BR112014018903A2 - plantas resistentes ao glifosato e métodos associados - Google Patents

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Justin M. Lira
Robert M. Cicchillo
Carla Yerkes
Andrew E. Robinson
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Dow Agrosciences Llc
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Abstract

  MÉTODO DE GERAÇÃO DE UMA PLANTA, PARTE DE PLANTA, ÓRGÃO DE PLANTA, SEMENTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA RESISTENTE A HERBICIDA, USO DAS MESMAS, MÉTODO PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A UM HERBICIDA A UMA PLANTA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, BEM COMO MÉTODO PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS EM UMA ÁREA SOB CULTIVO CONTENDO PLANTAS RESISTENTES A HERBICIDAS. São fornecidas plantas, partes de plantas, órgãos de plantas, sementes de plantas e/ou células de plantas que têm resistência ao glifosato compreendendo um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1 e métodos associados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO DE GERAÇÃO DE UMA PLANTA, PARTE DE PLANTA, ÓRGÃO DE PLANTA, SEMENTE DE PLANTA OU CÉLULA DE PLANTA RE- SISTENTE A HERBICIDA, USO DAS MESMAS, MÉTODO PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A UM HERBICIDA A UMA PLANTA, MO- LÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA,
BEM COMO MÉTODO PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS EM UMA ÁREA SOB CULTIVO CONTENDO PLANTAS RESISTEN- TES A HERBICIDAS". REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] O presente Pedido reivindica o benefício do Pedido de Pa- tente Provisório dos Estados Unidos Nº de Série 61/593.555, deposi- tado em 1 de Fevereiro de 2012 e também do Pedido de Patente Pro- visório dos Estados Unidos Nº de Série 61/625.222, depositado em 17 de Abril de 2012. DECLARAÇÃO DE ACORDO COM 37 C.E.R. $& 1.821 (C) OU (E) -
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADAS COMO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] De acordo com 37 C.F.R. $ 1.821 (c) ou (e), um arquivo que contém uma versão em texto ASCII da Listagem de Sequências foi enviado concomitantemente com o presente Pedido, os conteúdos do qual são aqui incorporados por referência.
CAMPO TÉCNICO
[003] A presente descrição refere-se a plantas novas e distintas que compreendem DGT-14, bem como métodos associados. Algumas modalidades referem-se a novos polipeptídeos envolvidos no metabo- lismo de N-(fosfonometil) glicina, ácidos nucleicos que codificam tais polipeptídeos e métodos para identificação dos mesmos. Modalidades particulares referem-se à plantas, partes de planta, órgãos de planta e células de planta que compreendem os polipeptídeos e/ou ácidos nu-
1a/168 cleicos precedentes.
ANTECEDENTES
[004] Espécies de ervas daninhas têm sido há muito um proble- ma em campos cultivados. Em virtude de uma operação de mão de obra intensiva, o controle de ervas daninhas tem se tornado mais fácil pela disponibilidade de herbicidas químicos que matam eficientemente /
variedades de culturas e fertilizantes aprimorados, fez uma contribui- ção significativa para a "revolução verde" em agricultura. Herbicidas particularmente úteis são aqueles que têm um amplo espectro de ati- vidade herbicida. Infelizmente, os herbicidas de largo espectro têm, tipicamente, um efeito prejudicial sobre as plantas de cultura expostas ao herbicida. Uma forma de superar este problema é produzir plantas que são tolerantes a determinados herbicidas de largo espectro.
[005] Um exemplo de um herbicida de largo espectro é N- fosfonometil-glicina, também conhecido como glifosato. O glifosato tem sido amplamente usado por agricultores em todo o mundo para o con- trole de ervas daninhas antes de plantio das culturas, por exemplo, em plantio direto. Além disso, o glifosato é um meio eficiente para controle de ervas daninhas e plantas voluntárias entre os ciclos de produção ou rotação de culturas. O glifosato não permanece no solo após o uso e é amplamente considerado como um dos herbicidas químicos mais am- bientalmente seguros e amplamente eficazes disponíveis para uso em agricultura.
[006] O glifosato mata as plantas por meio de inibição da via de ácido chiquímico. Esta via leva à biossíntese de compostos aromáti- cos, incluindo aminoácidos, vitaminas e hormônios de plantas. O glifo- sato bloqueia a condensação de ácido fosfoenolpirúvico (PhosphoE- nolPyruvic - PEP) e ácido 3-fosfochiquímico em ácido 5-enolpiruvil-3- fosfochiquímico através de ligação e inibição de atividade da enzima sintase de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato, comumente referida como "sintase de EPSP" e "EPSPS".
[007] Infelizmente, não há plantas de cultura conhecidas que são naturalmente tolerantes ao glifosato e, portanto, a utilidade deste her- bicida para o controle de ervas daninhas em culturas cultivadas era limitada. Um método para produzir plantas de cultura tolerantes ao gli- fosato é introduzir um gene que codifica uma forma tolerante ao glifo-
sato heteróloga de um gene de EPSPS na planta de cultura usando técnicas de engenharia genética. Usando mutagênese química, formas tolerantes ao glifosato de EPSPS foram produzidas em bactérias e os genes heterólogos foram introduzidos em plantas para produzir plantas tolerantes ao glifosato (vide, por exemplo, Comai et al., Science 221: 370-71 (1983)). Os genes de EPSPS heterólogos são usualmente su- perexpressos em plantas de cultura para se obter o nível desejado de tolerância.
[008] Os exemplos precedentes da técnica relacionada e limita- ções associadas à mesma se destinam a ser ilustrativos e não exclusi- vos. Outras limitações da técnica relacionada se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica quando de leitura do relatório descri- tivo.
DESCRIÇÃO
[009] Em modalidades, a descrição refere-se a uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0010] Em outras modalidades, a descrição refere-se a métodos de produção de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta resistente ao glifosato compreendendo: transformação de uma planta, parte de planta, órgão de planta, se- mente de planta e/ou célula de planta com um ácido nucleico que codi- fica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1; e expressão do ácido nucleico de modo a produzir o polipeptí- deo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0011] Modalidades incluem vetores que compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de iden- tidade com SEQ ID NO: 1.
[0012] Exemplos particulares incluem vetores que compreendem um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0013] Outras modalidades incluem vetores compreendendo uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Por exemplo, um vetor pode compre- ender uma sequência de ácido nucleico tendo pelo menos 90% de i- dentidade com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
[0014] Modalidades incluem plantas tolerantes ao glifosato e célu- las de planta que expressam um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO: 1.
[0015] Modalidades adicionais incluem métodos para controle de ervas daninhas em um campo ou área sob cultivo contendo plantas resistentes ao glifosato, em que tal método pode incluir: plantio de uma planta ou uma semente de planta que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com SEQ ID NO : 1 no campo ou área sob cultivo; e aplicação, ao campo ou área sob cultivo, de uma quantidade suficiente de glifosato para o controle de ervas daninhas no campo sem afetar significativa- mente a planta.
[0016] Em algumas modalidades, a descrição refere-se à células regeneráveis para uso em cultura tecidual de plantas resistentes ao glifosato. Tal cultura tecidual pode ser capaz de regeneração de plan- tas tendo as características morfológicas e fisiológicas das plantas re- sistentes ao glifosato precedentes e também de regeneração de plan- tas tendo substancialmente o mesmo genótipo que as plantas prece- dentes. Células regeneráveis em tais culturas teciduais podem ser, por exemplo, embriões, protoplastos, células meristemáticas, caule, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raízes, flores, sementes, frutos e colmos. Modalidades particulares referem-se à plantas regeneradas a partir de culturas teciduais de modalidades da descrição.
[0017] Em algumas modalidades, a descrição refere-se à células que não são regeneráveis para produzir plantas, por exemplo, para uso em produção de linhagens de células de plantas resistentes ao glifosato. Em outras modalidades, a descrição refere-se à plantas que compreendem, em parte, tais células.
[0018] Em determinadas modalidades, a presente descrição refe- re-se á aplicação de múltiplos herbicidas às culturas plantadas em uma área sob cultivo. Uma aplicação sobre a parte superior de glifosa- to, além de múltiplos herbicidas, tira vantagem das propriedades dos diferentes herbicidas, de modo que é conferido controle de ervas dani- nhas com uma combinação aprimorada de flexibilidade e economia. Por exemplo, herbicidas individuais têm diferentes longevidades na área sob cultivo ou seja, alguns herbicidas persistem e são eficazes por um tempo relativamente longo após terem sido aplicados à área, enquanto que outros herbicidas são rapidamente decompostos em ou- tros compostos ativos e/ou inativos. Um sistema de aplicação de her- bicida aprimorado de acordo com determinadas modalidades permite o uso de glifosato e múltiplos herbicidas, de modo que os produtores podem configurar a seleção de determinados herbicidas para uso em uma situação em particular.
[0019] Em outras modalidades, a presente descrição refere-se a métodos e composições para produção e uso de uma planta que é to- lerante a mais de um herbicida ou classe ou subclasse de herbicidas, conforme descrito abaixo. Em modalidades particulares, é fornecida uma planta que é tolerante ao glifosato e pelo menos um outro herbici- da (ou classe ou subclasse de herbicida) ou produto químico (ou clas- se ou subclasse de outro produto químico) (por exemplo, fungicidas, inseticidas, reguladores de crescimento de plantas e similares). Tais plantas podem encontrar uso, por exemplo, em métodos que compre- endem o tratamento de plantas de cultura com múltiplos herbicidas.
Assim, a descrição proporciona plantas resistentes a herbicidas as quais toleram o tratamento com um herbicida ou combinação de herbi- cidas (incluindo uma combinação de herbicidas que atuam, cada um, através de um modo de ação diferente) ou uma combinação de pelo menos um herbicida e pelo menos um outro produto químico, incluindo fungicidas, inseticidas, reguladores de crescimento de plantas e simila- res. Deste modo, a descrição fornece métodos aprimorados de cres- cimento plantas de cultura pelo fato de que ervas daninhas são seleti- vamente controladas.
[0020] Em uma modalidade, as plantas resistentes a herbicidas compreendem uma molécula de ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo heterólogo que confere tolerância ao glifosato e uma molécu- la de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que confere tolerân- cia ao ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). De acordo com os pará- grafos precedentes, são fornecidas plantas que compreendem pelo menos uma terceira molécula de ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo que confere à planta de um traço selecionado do grupo que consiste em um traço de tolerância a herbicida; um traço de resistência a insetos; um traço agronômico; um traço de resistência à doenças; um traço de ácido graxo modificado; ou um traço de fitato reduzido.
[0021] Em outra modalidade, as plantas resistentes a herbicidas compreendem uma molécula de ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato e uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao glufosinato. Alguns exemplos incluem uma planta resistente a herbici- das que compreende pelo menos uma terceira molécula de ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo que confere à planta um traço de tolerância a herbicida, um traço de resistência a insetos, um traço a- gronômico, um traço de resistência à doenças, um traço de ácido gra- xo modificado ou um traço de fitato reduzido.
[0022] Em outra modalidade, a planta resistente a herbicidas com- preende uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que confere tolerância ao glifosato e uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida que inibe a enzima sintase de acetolactato (AcetoLactate Synthase - ALS) (Lee et al., 1988 EMBO J. 7: 1241), também conhecida como en- zima sintetase de aceto-hidroxiácido (AcetoHydroxyAcid Synthase - AHAS) (Miki et al., 1990, Theor. Appl. Genet. 80: 449). Deste modo, são ainda proporcionadas plantas que compreendem pelo menos uma terceira molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que confere à planta um traço de tolerância a herbicida, um traço de resis- tência a insetos, um traço agronômico, um traço de resistência à do- enças, um traço de ácido graxo modificado ou um traço de fitato redu- zido.
[0023] Em outra modalidade, todas as moléculas de ácido nucleico podem ser combinadas ou "empilhadas" com qualquer outra molécula de ácido nucleico para conferir resistência ou tolerância adicional ao glifosato ou outro herbicida e/ou para conferir resistência a insetos ou doenças selecionados e/ou melhorias nutricionais e/ou características agronômicas aprimoradas e/ou proteínas ou outros produtos úteis para uso em rações para animais, alimentos, industrial, farmacêutico ou ou- tros. Modalidades incluem o empilhamento de duas ou mais sequên- cias de ácidos nucleicos de interesse dentro do genoma de uma plan- ta. Tal pilha pode ser obtida via melhoramento convencional de planta usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, re-transformação de uma planta transgênica ou adição de novos traços através de integra- ção objetivada via recombinação homóloga. Um exemplo de tal pilha é qualquer combinação de um dos seguintes: uma molécula de ácido nucleico de dgt-14, uma molécula de ácido nucleico de Cry34Ab1, uma molécula de ácido nucleico de Cry35Ab1, uma molécula de ácido nu- cleico de Cry1F, uma molécula de ácido nucleico de Cry1Ac, uma mo- lécula de ácido nucleico de aad-12, uma molécula de ácido nucleico de add-1, uma molécula de ácido nucleico de pat e uma molécula de áci- do nucleico de DSM-2.
[0024] Além dos aspectos exemplificativos e modalidades descri- tas acima, aspectos e modalidades adicionais se tornarão evidentes por meio de estudo das descrições a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025] A Figura 1 representa um alinhamento de sequência parcial de DGT-14 (SEQ ID NO: 46), DGT-11 (SEQ ID NO: 47), DGT-12 (SEQ ID NO: 49), DGT-18 (SEQ ID NO: 50) DGT-29 (SEQ ID NO: 53) e DGT-30 (SEQ ID NO: 52) com outras enzimas sintase de EPSP, tais como grg-23 (SEQ ID NO: 54; derivada de Patente dos Estados Uni- dos Nº 7.834.249.), CP4 (SEQ ID NO: 48; ACESSO GENB ANK Nº AEM75108.1) de Agrobacterium tumefaciens, DGT-3 (SEQ ID NO: 57; ACESSO GENBANK Nº P17688) de Brassica napus, DGT-1 (SEQ ID NO: 56) de Glycine max, DGT-7 (SEQ ID NO: 55; ACESSO GENBANK Nº EU977181) de Triticum aestivum e aroA (SEQ ID NO: 51; Padgette et al. (1991); Eschenburg et al. (2002); Priestman et al. (2005), Hagha- ni et al. (2008) de Escherichia coli. Todas as seis enzimas DGT (DGT- 14, DGT-11, DGT-12, DGT-18, DGT-30 e DGT-29) compartilham uma alanina conservada na posição de aminoácido 96 da enzima sintase de EPSP aroA. A localização deste aminoácido é indicada por um as- terisco e o resíduo de aminoácido está sublinhado.
[0026] A Figura 2 mostra um alinhamento das enzimas de com- primento total de DGT-1 (SEQ ID NO: 59) de Glycine max, DGT-3 (SEQ ID NO: 58; ACESSO GENBANK Nº* P17688) de Brassica napus e DGT-7 (SEQ ID NO: 60; ACESSO GENBANK Nº EU977181 ) de Tri- ticum aestivum. A localização do resíduo de aminoácido que sofreu mutação de glicina para alanina é indicada pelo primeiro asterisco. À localização do resíduo de aminoácido que sofreu mutação de treonina para isoleucina é indicada pelo segundo asterisco. A localização do terceiro resíduo de aminoácido que sofreu mutação de prolina para serina é indicada pelo terceiro asterisco.
[0027] A Figura 3 representa um mapa do plasmídeo de PDAB100427.
[0028] A Figura 4 representa um mapa do plasmídeo PDAB102946.
[0029] A Figura 5 representa um mapa do plasmídeo PDAB100431.
[0030] A Figura 6 representa um mapa do plasmídeo PDAB100432.
[0031] A Figura 7 representa um mapa do plasmídeo de PDAB100435.
[0032] A Figura 8 representa um mapa do plasmídeo PDAB100446.
[0033] A Figura 9 representa um mapa do plasmídeo de PDAB100436.
[0034] A Figura 10 representa os valores de ICs59 obtidos após in- trodução de várias mutações dentro de DGT-1 (A) e DGT-7 (B) usando PEP a 1 mM. Tanto para as curvas de ICs,K para quanto B, triângulos sólidos representam o tipo selvagem, círculos fechados representam os mutantes GA, quadrados abertos representam mutantes e quadra- dos sólidos representam mutantes TIPS.
[0035] A Figura 11 descreve um mapa de plasmídeo de PDAB107526.
[0036] A Figura 12 descreve um mapa de plasmídeo de PDAB102787.
[0037] A Figura 13 descreve um mapa de plasmídeo de
PDAB105525.
[0038] A Figura 14 descreve um mapa de plasmídeo de PDAB105526.
[0039] A Figura 15 descreve um mapa de plasmídeo de PDAB105527.
[0040] A Figura 16 descreve um mapa de plasmídeo de PDAB105528.
[0041] A Figura 17 descreve um mapa de plasmídeo de PDAB105529. MODO(S) PARA REALIZAR A INVENÇÃO
[0042] As moléculas de ácido nucleico de dgt-14 com códons oti- mizados descritas aqui são úteis em uma ampla variedade de aplica- ções nas quais resistência ao herbicida glifosato pode ser de uso na planta.
[0043] Quando de referência a plantas que são resistentes ou tole- rantes ao glifosato, entenda-se que uma aplicação de uma quantidade suficiente de glifosato na planta não afeta significativamente ou mata a planta. Uma planta pode ser naturalmente tolerante a um herbicida em particular ou uma planta pode ser tolerante a herbicidas como um re- sultado de intervenção humana tal como, por exemplo, reprodução se- letiva ou a introdução de um transgene no genoma da planta. Uma "planta resistente ao glifosato" é uma planta que contém um polipeptí- deo ou molécula de ácido nucleico que confere tolerância ao herbicida à planta ou outro organismo que a expressa (isto é, torna uma planta ou outro organismo tolerante a herbicidas). Plantas que são resisten- tes ou tolerantes ao glifosato podem mostrar algum impacto mínimo da aplicação de glifosato à planta. Por exemplo, pode haver uma altera- ção no crescimento e desenvolvimento normais da planta, em que a planta pode exibir sinais ou sintomas que estão associados a estresse ou doença. Tal impacto mínimo resultante da aplicação de glifosato à plantas que são resistentes ou tolerantes ao glifosato contrasta com o impacto negativo que resulta na aplicação de glifosato à plantas que são suscetíveis ao glifosato. A aplicação de glifosato à plantas susce- tíveis pode afetar significativamente ou matar a planta. A aplicação de glifosato à plantas que compreendem uma molécula de ácido nucleico que confere tolerância resulta em significativamente menos impacto do que a aplicação à plantas que não compreendem uma molécula de ácido nucleico que confere tolerância ao glifosato.
[0044] Assim, uma planta tolerante a um herbicida ou outro produ- to químico, se ela mostra dano em comparação com uma planta de controle apropriada, este é menor do que o dano exibido pela planta de controle em pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% ou 1000% ou mais. Desta maneira, uma planta que é tolerante a um herbicida ou outro produto químico mostra tolerância aprimorada em relação a uma planta de controle apropriada. Danos resultantes de tratamento com herbicida ou outro produto quíi- mico são ensaiados avaliando-se qualquer parâmetro de crescimento ou bem-estar da planta considerado adequado por aqueles versados na técnica. O dano pode ser avaliado através de verificação visual e/ou por meio de análise estatística de parâmetros apropriados de plantas individuais ou um grupo de plantas. Assim, o dano pode ser ensaiado avaliando-se, por exemplo, parâmetros tais como a altura da planta, peso da planta, coloração das folhas, comprimento da folha, floração, fertilidade, formação de espigas, rendimento, produção de sementes e assim por diante. Danos também podem ser ensaiados avaliando-se o tempo decorrido para um estágio de desenvolvimento em particular (por exemplo, formação de espigas, floração ou poliniza- ção) ou o tempo decorrido até que a planta se recupere de tratamento com um determinado herbicida e/ou produto químico.
[0045] Ao fazer tais avaliações, valores específicos podem ser a- tribuídos a determinados graus de danos, de modo que análise estatís- tica ou comparações quantitativas podem ser feitas. O uso das faixas de valores que descrevem graus específicos de danos é conhecido na técnica e qualquer faixa ou escala adequada pode ser usada. Por e- xemplo, escores de lesão por herbicida (também denominados esco- res de tolerância) podem ser atribuídos. Conforme indicado acima, a tolerância a herbicida também é indicada por outras classificações nesta escala, onde uma planta de controle apropriada exibe um escore menor na escala ou onde um grupo de plantas de controle adequado exibe um escore estatisticamente menor em resposta a um tratamento com herbicida do que um grupo das plantas em questão.
[0046] Os danos causados por um herbicida ou outro produto qui- mico podem ser avaliados em vários momentos após uma planta ter sido tratada com um herbicida. Muitas vezes, o dano é avaliado em torno do período em que a planta de controle exibe dano máximo. Al- gumas vezes, o dano é avaliado após um período de tempo no qual uma planta de controle que não foi tratada com herbicida ou outro pro- duto químico tenha crescido e/ou se desenvolvido de forma mensurá- vel quando comparado com o tamanho ou estágio no qual foi adminis- trado o tratamento. Os danos podem ser avaliados em vários momen- tos, por exemplo, em 12 horas ou em 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dias ou três semanas, quatro semanas ou mais após a planta de teste ter sido foi tratada com herbicida. Qualquer momento de ava- liação é adequado, contanto que ele permita a detecção de uma dife- rença na resposta a um tratamento entre plantas de teste e de contro- le.
[0047] Um herbicida "não afeta significativamente" uma planta quando ele não tem efeito sobre a planta ou quando ele tem algum efeito sobre a planta do qual a planta se recupera depois ou quando ele tem um efeito que é prejudicial, mas o qual é compensado, por e- xemplo, pelo impacto do herbicida particular sobre as ervas daninhas. Assim, por exemplo, uma planta de cultura não é "significativamente afetada" por um herbicida ou outro tratamento se ela exibe uma dimi- nuição de menos de 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% em pelo menos um parâmetro adequado que é indicati- vo de saúde e/ou produtividade na planta quando comparado com uma planta de controle adequada (por exemplo, uma planta de cultura sem tratamento). Parâmetros adequados que são indicativos de saúde e/ou produtividade da planta incluem, por exemplo, a altura da planta, peso da planta, comprimento das folhas, tempo decorrido até um de- terminado estágio de desenvolvimento, floração, rendimento, produção de sementes e similares. A avaliação de um parâmetro pode ser atra- vés de verificação visual e/ou por meio de análise estatística de qual- quer parâmetro adequado. Uma comparação pode ser feita através de verificação visual e/ou por meio de análise estatística. Consequente- mente, uma planta de cultura não é "significativamente danificada por" um herbicida ou outro tratamento se ela exibe uma diminuição em pelo menos um parâmetro, mas essa diminuição é de natureza temporária e a planta se recupera inteiramente dentro de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas ou 6 semanas.
[0048] Inversamente, uma planta é significativamente afetada ou danificada por um herbicida ou outro tratamento se ela exibe mais de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 150% ou 170% de diminuição em pelo menos um parâmetro adequado que é indicativo de saúde e/ou produtividade da planta em comparação com uma plan- ta de controle adequada (por exemplo, uma erva daninha não tratada da mesma espécie). Assim, uma planta é significativamente danificada quando ela exibe uma diminuição em pelo menos um parâmetro e a planta não se recupera inteiramente dentro de 1 semana, 2 semanas,
3 semanas, 4 semanas ou 6 semanas.
[0049] Danos resultantes de um herbicida ou outro tratamento químico de uma planta são avaliados por meio de inspeção visual de outro método adequado por aqueles versados na técnica e são avalia- dos através de análise estatística de parâmetros adequados. A planta a ser avaliada é dita como a "planta de teste". Tipicamente, uma planta de controle adequada é qualquer uma que expresse o(s) mesmo(s) polipeptídeo(s) de tolerância a herbicida que a planta a ser avaliada quanto à tolerância a herbicidas (isto é, a "planta de teste"), mas que não foi tratada com herbicida.
[0050] A menos que definido em contrário, todos os termos técni- cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme co- mumente entendido por aqueles versados na técnica à qual a presente descrição se refere. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. A menos que requerido pelo contexto, ter- mos no singular devem incluir o plural e termos no plural incluem o singular. Todas as publicações, patentes e outras referências mencio- nadas aqui são incorporadas por referência na íntegra para todas as finalidades, como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicada como sendo incorporada por referência, a menos que apenas seções específicas de patentes ou publicações de patentes sejam indicadas como sendo incorporadas por referência.
[0051] Para esclarecer ainda mais a presente descrição, os ter- mos, abreviaturas e definições a seguir são fornecidos.
[0052] Conforme usado aqui, os termos "compreende", "compre- endendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo" ou qualquer outra variação dos mesmos se destinam a ser não exclu- sivos ou abertos. Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreende uma lista de elementos não está necessariamente limitado a apenas esses elementos, mas pode incluir outros elementos que não estejam ex- pressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, proces- so, método, artigo ou aparelho. Além disso, a menos que expressa- mente indicado em contrário, "ou" refere-se a um ou inclusivo e não a um ou exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente), A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente) e tanto A quanto B são verdadeiros (ou presentes).
[0053] Também, os artigos indefinidos "um" e "uma" precedendo um elemento ou componente de uma modalidade da descrição se des- tinam a ser não restritivos em relação ao número de casos, isto é, as ocorrências do elemento ou componente. Portanto "um" ou "uma" deve ser lido para incluir um ou pelo menos um e a forma da palavra no sin- gular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número seja obviamente concebido para estar no singular.
[0054] O termo "invenção" ou "presente invenção", conforme usa- do aqui, é um termo não limitativo e não se destina a referir-se a qual- quer modalidade única da invenção em particular, mas abrange todas as possíveis modalidades, conforme descrito no pedido.
[0055] Um "herbicida" é um produto químico que causa lesão tem- porária ou permanente a uma planta. Exemplos não limitativos de her- bicidas que podem ser empregados nos vários métodos e composi- ções da descrição são discutidos em maiores detalhes aqui. Um herbi- cida pode ser incorporado na planta ou pode atuar sobre a planta sem ser incorporado pela planta ou suas células. Um "ingrediente ativo" é o produto químico em uma formulação herbicida principalmente respon- sável por sua fitotoxicidade e o qual é identificado como sendo o in- grediente ativo no rótulo do produto. Informação no rótulo do produto está disponível a partir da U.S. Environmental Protection Agency e é atualizada online em oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own; informação no rótulo do produto também está disponível on-line em www.cdms.net. O termo "equivalente ácido" expressa a taxa ou quantidade como o ácido parental do ativo herbicida.
[0056] O termo "planta", conforme usado aqui inclui, porém sem limitações, qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma plan- ta.
[0057] Os termos "polinucleotídeo", "ácido nucleico" e "molécula de ácido nucleico" se destinam a abranger um único ácido nucleico, bem como múltiplos ácidos nucleicos, um fragmento de ácido nucleico, variante ou derivado do mesmo, ou construto, por exemplo, RNA men- sageiro (MRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeos da sequência de cDNA de comprimento total ou um fragmento da mesma, incluindo as sequências não traduzidas 5' e 3' e as sequências de codificação. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, o qual pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. Por exem- plo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser composto de DNA fita simples ou fita dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e fita dupla, RNA fita simples e dupla e RNA que é uma mistu- ra de um regiões de fita simples e dupla, moléculas híbridas compre- endendo DNA e RNA que podem ser fita simples ou, mais tipicamente, fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Estes termos também abrangem formas química, enzimática ou metabolica- mente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.
[0058] Uma sequência de polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser dita como "isolada", na qual ela tenha sido removida de seu ambi- ente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico heteró- logo que codifica um polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo com atividade de tolerância ao glifosato contido em um vetor é considerado isolado para fins da presente descrição. Outros exemplos de um poli- nucleotídeo isolado ou ácido nucleico incluem polinucleotídeo recom- binante mantido em células hospedeiras heterólogas ou um polinucleo- tídeo ou ácido nucleico purificado (parcial ou substancialmente) em solução. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico isolado de acordo com modalidades da presente descrição inclui ainda tais moléculas produ- zidas sinteticamente. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico isolado na forma de um polímero de DNA pode ser compreendido de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.
[0059] O termo "gene" refere-se a uma sequência de ácido nuclei- co que codifica moléculas de produtos funcionais, quer RNA ou proteí- na, opcionalmente incluindo sequências reguladoras que precedem (sequências não codificadoras 5') e sucedem (sequências não codifi- cadoras 3') a sequência codificadora.
[0060] Conforme usado aqui, o termo "região codificadora" refere- se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoá- cidos específica. "Sequências reguladoras apropriadas" refere-se à sequências de nucleotídeos localizada a montante (sequências não codificadoras), dentro ou a jusante (sequências não codificadoras 3') de uma sequência codificadora e que influenciam a transcrição, pro- cessamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência codifi- cadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, íntrons, sequências de reconhecimen- to de poliadenilação, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação de efetuador e estrutura de haste-alça.
[0061] Conforme usado aqui, o termo "polipeptídeo" se destina a abranger um único "polipeptídeo", bem como múltiplos "polipeptídeos" e fragmentos dos mesmos e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida
(também conhecidas como ligações peptídicas). O termo "polipeptí- deo" refere-se a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento específico do produto. Assim, pep- tídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeos, "proteína", "cadeia de aminoácidos" ou qualquer outro termo usado para se referir a uma ca- deia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos estão incluídos na defi- nição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de ou alternadamente com qualquer um destes termos. Um poli- peptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzi- do por meio da tecnologia recombinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer modo, incluindo através de síntese quíi- mica.
[0062] Por um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante ou derivado do mesmo, entenda-se um polipeptídeo que não está em seu meio natural. Não é necessário qualquer nível particular de purificação. Assim, referência a "isolado" significa o envolvimento da "mão huma- na", conforme descrito aqui. Por exemplo, um polipeptídeo isolado po- de ser removido de seu ambiente nativo ou natural. Polipeptídeos e proteínas recombinantes expressos em células hospedeiras são con- siderados isolados para fins da descrição, bem como polipeptídeos nativos ou recombinantes que tenham sido separados, fracionados ou parcial ou substancialmente purificados por meio de qualquer técnica adequada.
[0063] Conforme usado aqui, "nativo" refere-se à forma de um po- linucleotídeo, gene ou polipeptídeo conforme encontrado na natureza com suas próprias sequências reguladoras, se presentes.
[0064] Conforme usado aqui, "endógeno" refere-se à forma natural de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo em sua localização natu- ral no organismo ou no genoma de um organismo. "Polinucleotídeo endógeno" inclui um polinucleotídeo nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. "Gene endógeno" inclui um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. "Polipeptídeo endógeno" inclui um polipeptídeo nativo em sua localização natural no organismo.
[0065] Conforme usado aqui, "heterólogo" refere-se a um polinu- cleotídeo, gene ou polipeptídeo normalmente não encontrado no orga- nismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro. "Polinucleotídeo heterólogo" inclui uma região codificadora nativa ou uma porção da mesma que é reintroduzida no organismo de origem em uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo corresponden- te. "Gene heterólogo" inclui uma região codificadora nativa ou uma porção da mesma que é reintroduzida no organismo de origem em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exem- plo, um gene heterólogo pode incluir uma região codificadora nativa que é uma porção de um gene quimérico incluindo regiões reguladoras não nativas, que é reintroduzida no hospedeiro nativo. "Polipeptídio heterólogo" inclui um polipeptídeo nativo que é reintroduzido no orga- nismo de origem em uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente. Os presentes genes e proteínas podem ser fundidos com outros genes e proteínas para produzir proteínas de fusão ou quiméricas. Os genes e proteínas úteis de acordo com modalidades da presente descrição incluem não apenas as sequências de comprimen- to total especificamente exemplificadas, mas também porções, seg- mentos e/ou fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e deleções internas e/ou terminais comparado com as moléculas de comprimento total) destas sequências, variantes, mutantes, quiméricos e fusões dos mesmos.
[0066] Conforme usado aqui, o termo "modificação" pode referir-se a uma alteração em um polinucleotídeo descrito aqui que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo, bem como uma alteração em um polipeptídeo descrito aqui que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada do polipeptídeo. Alternativa- mente, o termo "modificação" pode referir-se a uma alteração em um polinucleotídeo descrito aqui que resulta em atividade aumentada ou aprimorada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo, bem como uma alteração em um polipeptídeo descrito aqui que resulta em atividade aumentada ou aprimorada do polipeptídeo. Tais alterações podem ser feitas por meio de métodos bem conhecidos na técnica in- cluindo, porém sem limitações, deleção, mutação (por exemplo, muta- gênese espontânea, mutagênese aleatória, mutagênese causada por genes mutantes ou mutagênese de transposon), substituição, inser- ção, regulação negativa, alteração de localização celular, alteração do estado do polinucleotídeo ou polipeptídeo (por exemplo, metilação, fosforilação ou ubiquitinação), remoção de um cofator, introdução de um RNA/DNA anti-senso, introdução de um RNA/DNA de interferência, modificação química, modificação covalente, irradiação com raios UV ou raios X, recombinação homóloga, recombinação mitótica, métodos de substituição de promotor e/ou combinações dos mesmos. Orienta- ção sobre a determinação de quais nucleotídeos ou resíduos de ami- noácidos podem ser modificados pode ser encontrada comparando-se a sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo particular com aquela de polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos, por exemplo, de le- vedura ou bacterianos, e maximizando o número de modificações fei- tas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou sequên- cias de consenso.
[0067] O termo "derivado", conforme usado aqui, refere-se a uma modificação de uma sequência apresentada na presente descrição. Ilustrativa de tais modificações seriam a substituição, inserção e/ou deleção de uma ou mais bases em relação a uma sequência de ácido nucleico de uma sequência codificadora descrita aqui que preserva, alterar ligeiramente ou aumenta a função de uma sequência codifica- dora descrita aqui em espécies de cultura. Tais derivados podem ser prontamente determinados por aqueles versados na técnica, por e- xemplo, usando técnicas de modelamento computadorizado para pre- visão e otimização da estrutura de sequência. O termo "derivado" tam- bém inclui, assim, sequências de ácido nucleico tendo identidade de sequência substancial com as sequências codificadoras descritas aqui, de modo que elas sejam capazes de ter as funcionalidades descritas para uso em produção de DGT-14 de modalidades da presente descri- ção.
[0068] Conforme usado aqui, o termo "variante" refere-se a um polipeptídeo diferente de um polipeptídeo especificamente citado de uma modalidade da descrição por inserções, deleções, mutações e substituições de aminoácidos criadas usando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante, tal como mutagênese. Orientação sobre a de- terminação de resíduos de aminoácido que podem ser substituídos, adicionados ou deletados sem abolir a atividade de interesse pode ser encontrada comparando-se a sequência do polipeptídeo em particular com aquela de polipeptídeos homólogos e minimizando o número de alterações de sequência de aminoácidos efetuadas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou substituindo aminoácidos por se- quências de consenso. Proteínas de modalidades da presente descri- ção podem ter aminoácidos substituídos, contanto que elas mante- nham a atividade funcional desejada. Genes "variantes" têm sequên- cias de nucleotídeos que codificam as mesmas proteínas ou proteínas equivalentes tendo atividade equivalente ou similar a uma proteína e- xemplificada.
[0069] Os termos "proteínas variantes" e "proteínas equivalentes"
referem-se à proteínas que têm a mesma ou essencialmente a mesma atividade biológica/funcional contra os substratos alvo e sequências equivalentes às proteínas exemplificadas. Conforme usado aqui, refe- rência a uma sequência "equivalente" refere-se à sequências que têm substituições, deleções, adições ou inserções de aminoácidos que a- primoram ou não afetam negativamente a atividade de forma significa- tiva. Fragmentos que retêm atividade também estão incluídos nesta definição. Fragmentos e outros equivalentes que retêm a mesma ou função ou atividade similar como um fragmento correspondente de uma proteína exemplificada estão dentro do âmbito de modalidades da presente descrição.
[0070] Genes variantes podem ser usados para produzir proteínas variantes; hospedeiros recombinantes podem ser usados para produzir proteínas variantes. Usando estas técnicas "embaralhamento gênico", podem ser construídos genes e proteínas equivalentes que compreen- dem quaisquer 5, 10 ou 20 resíduos contíguos (aminoácidos ou nucle- otídeos) de qualquer sequência exemplificada aqui. Conforme aqueles versados na técnica sabem, técnicas de embaralhamento gênico, por exemplo, podem ser adaptadas para se obter equivalentes tendo, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 , 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 , 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 , 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 , 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178,
179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 , 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214 , 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239 , 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264 , 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 , 290, 291, 292 ou 293 resíduos contíguos (aminoácidos ou nucleotídeos), correspondendo a um segmento (do mesmo tamanho) em qualquer uma das sequências exemplificadas ou sugeridas (ou complementos (complementos completos) das mesmas). Segmentos de tamanho si- milar, especialmente aqueles para regiões conservadas, também po- dem ser usados como sondas e/ou iniciadores.
[0071] Estratégias de "embaralhamento" podem ser concebidas e objetivadas após obtenção e exame das coordenadas atômicas 3-D (tridimensional) e estrutura cristalina de uma proteína de interesse. Assim, "embaralhamento focado" pode ser dirigido a determinados segmentos de uma proteína que são ideais para modificação, tais co- mo segmentos expostos na superfície e, de preferência, segmentos não internos que estão envolvidos no dobramento de proteínas e inte- gridade estrutural 3-D essencial. A Patente dos Estados Unidos Nº
5.605.793, por exemplo, descreve métodos para a geração de diversi- dade molecular adicional usando remontagem de DNA após fragmen- tação aleatória ou focada. Isto pode ser dito como "embaralhamento" gênico o qual envolve, tipicamente, mistura de fragmentos (de um ta- manho desejado) de duas ou mais moléculas de DNA diferentes, se- guido de ciclos repetidos de renaturação. Isto pode aprimorar a ativi- dade de uma proteína codificada por um gene inicial. O resultado é uma proteína quimérica que tem atividade aprimorada, especificidade de substrato alterada, estabilidade enzimática aumentada, estereoes- pecificidade alterada ou outras características.
[0072] "Substituições" de aminoácidos podem ser o resultado de substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo proprieda- des estruturais e/ou químicas similares, ou seja, substituições de ami- noácidos conservativas, ou podem ser o resultado de substituição de um aminoácido por um aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas diferentes, isto é, substituições de aminoácidos não conservativas. Aminoácidos podem ser classificados nas seguintes categorias: não polares, polares não carregados, básicos e ácidos. Substituições de aminoácidos "conservativas" podem ser feitas com base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicida- de, hidrofilicidade ou natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem glicina, ala- nina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e meti- onina; aminoácidos polares neutros incluem serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positivamente carrega- dos (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos nega- tivamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutãâ- mico.
[0073] Alternativamente, substituições de aminoácidos "não con- servativas" podem ser feitas através de seleção de diferenças na pola- ridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade ou natureza anfipática de qualquer um destes aminoácidos. "Inserções" ou "dele- ções" podem estar dentro da faixa de variação estrutural ou funcional- mente tolerada pelas proteínas recombinantes. A variação permitida pode ser determinada experimentalmente fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos em uma molécu- la polipeptídica usando técnicas de DNA recombinante e testando as variantes recombinantes resultantes quanto à atividade.
[0074] Alterações específicas no "sítio ativo" da enzima podem ser feitas para afetar a funcionalidade inerente em relação à atividade ou estereoespecificidade. Vide Muller et. al., "Structural basis for the enantiospecificittes of R- and S-specific phenoxypropionate/alpha- ketoglutarate dioxygenases", Protein Sci. (2006). Por exemplo, a estru- tura de cristal conhecida tauD foi usada como uma dioxigenase mode- lo para determinar resíduos de sítio ativo enquanto ligada ao seu subs- trato inerente, taurina. Vide Elkins et al. (2002) "X-ray crystal structure of Escherichia coli taurine/alpha-kKketoglutarate dioxygenase complexed to ferrous iron and substrates", Biochemistry 41(16): 5185-5192. Em relação à otimização de sequência e capacidade de concepção de sí- tios ativos de enzimas vide Chakrabarti et al., PNAS (23 de Agosto de 2005), 102(34): 12035-12040.
[0075] Várias propriedades e características tridimensionais da proteína também pode ser alteradas sem afetar adversamente a ativi- dade/funcionalidade da proteína. Podem ser toleradas/feitas substitui- ções de aminoácidos conservativas que não afetam adversamente a atividade e/ou a configuração tridimensional da molécula. Aminoácidos podem ser classificados nas seguintes categorias: não polares, pola- res não carregados, básicos e ácidos. Substituições conservativas pe- las quais um aminoácido de uma classe é substituído por outro amino- ácido do mesmo tipo caem dentro do âmbito de modalidades da pre- sente descrição, contanto que a substituição não seja prejudicial para a atividade biológica do composto. Também podem ser concebidas proteínas variantes que diferem ao nível de sequência, mas que man- têm a mesma estrutura tridimensional essencial geral, distribuição de carga na superfície e similares. Vide, por exemplo, Patente dos Esta- dos Unidos Nº 7.058.515; Larson et al., Protein Sci. 2002, 11: 2804- 2813, "Thoroughly sampling sequence space: Large-scale protein de- sign of structural ensembles"; Crameri et al, Nature Biotechnology 15,
436-438 (1997), "Molecular evolution of an arsenate detoxification pa- thway by DNA shuffling"; Stemmer, W.P.C.1994. "DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for mo- lecular evolution". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stem- mer, W.P.C.1994. "Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuf- fling". Nature 370: 389-391; Stemmer, W.P.C.1995. "Searching se- quence space". Bio/Technology 13: 549-553; Crameri, A., Cwirla, S. e Stemmer, W.P.C.1996. "Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling". Nature Medicine 2: 100-103; e Crameri, A., Whitehorn, E.A., Tate, E. e Stemmer, W.P.C. 1996. "Improved green fluorescent protein by molecular evolution using DNA shuffling". Nature Biotechnology 14: 315-319.
[0076] Concepção computadorizada de 5' ou 3' UTRs mais ade- quadas para DGT-14 (hairpinas sintéticas) também pode ser realizada dentro do âmbito de modalidades da presente descrição. Modelamento por computador em geral, bem como embaralhamento gênico e evolu- ção dirigida, são discutidos aqui em outra parte. Mais especificamente em relação ao modelamento por computador e UTRs, técnicas de mo- delamento computadorizado para uso na predição/avaliação de deri- vados de 5' e 3' UTRs de acordo com a presente descrição incluem, porém sem limitações: MFold versão 3.1 disponível da Genetics Cor- poration Group, Madison, WI (vide Zucker et al., "Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide", em RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barcis- zewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Pu- blishers, Dordrecht, NL, (1999); Zucker et al., "Expanded Sequence Dependence of Thermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure", J. Mol. Biol. 288, 911-940 (1999); Zucker et al., "RNA Secondary Structure Prediction" em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick e
R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, (2000)); COVE (análise de estrutura de RNA usando modelos de cova- riância (métodos sem gramática de contexto estocástico)) v.2.4.2 (Eddy & Durbin, Nucl. Acids Res. 1994, 22: 2079-2088), o qual é distri- buído livremente como código fonte e o qual pode ser baixado aces- sando o site genetics.wustl.edu/Eddy/software/;, e FOLDALIGN, tam- bém distribuído gratuitamente e disponível para download no site bio- inf.au.dk. FOLDALIGN/(vide "Finding the most significant common se- quence and structure motifs in a set of RNA sequences", J. Grodkin, L. J. Heyer e G. D. Stormo. Nucleic Acids Research, Vol. 25, Nº 18, páginas 3724-3732, 1997, "Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNA Sequences", J. Gorodkin, L. J. Heyer e G. D. Stormo. /!SMB 5; 120-123, 1997).
[0077] Fragmentos de genes de comprimento total podem ser fei- tos usando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponí- veis de acordo com procedimentos convencionais. Por exemplo, enzi- mas tal como Bbs | ou mutagênese dirigida podem ser usadas para cortar sistematicamente nucleotídeos das extremidades de genes. A- lém disso, genes parciais que codificam fragmentos ativos podem ser obtidos usando uma variedade de enzimas de restrição. Proteases po- dem ser usadas para obter diretamente fragmentos ativos destas pro- teínas.
[0078] Está dentro do âmbito de modalidades da descrição, con- forme descrito aqui, que proteínas podem ser truncadas e ainda reter atividade funcional. Por "proteína truncada" entenda-se que uma por- ção de uma proteína pode ser clivada, ao mesmo tempo em que a pro- teína truncada restante retém e exibe a atividade desejada após cliva- gem. Clivagem pode ser obtida por várias proteases. Além disso, pro- teínas eficazmente clivadas podem ser produzidas usando técnicas de biologia molecular, em que as bases de DNA que codificam a dita pro-
teína são removidas através de digestão com endonucleases de restri- ção ou outras técnicas disponíveis para aqueles versados na técnica. Após truncamento, as ditas proteínas podem ser expressas em siste- mas heterólogos, tais como E. coli, baculovírus, sistemas virais com base em plantas, fungos e similares e, então, colocadas em bioensai- os de tolerância a herbicidas, conforme descrito aqui, para determinar a atividade. É bem conhecido na técnica que proteínas truncadas po- dem ser produzidas com sucesso, de modo que elas retenham a ativi- dade funcional, ao mesmo tempo em que têm menos do que a se- quência de comprimento total inteira. Por exemplo, proteínas de B.t. podem ser usadas em uma forma truncada (proteína de núcleo) (vide, por exemplo, Hofte et al. (1989) e Adang et al. (1985)). Conforme usa- do aqui, o termo "proteína" pode incluir truncamentos funcionalmente ativos.
[0079] Em alguns casos, especialmente para expressão em plan- tas, pode ser vantajoso usar genes truncados que expressam proteí- nas truncadas. Genes truncados preferidos usualmente codificarão 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74,75, 76, 77,78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% da proteína de comprimento total.
[0080] O termo "promotor" refere-se a uma sequência de DNA ca- paz de controlar a expressão de uma sequência codificadora ou RNA funcional. Em geral, uma sequência codificadora está localizada 3' a uma sequência promotora. Promotores podem ser totalmente deriva- dos de um gene nativo ou ser compostos por diferentes elementos de- rivados de diferentes promotores encontrados na natureza ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido por aqueles versados na técnica que diferentes promotores podem dirigir a expres- são de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células ou em dife-
rentes fases de desenvolvimento ou em resposta à diferentes condi- ções ambientais ou fisiológicas. Promotores os quais fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células são, na maioria das vezes, comumente ditos como "promotores constitutivos". É ainda reconhecido que, uma vez que, na maioria dos casos, os limites exa- tos de sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotora idêntica.
[0081] O termo "operativamente ligado" refere-se à associação de sequências de ácidos nucleicos sobre um único fragmento de ácido nucleico de modo que a função de uma seja afetada pela outra. Por exemplo, um promotor está operativamente ligado a uma sequência codificadora quando ele é capaz de efetuar a expressão da dita se- quência codificadora (por exemplo, pelo fato de que a sequência codi- ficadora está sob o controle transcricional do promotor). Sequências codificadoras podem estar operativamente ligadas à sequências regu- ladoras na orientação senso ou antissenso.
[0082] O termo "expressão", conforme usado aqui, refere-se à transcrição e acúmulo estável de RNA senso (mMRNA) ou antissenso derivado do fragmento de ácido nucleico de modalidades da descrição. Expressão também pode referir-se à tradução de mRNA em um poli- peptídeo.
[0083] O termo "superexpressão", conforme usado aqui, refere-se à expressão que é maior do que a expressão endógena do mesmo ou um gene relacionado. Um gene heterólogo é superexpresso se sua expressão é maior do que aquela de um gene endógeno comparável.
[0084] Conforme usado aqui, o termo "transformação" refere-se à transferência e integração de um ácido nucleico ou fragmento em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucleico transformados são ditos como organismos "transgênicos" ou "recom- binantes" ou "transformados". Métodos conhecidos para transformação incluem transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, transformação por fosfato de cálcio, trans- formação por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos de ultrassom (por exemplo, sonoporação), transformação de liposso- mas, microinjeção, DNA nu, vetores de plasmídeo, vetores virais, bio- lística (bombardeamento de micropartículas), transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS'"Y, feixe de aerossol ou transfor- mação por PEG, bem como outros métodos possíveis.
[0085] Os termos "plasmídeo" e "vetor", conforme usado aqui, re- ferem-se a um elemento cromossômico adicional que frequentemente porta genes que não fazem parte do metabolismo central da célula e usualmente na forma de moléculas de DNA fita dupla circular. Tais e- lementos podem ser sequências de replicação autônoma, sequências de integração genômica, fagos ou sequências de nucleotídeos, linea- res ou circulares, de DNA ou RNA fita simples ou dupla, derivadas de qualquer fonte, nas quais uma série de sequências de nucleotídeos foram unidas ou recombinadas em um único construto o qual é capaz de introduzir um fragmento promotor e a sequência de DNA para um produto gênico selecionado, juntamente com a sequência 3' não tradu- zida apropriada, em uma célula.
[0086] Conforme usado aqui, o termo "degenerância de códon" refere-se à natureza do código genético que permite variação da se- quência de nucleotídeos sem afetar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Aqueles versados na técnica estão bem cientes da "tendência de códon" exibida por uma célula hospedeira específica quanto ao uso de códons de nucleotídeos para especificar um determinado aminoácido. Portanto, quando de síntese de um gene para aprimorar a expressão em uma célula hospedeira, é desejável conceber o gene de modo que sua frequência de uso de códon se a- proxime da frequência de uso de códon preferida da célula hospedeira.
[0087] O termo "códon otimizado", em referência a genes ou regi- ões codificadoras de moléculas de ácidos nucleicos para transforma- ção de vários hospedeiros, refere-se à alterações de códons no gene ou regiões codificadoras das moléculas de ácido nucleico de modo a refletir o uso típico de códon do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo DNA. Tal otimização inclui substituição de pelo menos um ou mais de um ou um número significativo de códons por um ou mais códons que são mais frequentemente usados em ge- nes deste organismo.
[0088] Desvios na sequência de nucleotídeos que compreende os códons que codificam os aminoácidos de qualquer cadeia polipeptídica permitem variações na sequência que codifica o gene. Uma vez que cada códon consiste em três nucleotídeos e os nucleotídeos que cons- tituem o DNA estão restritos à quatro bases específicas, há 64 possí- veis combinações de nucleotídeos, 61 das quais codificam aminoáci- dos (codificam os três códons restantes que codificam sinais de térmi- no de tradução). O "código genético", o qual mostra quais códons codi- ficam quais aminoácidos, é comumente conhecido na técnica. Como um resultado, muitos aminoácidos são designados por mais de um có- don. Por exemplo, os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro tripletos, serina e arginina por seis, enquanto que triptofano e metionina são codificados por apenas um tripleto. Esta degenerância permite que a composição de bases de DNA varie ao longo de uma ampla faixa sem alteração da sequência de aminoácidos das proteínas codificadas pelo DNA.
[0089] Muitos organismos exibem uma tendência para o uso de códons particulares para codificar a inserção de um aminoácido parti- cular em uma cadeia peptídica em crescimento. Diferenças na prefe-
rência de códons, ou tendência de códons, quanto ao uso de códons entre organismos é conferida pela degenerância do código genético e é bem documentada entre muitos organismos. A tendência de códon frequentemente se correlaciona com a eficiência de tradução de RNA mensageiro (mMRNA) a qual, por sua vez, se acredita ser dependente, inter alia, das propriedades dos códons que estão sendo traduzidos e da disponibilidade de moléculas de RNA de transferência (t(RNA) em particular. A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons mais frequentemente usados em síntese de peptídeos. Consequentemente, genes podem ser adapta- dos ou concebidos para expressão ideal do gene em um determinado organismo com base em otimização de códon.
[0090] Dado o grande número de sequências de genes disponíveis para uma grande variedade de espécies de animais, plantas e micro- organismos, é possível calcular as frequências relativas de uso de có- dons. Tabelas de uso de códons estão prontamente disponíveis, por exemplo, no "Codon Usage Database", disponível em www.kKazusa.or.jp/codon/ e tais tabelas pode ser adaptadas através de uma série de maneiras. Vide Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28: 292 (2000). Ao usar esta ou tabelas similares, aqueles versados na técnica podem aplicar as frequências à qualquer dada sequência polipeptídica para conceber e produzir um fragmento de ácido nucleico sintético de uma região codificadora com códons otimizados a qual codifica o poli- peptídeo, mas que usa códons ótimos para uma determinada espécie. Em algumas modalidades, a presente descrição refere-se à formas com códons otimizados de dgt-14 e/ou outras proteínas acessórias da descrição, conforme ainda descrito aqui.
[0091] Para obter alta expressão de genes heterólogos em plan- tas, pode ser preferido conceber e remanipular os ditos genes, de mo- do que eles sejam mais eficientemente expressos em células de planta e, em particular, isto pode ser preferido onde se deseja que um gene bacteriano seja expresso em células de plantas dicotiledôneas, bem como monocotiledôneas. O gene de tipo selvagem que codifica DGT- 14 foi isolado e a sequência de nucleotídeos nativa que codifica a se- quência de aminoácidos prevista pode ser encontrada em GenBank Número ZP 01452683, a qual é aqui incorporada por referência na íntegra. A sequência da proteína codificada compreendendo uma mo- dificação na qual glicina foi modificada para uma alanina no resíduo de aminoácido 111 do GenBank Número ZP 01452683 é descrita como SEQ ID NO: 1.
[0092] Modalidades da descrição referem-se a uma modificação de dgt-14, em que uma sequência de gene dgt-14 sintética foi conce- bida para expressão em plantas. Concepção de um gene dgt-14 otimi- zado para expressão da mesma proteína DGT-14 em plantas monoco- tiledôneas e dicotiledôneas é mostrada com uma remanipulação da região codificadora da proteína deste gene para expressão ótima. São descritas aqui sequências de nucleotídeos otimizadas que codificam um polipeptídeo de DGT-14. Duas destas sequências de nucleotídeos de dgt-14 otimizadas de planta são mostradas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3. A sequência de nucleotídeos modificada é dita como dgt-14 otimizado para dicot em SEQ ID NO: 2 ou dgt-14 otimizado pa- ra monocot em SEQ ID NO: 3 e confere tolerância ao glifosato in plan- ta.
[0093] A molécula de ácido nucleico de dgt-14 de SEQ ID NO: 2 foi otimizada para aprimorar a expressão em plantas dicotiledôneas. À molécula de ácido nucleico de dgt-14 de SEQ ID NO: 3 foi otimizada para aprimorar a expressão em plantas monocotiledôneas. O uso de códons foi selecionado com base no uso de códons preferido pelo fato de que ele foi remodelado, de modo que a proteína é codificada por códons tendo uma tendência para uso em plantas monocots e dicots e sequências deletérias e sítios de restrição supérfluos foram removidos para aumentar a eficiência de transcrição/tradução do polipeptídeo de DGT-14 e facilitar etapas de manipulação de DNA. Ao fazer isso, ex- pressão de DGT-14 em plantas será aprimorada e DGT-14 conferirá resistência à aplicações de glifosato.
[0094] Similarmente, a molécula de ácido nucleico de dgt-14 (v6) de SEQ ID NO: 4 foi otimizada para aprimorar a expressão em Esche- richia coli. O uso de códons foi selecionado com base no uso de có- dons preferido em E. coli pelo fato de que dgt-14 foi reformulado, de modo que a proteína é codificada por códons tendo uma tendência pa- ra o uso em E. coli. Durante reformulação, sequências deletérias e sí- tios de restrição supérfluos foram removidos para aumentar a eficiên- cia de transcrição/tradução da sequência codificadora de DGT-14 e facilitar etapas de manipulação de DNA. Ao fazer isso, expressão de DGT-14 em E. coli resulta em expressão robusta de proteína para ca- racterização enzimática de DGT-14.
[0095] O termo " identidade percentual" (ou "identidade %"), con- forme conhecido na técnica, é uma relação entre duas ou mais se- quências polipeptídicas ou duas ou mais sequências de polinucleotídi- cas determinada por comparação das sequências. Na técnica, "identi- dade" também significa o grau de relação de sequência entre sequên- cias polipeptídicas ou polinucleotídicas, conforme o caso, determinado pela correspondência entre trechos de tais sequências. "Identidade" e "similaridade" podem ser facilmente calculadas por meio de métodos conhecidos incluindo, porém sem limitações, àqueles descritos em:
1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford Universi- ty: NY (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Part | (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G.,
Ed.) Academic (1987); e 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
[0096] Métodos para determinação de identidade de sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos são conhecidos na técnica. Tipica- mente, tais técnicas incluem determinação da sequência de nucleotí- deos do mMRNA para um gene e/ou determinação da sequência de a- minoácidos codificada pela mesma e comparação destas sequências com uma segunda sequência de nucleotídeos ou aminoácidos. Se- quências genômicas podem também ser determinadas e comparadas desta maneira. Em geral, identidade refere-se a uma correspondência exata de nucleotídeo para nucleotídeo ou aminoácido para aminoácido das duas sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, respecti- vamente. Duas ou mais sequências de polinucleotídeos (ou aminoáci- dos) podem ser comparadas ao determinar sua identidade percentual. A identidade percentual de duas sequências de ácidos nucleicos ou sequências de aminoácidos é o número de correspondências exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das se- quências mais curtas e multiplicado por 100. Vide Russell, R. e Barton, G., "Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds", J. Mol. Biol. 244, 332-350 (1994), na página 337, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra.
[0097] Além disso, métodos para determinar a identidade e simila- ridade estão codificados em programas de computador publicamente disponíveis. Alinhamentos de sequências e cálculos da identidade per- centual podem ser realizados, por exemplo, usando o programa AlignX do pacote Vector NTIº (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou o programa Me- gAlign"M do pacote LASERGENE Bioinformatics Computing (DNAS- TAR Inc., Madison, WI). Alinhamento múltiplo de sequências é realiza- do usando o "método de alinhamento Clustal ", o qual abrange diver- Sas variedades do algoritmo, incluindo o "método de alinhamento Clus-
tal V ", que corresponde ao método de alinhamento Clustal V marcado (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci., 8: 189-191 (1992)) e encontrado no programa MegAlign'"" do pacote LASERGENE Bioinformatics Compu- ting (DNASTAR Inc.). Para múltiplos alinhamentos, os valores de de- fault correspondem a PENALIDADE POR LACUNA = 10 e PENALI- DADE POR EXTENSÃO DE LACUNA = 10. Os parâmetros de default para alinhamentos aos pares e cálculo da identidade percentual de sequências de proteínas usando o método Clustal são KTUPLE = 1, PENALIDADE POR LACUNA = 3, JANELA = 5 e DIAGONAIS SAL- VAS = 5. Para ácidos nucleicos, estes parâmetros são KTUPLE = 2, PENALIDADE POR LACUNA = 5, JANELA = 4 e DIAGONAIS SAL- VAS = 4. Após alinhamento das sequências usando o programa Clus- tal V, é possível obter uma "identidade percentual" ao visualizar a tabe- la de "distâncias de sequência" no mesmo programa. Adicionalmente, o "método de alinhamento Clustal W" está disponível e corresponde ao método de alinhamento Clustal W marcado (descrito por Higgins e Sharp, CABIOS. 5: 151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191(1992)) e encontrado no programa MegAlign"“ v6.1 dos do pacote LASERGENE Bioinformatics Computing (DNASTAR Inc.). Parâmetros de default para alinhamento múltiplo são (PENAL|- DADE POR LACUNA = 10, PENALIDADE POR EXTENSÃO DE LA- CUNA = 0,2, Delay Divergen Segs (%) = 30, Peso por Transição de DNA = 0,5, Matriz de Peso de Proteína = Gonnet Series, Matriz de Pe- so de DNA = IUB). Após alinhamento das sequências usando o pro- grama Clustal W, é possível obter uma "identidade percentual" ao vi- sualizar a tabela de "distâncias de sequência" no mesmo programa.
[0098] É bem entendido por aqueles versados na técnica que mui- tos níveis de identidade de sequência são úteis na identificação de po- lipeptídeos a partir de outras espécies, em que tais polipeptídeos têm a mesma ou função ou atividade similar. Exemplos úteis de identida- des percentuais incluem, porém sem limitações: 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou qualquer percentagem inteira de 55% a 100 % pode ser útil na descrição de modalidades da presente descrição tal como, por exemplo, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 11%, 12%, 73%, T4%, 15%, 16%, 17%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83% , 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Fragmentos de ácidos nucleicos adequados não apenas têm as homologias acima mas, tipicamente, codificam um poli- peptídeo tendo pelo menos 50 aminoácidos, de preferência pelo me- nos 100 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 150 aminoáci- dos, ainda mais preferivelmente pelo menos 200 aminoácidos e, mais preferivelmente, pelo menos 250 aminoácidos.
[0099] O termo "software de análise de sequência" refere-se a qualquer algoritmo de computador ou programa de software que é útil para a análise de sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. O "software de análise de sequência" pode estar comercialmente dispo- nível ou ter sido desenvolvido de forma independente. Software de a- nálise de sequência típicos incluirão, porém sem limitações: 1.) O pa- cote de programas GCG (Wisconsin Package Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); 2.) Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)); 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); e 5.) o progra- ma FASTA que incorpora o algoritmo de Smith-Waterman ((W. R. Pe- arson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY). Dentro do contexto do presente Pedido, deverá ser enten- dido que, onde o software de análise de sequência é usado para análi- se, os resultados da análise serão com base nos "valores de default"
do programa em questão, a menos que especificado de outra forma. Conforme usado aqui, "valores de default" significará qualquer conjun- to de valores ou parâmetros que vieram originalmente carregados com o software quando inicializado pela primeira vez.
[00100] “Quando de referência a técnicas de hibridização, a totalida- de ou parte de uma sequência de nucleotídeos conhecida pode ser usada como uma sonda que hibridiza seletivamente à outras sequên- cias de nucleotídeos correspondentes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (isto é, bibliotecas genômicas ou de cDNA) a partir de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNA de plasmídeo, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, fragmentos de DNA amplificados por PCR, oligo- nucleotídeos ou outros polinucleotídeos e podem ser marcadas com um grupo detectável, tal como *ºP, ou qualquer outro marcador detec- tável. Assim, por exemplo, sondas para hibridização podem ser feitas por meio de marcação de oligonucleotídeos sintéticos com base nas sequências de DNA de modalidades da descrição. Métodos para pre- paro de sondas para hibridização e para construção de bibliotecas ge- nômicas e de cDNA são geralmente conhecidos na técnica e estão descritos (Sambrook et al., 1989).
[00101] As sondas de ácido nucleico e os iniciadores de modalida- des da presente descrição hibridizam sob condições rigorosas com uma sequência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou am- plificação de ácido nucleico convencional pode ser usado para identifi- car a presença de DNA a partir de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas são capazes de hibridizar especificamente com outras moléculas de ácido nucleico sob determinadas circunstâncias. Conforme usado aqui, duas moléculas de ácido nucleico são ditas como sendo capazes de hibridi-
zar especificamente com uma outra se as duas moléculas são capa- zes de formar uma estrutura de ácido nucleico fita dupla antiparalela. Uma molécula de ácido nucleico é dita como o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se as duas moléculas de ácido nucleico exibem complementaridade completa. Conforme usado aqui, diz-se que as moléculas exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Moléculas que exibem complementaridade completa geral- mente hibridizam uma com a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sob condições convencionais de "alta estringência". Condições convencionais de alta estringência são descritas por Sambrook et al., 1989.
[00102] Duas moléculas são ditas como exibindo "complementari- dade mínima" se elas podem hibridizar uma à outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra pelo menos sob condições convencionais de "baixa estringência". Condições convencionais de baixa estringência são descritas por Sambrook et al., 1989. Para que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, ela precisa exibir apenas a complementa- ridade mínima de sequência para ser capaz de formar uma estrutura fita dupla estável sob as concentrações de solventes e de sal empre- gadas em particular.
[00103] Fatores que afetam a estringência de hibridização são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, porém sem limitações, temperatura, pH, força iônica e concentração de solventes orgânicos tais como, por exemplo, formamida e sulfóxido de dimetila. Conforme é conhecido por aqueles versados na técnica, a estringência de hibridização aumenta quanto maior for a temperatura, quanto maior for a força iônica e quanto menor for a concentração de solventes.
[00104] O termo "condição estringente" ou "condições de estringên-
cia" é funcionalmente definido em relação à hibridização de uma sonda de ácido nucleico com um ácido nucleico alvo (isto é, para uma se- quência de ácido nucleico de interesse particular) pelo procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook et a/., 1989 em
9.52-9.55. Vide também Sambrook et a/., 1989 em 9.47-9.52 e 9.56-
9.588.
[00105] Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é menos de cerca de 1,5 M de íons de Na”, tipicamente uma concentração de íons de NA* de cerca de 0,01 a 1,0 M (ou outros sais) em um pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 C para sondas curtas (por exempl o, 10 a 50 nu- cleotídeos) e pelo menos cerca de 60 C para sondas longas (por e- xemplo, mais de 50 nucleotídeos). Condições estringentes podem também ser alcançadas com a adição de agentes de desestabilização, tal como formamida. Exemplos de condições de baixa estringência in- cluem hibridização com um tampão de formamida a 30 a 35%, NaCl a 1,0 M, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate - dodecil sulfato de sódio) a 0,1% a 37 TC e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl a 3,0 M/citrato trissódico a 0,3 M) a 50 a 55 (C. Condições de estringência moderada exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40 a 45%, NaCl a 1,0 M, SDS a 0,1% a 37 C e uma lavagem em 0,5 Xa 1X SSC a 55 a 60 T. Condições altamente estringent es exemplificati- vas incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl a ,0M, SDS a 0,1% a 37 C e uma lavagem em 0,1 XKSSC a BO a 65º C.
[00106] A especificidade é, tipicamente, uma função de lavagens pós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a tempera- tura da solução final de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, a T,, po- de ser aproximada a partir da equação Tr, = 81,5 ºC + 16,6 (LogM) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form.) - 500/L, em que M é a molaridade dos cátions monovalentes, % GC é a porcentagem de nucleotídeos guano-
sina e citosina no DNA, % form. é a percentagem de formamida na so- lução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de ba- ses (Meinkoth e Wahl, 1984). A Tr, é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hi- bridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. A T, é reduzida em cerca de | CC para cada 1% de disparidade; assim, a Tm, condi- ções de hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para sequên- cias de identidade desejada hibridizar. Por exemplo, se sequências com 90% de identidade são buscadas, a T,, pode ser reduzida para 10 T. Geralmente, condições estringentes são selecion adas para serem cerca de 5 C menor do que o ponto de fusão térmica (Tr) para a se- quência específica e seu complemento em uma força iônica e pH defi- nidos. No entanto, condições severamente estringentes podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3 ou 4 C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm); condições moderadamente estringentes podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10 C menor do que o ponto de fusão térmica (Tr); condições de baixa estringência podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 11 a 20 C menor do que o ponto de fusão térmica (Tm). Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e a Tr, desejada, aqueles versados na téc- nica entenderão que variações na estringência de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de disparidade resulta em uma T,, de menos de 45 “C (solução aquo- sa) ou 32 CT (solução de formamida), é preferível a umentar a concen- tração de SSC, de modo que uma temperatura mais alta possa ser u- sada. Um guia extenso para a hibridização de ácidos nucleicos é en- contrada em (1997) Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Bio- logy, páginas 2-40, Terceira Edição (1997) e Sambrook et al. (1989).
[00107] Técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular con- vencionais usadas aqui são bem conhecidas na técnica e são descri-
tas, por exemplo, por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989); e por Silhavy et al., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); e por Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
[00108] As manipulações genéticas de um hospedeiro recombinan- te descritas aqui podem ser realizadas usando técnicas genéticas e triagem convencionais e podem ser feitas em qualquer célula hospe- deira que seja adequada para manipulação genética. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira recombinante descrita aqui pode ser qualquer organismo ou micro-organismo hospedeiro útil para modi- ficação genética e expressão de gene recombinante. Em algumas mo- dalidades, um hospedeiro recombinante pode ser, porém sem limita- ções, qualquer planta superior, incluindo tanto plantas monocotiledô- neas quanto dicotiledôneas, e plantas de consumo, incluindo plantas de cultura e plantas usadas por seus óleos. Assim, qualquer espécie de planta ou célula de planta pode ser selecionada, conforme ainda descrito abaixo.
[00109] Em algumas modalidades, plantas as quais são genetica- mente modificadas de acordo com a presente descrição (por exemplo, células hospedeiras de plantas) incluem, porém sem limitações, todas as plantas superiores, incluindo tanto plantas dicotiledôneas quanto monocotiledôneas e, em particular, plantas de consumo, incluindo plantas de cultura. Tais plantas podem incluir, porém sem limitações, por exemplo: alfafa, soja, algodão, colza (também descrita como cano- la), linhaça, milho, arroz, braquiária, trigo, açafrão, sorgo, beterraba, girassol, tabaco e gramíneas. Assim, qualquer espécie de planta ou célula de planta pode ser selecionada. Em modalidades, as células de planta usadas aqui e as plantas cultivadas ou derivadas das mesmas incluem, porém sem limitações, células que podem ser obtidas a partir de colza (Brassica napus); mostarda Indiana (Brassica juncea); mos- tarda Etíope (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); repolho (Bras- Sica oleracea); soja (Glycine max); linhaça/linho (Linum usitatissimum); milho (também descrito como milho amarelo) (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girassol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana; castanha do Pará (Betholettia excel- Sa); mamona (Ricinus communis); coco (Cocus nucifera); coentro (Co- riandrum sativum); algodão (Gossypium spp.); amendoim (Arachis hy- pogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); palma (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa); abóbora (Cucurbita maxima); ce- vada (Hordeum vulgare); cana-de-açúcar (Saccharum officinarum); arroz (Oryza sativa); trigo (Triticum spp., incluindo Triticum durum e Triticum aestivum); e lentilha (Lemnaceae sp.). Em algumas modalida- des, a base genética dentro de uma espécie de planta pode variar.
[00110] "Partes de planta", conforme usado aqui, inclui quaisquer partes de uma planta incluindo, porém sem limitações, sementes (in- cluindo sementes maduras e sementes imaturas), um corte de planta, uma célula de planta, uma cultura de célula de planta, um órgão de planta, pólen, embriões, flores, frutos, rebentos, folhas, raízes, caules, explantes, etc. Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica das plantas que compreende um protoplasto e uma parede celular. Uma célula de planta pode estar na forma de uma única célula isolada ou agregado de células, tal como um caule friável ou uma célula em cultura, ou pode ser parte de uma unidade maior organizada, por e- xemplo, um tecido de planta, órgão de planta ou planta. Assim, uma célula de planta pode ser um protoplasto, uma célula que produz ga- metas ou uma célula ou uma coleção de células que pode regenerar uma planta inteira. Como tal, uma semente, que compreende várias células de planta e que é capaz de regeneração em uma planta inteira, é considerada uma célula de planta para fins da presente descrição. Um órgão de planta ou tecido de planta pode ser uma semente, proto- plastos, caules ou quaisquer outros grupos de células de planta que são organizados em uma unidade estrutural ou funcional. Partes de planta particularmente úteis incluem partes colhíveis e partes úteis pa- ra propagação de plantas de prole. Uma parte colhível de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, por exemplo, flores, pólen, mudas, tubérculos, caules, folhas, frutos, sementes, raízes e similares. Uma parte de uma planta útil para propagação inclui, por exemplo, sementes, frutos, estacas, tubérculos, mudas, enxertos e similares. À cultura tecidual será, de preferência, capaz de regeneração de plantas com características morfológicas e fisiológicas à planta endógama precedente e de regeneração de plantas que têm substancialmente o mesmo genótipo que a planta endógama precedente. Em contraste, algumas células de planta não são capazes de ser regeneradas para produzir plantas. De preferência, as células regeneráveis em tais cultu- ras teciduais serão embriões, protoplastos, células meristemáticas, caule, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flores, grãos, núcleos, espigas, cascas ou talos. Ainda, modalidades da pre- sente descrição fornecem plantas regeneradas a partir de culturas te- ciduais de modalidades da descrição.
[00111] Em relação à produção de plantas geneticamente modifica- das, métodos para a engenharia genética de plantas são bem conhe- cidos na técnica. Por exemplo, foram desenvolvidos vários métodos para a transformação de plantas, incluindo protocolos de transforma- ção biológica e física para plantas dicotiledôneas, bem como plantas monocotiledôneas (por exemplo, Goto-Fumiyuki et al/., Nature Biotech 17: 282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc.,
Boca Raton, páginas 67-88 (1993)). Além disso, vetores e métodos de cultura in vitro para transformação de célula ou tecido de planta e re- generação de plantas estão disponíveis, por exemplo, em Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 89-119 (1993).
[00112] Um grande número de técnicas está disponível para inser- ção de DNA em uma célula hospedeira de planta. Estas técnicas in- cluem transformação com T-DNA desarmado usando Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transfor- mação, transfecção por fosfato de cálcio, transformação por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, métodos de ultrassom (por e- xemplo, sonoporação), transformação de lipossomas, microinjeção, DNA nu, vetores de plasmídeo, vetores virais, biolística (bombardea- mento de micropartículas), transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS"Y", feixe de aerossol ou PEG, bem como outros mé- todos possíveis.
[00113] Por exemplo, o construto de DNA pode ser introduzido dire- tamente no DNA genômico da célula de planta usando técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células de plan- ta ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido da planta usando métodos de biolística, tal como bombardea- mento de partícula de DNA (vide, por exemplo, Klein et al. (1987) Na- ture 327: 70 73). Métodos adicionais para transformação de células de planta incluem microinjeção via captação de DNA mediada por carbo- neto de silício WHISKERS"" (Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Repor- ter 9: 415-418). Alternativamente, o construto de DNA pode ser intro- duzido na célula da planta através de transformação por nanopartícu- las (vide, por exemplo, Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 12/245.685, o qual é aqui incorporado por referência na íntegra).
[00114] Outro método conhecido para transformação de plantas é transformação mediada por microprojétil, em que o DNA é transporta- do sobre a superfície de microprojéteis. Neste método, o vetor de ex- pressão é introduzido em tecidos de plantas com um dispositivo biolís- tico que acelera os microprojéteis em velocidade suficiente para pene- trar as paredes celulares e membranas das plantas. Sanford et al, Part. Sci. Technol. 5: 27 (1987), Sanford, J. C., Trends Biotech. 6: 299 (1988), Sanford, J. C., Physiol. Plant 79: 206 (1990), Klein et al., Biote- chnology 10: 268 (1992).
[00115] Alternativamente, métodos de transferência de genes e transformação incluem, porém sem limitações, transformação de pro- toplastos através de precipitação com cloreto de cálcio, polietileno gli- col (PolyEthylene Glycol - PEG) ou captação de DNA nu mediada por eletroporação (vide Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3: 2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199: 169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828; e Shimamoto (1989) Nature 338: 274-276) e eletroporação de tecidos de planta (D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505).
[00116] Um método amplamente usado para introdução de um ve- tor de expressão em plantas baseia-se no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Horsch et al., Science 227: 1229 (1985). A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias patogênicas de plantas no solo que se sabe serem úteis para transformar geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, são portadores de genes responsáveis pela trans- formação genética da planta. Kado, C. |., Crit. Rev. Plant. Sci. 10: 1 (1991). Descrições de sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para a transferência de genes mediada por Agrobacterium também estão disponíveis, por exemplo, Gruber et al., supra, Miki et al., supra, Moloney et al., Plant Cell Reports 8: 238 (1989) e Patentes dos Esta-
dos Unidos Nº 4.940.838 e 5.464.763.
[00117] Se Agrobacterium é usada para transformação, o DNA a ser inserido deve ser clonado em plasmídeos especiais, a saber, em um vetor intermediário ou em um vetor binário. Vetores intermediários não podem se reproduzir em Agrobacterium. O vetor intermediário po- de ser transferido para Agrobacterium tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). O sistema Japan Tobacco Superbi- nary é um exemplo de um sistema deste tipo (revisto por Komari et a/., (2006) Em: Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) Nº 343: Agro- bacterium Protocols (2º Edição, Vol. 1) HUMANA PRESS Inc., Totowa, NJ, páginas 15-41; e Komori et a/., (2007) Plant Physiol. 145: 1155- 1160). Vetores binários podem se reproduzir tanto em E. coli quanto em Agrobacterium. Eles compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante os quais estão limitados pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transformados diretamente em Agrobacterium (Holsters, 1978). A Agrobacterium usa- da como célula hospedeira deve compreender um plasmídeo que traz uma região vir. O plasmídeo Ti ou Ri também compreende a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula de planta. T-DNAs adicio- nais podem estar contidos.
[00118] As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tu- mefaciens dirigirão a inserção de uma T-fita contendo o construto e marcador adjacente no DNA de célula de planta quando a célula é in- fectada pela bactéria usando um vetor binário de T-DNA (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12: 8711-8721) ou o procedimento de cocultura (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Geralmente, o sistema de transformação de Agrobacterium é usado para manipular plantas dicotiledôneas (Bevan et a/. (1982) Ann. Rev. Genet 16: 357-384; Ro- gers et al. (1986) Methods Enzymol. 118: 627-641). O sistema de transformação de Agrobacterium pode também ser usado para trans- formar, bem como transferir, DNA para plantas e células de plantas monocotiledôneas. Vide Patente dos Estados Unidos Nº 5.591.616; Hernalsteen et al. (1984) EMBO J 3: 3039-3041; Hooykass-Van Slog- teren et al. (1984) Nature 311: 763-764; Grimsley et al. (1987) Nature 325: 1677-179; Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 31-40; e Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95: 426-434. Após a introdução do constru- to genético em células de planta, células de planta podem ser cultiva- das e, quando de emergência de tecido de diferenciação, tais como rebentos e raízes, plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas podem ser geradas. Metodo- logias para regeneração de plantas são conhecidas por aqueles ver- sados na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil e Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). A planta geneticamente modificada descrita aqui pode ser cultivada em um meio de fermenta- ção ou cultivada em um meio adequado, tal como terra. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superio- res pode incluir qualquer meio de crescimento para plantas incluindo, porém sem limitações, terra, areia, qualquer outro meio em partículas que suporte o crescimento da raiz (por exemplo, vermiculita, perlita, etc.) ou cultura hidropônica, bem como luz, água e suplementos nutri- cionais adequados, os quais otimizam o crescimento da planta superi- or.
[00119] As células de planta transformadas que são produzidas por meio de qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira a qual possua o genó- tipo transformado e, assim, o fenótipo desejado. Tais técnicas de re- generação contam com manipulação de determinados fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura tecidual, tipicamente contam com um marcador biocida e/ou herbicida o qual tenha sido introduzido junto com as sequências de nucleotídeos desejadas. A regeneração de plantas a partir de protoplastos cultivados é descrita em Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture" em Handbook of Plant Cell Cul- ture, páginas 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, páginas 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração também pode ser obtida a partir de caules, explantes, órgãos, pólen, embriões de plan- tas ou partes das mesmas. Tais técnicas de regeneração estão descri- tas, de modo geral, em Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486.
[00120] Em outras modalidades, as células de planta que são trans- formadas não são capazes de regeneração para produzir uma planta. Tais células podem ser empregadas, por exemplo, no desenvolvimen- to de uma linhagem de células de planta com o fenótipo relevante, por exemplo, resistência a herbicidas.
[00121] Os ácidos nucleicos introduzidos em uma célula de planta podem ser usados para conferir traços desejados para essencialmente qualquer planta. Uma grande variedade de plantas e sistemas de célu- las de plantas podem ser manipulados para as características fisiológi- cas e agronômicas desejadas descritas aqui usando os construtos de ácido nucleico da presente descrição e os vários métodos de transfor- mação mencionados acima. Em modalidades preferidas, as plantas e células de planta alvo para manipulação incluem, porém sem limita- ções, aquelas plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, tais como culturas, incluindo culturas de cereais (por exemplo, trigo, milho, arroz, painço, cevada), culturas de frutas (por exemplo, tomate, maçã, pera, morango, laranja), culturas forrageiras (por exemplo, alfafa), culturas de vegetais de raiz (por exemplo, cenoura, batata, beterraba, inhame),
culturas de vegetais folhosos (por exemplo, alface, espinafre); plantas com flores (por exemplo, petúnia, rosa, crisântemo), coníferas e pi- nheiros (por exemplo, pinheiro, abeto); plantas usadas em fitoterapia (por exemplo, plantas que acumulam metais pesados); oleaginosas (por exemplo, girassol, colza) e plantas usadas para fins experimentais (por exemplo, Arabidopsis). Assim, as composições e métodos descri- tos têm uso sobre uma ampla variedade de plantas incluindo, porém sem limitações, espécies dos gêneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glycine, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna e Zea mays.
[00122] Uma célula de planta, caule, tecido ou planta transformada pode ser identificada e isolada por meio de rastreio ou seleção do ma- terial de planta manipulado quanto aos traços codificados pelos genes marcadores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, sele- ção pode ser realizada através de crescimento do material de planta manipulado sobre meios contendo uma quantidade inibidora do antibi- ótico ou herbicida ao qual o construto gênico de transformação confere resistência. Ainda, plantas e células de planta transformadas também podem ser identificadas por meio de rastreio da atividade de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, os genes de fB- glucuronidase, luciferase ou gfp) que possam estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinantes. Tais metodologias de se- leção e rastreio são bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
[00123] O termo introduzido, no contexto de inserção de um ácido nucleico em uma célula, inclui transformação na célula, bem como cruzamento de uma planta tendo a sequência com outra planta, de modo que a segunda planta contenha a sequência heteróloga, con-
forme em técnicas de melhoramento de plantas convencionais. Tais métodos de melhoramento são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Para uma discussão sobre técnicas de melhoramento de plantas vide Poehiman (1995) Breeding Field Crops, AVI Publication Co., Westport Conn, 4º Edição. Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um gene nas plantas. Esta técnica tem sido usada há décadas para introduzir traços em uma planta. Um exemplo de uma descrição desta e outras metodologias de melhoramento de plantas que são bem conhecidas pode ser encontrado em referências tais como Poehlman, supra e Plant Breeding Methodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc. (1988). Em um protocolo típico de re- trocruzamento, a variedade original de interesse (progenitor recorren- te) é cruzada com uma segunda variedade (progenitor não recorrente) que traz o único gene de interesse a ser transferido. A prole resultante desse cruzamento é, então, cruzada novamente com o progenitor re- corrente e o processo é repetido até que seja obtida uma planta em que essencialmente todas as características morfológicas e fisiológi- cas desejadas do progenitor recorrente são recuperadas na planta convertida, além do gene único transferido pelo progenitor não recor- rente.
[00124] Determinadas modalidades referem-se a processos de ge- ração de cruzamentos usando uma planta de uma modalidade da pre- sente descrição como pelo menos um dos progenitores. Por exemplo, determinadas modalidades referem-se a uma planta híbrida F, tendo, como um ou ambos os progenitores, todas as plantas exemplificadas aqui. Outras modalidades referem-se à sementes produzidas por tais híbridos F,. Ainda outras modalidades referem-se a um método para produzir uma semente híbrida F, por meio de cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, progeni- tor endógamo) e colhendo a semente híbrida resultante. Outras moda-
lidades referem-se a uma planta exemplificada que é um progenitor feminino ou um progenitor masculino. Características das plantas re- sultantes podem ser aprimoradas através de uma análise cuidadosa das plantas progenitoras.
[00125] Uma planta transgênica que contém um polinucleotídeo de dgt-14 de uma modalidade da presente descrição pode ser produzida primeiro cruzando sexualmente uma primeira planta progenitora que consiste em uma planta crescida a partir da semente de qualquer uma das linhagens citadas aqui e uma segunda planta progenitora, deste modo, produzindo uma pluralidade de primeiras plantas de prole; en- tão, selecionando uma primeira planta de prole que é resistente ao gli- fosato; autopolinizando a primeira planta de prole, deste modo, produ- zindo uma pluralidade de segundas plantas de prole; e, então, selecio- nando, a partir das segundas plantas de prole, uma planta que é resis- tente ao glifosato. Estas etapas podem incluir ainda retrocruzamento da primeira planta de prole ou da segunda planta de prole com a se- gunda planta progenitora ou uma terceira planta progenitora. Uma cul- tura que compreende sementes de modalidades particulares, ou prole das mesmas pode, então, ser plantada.
[00126] Deve também ser entendido que duas diferentes plantas transgênicas podem também ser cruzadas para produzir descendentes que contenham dois genes exógenos de segregação independente adicionados. Autopolinização apropriada de prole pode produzir plan- tas que são homozigóticas para ambos os genes exógenos adiciona- dos. Retrocruzamento de uma planta progenitora e cruzamento com uma planta não transgênica também considerados, bem como propa- gação vegetativa. Outros métodos de melhoramento comumente usa- dos para diferentes traços e culturas são conhecidos na técnica. Me- lhoramento por retrocruzamento tem sido usado para transferir genes para um traço simplesmente herdado, altamente hereditário para um cultivar homozigótico ou linhagem endógama desejável, a qual é o progenitor recorrente. A fonte do traço a ser transferido é denominada o progenitor doador. A planta resultante deverá ter os atributos do pro- genitor recorrente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferi- do do progenitor doador. Após o cruzamento inicial, indivíduos que possuem o fenótipo do progenitor doador são selecionados e cruzados repetidamente (retrocruzamento) com o progenitor recorrente. Espera- se que o progenitor resultante tenha os atributos do progenitor recor- rente (por exemplo, cultivar) e o traço desejável transferido do progeni- tor doador.
[00127] Um ácido nucleico que codifica a sequência de nucleotí- deos de dgt-14 conforme descrito aqui pode ser clonado em um vetor para transformação em células procariotas ou eucariotas para replica- ção e/ou expressão. Vetores podem ser vetores procariotas, por e- xemplo, plasmídeos ou vetores de desvio, vetores de inseto ou vetores eucariotas. Um ácido nucleico que codifica um polinucleotídeo de dgt- 14 também pode ser clonado em um vetor de expressão para adminis- tração a uma célula de planta. Algumas vezes, pode ser preferível ter vetores que sejam funcionais em E. coli (por exemplo, produção de proteína para produzir anticorpos, análise de sequência de DNA, cons- trução de insertos, obtenção de quantidades de ácidos nucleicos).
[00128] Para expressar a proteína DGT-14, sequências de nucleo- tídeos que codificam a sequência de dgt-14 são, tipicamente, subclo- nadas em um vetor de expressão que contém um promotor para dirigir a transcrição. Promotores bacterianos e eucariotas adequados são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2º ed. 1989; 3º ed,, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., su- pra.). Sistemas de expressão bacterianos para expressão da sequên-
cia de dgt-14 estão disponíveis, por exemplo, em E. coli, Bacillus sp. e Salmonella (Palva et al., Gene 22: 229-235 (1983)). Kits para tais sis- temas de expressão estão comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucariotas para células de mamífero, levedura e células de inseto são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e também estão comercialmente disponíveis.
[00129] O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética para a célula é selecionado levando-se em conta o uso pretendido da proteína DGT-14, por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos, protozoários, etc. Vetores de ex- pressão bacterianos e animais convencionais são conhecidos na téc- nica e são descritos em detalhes, por exemplo, na Publicação de Pa- tente dos Estados Unidos 20050064474A1 e Publicações de Patente Internacional WO 05/084190, WOO05/014791 e WOO03/080809. Méto- dos de transfecção convencionais podem ser usados para produzir linhagens de células bacterianas que expressam grandes quantidades de proteína, as quais podem, então, ser purificadas usando técnicas convencionais.
[00130] O promotor usado para expressão de um ácido nucleico que codifica dgt-14 depende da aplicação particular. Por exemplo, um promotor constitutivo forte apropriado para a célula hospedeira é nor- malmente usado para expressão e purificação de proteínas DGT-14. Exemplos não limitativos de promotores preferidos de planta incluem sequências promotoras derivadas de ubiquitina-10 (ubi-10) de A. thali- ana (Callis, et a/., 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); sintase de manopina (Amas) de A. tumefaciens (Petolino et al., Patente dos Esta- dos Unidos Nº 6.730.824.); e/ou vírus Mosaico da ma ndioca (CSVMV) (Verdaguer et a/., 1996, Plant Molecular Biology 31: 1129-1139).
[00131] Nos métodos descritos aqui, uma série de promotores que dirigem a expressão de um gene em uma planta podem ser emprega-
dos. Tais promotores podem ser selecionados de promotores constitu- tivos, quimicamente regulados, indutíveis, tecido-específicos e semen- te-específicos.
[00132] Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do Vírus Mosaico da couve-flor 35S (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812); promotor de Actina de Arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171); promotor de Ubiquitina de milho (Patente dos Estados U- nidos Número 5.510.474; Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619-632 e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689); promotor pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581-588); promotor ALS (Patente dos Estados Unidos Número 5.659.026); promotor de Histona de milho (Chabouté et al. Plant Molecular Biology, 8: 179-191 (1987)) e similares.
[00133] A faixade promotores compatíveis com plantas disponíveis inclui promotores tecido-específicos e indutíveis. Um elemento regula- dor indutível é um que é capaz, direta ou indiretamente, de ativação de transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor, as sequências de DNA ou genes não serão transcritos. Tipicamente, o fator de proteína que se liga especificamente a um elemento regulador indutível para ativar a transcrição está presente em uma forma inativa a qual é, então, direta ou indiretamente convertida à forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico, tal como uma proteína, metabólito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico, ou um estresse fisio- lógico imposto diretamente pelo calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente através da ação de um patógeno ou agente transmissor de doença, tal como um vírus. Uma célula de planta que contém um elemento regulador indutível pode ser exposta a um indutor ao aplicar externamente o indutor à célula ou planta, tal como por meio de pulve- rização, rega, aquecimento ou métodos similares.
[00134] Qualquer promotor indutível pode ser usado em modalida- des da presente descrição. Vide Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361- 366 (1993). Exemplos de promotores indutíveis incluem os promotores do receptor de ecdisona (Patente dos Estados Unidos Nº 6.504.082); promotores do sistema ACE1, os quais respondem ao cobre (Mett et al. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); genes In2-1 e In2-2 de milho, os quais respondem a fitoprotetores de herbicida de sulfonamida (Patente dos Estados Unidos Nº 5.364.780; Hershey et al., Mol. Gen. Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz et al., Mol. Gen. Genet. 227: 229- 237 (1991) ou promotores de um gene de hormônio esteroidal, a ativi- dade de transcrição do qual é induzida por um hormônio de glucocorti- costeroide (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991) e MchNellis et al., (1998) Plant J. 14(2): 247-25); o promotor GST de milho, o qual é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergência (vide Patente dos Estados Unidos Nº 5.965.387 e Publicação de Pedido de Patente In- ternacional Nº WO 93/001294) e o promotor PR-1a de tabaco, o qual é ativado pelo ácido salicílico (vide Ono S, Kusama M, Ogura R, Hiratsu- ka K., "Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Moni- tor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Re- porter System", Biosci Biotechnol Biochem. 23 de Setembro de 2011; 75(9): 1796-800). Outros promotores quimicamente regulados de inte- resse incluem promotores reprimíveis por tetraciclina e indutíveis por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 e Patentes dos Estados Unidos Nº 5.814.618 e
5.789.156).
[00135] Outros promotores reguláveis de interesse incluem um e- lemento regulador que responde ao frio ou um elemento regulador que resposta ao choque térmico, a transcrição do qual pode ser realizada em resposta à exposição ao frio ou calor, respectivamente (Takahashi et al., Plant Physiol. 99: 383-390, 1992); o promotor do gene de desi- drogenase de álcool (Gerlach et al., PNAS USA 79: 2981-2985 (1982); Walker et al., PNAS 84(19): 6624-6628 (1987)), indutível por condi- ções anaeróbicas; e o promotor indutível pela luz derivado do gene rbcS de ervilha ou gene psaDb de ervilha (Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265); um elemento regulador indutível pela luz (Fe- inbaum et al., Mol.
Gen.
Genet. 226: 449, 1991; Lam e Chua, Science 248: 471, 1990; Matsuoka et al. (1993) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 90(20): 9586-9590; Orozco et al. (1993) Plant Mol.
Bio. 23(6): 1129- 1138), um elemento regulador indutível por hormônio de planta (Yama- guchi-Shinozaki et al., Plant Mol.
Biol. 15: 905, 1990; Kares et al., Plant Mol.
Biol. 15: 225, 1990) e similares.
Um elemento regulador indutível também pode ser o promotor dos genes |n2-1 ou In2-2 de milho, o qual responde a fitoprotetores de herbicida de benzenossulfonamida (Her- shey et al., Mol.
Gen.
Genet. 227: 229-237, 1991; Gatz et al., Mol.
Gen.
Genet. 243: 32-38, 1994) e o repressor Tet do transposon Tn10 (Gatz et al., Mol.
Gen.
Genet. 227: 229-237, 1991). Promotores indutí- veis por estresse incluem promotores indutíveis por estresse pela á- gua/sal, tal como P5CS (Zang et al. (1997) Plant Sciences 129: 81-89); promotores indutíveis pelo frio, tais como cor15a (Hajela et al. (1990) Plant Physiol. 93: 1246-1252), cor15b (Wilhelm et al. (1993) Plant Mol.
Biol. 23: 1073-1077), wsc120 (Ouellet et al. (1998) FEBS Lett. 423: 324-328), ci7 (Kirch et al. (1997) Plant Mol.
Biol. 33: 897-909), ci21A (Schneider et al. (1997) Plant Physiol. 113: 335-45); promotores indutí- veis pela estiagem, tais como Trg-31 (Chaudhary et al (1996) Plant Mol.
Biol. 30: 1247-57), rd29 (Kasuga et al. (1999) Nature Biotechno- logy 18: 287-291); promotores indutíveis osmóticos, tais como Rab17 (Vilardell et al. (1991) Plant Mol.
Biol. 17: 985-93) e osmotina (Ragho- thama et al. (1993) Plant Mol.
Biol. 23: 1117-28); e promotores indutí-
veis pelo calor, tais como proteínas de choque térmico (Barros et al. (1992) Plant Mol. 19: 665-75; Marrs et al. (1993) Dev. Genet. 14:27- 41), smHSP (Waters et al. (1996) J. Experimental Botany 47: 325-338) e o elemento indutível por choque térmico do promotor de ubiquitina de salsa (WO 03/102198). Outros promotores indutíveis pelo estresse incluem rip2 (Patente dos Estados Unidos Nº 5.332.808 e Publicação dos Estados Unidos Nº 2003/0217393) e rd29a (Yamagu chi-Shinozaki et al. (1993) Mol. Gen. Genetics 236: 331-340). Determinados promo- tores são indutíveis por ferimento, incluindo o promotor pMAS de A- grobacterium (Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen et al., (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3): 337-343).
[00136] Promotores tecido-específicos preferidos podem ser usados para objetivar transcrição e/ou expressão aumentada dentro de um tecido de planta em particular. Quando de referência à expressão pre- ferencial, o que se quer dizer é expressão em um nível maior no tecido de planta em particular do que em outros tecidos da planta. Exemplos destes tipos de promotores incluem expressão preferida em sementes, tal como aquela proporcionada pelo promotor de faseolina (Bustos et al.1989. The Plant Cell Vol. 1, 839-853) e o gene de globulina-1 de mi- lho (Belanger, et al. 1991 Genetics 129:863-972). Para dicots, promo- tores preferidos para semente incluem, porém sem limitações, B- faseolina de feijão, napina, B-conglicinina, lectina de soja, cruciferina e similares. Para monocots, promotores preferidos para semente inclu- em, porém sem limitações, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, y-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globu- lina 1, etc. Promotores preferidos para sementes também incluem promotores que dirigem a expressão de genes predominantemente em tecidos específicos dentro da semente tais como, por exemplo, o pro- motor preferido para endosperma y-zeína, o promotor críptico de taba-
co (Fobert et al. 1994. T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco. Plant J. 4: 567-577), o promotor do gene P de milho (Chopra et al. 1996. Alleles of the maize P gene with distinct tis- sue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal re- placements. Plant Cell 7: 1149-1158, Errata em Plant Cell 1997, 1: 109), o promotor de globulina-1 de milho (Belenger e Kriz.1991. Mo- lecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene. Genetics 129: 863-972) e promotores que dirigem a expressão ao re- vestimento da semente ou casca de grãos de milho, por exemplo, o promotor de sintetase de glutamina sintetase específico para pericarpo (Muhitch et al.,2002. Isolation of a Promoter Sequence From the Glu- tamine Synthetase,.., Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize. Plant Science 163: 865-872).
[00137] Além do promotor, o vetor de expressão contém, tipicamen- te, uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais necessários para a expressão do ácido nucleico em células hospedeiras, quer procariotas ou eucariotas. Uma cassete de expressão típico contém, assim, um promotor operativa- mente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína e sinais necessários, por exemplo, para poliadeni- lação eficaz do produto de transcrição, término de transcrição, sítios de ligação ribossômica ou término de tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, potencializadores e sinais de Ssplicing heterólogos.
[00138] Outros componentes do vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso pretendido do gene. Exemplos incluem marcado- res selecionáveis, sequências de objetivação ou reguladoras, sequên- cias de peptídeos de trânsito, tal como a sequência de peptídeo de trânsito otimizada (vide Patente dos Estados Unidos Nº 5.510.471), sequências de estabilização, tal como RB7 MAR (vide Thompson e
Myatt, (1997) Plant Mol. Biol., 34: 687-692 e documento WO9727207) ou sequências líderes, íntrons, etc. Descrições gerais e exemplos de vetores de expressão de plantas e genes repórteres podem ser encon- trados em Gruber et al., "Vectors for Plant Transformation" em Me- thods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press páginas 89-119 (1993). A seleção de um vetor de expres- são apropriado dependerá do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão tam- bém incluirá o término 3' da sequência de nucleotídeos heteróloga de interesse, uma região de término de transcrição e tradução funcional em plantas. A região de término pode ser nativa com a sequência de nucleotídeos do promotor de modalidades da presente descrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de término convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de tér- mino de sintase de octopina e sintase de nopalina (NOS) (Depicker et al., Mol. and Appl. Genet. 1: 561-573 (1982) e Shaw et al. (1984) Nu- cleic Acids Research vol. 12, Nº 20, páginas 831-7846 (nos)); vide também Guerineau et al. Mol. Gen. Genet. 262: 141-144 (1991); Proudfoot, Cell 64: 671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5: 141- 149 (1991); Mogen et al. Plant Cell 2: 1261-1272 (1990); Munroe et al. Gene 91: 151-158 (1990); Ballas et al. Nucleic Acids Res. 17: 7891- 7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639 (1987).
[00139] Os cassetes de expressão podem ainda conter sequências líderes 5'. Tais sequências líderes podem atuar para aumentar a tra- dução. Líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, líderes de picornavírus, líder de EMCV (região não codificadora 5' de encefalomiocardite), Elroy-Stein et al. Proc. Nat. A- cad. Sci. USA 86: 6126-6130 (1989); líderes de potivírus, por exemplo, líder de TEV (Tobacco Etch Virus - Vírus da Queima de Tabaco) Car-
rington and Freed Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), líder de MDMV (Vírus Mosaico Anão do Milho - Maize Dwarf Mosaic Virus), Allison et al., Virology 154: 9-20 (1986); proteína de ligação à cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP), Macejak et al. Nature 353: 90-94 (1991); líder não traduzido do mMRNA de proteína do envelope do vírus mosaico da alfafa (RNA 4 de AMV), Jobling et al. Nature 325: 622-625 (1987); líder do Vírus Mosaico de Tabaco (TMV - Tobacco Mosaic Virus), Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237-256; e líder do vírus da mancha clorótica de milho (Maize Chloro- tic Mottle Virus - MCMV) Lommel et al. Virology 81: 382-385 (1991). Vide também Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968 (1987).
[00140] O construto também pode conter sequências que intensifi- cam a tradução e/ou estabilidade de mMRNA, tais como íntrons. Um e- xemplo de um tal íntron é o primeiro íntron do gene Il da variante de histona H3.1Il de Arabidopsis thaliana. Chaubet et al. Journal of Mole- cular Biology, 225: 569-574 (1992).
[00141] Naqueles casos onde é desejável ter o produto expresso da sequência de nucleotídeos heteróloga dirigido a um organela particu- lar, particularmente o plastídeo, amiloplasto ou retículo endoplasmáti- co, ou secretado na superfície da célula ou extracelularmente, o cas- sete de expressão pode ainda compreender uma sequência codifica- dora para um peptídeo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem, porém sem limitações, o peptídeo de trânsito para a proteína portadora de acila, a pequena subunidade de RUBISCO, sintase EPSP de planta e Helianthus annuus (vide Lebrun et al. Patente dos Estados Unidos Nº 5.510.417), pe ptídeo de trânsito de cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson et al. Plant Physiol 117(4): 1235-1252 (1998); Sullivan et al. Plant Cell 3(12): 1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196(3): 477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267(26): 18999-9004) e similares. Além disso, peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos são conhecidos na técnica, tal como o Peptídeo de Trânsito Otimizado (vide Patente dos Estados U- nidos Nº 5.510.471). Peptídeos de trânsito de cloro plasto adicionais foram descritos previamente nas Patentes dos Estados Unidos Nº
5.717.084; 5.728.925. Aqueles versados na técnica apreciarão pron- tamente as muitas opções disponíveis para expressar um produto em um organela particular. Por exemplo, a sequência de alfa-amilase de cevada é frequentemente usada para dirigir a expressão ao retículo endoplasmático (Rogers, J. Biol. Chem. 260: 3731-3738 (1985)).
[00142] Será apreciado por aqueles versados na técnica que o uso de tecnologias de DNA recombinante pode aprimorar o controle de ex- pressão de moléculas de ácido nucleico transfectadas por meio de manipulação, por exemplo, o número de cópias das moléculas de áci- do nucleico dentro da célula hospedeira, a eficiência com a qual as moléculas de ácido nucleico são transcritas, a eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e a eficiência de modificações pós-traducionais. Adicionalmente, a sequência do promotor poderia ser geneticamente modificada para aprimorar o nível de expressão quando comparado com o promotor nativo. Técnicas recombinantes úteis para controlar a expressão de moléculas de ácidos nucleicos in- cluem, porém sem limitações, integração estável das moléculas de á- cido nucleico em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, adi- ção de sequências de estabilidade de vetor em plasmídeos, substitui- ções ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exem- plo, promotores, operadores, intensificadores), substituições ou modifi- cações de sinais de controle da tradução (por exemplo, sítios de liga- ção ribossômica, sequências de Shine-Dalgarno ou Kozak), modifica- ção de moléculas de ácido nucleico que correspondem ao uso de có- don da célula hospedeira e supressão de sequências que desestabili- zam transcritos.
[00143] Genes repórteres ou marcadores para seleção de células ou tecidos ou partes de planta ou plantas transformadas podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores se- lecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabóli- tos, tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, redutase de di- hidrofolato, a qual confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13: 143-149, 1994; vide também Herrera Es- trella et al., Nature 303: 209-213, 1983; Meijer et al., Plant Mol. Biol. 16: 807-820, 1991); fosfotransferase de neomicina, a qual confere re- sistência a aminoglicosídeos de neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2: 987-995, 1983 e Fraley et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 4803 (1983)) e fosfotransferase de higromicina, a qual confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32: 481-485, 1984; vide também Waldron et al., Plant Mol. Biol. 5: 103-108, 1985; Zhijian et al., Plant Science 108: 219-227, 1995); trpB, a qual permite que as células utilizem indola em vez de triptofano; hisD, a qual permi- te que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 85: 8047, 1988); isomerase de manose-6- fosfato, a qual permite que as células utilizem manose (documento WO 94/20627); descarboxilase de ornitina, a qual confere resistência ao inibidor de descarboxilase de ornitina, 2-(difluorometil)-DL -ornitina (DFMO; McConlogue, 1987, em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Asper- gillus terreus, a qual confere resistência à blasticidina S (Tamura, Bi- osci. Biotechnol. Biochem. 59: 2336-2338, 1995).
[00144] “Marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma sintase de acetolactato mutante, a qual confere resistência à imi- dazolinona ou sulfonilureia (Lee et al., EMBO J. 7:1241-1248, 1988), um mutante psbA, o qual confere resistência à atrazina (Smeda et al., Plant Physiol. 103: 911-917, 1993) ou uma oxidase de protoporfirino-
gênio mutante (vide Patente dos Estados Unidos Nº 5.767.373) ou ou- tros marcadores que conferem resistência a um herbicida, tal como glufosinato. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, porém sem limitações, genes que codificam resistência ao cloranfenicol (Herrera Estrella et al., EMBO J. 2: 987-992, 1983); es- treptomicina (Jones et al., Mol. Gen. Genet. 210: 86-91, 1987); espec- tinomicina (Bretagne-Sagnard et al., Transgenic Res. 5: 131-137, 1996); bleomicina (Hille et al., Plant Mol. Biol. 7: 171-176, 1990); sulfo- namida (Guerineau et al., Plant Mol. Biol. 15: 127-136, 1990); bro- moxynil (Stalker et al., Science 242: 419-423, 1988); glifosato (Shaw et al., Science 233: 478-481, 1986); fosfinotricina (DeBlock et al., EMBO J. 6: 2513-2518, 1987) e similares.
[00145] Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA que codifica resistência ao glufosinato e, em uma modalidade, pode ser a acetil transferase de fosfinotricina (pat), gene pat de milho otimizado ou o gene bar sob o controle do promotor do vírus do mosaico da mandioca. Estes genes conferem resistência ao bialaphos. Vide Wohl- leben et a/., (1988) Gene 70: 25-37; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603; 1990; Uchimiya et al., BioTechnology 11: 835, 1993; White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062, 1990; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79: 625-631, 1990; e Anzai et al., Mol. Gen. Gen. 219: 492, 1989. Uma versão do gene pat é o gene pat otimizado de milho descrito na Paten- te dos Estados Unidos Nº 6.096.947.
[00146] Além disso, marcadores que facilitam a identificação de uma célula de planta que contém o polinucleotídeo que codifica o mar- cador podem ser empregados. Marcadores contáveis ou detectáveis são úteis onde a presença da sequência produz um produto mensurá- vel e pode produzir o produto sem destruição da célula de planta. E- xemplos incluem o gene de B-glucuronidase ou uidA (GUS), o qual co- difica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são co-
nhecidos (por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nº 5.268.463 e
5.599.670); acetil transferase de cloranfenicol (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 Nº 13, páginas 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é beta-caroteno ou provitamina A (Ye et al., Science 287: 303-305-(2000)). O gene tem sido usado para aumentar a nutrição de arroz mas, neste caso, é usa- do em vez de um marcador detectável e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada pela cor dourada conferida. Ao con- trário do caso onde o gene é usado por sua contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor da proteína é suficiente para fins de marcação. Outros marcadores detectáveis incluem os genes de an- tocianina/flavonoides em geral (vide discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990)2: 115-127) incluindo, por exemplo, um gene do R-locus, o qual codifica um produto que regula a produção de pigmen- tos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta et al., em Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publi- shers, Appels and Gustafson eds., páginas 263-282 (1988)); os genes os quais controlam a biossíntese de pigmentos flavonoides, tais como os genes C1 de milho (Kao et al., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; S- cheffler et al. Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 de milho (Wie- nand et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 203: 202-207); o gene B (Chand- ler et al., Plant Cell (1989) 1: 1175-1183), o gene p1 (Grotewold et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88: 4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76: 543-553; Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39: 11-19); os genes do locus bronze (Ralston et al., Genetics (1988) 119: 185- 197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), dentre outros.
[00147] Outros exemplos de marcadores adequados incluem o ge- ne da proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 and Kato et al. (2002) Plant Physiol. 129: 913- 42), o gene da proteína fluorescente amarela (PHIYFP'Y da Evrogen;
vide Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, o qual codifica uma luciferase, a presença do qual pode ser detectada usando, por exemplo, um filme de raios X, contagem de cintilação, es- pectrofotometria fluorescente, câmaras de vídeo de baixa luminosida- de, câmaras de contagem de fótons ou luminometria com múltiplas cavidades (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8: 343); um gene da proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al., Plant J. (1995) 8(5): 777-84); e DsRed2, onde as células de planta transformadas com o gene marca- dor são de cor vermelha e, assim, visualmente selecionáveis (Dietrich et al. (2002) Biotechniques 2(2): 286-293). Exemplos adicionais inclu- em um gene de B-lactamase (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci. U.-S.A. (1978) 75: 3737), o qual codifica uma enzima para a qual são conheci- dos vários substratos cromogênicos (por exemplo, PADAC, uma cefa- losporina cromogênica); um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.-S.A. (1983) 80: 1101), o qual codifica uma dioxigenase de catecol que pode converter catecóis cromogênicos; um gene de a- amilase (lkuta et al., Biotech. (1990) 8: 241); e um gene de tirosinase (Katz et al., J. Gen. Microbiol. (1983) 129: 2703), o qual codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona a qual, por Sua vez, se condensa para formar o composto melanina facilmente detectável. Evidentemente, muitos destes marcadores estão disponí- veis e são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00148] Em determinadas modalidades, a sequência de nucleotí- deos pode ser opcionalmente combinada com outra sequência de nu- cleotídeos de interesse. O termo "sequência de nucleotídeos de inte- resse" refere-se a uma molécula de ácido nucleico (a qual pode tam- bém ser dita como um polinucleotídeo) a qual pode ser uma molécula de RNA transcrita, bem como moléculas de DNA, que codifica um po- lipeptídeo ou proteína desejada, mas também pode referir-se à molé- culas de ácido nucleico que não constituem um gene completo e as quais não codificam necessariamente um polipeptídeo ou proteína (por exemplo, um promotor). Por exemplo, em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode ser combinada ou "empilhada" com outra que confere resistência ou tolerância adicional ao glifosato ou outro herbicida e/ou confere resistência para selecionar insetos ou do- enças e/ou intensificações nutricionais e/ou características agronômi- cas aprimoradas e/ou proteínas ou outros produtos úteis para uso em rações para animais, alimentos, industriais, farmacêuticos ou outros. O "empilhamento" de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos de interesse dentro do genoma de uma planta pode ser obtido, por exem- plo, através de melhoramento convencional de plantas usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, re-transformação de uma planta transgênica ou adição de novos traços por meio de integração objeti- vada através de recombinação homóloga.
[00149] Tais sequências de nucleotídeos de interesse incluem, po- rém sem limitações, aqueles exemplos fornecidos abaixo.
1. Genes ou Sequências Codificadoras (por exemplo, RNAi) que Con- ferem Resistência à Pragas ou Doenças
[00150] (A) Genes de Resistência à Doenças de Plantas. Defesas das plantas são frequentemente ativadas pela interação específica en- tre o produto de um gene de resistência à doenças (R) na planta e o produto de um gene de avirulência (Avr) correspondente no patógeno. Uma variedade de plantas podem ser transformadas com o gene de resistência clonado para manipular plantas que sejam resistentes à cepas patogênicas específicas. Exemplos de tais genes incluem o ge- ne Cf-9 de tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266: 789), o gene Pto de tomate, o qual codifica uma quinase de proteína, para resistência a Pseudomonas syringae pv. de tomate (Martin et al., 1993 Science 262: 1432) e o gene RSSP2 de A-
rabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78: 1089).
[00151] (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado sobre a mesma, tal como uma sequência de nucleotídeos de um gene de i-endotoxina de Bt (Geiser et al., 1986 Gene 48: 109) e um gene inseticida vegetativo (VIP) (vide, por exemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 5389-94). Além disso, moléculas de DNA que codificam genes de d-endotoxinas podem ser adquiridas da American Type Culture Collec- tion (Rockville, MD) sob os números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.
[00152] (C) Uma lectina, tal como sequências de nucleotídeos de vários genes de lectina de ligação à manose de Clivia miniata (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24: 825).
[00153] (D) Uma proteína de ligação à vitamina, tais como avidina e homólogos de avidina, os quais são úteis como larvicidas contra pra- gas de insetos. Vide Patente dos Estados Unidos Nº 5.659.026.
[00154] (E) Um inibidor enzimático, por exemplo, um inibidor de pro- tease ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de protease de cisteína de arroz (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262: 16793), um inibidor | de protease de tabaco (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21: 985) e um inibidor de a-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243).
[00155] (F)Um hormônio ou ferormônio específico para inseto, tal como um ecdiesteroide e hormônio juvenil, uma variante do mesmo, um mimético com base no mesmo ou um antagonista ou agonista do mesmo, tal como expressão em baculovírus de hormônio juvenil clo- nado esterase, um inativador de hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344: 458).
[00156] (G)Um peptídeo ou neuropeptídeo específico para inseto o qual, quando de expressão, perturba a fisiologia da praga afetada (J. Biol. Chem. 269: 9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identifica- da em Diploptera punctata (Pratt, 1989) e neurotoxinas paralíticas es- pecíficas para inseto (Patente dos Estados Unidos Nº 5.266.361).
[00157] (H)Um veneno específico para inseto produzido na nature- za por uma cobra, uma vespa, etc., tal como um peptídeo de escorpião tóxico para insetos (Pang, 1992 Gene 116: 165).
[00158] (1) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de mono- terpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um deri- vado de fenilpropanoide ou outra molécula não proteinácea com ativi- dade inseticida.
[00159] (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo modifi- cação pós-transcricional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzimas glicolíticas, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma estera- se, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, quer natu- ral ou sintética. Exemplos de tais genes incluem um gene callas (Pedi- do PCT publicado WOS93/02197), sequências codificadoras de quitina- se (as quais podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob os núme- ros de acesso 67152 e 3999637), quitinase de ancilóstomo de tabaco (Kramer et al., 1993 /nsect Molec. Biol. 23: 691) e gene de poliubiquiti- na ubi4-2 de salsa (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21: 673).
[00160] (K) Uma molécula que estimula a transdução de sinal. E- xemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeos de clones de cDNA de calmodulina de feijão mungo (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24: 757) e uma sequência de nucleotídeos de um clone de cDNA de calmodulina de milho (Griess et al., 1994 Plant Phy- siol. 104: 1467).
[00161] (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Vide Patentes dos Estados Unidos Nº 5.659.026 e 5.607.914; a última ensina peptí- deos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doenças.
[00162] (M) Uma permease da membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo lítico de cecropina-B (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89: 43), o que torna plantas de tabaco transgênicas resistentes à Pseudomonas solanacearum.
[00163] (N) Uma proteína viral invasiva ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas do envelo- pe viral em células de planta transformadas confere resistência à in- fecções virais e/ou desenvolvimento de doenças pelo vírus do qual o gene de proteína do envelope é derivado, bem como por vírus relacio- nados. Resistência mediada por proteína do envelope foi conferida à plantas transformadas contra vírus mosaico de alfafa, vírus mosaico de pepino, vírus da listra de tabaco, vírus X de batata, vírus Y de bata- ta, vírus da queima de tabaco, vírus do anel de tabaco e vírus mosaico de tabaco. Vide, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopa- thol. 28: 451.
[00164] (O) Um anticorpo específico para inseto ou uma imunotoxi- na derivada do mesmo. Assim, um anticorpo objetivado a uma função metabólica crítica no intestino de inseto poderia inativar uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract H497, Seventh Intl. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interacti- ons, mostram inativação enzimática em tabaco transgênico via produ- ção de fragmentos de anticorpos com uma única cadeia.
[00165] (P) Um anticorpo específico para vírus. Vide, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266: 469, o qual mostra que plantas transgênicas que expressam genes de anticorpos recombinantes são protegidas contra ataque viral.
[00166] (Q) Uma proteína que interrompe o desenvolvimento pro-
duzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, endo a- 1,4-D poligalacturonases fúngicas facilitam a colonização fúngica e liberação de nutrientes pela planta ao solubilizar a homo-a-1,4-D- galacturonase na parede celular da planta (Lamb et al., 1992) Bi- o/Technology 10: 1436). A clonagem e caracterização de um gene o qual codifica uma proteína inibidora de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart et al. (1992 Plant J. 2: 367).
[00167] (R) Uma proteína que interrompe o desenvolvimento produ- zida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação de ri- bossomo de cevada, que confere uma maior resistência à doença fún- gica (Longemann et al., 1992. Bio/Technology 10: 3305).
[00168] (S) RNA de interferência, no qual uma molécula de RNA é usada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA, em um exemplo, é parcial ou totalmente fita dupla, a qual dispa- ra uma resposta ao silenciamento, resultando em clivagem do dsRNA em pequenos RNAs de interferência os quais são, então, incorporados em um complexo de objetivação que destrói MRNAs homólogos. Vide, por exemplo, Fire et al., Patente dos Estados Unidos Nº 6.506.559.; Graham et al., Patente dos Estados Unidos Nº 6.573. 099.
2. Genes que Conferem Resistência a um Herbicida
[00169] (A) Genes que codificam a resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida de imidazalinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Exemplos de genes nesta categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee et al., 1988 EMBO J. 7: 1241), a qual é também conhecida como enzima AHAS (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80: 449).
[00170] (B)Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância ao glifosato transmitida por genes mutantes de sintase de EPSP e aroA ou através de inativação metabólica por genes tais como GAT (acetiltransferase de glifosato) ou GOX (oxidase de glifosa-
to) e outros compostos de fosfono, tal como glufosinato (genes pat e bar, DSM-2) e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo-hexanodionas (genes que codificam inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nº 4.940.835, a qual descreve a sequência de nu- cleotídeos de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida da ATCC sob o Número de Acesso 39256 e a sequên- cia de nucleotídeos do gene mutante é descrita na Patente dos Esta- dos Unidos Nº 4.769.061. O Pedido de Patente Europe ia Nº O 333 033 e Patente dos Estados Unidos Nº 4.975.374 descrevem sequências de nucleotídeos de genes de sintetase de glutamina que conferem resis- tência a herbicidas, tal como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotí- deos de um gene de acetil transferase de fosfinotricina é fornecida no Pedido de Patente Europeia Nº O 242 246. De Greef et al. (1989) Bi- o/Technology 7: 61 descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam atividade de acetil transferase de fosfinotricina. Exemplos de genes de resistência a áci- dos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo-hexanodionas, tais como sethoxy- dim e haloxyfop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83: 435.
[00171] (C) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e benzonitrilo (gene de nitrilase). Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3: 169 descrevem o uso de plasmídeos que codificam genes psbA mu- tantes para transformar Chlamydomonas. Sequências de nucleotídeos para genes de nitrilase são descritas na Patente dos Estados Unidos Nº 4.810.648 e moléculas de DNA que contêm estes ge nes estão dis- poníveis sob os números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA que codifica uma S-transferase de glu- tationa são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285: 173.
[00172] (D) Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que se liga à dioxigenases de hidroxifenilpiruvato (HPPD), enzimas as quais catalisam a reação na qual para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isto inclui herbicidas tais como isoxazolas (documentos EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Patente dos Estados Unidos Nº
5.424.276), em particular isoxaflutola, a qual é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilos (documentos EP496630, EP496631), em par- ticular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO02CH3-4-CF3fenil)propano-1,3- diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3CI2fenil )|propano-1,3- diona, tricetonas (documentos EP625505, EP625508, Patente dos Es- tados Unidos Nº 5.506.195), em particular sulcotrio na e pirazolinatos. Um gene que produz um excesso de HPPD nas plantas pode conferir tolerância ou resistência a tais herbicidas incluindo, por exemplo, os genes descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nº 6.268.549 e
6.245.968 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº
20030066102.
[00173] (E)Genes que codificam resistência ou tolerância a herbici- das de fenóxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e os quais também podem conferir resistência ou tolerância a herbicidas de ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a-cetoglutarato (aad-1) descrito na Patente dos Estados Unidos Nº 7.838.733.
[00174] (F)Genes que codificam resistência ou tolerância a herbici- das de fenóxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e os quais também podem conferir resistência ou tolerância a herbicidas de piridilóxi auxina, tais como fluroxypyr ou triclopyr. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de a- cetoglutarato (aad-12), descrito no documento WO 2007/053482 A2.
[00175] (G) Genes que codificam resistência ou tolerância ao di-
camba (vide, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos Nº 20030135879).
[00176] (H)Genes que conferem resistência ou tolerância a herbici- das que inibem a oxidase de protoporfirinogênio (PPO) (vide Patente dos Estados Unidos Nº 5.767.373).
[00177] (1) Genes que conferem resistência ou tolerância a herbici- das de triazina (por exemplo, atrazina) e herbicidas de derivados de ureia (tal como diuron) que se ligam à proteínas de centros de reação de fotossistema II (PS 1I) (vide Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245).
3. Genes que Conferem ou Contribuem Para um Traço de Valor Adi- cionado
[00178] (A) Metabolismo modificado de ácidos graxos, por exemplo, através de transformação de milho ou Brassica com um gene antis- senso ou desaturase de estearoil-ACP para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 2624).
[00179] (B) Diminuição do teor de fitato
[00180] (1) Introdução de um gene que codifica a fitase, tal como o gene de fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt et al., 1993 Ge- ne 127: 87), aumenta a desagregação de fitato, adicionando mais fos- fato livre à planta transformada.
[00181] (2) Poderia ser introduzido um gene que reduz o teor de fitato. Em milho, por exemplo, isto poderia ser obtido por meio de clo- nagem e, então, reintrodução do DNA associado com o único alelo o qual é responsável por mutantes de milho caracterizados por baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35: 383).
[00182] (C) Composição de carboidrato modificada obtida, por e- xemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica uma enzima que altera o padrão de ramificação de amido. Exemplos de tais enzimas incluem o gene de frutosiltransferase de Streptococcus mu- cus (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170: 810), o gene de levansu- crase de Bacillus subtilis (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genet. 200: 220), a-amilase de Bacillus licheniformis (Pen et al., 1992 Bi- o/Technology 10: 292), genes de invertase de tomate (Elliot et al., 1993), gene de amilase de cevada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268: 22480) e a enzima || de ramificação de amido em endosperma de milho (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102: 10450).
[00183] A sequência de interesse também pode ser uma sequência de nucleotídeos introduzida em uma área predeterminada do genoma da planta por meio de recombinação homóloga. Métodos para integrar de forma estável uma sequência de polinucleotídeos dentro de um sí- tio cromossômico específico de uma célula da planta através de re- combinação homóloga foram descritos na técnica. Por exemplo, inte- gração sítio específica, conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 2009/0111188 A1, envolve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequên- cia de polinucleotídeos doadora em um alvo cromossômico. Além dis- so, o Pedido de Patente Internacional Nº WO 2008/02 1207 descreve recombinação homóloga mediada pelo dedo de zinco para integrar es- tavelmente uma ou mais sequências de polinucleotídeos doadoras em localizações específicas do genoma. Uso de recombinases, tais como FLP/DRF, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos Nº
6.720.475, ou CRE/LOX, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos Nº 5.658.772, pode ser feito para integrar de forma estável uma sequência de polinucleotídeos em um sítio cromossômico especí- fico. Finalmente, o uso de meganucleases para objetivar polinucleotí- deos doadores a um sítio cromossômico específico foi descrito em Pu- chta et al., PNAS USA 93 (1996) páginas 5055-5060).
[00184] Outros vários métodos para integração sítio específica den-
tro de células de planta são geralmente conhecidos e aplicáveis ( Ku- mar et al., Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) páginas 155-159). Além dis- So, sistemas de recombinação sítio-específicos que foram identificados em vários organismos procariotas e eucariota inferiores podem ser a- plicados para uso em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, po- rém sem limitações, o sistema de recombinase R/RS do plasmídeo PSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) e o sistema Gin/gix do fago Mu (Maeser e Ka- hlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
[00185] Vários ensaios podem ser usados em relação à molécula de ácido nucleico de acordo com determinadas variantes da descrição. As técnicas a seguir são úteis em uma variedade de situações e, em uma modalidade, são úteis na detecção da presença da molécula de ácido nucleico e/ou polipeptídeo codificado em uma célula de planta. Por exemplo, a presença da molécula pode ser determinada através de uma variedade de formas, incluindo usando um iniciador ou sonda da sequência, análise ELISA para detectar a proteína codificada, Wes- tern blot para detectar a proteína ou Northern ou Southern blot para detectar RNA ou DNA. Ensaios enzimáticos para detecção da enzima DGT-14 podem ser empregados. Ainda, um anticorpo o qual pode de- tectar a presença da proteína DGT-14 pode ser gerado usando proce- dimentos reconhecidos na técnica. Técnicas adicionais, tais como hi- bridização in situ, coloração enzimática e imunocoloração, também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão do constru- to recombinante em órgãos e tecidos específicos de plantas. O trans- gene pode ser expresso seletivamente em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios do desenvolvimento ou o transgene pode ser ex- presso em praticamente todos os tecidos da planta, substancialmente ao longo de todo seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de ex- pressão combinatorial também é aplicável.
[00186] Análise de Southern é um método de detecção comumente usado, em que o DNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o DNA pelo peso mo- lecular e, então, transferido para membranas de náilon. Ele é, então, hibridizado com o fragmento de sonda, o qual foi radioativamente mar- cado com *?*P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma so- lução de SDS.
[00187] Da mesma forma, análise Northern emprega um protocolo similar, em que o RNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o RNA pelo peso mo- lecular e, então, transferido para membranas de náilon. Ele é, então, hibridizado com o fragmento de sonda, o qual foi radioativamente mar- cado com *?P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma so- lução de SDS. Análise do RNA (por exemplo, mRNA) isolado de teci- dos de interesse pode indicar os níveis relativos de expressão. Nor- malmente, se o MRNA está presente ou a quantidade de MRNA au- mentou, pode-se presumir que o transgene correspondente é expres- so. A análise de Northern ou outros protocolos de análise de MRNA podem ser usados para determinar os níveis de expressão de um transgene introduzido ou gene nativo.
[00188] Na análise Western, em vez de isolar o DNA/RNA, a proteí- na de interesse é extraída e colocada sobre um gel de acrilamida. À proteína é, então, transferida para uma membrana e contatada com uma substância de marcação. Vide, por exemplo, Hood et al., "Com- mercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification”", Molecular Breeding 3: 291-306 (1997); Towbin et al, (1979) "Electro- phoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose Sheets: procedure and some applications", Proc Natl Acad Sci USA 76(9): 4350-4354; Renart et al., "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure", Proc Natl Acad Sci USA 76(7): 3116-3120.
[00189] A molécula de ácido nucleico de modalidades da descrição ou segmentos da mesma, pode ser usada como iniciador para amplifi- cação por PCR. Na realização de amplificação por PCR, um determi- nado grau de desemparelhamento pode ser tolerado entre o iniciador e o modelo. Portanto, mutações, deleções e inserções (especialmente adições de nucleotídeos na extremidade 5') dos iniciadores exemplifi- cados caem dentro do âmbito da presente descrição. Mutações, inser- ções e deleções podem ser produzidas em um determinado iniciador por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00190] Outro exemplo de método de detecção é a técnica de pi- rossequenciamento, conforme descrito por Winge (Innov. Pharma. Te- ch. 100: 18-24, 2000). Neste método, é concebido um oligonucleotídeo que se sobrepõe ao DNA genômico adjacente e à junção do inserto de DNA. O oligonucleotídeo é hibridizado a um produto de PCR fita sim- ples a partir da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e outro na sequência de flanqueamento genômica) e incubado na pre- sença de uma DNA polimerase, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, 5' fosfossulfato de adenosina e luciferina. DNTPs são adicionados indivi- dualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medi- do. Um sinal luminoso indica a presença da sequência do inserto transgênico/de flanqueamento em virtude de amplificação, hibridização e extensão de uma única ou múltiplas bases bem sucedida (esta téc- nica é usada para sequenciamento inicial, não para a detecção de um gene específico quando ele é conhecido).
[00191] Beacons moleculares foram descritos para uso em detec- ção de sequência. Resumidamente, é concebida uma sonda de oligo- nucleotídeo FRET que se sobrepõe à junção de inserto de DNA e de flanqueamento genômica. A estrutura única da sonda de FRET resulta no fato de que ela contém uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescente e de dissipação em estreita proximidade. A son- da de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador em uma sequência do inserto de DNA e outro na sequência de flanqueamento genômica) se ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A- pós amplificação por PCR bem sucedida, hibridação da(s) sonda(s) de FRET para objetivar a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções fluorescente e de dissipação. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência do inserto transgênico/de flanqueamento em virtude de amplificação e hibridização bem sucedidas.
[00192] Ensaio de sonda por hidrólise, também conhecido como TAQMANPO (Life Technologies, Foster City, Califórnia), é um método para detectar e quantificar a presença de uma sequência de DNA. Re- sumidamente, é concebida uma sonda de oligonucleotídeo de FRET com um oligo dentro do transgene e um na sequência de flanquea- mento genômica para detecção evento-específica. A sonda de FRET e iniciadores de PCR (um iniciador em uma sequência do inserto de DNA e outro na sequência de flanqueamento genômica) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. A hibridização da sonda de FRET resulta em clivagem e liberação da porção fluores- cente para longe da porção de dissipação da sonda de FRET. Um si- nal fluorescente indica a presença da sequência do inserto transgêni- co/de flanqueamento em virtude de amplificação e hibridização bem sucedidas.
[00193] O ELISA, ou imunoensaio enzimático, é conhecido desde
1971. Em geral, antígenos solubilizados em um tampão são revestidos sobre uma superfície de plástico. Quando soro é adicionado, anticor- pos podem se prender ao antígeno sobre a fase sólida. A presença ou ausência destes anticorpos pode ser demonstrada quando conjugado a uma enzima. Adição do substrato adequado detectará a quantidade de conjugado ligado, o qual pode ser quantificado. Um ensaio ELISA comum é aquele que usa anticorpos policlonais anti-(proteína) biotini- lados e um conjugado de fosfatase alcalina. Por exemplo, um ensaio ELISA usado para determinação quantitativa dos níveis de lacase po- de ser um ensaio em sanduíche de anticorpo, o qual usa anticorpos policlonais de coelho obtidos comercialmente. O anticorpo foi conjuga- do à fosfatase alcalina para detecção. Em outro exemplo, um ensaio ELISA para detectar tripsina ou tripsinogênio usa anticorpos policlonais antitripsina e antitripsinogênio biotinilados e um conjugado de estrep- tavidina-fosfatase alcalina.
[00194] Glifosato, uma composição compreendendo N- (fosfonometi|)glicina, é um componente largamente usado em herbici- das. O glifosato é, tipicamente, formulado como um sal em um concen- trado líquido aquoso, um concentrado sólido, uma emulsão ou uma microemulsão. Formas de sal adequadas de glifosato que podem ser usadas de acordo com qualquer uma das formulações incluem, por exemplo, sais de metais alcalinos, por exemplo, sais de sódio e potás- sio, sais de amônio, sais de diamônio, tal como dimetilamônio, sais de alquilamina, por exemplo, sais de dimetilamina e isopropilamina, sais de alcanolamina, por exemplo, sais de etanolamina, sais de alquil sul- fônio, por exemplo, sais de trimetil sulfônio, sais de sulfoxônio e mistu- ras ou combinações dos mesmos. Exemplos de formulações comerci- ais de glifosato incluem, sem restrição: GLYPHOMAXº, GLYPHO- MAXº XRT, GLYPHOMAXº PLUS, DURANGOº?, ROUNDUP ULTRA”, ROUNDUP ULTRAMAXº, ROUNDUPº CT, ROUNDUPº EXTRA, ROUNDUPº BIOACTIVE, ROUNDUPº BIOFORCE, RODEO”, POLA- RISº, SPARKº, ACCORDº SP, ACCORDº XRT, and ACCORDº CONCENTRATE, todos os quais contêm glifosato como seu sal de isopropilamônio (IPA); ROUNDUPº DRY and RIVAL'Y, os quais con- têm glifosato como seu sal de amônio; ROUNDUPº GEOFORCE, uma formulação do glifosato sódico; TOUCHDOWN''Y, uma formulação sal de trimésio de glifosato, TOUCHDOWN IQ7Y, uma formulação sal de diamônio de glifosato, TOUCHDOWN TOTAL 1IQ”, uma formulação de glifosato potássico e ROUNDUP WEATHERMAXº, uma formulação de glifosato potássico. As formulações de glifosato podem incluir fitoprote- tores, tensoativos e adjuvantes. Fornecimento de uma planta ou célula de planta que é resistente à formulações herbicidas de glifosato pode ser útil em uma variedade de aplicações onde essas células de planta tendo tal resistência podem tolerar exposição à quantidades suficien- tes de glifosato as quais são usadas para controlar as ervas daninhas em uma área sob cultivo. Modificação da sequência de nucleotídeos nativa de dgt-14 bacteriana pode permitir resistência aprimorada ao herbicida glifosato quando expresso em uma célula de planta.
[00195] O glifosato pode ser aplicado por cima de plantas em e- mergência ao longo dos diferentes estágios de desenvolvimento da planta. Variedades de plantas tolerantes ao glifosato usado em combi- nação com formulações herbicidas de glifosato se tornaram o progra- ma padrão para manejo de ervas daninhas em produção agrícola nos Estados Unidos e em todo o mundo. A principal vantagem para os produtores de usar um traço de tolerância ao glifosato (por exemplo, dgt-14) é que isto permite uma aplicação simples e conveniente de gli- fosato, um largo espectro herbicida pós-emergência, para controlar plantas e gramíneas indesejadas (por exemplo, "ervas daninhas") com excelente nível de segurança para a cultura e menor dependência de aplicações de herbicidas pré-planta. Outros benefícios incluem um me- lhor ajuste em sistemas de preparo reduzido e plantio direto. Culturas tolerantes ao glifosato têm expandido as opções para manejo de ervas daninhas e tornou a prática de controle de ervas daninhas muito mais fácil, mais barata e mais flexível. Os produtores têm reportado que fa- zem menos incursões através dos campos para aplicar herbicidas, bem como fazer menos incursões de cultivo, o que conserva combus- tível e reduz a erosão do solo. Culturas tolerantes ao glifosato, portan- to, diminuem os riscos ambientais causados pelos herbicidas e, ao mesmo tempo, aumentam a eficácia do controle químico necessário de ervas daninhas.
[00196] Consequentemente, em diversas modalidades, são propor- cionados métodos para o controle seletivo de ervas daninhas em uma área sob cultivo contendo uma planta resistente ao glifosato. Os méto- dos compreendem aplicação de uma quantidade suficiente de um her- bicida glifosato à folhagem de culturas e ervas daninhas para controlar o crescimento das ervas daninhas.
[00197] A quantidade relativa de glifosato presente em uma compo- sição herbicida considerada (isto é, um concentrado sólido em partícu- las ou um concentrado líquido ou, alternativamente, uma composição pronta para uso ou mistura para tanque) pode variar dependendo de muitos fatores incluindo, por exemplo, a espécie de erva daninha a ser controlada e o método de aplicação. De um modo geral, no entanto, a concentração de glifosato e opcionalmente um tensoativo e/ou algum outro adjuvante ou aditivo (conforme descrito aqui em outra parte) u- sado na composição herbicida é suficiente para controlar as ervas da- ninhas dentro de uma área sob cultivo.
[00198] Adicionalmente, a concentração de glifosato e opcional- mente um tensoativo e/ou algum outro adjuvante ou aditivo (conforme descrito aqui em outra parte) usado na composição herbicida é sufici- ente para permitir o controle de novo crescimento de ervas daninhas dentro de uma área sob cultivo.
[00199] Consequentemente, composições de concentrado líquido são formuladas para incluir glifosato em uma concentração de pelo menos cerca de 50 gramas, pelo menos cerca de 75 gramas ou pelo menos cerca de 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 ou 700 gramas (equiva- lente ácido ou a.e.) por litro ou mais. As concentração de glifosato va- ria, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 680 gramas (a.e.) por litro, de cerca de 100 a cerca de 600 gramas (a.e.) por litro (gpl), de cerca de 250 a cerca de 600 gramas (a.e.) por litro ou de cerca de 360 a cerca de 540 gramas (a.e.) por litro. Quando expresso como uma per- centagem em peso com base no peso total do concentrado de glifosa- to, um concentrado líquido compreende pelo menos cerca de 10% em peso de glifosato (equivalente ácido ou a.e.), pelo menos cerca de 15% em peso ou pelo menos cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou 68% em peso a.e. ou mais. A concentração de glifosato varia, por exemplo, de cerca de 10% em peso a cerca de 70% em peso a.e., de cerca de 20% em peso a cerca de 68% em peso a.e. ou de cerca de 25% em peso a cerca de 45% em peso a.e. Se o concentrado é aplicado como uma composição pronta para uso, a concentração de glifosato é, tipicamente, de cerca de 1% em peso a cerca de 3% em peso a.e. e de cerca de 1% em peso a cerca de 2% em peso a.e.
[00200] “Quando expresso como uma percentagem em peso com base no peso total do concentrado de glifosato, composições de con- centrados sólidos são formuladas para incluir glifosato em uma con- centração de pelo menos cerca de 5% em peso de glifosato (equiva- lente ácido ou a.e.), pelo menos cerca de 20% em peso a.e. ou pelo menos cerca de 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% em peso a.e. ou mais. A concentração de glifosato varia, por e-
xemplo, de cerca de 5 % em peso a cerca de 97% em peso a.e., de cerca de 30 % em peso a cerca de 85% em peso a.e. ou de cerca de 50% em peso a cerca de 75% em peso a.e.
[00201] “Composições para pulverização são formuladas para apli- cação de pelo menos cerca de 1 galão (3,8 L) da composição para pulverização por hectare, pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 galões (75,7 L) por hectare ou mais. O volume de pulverização da composição para pulverização va- ria, por exemplo, de cerca de 1 galão (3,8 L) a cerca de 100 galões (380 L) por acre, de cerca de 2 galões (7,6 L) a cerca de 40 galões (151,4 L) por acre e de cerca de 2 galões (7,6 L) a cerca de 5 galões (18,9 litros) por acre para uma aplicação aérea e de cerca de 5 galões (18,9 L) a cerca de 20 galões (75,7 litros) por acre para uma aplicação por terra.
[00202] —Alternativamente, as composições herbicidas de glifosato podem ser fornecida ao usuário final já formuladas, quer na diluição desejada para aplicação (ou seja, composições "prontas para uso") ou requerendo diluição, dispersão ou dissolução em água pelo usuário final (ou seja, composições "concentradas"). Tais concentrados de pré- fabricados podem ser líquidos ou sólidos em partículas.
[00203] “Formulações concentradas líquidas que têm uma fase a- quosa na qual o glifosato está presente predominantemente na forma de um sal e uma fase não aquosa opcionalmente contendo um segun- do ingrediente ativo herbicida que é relativamente insolúvel em água, podem ser empregadas. Tais formulações incluem, ilustrativamente, emulsões, suspensões e suspoemulsões (incluindo macro- e microe- mulsões dos tipos água-em-óleo, óleo-em-água e água-em-óleo-em- água). A fase não aquosa pode compreender, opcionalmente, um componente microencapsulado, por exemplo, um herbicida microen- capsulado. Em formulações com uma fase não aquosa, a concentra-
ção a.e. de glifosato na composição como um todo está, no entanto, dentro das faixas indicadas aqui para formulações concentradas aquo- sas.
[00204] Deverá ser notado que as composições para pulverização herbicidas são aplicadas como soluções ou dispersões aquosas, quer elas tenham sido fabricadas prontas para aplicação ou resultem de uma diluição adicional de um concentrado líquido de glifosato ou da adição de água a um concentrado sólido em partículas de glifosato. No entanto, o termo "aquoso", conforme usado aqui, não pretende excluir a presença de uma pequena quantidade de solvente não aquoso, con- tanto que o solvente predominantemente presente seja água.
[00205] Uma modalidade da descrição é dirigida a um método para matar ou controlar ervas daninhas ou vegetação indesejada em uma área sob cultivo contendo uma cultura (por exemplo, de plantas trans- gênicas resistentes ao glifosato). Em uma modalidade, o método com- preende aplicação de glifosato como uma mistura para tanque e apli- cação de uma quantidade herbicidamente suficiente da mistura para tanque à folhagem de plantas geneticamente transformadas para tole- rar o glifosato e, simultaneamente, à folhagem de ervas daninhas que crescem em estreita proximidade com tais plantas. Este método de uso resulta em controle das ervas daninhas ou vegetação indesejada, ao mesmo tempo em que deixa as plantas tolerantes a herbicida subs- tancialmente ilesas.
[00206] Em uma modalidade da descrição, uma composição aquo- sa de glifosato pode ser aplicada aos tecidos foliares das plantas para matar ou controlar o crescimento de uma ampla variedade de plantas indesejáveis, incluindo gramíneas anuais e perenes e espécies de er- vas daninhas de folha larga, através de aplicação de composições a- quosas de glifosato aos tecidos foliares das plantas. Tais plantas po- dem incluir, porém sem limitações, por exemplo: alfafa, soja, algodão,
canola, linhaça, milho, arroz, braquiária, trigo, açafrão, sorgo, beterra- ba, girassol, tabaco e gramíneas. Assim, qualquer espécie de planta ou célula de planta pode ser selecionada. Em modalidades, as células de planta usadas aqui e plantas cultivadas ou derivadas das mesmas incluem, porém sem limitações, células que podem ser obtidas a partir de colza (Brassica napus); mostarda Indiana (Brassica juncea); mos- tarda Etíope (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); repolho (Bras- sica oleracea); soja (Glycine max); linhaça/linho (Linum usitatissimum); milho (também descrito como milho amarelo) (Zea mays); cártamo (Carthamus tinctorius); girassol (Helianthus annuus); tabaco (Nicotiana tabacum); Arabidopsis thaliana; castanha do Pará (Betholettia excel- sa); mamona (Ricinus communis); coco (Cocus nucifera); coentro (Co- riandrum sativum); algodão (Gossypium spp.); amendoim (Arachis hy- pogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); palma (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); arroz (Oryza sativa); abóbora (Cucurbita maxima); ce- vada (Hordeum vulgare); cana-de-açúcar (Saccharum officinarum); arroz (Oryza sativa); trigo (Triticum spp., incluindo Triticum durum e Triticum aestivum); e lentilha (Lemnaceae sp.). Em algumas modalida- des, a base genética dentro de uma espécie de planta pode variar.
[00207] A composição herbicida é aplicada às plantas em uma taxa suficiente para proporcionar os resultados biológicos desejados: con- trole de crescimento de ervas daninhas sem afetar significativamente as plantas de culturas tolerantes ao glifosato. Estas taxas de aplicação são geralmente expressas como quantidade de glifosato por unidade de área tratada, por exemplo, gramas por hectare (g/ha). O que consti- tui um "efeito significativo" varia de acordo com os padrões e a prática daqueles que investigam, desenvolvem, comercializam e usam as composições e seleção de taxas de aplicação que são significativa- mente eficazes para uma composição está dentro da perícia daqueles versados na técnica. Tipicamente, a quantidade da composição apli-
cada por área unitária para conferir um controle de espécies de ervas daninhas de 85%, conforme medido por redução do crescimento ou mortalidade, é frequentemente usada para definir uma taxa comercial.
[00208] A seleção de uma série de taxas de aplicação de herbicida de glifosato suficientes para controlar ervas daninhas em uma área sob cultivo está dentro da perícia do cientista agrícola comum. Aqueles versados na técnica também reconhecerão que as condições individu- ais da planta, clima e condições de crescimento, bem como os ingre- dientes ativos específicos e sua proporção em peso na composição, influenciarão o grau de eficácia herbicida obtido na prática os métodos descritos aqui.
[00209] As composições herbicidas para pulverização podem ser aplicadas à folhagem das plantas a serem tratadas por meio de qual- quer dos métodos apropriados que são bem conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo técnicas de aplicação aérea e aplicação por terra (por exemplo, um pulverizador do tipo barra, um pulverizador manual, pavios de corda, etc.).
[00210] Se desejado, o usuário pode misturar um ou mais adjuvan- tes com uma composição da descrição e a água de diluição quando de preparo da composição para aplicação. Tais adjuvantes podem incluir um tensoativo adicional e/ou um sal inorgânico, tal como sulfato de amônio, com o objetivo de aprimorar ainda mais a eficácia herbicida.
[00211] Outros aprimoramentos incluem também o uso de fitoprote- tores adequados para proteger ainda mais as plantas e/ou adicionar resistência cruzada a mais herbicidas. Fitoprotetores normalmente a- gem para aumentar o sistema imune da planta ao ativar/expressar CP450. Fitoprotetores são agentes químicos que reduzem a fitotoxici- dade de herbicidas para as plantas através de um mecanismo fisioló- gico ou molecular sem comprometer a eficácia de controle de ervas daninhas.
[00212] —Fitoprotetores herbicidas incluem benoxacor, cloquintocet, cyometrinil, dichlormid, dicyclonon, dietolato, fenclorazola, fenclorim, flurazola, fluxofenim, furilazola, isoxadifeno, mefenpyr, mefenato, ani- drido naftálico e oxabetrinil. Ativadores de plantas (uma nova classe de compostos que protegem as plantas através de ativação de seus me- canismos de defesa) também podem ser usados em modalidades da descrição. Estes incluem acibenzolar e probenazola.
[00213] Fitoprotetores comercializados podem ser usados para a proteção de culturas de sementes grandes, tais como milho, sorgo, arroz e arroz cultivado úmido, contra herbicidas aplicados pré- emergência ou incorporados pré-plantio das famílias tiocarbamato e cloroacetanilida. Fitoprotetores também foram desenvolvidos para pro- teger culturas de cereais de inverno, tal como trigo, contra aplicações pós-emergência de herbicidas de ariloxifenoxipropionato e sulfonilurei- a. O uso de fitoprotetores para a proteção de milho e arroz contra her- bicidas de sulfonilureia, imidazolinona, ciclo-hexanodiona, isoxazola e tricetona também é bem estabelecido. Um aumento induzido por fito- protetor de desintoxicação de herbicidas em plantas fitoprotegidas é amplamente aceito como o principal mecanismo envolvido na ação protetora. Fitoprotetores induzem cofatores, tais como glutationa e en- zimas de desintoxicação de herbicidas, tais como S-transferases de glutationa, mono-oxigenases de citocromo P450 e transferase de glu- cosila. Hatzios, K.K., Burgos, N. (2004) "Metabolism-based herbicide resistance: regulation by safeners", Weed Science: Vol. 52, Nº 3, páginas 454- 467. Todas as publicações e documentos de patentes publicados citados no presente relatório descritivo são aqui incorpora- dos por referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indica- do como sendo incorporado por referência.
[00214] “Modalidades da presente descrição são definidas mais de-
talhadamente nos exemplos a seguir. Deverá ser entendido que estes exemplos são fornecidos a título de ilustração apenas. A partir da dis- cussão acima e estes Exemplos, aqueles versados na técnica podem determinar as características essenciais da descrição e, sem se afas- tar do espírito e âmbito da mesma, podem fazer várias alterações e modificações das modalidades da descrição para adaptá-la aos vários usos e condições. Assim, várias modificações das modalidades da descrição, além daquelas apresentadas e descritas aqui, serão eviden- tes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações também se destinam a cair dentro do âmbito das reivindicações anexas. O seguinte é fornecido como forma de ilustra- ção e não se destina a limitar o âmbito da descrição.
EXEMPLOS Exemplo 1: Sintase de EPSP Mutante
[00215] Uma mutação de um único aminoácido (G96A) na enzima sintase de 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (sintase de EPSP) de Es- cherichia coli pode resultar em insensibilidade ao glifosato (Padgette et al., (1991); Eschenburg et a/., (2002); Priestman et a/., (2005); Haghani et al., (2008)). Embora esta mutação confira tolerância ao glifosato, ela também é conhecida por afetar adversamente a ligação de sintase EPSP ao seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PhosphoEnolPyru- vate - PEP). A alteração resultante na eficiência de ligação ao substra- to pode tornar uma enzima com mutação inadequada para conferir to- lerância ao glifosato in planta.
[00216] O banco de dados do NCBI Genbank foi pesquisado in sili- co quanto à proteína sintase de EPSP e sequências de polinucleotí- deos que contêm naturalmente uma alanina em uma posição análoga dentro da enzima sintase de EPSP àquela da mutação G96A, a qual foi introduzida na versão de E. coli da enzima (Padgette et a/., (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al., (2005); Haghani et al.
(2008)) ou sequências de polinucleotídeos e proteínas de sintase de EPSP que poderiam ser alteradas através de introdução de um alanina por glicina em uma localização G96A análoga.
[00217] Uma enzima que foi identificada foi DGT-14 (ACESSO GENBANK Nº ZP 01452683) de Mariprofundus ferrooxydans. Outros dados in silico garimpados revelaram cinco outras enzimas únicas com homologia à DGT-14 identificadas como DGT-11 (ACESSO GENBANK Nº YP 989551.1), DGT-12 (ACESSO GENBANK Nº ZP 01622155.1), DGT-18 (ACESSO GENBANK Nº NP 928909.1), DGT-29 (ACESSO GENBANK Nº YP 322772.1) e DGT-30 (ACESSO GENBANK Nº ZP 02156189.1). Uma dessas enzimas, DGT -11 (SEQ ID NO: 5), contém uma alanina natural em uma posição análoga den- tro da enzima sintase de EPSP àquela da mutação G96A, a qual foi introduzida na versão de E. coli da enzima. Uma vez que proteínas sintase de EPSP de diferentes organismos são de diferentes compri- mentos, a numeração da mutação para a versão de E. coli da enzima sintase de EPSP não corresponde necessariamente à numeração da mutação para as enzimas sintase de EPSP de outros organismos. Es- tas enzimas identificadas sintase de EPSP, nativas ou com mutação com uma alanina introduzida no resíduo de aminoácido glicina, não foram previamente caracterizadas em relação à tolerância ao glifosato ou afinidade com o substrato PEP.
[00218] As novas enzimas DGT-14, DGT-12, DGT-18, DGT-29 e DGT-30 foram obtidas e a mutação de glicina para alanina foi introdu- zida nas enzimas sintase de EPSP em uma localização análoga ao sítio G96A descrito para a versão de E. coli da enzima sintase de EPSP. A sequência da proteína DGT-14 foi modificada mediante intro- dução de uma alanina para substituir a glicina endógena de ACESSO GENBANK Nº ZP 01452683 no resíduo de aminoácido 101, deste modo, resultando em SEQ ID NO: 1. A sequência de proteína DGT-12 foi modificada mediante introdução de uma alanina para substituir a glicina endógena de ACESSO GENBANK Nº* ZP 01622155.1 no resí- duo de aminoácido 111, deste modo, resultando em SEQ ID NO: 7. A sequência da proteína DGT-18 foi modificada mediante introdução de uma alanina para substituir a glicina endógena de ACESSO GEN- BANK Nº NP 928909.1 no resíduo de aminoácido 96, deste modo, resultando em SEQ ID NO: 9. A sequência da proteína DGT-29 foi modificada mediante introdução de uma alanina para substituir a glici- na endógena de ACESSO GENBANK Nº YP 322772.1 no re síduo de aminoácido 96, deste modo, resultando em SEQ ID NO: 11. A sequên- cia da proteína DGT-30 foi modificada mediante introdução de uma alanina para substituir a glicina endógena de ACESSO GENBANK Nº* ZP 02156189.1 no resíduo de aminoácido 96, deste modo, resultando em SEQ ID NO: 13.
[00219] As enzimas sintase de EPSP modificadas e a enzima de sintase de EPSP nativa DGT-11 foram caracterizadas quanto à tole- rância ao glifosato e afinidade pelo substrato PEP por meio de compa- ração com enzimas sintase de EPSP de Classe |. As seguintes enzi- mas de Classe |: DGT 1 de Glycine max, DGT-3 de Brassica napus (ACESSO GENBANK Nº P17688) e DGT-7 de Triticum aestivum (A- CESSO GENBANK Nº* EU977181) foram usadas como uma compa- ração. As enzimas sintase de EPSP de Classe | e variantes mutantes das mesmas foram sintetizadas e avaliadas. Uma mutação introduzida nas enzimas sintase de EPSP de planta consistia na mutação de Gli- cina para Alanina feita dentro da enzima sintase de EPSP em uma lo- calização similar àquela da mutação G96A da versão de E. coli da en- zima. Além disso, mutações de Treonina para Isoleucina e Prolina pa- ra Serina foram introduzidas dentro destas enzimas sintase de EPSP de Classe | em posições análogas àquelas do aminoácido 97 (T para |) e aminoácido 101 (P para S) na sintase de EPSP de E. coli, conforme descrito em Funke et a/., (2009).
[00220] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequência parcial de DGT-14, DGT-11, DGT-12, DGT-18, DGT-29 e DGT-30 com outras enzimas sintase de EPSP. Como um resultado da modificação de ala- nina para glicina para DGT-14, DGT-12, DGT-18,-DGT 29 e DGT-30, estas enzimas DGT compartilham uma alanina conservada na posição de aminoácido 96 da enzima sintase de EPSP aroA. A localização deste aminoácido é indicada por um asterisco e o resíduo de aminoá- cido está sublinhado.
[00221] A Figura 2 mostra um alinhamento das enzimas DGT-1, DGT-3 e DGT-7. A localização do resíduo de aminoácido que sofreu mutação de glicina para alanina é indicada pelo primeiro asterisco. À localização do resíduo de aminoácido que sofreu mutação de treonina para isoleucina é indicada pelo segundo asterisco. A localização do terceiro resíduo de aminoácido que sofreu mutação de prolina para serina é indicada pelo terceiro asterisco. Estas mutações foram intro- duzidas em diferentes versões de DGT 1, DGT-3 e DGT-7. As diferen- tes versões dos genes os quais contêm as mutações são descritas em maiores detalhes abaixo. Exemplo 2: Otimização de Sequência para Expressão em Plantas e Bactérias
[00222] Análise da sequência codificadora de DGT-14 de Maripro- fundus ferrooxydans revelou a presença de vários motivos de sequên- cia que se acreditava serem prejudiciais para expressão ótima em planta, bem como uma composição de códons não ótima para expres- são em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Modalidades da presente descrição fornecem um uma concepção de um gene de plan- ta otimizado que codifica DGT-14 para gerar uma sequência de DNA que pode ser expressa de forma ótima em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas e em que as modificações de sequência não impe-
dem a tradução ou transcrição.
[00223] Em virtude da plasticidade conferida pela redundân- cia/degenerância do código genético (isto é, alguns aminoácidos são especificados por mais de um códon), a evolução dos genomas em diferentes organismos ou classes de organismos tem resultado em uso diferencial de códons sinônimos. Esta "tendência de códon" se reflete na composição de base média de regiões codificadoras de proteínas. Por exemplo, organismos tendo genomas com teores relativamente baixos de G+C usam mais códons tendo A ou T na terceira posição de códons sinônimos, enquanto que aqueles que têm teores relativamen- te maiores de G+C usam mais códons com G ou C na terceira posi- ção. Além disso, acredita-se que a presença de códons "secundários" dentro de um mMRNA possa reduzir a taxa absoluta de tradução de MRNA, especialmente quando a abundância relativa do tRNA carre- gado correspondente ao códon secundário é baixa. Uma extensão deste raciocínio é que a diminuição na taxa de tradução por códons secundários individuais seria pelo menos aditiva para múltiplos códons secundários. Portanto, MRNAs tendo altos teores relativos de códons secundários teriam taxas de conversão correspondentemente baixas. Esta taxa poderia ser refletida por níveis correspondentemente baixos da proteína codificada.
[00224] Em engenharia de um gene que codifica DGT-14 para ex- pressão em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas (tais como algodão, canola, tabaco, milho, soja, trigo e arroz), a tendência de có- dons da(s) planta(s) hospedeira(s) potencial(is) pode ser determinada, por exemplo, usando bancos de dados de sequências de DNA publi- camente disponíveis para encontrar informações sobre a distribuição de códon de genomas de plantas ou regiões codificadoras de proteína de vários genes de plantas. A tendência de códon é a distribuição es- tatística dos códons que a planta usa para codificação dos aminoáci-
dos de suas proteínas.
Os usos de códons preferidos para dicots ou monocots (milho) são mostrados na Tabela 1.
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[00225] A tendência de códons pode ser calculada como a frequên- cia na qual um único códon é usado em relação aos códons para to- dos os aminoácidos.
Alternativamente, a tendência de códon pode ser calculada como a frequência na qual um único códon é usado para codificar um aminoácido particular em relação a todos os outros có- dons para este aminoácido (códons sinônimos). Na concepção de re- giões codificadoras para expressão em planta, os códons primários ("primeira escolha") preferidos pela planta devem ser determinados, bem como as segunda, terceira, quarta, etc. opções de códons prefe- ridos quando há múltiplas escolhas.
Uma nova sequência de DNA po- de, então, ser concebida, a qual codifica a sequência de aminoácidos do mesmo peptídeo de DGT-14, mas a nova sequência de DNA difere da sequência de DNA original pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto pre- ferido, etc.) para especificar o aminoácido em cada posição na se- quência de aminoácidos.
A nova sequência é, então, analisada quanto a sítios de enzimas de restrição que possam ter sido criados pelas modificações.
Os sítios identificados são adicionalmente modificados por substituição dos códons pelos primeiro, segundo, terceiro ou quar- to códons preferidos de escolha.
Outros sítios na sequência os quais poderiam afetar a transcrição ou tradução do gene de interesse inclu- em as estruturas de haste-alça, junções de éxons:íntrons (5' ou 3'), sinais de adição de poli A ou sinais de término de RNA polimerase; estes sítios são removidos pela substituição por códons de plantas.
À sequência é ainda analisada e modificada para reduzir a frequência de duplas de TA ou CG.
Além das duplas, blocos que sequências de G ou C que têm mais do que cerca de seis resíduos que são os mesmos podem afetar a transcrição ou tradução da sequência.
Portanto, estes blocos podem ser vantajosamente modificados por meio de substitui- ção dos códons de primeira ou segunda escolha, etc., pelo próximo códon preferido de escolha.
[00226] Assim, uma variedade de métodos podem ser usados para produzir um gene conforme descrito aqui. Um exemplo de tal aborda- gem é ainda ilustrado no Pedido PCT WO 97/13402. Assim, genes sin- téticos que são funcionalmente equivalentes ao gene dgt-14 da pre- sente descrição podem ser usados para transformar hospedeiros, in- cluindo plantas. Orientação adicional em relação à produção de genes sintéticos pode ser encontrada por exemplo, na Patente dos Estados Unidos Número 5.380.831.
[00227] Para manipular um gene otimizado para planta que codifica um dgt-14, uma sequência de DNA foi concebida para codificar as se- quências de aminoácidos utilizando o código genético redundante es- tabelecido a partir de uma tabela de tendência de códons compilada a partir de sequências de codificação de proteína para as plantas hos- pedeiras em particular. Na Tabela 1, as Colunas D e | apresentam as distribuições (em % de uso para todos os códons para este aminoáci- do) de códons sinônimos para cada aminoácido, conforme encontrado nas regiões codificadoras de plantas monocotiledôneas (milho). As Co- lunas E e J apresentam as distribuições (em % de uso para todos os códons para este aminoácido) de códons sinônimos para cada amino- ácido conforme encontrado nas regiões codificadoras de plantas dicoti- ledôneas. Alguns códons sinônimos para alguns aminoácidos são en- contrados apenas raramente em genes de plantas (por exemplo, CGG). Normalmente, um códon era considerado como sendo usado raramente se ele é representado em cerca de 10% ou menos do tem- po para codificar o aminoácido relevante em genes de qualquer tipo de planta (indicado por DNU nas Colunas C e H da Tabela 1). Para equi- librar a distribuição das escolhas de códons restantes para um amino- ácido, uma representação de Média Ponderada de cada códon foi cal- culada usando a fórmula:
[00228] “Média Ponderada % de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100
[00229] “onde C1é ocódonem questão e %C2, %C3, etc. represen- tam as médias dos valores % para dicot de códons sinônimos restan- tes (valores médios % para os códons relevantes são tomados a partir das Colunas C e H) da Tabela 1.
[00230] O valor da Média Ponderada % para cada códon é forneci- do nas Colunas C e H da Tabela 1.
[00231] Uma nova sequência de DNA a qual codifica essencialmen- te a sequência de aminoácidos da proteína DGT-14 foi concebida para expressão ótima em plantas dicotiledôneas usando uma distribuição equilibrada de códons de códons frequentemente usados encontrados em genes de plantas dicotiledôneas. Uma segunda sequência de DNA a qual codifica essencialmente a sequência de aminoácidos da proteí- na DGT-14 foi concebida para expressão ótima em plantas monocoti- ledôneas usando uma distribuição equilibrada de códons para códons frequentemente usados encontrados em genes de plantas monocotile- dôneas. As duas sequências de DNA são diferentes da sequência ori- ginal de DNA que codifica dgt-14 pela substituição de códons de plan- ta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido) para especificar o aminoácido apropriado em cada posição dentro da sequência de aminoácidos da proteína. Concepção da se- quência de DNA otimizada para planta foi iniciada por tradução inversa de sequência de proteína da sequência da proteína DGT-14 (Acesso GenBank: ZP 01452683) que tinha sido modificada através da intro- dução de uma alanina para substituir a glicina endógena no resíduo de aminoácido 101. SEQ ID NO: 1 foi inversamente traduzida usando uma tabela de tendência de códons para dicot construída a partir da Tabela 1, Colunas E e J. Uma segunda tradução inversa de SEQ ID NO: 1 foi realizada usando uma tabela de tendência de códons para monocot construída a partir da Tabela 1, Colunas D e |. A sequência inicial foi, então, modificada compensando alterações códon (ao mes- mo tempo em que retinha a representação de códon média ponderada global) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzi- mas de restrição, remover estruturas secundárias intrafita altamente estáveis e remover outras sequências que possam ser prejudiciais pa- ra manipulações de clonagem ou expressão do gene manipulado em plantas. A sequência de DNA foi, então, novamente analisada quanto aos sítios de reconhecimento de enzimas de restrição que poderiam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados foram ainda modificados através de substituição dos códons relevantes pelos pri- meiro, segundo, terceiro e quarto códons preferidos de escolha. Ou- tros sítios nas sequências que poderiam afetar a transcrição ou tradu- ção do gene de interesse incluem as junções de éxons:íntrons (5' ou 3'), sinais de adição de poli A ou sinais de término de RNA polimerase. As sequências modificadas foram ainda analisadas e alteradas para reduzir a frequência de duplas de TA ou CG e aumentar a frequência de duplas de TG ou CT. Além destas duplas, blocos de sequências que têm mais do que cerca de seis resíduos consecutivos de [G+C] ou [A+T] podem afetar a transcrição ou tradução da sequência. Portanto, estes blocos de sequência também foram modificados através de substituição dos códons de primeira ou segunda escolha, etc. por ou- tros códons preferidos de escolha. Códons raramente usados não são incluídos de forma substancial na concepção do gene, sendo usados apenas quando necessário para acomodar um critério de concepção diferente que não a composição de códons per se (por exemplo, adi- ção ou deleção de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição).
[00232] A sequência de polinucleotídeos de dgt-14 v2 otimizada pa- ra planta dicotiledônea recentemente criada é listada em SEQ ID NO:
2. A sequência de polinucleotídeos de dgt-14 v2 otimizada para planta monocotiledônea recentemente criada é listada em SEQ ID NO: 3. As sequências de DNA resultantes têm um maior grau de diversidade de códons, uma composição de base desejável, contêm sítios de reco- nhecimento de enzimas de restrição estrategicamente posicionados e ausência de sequências que poderiam interferir com a transcrição do gene ou tradução do mRNA resultante.
[00233] Uma vez que uma sequência de DNA otimizada para planta tenha sido concebida em papel ou in silico, moléculas reais de DNA podem ser sintetizadas em laboratório para corresponder, quanto à sequência, exatamente à sequência concebida. Tais moléculas de áci- do nucleico sintéticas podem ser clonadas e de outra forma manipula- das exatamente como se elas fossem derivadas de fontes naturais ou nativas. Síntese de um fragmento de DNA que compreende SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 contendo sequências adicionais, tais como términos 6-quadro (códons terminais localizados em todos os seis quadros de leitura os quais são adicionados à extremidade 3' da se- quência codificadora) e um sítio de restrição 5' para clonagem, foi rea- lizada por fornecedores comerciais (DNA2.0, Menlo Park, CA). A mo- lécula de ácido nucleico sintética foi, então, clonada em vetores de ex- pressão e transformada em plantas ou bactérias, conforme descrito nos Exemplos abaixo. Otimização para Expressão em Bactérias
[00234] Uma nova sequência de DNA que codifica a proteína DGT- 14 de SEQ ID NO: 1, a qual é otimizada para expressão em células de Escherichia coli, foi concebida. Concepção da sequência de DNA oti- mizada para E. coli foi iniciada por tradução inversa de sequência de proteína de SEQ ID NO: 1 usando um protocolo de otimização de có- dons de propriedade da GeneArt (Regensburg, Alemanha). A sequên- cia inicial foi alterada compensando alterações de códon (ao mesmo tempo em que retém a representação de média ponderada global) pa-
ra remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzimas de res- trição, remover estruturas secundárias intrafita altamente estáveis e outras sequências que poderiam ser prejudiciais para manipulações de clonagem ou expressão do gene manipulado. Um exemplo de tal se- quência prejudicial a ser evitada dentro de uma região codificadora é uma sequência de ligação a RNA 168 ribossômico ("sequência de Shine-Dalgarno"), tal como AGGAGG, a qual pode codificar, por e- xemplo, dois aminoácidos consecutivos da arginina, mas também po- de servir como um sinal de início de tradução intragênico (e, portanto, indesejável). A sequência de DNA de dgt-14 v6 com tendência de có- dons para E. coli que codifica a proteína de SEQ ID NO: 1 é fornecida como SEQ ID NO: 4.
[00235] Para facilitar a clonagem e assegurar início de tradução efi- ciente, uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição Ndel 5' terminal foi colocada a montante do códon de início de tradução ATG. Também para facilitar a clonagem e assegurar término de tradu- ção adequado, bases que codificam dois códons de término de tradu- ção TAA e um sítio de reconhecimento de enzima de restrição Xhol foram incluídos na extremidade 3' da região codificadora. Síntese de um fragmento de DNA que compreende SEQ ID NO: 4 foi realizada pelo fornecedor comercial GeneArt.
[00236] Estratégias de otimização de códon para Escherichia coli similares foram usadas para conceber dgt-11 v6, dgt-12 v6, dgt-18 v6, dgt-29 v6, and dgt-30 v6. As versões com códons otimizados para Es- cherichia coli destes genes são listadas como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14, respectiva- mente. Exemplo 3: Construção de Vetores Para Expressão Bacteriana de Ge- nes os Quais Conferem Tolerância ao Glifosato Construção de Vetor de Expression pET, dat-14 para Expressão em E.
Coli
[00237] Para testagem in vitro, a sequência do gene dgt-14 v6 oti- mizado para E. coli (SEQ ID NO: 3) foi enviada para a GeneArt para síntese e clonagem. A sequência do gene dgt-14 v6 sintetizada foi clo- nada no vetor de expressão pET28 via sítios de restrição Ndel e Xhol adicionados. O construto resultante introduziu um marcador 6X His N- terminal e motivo de ligação à trombina. O construto resultante foi i- dentificado como pDAB100427 (Figura 3).
[00238] “Mutagênese sítio dirigida foi realizada no dgt-14 v6 sintético para confirmar o papel da alanina que foi introduzida no resíduo de glicina do resíduo de aminoácido 101. O kit Quick Change 1I6 da Stra- tagene (Santa Clara, CA) foi usado para realizar a mutagênese. Os iniciadores a seguir foram concebidos para fazer a troca de aminoáci- dos. DGT14 MutF: (SEQ ID NO: 15 5' ggATgCCggTAATgCAggA- ACCTgTgATTCATCTAATAA), DGT14 MutR: (SEQ ID NO: 16 5' CCAT- CAgACgAACACAggTTCCTgcCATTACCAaggCATCC). As reações de PCR foram ajustadas de acordo com o protocolo QuickChange usando PDAB100427 (dgt-14 v6) como DNA modelo. O construto contendo a sequência de tipo selvagem de dgt-14 v1 invertida (SEQ ID NO: 17) foi designado pDAB102945 (Figura 4) e confirmado através de sequenci- amento de DNA. Construtos Adicionais, Vetor de Expressão pET para Expressão em E. Coli
[00239] Para testagem in vitro, as sequências dos genes dgat-11 v6, dgt-12 v6, dgt-18 v6, dgt-29 v6, and dgt-30 v6 foram enviadas para a GeneArt para síntese e clonagem. Os genes sintetizados foram clona- dos no vetor de expressão pET28. Os construtos resultantes foram identificados como pDAB100431 (Figura 5) que contém dgt-11 v6, PDAB100432 (Figura 6) que contém dgt-11 v6, pDAB100435 (Figura 7) que contém agt-18 v6, pDAB100446 (Figura 8) que contém dgt-29 v6, and pDAB100436 (Figura 9) que contém dgt-30 v6.
[00240] —Construtos adicionais contendo dgt-1, dgt-3 e dgt-7 foram sintetizados. Estes construtos foram usados para testagem in vitro das sequências dos genes dgt-1 v5, dgt-1 v6, dgt-1 v7, dgt-1 vê, dgt-3 v6, dat-3 v7, dgt-3 vê, dgt-7 v5, dgt-7 v6, dat-7 v7 e dgt-7 vê e foram envi- adas para a GeneArt para síntese e clonagem. Os genes sintetizados foram clonados no vetor de expressão pET28. Os construtos resultan- tes foram identificados como pDAB102028 que contém dgt-1 v5, PDAB102029 que contém dgt-1 v6, pDAB 102032 que contém agt-1 v7, PDAB102034 que contém dgt-1 v8, pDAB 100429 que contém dgt-3 v6, PDAB 1100442 que contém dgt-3 v7, pDAB 100430 que contém dgt-3 v8, PDAB 102036 que contém dgt-7 v5, pDAB 102038 que contém adgt-7 v6, PDAB 102040 que contém dgt-7 v7, and pDAB102042 que contém dgat- 7 vê. Estes construtos e as sequências de proteínas DGT as quais fo- ram expressas são descritos no Pedido de Patente dos Estados Uni- dos Nº 11975658, incorporado aqui por referência na íntegra. Exemplo 4: Ensaio Cinético Enzimático Bioquímico !n Vitro Superexpressão e Purificação de Enzimas DGT Recombinantes
[00241] Proteínas DGT recombinantes foram superexpressas em células Rosetta2'y (DE3) (Novagen, Madison, WI) a partir dos constru- tos descritos acima. Uma única colônia foi usada para inocular 50 mL de culturas iniciadoras de LB contendo cloranfenicol (25 mg/mL) e ca- namicina (50 pg/ml) que foram cultivadas durante a noite a 37 ºC. As culturas noturnas foram usadas para inocular 1 L de LB contendo clo- ranfenicol (25 mg/mL) e canamicina (50 pg/ml). As culturas foram culti- vadas a 37 (C até uma OD çoo = 0,6, então, colocadas em um banho de água gelada durante 10 minutos. Expressão das proteínas alvo foi ob- tida mediante adição de IPTG até uma concentração final de 500 UM. A indução foi deixada prosseguir durante a noite a 20 ºC, seguido por coleta através de centrifugação a 8.000 rpm durante 20 minutos. Os péletes de células foram armazenados a -80 CT até s erem necessários para purificação. Todos as etapas de purificação foram realizadas a 4 CT.
[00242] Os péletes de células de culturas de 1 L foram ressuspen- sos em 20-30 mL de Tampão A (HEPES a 50 mM, pH de 7,5, KCl a 150 MM, DTT a 2 mM, EDTA a 1 mM, imidazola a 20 mM e 5% de gli- cerol). Coquetel inibidor de protease COMPLETETY (1 comprimido/50 mL, Roche, Indianápolis, IN) e lisozima (1 mg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram, então, adicionados e a suspensão foi agitada duran- te 20 minutos. Lise celular foi realizada usando um sonicador Branson 250 (3 x ciclos de 60 segundos), seguido por remoção dos detritos ce- lulares por meio de centrifugação a 16.000 rpm durante 45 minutos. Enzimas DGT foram purificadas até homogeneidade em uma única etapa através de cromatografia de afinidade com metal imobilizado (Immobilized Metal Affinity Chromatography - IMAC) usando uma colu- na bruta HisTrap FF de 5 mL. A coluna foi equilibrada em Tampão A e a amostra foi carregada no mesmo tampão. A coluna foi, então, lavada com 10 volumes de coluna de Tampão A, seguido por eluição em um gradiente linear de a 0-100% de Tampão B (HEPES a 50 mM, pH de 7,5, KCI a 200 mM, DTT a 2 mM, EDTA a 1 mM, imidazola a 500 mM e 5% de glicerol) sobre 25 volumes de coluna. Frações contendo a pro- teína alvo, conforme avaliado através de análise SDS-PAGE, foram concentradas para 2,5 mL usando um dispositivo de ultracentrifugação Millipore equipado com um filtro com corte de peso molecular (Molecu- lar Weight Cut-Off - MIVCO) de 10 kDa. O tampão das enzimas DGT purificadas foi trocado usando colunas PD-10 (GE Healthcare) em HEPES a 50 mM, pH de 7,5, KCl a 150 MM, DTT a 2 mM e 5% de gli- cerol e subsequentemente concentradas para — 1 mL. As amostras foram, tipicamente, diluídas a 1:50 e o espectro de UV visível foi regis- trado a partir de 240-700 nm em um espectrofotômetro Cary50 Bio UV-
Visible. Um coeficiente de extinção teórico foi, então, usado para cal- cular a concentração de proteína com base na absorbância a 280 nm (ExPASy, Genebra, Suíça).
Caracterização Cinética /n Vitro de Enzimas DGT de Planta e Bacteri- anas
[00243] As atividades enzimáticas de DGTs de tipo selvagem (WT) e mutantes foram medidas pela produção de fosfato inorgânico (P;) em um procedimento modificado descrito por Lanzetta et al/., (1979). Lan- zetta P., Alvarez L., Reinach P. e Candia O., (1979) Anal Bioch., 100: 95-97. Os ensaios foram realizados no formato de placa com 96 cavi- dades em um total de 50 ul sobre um leitor de placas Spectra-Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os ensaios típicos continham HEPES a 50 mM, pH de 7,5, KCl a 150 MM, DITTa 2mM e S3P a 1 mM. Concentrações de PEP e glifosato foram variadas, conforme indi- cado. O glifosato foi obtido da Sigma como o ácido livre e foi ressus- penso em ddH,O. O glifosato foi solubilizado mediante a adição de KOH até a mistura estar em um pH neutro. Os ensaios foram iniciados através da adição da enzima DGT em concentrações que variavam entre 0,01-1 uM. As reações foram terminadas pela adição de 235 ul de uma mistura a 3:1 de verde de malaquita:solução de molibdato de amônio. Após o desenvolvimento de cor ter terminado (- 1 minuto), a alteração na absorbância a 660 nm foi registrada e a quantidade de P; formado foi calculada a partir de uma curva padrão. Reações de con- trole sem enzima foram usadas para corrigir a absorbância de fundo. Altas concentrações de PEP (> 2 mm) e glifosato (> 30 mM) contribu- em com uma quantidade significativa da absorbância de fundo usando este método de detecção. Os dados foram ajustados à equação de Michaelis-Menten, o que permitiu determinação da Kn e Vmax (Equação 1), enquanto que a ICs, foi determinado a partir da Equação 2, onde y é a atividade relativa e s é o coeficiente de Hill. Os dados foram anali-
sados usando o software GraFit'Y versão 5 (Erithacus Software Limi- ted, Horley, Reino Unido). Equação 1: Equação 2: y= 100% - "e
[00244] O valor de Cs, para um inibidor competitivo mudará depen- dendo da concentração de substrato, portanto, os valores de ICs59 na Tabela 2 foram obtidos em PEP a 1 mM e em PEP a 60 uM (uma es- timativa das concentrações intracelulares de PEP em plantas). Apenas os valores de ICsqy medidos com a mesma concentração de PEP de- vem ser comparados. Adicionalmente, valores de ICsx9 de enzimas al- tamente tolerantes não puderam ser precisamente determinados pelo método de Lanzetta e foram, portanto, estimados com base na ativida- de relativa. Cinética de DGTs de Planta
[00245] — Duas enzimas com sequências nativas sem mutação, DGT- 1 v5 e DGT-7 v5, foram testadas primeiro para estabelecer parâmetros de linha de base para sensibilidade ao glifosato. Ambas as proteínas exibiram baixos valores de K,, para PEP (- 70 UM) e eram sensíveis ao glifosato, com valores de IC59y de — 20 uM (Tabela 2) em PEP a 1 mM. Conforme observado para DGT-1 v6, DGT 3 vê e DGT-7 v6, uma única mutação pontual de G para A aprimorou significativamente a to- lerância ao glifosato (valores de IC; de 8-21 mM), mas também au- mentou a K,, para PEP em — 8 vezes. A mutação dupla (GAPS) para todas as DGTs derivadas de plantas (DGT-1 v7, a DGT-3 v7 e DGT-7 v7) também aumentou a tolerância ao glifosato porém, mais uma vez, resultou em uma elevação considerável na K, para PEP (Tabela 2).
Os mutantes TIPS (DGT-1 vê, DGT-3 vê e DGT-7 vê) são tolerantes à concentrações modestas de glifosato (3-6 mM) porém, em contraste com os mutantes GA e GAPS, os níveis da K, se mantiveram próxi- mos das proteínas de tipo selvagem, entre 60-200 uM. A Figura 10 mostra as alterações na tolerância ao glifosato para DGT-1 (A) e DGT- 7 (B) quando de introdução das mutações especificadas. A concentra- ção de PEP foi mantida a 1 mM para os experimentos que resultam nos dados mostrados na Figura 10, o que provavelmente levou à ele- vada ICso (> 80 mM) para DGT-7 v8. Outros procedimentos foram rea- lizados para determinar se menores níveis de PEP alteravam a tole- rância relativa ao glifosato. Níveis fisiologicamente relevantes de PEP variam de 5-60 uM. Com PEP a 60 UM, o valor de ICs59 diminuiu signifi- cativamente (3,6 mM), sugerindo que a determinação inicial foi influen- ciada pelo excesso de PEP, conforme esperado a partir de uma cinéti- ca de Michaelis-Menten e observado na Tabela 2.
[00246] A Figura 10 mostra os valores de ICs55 obtidos após introdu- ção de várias mutações dentro de DGT-1 (A) e DGT-7 (B) usando PEP a 1 mM. Tanto para as curvas de ICs9 A quanto B, triângulos sólidos representam o tipo selvagem, círculos sólidos representam os mutan- tes GA, quadrados vazados representam mutantes GAPS e quadrados sólidos representam mutantes TIPS.
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Cinética de DGTs Bacterianas
[00247] A enzima DGT v6 com mutação (mutação G101A) possuía os parâmetros cinéticos globais e tolerância ao glifosato mais favorá- veis (K.a/Km E elevada ICso). A enzima era tolerante ao glifosato em concentrações > 80 mM e exibiam uma eficiência catalítica de 3 x 10º M' s*. Conforme esperado, a enzima DGT-14 v1 de tipo selvagem exibiu uma ICs, significativamente menor de 0,44 mM (em PEP a 60 UM) e uma K,, para PEP de 208,6 uM. A enzima de tipo selvagem ou nativa também exibiu uma alta eficiência catalítica (5,3 x 10º Ms”). Os dados demonstram que, embora DGT-14 v1 seja mais sensível ao glifosato quando comparado com DGT-14 v6, ela retém algum nível inato de tolerância que é maior do que aquele das enzimas nativas de plantas. Como um resultado de alteração do resíduo de glicina para alanina no aminoácido 101, a ICsg mudou de — 20,16 mM para > 80,00 mM em PEP a 1 mM e 0,44 mM para > 0,80 mM em PEP a 60 uM. Ní- veis fisiologicamente relevantes de PEP variavam de 5-60 uM. Da mesma forma, a introdução do resíduo de alanina em glicina no ami- noácido 101 resultou em um aumento da K,, para PEP de 208,6 uM para 352,5 uM. A introdução da mutação G101A resultou em aprimo- ramento da tolerância ao glifosato para DGT-14 v6.
[00248] — Adicionalmente, outras cinco enzimas bacterianas também foram avaliadas quanto à tolerância ao glifosato. Todas eram variantes com mutação de glicina para alanina, exceto DGT-11v6, a qual com- preende a sequência da proteína de tipo selvagem e possui um resí- duo de aminoácido de alanina natural. Os parâmetros cinéticos e valo- res de ICx, estão descritos na Tabela 2. As enzimas DGT-11v6, DGT- 12 v6, DGT-18 v6, DGT-29 v6 e DGT-30 v6 eram tolerantes ao glifosa- to em concentrações de 9,98 mM, 4,00 mM, 33,25 mM, 80 mM e 15,55 MM, respectivamente, em PEP a 1 mM. Os parâmetros cinéticos e a tolerância para enzimas as quais possuem o resíduo de aminoácido alanina são maiores do que as enzimas nativas ou de tipo selvagem de plantas (DGT-1v5 e DGT-7v5), as quais possuem um resíduo de aminoácido glicina. DGT-11v6, DGT-12 v6, DGT-18 v6, DGT-29 vê e DGT-30 v6 possuíam parâmetros cinéticos que indicam que as enzi- mas são tolerantes ao glifosato. Exemplo 5: Clonagem de Vetores de Transformação de Plantas Construção de Vetor Binário de Planta
[00249] “Métodos de clonagem convencionais foram usados na construção de vetores de entrada contendo uma sequência de polinu- cleotídeo do peptídeo de trânsito de cloroplasto unido ao dgt-14 como uma fusão em-quadro. Os vetores de entrada contendo um peptídeo de trânsito de cloroplasto (TraP) fundido ao dgt-14 foram montados usando a IN-FUSION'Y Advantage Technology (Clontech, Mountain View, CA). Peptídeos de trânsito TraP4 v5 (SEQ ID NO: 18), TraP5 v1 (SEQ ID NO: 19), TraP5 v2 (SEQ ID NO: 20), TraP8 v2 (SEQ ID NO: 21), TraP9 v2 (SEQ ID NO: 22), TraP12 v2 (SEQ ID NO: 23) e TraP13 v2 (SEQ ID NO: 24) foram, cada um, sintetizados pelo DNA2Z2.0 (Menlo Park, CA) e fundidos com fragmento da extremidade 5' de dgt-14 até e incluindo um sítio único de reconhecimento da endonuclease de restri- ção Accl.
[00250] — Plasmídeos binários os quais continham os vários cassetes de expressão de TraP e dgt-14 foram acionados pelo promotor de U- biquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi1O; Callis, et a/., (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493) e flanqueado pela região não traduzi- da 3' do quadro de leitura aberta vinte e três de Agrobacterium tumefa- ciens (AtuORF23 UTR 3'; Patente dos Estados Unidos Nº 5. 428.147).
[00251] Os cassetes de expressão de TraP e dgt-14 montados fo- ram manipulados usando a Tecnologia GATEWAYº (Invitrogen, Carls- bad, CA) e transformados em plantas através de transformação de plantas mediada por Agrobacterium. Endonucleases de restrição foram obtidas da New England Biolabs (NEB; Ipswich, MA) e DNA ligase T4 (Invitrogen) foi usada para ligação de DNA. Reações Gateway foram realizadas usando mistura de enzimas GATEWAY? LR CLONASEº (Invitrogen) para montagem de um vetor de entrada em um único vetor de destino o qual continha o cassete marcador selecionável promotor do vírus mosaico de mandioca (CSVMV; Verdaguer et a/., (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139) — DSM-2 (Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 2007/086813) - região não traduzida 3' do quadro de leitura aberta um de Agrobacterium tumefaciens (AWuORF1 3' UTR; Huang et al., (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-1822). Preparo de plasmídeo foi rea- lizado usando o kit NUCLEOSPINº Plasmid (Macherey-Nagel Inc., Be- thlehem, PA) ou kit Plasmid Midi Kit'y (Qiagen) seguindo as instruções dos fornecedores. Os fragmentos de DNA foram isolados usando o kit QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen) após eletroforese em gel de Tris-acetato/agarose.
[00252] Colônias de todos os plasmídeos reunidos foram inicial- mente pesquisadas através de digestão por restrição de DNA mini- prep. DNA de plasmídeo de clones selecionados foi sequenciado por um fornecedor de sequenciamento comercial (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL). Dados de sequência foram reunidos e analisados usando o software SEQUENCHERTY (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
[00253] Os construtos binários a seguir expressam as várias se- quências gênicas de fusão de TraP:dgt-14: pDAB107526 (Figura 11) contém TraP4 v5:dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 25); pDAB102787 (Figura 12) contém TraP5 v1: dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 26); pDAB105525 (Figura 13) contém TraP5 v2: dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 27); pDAB105526 (Figu- ra 14) contém TraP8 v2: dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 28); pDAB105527 (Fi- gura 15) contém TraP9 v2: dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 29); e pDAB105528 (Figura 16) contém TraP12 v2: dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 30); and,
PDAB105529 (Figura 17) contém TraP13 v2: dgt-14 v2 (SEQ ID NO: 31).
[00254] Uma pequena modificação foi feita no resíduo metionina inicial da sequência codificadora de dgt-14 quando as fusões em- quadro foram construídas. Por exemplo, a metionina foi alterada para alanina nas sequências codificadoras de dgt-14 em pDAB105529, PDABO17526, —pDAB105525, pDAB105526, pDAB105527 e PDAB105528. A metionina foi deixada inalterada em pDAB102787. As modificações foram introduzidas para facilitar a clonagem da sequên- cia codificadora de dgt-14 atrás dos peptídeos de trânsito de cloroplas- to e as listagens de sequência descritas acima contêm o resíduo de aminoácido modificado. Exemplo 6: Transformação e Seleção em Arabidopsis Transformação de Arabidopsis thaliana
[00255] —Arabidopsis foi transformada usando o método de imersão floral de Clough e Bent (1998). Uma colônia de Agrobacterium selecio- nada contendo um dos plasmídeos binários descritos acima foi usada para inocular uma ou mais pré-culturas de 100 mL de caldo YEP con- tendo espectinomicina (100 mg/L) e canamicina (50 mg/L). A cultura foi incubada durante a noite a 28 C com agitação constante a 225 rpm. As células foram peletizadas a aproximadamente 5000 x g duran- te 10 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante resultante descartado. O pélete celular foi gentilmente ressuspenso em 400 mL de meio contendo: 5% (peso/v) de sacarose, 10 mg/L de 6- benzilaminopurina e Silwet L-77 a 0,04%. Plantas de aproximadamen- te 1 mês de idade foram imersas no meio durante 5-10 minutos com agitação suave. As plantas foram deitadas de lado e cobertas com sa- cos plásticos transparentes ou opacos durante 2-3 horas e, então, co- locados na posição vertical. As plantas foram cultivadas a 22 C com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. Aproximada-
mente 4 semanas após imersão, as sementes foram coletadas. Seleção de Plantas Transformadas
[00256] Sementes T, recentemente coletadas [contendo os casse- tes de expressão de dgt-14 e DSM-2] foram deixadas secar durante 7 dias em temperatura ambiente. Sementes T, foram semeadas em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm, cada uma recebendo uma alíquota de 200 mg de sementes T, estratificadas (- 10.000 sementes) que tinham sido previamente suspensas em 40 mL de solução de aga- rose a 0,1% e armazenadas a 4 “C durante 2 dias para completar os requisitos de dormência e assegurar germinação síncrona das semen- tes.
[00257] Sunshine Mix LP5 foi coberta com vermiculita fina e subirri- gada com solução de Hoagland até umedecida, então, deixada drenar pela gravidade. Cada alíquota de sementes estratificada de 40 mL foi semeada uniformemente sobre a vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de umidade durante 4-5 dias. As cúpulas foram removi- das um dia antes de seleção inicial de transformante usando uma pul- verização de glufosinato pós-emergência (seleção do gene DSM-2 co- transformado).
[00258] Sete dias após plantio (Days After Planting - DAP) e nova- mente 11 DAP, as plantas T, (cotilédones e estágio de 2-4 folhas, res- pectivamente) foram pulverizadas com uma solução a 0,2% de herbi- cida Liberty (200 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City , MO) em um volume de pulverização de 10 ml/bandeja (703 L/ha), usando a ponta de um pulverização de ar comprimido DeVilbiss para distribuir uma taxa efetiva de 280 g ai/há de glufosinato por apli- cação. Os sobreviventes (plantas que crescem ativamente) foram i- dentificados 4-7 dias após a pulverização final e transplantados indivi- dualmente para vasos de 3 polegadas (7,6 cm) preparados com meio de envasamento (Metro Mix 360). Plantas transplantadas foram cober-
tas com cúpulas de umidade durante 3-4 dias e colocadas em uma câmara de crescimento a 22 C conforme antes ou movidas direta- mente para a estufa. As cúpulas foram posteriormente removidas e as plantas cultivadas na estufa (22 + 5 CC, UR de 50 + 30% e fotoperíodo de 14 h de luz:10 h de escuro, mínimo de 500 uE/m?s' de luz natural + suplementar). Análise de confirmação molecular foi concluída em plan- tas T, sobreviventes para confirmar que o gene de tolerância ao glifo- sato tinha sido integrado de forma estável no genoma das plantas. Confirmação Molecular
[00259] A presença dos transgenes dgt-14 e DSM-2 no genoma de plantas Arabidopsis que foram transformadas com pDAB105525, PDAB105526, PpDAB105527, PDAB105528, PDAB105529, PDAB102787 foi confirmada. A presença destas sequências de polinu- cleotídeos dentro das plantas Arabidopsis T, foi inicialmente pesquisa- da por meio de um ensaio com sondas de hidrólise, análogo ao TAQ- MANY, para confirmar a presença dos transgenes DSM-2 e dgt-14. Os eventos foram rastreados por meio de PCR do cassete de expres- são gênica para determinar se o cassete de expressão de dgt-14 tinha sido completamente integrado nos genomas das plantas sem rearran- jo. Os dados gerados a partir destes estudos foram usados para de- terminar o número de cópias do transgene e identificar eventos em A- rabidopsis selecionados para auto fertilização e avanço para a geração T2. As plantas Arabidopsis T2 que seguiram adiante também foram tes- tadas através de ensaios com sondas de hidrólise para confirmar a presença e estimar o número de cópias dos genes DSM-2 and dgt-14 no cromossoma das plantas. Em seguida, um ensaio Southern blot foi usado para confirmar o número de cópias estimado para um subcon- junto de plantas Arabidopsis T1. Finalmente, um ensaio Western blot validou que os eventos expressavam a proteína DGT-14. Ensaio com Sondas de Hidrólise
[00260] O número de cópias foi determinado nas plantas Arabidop- sis T, e T7 usando o ensaio com sondas de hidrólise descrito abaixo. Plantas com números variados de transgenes foram identificadas e avançadas para subsequentes estudos de tolerância ao glifosato.
[00261] Amostras de tecidos foram coletadas em placas com 96 cavidades e liofilizadas durante 2 dias. Maceração dos tecidos foi rea- lizada com um pulverizador tecidual KLECOY e esferas de tungstênio (Environ Metal Inc., Sweet Home, Oregon). Após maceração de tecido, o DNA genômico foi isolado em um formato de alto rendimento usando o kit Biosprint 96 Plant& (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi quantificado pelo kit por Quant-IT Pico Green DNA Assay'"“ (Molecular Probes, Invi- trogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para cerca de 2 ng/mL para o ensaio com sondas de hidrólise usando um manipulador de líquidos automático BIOROBOT3000TY (Qiagen, Ger- mantown, MD). Determinação do número de cópias do transgene pelo ensaio com sondas de hidrólise foi realizada por PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLERG480 (Roche Applied Science, Indi- anápolis, IN). Os ensaios foram concebidos para os genes DSM-2, dgt-14 e o gene de referência interna, TAFIIM5 (ID GenBank: NCO03075; Duarte et al, (201) BMC Evol Biol, 10: 61).
[00262] Para amplificação, LIGHTCYCLERG&480 Probes Master Mix (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em uma con- centração final de 1X em uma reação multiplex com volume de 10 mL contendo 0,1 mM de cada iniciador para DSM-2 e dgt-14, 0,4 mM de cada iniciador para TAFII15 e 0,2 UM de cada sonda (Tabela 3). Uma reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma exten- são a 60 CT durante 40 segundos com aquisição de fl uorescência. To- das as amostras foram executadas e os valores médios de limiar de Ciclo (Cycle threshold - Ct) foram usados para análise de cada amos-
tra. Análise dos dados de PCR em tempo real foi realizada usando o software LightCycler& release 1.5 usando o módulo de quant. relativa e com base no método de AACt. Para isso, uma amostra de DNA ge- nômico de um único calibrador de cópia e verificador de 2 cópias co- nhecido foram incluídos em cada série. Resultados do número de có- pias do rastreio por sonda de hidrólise foram determinados para plan- tas Arabidopsis transgênicas T, e T>. Tabela 3. Informações de iniciador e sonda para ensaio com sondas de hidrólise dos genes DSM-2, dgt-14 e do gene de referência interna (TAFIIS). NO: 34) ID NO: 37) 38) 39) Confirmação Integração de dgt-14 via Análise Southern Blot
[00263] Análise Southern blot foi usada para estabelecer o padrão de integração do fragmento de DNA de T-fita inserido e identificar e- ventos que continham dgt-14. Foram gerados dados para demonstrar a integração e integridade dos insertos transgênicos no genoma de Arabidopsis. Os dados de Southern blot foram usados para identificar a integração simples de uma cópia intacta do DNA de T-fita. Análise Southern blot detalhada foi realizada usando uma sonda de PCR am- plificada específica para o cassete de expressão do gene dgt-14. Hi-
bridização da sonda com o DNA genômico que tinha sido digerido com enzimas de restrição específicas identificou fragmentos de DNA ge- nômico de pesos moleculares específicos, os padrões dos quais foram usados para identificar eventos transgênicos T, de inserção simples, de comprimento total para avanço para a próxima geração.
[00264] Amostras de tecidos foram coletadas em tubos cônicos de 2 mL (Eppendorf) e liofiizadas durante 2 dias. Maceração dos tecidos foi realizada com um pulverizador tecidual KLECKO'Y e esferas de tungstênio. Após maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado usando um procedimento de isolamento CTAB. O DNA genômico foi ainda purificado usando o kit Qiagen Genomic Tips. O DNA genômico foi quantificado por meio do kit de ensaio Quant-IT Pico Green DNATY (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantifi- cado foi ajustado para 4 ug para uma concentração consistente.
[00265] Para cada amostra, 4 ug de DNA genômico foram comple- tamente digeridos com a enzima de restrição Swal (New England Bio- labs, Beverley, MA) e incubados a 25 € durante a noite, então, Nsil foi adicionada à reação e incubada a 37 ºC durante 6 horas. O DNA dige- rido foi concentrado por meio de precipitação com Quick Precipitation Solution'"y (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) de acordo com o pro- tocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi, então, ressus- penso em 25 mL de água a 65 “C durante 1 hora. As a mostras res- suspensas foram carregadas sobre um gel de agarose a 0,8% prepa- rado em 1X TAE e submetidas à eletroforese durante a noite a 1,1 Viem em 1X tampão de TAE. O gel foi sequencialmente submetido à desnaturação (NaOH a 0,2 M/NaCl a 0,6 M) durante 30 minutos e neu- tralização (Tris-HCI a 0,5 M (pH de 7,5)/NaCIl a 1,5 M) durante 30 mi- nutos.
[00266] Transferência de fragmentos de DNA para membranas de náilon foi realizada por meio de absorção passiva de 20 X solução de
SSC durante a noite através do gel sobre membranas de transferência IMMOBILONTY NY+ tratadas (Millipore, Billerica, MA) usando um pavio de papel de cromatografia e toalhas de papel. Após transferência, a membrana foi brevemente lavada com 2X SSC, cruzada com STRA- TALINKER'Y 1800 (Stratagene, La Jolla, CA) e cozida a vácuo a 80 T durante 3 horas.
[00267] As blots foram incubadas com uma solução de pré- hibridização (Perfect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora a 65 “O em garrafas rolantes de vidro usando uma incu badora de hibri- dização modelo 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). As sondas foram preparadas a partir de um fragmento de PCR contendo a se- quência codificadora completa. O fragmento amplificado por PCR foi purificado usando o kit de extração em gel QIAEX II" e marcadas com a32P-dCTP via o kit de marcação Random RT Prime IT'Y (Stra- tagene, La Jolla, CA). As blots foram hibridizadas durante a noite a 65 *C com a sonda desnaturada adicionada diretamente ao tampão de hibridização em uma contagem de cerca de 2 milhões por blot por mL. Após hibridização, as blots foram sequencialmente lavadas a 65 TO com 0,1X SSC/SDS a 0,1% durante 40 minutos. Finalmente, as blots foram expostas à telas de imagiologia de fósforo por armazenamento e fotografadas usando um sistema de imagiologia Molecular Dynamics Storm 8607“,
[00268] As análises Southern blot realizadas neste estudo foram usados para determinar o número de cópias e confirmar que os even- tos selecionados continham o transgene dgt-14 no genoma de Arabi- dopsis. Confirmação de Cassete de Expressão de Gene dgt-14 via Análise de
PCR
[00269] A presença do cassete de expressão do gene dgt-14 conti- do nos eventos de plantas T, foi detectado por uma reação de PCR de ponto final. Iniciadores (vide Tabela 4) específicos para o promotor A- tUbi10 v2 e regiões AtuORF23 3'UTR v1 cassete de expressão de ge- ne dgt-14 foram usados para detecção. Tabela 4. Iniciadores de oligonucleotídeo usados para confirmação de cassete de expressão do gene dgt-14.
CAGGATAT 3' CATGCTCC 3'
[00270] As reações de PCR requeriam um protocolo de ciclo de PCR em três etapas convencional para amplificar o cassete de ex- pressão gênica. Todas as reações de PCR foram realizadas usando as seguintes condições de PCR: 94 C durante três minutos, seguido por 35 ciclos de 94 “CC durante trinta segundos, 60 “C durante trinta segundos e 72 “C durante três minutos. As reações f oram concluídas usando o kit EX-TAQ PCR'Y (Takara Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japão) segundo as instruções do fabricante. Após o ciclo final, a rea- ção foi incubada a 72 C durante 10 minutos. Eletro forese em gel de agarose TAE foi usada para determinar o tamanho do fragmento am- plificado por PCR. Amplicons de PCR com um tamanho esperado indi- caram que um cassete de expressão gênica de comprimento completo estava presente no genoma dos eventos de Arabidopsis transgênica. Confirmação de Transcrição Relativa de dgt-14 via Análise PCR Quan- titativa de Transcrição Reversa
[00271] Amostras de tecido de plantas transgênicas para dgt-14 fo- ram coletadas em placas com 96 cavidades e congeladas a 80 O. Maceração dos tecidos foi realizada com um pulverizador tecidual KLECO'"Y e esferas de tungstênio (Environ Metal Inc., Sweet Home, Oregon). Após maceração do tecido, o RNA total foi isolado com for- mato de alto rendimento usando o kit Qiagen Rneasy 967“ 6 (Qiagen,
Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante, o qual incluía o tratamento opcional com DNAsel sobre a coluna. Esta etapa foi subsequentemente seguida por um tratamento adicional com DNAsel (Ambion, Austin, TX) do RNA total eluído. Síntese de cDNA foi realizada usando o RNA total como modelo com o kit High Capacity CcDNA Reverse Transcription'Y (Applied Biosystems, Austin, TX) se- guindo o procedimento sugerido pelo fabricante, com a adição do oli- gonucleotídeo, TVN. Quantificação de expressão foi realizada por meio de análise de sondas de hidrólise e foi realizada através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLERG&480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os ensaios foram concebidos para dgt-14 e o gene de referência interna "proteína desconhecida" (número de a- cesso GenBank: AT4G24610) usando o Software LIGHTCYCLERO Probe Design 2.0. Para amplificação, LIGHTCYCLER&480 Probes Master Mix (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) foi preparada em 1X concentração final em uma reação singleplex com volume de 10 mL contendo 0,4 mM de cada iniciador e 0,2 mM de cada sonda (Ta- bela 5).
[00272] Uma reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma extensão a 60 C durante 40 segundos com aq uisição de fluorescência. Todas as amostras foram passadas em triplicata e os valores médios de limiar de Ciclo (Ct) foram usados para análise de cada amostra. Uma reação de transcrição inversa foi realizada para cada amostra para assegurar que nenhuma contaminação por DNAg estava presente. Análise dos dados de PCR em tempo real foi realiza- da com base no método de AACt. Este ensaio foi usado para determi- nar a expressão relativa de dgt-14 em eventos de Arabidopsis trans- gênica que foram determinados como sendo hemizigóticos e homozi- góticos. Os níveis relativos de transcrição de mMRNA de dgt-14 varia- vam de 25,3 a 313,7 vezes maior do que o controle interno. Estes da-
dos indicam que plantas transgênicas para dgt-14 continham um cas- sete de expressão de gene dgt-14 funcional e as plantas eram capa- zes de transcrever o transgene dgt-14. Tabela 5. Iniciadores de PCR usados para PCR quantitativa de trans- crição inversa de dgt-14 polis, IN) polis, IN) Análise Western Blotting
[00273] DGT-14 foi detectada em amostras de folhas de plantas Arabidopsis thaliana transgênicas. Extratos de plantas de plantas transgênicas para dgt-14 e padrões de proteína DGT-14 foram incuba- dos com tampão de desnaturação de amostra de ureia a 8M a 90 C durante 5 minutos e separados por eletroforese em um gel de acrila- mida pré-moldado. As proteínas foram, então, eletrotransferidas para uma membrana de nitrocelulose usando o protocolo do fabricante. A- pós bloqueio com a WESTERNBREEZEOGO Blocking Mix (Invitrogen), a proteína DGT-14 foi detectada por antissoro anti-DGT-14 de cabra, seguido por fosfatase anticoelho. A proteína detectada foi visualizada pelo substrato quimioluminescente BCIP/NBT Western Analysis Rea- gent (KPL, Gaithersburg, MD). Produção de uma proteína DGT-14 in- tacta via Western blot indicou que as plantas transgênicas para dgt-14 as quais foram ensaiadas expressam a proteína DGT-14. Exemplo 7: Tolerância ao glifosato
[00274] Plantas Arabidopsis transgênicas T, contendo o transgene de DGT-14 foram pulverizadas com diferentes doses de glifosato. Uma distribuição de concentrações variadas de taxas de glifosato, incluindo taxas elevadas, foram aplicadas neste estudo para determinar os ní- veis relativos de resistência (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). A taxa de uso típico de 1X em campo para o glifosato é de 1.120 g ae/ha. As plantas Arabidopsis T, que foram usadas neste estudo variavam quan- to ao número de cópias para o transgene de DGT-14. As plantas Ara- bidopsis T, de baixo número de cópias de dgt-14 foram identificadas usando os ensaios de confirmação molecular descritos acima e auto- polinização e usadas para produzir plantas To. A Tabela 6 mostra a resistência para plantas transgênicas para dgt-14 quando comparado com plantas de controle que compreendem um gene de resistência ao herbicida glifosato, dgt-1 (conforme descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 12558351, aqui incorporado por re ferência na ínte- gra) e controles de tipo selvagem.
Resultados de Seleção com Glifosato de Plantas Arabidopsis Trans- formadas com dat-14
[00275] Os transformantes de Arabidopsis T, foram selecionados a partir da base de sementes não transformadas usando um esquema de seleção com glufosinato. Três quartos ou 30.000 sementes foram analisados para cada construto T,. As plantas T, selecionadas acima foram molecularmente caracterizadas e as plantas foram subsequen- temente transplantadas para vasos individuais e pulverizadas com vá- rias taxas de glifosato comercial, conforme descrito anteriormente. À resposta à dose destas plantas é apresentada em termos de lesão vi- sual % 2 semanas após tratamento (Weeks After Treatment - WAT). Os dados são apresentados em uma tabela a qual mostra plantas indi- viduais que exibem pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão grave (> 40%). Uma média aritmética e o desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transforma-
ção de Arabidopsis. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis de tipo selvagem, não transformada (cv Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato.
[00276] O nível de resposta da planta variou nas plantas Arabidop- sis T,1. Esta variação pode ser atribuída ao fato de que cada planta re- presenta um evento de transformação independente e, portanto, o número de cópias do gene de interesse varia de planta para planta. Uma média global de lesão por população pela taxa é apresentada na Tabela 6 para demonstrar a tolerância conferida por cada um dos construtos de dgt-14 ligados com um peptídeo de trânsito de cloroplas- to versus controles de dgt-14 e de tipo selvagem não transformados para taxas variadas de glifosato. Os eventos continham dgt-14 ligado com TraP8 v2 (pDAB105526), TraP9 v2 (pDAB105527), TraP12 v2 (PDAB105528) e TraP13 v2 (pDAB105529). Dados da seleção com glifosato de plantas T, demonstraram que, quando DGT-14 foi ligada com estes peptídeos de trânsito de cloroplasto, tolerância robusta a altos níveis de glifosato foi conferida. Comparativamente, dgt-14 ligado com TraP4 v5 (pDAB107526), TraP5 v2 (pDAB105525) e TraP5 v1 (PDAB102787) não confere tolerância ao tratamento em altas concen- trações de glifosato, mas estes construtos foram mais tolerantes do que controles não transformados (ou de tipo selvagem) que foram tra- tados com as mesmas taxas de glifosato. Além disso, houve casos quando eventos que foram mostrados como contendo três ou mais có- pias de dgt-14 eram mais suscetíveis à altas taxas de glifosato. Estes casos são demonstrados dentro da faixa de percentagem de lesão vi- sual mostrada na Tabela 6. É provável que a presença de um número elevado de cópias dos transgenes dentro das plantas Arabidopsis re- sulte em silenciamento do transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultou em sensibilidade ao glifosato, apesar da presença do transgene dgt-14. Tabela 6. Resposta de Arabidopsis T, transformadas com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência comparado com uma população segregante dgt-1 (T2) e um controle não transfor- mado.
Lesão % visual a 2 semanas após aplicação. (PDAB107526) (Nº de Réplicas)
| tes Om creio oo
40% padrão | (%) [ogasmadegífísso | a [o [o (00 oo] [fos gaemade gifosato | 0 | o | 4 [ess] 43 [500] | 20 gaemadeaífesato | 0 | o | a foro] 71 [sseo [1680 gaema de gifosato| 0 | o | 4 [o6s| 17 [esses [3360 gama de gfosato| 0 | o | a | 958] 15 [95296]
(PDAB102787) (Nº de réplicas)
40% padrão | (%) | 0gaehadeglifosato | 6 | o | o |oo| oo) o) | os gaemade glfosato | 0 | o | 6 640] 130 [500] Pommeteaten | e 19 e SECO DS
100
[1600 gasmadegífosao| o | o | 6 [1000] oo | 100]
(PDAB105525) (Nº de Réplicas) metem ma raia Po 40% padrão | (%) [ogsemadegífóssio | 5 | o o o oo o] [105 g asma de gifosato | 0 | o | 5 [eso] 27 [506] Comemenatens 1 ECA DS, 100 aeee 3 1 SE 100 Omacem eat 9 [9 | e 182 DS 100 TraP8 v2::dgt-14 (DDAB 105526) (Nº de Réplicas) a a E a a PA ES 40% padrão | (%) [ogsemadegíasão | a [o o 00] oo o] [Tos gasMade gífosato | 0 | 2 | 2 [200] 147 [20-50] [1209 aeMadegífosato | 3 | o | 1 [238] 315 [o7o] [1680 g aefma de glfosato] 0 | 1 | 3 [663] 264 [2585] [8360 g aefma de glfosato] 3 | o | 1 [265/4265 [020] (PDAB105527) (Nº de Réplicas) metem ma er retal Po 40% padrão | (%) [ogsemadegífóssio | a | o o o oo o] [305 gaeíma de gifosato | 2 | 1 | 1 [280] 257 [0so] [H20 gasmade gifesato | 2 | o | 2 [375] s7r7 [oro] [1600 gasmade gifosato| 2 | 0 | 2 [288] 390 [1535] [3360 g aema de lfosato] 1 | o | 3 | 638] 02 [505]
TraP12 v2::dgt-14 Faixa % de lesão | Análise % de lesão | ted Sl, Oia Po | 40% padrão | (%) [ogastadegíasão | 5 [o [o ooo o] [fios gasMade gifosato | 5 | 0 | o | 6o| ss [oxs [420 gasMadegifosato | 4 | 1 | o |110| 55 [520] [5360 g aema de gifosato] 2 | 3 | o [190] a2 [1525] (PDAB105529) (Nº de Réplicas) | ted Selo, Oia Po | 40% padrão | (%) [ogasmadegíasão | a [o [o ow oo o] [ios gaemadegifosato | 2 | o | 2 [345] 324 [56] [4209 aema de gifosato | 2 | 1 | 1 [213] 272 [0-0] [1600 gasíha de gífosato| 3 | o | 1 [270] 356 [50] [8500 g aeía de gifosato] 3 | 1 [ o [528][s15 [150] (Nº de Réplicas) | ted Sl, Oia So | 40% padrão | (%) | ogaemadegifosato | 4 | o | o | 00| oo) o | [705 9 aeíma de gifosato | o | 3 | 1 [200[ 141 [30-00] [1209 aema de gifosato | 0 | a | o [300[ 00 | o] teme state 9 13 | Se SE 100 [SssOgasTade gas | 0 [ o [a [575/67 [255]
Controle não transforma- do (Nº de Réplicas) 40% padrão | xa(%) | ogaemadegífosato | 4 [o | o [00/00] o) [105 gaemade gifosato | 0 | o | 4 [1000] oo | 100] [420 g asma de gifosato | 0 | o | 4 [1000] 0.0 | 100] [1680 gaemade gifosato| 0 | o | 4 [1000] oo [100] [3360 gaemade gifosato| 0 | o | 4 [1000] 0.0 [100]
[00277] Plantas Arabidopsis T, selecionadas as quais foram identifi- cadas como contendo baixos números de cópias de insertos do trans- gene (1-3 cópias) foram auto fertilizadas para produzir uma segunda geração para avaliação adicional de tolerância ao glifosato. As plantas Arabidopsis de segunda geração (T2) que continham 1-3 cópias do transgene dgt-14 foram ainda caracterizadas quanto à tolerância ao glifosato e tolerância ao glufosinato (resistência ao glufosinato indicou que o cassete de expressão PAT estava intacto e não foi submetido a rearranjos durante autopolinização das plantas T,). Na geração T,, plantas hemizigóticas e homozigóticas estavam disponíveis para tes- tagem para cada evento e, portanto, foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigóticas contêm dois alelos diferentes em um locus quando comparado com plantas homozigóticas que con- têm os mesmos dois alelos em um /ocus. O número de cópias e os níveis de ploidia de plantas T7, foram confirmados usando os protoco- los de análise molecular previamente descritos. Da mesma forma, gli- fosato foi aplicado usando os métodos e as taxas conforme descrito anteriormente. A resposta à dose das plantas é apresentada em ter- mos de lesão visual % a 2 semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos que exibem pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão grave (> 40%). Uma média aritmética e o desvio padrão são apresen-
tados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis de tipo selvagem, não trans- formada (cv. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato. Além disso, plantas que compreendem um gene de resistência ao her- bicida glifosato, dgt-1 (conforme descrito no Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº 12558351, aqui incorporado por re ferência na ínte- gra), foram incluídas como um controle positivo.
[00278] Na geração T,2, tanto eventos dgt-14 de uma única cópia única quanto de baixo número de cópias (duas ou três cópias) foram caracterizados quanto à tolerância ao glifosato. Uma média global de lesão por população pela taxa é apresentada na Tabela 7 para de- monstrar a tolerância conferida por cada um dos construtos de dgt-14 ligados com um peptídeo de trânsito de cloroplasto versus controles de tipo selvagem não transformados dgt-1 e taxas variadas de glifosato. Os eventos da geração T, continham dgt-14 ligado com TraP8 v2 (PDAB105526), TraP9 v2 (pDAB105527), TraP12 v2 (pDAB105528) e TraP13 v2 (pDAB105529). Todos esses eventos são altamente resis- tentes ao glifosato. Os resultados indicaram que a faixa de lesões para plantas Arabidopsis T7 era menos de 20% para todas as concentra- ções de glifosato que foram testadas. Eventos em Arabidopsis T2 con- tendo dgt-14 ligado com TraP4 v5 (pDAB107526), TraP5 v2 (PDAB105525) e TraP5 v1 (pDAB102787) não conferem tolerância ro- busta ao glifosato quando comparado com os outros construtos de dgt- 14 que continham outros peptídeos de trânsito TraP. No entanto, os construtos de dgt-14 ligado com TraP4 v5 (pDAB107526), TraP5 v2 (PDAB105525) e TraP5 v1 (pDAB102787) conferem um baixo nível de tolerância ao glifosato, o qual era significativamente maior comparado com o controle não transformado. Em geral, os resultados mostraram que plantas que contêm e expressam DGT-14 proporcionaram resis-
tência ao glifosato de nível comercial em níveis de até 3 vezes a taxa no campo (1.120 g ae/ha).
Tabela 7. Resposta de Arabidopsis T2 transformada com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência comparado com uma população segregante dgt-1 (T2) e um controle não transformado. Lesão visual % 2 semanas após aplicação. Os dados representam uma linhagem com uma única cópia selecionada de cada construto que é segregado como um único locus no rastreio de hereditariedade. TraP4 v5::dgt-14 (DDAB 107526) (Nº de réplicas) | e tema lo EIS co 40% padrão| (%) | ogaemadegífosato | a | o | o [00] ooo] [120 gasmade gífosato | 0 | o | 4 [sso] oo | ss] [Bro gaemade gífosato | 0 | o | 4 [875] as [asso] [1680 gaemadegifosato| 0 | o | 4 | 925] as [soss [3360 gama de gifosato| o | o | 4 [eso] co] es] (PDAB102787) de réplicas) 40% padrão | (%) [ogaemadegífosao | a | o | o [00 oo [o] [120gaemadegífosato | 0 | o | 4 [s00| oo [eo [8ogasmadegífosato | 0 | o | 4 [s00| oo [so [1680 gasmade gifosato| 0 | 0 | 4 [888] 25 /550 [3360 gashadegifosato| 0 | o | 4 [945] 33 posa
TraP5 v2::dgt-14 (pDDAB 105525) de réplicas)
40% padrão | (%) [ogasmadegísão | a [o [o ow oo o] [s20gasmade gifosato | 0 | o | 4 [663] 25 fm [840 gasmadegífosato | 0 | o | 4 [900] 41 poses amena tt SEE OL
100 een tt e S 100 TraP8 v2::dgt-14 (pDAB 105526) (Nº de réplicas) | mA o Gs | paso | co |
40% padrão | (%) | 0gasnade glifosato | 4 | o | o [oo| oo | o | [s20gasmadegífosato | 4 | o | o (os| 10 [oz] [Brogaemadegífosato | 4 | o | o [00] oo | o [eso gasta de gifosato 4 | o [ o [25/ 29 [os] [3360 gema de gifesato| 4 | 0 | o [50] 28 [om]
105527) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) | 0gaemadeglifosato | 4 | o | o 0o| oo | o | | 420 g ae/ha de glifosato | 4 | o | o /00| oo | o | | 840 g ae/ha de glifosato | 4 | o | o /00| oo | o | [eso gaeMadegifosato| 4 | o | o [18[ 24 [05] [3960 gaemadegifosato| 2 | 2 | o [175] 176 [os]
(PDAB105528) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) ogasmadegífosato | 4 | o | o joo| oo | o [a gaemadegífósais | 4 | o | o [r1af 24 (os) [Bogaemadegífosato | 4 | o | o [25/29 | os) [1680 gaemadegífosato| 4 | o | o [20/20 | os) [3960 gaemadegifosato| 4 | o | o [sa] 28 joto]
(PDAB105529) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) | ogasmadegífosão | a [ o [o o] o (o) [F20 gasmade gfosato | 4 | 0 | o [of o [o [Bs0gaemadegífosato | 4 | o | o [13/25 | os) [1600 gaemadegltosato| 4 | o | o [18] 24 [os] [3360 gama de gífosto| 4 | o | o [38] 48 [oro]
de réplicas)
40% dia | padrão | (%) [ogastadegíosso | 3 | o | o [00] oo [o] [120 gaemadegifosato | 2 | o | 2 [d00] s04 | 575] [Bsogasmadegífosato | o | 2 | 2 [475] 318 [2075] [TosogaeMadegífosato | 0 | 2 | 2 [413] 239 [2070] [3860 gaeMadegífosato | 0 | 4 | o [350] 00 | 36
Controle não transformado de réplicas) 40% dia | padrão | (%) | ogasmadegíásio | 4 | o | o [00 oo | o] | s20 gasmhadegíftosato | o | o | a ros oo | too] | Bro gashadegifosato | o | o | a /r1onol 00 | 100] | 1680 gasmadegífosato | 0 | o | a jr1ono oo | oo] [ 3360 gaemadegítosato | o | o | 4 [1000] o0 | 100]
[00279] Plantas Arabidopsis T, aleatoriamente selecionadas as quais foram identificadas como contendo baixos números de cópias de insertos do transgene (1-3 cópias) foram auto fertilizadas para produzir uma terceira geração para avaliação adicional de tolerância ao glifosa- to. Sementes de Arabidopsis da terceira geração (T3) foram plantadas e avaliadas quanto à tolerância ao glifosato usando os mesmos proto- colos conforme descrito anteriormente. Os eventos testados na gera- ção T; continham réplicas de cada linhagem que eram homozigóticas (conforme determinado usando uma triagem de resistência ao glufosi- nato para determinar se qualquer uma das plantas avançadas mostra- va segregação dos transgenes). Estes eventos foram analisados via LC-MS-MS para confirmar que se plantas expressavam a proteína DGT-14. Os resultados da geração T3 para a média global de lesão por população pela taxa de glifosato são apresentados na Tabela 8, a qual mostra a tolerância ao glifosato apresentada por cada um dos construtos de dgt-14 para taxas variadas de glifosato. Eventos T; re- sistentes exemplificativos compreendiam dgt-14 ligado com TraP8 v2 (PDAB105526), TraP9 v2 (pDAB105527), TraP12 v2 (pDAB105528) e TraP13 v2 (pDAB105529). Todos esses eventos são altamente resis- tentes ao glifosato. Os resultados indicaram que a faixa de lesões para as plantas Arabidopsis T; era menos do que 20% para todas as con- centrações de glifosato que foram testadas. Eventos em Arabidopsis
T3 contendo dgt-14 ligado com TraP5 v2 (pDAB105525) e TraP5 v1 (PDAB102787) não conferem tolerância robusta ao glifosato quando comparado com os outros construtos de dgt-14 que continham diferen- tes peptídeos de trânsito TraP. No entanto, os construtos de dgt-14 ligado com TraP5 v2 (pDAB105525) e TraP5 v1 (pDAB102787) confe- rem um baixo nível de tolerância ao glifosato, o qual era significativa- mente maior comparado com o controle não transformado. Em geral, os resultados mostraram que plantas que contêm e expressam DGT- 14 conferiam um nível de resistência ao glifosato comercial em níveis de até 3 vezes a taxa no campo (1.120 g ae/ha).
Tabela 8. Resposta de Arabidopsis T;3 transformada com dgt-14 para uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós-emergência comparado com uma população segregante dgt-1 (T2) e um controle não transfor- mado. Lesão visual % 2 semanas após aplicação. Os dados represen- tam uma população com única cópia selecionada de cada construto que era segregado como um único locus na triagem de hereditarieda- de T>.
(PDAB102787) de réplicas) 40% dia | padrão | (%) [ogasmadegíosato | 4 | o | o [00 oo | o] [a20gasmadegífosato | 0 | o | 4 [eso] 41 jaoso] [Bsogasmadegífosato | 0 | o | 4 [863] 25 jaseo| eme atens 9 est US 100 Poema E O e et DS 100
(PDAB105525) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) [ogasmadegífásato | 4 | o [o [oof oo [o] [120 gasMadegifosato | 0 | 0 | 4 [oa] 39 [soss] oem tes [9 E SS)
100 [Tesogaemadegífasaio | o | o | a [eso] 25 [sos] [3360 gaeíma de gifosato | o | o | 4 [otri 24 [soes]
(PDAB105526) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) [ogasmadegíásso | 4 | o | o [oo oo | o [20 gasMhadegífesato | 4 | o | o [00] 00 | o] [840 gaemadeglfosato | 4 | o | o |13/ 25 [os] [16so gama de gifosao | 4 | o | o fool oo [o] [3360 gaema de glfosato| 4 | o | o [40] so [210]
105527) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) | ogaemadegífesato | 4 | o | o [00] oo | o] [20 gasmadegífosato | 4 | o | o [00] 00 | o | [ogasmadegífosato | 4 | o | o [00] oo | o | [T6so gas de gifosato | 4 | o | o fool 00 [o] [3360 gaehadegifosato| 4 | o | o [43] 15 | 25]
TraP12 v2::dgt-14 (DDAB 105528) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) ogasmadeníásas | a | o [o fo0f oo o [120 gaemadegífosato | 4 | o | o [oo 00 | o [sogaemadegífosato | 4 | o | o [oo 00 | o [eso gaemadegífosaio| 4 | 0 | o [25] 50 [om] 360 gaemadegífosao| 4 | o [| o [28] 21 [27]
(PDAB105529) de réplicas)
40% dia | padrão | (%) | 0gaemadeglifosato | 4 | o | o j0o| oo | o | | 420 g ae/ha de glifosato | 4 | o | o [0o| oo | o | | 840 g ae/ha de glifosato | 4 | o | o /0o| oo | o | | 1680 g ae/ha de glifosato | 4 | o | o /0o| oo | o | [3360 gacmadegifosato| 4 | o | o [18] 24 [os]
de réplicas)
40% dia | padrão | (%) [ogasmadegíasão | 1 | o | o [00] oo [o] [a20gasmadegifosato | 0 | 2 | 2 [s25] s6 [3050] [Bro gasmadeaífosato | 0 | 4 | o [s00/ 00 | ao [1680 9 ae/ha de glfosato| o | 3 | 1 [475] 150 [2070] Poema O [ET DS
100
Controle não transforma- do de réplicas) Na a PA A a A 40% padrão | (%) ogasmhadegífosaio | a | o | o [00/00 [o] [a20gasMade gifosato | 0 | o | 4 [1000] oo [100] [840 g asma de glfosato | 0 | o | 4 [1000] oo | oo] [1680 gasíha de gifosato | 0 | 0 | 4 [1000] oo [100] [3360 gaeíha de glfosato| 0 | o | 4 |1000] 0.0 |10o] dgt-14 como Marcador de Seleção
[00280] O uso de dgt-14 como um marcador selecionável para a- gente de seleção de glifosato é testado com as plantas Arabidopsis transformadas descritas acima. Cerca de 50 sementes de Arabidopsis de geração T, (homozigótica para dgt-14) são enriquecidas em apro- ximadamente 5.000 sementes de tipo selvagem (sensível ao glifosato). As sementes são germinadas e as plântulas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato. Vários tratamentos de glifosato são comparados; cada bandeja de plantas recebe uma ou dois ciclos de aplicação de glifosato em um dos seguintes esquemas de tratamento: 7 dias após plantio (Days After Planting - DAP), 11 DAP ou 7 seguido de 11 DAP. Uma vez que todas as plantas também contêm um gene de resistência ao glufosinato no mesmo vetor de transformação, plan- tas contendo dgt-14 selecionadas com glifosato podem ser diretamen- te comparadas com contendo plantas de controle contendo DSM-2 ou pat selecionadas com glufosinato.
[00281] Tratamentos com glifosato são aplicados com a ponta de um pulverizador DeVilbiss conforme descrito anteriormente. As plantas transgênicas contendo dgt-14 são identificadas como "resistentes" ou "sensíveis" 17 DAP. Tratamentos de 26,25-1680 g ae/ha de glifosato aplicado 7 e 11 dias após o plantio (Days After Planting - DAP) mos- tram seleção eficaz para plantas Arabidopsis transgênicas que contêm dgt-14. Plantas sensíveis e resistentes são contadas e o número de plantas tolerantes ao glifosato é correlacionado com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-14 as quais são plantadas. Estes resultados indicam que dgt-14 pode ser efetivamente usado como um marcador seletivo alternativo para uma população de Arabidopsis transformada.
Hereditariedade de dgat-14
[00282] Eventos de Arabidopsis T, transgênica confirmados foram autopolinizados para produzir sementes T7. Estas sementes tiveram a prole testada aplicando herbicida Ignite"" contendo glufosinato (200 g ae/ha) a 100 irmão T, aleatórios. Cada planta T> individual foi trans- plantada para vasos quadrados de 7,5 cm antes de pulverizar a apli- cação (pulverizador de trilho em uma taxa de aplicação de 187 L/ha). As famílias T, (plantas T.) segregadas no modelo 3 Resistente: 1 Sen- sível antecipado para um único /ocus dominantemente herdado heredi- tariedade Mendeliana, conforme determinado por análise de qui- quadrado (P> 0,05). A percentagem de famílias T, que segregavam com a hereditariedade Mendeliana esperada são ilustradas na Tabela 9 e demonstram que o traço dgt-14 é passado através de hereditarie- dade Mendeliana para a geração T7. Sementes foram coletadas de 5 a indivíduos T, (sementes T3). A prole de vinte e cinco irmãos T; de cada uma das 3-4 famílias T, aleatoriamente selecionadas foi testada, conforme descrito anteriormente. Os dados não mostraram segrega- ção e, assim, demonstram que dgt-14 é estavelmente integrado no cromossoma e herdado de uma forma Mendeliana por pelo menos três gerações.
Tabela 9. Percentual de famílias T, (plantas T.) segregantes como uma hereditariedade Mendeliana única para um teste de prole de 100 plantas.
Segregantes em 1 Locus (%) Exemplo 8: Transformação de Outras Espécies de Culturas
[00283] Soja pode ser transformada com genes dgt-14, dgt-11, dagt- 12, dgt-18, dgt-29 ou dgt-30 para conferir altos níveis de resistência ao herbicida glifosato usando as mesmas técnicas descritas anteriormen- te no Exemplo ft11 ou Exemplo ft13 do documento WO 2007/053482.
[00284] Algodão pode ser transformado com genes dgt-14, dgt-11, dgt-12, dgt-18, dgt-29 ou dgt-30 para conferir altos níveis de resistên- cia ao herbicida glifosato usando as mesmas técnicas descritas anteri- ormente no Exemplo f14 do Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº7.838.733 ou Exemplo tt12 do documento WO 2007/05 3482 (Wright etal.).
[00285] Canola pode ser transformada com genes dgt-14, dgt-11, dgt-12, dgt-18, dgt-29 ou dgt-30 para conferir altos níveis de resistên- cia ao herbicida glifosato usando as mesmas técnicas descritas anteri- ormente no Exemplo *%26 do Pedido de Patente dos Estados Unidos Nº7.838.733 ou Exemplo tt22 do documento WO 2007/05 3482 (Wright etal.). Exemplo 9: Transformação Outras Culturas Mediada por Agrobacteri-
um
[00286] À luzda presente descrição, culturas adicionais podem ser transformadas de acordo com modalidades da presente descrição u- sando métodos que são conhecidos na técnica. Para transformação mediada por Agrobacterium de centeio vide, por exemplo, Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye", Transgenic Res. Outubro de 2003; 12(5): 587-96). Para transformação mediada por Agrobacterium de sorgo vide, por exemplo, Zhao et al., "Agrobacterium-mediated sor- ghum transformation", Plant Mol Biol. Dezembro de 2000; 44(6): 789-
98. Para transformação mediada por Agrobacterium de cevada vide, por exemplo, Tingay et a/l., "Agrobacterium tumefaciens-mediated bar- ley transformation", The Plant Journal, (1997) 11: 1369-1376. Para transformação mediada por Agrobacterium de trigo vide, por exemplo, Cheng et al., "Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobac- terium tumefaciens", Plant Physiol. Novembro de 1997; 115(3): 971-
980. Para transformação mediada por Agrobacterium de arroz vide, por exemplo, Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobac- terium tumefaciens", Plant Mol. Biol. Setembro de 1997; 35(1-2): 205-
18.
[00287] Os nomes em latim para estas e outras plantas são forneci- dos abaixo. Será evidente que outras técnicas de transformação (que não Agrobacterium) podem ser usadas para transformar dgt-14, por exemplo, nestas e outras plantas. Exemplos incluem, porém sem limi- tações: Milho (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), Cevada (Hordeum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Beterraba Doce e Sacarínica (Beta spp.), Cana-de-açúcar (Arenga pinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum e outras espécies, Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras espécies e Cyphomandra betacea), Batata (Solanum tubero- sum), Batata Doce (Ipomoea batatas), Centeio (Secale spp.), Pimentas (Capsicum annuum, chinense e frutescens), Alface (Lactuca sativa, perennis e pulchella), Couve (Brassica spp.), Aipo (Apium graveolens), Berinjela (Solanum melongena), Amendoim (Arachis hypogea), Sorgo (Sorghum spp.), Alfafa (Medicago sativa), Cenoura (Daucus carota), Feijões (Phaseolus spp. E outros gêneros), Aveias (Avena sativa e s- trigosa), Ervilhas (Pisum, Vigna e Tetragonolobus spp.), Girassol (He- lianthus annuus), Abóbora (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa). Tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Turfa (Lo- lium, Agrostis, Poa, Cynodon e outros gêneros), Trevo (Trifolium), Ervi- lhaca (Vicia). Transformação de tais plantas com genes dgt-14, dgt-11, dgt-12, dgt-18, dgt-29 e dgt-30, por exemplo, é considerada em moda- lidades da presente descrição.
[00288] Genes Dgt-14, dgt-11, dgt-12, dgt-18, dgt-29, and dgt-30 têm o potencial de aumentar a aplicabilidade dos principais herbicidas de glifosato para uso na estação em muitos sistemas de cultivo de madeira decídua e perene. Espécies de madeiras resistentes ao herbi- cida glifosato aumentariam a flexibilidade de uso superior desses her- bicidas, sem problemas de lesões. Estas espécies incluem, porém sem limitações: amieiro (Alnus spp.), cinzas (Fraxinus spp.), pinheiros e espécies de álamo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Betula Spp.), cerejeira (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira (Carya spp.), bordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.) e pinheiros (Pinus spp.).
[00289] Uso de resistência a herbicidas de glifosato para o controle seletivo de ervas daninhas em espécies ornamentais e frutíferas tam- bém está dentro do âmbito das modalidades da presente descrição. Exemplos incluem, porém sem limitações: rosa (Rosa spp.), arbustos (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begonia spp.), ro-
dodendro (Rhododendron spp.), maçã verde ou maça comum (Malus SPpp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp.) e mal-me-quer (Tage- tes Spp.). Exemplo 10: Transformação de Milho Construtos de DNA para Transformação de Milho
[00290] “Métodos de clonagem convencionais, conforme descrito acima, são usados na construção de vetores binários para uso em transformação de milho mediada por Agrobacterium tumefaciens. Os seguintes elementos gênicos são usados em vetores os quais contêm dgt-14; o promotor de Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbi1, Patente dos Estados Unidos Nº 5.510.474) é usado para conduzir a sequência co- dificadora de dgt-14, a qual é flanqueada por uma região 3' não tradu- zida de Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR; Patente dos Estados Uni- dos Nº 7.179.902), o cassete marcador selecionável consiste no pro- motor de Ubiquitina 1 de Zea mays que é usado para conduzir a se- quência codificadora de aad-1 (Patente dos Estados Unidos Nº
7.838.733), a qual é flanqueada por uma região 3' não traduzida de Lipase de Zea mays. A sequência codificadora de aad-1 confere tole- rância a herbicidas de fenóxi auxina, tais como herbicidas de ácido 2 4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e ariloxifenoxipropionatos (AOPP). Os construtos de dgt-14 são construídos como vetores binários padrões e vetores de sistema superbinário de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tóquio, JP). Esterilização de Espiga e Isolamento de Embrião
[00291] Para obter embriões imaturos de milho, plantas Zea mays da linhagem endógama B104 são cultivadas em uma estufa e são auto polinizadas ou polinizadas por irmãos para produzir espigas. As espi- gas são colhidas cerca de 9-12 dias após polinização. No dia experi- mental, as superfícies das espigas são esterilizadas por meio de imer- são em uma solução de hipoclorito de sódio a 20% (5%) e agitada du-
rante 20-30 minutos, seguido por três lavagens em água esterilizada. Após esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5-2,4 mm) foram dissecados assepticamente de cada ouvido e aleatoriamente distribuí- dos em tubos de microcentrifugação contendo meio líquido de infecção (Meio Basal LS, 4,43 g/L; Solução de Vitamina N6 [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; sacarose, 68,5 g/L; D(+) glicose, 36,0 g/L; 10 mg/ml de 2,4-D, 150 mL/L). Para um dado conjunto de experimentos, embriões obtidos a partir de três espigas são usados para cada trans- formação. Início de Cultura com Agrobacterium
[00292] Estoques em glicerol de Agrobacterium contendo os veto- res de transformação binários descritos acima são riscados sobre pla- cas com meio mínimo AB contendo os antibióticos adequados e são cultivados a 20 ºC durante 3-4 dias. Uma única colônia é escolhida e cultivada sobre placas YEP contendo os mesmos antibióticos e incu- bada a 28 ºC durante 1-2 dias. Cultura de Agrobacterium e Cocultivo
[00293] Colônias de Agrobacterium são tiradas da placa de YEP, suspensas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL e a densidade celular é ajustada para ODsoo nm de 0,2-0,4 u- sando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium são colo- cadas em um agitador rotativo a 125 rpm, temperatura ambiente, en- quanto dissecação de embriões é realizada. Embriões zigóticos imatu- ros entre 1,5-2,4 mm de tamanho são isolados de grãos de milho este- rilizados e colocados em 1 mL de meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) é adicionada a cada tubo e os tubos são colocados em uma plataforma de agitação durante 10-15 minutos. Os embriões são transferidos para meio de cocultivo (sais MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Mio-inositol, 100,0 mg/L; hidrolisato enzimático de caseína, 100,0 mg/L; Dicamba-
KOH a 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; GelzanTY, 3,00 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml de AgNo;z, 15,0 mg/L; DMSO, 100 UM), orientados com o escutelo voltado para cima e incubados a 25 *C sob luz de 24 horas em uma intens idade da luz de 50 umole m? seg”, durante 3 dias.
Seleção de Caule e Regeneração de Eventos Putativos
[00294] Após o período de cocultura, os embriões são transferidos para meios de repouso (Sais MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; 1,2,3,5/4,6- Hexa-hidroxiciclo-hexano, 100 mg/L; MES [ácido (2-(n- morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisato enzi- mático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH a 30 mM, 3,3 mg/L; Sa- carose, 30,0 gm/L; Gelzan 2,30 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 mI/L; 8,5 mg/ml de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubados sob luz de 24 horas em uma intensidade de luz de 50 umole m'? seg” e a 25 “C durante 3 dias. Experimentos de resposta à dosagem de inibição de crescimento su- geriram que concentrações de glifosato de 0,25 mM e maiores são su- ficientes para inibir o crescimento celular na linhagem de milho B104 não transformada. Os embriões são transferidos para meio de Seleção 1 contendo glifosato a 0,5 mM (Sais MS, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Mio-inositol , 100,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)- etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L ; Hidrolisato enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH a 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; GelzanTY 2,30 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 8,5 mg/ml de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e in- cubados no escuro e/ou sob luz de 24 horas em uma intensidade de luz de 50 umole m? seg durante 7-14 dias a 28ºC. Caules embriogê- nicos em proliferação são transferidos para meio de Seleção 2 conten- do glifosato a 1,0 mM ( Sais MS, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexa- hidroxiciclo-hexano, 100 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [ácido (2-
(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L ; Hidrolisato en- zimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH a 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan'y 2,30 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 mI/L; 8,5 mg/ml de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L; R-Haloxyfop ácido 0,1810 mg/L) e são incubados no escu- ro e/ou sob luz de 24 horas em uma intensidade de luz de 50 umole m* ? seg durante 14 dias a 28ºC.
Essa etapa de seleção permitiu que os caules transgênicos proliferassem e diferenciassem ainda mais.
O pe- ríodo de seleção de caule dura três a quatro semanas.
Caules embrio- gênicos em proliferação são transferidos para meio PreReg contendo glifosato a 0,5 mM ( Sais MS, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexa-hidroxiciclo- hexano, 100 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [ácido (2-(n-morfolino)- etanossulfônico), ácido livre] 0,250 gm/L; Hidrolisato enzimático de ca- seína 50,0 mg/L; NAA-NaOH 0,500 mg/L; ABA-EtOH 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; Sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan'"Y 2,50 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 mIl/L; 8,5 mg/ml de AgNo3, 1,00 mg/L; Car- benicilina, 250,0 mg/L) e cultivados sob luz de 24 horas em uma inten- sidade de luz de 50 umole m? seg” durante 7 dias a 28ºC.
Caules embriogênicos com rebentos de tipo broto são transferidos para meio de Regeneração contendo glifosato a 0,5 mM ( Sais MS, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4 ,6-Hexa-hidroxiciclo-hexano, 100,0 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434'Y 3,00 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 mI/L; Carbenicilina, 125,0 mg/L) e cultivados sob luz de 24 horas em uma intensidade de luz de 50 umole m? seg'* durante 7 dias.
Pequenos brotos com raízes primárias são transferidos para meio de enraizamento ( Sais MS, 4,33 gm/L; Vitamina-MS Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 1,2,3,5/4,6-Hexa-hidroxiciclo-hexano, 100 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G4347Y 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) em fitobandejas e são incubados sob um fotoperíodo de 16/8 horas de luz/escuro em uma intensidade de luz de 140-190 umole m? seg” durante 7 dias a 27ºC. Plântulas transgênicas putativas são analisadas quanto ao número de cópias do transgene usando os pro- tocolos descritos acima e transferidas para o solo.
Confirmação Molecular da Presença dos Transgenes dgt-14 e aad-1 Dentro das Plantas de Milho
[00295] A presença das sequências de polinucleotídeo de dgt-14 e aad-1 são confirmadas através de ensaios com sondas de hidrólise. Plantas de milho T, isoladas são inicialmente rastreadas por meio de um ensaio com sondas de hidrólise, análogo ao TAQMAN'Y, para con- firmar a presença de transgenes dgt-14 e aad-1. Os dados gerados a partir destes estudos são usados para determinar o número de cópias do transgene e usados para selecionar eventos de milho transgênico para retrocruzamento e avanço para a geração T,.
[00296] As amostras de tecido são coletadas em placas com 96 ca- vidades, maceração de tecidos é realizada com um pulverizador teci- dual KLECO'Y e esferas de aço inoxidável (Hoover Precision Pro- ducts, Cumming, GA), em Tampão Qiagen'Y RLT. Após maceração dos tecidos, o DNA genômico é isolado em um formato de alto rendi- mento usando o kit Biosprint 96“ Plant (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico é quantificado usando o kit Quant-IT Pico Green DNA Assay'" (Molecu- lar Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado é ajustado para cerca de 2 ng/ul para o ensaio com sondas de hidrólise usando um manipulador de líquidos BIOROBOT30007Y automatizado (Qiagen, Germantown, MD). Determinação do número de cópias do transgene pelo ensaio com sondas de hidrólise, análogo ao ensaio TAQMAN?, é realizada por PCR em tempo real usando o sistema LI- GHTCYCLERº480 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN). Os en- saios são concebidos para aad-1 e dgt-14 e um gene de referência interna Invertase (Nº Genbank: U16123.1) usando o Software LI-
GHTCYCLERº Probe Design 2.0. Para amplificação, LIGHTCY- CLERº480 Probes Master Mix (Roche Applied Science, Indianápolis, IN) é preparada em uma concentração final de 1X em uma reação multiplex com volume de 10 mL contendo 0,4 mM de cada iniciador para dgt-14 e aad-1 e 0,2 uM de cada sonda. Uma reação de amplifi- cação em duas etapas é realizada com uma extensão a 60 C durante 40 segundos, com aquisição de fluorescência. Todas as amostras são passadas e os valores médios de limiar de Ciclo (Ct) são usados para análise de cada amostra. Análise de dados por PCR em tempo real é realizada usando o software LightCyclerº Release 1.5 usando o módu- lo de quant. relativa e baseia-se no método de AACt. Controles incluí- am uma amostra de DNA genômico de um único calibrador de cópia e duas verificações de cópias conhecidas que estão incluídas em cada série. Tolerância a Herbicidas Pós-emergência em Milho T, Transformado com dgat-14
[00297] Eventos To, são deixados se habituar na estufa e são culti- vados até que duas a quatro novas folhas de aparência normal tenham emergido da espira (isto é, plantas que sofreram transição de cultura tecidual para as condições de crescimento na estufa). As plantas são cultivadas a 27 C sob condições de 16 horas de luz :8 horas de escuro na estufa. As plantas são, então, tratadas com formulações comerciais de Durango DMA'Y (contendo o herbicida glifosato) com a adição de 2% peso/v de sulfato de amônio. Aplicações de herbicidas são feitas com um pulverizador de trilho em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura do pulverizador de 50 cm. Plantas T, são pulverizadas com uma variedade de faixas de glifosato, de 280-4480 g ae/ha de glifosa- to, a qual é capaz de causar lesão significativa em linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que provo- ca lesão > 95% para o endógamo B104.
[00298] Os resultados das plantas de milho Tq com dgt-14 demons- tram que tolerância ao glifosato é alcançada em taxas de até 4480 g ae/ha. Plantas T, selecionadas são autofecundadas ou retrocruzadas para posterior caracterização na próxima geração. Experimentos adi- cionais incluem um teste com 100 plantas de prole que é conduzido sobre linhagens dgt-14 escolhidas que contendo as plantas T,. Todas as plantas são pulverizadas com 140-1120 g ae/ha de glufosinato ou 105-1680 g ae/ha de glifosato, conforme descrito anteriormente. Tanto o marcador selecionável quanto o gene de resistência ao glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Portanto, se um gene de tolerância a herbicida é selecionado para pulverização com um herbicida, acredi- ta-se que ambos os genes estejam presente. A catorze DAT, plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a percentagem de linhagens que segregavam como um único locus um traço domi- nantemente Mendeliano (3R:1S), conforme determinado por análise de qui-quadrado. Estes dados demonstram que dgt-14 é herdado como um gene de resistência ao glifosato robusto em uma espécie monoco- tiledônea. Taxas aumentadas de glifosato são aplicadas aos sobrevi- ventes T, ou F, para caracterizar ainda mais a tolerância e proteção as quais são conferidas pelo gene dgt-14.
Uso de Tolerância ao Herbicida Glifosato Pós-Emergência Como um Marcador Selecionável
[00299] Conforme descrito anteriormente, plantas T, transformadas são movidas da cultura tecidual e habituadas na estufa. Os eventos testados continham dgt-14 ligado a vários diferentes peptídeos de trânsito de cloroplasto. É demonstrado que estas plantas T, conferem tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato e plantas não trans- formadas são controladas com glifosato em concentrações tão baixas quanto 280 g ae/ha. Estes dados demonstram que dgt-14 pode ser usado como um marcador de seleção usando uma concentração de glifosato que varia de 280-4480 g ae/há.
[00300] Outra modalidade inclui enriquecer um número definido de sementes de linhagens fixas de milho que contêm o transgene dgt-14 em um determinado número de sementes de milho não transformado. As sementes são plantadas e deixadas crescer até o estágio de de- senvolvimento V1-V3, ponto no qual as plântulas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato na faixa de 280-4480 g ae/ha. Após 7-10 dias, as plantas sensíveis e resistentes são contadas e a quantidade de plantas tolerantes ao glifosato é correlacionada com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt- 14 que são plantadas. Exemplo 11: Empilhamento Com Outros Traços
[00301] Culturas transgênicas contendo traços de resistência a in- setos (Insect Resistance - IR) são predominantes em cultura de milho, soja e algodão em toda a América do Norte e o uso destes traços está em expansão em todo o mundo. Culturas transgênicas comerciais combinando traços de resistência a insetos e tolerância a herbicidas (Herbicide Tolerance - HT) foram desenvolvidas por várias empresas que produzem sementes. Estas incluem traços de Bacillus thuringien- sis (por exemplo, toxinas Bt listadas no site lifesci.sussex.ac.uk, 2006), traços de resistência a insetos não-Bt e qualquer um ou todos os tra- ços HT mencionados acima. A capacidade de controlar vários proble- mas de pragas através de traços de IR é um conceito de produto co- mercial valioso. No entanto, a conveniência deste conceito de produtos será limitada se o controle de ervas daninhas e controle de insetos são independentes um do outro. dgt-14, isoladamente ou empilhado com um ou mais traços HT adicionais, pode ser empilhado com um ou mais traços de entrada adicionais (por exemplo, resistência a insetos, resis- tência a fungos ou tolerância ao estresse (vide www.isb.vt.edu), quer através de melhoramento convencional ou conjuntamente como um novo evento de transformação. Traços de IR exemplificativos podem ser empilhados com dgt-14. Quando de obtenção de uma sequência codificadora de um traço de IR, aqueles versados na técnica adiciona- rão elementos de expressão (por exemplo, promotor, íntron, 3'UTR, etc.) e empilharão molecularmente o traço de IR com dgt-14 através de metodologias de DNA recombinante. Traços de IR exemplificativos candidatos incluem: Cry1F (Patentes dos Estados Unidos Nº
5.126.133; 5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; 6.573.240 e 6.737.273), Cry1A(c) (Patente dos Estados Unidos Nº 6.114.138;. 5.710,020;
6.251.656 e 6.229.004), Cry1F e Cry1A(c) como um empilhamento tri- plo com dgt-14, Cry34Ab(1) (Patentes dos Estados Unidos Nº
7.323.556;. 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246;
6.340.593), Cry35Ab(1) (Patentes dos Estados Unidos Nº 6.340.593;
7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246) ou Cry35Ab(1) e Cry34Ab(1) como um empilhamento triplo com dgt-14. Os benefícios incluem controle aprimorado de ervas daninhas conferi- do pelo dgt-14 e descrito nos exemplos anteriores relacionados à ca- pacidade de gerir pragas de insetos e/ou outros fatores agronômicos. Assim, modalidades da presente descrição podem ser usadas para fornecer um pacote agronômica completo de qualidade aprimorada da cultura com a capacidade de controlar, flexivelmente e com custo efi- caz, qualquer variedade de problemas agronômicos.
[00302] Traços de IR e HT combinados têm aplicação na maioria das culturas agronômicas e hortícolas/ornamentais e florestas. A com- binação de dgt-14 e sua tolerância a herbicida e resistência a insetos comensuráveis conferida por qualquer variedade de genes de IR Bt ou não-Bt pode ser aplicada para as espécies de culturas listadas (porém sem limitações) nos Exemplos 8 e 9. Aqueles versados na técnica de controle de ervas daninhas reconhecerão que o uso de qualquer um dos múltiplos herbicidas comerciais descritos é viabilizado por trans-
formação e empilhamento de dgt-14 com o traço de HT ou traço de IR correspondente, quer por melhoramento convencional ou engenharia genética. Taxas específicas de herbicidas representativos destes pro- dutos químicos podem ser determinadas pelos rótulos de herbicidas compilados no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados on-line (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou qualquer guia de proteção de cultura comercial ou acadêmico, tal como o Crop Protection Guide from Agrili- ance (2005). Cada herbicida alternativo permitido para uso em HTCs por dgt-14, quer usado isoladamente, em mistura para tanque ou se- quencialmente, é considerado dentro do âmbito das modalidades da presente descrição. Exemplo 12: Traço de DGT-14 Empilhado com Traço de AAD em Qualquer Cultura
[00303] Ao empilhar um traço de dgt-14 com um traço aad (por e- xemplo, aad-1 descrito na Patente dos Estados Unidos Nº 7.838. 733 ou aad-12 descrito no documento WO 2007/053482 A2), quer através de melhoramento convencional ou conjuntamente como um novo e- vento de transformação, a eficácia de controle de ervas daninhas, fle- xibilidade e capacidade de gerir mudanças de ervas daninhas e de- senvolvimento de resistência a herbicidas podem ser aprimoradas.
[00304] Transformação de culturas com aad-1 permite que um pro- dutor aplique seletivamente herbicidas de ariloxialcanoato em culturas de monocotiledôneas. Tais culturas de monocots terão uma margem maior de segurança contra fenóxi auxina. Além disso, fenóxi auxinas podem ser aplicadas seletivamente em culturas de dicots transforma- das com aad-1. Transformação de culturas com aad-12 permite que um produtor aplique seletivamente herbicidas de piridilóxi auxina e ari- loxialcanoato em culturas de dicots para controlar espécies de ervas daninhas. Ao empilhar dgt-14 com os traços aad-1 ou dgt-12, é forne-
cido aos produtores um espectro mais amplo de herbicidas para o ma- nejo de ervas daninhas. Além disso, o uso de combinações de herbici- das resultará em uma maior flexibilidade para gerir a resistência a her- bicidas entre espécies de ervas daninhas.
[00305] Vários cenários para opções aprimoradas de controle de ervas daninhas podem ser vislumbrados onde um traço de dgt-14 e um traço de aad são empilhados em qualquer espécie de cultura mo- nocotiledônea ou dicotiledônea:
[00306] a)oO glifosato pode ser aplicado em uma taxa de aplicação pós-emergência convencional (420-2160 g ae/ha, de preferência 560- 1120 g ae/ha) para o controle da maioria das espécies de ervas dani- nhas de folha larga e gramíneas. O traço de dgt-14 pode conferir tole- rância nestas taxas de aplicação de glifosato. Para o controle de ervas daninhas de folhas largas resistentes ao glifosato, tal como Conyza canadenses, ou ervas daninhas inerentemente difíceis de controlar com glifosato (por exemplo, Commelina spp.), 280-2240 g ae/ha (de preferência 560-1120 g ae/ha) de 2,4-D podem ser aplicados sequen- cialmente em uma mistura para tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para conferir um controle adicional. Tanto aad-1 quanto aad- 12 conferem tolerância ao 2,4-D.
[00307] Além disso, aad-12 confere tolerância a herbicidas de piridi- lóxi auxina, tais como triclopyr e fluroxypyr. Herbicidas de piridilóxi au- xina podem ser aplicados para controlar ervas daninhas de folha larga resistentes ao glifosato, tais como Conyza canadensis e Commelina spp. Para triclopyr, as taxas de aplicação normalmente variam de 70- 1120 g ae/ha, mais tipicamente 140-420 g ae/ha. Para fluroxypyr, as taxas de aplicação normalmente variam de 35-560 g ae/ha, mais tipi- camente 70-280 ae/ha.
[00308] b)O glifosato pode ser aplicado em uma taxa de aplicação pós-emergência convencional (420-2160 g ae/ha, de preferência 560-
1120 g ae/ha) para o controle da maioria das espécies de ervas dani- nhas de folha larga e gramíneas. Para o controle de espécies de gra- míneas resistentes ao glifosato, tais como Lolium rigidum ou Eleusine indica, 10-200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha) de quizalofop podem ser aplicados sequencialmente como uma mistura para tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para conferir controle eficaz. aad-1 confere tolerância ao quizalofop. Empilhamento de aad-1 em combinação com dgt-14 em espécies de cultura resultaria em culturas as quais são tolerantes aos herbicidas descritos acima.
[00309] c)O glifosato é eficaz no controle de outras espécies de gramíneas que não ervas daninhas de folhas largas. Os traços de aad- 1 e dgt-14 empilhados permitirão a aplicação de taxas de glifosato efi- cazes para gramíneas (105-840 g ae/ha, mais preferivelmente 210-420 g ae/ha). 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, mais preferivelmente 560-1120 g ae/ha) pode, então, ser aplicado sequencialmente como uma mistura para tanque ou como uma pré-mistura com taxas de glifosato eficazes para gramíneas para conferir controle necessário de ervas daninhas de folhas largas. Um herbicida de AOPP, tal como quizalofop, a 10- 200 g ae/ha (de preferência 20-100 g ae/ha e, mais preferivelmente, 20-35 g ae/ha), pode ser usado para um controle mais robusto de er- vas daninhas e/ou retardar o desenvolvimento de gramíneas resisten- tes ao glifosato. A baixa taxa de glifosato também conferirá algum be- nefício para o controle de ervas daninhas de folhas largas; no entanto, o controle primário será pelo 2,4-D.
[00310] d)Da mesma forma, traços de aad-12 e dgt-14 empilhados permitirão a aplicação de taxas de glifosato eficazes para gramíneas (105-840 g ae/ha, mais preferivelmente 210-420 g ae/ha). 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, mais preferivelmente 560-1120 g ae/ha) pode, en- tão, ser aplicado sequencialmente como uma mistura para tanque ou como uma pré-mistura com taxas de glifosato eficazes para gramíneas para conferir controle necessário de ervas daninhas de folhas largas. Triclopyr e fluroxypyr, usados nas taxas mencionadas acima, também serão componentes aceitáveis no regime de tratamento. A baixa taxa de glifosato também conferirá algum benefício para o controle de ervas daninhas de folhas largas; entretanto, o controle primário é pelo 2,4-D, triclopyr ou fluroxypyr.
[00311] Aqueles versados na técnica de controle de ervas daninhas reconhecerão que o uso um ou mais herbicidas comerciais de arilóxi auxina isoladamente ou em combinação (sequencial ou independen- temente) é permitido por transformação com aad-12 em culturas. Da mesma forma, o uso de um ou mais herbicidas comerciais de fenóxi auxina isoladamente ou em combinação (sequencial ou independen- temente) com um ou mais herbicidas comerciais de AOPP é permitido por aad-1. Empilhamento de qualquer um destes traços com dgt-14 permite uma gestão mais robusta de espécies de ervas daninhas. As taxas específicas de outros herbicidas representativos destes produtos químicos podem ser determinadas pelos rótulos de herbicidas compi- lados no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados on-line (por exemplo, cdms.net/manuf/manutf.asp) ou qualquer guias de proteção de cultura comerciais ou acadêmicos, tal como o Crop Protection Guide from Agriliance (2005). Cada herbi- cida alternativo permitido para uso em HTCs por aad-12, aad-1 ou dgat- 14, quer usados isoladamente, como uma mistura para tanque ou se- quencialmente, é considerado dentro do âmbito das modalidades da presente descrição. Exemplo 13: DGT-14 Empilhada com o Traço de AHAS em Qualquer Cultura
[00312] Traços que codificam tolerância a herbicidas de imidazoli- nona (AHAS) estão atualmente presentes em uma série de culturas plantadas na América do Norte incluindo, porém sem limitações, milho,
arroz, girassol e trigo.
Culturas adicionais tolerantes à imidazolinonas (por exemplo, algodão e beterraba) já estão em desenvolvimento, mas não foram comercialmente lançadas até hoje.
Muitos herbicidas de i- midazolinona (por exemplo, herbicidas imazamox, imazethapyr, ima- zaquin e imazapic) são atualmente usados seletivamente em diversas culturas convencionais.
O uso dos herbicidas imazethapyr, imazamox e o imazapyr não seletivo foi permitido através de traços de tolerância à imidazolinona, tal como AHAS.
HTCs tolerantes à imidazolinonas têm, até o momento, a vantagem de serem não transgênicas.
Esta classe de produtos químicos também tem atividade residual no solo significativa, assim, sendo capaz de conferir controle de ervas dani- nhas que se estende além do momento de aplicação, ao contrário de sistemas com base em glifosato ou glufosinato.
No entanto, o espectro de ervas daninhas controladas por herbicidas de imidazolinona não é tão amplo quanto o glifosato (Agriliance, 2003). Além disso, os herbici- das de imidazolinona têm um modo de ação (inibição de sintase de acetolactato, ALS) contra o qual muitas ervas daninhas desenvolveram resistência (Heap | (2004). Pesquisa internacional sobre ervas dani- nhas resistentes a herbicidas, disponível em www.weedscience.com). Ao empilhar dgt-14 com um traço de tolerância à imidazolinonas, quer por meio de melhoramento convencional ou conjuntamente como um novo evento de transformação, a eficácia de controle de ervas dani- nhas, flexibilidade e capacidade de gerir mudanças de ervas daninhas e desenvolvimento de resistência a herbicidas poderiam ser aprimora- das.
Conforme mencionado nos exemplos precedentes, ao transformar culturas com dgt-14, pode-se aplicar seletivamente herbicidas de glifo- sato em culturas de monocots e dicots.
Diversos cenários para opções de controle de ervas daninhas aprimorado podem ser vislumbrados onde um dgt-14 e um traço de tolerância à imidazolinonas são empi- lhados em qualquer espécie de cultura monocotiledônea ou dicotiledô-
nea.
[00313] a) Imazethapyr pode ser aplicado em uma taxa de aplica- ção pós-emergência convencional (35 a 280 g ae/ha, de preferência 70-140 g ae/ha) para o controle de muitas espécies de gramíneas e ervas daninhas de folhas largas.
[00314] ii) Ervas daninhas de folhas largas resistentes a inibidores de ALS, tais como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium album (dentre outras, Heap, 2004) podem ser controladas misturando em tanque o glifosato a 420-2160 g ae/ha, de preferência 560-1120 g ae/ha.
[00315] ii) Espécies de folhas largas inerentemente mais tolerantes a herbicidas de imidazolinonas, tal como /pomoea spp., também po- dem ser controladas misturando em tanque o glifosato a 420-2160 g ae/ha, de preferência 560-1120 g ae/ha..
[00316] iii) Gramíneas resistentes a inibidores de ALS, tais como como Sorghum halepense and Lolium spp., podem ser controladas misturando em tanque o glifosato a 420-2160 g ae/ha, de preferência 560-1120 g ae/ha.
[00317] iv) Espécies de ervas daninhas inerentemente tolerantes (por exemplo, Agropyron repens) também podem ser controladas mis- turando em tanque o glifosato a 420-2160 g ae/ha, de preferência 560- 1120 g ae/ha.
[00318] Aqueles versados na técnica de controle de ervas daninhas reconhecerão que o uso de qualquer um de vários herbicidas comerci- ais de imidazolinona ou glifosato, isoladamente ou em várias combina- ções, é permitido por transformação com dgt-14 e empilhamento com qualquer traço de tolerância à imidazolinona, quer através de melho- ramento convencional ou engenharia genética. Taxas específicas de outros herbicidas representativos destes produtos químicos podem ser determinadas pelos rótulos de herbicidas compilados no livro CPR
(Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados on-line (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer guias comerciais ou acadêmicos de proteção das culturas, tal como o Crop Protection Guide from Agriliance (2005). Cada herbicida alternativo permitido para uso em HTCs pelo dgt-14 e traços de tolerância a ALS, quer usados isoladamente, como uma mistura para tanque ou sequen- cialmente, está dentro do âmbito da presente descrição. Exemplo 14: Transformação de Soja
[00319] Sojatransgênica (Glycine max) contendo um transgene dgt- 14 estavelmente integrado é gerada por meio de transformação medi- ada por Agrobacterium de explantes do nó cotiledonar de soja. Uma cepa de Agrobacterium desarmada trazendo um vetor binário conten- do dgt-14 funcional é usada para iniciar a transformação.
[00320] A transformação mediada por Agrobacterium é realizada usando um procedimento com metade de um nó cotiledonar modifica- do de Zeng et al. (Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482). Resumidamente, sementes de soja (cv. Maverick) são germinadas em meios basais e nós cotile- donares são isolados e infectados com Agrobacterium. Meios de início de broto, alongamento de broto e enraizamento são suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacte- rium. Seleção via um herbicida é empregada para inibir o crescimento de rebentos não transformados. Brotos selecionados são transferidos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raízes e, então, transferidos para mistura de terra para aclimatização de plântulas.
[00321] Folhetos terminais de plântulas selecionadas são tratados topicamente (técnica de pintura de folha) com um herbicida para tria- gem de transformantes putativos. As plântulas selecionadas são trans- feridas para a estufa, deixadas se habituar e, então, as folha pincela- das com um herbicida para confirmar a tolerância. Amostras destas plantas T, transformadas putativas são coletadas e análise molecular é usada para confirmar a presença do marcador de seleção herbicida e o transgene dgt-14. Plantas T, estão deixadas auto fertilizar na estufa para produção de sementes T,.
[00322] Um segundo método de transformação de soja pode ser usado para produzir plantas de soja transgênicas adicionais. Uma ce- pa de Agrobacterium desarmada trazendo um vetor binário contendo dgt-14 funcional é usada para iniciar a transformação.
[00323] A transformação mediada por Agrobacterium é realizada usando um procedimento com metade de uma semente modificado de Paz et al., (Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K,, (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213). Resumidamente, sementes ma- duras de soja são esterilizadas durante a noite com gás cloro e embe- bidas em H,O estéril vinte horas antes de transformação da planta mediada por Agrobacterium. As sementes são cortadas ao meio por um corte longitudinal ao longo do hilo para separar a semente e retirar a casca da semente. O eixo embrionário é excisado e quaisquer re- bentos axiais/gomos são removidos do nó de cotilédones. Os explan- tes de metade de uma semente resultantes são infectados com Agro- bacterium. Meios de início de broto, alongamento de broto e enraiza- mento são suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção via um herbicida é empre- gada para inibir o crescimento de rebentos não transformados. Brotos selecionados são transferidos para meio de enraizamento para desen- volvimento de raízes e, então, transferidos para mistura de terra para aclimatização de plântulas.
[00324] Folhetos terminais de plântulas selecionadas são tratados topicamente (técnica de pintura de folha) com um herbicida para tria- gem de transformantes putativos. As plântulas selecionadas são trans- feridas para a estufa, deixadas se habituar e, então, as folha pincela-
das com um herbicida para confirmar a tolerância. Amostras destas plantas T, transformadas putativas são coletadas e análise molecular é usada para confirmar a presença do marcador de seleção herbicida e o transgene dgt-14. Vários eventos são identificados como contendo os transgenes. Estas plantas T, são avançadas para análise adicional e deixadas auto fertilizar na estufa para dar origem à sementes T,. So- ja contendo o transgene dgt-14 são obtidas. As plantas de soja dgt-14 são pulverizadas com diversas concentrações de glifosato e foi mos- trado que conferem tolerância ao glifosato em concentrações até 3360 g ae/ha. Exemplo 15: Transformação do Gene de DGT-14 em Arroz
[00325] Arroz transgênico (Oryza sativa) contendo um transgene dgt-14 estavelmente integrado é gerado por meio de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de nó cotiledonar de arroz. Uma cepa de Agrobacterium desarmada trazendo um vetor binário contendo dgt-14 funcional é usada para iniciar a transformação.
[00326] Os meios de cultura são ajustados para um pH de 5,8 com KOH a 1 M e solidificados com 2,5 g/l de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Caules embriogênicos são cultivados em discos de Petri de 100 x 20 mm contendo 40 ml de meio semissólido. Plântulas de ar- roz são cultivadas sobre 50 ml de meio em caixas MAGENTA. As sus- pensões de células são mantidas em frascos cônicos de 125 ml con- tendo 35 ml de meio líquido e centrifugados a 125 rpm. Indução e ma- nutenção de culturas embriogênicas ocorrem no escuro a 25-26 T e regeneração de plantas e cultura de planta inteira ocorrem em um am- biente iluminado com um fotoperíodo de 16 h (Zhang et al. 1996).
[00327] Indução e manutenção de caule embriogênico são realiza- das sobre um meio basal NB modificado, conforme descrito anterior- mente (Li et al. 1993), em que os meios são adaptados para conter 500 mg/L de glutamina. Culturas em suspensão são iniciadas e manti-
das em meio líquido SZ (Zhang et al. 1998) com a inclusão de 30 g/l de sacarose em vez de maltose. Meio osmótico (NBO) consistia em meio NB com a adição de manitol e sorbitol, cada um a 0,256 M. Caule resistente a herbicidas é selecionado sobre meio NB suplementado com o agente seletivo herbicida apropriado durante 34 semanas. Pré- regeneração é realizada em meio (PRH50) consistindo em meio NB com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (24-D), 1 mg/l de ácido o- naftalenoacético (NAA), ácido abscísico a 5 mg/I (ABA) e herbicida se- letivo durante 1 semana. Regeneração de plântulas após cultura sobre meio de regeneração (RNH50) compreendendo meio NB contendo 2,4-D, 0,5 mg/l de NAA e herbicida seletivo até que brotos putativa- mente transgênicos fossem regenerados. Os brotos são transferidos para meio de enraizamento com sais basais de Murashige e Skoog de intensidade mediana e vitaminas B5 de Gamborg, suplementado com sacarose a 1% e herbicida seletivo.
[00328] Sementes secas maduras de Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309 são esterilizadas, conforme descrito em Zhang et al. 1996. Tecidos embriogênicos são induzidos por meio de cultura de sementes de arroz estéreis maduras em meio NB no escuro. O caule primário de aproximadamente 1 mm de diâmetro é removido do escutelo e usado para iniciar a suspensão de células em meio líquido SZ. As suspen- sões são, então, mantidas conforme descrito em Zhang 1996. Tecidos embriogênicos derivados da suspensão são removidos do líquido de cultura 3-5 dias após a subcultura precedente e colocados em meio osmótico NBO para formar um círculo de cerca de 2,5 cm de diâmetro através de um disco de Petri e cultivados durante 4 h antes de bom- bardeio. Dezesseis a vinte horas após bombardeamento, os tecidos são transferidos do meio NBO para meio de seleção NBH50, assegu- rando que a superfície bombardeada esteja voltada para cima, e incu- bados no escuro durante 14-17 dias. Caule recém formado é, então,
separado dos explantes originais bombardeados e colocado próximo do mesmo meio. Após um período adicional de 8-12 dias, caule opaco relativamente compacto é identificado visualmente e transferido para meio de pré-regeneração PRH50 durante 7 dias no escuro. Caule em crescimento, o qual se tornou mais compacto e opaco é, então, sub- cultivado em meio de regeneração RNH50 durante um período de 14- 21 dias sob um fotoperíodo de 16 h. Brotos em regeneração são trans- feridos para caixas MAGENTA contendo 7 meio MSH50. Várias plan- tas regeneradas a partir de um único explante são consideradas irmãs e são tratadas como uma linhagem de planta independente. Uma plan- ta é classificada como positiva para o gene dgt-14 se ela produz raízes brancas grossas e cresce vigorosamente em 4 meio MSH50. Uma vez que as plântulas atingem o topo das caixas MAGENTA, elas são trans- feridas para a terra em um vaso de 6 cm sob umidade de 100% duran- te uma semana e, então, são transferidas para uma câmara de cres- cimento com um fotoperíodo de luz de 14 ha 30 T e escuro a 21 € durante 2-3 semanas antes de transplante para vasos de 13 cm na estufa. As sementes são coletadas e secas a 37 ºC durante uma se- mana antes de armazenamento a 4 O.
[00329] Plântulas de arroz putativamente transgênicas no estágio de 3-5 folhas são pulverizadas com uma solução de glifosato. Uma vez pulverizadas, as plântulas são deixadas secar durante uma hora antes de serem movidas da coifa. Avaliação de sensibilidade ou resistência ao glifosato é realizada 10-14 dias após tratamento (DAT). Plântulas de arroz resistentes ao glifosato, as quais contêm uma cópia totalmen- te integrada de dgt-14 na planta, são identificadas. Plantas de arroz contendo o transgene dgt-14 são obtidas. As plantas de arroz dgt-14 são pulverizadas com diversas concentrações de glifosato e mostra- ram conferir tolerância ao glifosato em concentrações até 3360 g a- elha.
Exemplo 16: Procedimentos para Transformação de Turfa
[00330] Transformação genética do transgene dgt-14 mediada por Agrobacterium tumefaciens em grama é obtida através de caules em- briogênicos iniciados a partir de sementes (cv. Penn-A-4). Vide "Effici- ency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolo- nifera L) transformation" (Luo et. al/., 2004)).
[00331] As células de caule são infectadas com uma cepa de A. tumefaciens trazendo um vetor superbinário que contém um transgene resistente a herbicidas (por exemplo, dgt-14) acionado por um promo- tor específico para monocotiledônea. A eficiência global de transfor- mação estável variava entre 18% a 45%. Análise Southern blot e ge- nética confirmam a integração do transgene no genoma da grama e transmissão normal e expressão estável do transgene para a geração T,7. Todos os eventos de transformação independentes trazem uma a três cópias do transgene e a maioria (60-65%) contém apenas uma única cópia do transgene sem rearranjos aparentes.
[00332] Sementes maduras são descascadas com uma lixa e a su- perfície esterilizada em alvejante Clorox*" a 10% (v/v) (hipoclorito de sódio a 6%) mais Tween 20 (Polissorbato 20) a 0,2% (v/v) de com agi- tação vigorosa durante 90 min. Após lavagem cinco vezes em água destilada estéril, as sementes são colocadas em meio de cultura para indução de caule (sais basais MS e vitaminas, 30 g/l de sacarose, 500 mg/| de hidrolisado de caseína, 6,6 mg/l de ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba), 0,5 mg/l de 6-benzilaminopurina (BAP) e 2 g/I| de Phytagel. O pH do meio é ajustado para 5,7 antes de esterilização em uma auto- clave a 120 € durante 20 min).
[00333] As placas de cultura contendo explantes de sementes pre- parados são mantidas no escuro em temperatura ambiente durante 6 semanas. Caules embriogênicos são visualmente selecionados e sub- cultivados em meio de indução de caule fresco no escuro em tempera-
tura ambiente durante 1 semana antes de cocultura.
[00334] Um dia antes de infecção mediada por Agrobacterium, o caule embriogênico é dividido em pedaços de 1 - a 2 mm e colocado em meio de indução de caule que continha acetossiringona a 100 UM. Uma alíquota de 10 ul da suspensão de Agrobacterium (OD = 1,0 a 660 nm), a qual abriga o transgene dgt-14 é, então, aplicada a cada pedaço de caule, seguido por 3 dias de cocultura no escuro a 25 TC. O caule é, então, transferido e cultivado durante 2 semanas em meio de indução de caule mais de 125 mg/l de cefotaxima e 250 mg/l de car- benicilina para suprimir o crescimento bacteriano.
[00335] Seleção de plantas transgênicas ocorre quando o caule é movido para meio de indução de caule contendo 250 mg/| de cefota- xima e um herbicida. O material do caule é mantido sobre este meio durante 8 semanas com um intervalo para seleção de subcultura de 3 semanas. O processo de seleção é realizado em temperatura ambien- te no escuro.
[00336] Para regeneração de plantas, os eventos de caule em proli- feração resistentes a herbicidas são primeiramente transferidos para meio de regeneração (meio basal MS, 30 g/| de sacarose, 100 mg/l de Mio-inositol, 1 mg/|! de BAP e 2 g/L de Phytagel) suplementado com cefotaxima e um herbicida para seleção. Estes caules são mantidas no escuro em temperatura ambiente durante 1 semana e, então, transfe- ridos para a luz durante 2-3 semanas para desenvolver rebentos.
[00337] Os brotos desenvolvidos são separados e transferidos para meio de regeneração sem hormônio contendo um herbicida e cefota- xima para promover o crescimento da raiz, ao mesmo tempo em que mantém a pressão de seleção e suprime quaisquer células de Agro- bacterium restantes. Plântulas com raízes bem desenvolvidas (3-5 semanas) são, então, transferidas para terra e crescidas na estufa ou no campo.
[00338] As plantas transgênicas são mantidas fora de portas em uma sementeira de contenção (3-6 meses) até o solstício de inverno em dezembro. As plantas vernalizadas são, então, transferidas para a estufa e mantidas a 25 “C sob um fotoperíodo de 16/8 h e rodeadas por plantas de controle não transgênicas que isolam fisicamente as plantas transgênicas de outras fontes de pólen. As plantas transgêni- cas começam a floração 3-4 semanas após terem sido movidas de vol- ta para a estufa. Estas plantas são retrocruzadas com o pólen das plantas de controle adjacentes. As sementes coletadas de cada planta transgênica individual são germinadas na terra a 25 'C e plantas T, são cultivadas na estufa para posterior análise.
[00339] Outras gramíneas que estão consideradas para transforma- ção com dgt-14 de acordo com o protocolo descrito incluem Poa anual (Poa annua), Grama da Bahia, Bentgrass, Grama das Bermudas, Grama azul, Bluestems, Brachiaria, Bromegrass, Browntop bent (Agrostis capil- laries), Buffalograss, Canary Grass, Carpetgrass, Centipedegrass, Fes- tuca Chewings (Festuca rubra commutate), Crabgrass, Creeping bent (Agrostis stolonifera), Crested hairgrass (Koeleria macrantha), Dallis- grass, Festuca, Festolium, Hard/sheeps fescue (Festuca ovina), Grama- grass, Grama Indiana, Grama de Johnson, Lovegrass, misturas (Equita- ção, Pastagens, etc.), Gramíneas Nativas, Orchardgrass, azevém pere- ne (Lolium perenne), Redtop, Rescuegrass, Azevém anual e perene, Festuca vermelha crespa Slender (Festuca rubra trichophylla), Poa de caule liso (Poa pratensis), St. Augustine, Festuca vermelha crespa S- trong (Festuca rubra rubra), Grama do Sudão, Switchgrass, Festuca alta (Festuca arundinacea), Tufted hairgrass (Deschampsia caespitosa), Turfgrasses, Trigo silvestre e Zoysiagrass. Exemplo 17: DGT-14 em Colza (Brassica napus)
[00340] O gene dgt-14 que confere resistência ao glifosato é usado para transformar Brassica napus var. Nexera'Y 710 com transforma-
ção mediada por Agrobacterium.
[00341] A superfície de sementes de Brassica napus é esterilizada com alvejante comercial a 10% durante 10 minutos e lavada 3 vezes com água destilada estéril. As sementes são, então, colocadas sobre metade da concentração de meio MS (Murashige e Skoog, 1962) e mantidas em regime de crescimento regulado a 25 ºC e um fotoperío- do de 16 horas de luz/8 horas de escuro.
[00342] “Segmentos de hipocótilo (3-5 mm) foram excisados de mu- das de 5-7 dias e colocados em meio de indução de caule KID1 (meio MS com 1 mg/l de cinetina e 1 mg/I| de 2,4-D) durante 3 dias como pré- tratamento. Os segmentos são, então, transferidos para um disco de Petri e tratados com uma cepa de Agrobacterium tumefaciens conten- do um construto compreendido de dgt-14. A Agrobacterium tumefaci- ens é cultivada durante a noite a 28 ºC no escuro em um agitador a 150 rpm e, então, ressuspensa em meio de cultura.
[00343] Após um tratamento de 30 minutos dos segmentos de hipo- cótilo com Agrobacterium, estes segmentos são colocados de volta no meio de indução de caule durante 3 dias. Após cocultura, os segmen- tos são colocados em KID1ITC (meio de indução de caule contendo 250 mg/| de carbenicilina e 300 mg/l de Timentina) durante uma sema- na de recuperação. Alternativamente, os segmentos são colocados diretamente sobre meio de seleção KID1H1 (meio acima com um her- bicida). Carbenicilina e Timentina são os antibióticos usados para ma- tar a Agrobacterium. O agente de seleção permite o crescimento das células transformadas.
[00344] Amostras de caule de eventos independentes isolados são testadas por PCR. As amostras que testadas positivas para a presen- ça de dgt-14 são confirmadas e avançadas para meio de regeneração. Os segmentos de hipocótilo de caule são, então, colocados em meio de regeneração de broto B3Z1H1 (meio MS, 3 mg/l de benzilamino purina, 1 mg/l de zeatina, 0,5 gm/l de MES [ácido 2-(N-morfolino)- etanossulfônico], 5 mg/l de nitrato de prata, herbicida seletivo, Carbe- nicilina e Timentina). Após 3 semanas, os brotos começam a regene- ração. Segmentos de hipocótilo, juntamente com os brotos, são trans- feridos para meio B3Z1H3 (meio MS, 3 mg/l de benzilamino purina, 1 mg/l de zeatinaa 0,5 gm/l de MES [ácido 2-(N-morfolino)- etanossulfônico], 5 mg/l de nitrato de prata, herbicida seletivo, carbeni- cilina e Timentina) durante mais 3 semanas.
[00345] Os brotos são excisados dos segmentos de hipocótilo e transferidos para médio de alongamento de caule MESH10 (MS, 0,5 g/l de MES, herbicida seletivo, Carbenicilina, Timentina) durante 2-4 semanas. Os brotos alongados são cultivados para indução de raízes em meio MSI.1 (MS com 0,1 mg/l de ácido indolbutírico). Uma vez que as plantas estabelecem um sistema de raiz, as plantas são transplan- tadas para a terra. As plantas são habituadas em condições ambien- tais controladas em um Conviron'Y durante 1-2 semanas antes de transferência para a estufa.
[00346] As plantas T, transformadas são autopolinizadas na estufa para obter sementes T,. As plantas T, e prole T, são pulverizadas com uma faixa de concentrações do herbicida glifosato para estabelecer o nível de proteção pelo gene dgt-14. Exemplo 18: Transformação de Tabaco
[00347] Pedaços de folha de tabaco (cv. Petit Havana) são trans- formadas usando Agrobacterium contendo o transgene dgt-14. Colô- nias individuais contendo o plasmídeo que contém o transgene dgt-14 são inoculadas em 4 mL de meio YEP contendo antibióticos para sele- ção do vetor contendo dgt-14 e incubadas durante a noite a 28 C em um agitador a 190 rpm. A cultura de sementes de 4 mL é subsequen- temente usada para inocular uma cultura de 25 mL do mesmo meio em um frasco de Erlenmeyer com defletor de 125 mL. Esta cultura é incubada a 28 CC com agitação a 190 rpm até atingir uma ODço,o de — 1,2. Dez ml! de suspensão de Agrobacterium são, então, colocados em discos de Petri" estéreis de 60 x 20 mm. Pedaços de folha recente- mente cortados (0,5 cm?) de plantas cultivadas assepticamente em meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) com 30 g/L de sacarose em PhytaTrays (Sigma, St. Louis, MO) são embebidos em10 mL da cultura noturna de Agrobacterium durante alguns minu- tos, secos por absorção em papel filtro estéril e, então, colocados so- bre o mesmo meio com a adição de 1 mg/L de ácido indol-acético e 1 mg/L de 6-benzilamino-purina. Três dias depois, os pedaços de folha cocultivados com Agrobacterium portando o transgene dgt-14 são transferidos para o mesmo meio com 5 mg/L de Basta'“ e 250 mg/L de cefotaxima. Após 3 semanas, as plântulas T, individuais são trans- feridos para meio MS com 10 mg/L de Basta'"Y“ e 250 mg/L de cefota- xima mais 3 semanas antes de transplante para a terra e transferência para a estufa. Plantas T, selecionadas (conforme identificado por meio de protocolos de análises moleculares descritos acima) são deixadas autopolinizar e as sementes são coletadas das cápsulas quando estão completamente secas. Plântulas T, são rastreadas quanto à zigosida- de e expressão do gene repórter (conforme descrito abaixo) e plantas selecionadas contendo o transgene dgt-14 são identificadas.
[00348] “Embora aspectos da presente descrição tenham sido des- critos em determinadas modalidades, eles podem ser adicionalmente modificados dentro do espírito e âmbito da presente descrição. O pre- sente Pedido, portanto, se destina a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações das modalidades da descrição usando seus princípios gerais. Ainda, o presente Pedido se destina a abranger tais desvios da presente descrição, conforme ocorre na prática conhecida ou habitual na técnica à qual estas modalidades pertencem e as quais estão den- tro dos limites das reivindicações anexas.

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES
1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de ser selecionada do grupo que consiste em: a) uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3; b) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipep- tídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; e c) um ácido nucleico heterólogo que compreende uma se- quência de nucleotídeos que hibridiza com um outro ácido nucleico tendo SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 sob condições de alta estrin- gência.
2. Vetor, caracterizado pelo fato de compreender a molécu- la de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, em que o vetor preferencialmente atende a pelo menos um dos seguintes requisitos: i) compreende ainda um ácido nucleico que codifica um po- lipeptídeo heterólogo.
ii) o ácido nucleico é operativamente ligado a um promotor, em que preferencialmente o promotor é o promotor AtUbi10.
3. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de conter a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, em que preferencialmente a célula hospedeira não é regenerável para produzir uma planta.
4. Método de geração de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta resistente ao glifosa- to, caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformação da planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou uma célula de planta com a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1; e b) expressão de um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1, em que preferencialmente o método atende a pelo menos um dos seguintes requisitos: i) a planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta transformada é resistente ao glifosato, ii) o polipeptídeo não compreende LGNAAT (SEQ ID NO: 61) e/ou não compreende ALLMXAPLT (SEQ ID NO: 62), em que X é selecionado do grupo que consiste em alanina, serina e treonina, ii) o polipeptídeo, quando alinhado com SEQ ID NO: 1, compre- ende uma alanina na posição correspondente à posição 101 de SEQ ID NO: 1, iv) a molécula de ácido nucleico tem pelo menos 95% de identi- dade de sequência com SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3, v) a molécula de ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.
5. Método para controle de ervas daninhas em uma área sob cultivo contendo plantas resistentes a herbicidas, caracterizado pelo fato de que compreende: a) plantio de uma planta ou uma semente de planta que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na rei- vindicação 1, na área sob cultivo; e b) aplicação, à área sob cultivo, de uma quantidade sufici- ente de herbicida para controlar ervas daninhas na área sob cul- tivo sem afetar significativamente a planta ou semente de planta, em que preferencialmente o método atende a pelo menos um dos se- guintes requisitos: i) o herbicida é glifosato,
ii) a planta ou a semente de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 compre- ende uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo, ili))) o segundo ácido nucleico compreende aad-1 ou aad-12.
6. Método para conferir resistência a um herbicida a uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformação da planta com uma construção de DNA, a referida construção compreendendo um promotor operativamen- te ligado à molécula de ácido nucleico como definida na reivindi- cação 1; b) regeneração de uma planta transformada; e c) expressão da molécula de ácido nucleico de modo a pro- duzir um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. em que preferencialmente o método atende a pelo menos um dos se- guintes requisitos: i) o herbicida é glifosato, ii) a construção de DNA compreende uma segunda molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo pas- sível de expressão na planta, em que preferencialmente o po- lipeptídeo heterólogo compreende aad-1 ou aad-12.
7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta que não é regenerável para produzir uma planta é transformada.
8. Uso de uma planta, parte de planta, órgão de planta, se- mente de planta ou célula de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para plantar ou cultivar uma cultura transgênica.
9. Método para gerar uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta transgênica, caracteri- zado pelo fato de que compreende cruzar uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.
10. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concre- tizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inici- almente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.
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