Se calculó la frecuencia de transformación y los resultados de los constructos T1 dgt-31, dgt-32, y dgt-33 se enumeran en la Tabla 14.
Tabla 14. Frecuencia de transformación de constructos Arabidopsis T1 dgt -31, dgt-32, y dgt-33 seleccionados con glufosinato para la selección del gen marcador seleccionable DSM-2 .
Las Plantas T seleccionadas líneas arriba fueron posteriormente trasplantadas a macetas individuales y pulverizadas con diferentes tasas de glifosato comercial. La Tabla 15 compara la respuesta de dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1 y genes de control para impartir resistencia a glifosato a transformantes de Arabidopsis T^ La respuesta se presenta en terminos de% de lesión visual 2 WAT. Los datos se presentan como un histograma de los individuos que exhiben pocas o ninguna lesiones (<20% ), lesión moderada (20-40%) , o lesión grave (>40%) . Se presenta una media aritmetica y desviación estándar para cada tratamiento. También se indica en la última columna el I ntervalo en respuesta individual para cada tasa y transformación. La Arabidopsis no-transformada (cv. Columbia) tipo silvestre sirvió como un control sensible al glifosato. El gen DGT-31 (vD con péptido de tránsito TraP23 impartió una leve tolerancia a herbicidas a plantas de Arabidopsis individuales en comparación con el control negativo, pero el gen exhibido mejoró la tolerancia con el péptido de tránsito TraP8. Tanto DGT-32 como DGT-33 demostraron una robusta tolerancia al glifosato a las tasas probadas con TraP8 y su respectivo péptido de tránsito del cloroplasto distinto (TraP14 y TraP24 respectivamente). Dentro de un tratamiento dado, el nivel de respuesta de la planta varía mucho, lo cual puede atribuirse al hecho de que cada planta representa un evento de transformación independiente y, por lo tanto, el número de copias del gen de interés varía de una planta a otra. Es importante notar que en cada tasa de glifosato probada, había individuos que eran más tolerantes que otros. Un promedio de lesiones de la población total por tasa se presenta en la Tabla 15 para demostrar la importante diferencia entre las plantas transformadas con dgt-31 , dgt-32, y dgt-33 v-1 frente a dgt- 1 v1 o controles de tipo silvestre.
Tabla 1 5. dgt-31, dgt-32, y dgt-33 v1 transformaron la respuesta de Arabidopsis T a una variedad de tasas de glifosato aplicadas post-emergencia, en comparación con una población resistente homocigota dgt- 1 (T4) , o un control no transformado. Porcentaje de lesión visual 2 semanas despues del tratamiento.
Ejemplo 8: dgt-32 y dgt-33 como Marcadores Seleccionables dgt-32 y dgt-33 v1 se usan como marcadores seleccionables con glifosato como el agente de selección . El rendimiento de estos marcadores se analiza con Arabidopsis transformada. Aproximadamente 50 semillas de Arabidopsis generación T4 (homocigotas para dgt-32 y dgt-33 vD se adicionaron a aproximadamente 5,000 semillas de tipo silvestre (sensibles). Varios tratamientos son comparados, cada bandeja de plantas recibieron una o dos temporizaciones de aplicación de glifosato en uno de los siguientes regímenes de tratamiento: 7 DAP, 1 1 DAP, o 7 seguido de 1 1 DAP. Puesto que todos los individuos tambien contienen el gen dsm-2 en el mismo vector de transformación, dgt-32 y dgt-33 seleccionados con glifosato pueden ser directamente comparados con dsm-2 seleccionado con glufosinato.
Los tratamientos se aplican con una boquilla de pulverización DeVilbiss™. Las plantas son identificadas como Resistentes o Sensibles 17 DAP. Los tratamientos de 26.25 a 280 g a.e./ha 2,4-D aplicados 7 y 1 1 días despues de la siembra (DAP) , son igualmente eficaces en frecuencia de selección. Estos resultados indican que dgt-32 y dgt 33 v1 pueden ser usados eficazmente como un marcador seleccionable.
Heredabilidad. Una variedad de eventos T fueron autopolinizados para producir semillas T2. Se probó la progenie de estas semillas aplicando Ignite™ (200 g a.e./ha) a 100 hermanos T2 aleatorios. Cada planta T2 individual fue trasplantada a macetas de 7.5 cm cuadrados antes de la aplicación por pulverización (pulverizador de pista a tasa de aplicación 187 l/ha) . Las familias T (plantas T2) que segregan en el modelo 3 Resistente: 1 Sensible anticipado para un locus individual heredado dominantemente con herencia mendeliana según se determina por análisis Chi cuadrado (P > 0.05) son determinadas.
Las semillas se recolectaron de 5 a 15 individuos T2 (semillas T3). Veinticinco hermanos T3 de cada una de tres familias T2 seleccionadas al azar son probados en progenie. Los datos que no muestran segregación demuestran que dgt-32 y dgt-33 v1 están cada uno integrado de forma estable y heredado de forma mendeliana a por lo menos tres generaciones.
Caracterización de Tolerancia a Herbicida Adicional de líneas DGT T3. Las semillas de Arabidopsis generación T3 están estratificadas, y se siembran en bandejas de selección. Una linea de control transformada que contiene dgt-1 y el control no transformado se plantan en una manera similar. Las plántulas se 5 transfieren a macetas individuales de 3 pulgadas en el invernadero. Todas las plantas son pulverizadas con el uso de un pulverizador de pista de fijado en 187 l/ha. Las plantas son pulverizadas con una variedad de glifosato de 420 a 3360 g a.e./ha (DU RANGO ™ DMA, Dow AgroSciences) . Todas las ío aplicaciones son formuladas en agua . Cada tratamiento se repite 4 veces, y las plantas son evaluadas a los 7 y 14 días despues del tratamiento.
Ejemplo 9: Transformación de Especies de Cultivos Adicionales 15 La soja es transformada con dgt-28, dgt-31 , y/o dgt-33 (con o sin un péptido de tránsito del cloroplasto) para proporcionar altos niveles de resistencia al glifosato herbicida, usando un método conocido para expertos en la téenica, por ejemplo, sustancialmente las mismas técnicas descritas anteriormente en 0 el Ejemplo 1 1 o Ejemplo 13 de la Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.
El algodón es transformado con dgt-28, dgt-32, y/o dgt-33 (con o sin un péptido de tránsito del cloroplasto) para proporcionar altos niveles de resistencia al glifosato herbicida, 25 usando un método conocido para expertos en la técnica, por ejemplo, sustancialmente las mismas teenicas descritas anteriormente en el Ejemplo 14 de la Patente Estadounidense 7,838,733, o en el Ejemplo 12 de la Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482. 5 La cañóla es transformada con dgt-28, dgt-31, y/o dgt-33 (con o sin un péptido de tránsito del cloroplasto) para proporcionar altos niveles de resistencia al glifosato herbicida usando un método conocido para expertos en la técnica, por ejemplo, sustancialmente las mismas técnicas descritas ío anteriormente en el Ejemplo 26 de la Patente Estadounidense 7,838,733, o en el Ejemplo 22 de la Publicación de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.
Ejemplo 10: Transformación del Maíz Constructos de ADN para Transformación del Maíz. Como 15 se describe líneas arriba, se usaron métodos estándar de clonación en la construcción de vectores binarios para uso en transformación de maíz mediada con Agrobacterium tumefaciens. La Tabla 16 enumera los vectores que fueron construidos para la transformación del maíz. Los siguientes elementos genéticos 20 fueron usados en los vectores que contenían dgt-20 ; el promotor Zea mays Ubiquitina 1 (ZmUbM ; Patente Estadounidense No. 5,510,474) se usó para accionar la secuencia de codificación dgt- 28 que está flanqueada por una región no traducida Zea mays Lipasa 3’ (Zm lip 3’UTR; Patente Estadounidense No. 7179902) , el 25 cartucho marcador seleccionable consiste en el promotor Zea mays Ubiquitina 1 que se usó para accionar la secuencia de codificación aad- 1 (Patente Estadounidense No. 7,838,733) la cual está flanqueada por una región no traducida Zea mays Lipasa 3’. La secuencia de codificación aad- 1 confiere tolerancia a los herbicidas de auxina fenoxi, como, ácido 2 ,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) y a herbicidas ariloxifenoxipropionatos (AOPP).
Los constructos dgt-28 fueron constru idos como vectores binarios estándar y vectores de sistema superbinario Agrobacterium (Japan Tobacco, Tokio, JP) . Los vectores binarios estándar incluyen: pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665 y pDAB107665. Los vectores de sistema superbinario Agrobacterium incluyen pDAB 108384, pDAB108385, pDAB 108386 y pDAB 108387.
Se completaron constructos adicionales que contienen un gen reportero de proteína fluorescente amarilla ( yfp ; Solicitud Patente Estadounidense 2007/0298412). pDAB109812 contiene un cartucho de gen reportero yfp que es accionado por el promotor Zea mays Ubiquitina 1 y flanqueado por la región no traducida Zea mays por 5 3’ (Zm per5 3’UTR; Patente Estadounidense No. 7179902) , el cartucho marcador seleccionable consiste en el promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar (SCBV; Patente Estadounidense No. 5,994, 123) que se usa para accionar la expresión de aad- 7 y está flanqueado por la región no traducida Zea mays Lipasa 3'. pDAB101556 contiene un cartucho de yfp que es accionado por el promotor de Zea mays Ubiquitina 1 y flanqueado por el Zea mays por la región 5 3' no traducida, el cartucho de marcador seleccionadle consiste en el promotor de Zea mays Ubiquitina 1 que se usa para ejecutar la expresión de 5 aad-1 y está flanqueado por la región no traducida de Zea mays Lipasa 3'. pDAB 107698 contiene un cartucho dgt-28 que es accionado por el promotor Zea mays Ubiquitina 1 y está flanqueado por una región no traducida Zea mays Lipasa 3’, un cartucho yfp que fue accionado por el promotor Zea mays ío Ubiquitina 1 y flanqueado por la región no traducida Zea mays por 5 3’ , el cartucho de marcador seleccionadle consiste en el promotor de virus baciliforme de la caña de azúcar que es usado para accionar la expresión de aad-1 y está flanqueado por la región no traducida Zea mays Lipasa 3’. Estos tres constructos 15 son vectores binarios estándar.
Tabla 16. Vectores de Transformación del Maíz 25 Esterilización de mazorca v aislamiento de embrión. Para obtener embriones inmaduros de maíz, plantas de la línea endogámica Zea mays B104 fueron cultivadas en el invernadero y fueron autopolinizados o polinizadas por hermanos para producir mazorcas. Las mazorcas se cosecharon aproximadamente 9 a 12 d ías después de la polinización . En el d ía experimental, la superficie de las mazorcas fue esterilizada mediante inmersión en una solución al 20% de hipoclorito de sodio (5%) y agitada durante 20-30 minutos, seguido de tres enjuagues en agua estéril Después de la esterilización, embriones cigóticos inmaduros (1 .5 a 2.4 mm) fueron diseccionados asépticamente de cada mazorca y distribuidos aleatoriamente en tubos de microcentrífuga conteniendo medios de infección líquidos (Medio LS Basal, 4.43 gm/l; Solución de Vitamina N6 [1000X], 1 .00 ml/l, L-prolina, 700.0 gm/l; Sacarosa, 68.5 gm/l, D( + ) Glucosa, 36.0 gm/l; 10 mg/ml de 2 ,4-D, 150 mI/I). Para un conjunto dado de experimentos, se usaron los embriones agrupados de tres mazorcas para cada transformación.
Iniciación de Cultivo Agrobacterium: Stocks de glicerol de Agrobacterium conteniendo los vectores de transformación binarios descritos líneas arriba fueron sembrados en placas de medio mínimo AB conteniendo antibióticos apropiados y fueron cultivados a 20°C durante 3 a 4 días. U na sola colonia fue recogida y sembrada en placas de YEP conteniendo los mismos antibióticos y fue incubada a 28°C durante 1 a 2 días.
Cultivo y Co-cultivo Agrobacterium. Colonias de Agrobacterium fueron tomadas de la placa YEP, suspendidas en 10 mi de medio de infección en un tubo desechable de 50 mi , y la densidad celu lar se ajustó a OD6oo nm de 0.2-0.4 usando un espectrofotómetro. Los cultivos de Agrobacterium se colocaron en un agitador rotatorio a 125 rpm , a temperatura ambiente, mientras fe realizada la disección de embriones. Embriones cigóticos inmaduros de tamaño entre 1 .5 y 2.4 mm fueron aislados de los granos de ma íz esterilizados y colocados en 1 mi del medio de infección) y lavados una vez en el mismo medio. La suspensión de Agrobacterium (2 mi) fue añadida a cada tubo y los tubos fueron colocados en la plataforma de un agitador durante 10 a 15 minutos. Los embriones fueron transferidos a medios de cocultivo (EM Salts, 4.33 gm/l, L-prolina, 700.0 mg/l; Myo-inositol, 100.0 mg/l; hidrolizado enzímático de caseína 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-Koh , 3.3 mg/l; sacarosa, 30.0 gm/l ; Gelzan™, 3.00 gm/l; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml de AgNo3, 15.0 mg/l; DMSO, 100 pM), orientados con el escutelo hacia arriba e incubados a 25°C , bajo luz las 24 horas a intensidad de luz 50 pinol m 2 seg 1 durante 3 d ías.
Selección de Callos v Regeneración de Eventos Putativos. Tras el período de co-cultivo, los embriones fueron transferidos a medios de reposo (EM Salts, 4.33 g/l de L-prolina; , 700.0 mg/l; 1 ,2, 3, 5/4, 6 - hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l ; MES [(ácido 2 - (N-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0.500 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína 100.0 mg/l ; 30 mM Dicamba-KOH , 3.3 mg/l; Sacarosa, 30.0 gm/l ; Gelzan 2.30 gm/l ; EM-Vitamina Modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 8.5mg/ml AgNo3, 15.0 mgm/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) sin agente selectivo e incubados bajo luz las 24 horas a intensidad de luz de 50 pmoles m 2 seg 1 y a 25°C durante 3 días.
Los experimentos de respuesta de dosificación de inhibición del crecimiento sugirieron que concentraciones de glifosato de 0.25 mM y superiores eran suficientes para inhibir el crecimiento celular en la línea de maíz B104 no transformada . Los embriones fueron transferidos a medios de Selección 1 conteniendo 0.500 mM de glifosato (EM Salts, 4.33 g/l de L-prolina; , 700.0 mg/l; Myo-inositol, 100.0 mg/l; MES [ácido (2 - (N-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0.500 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-KOH , 3.3 mg/l; Sacarosa, 30.0 gm/l; Gelzan™ 2.30 gm/l; EM-Vitamina Modificada [1000X], 1 .00 ml/l ; 8.5mg/ml AgNo3, 15.0 mg/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) e incubados bajo oscuridad y/o ] bajo luz de 24 horas a intensidad de luz 50 pmoles m 2 seg 1 durante 7 a 14 días a 28°C.
Los callos embriogenicos proliferantes se transfirieron a medio Selección 2 conteniendo 1 .0 mM de glifosato (EM Salts, 4.33 gm/l ; 1 ,2 , 3, 5/4, 6 - hexahidroxiciclohexano, 100mg/l; L-prolina, 700.0 mg/l; MES [(ácido 2 - (N-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0.500 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína 100.0 mg/l; 30 mM Dicamba-KOH , 3.3 mg/l; Sacarosa, 30.0 gm/l; Gelzan™ 2.30 gm/l; EM-Vitamina Modificada [1000X] , 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml AgNo3, 15.0 mg/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l; ácido R- haloxifop 0.1810 mg/l), y se incubaron en oscuridad y/o bajo luz 5 las 24 horas con intensidad de luz 50 pmol m 2 seg 1durante 14 días a 28°C. Esta etapa de selección permitió al callo transgenico proliferar y diferenciarse. El período de selección de callo duró de tres a cuatro semanas.
Los callos embriogénicos proliferantes se transfirieron a ío medio PreReg conteniendo 0.5 mM de glifosato (EM Salts, 4.33 gm/l; 1 ,2 , 3, 5/4, 6 - hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l; L-prolina, 350.0 mg/l; MES [(ácido -2-(N-morfolino)-etanosulfónico), ácido libre] 0.250 gm/l; hidrolizado enzimático de caseína 50.0 mg/l; NAA-NaOH 0.500 mg/l; ABA-EtOH 2.50 mg/l ; BA 1 .00 mg/l 2.50 i5 mM Dicamba-KOH, 1 .00 mg/l; Sacarosa, 45.0 gm/l; Gelzan™ 2.50 gm/l; MS-Vitamina Modificada [1000X] , 1 .00 ml/l; 8.5 mg/ml AgNo3, 1 .00 mg/l ; Carbenicilina, 250.0 mg/l), y se incubaron en oscuridad y/o bajo luz las 24 horas con intensidad de luz a 50 pmol m 2 seg 1durante 7 días a 28°C. 0 Callos embriogénicos con yemas similares a brotes se transfirieron a medios de Regeneración conteniendo 0.5 mM de glifosato (EM Salts, 4.33 gm/l; 1 ,2, 3, 5/4, 6 hexahidroxiciclohexano, 100.0 mg/l ; Sacarosa, 60.0 g/l; Gellan Gum G434™ 3.00 gm/l; EM-Vitamina Modificada [1000X] , 1 .00 5 ml/l, Carbenicilina, 125.0 mg/l) y se cultivaron bajo 24 horas de luz a intensidad de la luz 50 micromoles m 2 seg 1 durante 7 días.
Pequeños brotes con raíces primarias se transfirieron a medios de enraizamiento (EM Salts, 4.33 gm/l ; EM-Vitamina Modificada [1000X], 1 .00 ml/l; 1 ,2, 3, 5/4, 6- 5 hexahidroxiciclohexano, 100 mg/l; sacarosa, 60.0 gm/l; Gellan Gum G434™ 3.00 gm/l; Carbenicilina, 250.0 mg/l) en fitobandejas y se incubaron bajo 16/8 horas, de luz/oscuridad a intensidad de luz 140-190 pmoles m 2 seg 1 durante 7 días a 27°C . Plántulas transgenicas putativas fueron analizadas en busca del número de ío copia del transgén usando los protocolos descritos anteriormente y se transfirieron a suelo.
Confirmación Molecular de la Presencia de los transaénes dat-28 v aad-1 dentro de las Plantas de Maíz. La presencia de las secuencias de polinucleótidos dgt-28 y aad- 1 fue i5 confirmada vía ensayos con sonda de hidrólisis. Plantas de maíz T0 aisladas fueron cribadas inicialmente mediante un ensayo de sonda de hidrólisis, análogo a TAQMAN™, para confirmar la presencia de transgénes aad- 1 y dgt-28. Los datos generados a partir de estos estudios se usaron para determinar el número de 0 copia del transgén y se usaron para seleccionar eventos de maíz transgénico para retrocruzamiento y avance a la generación T Se recogieron muestras de tejido en placas de 96 pocilios, la maceración del tejido se realizó con un pulverizador de tejidos KLECO™ y perlas de acero inoxidable (Hoover Precisión 5 Products, Cumming , GA) , en solución amortiguador RLT Qiagen™.
Despues de la maceración del tejido, el ADN genómico fue aislado en formato de alto rendimiento usando el kit de planta Biosprint 96™ (Qiagen , Germantown , MD) según el protocolo sugerido por el fabricante. El ADN genómico fue cuantificado mediante kit de ensayo de ADN Quant-IT™ Pico Green (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). El ADN genómico cuantificado fue ajustado a aproximadamente de 2ng/pL para el ensayo de sonda de hidrólisis usando un manipulador de líquidos automatizado BIOROBOT3000™ (Qiagen , Germantown , MD) . La determinación del número de copia transgén mediante el ensayo de sonda de hidrólisis, análogo al ensayo TAQMAN®, fue realizado por PCR en tiempo real usando el sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, I ndianápolis, I N). Los ensayos fueron diseñados para aad-1 , dgt-28 y una I nvertasa de gen de referencia interna (GenBank Accesión No: U 16123.1 ) usando el LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificación , LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianápolis, I N) fue preparado a concentración final de 1 X en un volumen de 10pL de reacción múltiplex conteniendo 0.4 mM de cada iniciador para aad- 1 y dgt-28 y 0.2 mM de cada sonda (Tabla 17).
Una reacción de amplificación de dos etapas fue realizada con una extensión a 60°C durante 40 segundos con adquisición de fluorescencia. Todas las muestras fueron promediadas y los valores de umbral de ciclo (Ct) se usaron para el análisis de cada muestra. El análisis de datos PCR en tiempo real se realizó usando software LightCycler® versión 1 .5 usando el módulo quant relativo y está basado en el metodo AACt. Los controles incluyeron una muestra de ADN genómico de un de calibrador de copia única y dos copias de control conocido que se incluyeron en cada pasada. La Tabla 18 enumera los resultados de los ensayos de sonda de hidrólisis.
Tabla 17. Las secuencias de iniciador y sonda usados para el ensayo de sonda de hidrólisis de aacf-1 , dgt- 28 y referencia interna (Invertasa).
Tabla 18. T0 resultados de cantidad de copia para eventos dgt- 28. Eventos de baja copia consintieron en 1 -2 copias de transgenes, los números de copia única se enumeran entre paréntesis. Eventos de alta copia contenían 3 o más copias de transgénes.
Ejemplo 11 : Tolerancia al herbicida en maíz transformado dgt-28 A eventos de transformación de Zea mays dgt-28 (Tp) se les permitió aclimatarse en el invernadero y se cultivaron hasta que las plantas transicionaron de tejido de cultivo a condiciones de crecimiento en invernadero (es decir, 2.4 hojas nuevas , de aspecto normal, emergieron de la fronda). Las plantas fueron cultivadas a 27°C bajo condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas fueron entonces tratadas con formulaciones comerciales de DU I NTERVALO DMA™ (que contiene el herbicida glifosato) con la adición de sulfato de amonio al 2% m/v. Las aplicaciones de herbicida se hicieron con un rociador automático a un volumen de rocío de 187 L/ha, altura de rocío de 50 cm. Las plantas fueron rociadas con un I ntervalo de glifosato desde 280 hasta 4480 g de glifosato ae/ha, que es capaz de causar daño significativo a líneas de maíz sin transformar. Una dosis letal se define como la tasa que causa >95% de daño a la B104 endogámicos.
Los resultados de las plantas de maíz T0 dgt-28 demostraron que la tolerancia al glifosato se alcanzó a tasas de hasta 4480 g ae/ha. Un tipo de medio específico se usó en la generación T0 El mínimo retraso en el crecimiento y el crecimiento general de las plantas transformadas en comparación con las plantas de control no transformadas demostraron que dgt-28 proporciona una robusta tolerancia al glifosato cuando se liga a los péptldos de tránsito del cloroplasto TraP5, TraP8 y TraP23.
Plantas seleccionadas T0 son autosembradas o retrocruzadas para una mayor caracterización en la siguiente generación . 100 líneas elegidas de dgt-28 incluyendo a las plantas Ti son rociadas con 140-1 120 g ae/ha de glufosinato o 105-1680 g ae/ha de glifosato. Tanto el marcador seleccionable como el gen resistente al glifosato están incluidos en el mismo plásmido. Por lo tanto, si un gen tolerante al herbicida es seleccionado al rociarlo con un herbicida, se presume que ambos genes están presentes. 14 días después del tratamiento, las plantas resistentes y sensibles se cuentan para determinar el porcentaje de líneas que se segregaron como una sola característica dominante Mendeliana de locus único (3R: 1 S), determinada por un análisis de Chi cuadrada. Estos datos demuestran que dgt-28 es hereditario como un gen robusto de resistencia al glifosato en una especie monocotiledónea . Tasas mayores de glifosato se aplican a las sobrevivientes de J ^ o F-para caracterizar aún más la tolerancia y protección que proporciona el gen dgt-28.
La tolerancia al herbicida post-emerqencia en dat-28 transformó al maíz Tn Los eventos T0 de dgt-28 enlazados con TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23 fueron generados por la transformación de Agrobacterium y se les permitió aclimatarse bajo condiciones controladas de cámara de crecimiento hasta que de 2-4 hojas nuevas, de aspecto normal, habían emergido de la fronda. A las plantas se les asignaron números de identificación individuales y se tomaron muestras para análisis del número de copias tanto de dgt-28 como de aad- 1. Con base en los análisis del número de copias, se seleccionaron plantas para análisis de expresión de proteínas. Las plantas se trasplantaron a macetas más grandes con nuevo medio de cultivo y se cultivaron a 27°C bajo condiciones de 16 horas de luz:8 horas de oscuridad en el invernadero. Las plantas restantes de las que no se tomaron muestras para expresión de proteínas fueron entonces tratadas con formulaciones comerciales de DU I NTERVALO DMA™ (glifosato) con la adición de sulfato de amonio al 2% m/v. Los tratamientos se distribuyeron de modo que cada grupo de plantas contenía eventos T0 con un número variable de copias. Las aplicaciones de herbicida se hicieron con un rociador automático a un volumen de rocío de 187 L/ha, altura de rocío de 50 cm. Las plantas fueron rociadas con un Intervalo de glifosato desde 280 hasta 4480 g ae/ha de glifosato, capaz de causar daño significativo a líneas de maíz sin transformar. Una dosis letal se define como la tasa que causa >95% de daño a la B104 endógama. B104 era el origen genético de las plantas transformadas .
Los resu ltados de las plantas de maíz T0 dgt-28 demostraron que la tolerancia al glifosato se alcanzó hasta a 4480 g ae/ha. Tabla 19. El mínimo retraso en el crecimiento y el crecimiento general de las plantas transformadas en comparación con las plantas de control no transformadas demostraron que dgt-28 proporciona una robusta tolerancia al glifosato cuando se liga a TraP5, TraP8 y TraP23.
Tabla 19. Respuesta de los eventos T0 dgt-28 con número variable de copias a tasas de glifosato de entre 280 y 4480 g ae/ha + sulfato de amonio al 2.0% m/v 14 días después del tratamiento.
Los análisis de expresión de proteínas por medio de un ELISA estándar demostraron un Intervalo de promedios de la proteína DGT-28 de 12.6 a 22.5 ng/cm2 en todas las construcciones probadas.
Confirmación de tolerancia al qlifosato en la generación F baio condiciones de invernadero. Plantas T0 de una sola copia que no fueron rociadas fueron retrocruzadas con el origen B104 no transformado para mayor caracterización en la siguiente generación . En la generación T1 la tolerancia al glifosato fue evaluada para confirmar la herencia del gen dgt-28. Para plantas T i , se aplicó el herbicida ASSURE I I™ (35 g ae/ha de quizalofop-metil) en la etapa de crecimiento V1 para seleccionar para la proteína AAD-1 . Tanto el marcador seleccionable como el gen resistente al glifosato están incluidos en el mismo plásmido. Por lo tanto si se selecciona un gen , se asume que ambos genes están presentes. A 7 d ías después del tratamiento, se contaron las plantas resistentes y sensibles y se retiraron las plantas nulas de la población . Estos datos demuestran que dgt-28 (v1 ) es hereditario como un gen robusto de resistencia al glifosato en una especie monocotiledónea. Se tomaron muestras de las plantas para caracterización de la proteína DGT-28 por ELISA estándar y nivel de transcripción de ARN . Las plantas resistentes fueron rociadas con 560-4480 g ae/ha de glifosato como se describió anteriormente . Los datos demuestran una robusta tolerancia de dgt-28 ligada con los péptidos de tránsito del cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23 hasta 4480 g ae/ha de glifosato. Tabla 20.
Tabla 20. Respuesta de F, dgt-28 con una sola copia a tasas de glifosato de entre 560 y 4480 g ae/ha + sulfato de amonio al 2.0% m/v 14 días después del tratamiento.
Datos de ia expresión de proteínas demuestran un Intervalo de promedios de proteína DGT-28 de 42.2-88.2 ng/cm2 en todos los eventos Ti y construcciones probadas, estableciendo la expresión de proteínas en la generación T^ Caracterización de dgt-28 bajo condiciones de campo.
Eventos de una sola copia fueron enviados a una ubicación en campo para crear semilla tanto hemicigota híbrida como homocigota endógama para caracterización adicional. La semilla híbrida fue creada cruzando eventos T-, en la línea de 5 transformación de maíz B104 con la línea endógama 4XP81 1 generando poblaciones híbridas segregando 1 : 1 (hemicigoto:nulo) para el evento. Las semillas resultantes fueron enviadas a 2 ubicaciones separadas. Un total de cinco eventos con una sola copia por construcción se plantaron en cada ubicación por ío triplicado en un diseño de bloque completo aleatorio. Los campos fueron diseñados para que ocurrieran aplicaciones de glifosato en la etapa de crecimiento V4 y para que a un grupo separado de plantas se les aplicara en la etapa de crecimiento V8. El híbrido convencional 4XP81 1 /B 104 se usó como control negativo. 15 Hileras experimentales fueron tratadas con 184 g ae/ha de ASSU RE I I™ (106 g ai/L quizalofop-metil) para eliminar segregantes nulos. Todas las líneas experimentales se segregaron 1 : 1 (sensibles:resistentes) (p = 0.05) respecto a la aplicación de ASSURE I I™. Se tomaron muestras de plantas 0 resistentes seleccionadas de cada evento para en antificación de la proteína DGT-28 por medio de un ELI SA estándar.
Plantas resistentes al quizalofop-metil fueron tratadas con el herbicida comercial DU I NTERVALO DMA™ (480 g ae/L glifosato) con la adición de sulfato de amonio al 2.5% m/v en la etapa de 5 crecimiento V4 o V8. Las aplicaciones de herbicida se hicieron con un rociador rodante calibrado para depositar un volumen de 187 L/ha, altura de rocío de 50 cm . Las plantas fueron rociadas con un Intervalo de glifosato desde 1 120 hasta 4480 g ae/ha de glifosato, capaz de causar daño significativo a líneas de maíz sin transformar. Una dosis letal se define como la tasa que causa >95% de daño a la 4XP81 1 endógama. Evaluaciones visuales de daños se realizaron para determinar el porcentaje de clorosis visible, el porcentaje de necrosis, el porcentaje de inhibición del crecimiento y el daño total visible a los 7, 14 y 21 días despues del tratamiento. Se compararon las evaluaciones con los controles sin tratar para cada línea y con los controles negativos.
Los datos de daños visibles para todas las evaluaciones demostraron una robusta tolerancia hasta a 4480 g ae/ha de DUI NTERVALO DMA™ en ambas ubicaciones y en ambos momentos de aplicación. Se presentan eventos representativos de la aplicación en V4 de una ubicación y son consistentes con otros eventos, momentos de aplicación y ubicaciones. Tabla 21. Un evento de la construcción que contenía dgt-28 ligado con TraP23 (pDAB107665) fue tolerante a la selección por ASSURE I I™ para la proteína AAD-1 , pero fue sensible a todas las tasas de glifosato aplicadas.
Tabla 21 . Respuesta de los eventos dgt-28 a los que se aplicó un Intervalo de glifosato entre 1 120 y 4480 g ae/ha + sulfato de amonio al 2.5% m/v en la etapa de crecimiento V4.
Se realizaron evaluaciones adicionales durante la etapa de crecimiento reproductivo para la tasa de glifosato de 4480 g ae/ha . Las evaluaciones visuales de panículas, tiempos de polinización y llenado de la mazorca fueron similares a las de los controles sin tratamiento de cada línea para todas las construcciones, momentos de aplicación y ubicaciones. Los resultados cuantitativos para la proteína DGT-28 demostraron un Intervalo de promedios de expresión de proteína de 186.4-303.0 ng/cm2. Los datos demuestran una robusta tolerancia del maíz con dgt-28 transformado bajo condiciones de campo a traves de las etapas de crecimiento reproductivo hasta a 4480 g ae/ha de glifosato. Los datos también demostraron detección y función de la proteína DGT-28 con base en los resultados de tolerancia al rociado.
Confirmación de heredabilidad v tolerancia de dat-28 en el estado homociqótico. Semillas del Ti S2 fueron plantadas bajo condiciones de invernadero como se describió anteriormente. Las mismas cinco líneas de una sola copia que fueron caracterizadas bajo condiciones de campo fueron caracterizadas en el estado homogéneo. Las plantas fueron cultivadas hasta la etapa de crecimiento V3 y separadas en tres tasas de glifosato, desde 1 120 hasta 4480 g ae/ha de glifosato (DUI NTERVALO DMA™) y cuatro réplicas por tratamiento. Las aplicaciones se hicieron con un rociador automático como se describió anteriormente y fueron formuladas en sulfato de amonio al 2.0% m/v. Una aplicación de sulfato de amonio sirvió como un control sin tratamiento para cada línea . Las evaluaciones visuales se realizaron 7 y 14 días después del tratamiento, como se describió anteriormente. Los datos demostraron una tolerancia robusta hasta a 4480 g ae/ha de glifosato para todos los eventos examinados. Tabla 22.
Tabla 22. Respuesta de los eventos dgt-28 homocigóticos a los que se aplicó un Intervalo de glifosato entre 1 120 y 4480 g ae/ha + sulfato de amonio al 2.0% m/v.
La línea de pDAB107665 que no fue tolerante bajo condiciones de campo no demostró tolerancia al glifosato y es por tanto consistente con las observaciones de campo (los datos no se muestran). Con excepción de la línea previamente mencionada, todas las réplicas que fueron tratadas con glifosato de las líneas no fueron sensibles al glifosato. Por lo tanto, los datos demuestran heredabilidad a una población homogénea de maíz dgt-28 de una manera mendeliana. La expresión de la proteína DGT-28 por medio de un ELISA estándar demostró un Intervalo de promedios de expresión de proteína de 27.5-65.8 ng/cm2 a lo largo de eventos de una sola copia que eran tolerantes al glifosato. Los datos demuestran proteínas funcionales y estabilidad de la proteína DGT-28 a lo largo de las generaciones.
Ejemplo 12: Tolerancia al herbicida post-emergente uso de glifosato como marcador seleccionable Como se describió anteriormente, plantas T0 transformadas fueron movidas de cultivo de tejidos y aclimatadas en el invernadero. Los eventos probados contenían dgt-28 ligado a los peptidos de transporte del cloroplasto TraP5, TraP8 y TraP23. Se demostró que estas plantas T0 proporcionaban robusta tolerancia hasta a 4480 g ae/ha de glifosato, y las plantas no transformadas fueron controladas con glifosato a concentración tan baja como 280 g ae/ha . Estos datos demuestran que dgt-28 puede ser usado como un marcador seleccionable usando una concentración de glifosato en el Intervalo de 280-4480 g ae/ha .
Cierta cantidad de semillas de líneas de maíz fijas que contienen el transgén dgt-28 son incluidas en una cantidad de semillas de maíz no transformadas. Las semillas son plantadas y se les permite crecer hasta la etapa de desarrollo V1 -V3, momento en donde las plántulas son rociadas con una dosis de selección de glifosato en el I ntervalo de 280-4480 g ae/ha. Después de 7-10 días, las plantas sensibles y resistentes son contadas, y la cantidad de plantas tolerantes al glifosato muestra correlación con el número original de semillas transgenicas que contienen el transgén dgt-28 que son plantadas.
Ejemplo 13: Acumulación de maíz dgt-28 La proteína AAD-1 se usa como el marcador seleccionable en maíz transformado dgt-28 para propósitos de investigación. El gen aad-1 también puede ser usado como una característica de tolerancia a herbicidas en el maíz para proporcionar una tolerancia robusta 2,4-D hasta a una aplicación V8 en un cultivo. Cuatro eventos de las construcciones pDAB107663 (TraP4: :dgt-28), pDAB 107664 (TraP8: \dgt-28) y pDAB107666 (TraP5 wdgt-28) fueron caracterizados para la tolerancia de una aplicación de una mezcla en tanque de glifosato y 2,4-D. El estudio de caracterización fue completado con semillas F! bajo condiciones de invernadero. Las aplicaciones se hicieron en un rociador automático como se describió anteriormente a las siguientes tasas: 1 120-2240 g ae/ha de glifosato (seleccionador para el gen dgt-28), 1 120-2240 g ae/ha de 2 ,4-D (seleccionador para el gen aad- D, o una mezcla en tanque de los dos herbicidas a las tasas descritas. Las plantas fueron evaluadas 7 y 14 d ías después del tratamiento. Los resultados del rocío para aplicaciones de herbicidas a 2240 g ae/ha se muestran en la Tabla 23.
Tabla 23. Respuesta de maíz Fi aad- 1 y dgt-28 rociados con 2240 g ae/ha de 2,4-D, glifosato y una combinación en tanque de los dos herbicidas 14 días después del tratamiento.
Los resultados confirman que dgt-28 puede ser acumulado exitosamente con aad- 1 , incrementando así el espectro de herbicidas que pueden ser aplicados al cultivo en cuestión (glifosato + ácidos fenoxiaceticos para dgt-28 y , aad- 1 , respectivamente). En producción de cultivos donde existen hierbas de hojas anchas difíciles de controlar o biotipos de hierbas resistentes, la acumulación puede usarse como un modo de controlar hierbas y proteger el cultivo en cuestión. Características adicionales de entrada o salida también pueden acumularse con el gen dgt-28 en el maíz y otras plantas.
Ejem plo 14: Transformación de otros cultivos Cultivos adicionales son transformados usando téenicas conocidas. Para transformación de centeno por medio de Agrobacterium , ver p.e. , Popelka JC , Xu J, Altpeter F. , “Generación de centeno con bajo número de copias de transgén después de transferencia biolística de genes y producción de plantas (Secale cereale L.) de centeno transgénico instantáneamente libre de marcadores”, Transgenic Res. 2003 Oct; 12(5) :587-96.) . Para transformación de sorgo por medio de Agrobacterium , ver, p.e. , Zhao et. al., "Transformación de sorgo por medio de agrobacterium", Plant Mol Biol. 2000 Dic;44(6):789-98. Para transformación de cebada por medio de Agrobacterium, ver, p.e. , Tingay et. al., “Transformación de cebada por medio de agrobacterium tumefaciens”, The Plant Journal, (1997) 1 1 : 1369— 1376. Para transformación de trigo por medio de Agrobacterium, ver, p.e., Cheng et. al., “Transformación genética de trigo por medio de agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiol. 1997 Nov; 1 15(3) :971 -980. Para transformación de arroz por medio de Agrobacterium, ver, p.e. , Hiei et. al., "Transformación de arroz por medio de agrobacterium tumefaciens”, Plant Mol Biol. 1997 Sep;35(1 -2):205-18.
Otras técnicas de transformación (no con Agrobacterium) son usadas para transformar dgt-28, dgt- 32, o dgt- 33, por ejemplo, en el maíz (Zea mays) , trigo ( Triticum s p p . ) , arroz ( Oryza spp. y Zizania spp.), cebada ( Hordeum spp.) , algodón ( Abroma augusta y Gossypium spp.) , frijol de soya ( Glycine max), remolacha azucarera y común ( Beta spp.) , caña de azúcar ( Arenga pinnata), tomate ( Lycopersicon esculentum y otras spp. , Physalis ixocarpa, Solanum incanum y otras spp. , y Cyphomandra betacea ) , papa ( Solanum tuberosum) , batata ( Ipomoea batatas), centeno ( Secale spp.), Chiles ( Capsicum annuum, Chínense, y frutescens), lechuga ( Lactuca sativa, perennis, y pulchella), col (Brassica spp.), apio ( Apium graveolens) , berenjena ( Solanum melongena), cacahuate ( Arachis hypogea), sorgo ( Sorghum spp.), alfalfa ( Medicago sativa), zanahoria ( Daucus carota) , frijoles ( Phaseolus spp y otros generos) , avena ( Avena sativa y strigosa) , chícharos ( Pisum , Vigna, y Tetragonolobus spp.), girasol ( Helianthus annuus), calabaza ( Cucúrbita spp.) , pepino ( Cucumis sativa) . Tabaco ( Nicotiana spp.), arabidopsis ( Arabidopsis thaliana), césped ( Lolium , Agrostis, Poa, Cynodon, y otros géneros), trébol ( Trifolium) , arvejas (Vicia).
La resistencia al glifosato conferida por dgt-28, dgt-32 y dgt-33 aumenta la aplicabilidad de herbicidas de glifosato para su uso en temporada en muchos sistemas caducifolios y perennes de explotación de madera . Las especies madereras resistentes a herbicidas de glifosato aumentan la flexibilidad en el uso de estos herbicidas desde el aire sin preocuparse por daños. Por lo tanto, dgt-28, dgt-32 y dgt-33 son transformados a las especies madereras: aliso ( Alnus spp.), fresno ( Fraxinus spp.), especies de álamos y chopos ( Populus spp.), haya ( Fagus spp.), abedul ( Betula spp.), cerezo ( Prunas spp.), eucalipto ( Eucalyptus spp.), nogal americano ( Carya spp.), arce (Acer spp.) , roble ( Quercus spp.), y pino ( Pinus spp.) .
La resistencia a herbicidas de glifosato aumenta la aplicabilidad de herbicidas de glifosato para el control selectivo de hierbas en especies ornamentales y frutales. Así, dgt-28, Dgt-32 y/o dgt-33 son transformados en las especies ornamentales y frutales: rosa ( Rosa spp.), evónimo (Euonymus spp.), petunia ( Petunia spp. ), begonia ( Begonia spp.) , rododendro ( Rhododendron spp. ), manzana silvestre o manzana ( Malus spp.) , pera ( Pyrus spp.), durazno ( Prunus spp.), y calendula ( Tagetes spp.).
Ejemplo 15: Combinación con otros rasgos genéticos Los cultivos transgénicos resistentes a insectos (Rl) comprenden principalmente variedades de maíz, soja y algodón presentes en Norteamérica y su uso se está extendiendo a otros puntos del planeta. Varias empresas productoras de semillas han desarrollado productos transgénicos comerciales que combinan características de resistencia a insectos y tolerancia a los herbicidas, incluyendo rasgos de Bacillus thuringiensis (por ejemplo, toxinas Bt citadas en el listado de la página Web lifesci.sussex.ac.uk, 2006), rasgos de resistencia a insectos sin toxinas Bt y alguno o todos los rasgos de tolerancia a herbicidas mencionados anteriormente. La capacidad de controlar varios tipos de plagas a traves de características Rl es un valioso concepto comercial. No obstante, la conveniencia de este concepto se verá limitada si el control de malezas y el control de insectos son independientes entre sí.
A las mutaciones dgt-28, dgt- 31 o dgt- 32, por sí mismas o en combinación con uno o más rasgos adicionales de tolerancia a herbicidas, se insertan uno o varios rasgos agronómicos adicionales (como resistencia a insectos, resistencia a hongos o tolerancia al estrés y otros) (ver www.isb.vt.edu), bien sea mediante la mejora convencional o de manera conjunta dentro de un proceso de transformación completamente nuevo. El rasgo o rasgos resistentes a insectos se combinan con dgt- 28, dgt- 31 , dgt- 32, o dgt- 33. Tras obtener una secuencia de codificación de un rasgo Rl , se añaden elementos de expresión génica (por ejemplo promotor, intrón , 3’UTR, etcétera) y se hace una inserción molecular de dgt- 28, dgt- 31 , dgt- 32, o dgt- 33 al rasgo Rl , recurriendo a métodos de ADN recombinante.
Los rasgos Rl incluyen : Cry1 F (Patentes Estadounidenses Nos. 5, 126, 133; 5, 188,960; 5,691 ,308; 6,096,708; 6,573,240 y 6, 737,273), Cry1A(c) (Patentes Estadounidenses Nos. 6, 1 14, 1 38; 5,710.020; 6,251 ,656 y 6,229,004) , Cry1 F y Cry1 A(c) como triple inserción de dgt- 28 , dgt- 31 , dgt- 32 o dgt-33, Cry34Ab(1 ) (Patentes Estadounidenses Nos. 7,323,556; 7,897,342; 7,888,495; 7,875,430; 7,932,033; 7,956,246; 6,340.593), Cry35 Ab(1 ) (Patentes Estadounidenses Nos. 6,340.593; 7,323,556; 7,897,342 ; 7,888,495; 7,875,430; 7,932,033; 7,956,246), y/o Cry35Ab(1 ) y Cry 34Ab( 1 ) como triple inserción de dgt- 28, dgt-31 , dgt- 32 y/o dgt- 33.
Algunos de los beneficios incluyen un mejor control de malezas, aportado por las mutaciones dgt- 28, dgf-31 , dgt- 32 , o dgt-33 y descrito en ejemplos anteriores, junto con la capacidad de manejar plagas de insectos y/u otros problemas agronómicos. Las plantas que contienen tales rasgos combinados con dgt- 28, dgt- 31 , dgt- 32, y/o o dgt-33 ofrecen un completo paquete agronómico de cosechas de mejor calidad y la capacidad de controlar de manera flexible y económica cualquier cantidad de problemas agronómicos. Los rasgos combinados de resistencia a insectos y tolerancia a herbicidas pueden aplicarse en la mayoría de cultivos de horticultura, ornamentales y forestales.
La combinación de dgt- 28, dgt- 31 , dgt- 32 , o dgt-33 y la correspondiente tolerancia a herbicidas y resistencia a insectos alcanzadas por varios genes resistentes a insectos, Bt o no Bt, puede aplicarse a todas las especies de cultivos enumeradas en este documento. El uso en tales cultivos de alguno de los herbicidas comerciales que aquí se mencionan es posible gracias a la transformación de dgt-28, dgt-3 \ , dgt- 32, o dgt-33 y la inserción del rasgo correspondiente de TH o Rl , bien sea a traves de métodos convencionales de mejora o de la ingeniería genética. Las tasas específicas de aplicación de herbicidas que contengan los compuestos químicos mencionados se establecen a partir de las etiquetas de herbicidas compiladas en el libro CPR (Crop Protectlon Reference) o similar, compilaciones en l ínea de etiquetas (por ejemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) o cualquier guia comercial o academica de cuidado de cultivos, como la guía Crop Protection Guide de Agriliance (2005).
Ejemplo 16: Rasgo DGT combinado con un rasgo AAD en cualquier cultivo Al combinar un rasgo dgt con un rasgo aad (por ejemplo, aad-1, descrito en la Patente Estadounidense 7, 838, 733; o aad-12, descrito en la Publicación de Patentes I nternacionales del PCT No. WO 2007/053482 A2), mediante la mejora convencional o de manera conjunta dentro de un proceso de transformación completamente nuevo, se mejoran la eficacia del control de maleza, la flexibilidad, y la capacidad para manejar cambios en la maleza y el desarrollo de resistencia a herbicidas.
La transformación de los cultivos mediante el uso de aad-1 permite que el productor aplique herbicidas de ariloxialcanoicos de manera selectiva en cultivos de plantas monocotiledóneas. Tales cultivos tendrán un mayor margen de seguridad en cuanto a la exposición a fenoxi auxina. Adicionalmente, los herbicidas de tipo fenoxi-auxina pueden aplicarse selectivamente en cultivos de plantas dicotiledóneas transformadas con aad-1. La transformación de los cultivos mediante el uso de aad-12 permite que el productor aplique herbicidas de tipo piridiloxi auxina y ariloxialcanoicos de manera selectiva en cultivos de plantas dicotiledóneas para controlar las especies de maleza. Al dgt- 28, dgt- 31 , dgt- 32 , o cfgf-33 con los rasgos aad-1 o aad- 12 es posible ofrecer a los productores un I ntervalo más amplio de herbicidas para el control de malezas. Además, el uso de combinaciones de herbicidas implica mayor flexibilidad al tratar la resistencia a los herbicidas de varias especies de maleza.
Una planta de la especie monocotiledónea o dicotiledónea en la que se han insertado rasgos dgt y aad tendrá las siguientes opciones para el control de malezas: A. Aplicación de glifosato a una tasa estándar de tratamiento post-emergencia (420 a 2160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha) para el control de la mayoría de las especies de maleza gramíneas y de hoja ancha. Los rasgos dgt pueden permitir tolerancia a estas tasas de aplicación de glifosato. Para el control de malezas de hoja ancha resistentes al glifosato como la Conyza canadensis o malezas difíciles de controlar con glifosato (por ejemplo Commelina spp), se aplican 280 a 2240 g ae/ha (por ejemplo, 560 a1 120 g ae/ha) de 2,4-D de forma secuencial , mezclado en tanques o como premezcla con glifosato para mayor control. Los rasgos aad-1 y aad- 12 proporcionan tolerancia al 2 ,4-D. Además, el aad-12 tolera herbicidas de tipo piridiloxi auxina como triclopir y fluroxipir. Los herbicidas de tipo piridiloxi auxina se aplican para controlar malezas resistentes al glifosato como la Conyza canadensis y la Comme na spp. En el caso de triclopir, las tasas de aplicación suelen oscilar entre 70 y ? 1 120 g ae/ha, por ejemplo, 140 a 420 g ae/ha. En el caso de fluroxipir, las tasas de aplicación suelen oscilar entre 35 y 560 g 5 ae/ha, por ejemplo, 70 a 280 g ae/ha. ! B . Aplicación de glifosato a una tasa estándar de tratamiento post-emergencia (420 a 2160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha) para el control de la mayoría jle las especies de maleza gramíneas y de hoja ancha. Para controlar especies ío de malezas g ramíneas resistentes al glifosato como la Lolium rigidum o Eleusine indica, se aplican de 10 a 200 g ae/ha (por ejemplo, de 20 a 100 g ae/ha) de quizalofop de fo|rna secuencial, mezclado en tanques o como premezcla con glifosato para un control eficaz. El aacf-1 proporciona toleranci^i al quizalofop. 15 La inserción del rasgo aacf-1 junto con dgt- 28, dgt- 31 , dgt- 32, o dgt- 33 en especies de cultivo da como rebultado plantas tolerantes a los herbicidas descritos anteriormente.
C. El glifosato es eficaz para el control ¿le especies de malezas gramíneas además de las especies de hoja ancha. La 20 inserción de aad- 1 y dgt- 28, dgt-3† , dgt- 32, o dgt- 33 permite la aplicación de tasas de glifosato eficaces para el tratamiento de gramíneas (105 a 840 g ae/ha, por ejemplo, 210 420 g ae/ha). Posteriormente se aplica 2,4-D (280 a 2240 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha) de forma secuencial, mezclado en tanques o 25 como premezcla con tasas eficaces de glifosato para el tratamiento de gramíneas, con el fin de garantizar el nivel necesario de control de malezas de hoja ancha. Para un mejor control de malezas gramíneas y/o para retrasar la formación de malezas resistentes al glifosato se usa un herbicida AOPP como quizalofop en preparación 10 a 200 g ae/ha (por ejemplo, 20 a 100 g ae/ha y 20 a 35 g ae/ha). La baja tasa de glifosato tambien proporciona algunos beneficios para el control de malezas de hoja ancha, aunque la fuente principal de control proviene del 2,4-D.
D. De manera similar, la inserción de rasgo s aad- 12 y dgt- 28, dgt-2>'\ , dgt- 32, o dgt-33 permite la aplicación de tasas eficaces de glifosato para el tratamiento de gramíneas (105 a 840 g ae/ha, por ejemplo, 210 a 420 g ae/ha). Posteriormente se aplica 2,4-D (280 a 2240 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha) de forma secuencial, mezclado en tanques o como premezcla con tasas de glifosato eficaces para el tratamiento de gramíneas para garantizar el nivel necesario de control de í malezas de hoja ancha. Los herbicidas de triclopir y fluroxipir usados en los niveles señalados anteriormente también son componentes aceptables del programa de tratamiento. La baja tasa de glifosato proporciona asimismo algunos beneficios para el control de malezas de hoja ancha, aunque la fuente principal de control proviene del 2 ,4-D, triclopir o fluroxipir.
La transformación del rasgo aací-12 en los cultivos facilita el uso de uno o más herbicidas comerciales de ariloxi auxina, solos o combinados, de forma secuencial o independiente. De manera similar, el rasgo aad- 1 facilita el uso de uno o más herbicidas comerciales de tipo fenoxi auxina, solos o combinados, de forma secuencial o independiente, con uno o varios herbicidas comerciales de tipo AOPP. La combinación de cualquiera de estos rasgos con los rasgos dgt- 28, dgrf-31 , dgt- 32, o dgt- 33 permite un mejor tratamiento de las especies de maleza. Las tasas específicas de aplicación de herbicidas que contengan estos compuestos qu ímicos se establecen a partir de las etiquetas de herbicidas compiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o similar, compilaciones en línea de etiquetas (por ejemplo cdms.net/manuf/manuf.asp) o cualqu ier guía comercial o academica de cuidado de cultivos, como la guía Crop Protection Guide de Agril iance (2005) .
Ejemplo 17: Rasgo DGT apilado con rasgo AHAS en cualquier cultivo Los rasgos que codifican la tolerancia a los herbicidas de tipo imidazolinona (AHAS) se encuentran presentes actualmente en varios cultivos de Norteamérica, entre los que se incluyen maíz, arroz, girasol y trigo. Se han estado desarrollando otros cultivos tolerantes a la imidazolinona (por ejemplo algodón y remolacha azucarera. Actualmente se están usando varios herbicidas de tipo imidazolinona (por ejemplo, imazamox, imazetapir, imazaqum e imazapic) en varios cultivos tradicionales. La inserción de rasgos de tolerancia a la ¡midazolinona como el rasgo AHAS ha facilitado el uso de imazetapir, imazamox y el imazapir no selectivo. Hasta el momento, los cultivos tolerantes a herbicidas de tipo ¡midazolinona tienen la ventaja de ser no-transgenicos. Este tipo de compuestos tiene también una actividad residual significativa en el suelo, por lo que el control de malezas va más allá del periodo de aplicación, a diferencia del glifosato o compuestos basados en gl ufosinatos. No obstante, el Intervalo de malezas controladas a través de los herbicidas de tipo ¡midazolinona no es tan amplio como aquel del glifosato (Agriliance, 2003).
Adicionalmente, los herbicidas de tipo ¡midazolinona actúan de una forma (inhibición de acetolactato sintasa, ALS) a la que varias malezas han creado resistencia (Heap I (2004). Encuesta internacional de malezas resistentes a herbicidas, disponible en www.weedscience.com).
Al insertar dgt-28, dgt-31, dgt-32 o dgt-33 con un rasgo de tolerancia a la ¡midazolinona, mediante la mejora convencional o de manera conjunta como un proceso de transformación completamente nueva, se mejoran la eficacia del control de maleza, la flexibilidad , y la capacidad para manejar cambios en la maleza y el desarrollo de resistencia a los herbicidas.
Una planta de la especie monocotiledónea o dicotiledónea en la que se han insertado un rasgo dgt y un rasgo de tolerancia a la ¡midazolinona tendrá las siguientes opciones para el control de malezas: A. Aplicación de imazetapir a una tasa estándar de tratamiento post-emergencia (35 a 280 g a e/ha, por ejemplo, 70 a 140 g ae/ha) para el control de varias especies de maleza gramíneas y de hoja ancha. i) Las malezas de hoja ancha resistentes al inhibidor de ALS como el Amaranthus rudis, Ambrosia trífida, Chenopodium álbum (entre otras, Heap, 2004), se controlan mezclando glifosato en tanques a 420 a 2160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha. ii) Las especies de hoja ancha inherentemente más tolerantes a los herbicidas de tipo imidazolinona como la Ipomoea spp. pueden controlarse mezclando glifosato en tanques en preparaciones de 420 a 2160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha . iii) Las especies de hoja ancha resistentes al inhibidor de ALS como el Sorghum halepense and Lolium spp. pueden controlarse mezclando glifosato en tanques en preparaciones de 420 a 2160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha. iv) Las especies de hoja ancha inherentemente tolerantes (por ejemplo, Agropyron repens) pueden controlarse mezclando glifosato en tanques en preparaciones de 420-2160 g ae/ha, por ejemplo, 560 a 1 120 g ae/ha.
La transformación del dgt- 28, dgt-28, dgt-31 , dgt-32, o dgt-33 y su combinación con cualquier rasgo de tolerancia a la imidazolinona, mediante la mejora convencional o la ingeniería genetica facilita el uso de alguno de los herbicidas comerciales de tipo imidazolinona o glifosato, solos o en varias combinaciones. Las tasas específicas de aplicación de herbicidas que contengan estos químicos se establecen a partir de las etiquetas de herbicidas compiladas en el libro CPR (Crop Protection Reference) o similar, compilaciones en línea de etiquetas (por ejemplo cdms. net/manuf/manuf.asp) o cualquier guía comercial o académica de cuidado de cultivos, como la guía Crop Protection Guide de Agriliance (2005).
Ejemplo 18: Transformación de la soja La soja transgénica (Glycine max) que contiene un transgénico dgt-28 integrado de forma estable se genera a través de una transformación mediada por Agrobacterium de explantes de cotiledones de soya. Se usa una cepa desarmada de Agrobacterium que lleva un vector binario que contiene un dgt-28 funcional para iniciar la transformación.
La transformación mediada por Agrobacterium se lleva a cabo mediante el uso de un procedimiento de medio nudo de cotiledón de Zeng et al. (Zeng P. , Vadnais D.A., Zhang Z. , Polacco J .C. , (2004), Plant Cell Rep. , 22(7) : 478-482). En pocas palabras, las semillas de soja (cv. Maverick) germinan en los medios básales y los nudos de cotiledones se aíslan y se infectan con Agrobacterium. La iniciación de los brotes, la elongación de los brotes y los medios de enraizamiento se complementan con cefotaxima, vancomicina y timentin para la eliminación de Agrobacterium . La selección a traves de un herbicida se usa para inhibir el crecimiento de los brotes no transformados. Los brotes seleccionados se transfieren a medio de enraizamiento para el desarrollo de la raíz y su posterior transferencia a una mezcla de tierra para la aclimatación de las plántulas.
Folíolos terminales de las plántulas fueron tratados por vía tópica (hoja téenica de pintura) con un herbicida para detectar supuestas transformantes. Las plántulas seleccionadas fueron transferidas al invernadero, permitidos para aclimatarse y después la hoja pintada con un herbicida para reconfirmar la tolerancia. Se muestrearon estas supuestas transformado a las plantas y los análisis moleculares fueron usados para confirmar la presencia del marcador seleccionable herbicida y el transgén dgt-28. Las plantas permitieron a si mismo fertilizar en el invernadero para producir semilla de Tj.
Se puede usar un segundo método de transformación de la soja para producir plantas transgénicas de soja adicionales. Se usa una cepa desarmada de Agrobacterium que lleva un vector binario que contiene un dgt-28 funcional para iniciar la transformación.
La transformación mediada por Agrobacterium se lleva a cabo mediante el uso de un procedimiento de media-semilla de Paz et al . , (Paz M . , Martínez J . , Kalvig A. , Fonger T. , and Wang K. , (2005) Piant Cell Rep., 25: 206-213) . Durante un periodo breve, las semillas maduras de soja se esterilizan durante la noche con gas de cloro y se las embebe con H20 estéril veinte horas antes de la transformación de las plantas mediada por Agrobacterium. Las semillas se cortan por la mitad con un corte longitudinal a lo largo del hilo para separar la semilla y retirar la cubierta de la semilla. El eje embrionario se escinde y los brotes/capullos axiales se eliminan del nodo cotiledonar. Los explantes de media semilla resultantes son infectados con Agrobacterium . La iniciación de los brotes, la elongación de los brotes y los medios de enraizamiento se complementan con cefotaxima , vancomicina y timentin para la eliminación de Agrobacterium. La selección a través de un herbicida se usa para inhibir el crecimiento de los brotes no transformados. Los brotes seleccionados se transfieren a medio de enraizamiento para el desarrollo de la raíz y su posterior transferencia a una mezcla de tierra para la aclimatación de las plántulas.
Se realiza un procedimiento de muestreo y de análisis molecular de estas plantas putativas T0 con el fin de confirmar la presencia del marcador herbicida seleccionable como también la presencia del transgénico dgt-28. Se permite que las plantas T0 se auto fertilicen en el invernadero para producir semillas T ^ .
Confirmación de la heredabilidad del dgt-28 a la generación 11. La heredabilidad de la proteína dgt-28 en la generación T 1 se evaluó en una de dos maneras. El primer método incluye la siembra de semillas T-, en los medios “Metro- M ix” y la aplicación de 41 1 g ae/ha IGN ITE™ 280 SL en plantas germinadas en la primera fase trifoliada de crecimiento. El segundo metodo consistió en homogeneizar semilla por un total de 8 repeticiones usando un cojinete de bolas y un moledor tipo “genogrinder”. Después se usaron pruebas de tira de ELISA de la proteína PAT para detectar eventos hereditarios ya que el marcador de elección se encontraba en el mismo plásmido que el dgt-28. En cualquiera de los métodos si se determinó que una sola planta era tolerante al glufosinato o se detectó con la prueba de tira de ELI SA para PAT, se consideró que el evento demostró la heredabilidad para la generación Un total de cinco constructos fueron revisados con relación a la heredabilidad como se describió anteriormente. Los plásmidos con contenido de dgt-28 vincularon con TraP4, TraP8 y TraP23. Los eventos que cruzaron a través de los constructos demostraron un 68% de la heredabilidad de la proteína PAT: : DGT-28 a la generación Tt .
Tolerancia a herbicidas post-emergencia en soja T posterior transformada por dgt-28. Las semillas de eventos T-, que se determinaron como heredables mediante los métodos de selección descritos anteriormente se sembraron en medios “Metro-Mix” bajo condiciones de invernadero. Las plantas se cultivaron hasta que la primera trifoliada se expandiera completamente y se las trató con 41 1 g ea / ha IGNITE™ 280 SL para la selección del gen pat como se describió previamente. A las plantas resistentes provenientes de cada evento se les dio identificadores únicos y se tomaron muestras para análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos sobre cigosidad se usaron para asignar replicas de 2 hemicigotos y 2 homocigotos para cada tasa de glifosato aplicado, permitiéndose un total de 4 réplicas por tratamiento cuando se tenían en existencia suficientes plantas. Estas plantas se compararon “del tipo salvaje Peq ueña Habana tabaco”. Todas las plantas fueron sometidas a rociado mediante un pulverizador de pista fijado en 187 L/ ha. Las plantas se rociaron dentro de un I ntervalo de 560-4480 g ea/ha de sal dimetilamina (DMA) DU I NTERVALO ™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con la adición de 2% w/v de sulfato de amonio (AMS). Las plantas se evaluaron a los 7 y 14 días después del tratamiento. Se asignó una calificación de daño a las plantas con respecto a su retraso en el crecimiento global visual, la clorosis y la necrosis. La generación T se constituye en un factor de segregación, por lo que se espera alguna respuesta variable debido a diferencias en cigosidad.
Tabla 24. Los resultados del rociado demuestran a los 14 días (después del tratamiento) la tolerancia robusta hasta 4480 g ae/ha de glifosato de al menos un evento dgt-28 por constructo caracterizado. Todos los eventos representativos de copia única de los constructos proporcionan una tolerancia de hasta 4480 g ae/ha en comparación con el control negativo Maverick.
Protección de dgt-28 contra las tasas elevadas de glifosato en la generación T . Una prueba de progenie en 45 plantas se llevó a cabo en dos a cinco líneas T2 de dgt-28 por constructo. Las líneas homocigóticas se eligieron en base a los análisis cigosidad completados en la generación anterior. Se plantaron las semillas como se describió previamente. Las plantas se rociaron con 41 1 g ea/ha de IGNITE 280 SL para la selección del marcador seleccionable PAT como se ha descrito previamente. Despues de 3 d ías después del tratamiento, se contaron las plantas resistentes y las sensibles.
Para constructos que contienen TraP4 vinculado con dgt-28 (pDAB107543 y pDAB 107548) , nueve de las doce líneas puestas a prueba no segregaron, confirmando así la presencia de líneas homogéneas en la generación T2. Las líneas que contienen TraP8 vinculado con dgt-28 (pDAB107545) mostraron que dos de las cuatro líneas no tenían segregantes y se demostró la herencia mendeliana a través de al menos dos generaciones de dgt-28 en la soja. Se tomaron muestras de tejido de las plantas resistentes y la proteína DGT-28 fue cuantificada por métodos estándar de ELISA. Los datos demostraron un I ntervalo promedio de proteína DGT-28 de 32 ,8 a 107.5 ng/cm2 para las líneas T2 no segregantes puestas a prueba. Las líneas del constructo pDAB107553 (TraP23 ::dgt-28) no fueron seleccionadas previamente con glufosinato, y la respuesta a la dosis de glifosato se usó tanto como prueba de homogeneidad y tolerancia a las altas tasas de glifosato. Réplicas de las líneas del constructo pDAB107553 fueron tolerantes a tasas que se encuentran en un Intervalo que va desde 560 hasta 4480 g ae/ha de glifosato, y por lo tanto se confirmaron como una población homogénea y heredable por al menos dos generaciones.
Tasas de DU I NTERVALO DMA que van desde 560 a 4480 g ae/ha de glifosato se aplicaron a la soja trifoliada 2-3 como se ha descrito previamente. Los datos visualmente recogidos sobre daños a los 14 días despues del tratamiento confirmaron los resultados de tolerancia que se demostraron en la generación Ti Tabla 25. Los datos demuestran una tolerancia robusta del tabaco sometido a dgt-28 en niveles de hasta 3360 g ae/ha de glifosato a lo lardo de dos generaciones, en comparación con el control no transformado.
Ejemplo 19 Transformación de arroz con dgt-28 En un metodo ejemplar, el arroz transgénico (Oryza sativa) que contiene un dgt-28 integrado de forma estable se genera a través de la transformación mediada por Agrobacterium de las semillas esterilizadas de arroz. Se usa una cepa desarmada de Agrobacterium que lleva un vector binario que contiene un dgt-28 para iniciar la transformación .
Los medios de cultivo se ajustan a un pH de 5,8 con M KOH 1 M y se solidifican con 2.5 g/l de Phytagel (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO) . Los callos embriogénicos se cultivan en matraces cónicos de 100 x 20 mm que contenían 30 mi de medio semisólido. Las plántulas de arroz se cultivan en un medio de 50 mi en cajas MAGENTA. Las suspensiones celulares se mantienen en matraces cónico de 125 mi que contienen 35 mi de medio líquido y que rotan 125 revolucione por minuto. La inducción y el mantenimiento de cultivos embriogénicos se producen en un ambiente de oscuridad a 25-26°C, y la regeneración de las plantas y del cultivo de plantas enteras se lleva a cabo en habitaciones iluminadas con un fotoperíodo de 16-h (Zhang et al. 1996).
La inducción y el mantenimiento de los callos embriogénicos se realizan en un medio basal N B modificado, como se ha descrito anteriormente (Li et al. 1993) , en donde los medios se adaptan para contener 500 mg/l de glutamina. Los cultivos en suspensión son iniciados y mantenidos en medio líquido SZ (Zhang et al. 1998) con la inclusión de 30 g/L de sacarosa en lugar de la maltosa. El medio osmótico (N BO) consiste en medio NB con la adición de 0.256M tanto de manitol como de sorbitol. Los callos resistentes a los herbicidas se seleccionan en un 5 medio NB suplementado con el agente herbicida de elección que sea apropiado durante 3-4 semanas. La pre-regeneración se lleva a cabo en un medio (PRH50) que consiste de un medio N B con ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D), 1 mg/l de ácido a- naftalenacético (NAA) , 5 mg / I de ácido abscísico (ABA) y el ío herbicida de elección por 1 semana. La regeneración de plántulas después del cultivo en medio de regeneración (RN H50) que comprende un medio NB que contiene 2,4-D, 0.5 mg / I , de NAA, y herbicida de elección hasta putativamente los brotes transgénicos se regeneren. Los brotes se transfieren a un medio de 15 enraizamiento con sales básales Murashige y Skoog de potencia media y vitaminas B% de Gambor, todo esto suplementado con 1 % de sacarosa y herbicida de elección .
Las semillas maduras desecadas de Oryza sativa L. japónica cv. Taipéi 309 se esterilizan como se describe en Zhang et al . 0 1996. Los tejidos embriogénicos se inducen mediante el cultivo de las semillas de arroz maduras estériles sobre un medio N B en la oscuridad . El callo primario de aproximadamente 1 mm de diámetro, se retira del escutelo y se usa para iniciar la suspensión celular en medio líquido SZ. Después, las 5 suspensiones se mantienen como se describe en Zhang 1996. Los tejidos embriogenicos derivados de la suspensión se retiran del cultivo líquido en un periodo de 3 a 5 d ías después del sub cultivo previo y se colocan en un medio osmótico N BO para formar un círculo de cerca de 2.5 cm de diámetro en un plato de Petri y se cultivaron durante 4 horas antes del bombardeo.
Dieciséis a veinte horas después del bombardeo, los tejidos se transfieren de un medio N BO a un medio de NBH50 seleccionado, asegurándose que la superficie bombardeada se coloque hacia arriba, y se incube en la oscuridad durante 14 a 17 días. El callo recién formado se separa entonces de los explantes bombardeados originales y se coloca cerca en el mismo medio.
Después de un periodo adicional de 8 a 12 días, se puede identificar visualmente un callo relativamente compacto y opaco, y se lo transfiere a un pre- medio de regeneración PRH50 durante 7 días en un ámbito de oscuridad. El callo en crecimiento, que se hace más compacto y opaco, se lleva después a un sub-cultivo en un medio de regeneración RNH50 durante un período de 14-21 días bajo un régimen de foto-período de 16 horas por d ía . Los brotes regenerados se transfieren a cajas MAGENTA que contenían medio ½ MSH50. Varias plantas se regeneran a partir de un solo explante y se consideran como hermanos y son tratados como una línea de plantas independientes. Una planta se califica como positiva para el gen dgt-28 si produce raíces gruesas, blancas y crece vigorosamente en el medio ½ MSH50. Una vez que las plántulas alcanzan la parte superior de las cajas MAGENTA, se transfieren a la tierra en un contenedor de 6 cm por bajo un ámbito de 100% de humedad durante una semana , y después se mueven a una cámara de crecimiento con un período de luz 14 horas por d ía a 30°C y en la oscuridad a 21 °C durante 2-3 semanas antes del su trasplante a macetas de 13 cm en el invernadero. Las semillas se recogen y se secan a 37°C durante una semana antes de su almacenamiento a 4°C.
Análisis Tn de arroz dat-28. Los transformantes del arroz trasplantado obtenidos vía transformación del Agrobacterium se trasplantaron a los medios y fueron aclimatación a condiciones de invernadero. Se tomaron muestras de todas las plantas para la detección por PCR de dgt-28 y los resultados mostraron veintidós eventos PCR positivos para pDAB1 10827 (TraP8: :dgt-28) y al menos dieciséis eventos PCR positivos para pDAB 1 10828 (TraP23: :dgt-28) . El análisis Southern para dqt-28 de los eventos positivos de PCR demostró eventos simples (1 -2 copias) para ambas constructos. La extracción de proteínas de los eventos T0 seleccionados demostró que la extracción de proteína dgt-28 se encuentra en I ntervalo s que van desde niveles bajos de detección a 130 ng/cm2. Los eventos T0 eventos seleccionados a partir del constructo pDAB1 10828 fueron tratados con 2240 g de DMA ae/ha de DU INTERVALO™ como se ha descrito previamente y se evaluaron a los 7 y a los 14 días después del tratamiento. Los datos demostraron tolerancia robusta a la tasa de glifosato que se aplicó. Se permitió que todas las plantas que se comprobaron como positivas para PCR produjeran semillas Ti para una caracterización adicional.
La heredabilidad de dqt-28 en el arroz. Una prueba de progenie en 100 plantas se llevó a cabo en cuatro líneas Ti de dgt-28 del constructo pDAB1 10827 que contienen el peptido de tránsito al cloroplasto TraP8. Las semillas fueron plantadas en macetas con medios. Todas las plantas se rociaron con 560 g ae/ha DU I NTERVALO DMA™ para la selección del gen de dgt-28 como se ha descrito previamente. Después de transcurridos 7 d ías desde el tratamiento, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Dos de las cuatro líneas puestas a prueba para cada constructo se segregaron como un único locus, el rasgo mendeliano dominante (3R: 1 S) como se determina mediante el análisis de Chi cuadrado. Dgt-28 es un gen hereditario resistente al glifosato en múltiples especies.
Tolerancia a herbicidas en post-emergencia en arroz T transformado por dat-28. A las plantas T ^ resistentes de cada evento usadas en la prueba de progenie se les dio identificadores únicos y se tomaron muestras para análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos de cigosidad se usaron para asignar réplicas de 2 hemicigotos y 2 homocigotos para cada tasa de glifosato aplicado permitiendo un total de 4 réplicas por tratamiento. Estas plantas se compararon frente al arroz “tipo salvaje kitaake”. Todas las plantas se rociaron con un rociador de pista fijado en un nivel 187 L/ha. Las plantas se rociaron desde un Intervalo de 560-2240 g ae ha con DU INTERVALO DMA™. Todas las aplicaciones se formularon en agua con la adición de 2% de sulfato de amonio (AMS) w/v. Las plantas se evaluaron tanto a los 7 días como a los 14 días despues del tratamiento. Se asig nó a las plantas una calificación de daño con respecto al retraso del crecimiento global visual, a la clorosis y a la necrosis. La generación T1 se encuentra en segregación, por lo que se espera alguna respuesta variable debido a la diferencia en cigosidad .
Los resultados del rociado demuestran a 7 DAT (días después del tratamiento) se detecta daño vegetativo mínimo a tasas elevadas de glifosato (no se muestran los datos) .
Tabla 26. Los datos de daños que se pueden percibir visualmente a los 14 días después del tratamiento demuestran que menos del 15% de daño promedio que se puede percibir visualmente con niveles de hasta 2240 g ea/ha de glifosato.
Se evaluó la detección de proteína de DGT-28 para las replicas provenientes de todas las cuatro líneas ? · de pDAB1 10827 sometidas a pruebas. Los datos demostraron que la proteína DGT-28 promedio oscila entre 20 a 82 ng/cm2 y entre 21 -209 ng/cm2 para réplicas de hemicigotos y homocigotos respectivamente. Estos resultados demostraron la extracción estable de la proteina a la generación T·, y la tolerancia que tiene el arroz dgt-28 de hasta 2240 g ea/ha al glifosato después de una aplicación de 560 g ae/ha de glifosato usado para la selección.
Ejemplo 20: Transformación de césped con dgt-28 La transformación genética del transgénico dgt-28 mediada por Agrobacterium tumefaciens en “creeping bentgrass” (césped de estación fría) se logra a través del callo embriogénico iniciado a partir de las semillas (cv. Penn-A-4). Ver “Efficiency of Agrobacterium tumefaciens- mediated turfgrass ( Agrostis stolonifera L) transformaron” (Luo et. al. , 2004) Las células de callo se infectan con una cepa A. tumefaciens que hospeda un vector súper-binario que contiene un transgénico resistente a herbicidas accionado (por ejemplo, dgt-28, dgt-31, dgt-32, o dgt-33) por un promotor monocotiledóneo específico. La eficiencia global de transformación estable varía en un I ntervalo del 18% al 45% . El análisis “transferencia Southern” y el análisis genético confirman la integración del transgénico en el genoma del bentgrass y la transmisión normal y la expresión estable del transgénico en la generación Todos los eventos de transformación independientes portan una a tres copias del transgénico, y una mayoría (60-65%) contienen una sola copia del transgénico, sin reordenamientos aparentes.
Se descascaran las semillas maduras con papel de lija y se esteriliza la superficie en 10% (v/v) de lavandina Clorox™ (6% de hipoclorito de sodio) más 0.2% (v/v) de Tween 20 (Polisorbato 20) mediante agitación vigorosa durante 90 minutos. Después de enjuagar cinco veces en agua destilada estéril, las semillas se colocan sobre medio de inducción de callo (sales básales MS y vitaminas, 30 g/L de sacarosa, 500 mg/l de hidrolizado de caseína, 6,6 mg/l de 3,6-dicloro-o-an ísico (dicamba), 0.5 mg/l de 6-bencil amino purina (BAP) y 2 g/l de Phytagel. El pH del medio se ajusta a 5,7 antes de tratamiento en autoclave a 120°C durante 20 minutos).
Las placas de cultivo que contienen explantes preparados de semillas se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante 6 semanas. Los callos embriogenicos se selecciona visualmente y se sub-cultivan en un medio fresco de inducción de callos en la oscuridad , a temperatura ambiente durante 1 semana antes del co-cultivo.
Un día antes de la infección mediada por Agrobacterium , los callos embriogénicos se dividen en piezas de a 2 milímetros y se colocan en un medio de inducción de callo que contiene 100 uM de acetosiringona. Una alícuota de 10 ul de suspensión de Agrobacterium (OD = 1 .0 a 660 nm) que alberga el transgénico dgt-28, dgt-31, dgt-32, o dgt-33 se aplica después a cada pieza de los callos, ello es seguido por de 3 días de co-cultivo en la oscuridad a 25°C. Los callos se transfieren y se cultivaron durante 2 semanas en un medio de inducción de callos más 125 mg/l de Cefotaxima y 250 mg/l de Carbenicilina para inhibir el crecimiento bacteriano.
La selección de plantas transgénicas se produce cuando los callos se trasladan a un medio de inducción de callos que contiene 250 mg/l de cefotaxima y un herbicida. El material de callo se mantiene en este medio durante 8 semanas con un intervalo de selección de sub-cultivo de 3 semanas. El proceso de selección se realiza a temperatura ambiente en la oscuridad.
Para la regeneración de plantas, los eventos de callos proliferantes resistentes a los herbicidas se trasladan primero a un medio de regeneración (medio basal EM , 30 g/l de sacarosa, 100 mg/l de miomositol, 1 mg/l de BAP y 2 g/l de Phytagel) suplementado con cefotaxima, y un herbicida para la selección. Estos callos se mantienen en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 semana y despues se trasladan a la luz durante 2-3 semanas para desarrollar brotes.
Los brotes desarrollados se separan y se transfirieren a un medio de regeneración sin hormonas, que contiene un herbicida y cefotaxima para promover el crecimiento de la raíz mientras se mantiene la presión de selección y se suprime cualquier célula de Agrobacterium que reste. Las plántulas con raíces bien desarrolladas (en 3 a 5 semanas) se transfieren después a la tierra y se desarrollaron ya sea en el invernadero o en el campo abierto de cultivo.
Las plantas transgénicas se mantienen al aire libre en un vivero de contención (por 3 a 6 meses) hasta el solsticio de invierno en diciembre. Las plantas que vernalizaron se transfieren al invernadero y se mantienen a 25°C bajo un régimen de 16/8 horas de fotoperiodo y rodeadas por plantas control no transgénicas que físicamente aíslan a las plantas transgénicas de otras fuentes de polen . Las plantas transgenicas comienzan a florecer entre 3 a 4 semanas después de haber sido trasladadas de nuevo al invernadero. Estas plantas se fertilizan de forma cruzada con el polen de las plantas de control circundantes. Las semillas recolectadas de cada planta transgénica individual se hacen germinar en el suelo a 25°C, y las plantas Ti se cultivan en el invernadero para su posterior análisis.
Otras tipos de césped se transforman con dgt-28 de acuerdo con el protocolo descrito, incluyendo los siguientes, annual meadowgrass (pastito de invierno) (Poa annua), Bahiagrass, (pasto bahía) Bentgrass (agrostis), Bermudagrass (pasto de Bermudas), Bluegrass (pasto azul) , Bluestems, Brachiaria, Bromegrass, Browntop bent ( Agrostis capillaries) , Buffalograss, Canary Grass, Carpetgrass, Centipedegrass, Chewings fescue ( Festuca rubra commutate) , Crabgrass, Creeping bent ( Agrostis stolonifera) , Crested hairgrass ( Koeleria macrantha) , Dallisgrass, Fescue, Festolium, Hard/sheeps fescue ( Festuca ovina), Gramagrass, Indiangrass, Johnsongrass, Lovegrass, mezclas (Equma, Pastizales, etcétera), Native Grasses, Orchardgrass, Perennial ryegrass ( Lolium perenne) , Redtop, Rescuegrass, annual and perennial Ryegrass, Slender creeping red fescue ( Festuca rubra trichophylla) , Smooth-stalked meadowgrass (Poa pratensis) , St. Augustine, Strong creeping red fescue ( Festuca rubra rubra) , Sudangrass, Switchgrass, Tall fescue ( Festuca arundinacea), Tufted hairgrass ( Deschampsia caespitosa) , Turfgrasses, Wheatgrass, y Zoysiagrass Ejemplo 21 : Transformación de Brassica spp. con rasgo DGT El gen dgt-28, dgt-31, dgt-32, o dgt-33 confieren resistencia al glifosato se usa para transformar la Brassica napus de la variedad . Nexera™ 710 con transformación mediada por Agrobacterium.
Las semillas de Brassica napus se esterilizan superficialmente con lavandina comercial al 10% durante 10 minutos y se enjuagan 3 veces con agua destilada esteril. Las semillas se colocan después sobre medio basal MS de concentración media (Murashige and Skoog , 1962) y se mantienen bajo régimen de crecimiento que establece una temperatura de 2°C , y un fotoperiodo de 16 horas de luz / 8 horas oscuridad .
Los segmentos de hipocótilos (de 3 a 5 mm) se extirpan de las plántulas que tiene de 5 a 7 días de edad y se colocan en un medio de ind ucción de callo K1 D1 (medio MS con 1 mg/l de cinetina y 1 mg/ I 2 ,4-D) durante 3 d ías como pre-tratamiento. Los segmentos se transfieren después a una placa petri y se tratan con una cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un constructo que incluye dgt-28. El Agrobacterium tumefaciens se cultiva durante la noche a 28° C en la oscuridad en un agitador a 150 revoluciones por minuto y, posteriormente, se vuelve a suspender en el medio de cultivo.
Después de un tratamiento de 30 minutos con Agrobacterium de los segmentos de hipocótilos, estos segmentos se colocan de nuevo en el medio de inducción de callos durante 3 días. Después del co-cultivo, los segmentos se colocan en K1 D1 TC (medio de inducción de callos que contiene 250 mg/l Carbenicilina y 300 mg/l Timentin) durante una semana de recuperación . Alternativamente, los segmentos se colocan directamente en el medio de selección K1 D 1 H 1 (por encima del medio con un herbicida). La Carbenicilina y el Timentin son los antibióticos que se usan para matar el Agrobacterium. El agente de selección permite el crecimiento de las células transformadas Muestras de callos aislados de eventos independientes se ponen a prueba mediante PCR. Las muestras que dan positivo para la presencia de dgt-28, dgt-31, dgt-32, o dgt-33 se confirman y se las avanza a los medios de regeneración . Los segmentos de hipocótilos callosos se colocan , en ese momento, en B3Z1 H 1 (medio MS, 3 mg/l bencil amino purina, 1 mg/l zeatina, 0.5 g/l de MES [ácido 2-morfolino etano sulfónico], 5 mg/l de nitrato de plata, herbicida para selección, Carbenicilina y Timentin), un medio de regeneración. Después de 3 semanas los brotes comienzan regeneración. Segmentos de hipocótilos, junto con los brotes se transfieren a B3Z1 H3 medio (medio EM , 3 mg / I bencilamino purina , 1 mg / I Zeatina, 0.5 g / I de M ES [ácido 2-morfolino etano sulfónico] , 5 mg/l nitrato de plata, herbicida de selección , Carbenicilina y Timentin) durante otras 3 semanas.
Los brotes se cortaron de los segmentos de hipocótilos y se transfirieron a un medio para la elongación de brotes MESH 10 (EM , 0.5 gm/l de M ES, herbicida de selección , Carbenicilina , Timentin) durante 2 a 4 semanas. Los brotes alargados se cultivan para la inducción de raíces en MSI .1 (EM con 0.1 mg/l de ácido indolbutírico). U na vez que las plantas establecen un sistema de raíces, las plantas se trasplantaron a la tierra. Las plantas se aclimatan en condiciones ambientales controladas en un Conviron™ durante 1 a 2 semanas antes de su transferencia al invernadero.
Las plantas T0 transformadas se auto-polinizaron en el invernadero para obtener semillas T, . La progenie de las plantas To y T se rociaron con una gama de concentraciones de herbicida de glifosato para establecer el nivel de protección otorgada por el gen dgt-28, dgt-31, dgt-32, o dgt-33.
Ejemplo 22: Transformación de tabaco con dgt-28 Se transforman trozos de hojas de tabaco (cv. Petit Havana) usando Agrobacterium tumefaciens que contiene el transgén dgt-28. Se inoculan colonias simples que contienen el plásmido que contiene el transgén dgt-28 en 4 mi de medio de YEP que contiene espectinomicina (50 mg/ml) y estreptomicina (125 pg/ml) , y se incuban durante toda la noche a 28°C en un agitador a 190 rpm. Los 4 mi de cultivo de semilla después se usan para inocular un cultivo de 25 mi del mismo medio en un matraz de Erlenmcyer desconcertado. Este cultivo se incuba a 28°C agitando a 190 rpm hasta que alcanza un OD60o de ~1 .2. Después se coloca una suspensión de 10 mi de Agrobacterium en platos estériles Petri™ de 60 x 20 mm.
Se remojan trozos de hojas recien cortados (0.5 cm2) de plantas cultivadas asépticamente en un medio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission , KS) con 30 g/l de sucrosa en bandejas PhytaTrays™ (Sigma, St. Louis, MO) en Agrobacterium cultivadas durante toda la noche por alg unos minutos, se secan en papel de filtro estéril y después se colocan en el mismo medio, agregando 1 mg/l de ácido indolacético y 1 mg/l de 6-benzilamino purina . Tres días más tarde, los trozos de hojas cocultivados con Agrobacterium que contiene el transgén dgt-28 se transfieren al mismo medio con 5 mg/l de Basta™ y 250 mg/l de cefotaxima.
Después de tres semanas, las plántulas individuales T0 se transfieren al medio EM con 10 mg/l de Basta™ y 250 mg/l de cefotaxima otras tres semanas antes del trasplante al suelo y la transferencia al invernadero. Algunas plantas T0 (identificadas usando los protocolos de análisis molecular antes descrito) se dejan autopolinizar y se recogen las semillas de las cápsulas cuando se han secado por completo. Se analizan las plántulas T para comprobar la cigosidad y la expresión del gen reportero (como se describe a conti nuación) y se identifican plantas seleccionadas que contienen el transgén dgt-28.
Las plantas después se trasladaron al invernadero lavando el agar de las raíces, trasplantándolas a tierra en macetas cuadradas de 13.75 cm que se colocaron en bolsas Ziploc® (SC Johnson & Son , Inc.), con agua corriente en el fondo de la bolsa. Estas se colocaron en un invernadero de 30°C con luz solar indirecta durante una semana. Despues de 3 a 7 días, se abrió la bolsa; las plantas se fertilizaron y se dejaron crecer en la bolsa abierta hasta que las plantas se aclimataron al invernadero; en ese momento, se retiró la bolsa. Las plantas se cultivaron en condiciones de invernadero cálido normales (27°C durante el d ía, 24°C durante la noche, 16 horas de día, luz mínima natural y suplementaria = 1200 pE/m2s1).
Antes de la propagación , se tomaron muestras de las plantas T0 a fin de realizar análisis de ADN para determinar el número de copia de dgt-28 insertado por medio de PCR en tiempo real. El tejido nuevo se colocó en tubos y se liofilizó a 4°C durante dos días. Después de que el tejido se secó por completo, se colocó una perla de tungsteno (Valenite) en el tubo y las muestras se sometieron a molido en seco durante un minuto usando un molinillo Kelco. Después se siguió el procedimiento DNeasy™ estándar de aislamiento de ADN (Qiagen, DNeasy 69109). Después se goteó una parte proporcional del ADN extraído con Pico Green (Molecular Probes P7589); se observó la indicación en el fluorómetro (BioTek™) con estándares conocidos para obtener la concentración en ng/mI . Se usaron en total 100 ng de ADN como plantilla. La reacción PCR se llevó a cabo en el termocielador 9700 Geneamp™ (Applied Biosystems), sometiendo las muestras a 94°C durante 3 minutos y 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos y 72°C durante 1 minuto y 45 segundos, seguidos de 72°C durante 10 minutos. Los productos del PCR se analizaron por medio de electroforesis con un gel de agarosa al 1 %, goteado con EtBr y confirmado por medio de transferencia Southern.
Se regeneraron y trasladaron al invernadero entre cinco y nueve eventos positivos de PCR con 1 a 3 copias de gen dgt-28 de 3 constructos que contenían diferentes secuencias de peptido de tránsito al cloroplasto (TraP4, TraP8 y TraP23) .
Se tomaron muestras de todas las plantas con PCR positivo para cuantificación de la proteína DGT-28 por medio de un ELISA estándar. Se detectó la proteína DGT-28 en todas las plantas con PCR positivo y se observó una tendencia al aumento en la concentración de proteína con un aumento en el número de copias de dgt-28.
Heredabilidad de aad-12 (vD en el tabaco. Se efectuó una prueba de progenie de 100 plantas en cinco líneas de dgt-28 por constructo. Los constructos contenían una de las siguientes secuencias de péptido de tránsito al cloroplasto: TraP4, TraP8 o TraP23. Las semillas se estratificaron, germinaron y trasplantaron de modo muy similar al procedimiento con Arabidopsis antes descrito, con la excepción de que no se retiraron las plantas nulas por med io de la selección inicial antes del trasplante. Todas las plantas después se pulverizaron con 280 g ae/ha Ignito 280 SL para la selección del marcador seleccionable pat como se describió anteriormente. Tres d ías despues del tratamiento, se contaron las plantas resistentes y sensibles.
Cuatro de las cinco líneas probadas para cada constructo segregaron como una sola característica dominante Mendeliana de locus único (3R: 1 S), determinada por un análisis de Chi cuadrada. El dgt-28 es un gen de resistencia al glifosato heredable en varias especies.
Tolerancia al herbicida post-emerqente en tabaco T transformado por dgt-28. Se asignaron identificadores únicos a las plantas Ti resistentes de cada evento usadas en la prueba de progenie, y se hicieron muestras para análisis de cigosidad del gen dgt-28. Los datos de cigosidad se usaron para asignar dos réplicas hemicigotas y dos réplicas homocigotas para cada tasa de glifosato aplicada, lo cual permite obtener un total de cuatro réplicas por tratamiento. Estas plantas se compararon con el tabaco Petite Havana de tipo silvestre. Todas las plantas se pulverizaron con un pulverizador de surco ajustado en 187 l/ha. Las plantas después se pulverizaron con una tasa de 560-4480 g ae/ha con DURANGO DMA™. Todas las aplicaciones incluyeron agua en la fórmula, con la adición de sulfato de amonio al 2.0% m/v (AMS por sus siglas en inglés). Las plantas fueron evaluadas 7 y 14 días después del tratamiento. Se asig nó a las plantas una categoría de daño respecto del retraso en el crecimiento, clorosis y necrosis generales. La generación T-, se está segregando, por lo que se espera cierta variación en las respuestas debido a la diferencia en cigosidad.
Los resultados de las pulverizaciones demuestran que a los 7 d ías despues del tratamiento se detectaron lesiones vegetativas mínimas ante tasas elevadas de glifosato (los datos no se muestran). Tras 14 días después del tratamiento, los datos de lesiones obtenidos visualmente demuestran un aumento de las lesiones con eventos de copia única del constructo que contiene la secuencia TraP4 en comparación con los eventos de copia única de los constructos con TraP8 y TraP23. Tabla 27.
Tabla 27. Con una tasa de 2240 g ae/ha de glifosato, se demostró un daño medio del 37.5% con el evento que contenía TraP4, mientras que los eventos que conten ían TraP8 y TraP23 demostraron un daño medio del 9.3% y el 9.5% respectivamente.
Estos resultados demostraron tolerancia del dgt-28 hasta 80 g ae/ha de glifosato, así como diferencias en la tolerancia proporcionada por las secuencias de peptido de tránsito al cloroplasto vinculadas con el gen dgt-28.
Protección del dat-28 contra tasas de glifosato elevadas en la generación T Se efectuó una prueba de progenie de 25 plantas en dos a tres líneas de T2 de dgt-28 por constructo. Se seleccionaron líneas homocigóticas conforme a los análisis de cigosidad efectuados en la generación anterior. Las semillas se estratificaron , cultivaron y trasplantaron como se describió anteriormente. Todas las plantas después se pulverizaron con 280 g ae/ha Ignito 280 SL para la selección del marcador seleccionable pat como se describió anteriormente. Tres días después del tratamiento, se contaron las plantas resistentes y sensibles. Ninguna de las líneas probadas para cada constructo se segregaron , lo que confirma las líneas homogéneas en la generación T2 y demuestra la herencia mendeliana a través de por lo menos de dos generaciones de dgt-28 en el tabaco.
Se aplicaron tasas de DURANGO DMA™ de entre 420 y 3360 g ae/ha de glifosato a 2 a 3 hojas de tabaco como se describió anteriormente. Los datos de daño observados visualmente 14 días después del tratamiento confirmaron los resultados de tolerancia que se demostraron en la generación T1 . Los resultados foliares de líneas de dos copias del constructo que contiene TraP4 demostraron una tolerancia similar a aquella de las líneas de copia única con TraP8 y TraP23 (no se muestran los datos).
Tabla 28. Las líneas de copia única del constructo que contiene TraP4 con dgt-28 demostraron un aumento de los daños en comparación con las líneas de constructos que contiene TraP8 y TraP23 con dgt-28.
Los datos demuestran una tolerancia robusta del tabaco dgt-28 hasta 3360 g ae/ha de glifosato a traves de dos generaciones en comparación con el control no transformado.
Se tomaron muestras de las plantas seleccionadas de cada evento antes de las aplicaciones de glifosato para realizar análisis de la pro teína DGT-28 por medio del método DGT-28 ELISA estándar. Los datos demuestran la expresión de proteína DGT-28 media de las líneas únicas (1 -2 copias) a través de constructos que van desde 72.8 a 1 14.5 ng/cm2. Los datos demuestran que el dgt-28 está expresando proteína en la generación T2 de tabaco transformado, y los datos de tolerancia confirman la funcionalidad de la proteína DGT-28.
Acumulación de dat-28 para aumentar el espectro de herbicidas: Se cruzaron recíprocamente plantas homocigotas dgt-28 (pDAB 107543 y pDAB107545) y aad- 12 v1 (pDAB3278) (para esta última, ver PCT/US2006/042133 que se incorpora en el presente por referencia en su totalidad) y se recolectaron semillas F . Las semillas F de dos cruzamientos recíprocos de cada gen se estratificaron y 6 réplicas tratadas de cada cruzamiento se trataron con 1 120 g ae/ha de glifosato (selectivo para el gen dgt-2) , 1 120 g ae/ha 2,4-D (selectivo para el gen aad-D, o una mezcla en el tanque de los dos herbicidas a las tasas descritas. Las plantas fueron evaluadas 14 días después del tratamiento. Los resultados de la pulverización se muestran en la Tabla 29.
Tabla 29. Respuesta de F-i aad- 12 y dgt-28 Los resultados confirman que dgt-28 puede ser acumulado exitosamente con aad- 12 (vD, incrementando así el espectro de herbicidas que pueden ser aplicados al cultivo en cuestión (glifosato + ácidos fenoxiaceticos para dgt-28 y aad- 12, respectivamente). En producción de cultivos donde existen hierbas de hojas anchas difíciles de controlar o biotipos de hierbas resistentes, la acumulación puede usarse como un modo de controlar h ierbas y proteger el cultivo en cuestión . También se podrían acumular rasgos genéticos originales o de cultivo con el gen dgt-28.
Ejemplo 23: Resistencia al glifosato en el Trigo Producción de vectores binarios que codifican DGT-28. Los vectores binarios que contienen la expresión DGT-28 y cartuchos de selección PAT fueron diseñados y armados usando habilidades y teenicas conocidas comúnmente en el oficio. Cada cartucho de expresión DGT-28 contenía el promotor, región no traducida de 5' y el intrón del gen Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki et al Plant Physiology 1992, 100 1503-1507), seguido por una secuencia de codificación que consiste de uno de cuatro péptidos de tránsito (TraP4, TRAP8, TraP23 o TraP5) fusionados al extremo de 5' de una versión sintética del gen de la sintasa 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato (DGT-28) , que había sido optimizada en codones para expresión en plantas. El cartucho de expresión DGT-28 terminado con una región no traducida (UTR) de 3' que comprende el terminador transcripcional y el sitio de poliadenilación de un gen de lipasa ( Vp 1 ) de Z. mays (Paek et al Mol Cells 1998 30; 8(3) 336-42). El cartucho de selección PAT compuesto del promotor, la región no traducida de 5' y el intrón del gen Actina ( Act1 ) de Oryza sativa (McEIroy et al The Plant Cell 1990 2 (2) 163-1 71 ), seguido por una versión sintética del gen transferasa acetil fosfinotricina (PAT) aislado de Streptomyces viridochromogenes, que había sido optimizado en codones para expresión en plantas. El gen PAT codifica una proteína que confiere resistencia a los inhibidores de sintetasa de glutamina que incluyen fosfinotricina, glufosinato y bialafos (Wohlleben et al Gene 1988, 70 (1 ), 25-37). El cartucho de selección fue terminado con la UTR de 3’ que comprende el terminador de transcripcional y sitios de poliadenilación del gen 35s del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Chenault et al 1993 Plant Physiology 101 (4), 1395-1396).
El cartucho de selección fue sintetizado por un proveedor de síntesis genetica comercial (GeneArt, Life Technologies) y clonado en vector binario habilitado como Puerta de Enlace. Los 5 casetes de expresión DGT-28 fueron sub-clonados en pDONR221 .
El clon de ENTRADA resultante fue usado en una reacción LR Clonasa I I (Invitrogen , Life Technologies) con el vector binario habilitado para puerta de enlace codificando el cartucho de expresión fosfinotricina acetil transferasa (PAT). Las colonias de ío todos los plásmidos reunidos fueron cribadas inicialmente por digestión de restricción de ADN purificado usando endonucleasas de restricción obtenidas de New England Biolabs (N EB ; Ipswich , MA) y Promega (Promega Corporation, Wl). Las preparaciones de ADN plásmido se realizaron usando el Q IAprep Sp/n Miniprep Kit 15 (Qiagen , Hilden) o el Puré Yield Plasmid Maxiprep System (Promega Corporation , Wl), siguiendo las instrucciones de los proveedores. El ADN plasmídico de los clones seleccionados fue secuenciado usando el protocolo de secuenciación de ciclo ABI Sanger Sequencing y Big Dye Terminator v3.1 (Applied 0 Biosystems, Life Technologies). Los datos de secuencia fueron reunidos y analizados usando el software Sequencher™ (Gene Codes Corporation , Ann Arbor, M I) .
Los cuatro clones de expresión binarios resultantes: pDASOOOl 22 (T raP4-DGT28), pDAS000123 (T raP8-DGT28) , 5 pDASOOOl 24 (TraP23-DGT28) y pDAS000125 (T raP5-DGT28) fueron cada uno transformado en cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens.
La producción de eventos de trigo transgenico con constructo de expresión dat-28. Las plantas de trigo transgénicas que expresan uno de los cuatro constructos de expresión DGT-28 se generaron mediante transformación mediada por Agrobacterium usando la línea de trigo donante Bobwhite M PB26RH , siguiendo un protocolo similar a Wu et al. Transgenic Research 2008, 17:425-436. Eventos transgénicos T0 putativos fueron seleccionados para tolerancia de fosfinotricina (PPT), el fenotipo conferido por el marcador seleccionable PAT, y transferidos a suelo. Las plantas T0 fueron cultivadas bajo condiciones de contención en invernadero y se produjeron semillas T1 . En total, fueron generados aproximadamente 45 eventos T0 independientes para cada constructo de expresión DGT-28.
Resistencia a qlifosato en eventos de trigo Tn dat-28 del trigo. A Eventos T0 se les permitió aclimatarse en el invernadero y fueron cultivaron hasta que 2 a 4 horas nuevas y de aspecto normal , emergieron de la fronda (es decir, las plantas habían transicionado de cultivo de tejido a condiciones de crecimiento en invernadero). Las plantas fueron cultivadas a 25°C bajo condiciones de 12 horas de iluminación suplementaria en el invernadero hasta su madurez. Se completó una criba inicial de tolerancia al glifosato y análisis Taqman en plantas T cultivadas bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Los datos permitidos para la determinación de eventos T heredables serán caracterizados adicionalmente. Seis copias bajas (1 -2 copias) y dos eventos T ·, multi-copia fueron replantados bajo condiciones de invernadero y cultivados hasta la etapa de hoja 3. Las plantas T fueron rociadas con una fórmula comercial de glifosato (DU RANGO DMA™) desde un I ntervalo de 420 a 3360 g a.e./ha, lo que es capaz de causar daño significativo a líneas de trigo sin transformar. La adición de sulfato de amonio al 2% peso/volumen fue incluida en la aplicación . Una dosis letal se define como la tasa que causa >75% de lesión al control no transformado M PB26RH Bob White. Se aplicó herbicida.
En este ejemplo, las aplicaciones de glifosato fueron usadas tanto determinar la segregación del gen dgt-28 en la generación Ti , como para demostrar tolerancia a niveles crecientes de glifosato. La respuesta de las plantas se presenta en terminos de escala de lesión visual 21 días después del tratamiento (DAT) . Los datos se presentan como un histograma de individuos que exhiben menos de 25% de lesión visual (4) , 25 - 50% de lesión visual (3), 50 - 75% de lesión visual (2) y lesiones mayores al 75% (1 ) . Se presenta una media aritmética y desviación estándar para cada constructo usado para transformación de trigo. También se indica en la última columna el I ntervalo de clasificación de respuesta individual para cada tasa y transformación . Trigo no transformado de tipo silvestre (c.v. Bob White MPB26RH) sirvió como un control sensible al glifosato. En la generación T·, habían disponibles plantas hemicigotas y homoc ¡gotas para las pruebas de cada evento, y por lo tanto fueron incluidas para cada tasa de glifosato probada . Las plantas hemicigotas contendrán mitad de la dosis del gen que las plantas homocigotas, por lo tanto, se puede esperar variabilidad de respuesta aL glifosato en la generación J-i .
Los resultados de las plantas de trigo T · dgt- 28 demostraron que la tolerancia al glifosato se alcanzó a tasas de hasta 3360 g a .e./ha. con los peptidos de tránsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 y TraP23. Tabla 30. Los datos son de un evento Ti de copia baja, pero son representativos de la población para cada constructo.
Tabla 30. Respuesta de eventos de trigo T ·, dgt-28 de baja copia al glifosato 21 días después del tratamiento. 21 días despues del tratamiento, las plantas resistentes y sensibles se cuentan para determinar el porcentaje de líneas que se segregaron como una sola característica dominante Mendeliana de locus único (3R: 1 S), determinada por un análisis de Chi cuadrado. Tabla 31. Estos datos demuestran que dgt- 28 es hereditario como un gen robusto de resistencia al glifosato en una especie monocotiledónea.
Tabla 31. Porcentaje de eventos T·i dgt-28 por constructo que demuestre heredabilidad de forma mendeliana en base a una selección de glifosato a tasas que van de 420 a 3360 g e.a./ha.
Confirmación molecular de plantas transgenicas Tn para la i ración de DGT-28 que codifica T-ADNs. Se extrajo ADN genómico de material foliar liofilizado de todas las plantas de trigo TO putativo. El tejido foliar recien cosechado fue congelado rápidamente en nitrógeno líquido y liofilizado durante 24 horas en un Labconco Freezone 4.5® (Labconco, Kansas City, MO) a -40°C y 133 x 10 3 mBar de presión . El material liofilizado fue sometido a extracción de ADN usando el DNeasy® Plant ADN Extraction Mini kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
ADN de cada planta T0 fue probado en busca de presencia-ausencia de cepa de Agrobacterium tumefaciens transportado y para el número de copias integrada del DGT-28 que codifica T-ADN . La presencia-ausencia de cepa de A. tumefaciens fue realizada usando un ensayo Taqman® q PCR dúplex para amplificar el gen ubiquitina endógeno (cebadores directos e inversos y sonda: 5’ GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3’ (SEC I D No. : 85; Cebador directo) 5’ CTGCTTACCGGCAAAGAT GAG 3’ (SEC I D No. : 86; Cebador inverso) 5’ TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3’ (SEC I D No. : 87; Sonda) desde el genoma del trigo, y VirC desde pTiBo542 : 5’ CCG ACGAGAAAGACCAGCAA 3’ (SEC I D No. : 88; Cebador adelantado) 5’ CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3’ (SEC ID No. : 89; Cebador inverso) 5’ TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3’ (SEC I D No. : 90; Sonda) .
El número de copias de T-ADN integ radas fue estimado usando un ensayo Taqman® qPCR dúplex siguiendo el procedimiento de Livak y Schmittgen (Methods 2001 25:402-8). El ensayo amplificó el gen puromdolina-b endógeno de copia única (Pin b) en el geno a D de trigo hexaploide (Gautier et al Plant Science 2000 153, 81 -91 ): 5’ ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3’ (SEC I D No. : 91 ; Cebador directo) 5’ TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3’ (SEC I D No. : 92; Cebador inverso) 5’ ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3’ (SEC ID No. : 93; Sonda) y una región del promotor Actina (Act 1 ) presente en el T- ADN : 5’ CTCCCGCGCACCGATCTG 3’ (SEC I D No. : 94; Cebador directo) 5’ CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3’ (SEC ID No. : 95; Cebador inverso) 5' AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3’ (SEC ID No. : 96; Sonda) .
Plantas que no amplificaron un producto desde VirC y desde las que los productos correctos fueron amplificados con cebadores a ubiquitina endógena y promotor actina de arroz fueron clasificados como transgénicas. El número de T-ADN integrados fue estimado a partir de 2DDo(T), de acuerdo con Livak y Schmittgen (Methods 2001 25:402-8). En general, aproximadamente 95% de todas las plantas TO tenían al menos una copia integrada del T-ADN. Tabla 32.
Tabla 32. N úmero de plantas T0 independientes generadas y el número estimado de DGT-28 codificando T-ADN integrados.
Desarrollo de ensayos de ciaosidad PCR para seguimiento de herencia de transqén. Las secuencias que flanquean los sitios de integración del ADN-T fueron identificadas por digestión de ADN genómico purificado con ocho endonucleasas de restricción , seguidas de la ligadura de adaptadores de doble cadena específicos a los salientes creados por las endon ucleasas de restricción . Después de la ligación del adaptador, se realizó un PCR con un iniciador biotinilado en el extremo de 3' o de 5' del DGT-28 de codificación de T-ADN y un iniciador para cada adaptador. Los productos PCR fueron capturados y purificados en perlas Ampure Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) (Agencourt Bioscience Corporation, Beckman Coulter Company) . Se ejecutó despues un PCR anidado y los productos de amplificación fueron secuenciados en Sanger usando química BigDye® v3.1 (Applied Biosystems) en una plataforma de electroforesis capilar automatizada ABI3730xl®. El análisis de secuencia ejecutado usando el software Sequencher (GeneCodes, Ann Arbor, M I) fue usado para generar (donde era posible) una secuencia de consenso. La secuencia y únicos consenso resultante fueron utilizados como consultas BlastN contra genoma ensamblado de secuencia encuesta contiguos para el flujo ordenadas cromosoma armas de variedad de trigo de Chínese Spring (www.wheatgenome.org) para determinar los cromosomas en los que se había producido integración del T-ADN y para permitir el diseño de cebadores específicos al sub-genoma para el desarrollo de ensayos de cigosidad PCR .
Se desarrollaron dos ensayos PCR para cada evento transgénico, para permitir que la herencia del transgén sea seguida en generaciones subsiguientes. El primer ensayo (en lo sucesivo, denominado PCR salida-salida) fue diseñado para amplificar todo el sitio de integración T-ADN . La amplificación especifica al sub-genoma en este ensayo se obtuvo usando el PCR salida-salida con cebadores diseñados para situar la base penúltima (que contenía un enlace fosforotioato) sobre la variación de la secuencia de nucleótidos que distingue el locus objetivo de las copias duplicadas (homólogas y parálogas) del locus en otro lugar en el genoma del trigo. El segundo ensayo (denominado en lo sucesivo PCR entrada-salida) fue diseñado para amplificar desde el T-ADN en la secuencia endógena. Este ensayo usó uno de los cebadores del ensayo PCR salida-salida y un iniciador diseñado para el extremo de 3' o 5' del DGT-28 que codifica T-ADNs. Los cebadores PCR fueron diseñados para tener entre 18 y 27 nucleótidos de longitud y para tener una temperatura de fusión de 60 a 65°C , óptima 63°C . Los ensayos PCR salida-salida y entrada-salida se realizaron en un volumen de reacción de 25 mI con 0.2 mM dNTP, solución amortiguador 1 x PCR Phusion (New England Biolabs), 1 .5 mM gC , 0.5U polimerasa ADN Hotstart Phusion (New England Biolabs) , 25 ng ADN genómico purificado y 0.4 mM de cada iniciador. Las condiciones de cielado PCR eran de 98°C durante 30 segundos, despues (98°C durante 10 segundos, 65°C durante 20 segundos, 72°C durante 60 segundos) para 40 ciclos. La cigosidad de las plantas transgénicas fue asignada según se muestra en la Tabla 33.
Tabla 33. Eventos transgénicos para los que se desarrollaron eventos de cigosidad PCR y secuencias de iniciador usadas para PCR salida-salida y entrada-salida.
* Indica enlace fosforotioato Evaluación fenotípica de plantas transgenicas T para tolerancia al glifosato. Para determinar si eventos transgénicos con constructos de expresión DGT-28 mostraron tolerancia al glifosato, plantas T1 derivadas de los eventos individuales fueron evaluadas fenotípicamente en condiciones de contención de invernadero. Se realizaron dos cribados fenotípicos. En primer cribado (preliminar) , eventos transgénicos (con suficiente semilla T ·, para ambos cribados fenotípicos) fueron evaluados en su tolerancia al glufosinato y glifosato para confirmar la expresión DGT-28 y establecer el orden de clasificación para la tolerancia a herbicidas entre eventos. En el segundo cribado (detallado) , eventos transgénicos seleccionados fueron evaluados en tolerancia al glifosato a diferentes tasas de dosis de pulverización para determinar el nivel de tolerancia a herbicida conferido dentro de los eventos y entre constructos de expresión DGT-28.
Doce semillas T1 por evento seleccionado y tres replicados (12 semillas cada uno) de la línea de trigo donante no transformado M PB26RH Bobwhite se sembraron en macetas de 85 mm y se cultivaron hasta la etapa de 2 hojas bajo condiciones de buen riego a 25°C con iluminación suplementaria proporcionando un fotoperiodo de 12 horas. Las macetas se colocaron en un diseño aleatorio para permitir eliminar los efectos medioambientales durante el análisis de datos. Los eventos transgénicos cribados se enumeran en la Tabla 34. En la etapa de 2 hojas, todas las plantas T1 y el primer replicado de 12 plantas de trigo donantes no transformadas fueron pulverizados con glufosinato a una tasa de dosis de 420 g ai/ha. Las plantas fueron inspeccionadas visualmente despues de cuatro días y plantas representativas que capturaban el Intervalo de respuestas fenotípicas fueron usadas para desarrollar una escala de puntuación de 0 a 6. Tabla 35.
Tabla 34. Casos transgénicos probados en la pantalla preliminar.
‘Basado en el ensayo dúplex Taq man® q PC R . Pocas copias y multicopias indica £3 y >4 T-ADN integrados, respectivamente.
Tabla 35. Escala de puntuación usada para registrar la respuesta fenotípica al glufosinato a los 4 días de la pulverización .
Cada planta del ensayo fue puntada en relación con la escala de puntuación, con el anotador "ciego" con respecto al genotipo de la planta para eliminar influencias en la puntuación . Cinco días despues de la puntuación de glufosinato, todas las plantas T1 y las primeras y segundas réplicas de plantas no transformadas de trigo donantes se pulverizaron con glifosato a una tasa de dosis de 420 g ai / ha. La tercera réplica restante de trigo no transformado (un total de 12 plantas) no fue pulverizada. Las plantas fueron inspeccionadas visualmente a los 7, 14 y 21 d ías tras la pulverización. Una escala de puntuación que captura la variedad de respuestas fenotípicas fue desarrollada para cada momento y se usó para anotar todo. En todo momento, el anotador "ciego" con respecto al genotipo de la planta. La escala de puntuación en el día 7 tras la pulverización de 0 a 7 (Tabla 36), y de 1 a 4 a los 14 y 21 días tras la pulverización (Tabla 37). La longitud de la planta, el n úmero de tallos y las anormalidades morfológicas también se registraron para cada planta a los 14 días después de la pulverización con glifosato. Las plantas con germinación retrasada o establecimiento pobre fueron excluidas de los análisis posteriores.
Tabla 36. Escala de puntuación usada para registrar la respuesta fenotípica al glufosinato a los 7 días de la pulverización .
Tabla 37. Escala de puntuación usada para registrar la respuesta fenotípica al glufosinato a los 14 y 21 d ías de la pulverización.
El análisis de la respuesta al glufosinato no mostró una clara diferencia fenotípica entre plantas de trigo donantes no transformadas que fueron pulverizadas y plantas donantes no transformadas que no fueron pulverizadas (datos no mostrados) Como consecuencia, la tolerancia de los casos transgenicos a glufosinato no pudo ser evaluada de forma fiable. En contraste, en análisis de la respuesta de glifosato a los 21 días de la pulverización , mostró una diferencia clara del fenotipo entre las plantas donantes no transformadas pulverizadas y las no pulverizadas. Tabla 38. Por lo tanto, los análisis para la tolerancia de glifosato entre otros transgénicos se basaron en la valoración de las respuestas obtenidas a los 21 días de la pulverización. Se consideró que un caso transgénico mostraba tolerancia a glifosato cuando 4 o más plantas 12 T1 tuvieron un resultado mayor o igual a 3. Este criterio se basó en la expectación de que cada caso segregaría 1 :2: 1 (homocigiosis presente: hemicigoto: homocigoto ausente) para el transgén en la generación T1 y para permitir casos con expresión DGT28 debil a identificar. Los casos transgénicos fueron ordenados por Intervalo de tolerancia a glifosato observada usando un marcador agregado arbitrario calculado a partir de plantas tolerantes individuales. El marcador agregado fue calculado a través de la puntuación de las respuestas en los días 14 y 24 y la longitud de la planta, el número de tallos y las anormalidades morfológicas registradas el día 14 tras la pulverización .
Tabla 38. La respuesta fenotípica de las plantas de trigo donantes no transformadas al tratamiento herbicida a los 21 días tras la pulverización.
En total, 67 de los 92 casos transgénicos mostraron evidencias de tolerancia al glifosato. Tabla 39. Se estimó que seis casos transgénicos tenían £3 copias integradas del transgén y dos casos transgénicos tenían 4 o más transgénes integrado donde se seleccionó para cada vector de expresión DGT-28 para la inclusión en el segundo (detallado) fenotipo.
Tabla 39. Intervalo ordenado respuesta fenotípica de casos transgenicos a tratamiento de glifosato.
'U na puntuación positiva indica mayor tolerancia al glifosato. La puntuación agregada estandarizada para la planta de trigo donante no transformada fue 12.2.
Pantalla fenotípica detallada. Cuatro réplicas de 12 semillas T1 seleccionadas y ocho réplicas (12 semillas cada una) de trigo donante no transformado MPB26RH Bobwhite se sembraron en macetas de 85 mm y se cultivaron hasta la fase de 2 hojas bajo condiciones de buen riego a 25°C con iluminación complementaria proporcionando un fotoperíodo de 12 horas. Las macetas fueron situadas en un diseño al azar para permitir la eliminación efectos ambientales durante el análisis de datos. Las pantallas de transgénicos están enumeradas en la Tabla 40. En la etapa de 2 hojas, se registraron la longitud de la planta y el número de hojas de cada planta antes de pulverizar con glifosato.
La primera, segunda, tercera y cuarta replica de las plantas T1 para cada caso y el trigo donante no transformado fueron pulverizados con una dosis de 420, 840, 1680 y 3360 g ai/ha, respectivamente. La qumta, sexta, séptima y octava réplica del 5 trigo donante no transformado (total de 48 plantas) no fueron pulverizadas. A los 7, 14 y 21 días de la pulverización, se registró el tamaño de la planta, el número de hojas y la respuesta fenotípica al glifosato usando la escala de valoración de la Tabla 37. También se registraron las anormalidades morfológicas. Para ío la puntuación, el anotador fue "ciego" con respecto al genotipo de la planta y la tasa de dosis de pulverización para evitar el sesgo de puntuación . Las plantas con germinación retrasada y establecimiento pobre (criterio: longitud de planta <6 cm) en la puntuación previa a la pulverización fueron excluidas de análisis 15 posteriores.
Tabla 40. Casos transgénicos probados en la pantalla fenotípica detallada. 25 ‘Basado en el ensayo dúplex Taqman® qPCR. Pocas coplas y multicopias indica £3 y >4 T-ADN integrados, respectivamente.
Análisis de la respuesta de glifosato a 7, 14 y 21 días despues del rociado describió una diferencia fenotípica clara entre las plantas no trasformadas donantes de trigo rociadas y las sin rociar. Esta diferenciación es máxima a los 21 días y se observó en todas las tasas de dosis de glifosato. Tabla 41. Para evaluar la tolerancia de los eventos transgénicos a glifosato según cada tasa de dosis de rociado, las plantas T-, nulas (es decir, plantas que no portan el transgenico) se excluyeron de los análisis posteriores. Las plantas T-, con una puntuación de la respuesta de menos de tres a los 21 días después del rociado se consideran com que tienen el genotipo nulo. El análisis de la varianza (ANOVA) con base en los fenotipos tolerantes describió un efecto significativo para el constructo de extracción DGT-28, el suceso transgénico y la dosis de glifosato de rociado. Tabla 42 Sin embargo, pruebas de comparación múltiple no dieron a conocer una interpretación biológica significativa para el origen de estas diferencias debido a la gama limitada de las puntuaciones de respuesta (es decir, 1 a 4; Tabla 40) usada para registrar el fenotipo de las plantas individuales. En general, los ocho eventos transgénicos independientes analizados para cada constructo de extracción de DGT-28 mostraron una tolerancia similar al glifosato a cada tasa de dosis de rociado, lo que indica que los cuatro transgénicos 28-DGT confieren un fenotipo dominante y que una única copia fue suficiente para conferir tolerancia al glifosato. Cada una de los constructos DGT-28 describió la tolerancia eficaz de al menos 3360 g de ai / ha de glifosato.
Tabla 41. Respuesta fenotípica de las plantas no transformadas donantes de trigo a diferentes tratamientos de glifosato a los 21 días después del rociado.
Tabla 42. Análisis de la varianza (ANOVA) sobre la base de las plantas tolerantes a glifosato.
Suma de Cuadrado Df1 Valor-F Pr(>F)2 cuadrados medio Réplica 11 1.29 0.12 0.728 0.71181 2.00E- Vector 4 139.54 34.88 216.025 16*** Código de 2.00E- 29 178.52 6.16 38.122 evento 16*** Dosis de 3 2.14 0.71 4.417 0.00427** rociado 1Grados de libertad; Significancia estadística at 0.001 (***) y 0.01 (**), respectivamente.
Confirmación molecular de ADN-T presente en las plantas T1 tolerantes a glifosato. Los ensayos de PCR para 5 cigosidad desarrollados en el Ejemplo 2 se usaron para confirmar la presencia de ADN-T que codifica el DGT-28 en las plantas T1 tolerantes al glifosato mantenidas para la producción de semillas T2 (Ver el Ejemplo 6). En general, las pruebas de PCR de cigosidad se realizaron para 104 plantas T1 , de los cuales se ío confirmó que el 89% contenían al menos una copia del transgenico. Tabla 43. Estos resultados confirmaron que la tolerancia al glifosato observada fue conferida por la presencia de ADN-T que codifica el DGT-28.
Tabla 43. Segregación del transgénico observada entre 15 plantas T 1 . 5 Generación de semillas s T2 para eventos transgénica tolerantes al alifosato. Alrededor de ocho plantas tolerantes al glifosato T1 se salvaron de las revisiones fenotípicas de los 32 eventos transgénicos que fueron seleccionados para su inclusión en la revisión fenotípica detallada (Tabla 40). Las plantas se transfirieron a macetas de 200 mm y se cultivaron bajo condiciones de buen riego a 25°C con iluminación suplementaria proporcionando la foto periodo de 12 horas. Las espigas en cada planta fueron embolsadas individualmente antes de la antesis para evitar cruzamiento.
Mientras que los aspectos de esta invención se han descrito en ciertas partes, puede que se modifiquen adicionalmente dentro del espíritu y alcance de esta descripción . Esta aplicación está destinada a cubrir cualesquier variación, uso o adaptación de las modalidades de la invención usando sus principios generales. Además, esta solicitud está destinada a cubrir tales desviaciones de la presente descripción que entran dentro de la práctica conocida o habitual en la teenica a la que pertenecen tales modalidades y que están dentro de los límites de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Una molecula aislada de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de: una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEC ID No. : 2 o SEC I D No. : 3; una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC I D No. : 1 ; y un ácido nucleico heterólogo que comprende una secuencia de nucleótidos que se híbrida con otro ácido nucleico que tiene la SEC I D No. : 2 o SEC ID No. : 3 bajo condiciones de alta rigurosidad. 2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 , en donde el ácido nucleico comprende una secuencia sintética que ha sido diseñado para la expresión en una planta. 3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 . 4. El vector de la reivindicación 3, que comprende además un ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo. 5. El vector de la reivindicación 3, en donde el ácido nucleico está unido operativamente a un promotor. 6. Una célula huésped que contiene la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 como un ácido nucleico heterólogo unido operativamente a un promotor. 7. El vector de la reivindicación 5, en donde el promotor es el promotor AtUbM O. 5 8. La celula huésped de la reivindicación 6, en donde la célula huésped es una célula vegetal. 9. Una planta transgénica, parte de la planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula vegetal que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1 . ío 10. La planta transgénica, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula de planta de la reivindicación 9, en donde la planta, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, y / o célula de planta es tolerante al glifosato, cuando se compara con un tipo de planta silvestre de la misma especie. 15 1 1 . La planta transgénica, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula de planta de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico no codifica LGNAAT (SEC I D No. : 141 ) y no codifica ALLMXAPLT, en la que X se selecciona del grupo que consiste de alanina, serina, y treonina (SEC I D No. : 0 142) . 12. La planta, parte de planta, órgano de planta , semilla de planta, o célula de planta de la reivindicación 9, en donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que tiene identidad de al menos el 90% de la secuencia con la secuencia de aminoácidos 5 de SEC I D No. : 1 , que cuando se alinean con la SEC I D No. : 1 , comprende una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC I D No. : 1 y/o una treonina en la posición correspondiente a la posición 172 de la SEC I D No. : 1 . 13. Un cultivo de tejido de celulas regenerables producido a partir de la planta, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, y / o célula de planta de la reivindicación 9. 14. Los proplastos producidos a partir de la planta transgénica, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula de planta de la reivindicación 9. 15. El cultivo de tejido de la reivindicación 13, en donde las células regenerables se producen a partir de un tipo de tejido seleccionado del grupo que consiste de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, células meristemáticas, raíces, puntas de raíces, anteras, flores, tallos y vainas. 16. Una planta regenerada a partir del cultivo de tejido de la reivindicación 13, dentro del cual la planta es resistente a glifosato. 17. La célula de planta, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula de la planta de la reivindicación 9, en donde el genoma comprende una molécula de ácido nucleico que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con la SEC I D No. : 2 o la SEC I D No. : 3. 18. Un método de generación de célula de una planta, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula de una planta resistente al glifosato, el método se constituye por: la transformación de la planta, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o celula de planta con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ; y la extracción de un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con SEC ID 5 No. : 1 . 19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la planta transformada, parte de planta, órgano de planta, semilla de planta, o célula de planta es resistente al glifosato. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, donde ío el polipéptido no incluye a LGNAAT (SEC I D No. : 141 ) y/o no Incluye ALLMXAPLT, en la que X se selecciona del grupo que consiste de alanina, serina, y treonina (SEC I D No. : 142). 21 . El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el polipéptido, cuando se alinean con la SEC ID No. : 1 , 15 Incluye una alanina en la posición correspondiente a la posición 84 de la SEC I D No. : 1 y / o una treonina en la posición correspondiente a la posición 172 de la SEC I D No. : 1 . 22. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la molécula de ácido nucleico tiene al menos 95% de 20 identidad de secuencia con la SEC I D No. : 2 o SEC I D No. : 3. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID No. : 2 o SEC I D No. : 3. 24. Un método para controlar malas hierbas en una 25 superficie de cultivo que contiene las plantas resistentes a los herbicidas, el metodo incluye: plantar una planta o una semilla de planta que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 en la superficie de cultivo; y 5 aplicar a la superficie de cultivo una cantidad suficiente de herbicida para controlar las malas hierbas en la superficie de cultivo sin afectar significativamente a la planta o semilla de la planta. 25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en lo donde el herbicida es el glifosato. 26. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la planta o semilla de planta que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 , comprende un segundo ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo. 15 27. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde el segundo ácido nucleico incluye aad- 1 o aad- 12. 28. U n método para conferir resistencia a un herbicida en una planta, el método incluye: la transformación de la planta con un constructo de ADN , tal 0 constructo incluye un promotor vinculado operativamente a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 ; la regeneración una planta transformada; y la expresión de la molécula de ácido nucleico para producir un polipéptido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia 5 con SEC I D No. : 1 . 29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el herbicida es el glifosato. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el constructo de ADN incluye una segunda molécula de 5 ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo extraíble en la planta. 31 . El método de acuerdo con la reivindicación 30, en donde el polipéptido heterólogo incluye aad- 1 o aad- 12. 32. Una planta que tiene integrada de manera estable en ío su genoma el ácido nucleico de la reivindicación 1 , como un ácido nucleico heterólogo, en donde el ácido nucleico está vinculado operativamente a un promotor. 33. La planta de la reivindicación 32 , en donde la planta es una planta de soja. 15 34. La planta de la reivindicación 32 , en donde la planta es una planta de maíz. 35. La planta de la reivindicación 32 , en donde la planta se selecciona del grupo que consiste de trigo, maíz, soja, tabaco, brachiaria, arroz, mijo, cebada, tomate, manzana, pera, fresa, 20 naranja, alfalfa, algodón, zanahoria, patata, remolacha, batata, lechuga, espinaca, petunia, rosa, crisantemo, césped, pinos, abetos, piceas, plantas que acumulan metales pesados, girasol, cártamo, colza, y Arabidopsis. 36. La planta de la reivindicación 32 , en donde la planta 25 es una especie seleccionada del grupo que consiste de los generos de Asparagus, Avena, Brachiaria, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucúrbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Helianthus, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, 5 Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorgo, Triticum, Vitis, Vigna, y Zea. 37. La célula huésped de la reivindicación 8, en donde célula de la planta no es regenerable para producir una planta. 38. La célula huésped de la reivindicación 9, en donde ío célula de la planta no es regenerable para producir una planta. 39. El método de la reivindicación 18, en donde célula de la planta que no es regenerable para producir se transforma.
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