CN104202968A - 抗草甘膦植物及相关方法 - Google Patents

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R·M·西奇洛
C·耶基斯
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Abstract

提供了具有草甘膦抗性的包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸的植物、植物部分、植物器官、植物种子、和/或植物细胞以及相关的方法。

Description

抗草甘膦植物及相关方法
优先权要求
本申请要求2012年2月1日提交的美国临时专利申请序列号61/593,555、以及还有2012年4月17日提交的美国临时专利申请序列号61/625,222的权益。
根据37C.F.R.§1.821(c)或(e)-序列表作为ASCII文本文件形式递交的声明
依照37C.F.R.§1.821(c)或(e)，已将含有ASCII文本型式序列表的文件与本申请同时递交，其内容在此通过提述并入本文。
技术领域
本公开涉及包含DGT-14的新的且独特的植物以及相关方法。一些实施方案涉及有关N-(膦酰基甲基)甘氨酸代谢的新颖的多肽、编码这种多肽的核酸、以及用于鉴定它们的方法。特定的实施方案涉及包含前述多肽和/或核酸的植物、植物部分、以及植物细胞。
背景技术
杂草物种是一个长期以来存在于耕地的问题。虽然控制杂草曾经是劳动强度大的操作，但由于高效杀灭杂草的化学除草剂的可用性已使其变得更加容易。除草剂的广泛使用连同改良的作物品种和肥料已经对农业中的“绿色革命”做出了重大贡献。特别有用的除草剂是具有广谱除草活性的那些。不幸的是，广谱除草剂通常对暴露于除草剂的作物植物具有有害影响。克服这个问题的一种方式是产生耐受某些广谱除草剂的植物。
广谱除草剂的一个例子是N-膦酰基甲基甘氨酸，也称为草甘膦。草甘膦已经在全世界被农民广泛使用，用于在作物种植之前，例如在免耕种植(no-tillfarming)中控制杂草。另外，草甘膦是在生产周期或轮作之间控制杂草和自生植物的有效手段。草甘膦在使用后在土壤中不携带，它被广泛认为是可用于农业的环境最安全和广泛有效的化学除草剂之一。
草甘膦通过抑制莽草酸途径杀死植物。这个途径导致芳族化合物，包括氨基酸、维生素和植物激素的生物合成。通过与酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(通常被称为“EPSP合酶”和“EPSPS”)结合并抑制其活性，草甘膦阻断磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)与3-磷代莽草酸缩合为5-烯醇式丙酮酰-3-磷代莽草酸。
不幸的是，作物植物对草甘膦的天然耐受并非已知，因此，这种除草剂对种植作物的杂草控制的效用已受到限制。一种产生耐草甘膦作物植物的方法是使用基因工程技术将编码EPSPS基因的异源草甘膦耐受形式的基因导入作物植物中。利用化学诱变，已在细菌中产生EPSPS的耐草甘膦形式，并且将异源基因导入植物中而产生耐草甘膦植物(参见，例如，Comai等,Science 221：370-71(1983))。异源EPSPS基因通常在作物植物中过表达以获得期望的耐受水平。
相关技术的上述例子以及与其相关的局限性旨在是说明性的，而不是排他性的。在阅读本说明书之后，相关技术的其他局限性对于本领域的熟练技术人员将变得显而易见。
发明内容
在实施方案中，本公开涉及包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸的植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞。
在进一步的实施方案中，本公开涉及产生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器官、植物种子、和/或植物细胞的方法，其包括：用编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸转化植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞；并表达所述核酸，以便产生与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽。
实施方案包括包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸的载体。
具体的例子包括包含编码与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的多肽的核酸的载体。
其他实施方案包括包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核酸序列的载体。例如，载体可包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核酸序列。
实施方案包括包含表达与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的耐草甘膦植物和植物细胞。
另外的实施方案包括用于在含有抗草甘膦植物的耕作田地或区域中控制杂草的方法，其特征在于，其中这样的方法可包括：在所述耕作田地或区域中种植包含编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的多肽的核酸的植物或植物种子；并且向所述耕作田地或区域施用足够量的草甘膦，以控制田地中的杂草而不显著影响所述植物。
在一些实施方案中，本公开涉及可再生细胞用于在抗草甘膦植物的组织培养中的用途。这样的组织培养可能够再生具有前述抗草甘膦植物的生理学和形态学特征的植物，并且也能够再生与前述植物具有基本上相同基因型的植物。在这样的组织培养中的可再生细胞可以是，例如，胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、花、种子、荚果(pod)和茎。具体的实施方案涉及从本公开的实施方案的组织培养再生的植物。
在一些实施方案中，本公开涉及细胞，其不可再生以产生植物，例如供在产生抗草甘膦植物细胞系中使用。在其它实施方案中，本公开涉及部分地包含这种细胞的植物。
在某些实施方案中，本公开涉及向种植在培养区域中的作物施用多种除草剂。除了多种除草剂之外，过量施用(an over the top application)草甘膦利用了不同除草剂的特性，从而使杂草控制具备灵活性和经济性的改进的组合。例如，单独的除草剂在培养区域中具有不同的寿命，即，某些除草剂在它们施用到所述区域之后存留并且有效持续相对较长的时间，而其他除草剂迅速分解成其他化合物和/或非活性化合物。根据特定实施方案的改进的除草剂施用系统允许使用草甘膦和多种除草剂，使得种植者可以定制特定除草剂的选择以供在特定情况下使用。
在其他实施方案中，本公开涉及用于制作和使用耐受如下所述的一种以上的除草剂或除草剂类或亚类的植物的方法和组合物。在具体的实施方案中，提供了耐受草甘膦和至少一种其他除草剂(或除草剂类或除草剂亚类)或化学物质(或另一种化学物质类或化学物质亚类)(例如，杀真菌剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂和类似物)两者的植物。这类植物可用于例如包括用多种除草剂处理作物植物的方法中。因此，本公开提供了耐受用除草剂或除草剂的组合(包括各自通过不同的作用方式起作用的除草剂的组合)或至少一种除草剂与至少一种其他化学物质(包括杀真菌剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂和类似物)的组合处理的抗除草剂植物。以这种方式，本公开描述了培育作物植物的改进的方法，其中杂草被选择性地控制。
在一个实施方案中，除草剂抗性植物包含编码赋予对草甘膦的耐受性的异源多肽的核酸分子以及编码赋予对2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的耐受性的多肽的核酸分子。根据前述段落，提供了包含至少第三种核酸分子的植物，所述核酸分子编码对植物赋予选自下组的性状的多肽：除草剂耐受性状；昆虫抗性性状；农艺性状；抗病性性状；修饰的脂肪酸性状；或降低的植酸性状。
在另一个实施方案中，所述除草剂抗性植物包含编码赋予对草甘膦的耐受性的多肽的异源核酸分子以及编码赋予对草丁膦的耐受性的多肽的核酸分子。一些例子包括包含至少第三种核酸分子的抗除草剂植物，所述第三种核酸分子编码对植物赋予除草剂耐受性状、昆虫抗性性状、农艺性状、抗病性性状、修饰的脂肪酸性状、或降低的植酸性状的多肽。
在另一个实施方案中，所述抗除草剂植物包含编码赋予对草甘膦的耐受性的多肽的核酸分子以及编码赋予对抑制乙酰乳酸合酶(ALS)(Lee等，1988EMBO J.7:1241)，也称为乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(Miki等，1990Theor.Appl.Genet.80:449)的除草剂的耐受性的多肽的核酸分子。相应地，进一步提供了包含至少第三种核酸分子的抗除草剂植物，所述第三种核酸分子编码对植物赋予除草剂耐受性状、昆虫抗性性状、农艺性状、抗病性性状、修饰的脂肪酸性状、或降低的植酸性状的多肽。
在另一个实施方案中，任何核酸分子可与任何其他的核酸分子组合或“堆叠”，以提供另外的对草甘膦或另一种除草剂的抗性或耐受性，和/或提供选择昆虫或疾病的抗性和/或营养增强、和/或改进的农学特性、和/或在饲料、食品、工业、制药或其他用途中有用的蛋白质或其他产品。实施方案包括在植物基因组内堆叠两个或更多个感兴趣的核酸序列。这种堆叠可通过使用两个或更多个事件的常规植物育种、用含有感兴趣的序列的构建体转化植物、转基因植物的再转化、或者经由同源重组通过靶向整合添加新的性状来实现。这种堆叠的例子是以下项的任意组合：dgt-14核酸分子、Cry34Ab1核酸分子、Cry35Ab1核酸分子、Cry1F核酸分子、Cry1Ac核酸分子、aad-12核酸分子、aad-1核酸分子、pat核酸分子、以及DSM-2核酸分子。
除了上述示例性方面和实施方案之外，通过研究以下说明，其他方面和实施方案将是显而易见的。
附图简述
图1描绘了DGT-14(SEQ ID NO:46)、DGT-11(SEQ ID NO:47)、DGT-12(SEQ ID NO:49)、DGT-18(SEQ ID NO:50)、DGT-29(SEQ ID NO:53)、以及DGT-30(SEQ ID NO:52)与其他酶EPSP合酶的部分序列比对，所述其他酶例如grg-23(SEQ ID NO:54；源于美国专利号7,834,249)、来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的CP4(SEQ ID NO:48；GENBANK登录号AEM75108.1)、来自欧洲油菜(Brassica napus)的DGT-3(SEQ ID NO:57；GENBANK登录号P17688)、来自大豆(Glycine max)的DGT-1(SEQ ID NO:56)、来自普通小麦(Triticum aestivum)的DGT-7(SEQ ID NO:55；GENBANK登录号EU977181)、以及来自大肠杆菌(Escherichia coli)的aroA(SEQ ID NO:51；Padgette等，(1991)；Eschenburg等,(2002)；Priestman等，(2005)；Haghani等，(2008)。全部六种DGT酶(DGT-14、DGT-11、DGT-12、DGT-18、DGT-30、以及DGT-29)共享在酶aroA EPSP合酶氨基酸位置96处保守的丙氨酸。这个氨基酸的位置由星号指示，并将氨基酸残基加下划线。
图2显示了来自大豆的DGT-1(SEQ ID NO:59)、来自欧洲油菜的DGT-3(SEQ ID NO:58；GENBANK登录号P17688)、以及来自普通小麦的DGT-7(SEQ ID NO:60；GENBANK登录号EU977181)的全长酶的比对。从甘氨酸突变成丙氨酸的氨基酸残基的位置由第一个星号指示。从苏氨酸突变成异亮氨酸的氨基酸残基的位置由第二个星号指示。从脯氨酸突变成丝氨酸的第三个氨基酸残基的位置由第三个星号指示。
图3描绘pDAB100427的质粒图谱。
图4描绘pDAB102946的质粒图谱。
图5描绘pDAB100431的质粒图谱。
图6描绘pDAB100432的质粒图谱。
图7描绘pDAB100435的质粒图谱。
图8描绘pDAB100446的质粒图谱。
图9描绘pDAB100436的质粒图谱。
图10描绘在使用1mM PEP将不同的突变导入DGT-1(A)和DGT-7(B)中之后获得的IC50值。对于A和B两者的IC50曲线，实心三角形代表野生型，实心圆代表GA突变体，空心正方形代表GAPS突变体，并且实心正方形代表TIPS突变体。
图11描绘pDAB107526的质粒图谱。
图12描绘pDAB102787的质粒图谱。
图13描绘pDAB105525的质粒图谱。
图14描绘pDAB105526的质粒图谱。
图15描绘pDAB105527的质粒图谱。
图16描绘pDAB105528的质粒图谱。
图17描绘pDAB105529的质粒图谱。
用于实施本发明的方式
本文中公开的密码子优化的dgt-14核酸分子在其中草甘膦除草剂抗性可以在植物中使用的多种应用中是有用的。
当提及植物抵抗或耐受草甘膦时，它的意思是在植物上应用足够量的草甘膦有并不显著影响或杀死所述植物。植物可以天然耐受特定的除草剂，或者植物可以因人工结果例如像选择性育种或在植物的基因组中导入转基因而是耐除草剂的。“抗草甘膦植物”是包含多肽或核酸分子的植物，所述多肽或核酸分子将除草剂耐受性赋予植物或其他表达它的生物(即，使植物或其他生物耐除草剂)。对草甘膦有抗性或耐受性的植物可显示来自向所述植物施用草甘膦的某种最小的影响。例如，在植物的正常生长和发育方面可存在改变，其中所述植物可表现出与应激或疾病相关的征象或症状。这种由于向抵抗或耐受草甘膦的植物施用草甘膦所致的最小影响与导致向草甘膦敏感植物施用草甘膦的不利影响形成对照。向敏感植物施用草甘膦可显著影响或杀死所述植物。相比于向不包含赋予草甘膦耐受性的核酸分子的植物施用草甘膦，向包含赋予耐受性结果的核酸分子的植物施用草甘膦导致显著更小的影响。
因此，如果一种植物与适当的对照植物相比它显示的损伤比所述对照植物所展示的损伤小至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、或1000％或更多，则所述植物是耐受除草剂或其它化学物质的。以这种方式，对除草剂或其他化学物质耐受的植物相比于适当的对照植物显示增加的耐受性。由除草剂或其他化学处理所致的损伤是通过任何植物生长参数来评定的或者适当地由本领域的技术人员良好地评价。可通过目测和/或通过个体植物或一组植物的适当参数的统计分析来评定损伤。因此，例如可通过评估参数，如株高、株重、叶色、叶长、开花、能育性、抽丝、产量、种子产生等评定损伤。也可以通过评估特定发育阶段(例如，抽丝、开花或花粉脱落)所经过的时间、或直到植物从特定的化学物质和/或除草剂恢复所经过的时间来评定损伤。
在进行这种评定的过程中，可以对特定损伤程度赋予特定的值，使得可以做出统计分析或定量比较。使用值的范围来描述特定损伤程度是本领域已知的，并可使用任何适合的范围或标度。例如，可以将除草剂损伤评分(也称为耐受性评分)赋值。如上面所指出的，还通过在这个标度中的其他分级来指示除草剂耐受性，其中适当的对照植物展现出在所述标度上的较低评分，或其中一组适当的对照植物响应于除草剂处理展现出比一组主题植物统计学上更低的评分。
可在已用除草剂处理植物之后的不同时间评定由除草剂或其他化学物质引起的损伤。通常，大约在对照植物展现出最大损伤的时间评定损伤。有时，在其中未用除草剂或其它化学物质处理的对照植物相比于给予处理的大小或阶段已经可测量地生长和/或发育之后的一段时间评定损伤。可以在不同的时间评定损伤，例如，在用除草剂处理试验植物12小时或在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天、或三周、四周、或更长时间之后。任何评定时间是合适的，只要其允许检测响应于试验植物和对照植物处理的差异即可。
当除草剂对植物不具有作用时，或者当它对植物具有一些作用而所述植物后来从这种作用中恢复时，或者当它具有的作用有害但被抵销时(例如，通过特定除草剂对杂草的影响)，所述除草剂不“显著影响”植物。因此，例如，如果作物植物相比于适当的对照植物(例如，未处理的作物植物)在指示植物健康和/或生产力的至少一个适合的参数方面展现出小于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、或1％的下降，则所述作物植物未受到除草剂或其他处理的“显著影响”。指示植物健康和/或生产力的适合参数包括，例如，株高、株重、叶长、特定发育阶段经过的时间、开花、产量、种子产生，等等。可通过目测和/或通过任何适合的参数的统计分析进行参数的评价。可通过目测和/或通过统计分析来进行比较。因此，如果作物植物展现出在至少一个参数方面的下降，但所述下降在性质上是暂时的，并且所述植物在1周、2周、3周、4周或6周之内完全恢复，则所述作物植物未被除草剂或其它处理“显著损伤”。
相反，如果作物植物相比于适当的对照植物(例如，未处理的相同种类的杂草)在指示植物健康和/或生产力的至少一个适合的参数方面展现出大于50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、150％、或170％的下降，则所述作物植物受到除草剂或其他处理的显著影响或损伤。因此，如果一种植物展现出在至少一个参数方面的下降并且所述植物在1周、2周、3周、4周或6周之内没有完全恢复，则所述植物被显著损伤。
通过目测或其他适当的方法由本领域技术人员评定由除草剂或其他化学处理导致的植物损伤，并通过适当参数的统计分析将其评估。被评估的植物被称为“试验植物”。通常，适当的对照植物是表达与被评估除草剂耐受性的植物(即，所述“试验植物”)但其还没有用除草剂处理时相同的除草剂耐受性多肽的植物。
除非另外定义，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与涉及本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在发生冲突的情况下，以包含定义的本申请为准。除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，而复数术语应包括单数。出于所有目的，本文中提及的所有出版物、专利和其他参考文献通过提述以其整体并入，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示以通过提述并入本文一样，除非指示只有专利或专利出版物的特定部分通过提述并入本文。
为了进一步阐明本发明，提供了以下术语、缩写和定义。
如本文中使用的，术语“包含”(“comprises”、“comprising”)、“包括”(“includes”、“including”)、“具有”(“has”、“having”)、“含有”(“contains”或“containing”)或它们的任何其他变型均旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含列出的要素的组合物、混合物、工艺、方法、物品、或装置不一定仅限于那些要素，而可以包括未明确列出的或此类组合物、混合物、工艺、方法、物品或装置固有的其他要素。此外，除非明确相反地说明，“或”是指包含性的“或”而不是排他性的“或”。例如，通过任何一种以下情况来满足条件A或B：A是真实的(或存在的)且B是虚假的(或不存在)，A是虚假的(或不存在)且B为真实的(或存在)以及A和B都是真实的(或存在)。
并且，在本公开的实施方案的元件或组分之前的不定冠词“a”和“an”对于实例，即，出现的元件或组分的数量旨在是非限制性的。因此，“一”或“一个”应该被理解为包括一个或至少一个，并且元件或组分的单数词语形式还包括复数形式，除非所述数字明显意指单数。
如本文中使用的术语“发明”或“本发明”是非限制性术语，并且不旨在指任何的特定发明的单个实施方案，而是涵盖在本申请中披露的所有可能的实施方案。
“除草剂”是对植物引起暂时性或永久性损伤的化学物质。在本文中其他地方进一步详细论述可在本公开的多种方法和组合物中使用的除草剂的非限制性例子。除草剂可并入植物中，或者它可以作用于所述植物而不并入所述植物或其细胞中。“活性成分”是在除草剂制剂中主要负责其植物毒性并且被确定为在产品标签上的活性成分的化学物质。产品标签信息可以从美国环境保护局获得，并在oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own在线更新；产品标签信息也可在www.cdms.net在线获得。术语“酸当量”表示除草活性母体酸的比率或量。
如本文中使用的术语“植物”包括但不限于植物的任何后代、细胞、组织、或部分。
术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”旨在涵盖单数的核酸以及多个核酸、核酸片段、变体或其衍生物、或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。一种多核苷酸或核酸可包含全长cDNA序列的核苷酸序列或其片段，包括非翻译5'和3'序列和编码序列。一种多核苷酸或核酸可由任何多核糖核苷酸或者多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸或核酸可以如下组成：单链DNA和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链RNA和双链RNA、作为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链的DNA和RNA的杂合分子、或单链区和双链区的混合物。这些术语也包括多核苷酸或核酸的化学修饰形式、酶修饰形式、或代谢修饰形式。
多核苷酸或核酸序列可称为“分离的”，其中它已经从其天然环境中移出。例如，编码具有包含在载体中的草甘膦耐受活性的多肽或多肽片段的异源多核苷酸或核酸被认为对于本公开的目的是分离的。分离的多核苷酸或核酸的另外的例子包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液形式的纯化的(部分地或基本上纯化的)多核苷酸或核酸。根据本公开的实施方案的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这些分子。处于DNA聚合物形式的分离的多核苷酸或核酸可以由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段组成。
术语“基因”是指编码功能性产物分子RNA或蛋白质的核酸序列，任选地包括在编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。
如本文中使用的术语“编码区”是指对特定氨基酸序列进行编码的DNA序列。“适合的调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、之内或下游(3'非编码序列)并影响转录、RNA加工或稳定性、或相关编码序列的翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。
如本文中使用的，术语“多肽”意在涵盖单数个“多肽”以及复数个“多肽”和它们的片段，并指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两种或更多种氨基酸的任何链或多个链，并且不是指产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用来指具有两种或更多种氨基酸的任何链或多个链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义之内，并且术语“多肽”可以用来代替任何这些术语或与之可互换地使用。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但不一定是从指定的核酸序列翻译的。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成产生。
对于“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在它的天然环境中的多肽。不需要特殊的纯化水平。因此，提及“分离的”表示如本文中所述的“人工”的涉及。例如，可以从其天然或自然环境中取得分离的多肽。表达在宿主细胞中的重组多肽和蛋白质被认为针对本公开的目的是分离的，因为它们是已经分离的、分级的、或者通过任何适合的技术部分地或基本上纯化的天然的或重组的多肽。
如本文中使用的，“天然”是指如发现于自然界中的具有其自身调控序列(如果存在的话)的多核苷酸、基因或多肽的形式。
如本文中所使用的，“内源”是指在生物或生物中的基因组中处于其天然位置的多核苷酸、基因或多肽的天然形式。“内源多核苷酸”包括在生物的基因组中处于其天然位置的天然多核苷酸。“内源基因”包括在生物的基因组中处于其天然位置的天然基因。“内源多肽”包括在生物中处于其天然位置的天然多肽。
如本文中使用的“异源”是指通常未发现于宿主生物中但被导入到宿主生物中的多核苷酸、基因或多肽。“异源多核苷酸”包括以不同于相应的天然多核苷酸的形式再导入到源生物中的天然编码区或其部分。“异源基因”包括以不同于相应的天然基因的形式再导入到源生物中的天然编码区或其部分。例如，异源基因可包括作为包括被导入到天然宿主中的非天然调控区域的嵌合基因的一部分的天然编码区。“异源多肽”包括以不同于相应的天然多肽的形式再导入到源生物中的天然多肽。题述基因和蛋白质可与其他的基因和蛋白质融合而产生嵌合蛋白或融合蛋白。根据题述公开的实施方案有用的基因和蛋白质不仅包括具体例举的全长序列，而且还包括这些序列、变体、突变体、嵌合体及其融合体的部分、区段和/或片段(包括相比于全长分子的连续片段和内部和/或末端缺失)。
如本文中使用的术语“修饰”可指导致由本文中披露的多核苷酸编码的多肽的活性降低、基本上消除或消除的所述多核苷酸的变化、以及导致在本文中披露的多肽的活性降低、基本上消除或消除的所述多肽的变化。或者，术语“修饰”可以是指导致由本文中披露的多核苷酸编码的多肽的活性增加或增强的所述多核苷酸的变化、以及导致在本文中披露的多肽的活性增加或增强的所述多肽的变化。可通过本领域熟知的方法产生这样的变化，包括但不限于：缺失、突变(例如，自发突变、随机突变、由增变基因引起的诱变、或转座子诱变)、取代、插入、下调、改变细胞位置、改变多核苷酸或多肽的状态(例如，甲基化、磷酸化或泛素化)、除去辅因子、导入反义RNA/DNA、导入干扰RNA/DNA、化学修饰、共价修饰、用紫外线或X射线照射、同源重组、有丝分裂重组、启动子替代方法，和/或它们的组合。通过比较特定多核苷酸或多肽的序列和同源的多核苷酸或多肽的(例如，酵母或细菌的)序列，并且将高度同源性的区域(保守区)中或共有序列中进行的修饰的数量最大化，可找到确定哪些核苷酸或氨基酸残基可被修饰的指导。
如本文中使用的术语“衍生物”，是指在本公开中提出的序列的修饰。说明性的这种修饰将是保持、轻微改变、或增加本文中披露的编码序列在作物种类中的功能的与本文中披露的编码序列的核酸序列有关的一个或多个碱基的取代、插入、和/或缺失。例如，使用预测和优化序列结构的计算机建模技术，可以由本领域技术人员容易地确定这种衍生物。因而术语“衍生物”也包括与本文中披露的编码序列具有实质性序列同一性的核酸序列，使得它们能够具有用于在本公开的实施方案中产生DGT-14的所披露的功能性。
如本文中使用的，术语“变体”是指通过使用例如重组DNA技术(如诱变)产生的氨基酸插入、缺失、突变和取代而不同于本公开的实施方案的具体记载的多肽的多肽。通过比较特定多肽的序列和同源多肽的序列，并且将高度同源性的区域(保守区)中进行的氨基酸序列改变的数量最小化或通过用共有序列替代氨基酸，可找到确定那些氨基酸残基可被替换、添加或缺失而不消除感兴趣的活性的指导。题述公开的实施方案的蛋白质可具有取代的氨基酸，只要它们保留所期望的功能活性即可。“变体”基因具有编码与例示性蛋白质具有等同或相似的活性的相同蛋白质或等同蛋白质的核苷酸序列。
术语“变体蛋白”和“等同蛋白质”是指具有针对靶底物和作为例示蛋白质的等同序列的相同或基本相同的生物学/功能活性的蛋白质。如本文中使用的，提及的“等同”序列是指具有提高活性或没有不利地影响活性到显著程度的氨基酸取代、缺失、添加、或插入的序列。保留活性的片段也被包括在这个定义中。保留了与示例性蛋白的相应片段相同或相似的功能或活性的片段和其他等同物落入题述公开的实施方案的范围之内。
可以使用变体基因来产生变体蛋白；可以使用重组宿主来产生变体蛋白。利用这些“基因改组”技术，可以构建等同的基因和蛋白质，其包括本文中所例示的任何序列的任何5、10或20个连续残基(氨基酸或核苷酸)。正如本领域的技术人员所知，例如可以调整所述基因改组技术以获得具有例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、或293个连续残基(氨基酸或核苷酸)的等同物，其相应于在任何例示或建议的序列(或其互补物(完全互补物))中(具有相同大小)的区段。类似大小的区段，特别是保守区的那些，也可以用作探针和/或引物。
在获得和检验目的蛋白的原子3-D(三维)坐标和晶体结构之后，可以设计和靶向“改组”策略。因此，“聚焦改组”可以被定向到对于修饰是理想的蛋白质的某些区段，如表面暴露的区段，并且优选不是涉及与蛋白质折叠和基本3-D结构完整性的内部区段。例如美国专利号5,605,793描述了通过在随机或聚焦片段化之后使用DNA重新组装产生另外的分子多样性的方法。这可以被称为基因“改组”，它典型地包括混合两种或更多种不同的DNA分子的(具有期望大小)的片段，随后重复若干轮复性。这可以改进由起始基因所编码的蛋白质的活性。其结果是具有改进的活性、改变的底物特异性、增加的酶稳定性、改变的立体特异性、或其他特征的嵌合蛋白。
氨基酸“取代”可以是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替换一种氨基酸的结果，即，保守氨基酸替换，或者它们可以是用具有不同结构和/或化学性质的氨基酸替换一种氨基酸的结果，即非保守氨基酸替换。氨基酸可以被归于以下类：非极性氨基酸、不带电荷的极性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸。可以在涉及的残基的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性、或两亲性相似的基础上进行“保守”氨基酸取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
替代地，可以通过选择任何这些氨基酸的在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、或两亲性质方面的差异进行“非保守”氨基酸取代。“插入”或“缺失”可在变异范围内，只要重组蛋白在结构上或功能上容许即可。通过使用重组DNA技术在多肽分子中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代，并测定所得到的重组变体的活性，可以实验方式确定允许的所述变异。
可以进行酶“活性位点”的特定改变来影响关于活性或立体特异性的固有功能性。参见Muller等，“Structural basis for the enantiospecificities of R-andS-specific phenoxypropionate/alpha-ketoglutarate dioxygenases,”Protein Sci.(2006)。例如，已知的tauD晶体结构被用作模型双加氧酶，以确定活性位点残基，同时结合到其固有底物牛磺酸上。参见Elkins等(2002)“X-ray crystalstructure of Escherichia coli taurine/alpha-ketoglutarate dioxygenase complexed toferrous iron and substrates,”Biochemistry 41(16):5185-5192。关于酶活性位点的序列优化和可设计性，参见Chakrabarti等，PNAS(2005年8月23日)，102(34):12035-12040。
也可以改变蛋白质的各种性质和三维特征，而没有不利地影响所述蛋白质的活性/功能性。可容许/进行保守氨基酸取代，使其没有不利地影响所述分子的活性和/或三维构型。氨基酸可以被归于以下类：非极性氨基酸、不带电荷的极性氨基酸、碱性氨基酸和酸性氨基酸。藉此将一种类型的一个氨基酸替换为相同类型的另一个氨基酸的保守取代落入题述公开的实施方案的范围之内，只要取代对所述化合物的生物活性没有不利即可。也可设计在序列水平上不同但保留了相同或相似的总体基本三维结构、表面电荷分布等的变体蛋白。参见例如美国专利号7,058,515；Larson等，Protein Sci.200211:2804-2813，“Thoroughly sampling sequence space:Large-scale protein design of structuralensembles”；Crameri等，Nature Biotechnology 15,436-438(1997),“Molecularevolution of an arsenate detoxification pathway by DNA shuffling”；Stemmer,W.P.C.1994.DNA shuffling by random fragmentation and reassembly:in vitrorecombination for molecular evolution.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；Stemmer,W.P.C.1994.Rapid evolution of a protein in vitro by DNAshuffling.Nature 370:389-391；Stemmer,W.P.C.1995.Searching sequence space.Bio/Technology 13:549-553；Crameri,A.,Cwirla,S.和Stemmer,W.P.C.1996.Construction and evolution of antibody-phage libraries by DNA shuffling.NatureMedicine 2:100-103；以及Crameri,A.,Whitehorn,E.A.,Tate,E.和Stemmer,W.P.C.1996.Improved green fluorescent protein by molecular evolution usingDNA shuffling.Nature Biotechnology 14:315-319。
还可以在题述公开的实施方案的范围之内进行最适合于DGT-14(合成发夹结构)的5’或3’UTR的计算设计。在本文中其他地方论述大体上的计算机建模以及基因改组和定向进化。更具体地说，关于计算机建模和UTR，根据本公开的在预测/评估5’或3’UTR衍生物中使用的计算机建模技术包括但不限于:从Genetics Corporation Group,Madison,WI可获得的MFoId版本3.1(参见Zucker等,“Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary StructurePrediction:A Practical Guide,”见于RNA Biochemistry and Biotechnology,11-43,J.Barciszewski&B.F.C.Clark编,NATO ASI系列,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,NL,(1999)；Zucker等,“Expanded Sequence Dependence ofThermodynamic Parameters Improves Prediction of RNA Secondary Structure,”J.Mol.Biol.288,911-940(1999)；Zucker等,“RNA Secondary Structure Prediction,”于Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,S.Beaucage,D.E.Bergstrom,G.D.Glick,和R.A.Jones编,John Wiley&Sons,New York,11.2.1-11.2.10,(2000))；COVE(RNA structure analysis using covariance models(stochastic context freegrammar methods))v.2.4.2(Eddy&Durbin,Nucl.Acids Res.1994,22:2079-2088)，其可作为源代码自由发送并可通过登录网址genetics.wustl.edu/eddy/software/下载；以及FOLDALIGN,也可自由地发送并在网址bioinf.au.dk.FOLDALIGN/可下载(参见“Finding the most significantcommon sequence and structure motifs in a set of RNA sequences,”J.Grodkin,L.J.Heyer和G.D.Stormo.Nucleic Acids Research,Vol.25,no.18pp.3724-3732,1997,“Finding Common Sequence and Structure Motifs in a set of RNASequences,”J.Gorodkin、L.J.Heyer、和G.D.Stormo.ISMB 5；120-123,1997)。
可使用市售的外切核酸酶或内切核酸酶根据标准程序产生全长基因的片段。例如，酶如Bbs I或定位诱变可以用来从基因的末端系统地切掉核苷酸。同样，可使用多种限制酶获得编码活性片段的部分基因。蛋白酶可用于直接获得这些蛋白质的活性片段。
蛋白质可被截短而仍保留功能活性在如本文中披露的本公开的实施方案的范围之内。关于“截短的蛋白质”是指蛋白质的一部分可以被切割掉，同时在切割之后剩下的截短的蛋白质保留并且展现出所希望的活性。可通过各种蛋白酶来实现切割。此外，可以使用分子生物学技术产生有效裂解的蛋白质，其中编码所述蛋白质的DNA碱基通过用限制内切核酸酶消化或本领域技术人员可获得的其他技术去除。在截短之后，所述蛋白质可以在异源系统如大肠杆菌、杆状病毒、基于植物的病毒系统、酵母等中表达，然后将其置于如本文中披露的除草剂耐受性生物测定法中来确定活性。在现有技术中熟知的是，可成功地产生截短蛋白，使得它们保留功能活性同时具有小于整个全长的序列。例如，可以截短(核心蛋白)形式使用B.t.蛋白(参见，例如，Hofte等(1989)、以及Adang等(1985))。如本文中使用的，术语“蛋白质”可包括功能活性截短。
在一些情况下，特别是对于在植物中表达时，使用表达截短蛋白质的截短基因可以是有利的。优选的截短基因通常编码40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的全长蛋白质。
术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可整体地源于天然基因，或由源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成、或甚至包括合成的DNA区段。本领域的技术人员理解的是，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或在不同的发育阶段、或响应于不同的环境条件或生理条件而指导基因的表达。引起基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到的是，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指将核酸序列在单个核酸片段上的关联使得一者的功能被另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，所述编码序列在所述启动子的转录控制之下)，则所述启动子是与所述编码序列可操作地连接的。编码序列可以有义方向或反义方向可操作地连接于调控序列。
如本文中使用的术语“表达”，是指源于本公开的实施方案的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可指将mRNA翻译成多肽。
如本文中使用的术语“过表达”，是指高于相同或相关基因的内源表达的表达。如果异源基因的表达高于与之相当的内源基因的表达，则所述异源基因被过表达。
如本文中使用的术语“转化”是指一种核酸或片段转移和整合到宿主生物中，导致在遗传上稳定的遗传。含有所述转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物。已知的转化方法包括根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导的转化、磷酸钙转化、聚凝胺转化、原生质体融合、电穿孔、超声方法(例如，声孔作用)、脂质体转化、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体、基因枪(微粒轰击)、碳化硅晶须介导的转化、气溶胶发射(aerosol beaming)、或PEG转化、以及其他可能的方法。
本文中使用的术语“质粒”和“载体”，是指额外的染色体元件，其经常携带不属于细胞中心代谢的部分的基因，并且常常是呈环状双链DNA分子的形式。这样的元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、源自任何来源的线性或环状单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已连接或重组成独特的结构，所述结构能够针对选择的基因产物将启动子片段和DNA序列连同合适的3'非翻译序列导入细胞中。
如本文中使用的术语“密码子简并性”是指在遗传密码中允许代码核苷酸序列变化而不影响所编码的多肽的氨基酸序列的性质。本领域技术人员熟知在详明给定的氨基酸的核苷酸密码子的使用中由特定宿主细胞展现的“密码子偏好性”。因此，当在宿主细胞中合成用于提高表达的基因时，令人希望的是设计其密码子使用频率接近所述宿主细胞的优选密码子使用频率的基因。
术语“密码子优化的”，当它是指用于转化不同的宿主的基因或核酸分子的编码区时，是指改变所述基因或所述核酸分子的编码区中的密码子，以反映宿主生物的典型密码子使用而不改变由DNA编码的多肽。这种优化包括用在该生物的基因中被更频繁地使用的一个或多个密码子取代至少一个、或多于一个、或相当多的密码子。
在包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的偏差允许在编码所述基因的序列中的变化。由于每个密码子由三个核苷酸组成，且包含DNA的核苷酸被限制为四种特定的碱基，有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(其余的三种密码子编码终止翻译的信号)。显示哪些密码子编码哪些氨基酸的“遗传密码”在本领域中普遍已知的。其结果是，许多氨基酸由一个以上密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四个三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六个三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一个三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组成在宽范围内变化而不改变由DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。
许多生物显示出使用特定密码子进行编码的偏好，以便在不断增长的肽链中插入特定的氨基酸。密码子偏好(或密码子偏倚、在生物之间密码子使用的差异)是由遗传密码的简并性提供的，并且在许多生物中有充分的记载。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率关联，而这又被认为特别依赖于被翻译的密码子的特性和特定转运RNA(tRNA)分子的可用性。选择的tRNA在细胞中的优势通常是在多肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可以将基因定制或设计为基于密码子优化在给定生物中的最佳基因表达。
鉴于大量可用于各种各样的动物、植物和微生物物种的基因序列，有可能计算密码子使用的相对频率。密码子使用表是容易获得的，例如，在www.kazusa.or.jp/codon/可获得的“Codon Usage Database(密码子使用数据库)”，并且这些表可以适合于多种方式。参见Nakamura等Nucl.Acids Res.28:292(2000)。利用这种表或相似的表，本领域的普通技术人员可以使这些频率适用于任何给定的多肽序列，以设计并产生编码所述多肽但使用针对给定物种优化的密码子的密码子优化的编码区的合成核酸片段。在一些实施方案中，本公开涉及如本文中进一步描述的dgt-14和/或本公开的其他辅助蛋白的密码子优化形式。
为了获得异源基因在植物中的高表达，可优选设计和重新工程改造所述基因，使得它们更有效地在植物细胞中表达，尤其可优选的是其中细菌基因期望被表达于双子叶植物细胞以及单子叶植物细胞中。编码DGT-14的野生型基因已被分离，并且编码所述预测的氨基酸序列的天然核苷酸序列可以GenBank登录号ZP_01452683找到，其通过提述以其整体并入本文。包含其中在GenBank登录号ZP_01452683的氨基酸残基111处的甘氨酸被修饰为丙氨酸的修饰的编码的蛋白序列被披露为SEQ ID NO:1。
本公开的实施方案涉及dgt-14的修饰，其中合成的dgt-14基因序列被设计为用于在植物中表达。显示了用于在单子叶植物和双子叶植物两者中表达相同DGT-14蛋白的优化dgt-14基因的设计，其中这个基因的蛋白编码区被重新工程改造用于最佳表达。本文中描述的是编码DGT-14多肽的优化核苷酸序列。两个这样的植物优化的dgt-14核苷酸序列显示在SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3中。修饰的核苷酸序列被称为双子叶植物优化的dgt-14(为SEQ ID NO:2)或单子叶植物优化的dgt-14(为SEQ ID NO:3)并提供在植物体内的草甘膦耐受性。
将SEQ ID NO:2的dgt-14核酸分子优化以改进在双子叶植物中的表达。将SEQ ID NO:3的dgt-14核酸分子优化以改进在单子叶植物中的表达。基于优选的密码子使用而选择密码子使用，在于它被重新设计，使得所述蛋白质由具有朝向单子叶植物和双子叶植物任一者的使用偏好的密码子编码，并且将有害序列和冗余限制性位点去除，以增加DGT-14多肽的转录/翻译效率，并促进DNA操作步骤。这样，DGT-14在植物中的表达将被提高，并且DGT-14将提供针对草甘膦应用的抗性。
同样，将具有SEQ ID NO:4的dgt-14(v6)核酸分子优化以提高在大肠杆菌中的表达。基于优选的大肠杆菌密码子使用而选择密码子使用，在于将dgt-14重新设计，使得所述蛋白质由具有朝向大肠杆菌使用的偏好的密码子编码。在重新设计过程中将有害序列和冗余限制性位点去除，以增加DGT-14编码序列的转录/翻译效率，并促进DNA操作步骤。这样，DGT-14在大肠杆菌中的表达导致针对DGT-14的酶学性质的稳健的蛋白质表达。
如在本领域中已知的术语“同一性百分比”(或“同一性％”)是在两个或更多个多肽序列或两个或更多个多核苷酸之间的关系，如通过比较这些序列所确定的。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，根据具体情况，如通过这些序列的字符串之间的匹配所确定的。“同一性”和“相似性”可以通过已知方法容易地计算出，这些方法包括但不限于以下文献中披露的那些：1.)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编)Oxford University:NY(1988)；2.)Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.编)Academic:NY(1993)；3.)Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编)Humania:NJ(1994)；4.)SequenceAnalysis in Molecular Biology(von Heinje,G.编)Academic(1987)；以及5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编)Stockton:NY(1991)。
用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。典型地，这样的技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由其编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸序列或氨基酸序列进行比较。也可以这种方式确定和比较基因组序列。一般而言，同一性是指两个多核苷酸序列或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸对应关系。两个或更多个序列(多核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的同一性百分比进行比较。两个序列(不论是核酸序列还是氨基酸序列)的同一性百分比是在两个对齐的序列之间准确匹配的数量除以较短序列的长度再乘以100。参见Russell,R.和Barton,G.,“Structural Features can be Unconserved in Proteins with Similar Folds,”J.Mol.Biol.244,332-350(1994)，在第337页，通过提述以其整体并入本文。
另外，确定同一性和相似性的方法被编码在可公开获得的计算机程序中。例如，可使用套件的AlignX程序(Invitrogen，Carlsbad，CA)或LASERGENE生物信息学计算套件的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)进行序列比对和同一性百分比计算。使用“Clustal比对方法”进行所述序列的多重比对，该方法涵盖若干种类的算法，包括相应于标记为Clustal V的比对方法(由Higgins和Sharp披露，CABIOS.5:151-153(1989)；Higgins，D.G.等，Comput.Appl.Biosci.，8:189-191(1992))并且发现于LASERGENE生物信息学计算套件的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.)中的“Clustal V比对方法”。就多重比对而言，默认值相应于缺口罚分＝10和缺口长度罚分＝10。使用Clustal方法的蛋白序列的成对比对和百分比同一性计算的默认参数为K元组(KTUPLE)＝1，缺口罚分＝3，窗口＝5，以及存储的对角线(DIAGONALS SAVED)＝5。就核酸而言，这些参数为K元组＝2，缺口罚分＝5，窗口＝4，以及存储的对角线＝4。在使用Clustal V程序的序列比对后，通过观看相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”是可能的。另外，也可以使用“Clustal W比对方法”，该方法相应于标记为Clustal W的比对方法(由Higgins和Sharp描述,CABIOS.5:151-153(1989)；Higgins,D.G.等，Comput.Appl.Biosci.8:189-191(1992))并且发现于LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.)的MegAlignTMv6.1程序中。用于多重比对的默认参数(缺口罚分＝10、缺口长度罚分＝0.2、延迟发散序列(Delay Divergen Seqs)(％)＝30、DNA转换权重(DNA Transition Weight)＝0.5、蛋白质权重矩阵(Protein Weight Matrix)＝Gonnet系列和DNA权重矩阵(DNA Weight Matrix)＝IUB)。在使用Clustal W程序的比对序列后，通过观看相同程序中的“序列距离”表获得“百分比同一性”是可能的。
本领域的技术人员很好地理解，多种程度的序列同一性可用于鉴定来自其他物种的多肽，其中这样的多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分比的有用例子包括但不限于：55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或者从55％至100％的任何整数百分比可用于描述本公开的实施方案，例如55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。适合的核酸片段不但具有上述同源性，而且通常编码具有至少50个氨基酸，优选至少100个氨基酸，更优选至少150个氨基酸，还更优选至少200个氨基酸，且最优选至少250个氨基酸的多肽。
术语“序列分析软件”指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：1)GCG程序软件包(Wisconsin Package Version 9.0,GeneticsComputer Group(GCG),Madison,WI)；2)BLASTP,BLASTN,BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)；3)DNASTAR(DNASTAR,Inc.Madison,WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)；和5)结合了Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson,Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994),Meeting Date 1992,111-20.Editor(s)：Suhai，Sandor.Plenum＝New York,NY)。在本专利申请的上下文中应当理解，在使用序列分析软件进行分析时，分析结果将基于所参考的程序的“默认值”，除非另外指明。如在此所使用的“默认值”将指在首次初始化软件时最初加载的任何值或参数集。
当提及杂交技术时，已知核苷酸序列的全部或部分被用作探针，所述探针选择性地与存在于来自选择的生物的一组克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中的其他相应的核苷酸序列杂交。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、质粒DNA片段、cDNA片段、RNA片段、PCR扩增的DNA片段、寡核苷酸、或其他多核苷酸，并且可以被标记有可检测的基团如32P或任何其他检测标记。因而，例如，用于杂交的探针可以通过标记基于本公开的实施方案的DNA序列的合成寡核苷酸而制成。用于制备杂交探针和用于构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知和披露(Sambrook等，1989)。
本公开的实施方案的核酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。可使用任何常规核酸杂交或扩增方法以鉴定样品中来自转基因事件的DNA的存在。核酸分子或其片段能够在某些情况下与其他核酸分子特异性杂交。如本文中使用的，如果两个核酸分子能够形成反平行双链核酸结构，则称这两个核酸分子能够彼此特异性杂交。如果两个核酸分子呈现完全互补性，则称一个核酸分子为另一个核酸分子的“互补物”。如本文中使用的，当一个分子的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，称这些分子呈现“完全互补性”。呈现完全互补性的分子通常以足够的稳定性相互杂交以允许其在常规的“高严格”条件下保持退火至彼此。常规的高严格条件由Sambrook等(1989)描述。
如果两个分子可以以足够的稳定性相互杂交以允许其在至少常规的“低严格”条件下保持退火至彼此，则称其为呈现“最小互补性”。常规的低严格条件由Sambrook等(1989)描述。为了使核酸分子充当引物或探针，仅需其呈现序列的最小互补性，以便能够在采用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
影响杂交严格性的因素对于本领域技术人员是熟知的，并包括，但不限于，温度、pH、离子强度、以及有机溶剂例如像甲酰胺和二甲亚砜的浓度。正如本领域技术人员已知，杂交严格性随着更高的温度、更低的离子强度和更低的溶剂浓度而增加。
术语“严格条件”或“严格性条件”是关于核酸探针与靶核酸(即，与特定的目的核酸序列)通过Sambrook等，1989在9.52-9.55处讨论的特异性杂交步骤杂交而功能限定。还参见Sambrook等，1989，9.47-9.52和9.56-9.58。
通常，严格条件是这些：其中盐浓度小于约1.5M Na+离子、通常在pH 7.0至8.3下约0.01至1.0M Na+离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如，10至50个核苷酸)温度为至少约30℃而对于长探针(例如，大于50个核苷酸)为至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂(例如甲酰胺)实现严格条件。示例性的低严格条件包括用30％至35％的甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液中在37℃杂交，并且在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0MNaCl/0.3M枸橼酸三钠)中在50至55℃洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、0.1％SDS中在37℃杂交，并且在0.5X至1X SSC中在55至60℃洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1.0MNaCl、0.1％SDS中在37℃杂交，并且在0.1X SSC在60至65℃洗涤。
特异性通常取决于杂交后的洗涤，关键因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可根据方程Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form.)-500/L粗略估计Tm，其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中的鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是以碱基对表示的杂交体的长度(Meinkoth和Wahl,1984)。Tm是50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。对于每1％错配，Tm降低约1℃；因此，可调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以便具有所希望的同一性的序列杂交。例如，如果寻找具有90％同一性的序列，则可将Tm降低10℃。一般而言，将严格条件选择为比特异性序列及其互补物在限定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。然而，极严格条件可利用低于热熔点(Tm)1℃、2℃、3℃或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可利用低于热熔点(Tm)6℃、7℃、8℃、9℃或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可利用低于热熔点(Tm)11℃到20℃的杂交和/或洗涤。使用所述方程、杂交和洗涤组成以及所希望的Tm，本领域普通技术人员了解的是，固有地描述了杂交和/或洗涤溶液严格性的变化。如果所希望的错配程度导致Tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度，从而可使用较高温度。对核酸杂交的广泛指导见于(1997)Ausubel等,Short Protocols inMolecular Biology，第2-40页，第三版(1997)和Sambrook等(1989)。
在此所用的标准重组DNA技术和分子克隆技术是本领域熟知的并且描述如下：例如由Sambrook等的Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)；以及由Silhavy等的Experiments with Gene Fusions,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1984)；以及Ausubel等的CurrentProtocols in Molecular Biology,由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)出版。
本文中披露的重组宿主的遗传操作可使用标准遗传技术和筛选来执行，并且可以在适合于遗传操作的任何宿主细胞中进行。在一些实施方案中，本文中披露的重组宿主细胞可以是对于遗传修饰和重组基因表达有用的任何生物或微生物宿主。在一些实施方案中，重组宿主可以是但不限于任何高等植物，包括双子叶植物和单子叶植物两者，以及消费性植物，包括使用其油脂的作物植物和植物。因此，可如以下面进一步描述选择任何植物物种或植物细胞。
在一些实施方案中，根据本公开进行遗传修饰的植物(例如，植物宿主细胞)包括但不限于，任何高等植物，包括双子叶植物和单子叶植物两者，特别是消费性植物，包括作物植物。这样的植物可以包括但不限于，例如：苜蓿(alfalfa)、大豆、棉花、油菜籽(也被描述为卡诺拉/芸苔(canola))、亚麻子、玉米、水稻、臂形草(brachiaria)、小麦、红花、高粱、糖用甜菜、向日葵、烟草和草坪草(turf grass)。因此，可以选择任何植物物种或植物细胞。在实施方案中，本文中使用的植物细胞以及由其培育或衍生的植物包括但不限于：从如下可得到的细胞：欧洲油菜(Brassica napus)；印度芥菜(芥菜型油菜(Brassicajuncea))；埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)；萝卜(turnip)(芜菁(Brassica rapa))；卷心菜(cabbage)(甘蓝(Brassica oleracea))；大豆(Glycine max)；亚麻子/亚麻(Linum usitatissimum)；玉米(也描述为玉蜀黍(Zea mays))；红花(Carthamustinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)；巴西坚果(Betholettia excelsa)；蓖麻(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；香菜(芫荽(Coriandrum sativum))；棉(棉属物种(Gossypiumspp.))；落花生(Arachis hypogaea)；希蒙得木(Simmondsia chinensis)；油棕(Elaeisguineeis)；橄榄(Olea eurpaea)；大米(水稻(Oryza sativa))；南瓜(笋瓜(Cucurbitamaxima))；大麦(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；大米(水稻)；小麦(小麦属物种(Triticum spp.)，包括硬粒小麦(Triticum durum)和普通小麦(Triticum aestivum))；和浮萍(浮萍科物种(Lemnaceae sp.))。在一些实施方案中，在植物物种之内的遗传背景可以变化。
如本文中使用的“植物部分”包括植物的任何部分，包括但不限于，种子(包括成熟种子和未成熟的种子)、植物插枝(plant cutting)、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、花粉、胚、花、果实、芽(shoots)、叶、根、茎、外植体等等。植物细胞是植物的结构和生理单位，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可以呈分离的单细胞或细胞聚集体的形式，如易碎的愈伤组织、或培养的细胞，或者可以是更高的有组织的单位的一部分，例如，植物组织、植物器官、或植物。因而，植物细胞可以是原生质体、产生配子的细胞、或可以再生成为整株植物的细胞或细胞的集合。如此，包含多个植物细胞并且能够再生为完整的植物的种子被认为是用于本公开目的的植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织、或组织成结构和功能单位的任何其他组的植物细胞。特别有用的植物部分包括可收获部分和用于后代植物繁殖的部分。植物的可收获部分可以是植物的任何有用部分，例如，花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根，等等。可用于繁殖的植物部分包括，例如，种子、果实、扦枝、苗、块茎、根茎，等等。组织培养优选能够再生具有前述近交植物的生理学和形态学特征的植物，并能够再生与上述近交植物具有基本相同的基因型的植物。相反，一些植物细胞不能够被再生而产生植物。优选地，在这样的组织培养物中的可再生细胞将是胚、原生质体、分生组织细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、穗丝、花、核、穗、穗轴、壳或茎。更进一步地，本公开的实施方案提供了从本公开的实施方案的组织培养物再生的植物。
关于遗传修饰植物的生产，用于植物的基因工程的方法在本领域中是熟知的。例如，已经开发了用于植物转化的多种方法，包括双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如，Goto-Fumiyuki等，Nature Biotech17:282-286(1999)；Miki等，Methods in Plant Molecular Biology andBiotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993))。另外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法是可获得的，例如，见于Gruber等，Methods in Plant Molecular Biologyand Biotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编，CRC Press，Inc.，BocaRaton，pp.89-119(1993)。
大量技术可用于将DNA插入植物宿主细胞中。这些技术包括使用根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌作为转化剂用卸甲(disarmed)T-DNA转化、磷酸钙转染、聚凝胺转化、原生质体融合、电穿孔、超声方法(例如，声孔作用)、脂质体转化、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体、基因枪(微粒轰击)、碳化硅WHISKERSTM介导的转化、气溶胶发射(aerosol beaming)、或PEG、以及其他可能的方法。
例如，使用技术例如植物细胞原生质体的电穿孔和微注射可以将DNA构建体直接导入到植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用基因枪法如DNA粒子轰击将DNA构建体直接导入到植物组织中(参见，例如，Klein等(1987)Nature 327:70-73)。另外的用于植物细胞转化的方法包括经由碳化硅晶须(WHISKERS)介导的DNA摄取的显微注射(Kaeppler等(1990)Plant CellReporter 9:415-418)。替代地，可通过纳米颗粒转化将DNA构建体导入植物细胞中(参见，例如，美国专利申请号12/245,685，通过提述以其整体并入本文)。
植物转化的另一种已知方法是微粒介导的转化，其中DNA被携带在微粒的表面上。在这种方法中，用基因枪装置将表达载体导入植物组织中，所述基因枪装置使所述微粒加速达到足以穿透植物细胞壁和细胞膜的速度。Sanford等，Part.Sci.Technol.5:27(1987)，Sanford，J.C.，Trends Biotech.6:299(1988)，Sanford，J.C.，Physiol.Plant 79:206(1990)，Klein等，Biotechnology 10:268(1992)。
替代地，基因转移和转化方法包括但不限于，通过氯化钙沉淀的原生质体转化、聚乙二醇(PEG)-或电穿孔-介导的裸DNA的摄取(参见Paszkowski等(1984)EMBO J 3:2717-2722，Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Fromm等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 82:5824-5828；和及Shimamoto(1989)Nature 338:274-276)以及植物组织的电穿孔(D’Halluin等(1992)Plant Cell4:1495-1505)。
用于将表达载体导入植物中的广泛使用的方法是基于土壤杆菌的天然转化系统的。Horsch等，Science 227:1229(1985)。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌是已知用于遗传转化植物细胞的植物病原性土壤细菌。根癌土壤杆菌和毛根土壤杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。Kado，C.I.，Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)。用于土壤杆菌介导的基因转移的土壤杆菌载体系统和方法的描述也是可获得的，例如，Gruber等，上文，Miki等，上文，Moloney等，Plant Cell Reports 8:238(1989)，以及美国专利号4,940,838和5,464,763。
如果土壤杆菌用于转化，应当将有待被插入的DNA克隆到特殊的质粒中，即，进入中间载体或二元载体中。在土壤杆菌属中，中间质粒不能复制它们自身。可以借助于辅助质粒将中间质粒转移进根癌土壤杆菌中(接合)。日本烟草超二元系统(Japan Tobacco Superbinary system)是这种系统的例子(由Komari等综述，(2006)见于:Methods in Molecular Biology(K.Wang编)No.343:Agrobacterium Protocols(第二版，第1卷)HUMANA PRESS Inc.，Totowa，NJ，pp.15-41；和Komori等，(2007)Plant Physiol.145:1155-1160)。二元载体在大肠杆菌和土壤杆菌属两者中可以复制它们自身。它们包含由右边和左边T-DNA边界区加外框的选择标记基因和接头或多聚接头。它们可以被直接转化到土壤杆菌属中(Holsters,1978)。用作宿主细胞的土壤杆菌属将包含携带vir区的质粒。Ti或Ri质粒还包含T-DNA转移所必需的vir区。vir区对于将T-DNA转移到植物细胞中是必需的。可含有另外的T-DNA。
当细胞被细菌感染时，利用二元T-DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-8721)或共-培养程序(Horsch等(1985)Science 227:1229-1231)，根癌土壤杆菌宿主的毒力功能将指导含有构建体和邻近标记的T-链插入植物细胞DNA中。通常，土壤杆菌转化系统用于将双子叶植物工程改造(Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet 16:357-384；Rogers等(1986)Methods Enzymol.118:627-641)。土壤杆菌转化系统也可以用于将DNA转化以及转移到单子叶植物和植物细胞中。参见美国专利号5,591,616；Hernalsteen等(1984)EMBO J 3:3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等(1984)Nature 311:763-764；Grimsley等(1987)Nature325:1677-179；Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40；和Gould等(1991)Plant Physiol.95:426-434。在将遗传构建体导入植物细胞中之后，可以培育植物细胞，并且在分化组织如芽和根出现之后，可以产生成熟的植物。在一些实施方案中，可产生多株植物。用于再生植物的方法对于本领域普通技术人员是已知的，且可发现于例如Plant Cell and Tissue Culture，1994，Vasil和Thorpe编，Kluwer Academic Publishers，并见于:Plant Cell Culture Protocols(Methodsin Molecular Biology 111，1999Hall编，Humana Press)。可以在发酵培养基中培养或在适合的培养基如土壤中培育本文中描述的遗传修饰植物。在一些实施方案中，用于高等植物的适合生长培养基可包括用于植物的任何生长培养基，包括但不限于，土壤、砂、支持根生长的任何其它颗粒介质(例如蛭石、珍珠岩等)或水培培养、以及适当的光、水和优化高等植物生长的营养补充剂。
可以培养由上述任何一种转化技术产生的转化植物细胞而再生具有转化的基因型并因此所希望的表型的整株植物。这样的再生技术依赖于组织培养生长培养基中的某些植物激素的操纵，通常依赖于已经与所希望的核苷酸序列一起导入的杀生物剂和/或除草剂标记。从培养的原生质体再生植株描述于Evans等的“Protoplasts Isolation and Culture”见于Handbook of Plant Cell Culture，pp.124-176，Macmillian Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得。这样的再生技术在通常描述于Klee等(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486。
在其他实施方案中，所述转化的植物细胞不能够再生而产生植物。可以在例如开发具有相关表型例如除草剂抗性的植物细胞系中采用这样的细胞。
导入植物细胞中的核酸可用于在基本上任何植物上赋予所希望的性状。使用本公开的核酸构建体和上述各种转化方法，可将各种各样的植物和植物细胞系统工程改造为本文中描述的所希望的生理学和农艺特性。在优选的实施方案中，用于工程改造的靶植物和植物细胞包括但不限于，单子叶植物和双子叶植物，比如作物包括谷类作物(如小麦、玉蜀黍、水稻、小米、大麦)、果实作物(如番茄、苹果、梨、草莓、柑桔类)、饲料作物(如苜蓿)、根蔬菜作物(如胡萝卜、马铃薯、糖用甜菜、山药)、叶菜类蔬菜作物(如莴苣、菠菜)；开花植物(如，牵牛花、玫瑰、菊花)、针叶树和松树(例如，松树枞树/冷杉、云杉)；在植物修复中使用的植物(例如，重金属积累植物)；油料作物(例如，向日葵、油菜籽)和用于实验目的植物(例如，拟南芥)。因此，所披露的方法和组合物用于宽范围的植物，包括但不限于来自天门冬属、燕麦属、芸苔属、柑桔属、西瓜属、辣椒属、南瓜属、胡萝卜属、飞蓬属、大豆属、棉属、大麦属、莴苣属、黑麦草属、番茄属、苹果属、木薯属、烟草属、诸葛菜属、稻属、鳄梨属、菜豆属、豌豆属、梨属、李属、萝卜属、黑麦属、茄属、高粱属、小麦属、葡萄属、豇豆属和玉蜀黍的种类。
通过选择或筛选工程改造的植物材料的由存在于转化DNA上的标记基因编码的性状，可以鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的向转化基因构建体赋予抗性的抗生素或除草剂的培养基中培育工程改造的植物材料进行选择。此外，也可通过筛选可能存在于重组核酸构建体上的任何可见标记基因(例如，β-葡糖醛酸糖苷酶、荧光素酶、或gfp基因)的活性来鉴定转化的植物和植物细胞。这样的选择和筛选方法对于本领域技术人员是熟知的。
在将核酸插入细胞中的背景下的术语“导入”，包括转化到细胞中、以及使具有所述序列的植物与另一种植物杂交，使得所述第二植物包含如在常规植物育种技术中的异源序列。这样的育种技术对于本领域技术人员是熟知的。对于植物育种技术的讨论，请参见Poehlman(1995)Breeding Field Crops，AVIPublication Co.，Westport Conn，第4版。可以使用回交方法将基因导入到植物中。几十年来这种技术用于将性状导入到植物中。描述熟知的这种和其他的植物育种方法的例子可以发现于参考文献例如Poehlman，上文，以及PlantBreeding Methodology，Neal Jensen编，John Wiley&Sons，Inc.(1988)中。在一个典型的回交方案中，使感兴趣的原始品种(轮回亲本)与携带要被转移的感兴趣的单个基因的第二个品种(非轮回亲本)杂交。然后使从这种杂交得到的子代再与所述轮回亲本杂交，并且重复该过程，直到获得植物时为止，其中除了来自非轮回亲本的单个转移的基因之外，所述轮回亲本的基本上所有的所希望的形态学和生理学特性被回复在转换的植物中。
某些实施方案涉及使用本公开实施方案的植物作为至少一个亲本产生杂交体的过程。例如，特定的实施例涉及具有任何本文中例示的植物作为一个亲本或两个亲本的F1杂交植物。其他实施方案涉及由这样的F1杂交体产生的种子。还有其他实施方案涉及通过使例示的植物与不同的(如近交亲本)植物杂交并收获得到的杂交种子而产生F1杂交种子的方法。其它实施方案涉及作为母本或父本的例示植物。可以通过仔细考虑亲本植物而改进得到的植物的特性。
通过首先使包含从本文中提及的任何一个品系的种子培育的植物的第一亲本植物与第二亲本植物有性杂交，从而产生多个第一子代植物；然后选择抗草甘膦的第一子代植物；使第一子代植物自交，从而产生多个第二子代植物；然后从第二子代植物中选择抗草甘膦的植物，可培育出题述公开的实施方案的含有dgt-14多核苷酸的转基因植物。这些步骤可以进一步包括使第一子代植物中或第二子代植物与所述第二亲本植物或第三亲本植物回交。然后可以种植包含特定实施方案的种子的作物或其后代。
还应当理解的是，也可以使两种不同的转基因植物交配而产生含有两个独立分离的、添加的外源基因的后代。适当子代的自交能够产生对于两个添加的外源基因而言是纯合子的植物。还考虑与亲本植物回交以及与非转基因植物异型杂交，就像营养繁殖一样。通常用于不同性状和作物的其他育种方法是本领域已知的。回交育种已经用于将基因的简单遗传的、高度可遗传的性状转移到作为轮回亲本的令人希望的纯合栽培种或近交系中。将要被转移的性状的来源被称为供体亲本。得到的植物可望具有轮回亲本(例如栽培种)的属性以及令人希望的转移自供体亲本的性状。在初始杂交之后，选择具有供体亲本表型的个体，并使其重复地与轮回亲本杂交(回交)。得到的亲本可望具有轮回亲本(例如栽培种)的属性以及令人希望的转移自供体亲本的性状。
可以将编码如本文中所述的dgt-14核苷酸序列的核酸克隆到载体中，然后转化到原核或真核细胞中进行复制和/或表达。载体可以是原核载体例如质粒，或穿梭载体、昆虫载体、或真核载体。也可以将编码dgt-14多核苷酸的核酸克隆到表达载体中，然后施用至植物细胞。有时，具有在大肠杆菌中有功能的载体(例如，产生用于提高抗体的蛋白质、DNA序列分析、插入物的构建、获得大量核酸)可能是优选的。
为了表达dgt-14蛋白，通常将编码dgt-14序列的核苷酸序列亚克隆到含有指导转录的启动子的表达载体中。适合的细菌启动子和真核启动子是本领域熟知的并且例如描述于Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第2版1989；第3版2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression:A LaboratoryManual(1990)；和Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，上文)中。用于表达dgt-14序列的细菌表达系统可获自例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、和沙门菌属(Salmonella)(Palva等，Gene 22:229-235(1983))。用于这样的表达系统的试剂盒是可商购的。用于哺乳动物细胞、酵母、和昆虫细胞的真核表达系统是本领域技术人员熟知的，并且也是可商购的。
针对DGT-14蛋白的预期用途而选择用于将遗传信息运输到细胞中的具体表达载体，例如，在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中表达。标准细菌和动物表达载体是本领域已知的，并详细描述于例如美国专利公开20050064474A1和国际专利公开WO 05/084190、WO05/014791和WO03/080809中。可以使用标准转染方法来产生表达大量蛋白质的细菌细胞系，然后可利用标准技术将所述蛋白质纯化。
用来指导dgt-14编码核酸的表达的启动子取决于特定的应用。例如，适合于宿主细胞的强组成型启动子通常用于DGT-14蛋白的表达和纯化。优选的植物启动子的非限制性实例包括源于拟南芥泛素10(UBI-10)(Callis等，1990，J.Biol.Chem.，265:12486-12493)；根癌土壤杆菌甘露碱合酶(Δmas)(Petolino等，美国专利号6,730,824)；和/或木薯属脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer等，1996，Plant Molecular Biology 31:1129-1139)的启动子序列。
在本文中披露的方法中，可以采用指导基因在植物中表达的许多启动子。这样的启动子可以选自组成型启动子、化学调节型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、以及种子优选的启动子。
组成型启动子包括，例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(Odell等(1985)Nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等(1990)Plant Cell2:163-171)；玉米泛素启动子(美国专利号5,510,474；Christensen等(1989)PlantMol.Biol.12:619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU启动子(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)；玉米组蛋白启动子(Chabouté等Plant Molecular Biology，8:179-191(1987))；等等。
可用的植物相容性启动子的范围包括组织特异性启动子和诱导型启动子。诱导型调控元件是响应于诱导剂能够直接或间接激活一种或多种DNA序列或基因的转录的元件。在没有诱导物时，DNA序列或基因将不被转录。特异性地结合诱导型调控元件来激活转录的蛋白因子通常以无活性的形式存在，然后其经由所述诱导物直接或间接地转化为活性形式。所述诱导物可以是化学试剂，如蛋白质、代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加或通过病原体或病原如病毒的作用间接施加的生理应激。特异性地结合诱导型调控元件来激活转录的蛋白因子通常以无活性的形式存在，然后其经由所述诱导物直接或间接地转化为活性形式。所述诱导物可以是化学试剂，如蛋白质、代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或通过热、冷、盐、或有毒元素直接施加或通过病原体或疾病因子如病毒的作用间接施加的生理应激。可以通过向细胞或植物从外部施加诱导物，例如通过喷施、浇灌、加热或类似方法，使含有诱导型调控元件的植物细胞暴露于所述诱导物。
在本公开的实施方案中可使用任何诱导型启动子。参见Ward等Plant Mol.Biol.22:361-366(1993)。示例性诱导型启动子包括蜕皮激素受体启动子(美国专利号6,504,082)；响应于铜的来自ACE1系统的启动子(Mett等PNAS 90:4567-4571(1993))；响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2-1和In2-2基因(美国专利号5,364,780；Hershey等，Mol.Gen.Genetics 227:229-237(1991)和Gatz等，Mol.Gen.Genetics 243:32-38(1994))；来自Tn10的Tet阻抑物(Gatz等，Mol.Gen.Genet.227:229-237(1991)；或来自类固醇激素基因的启动子，其转录活性由糖皮质类固醇激素诱导，Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421(1991)和McNellis等，(1998)Plant J.14(2):247-257；经由用作芽前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉米GST启动子(参见美国专利号5,965,387和国际专利申请公开号WO 93/001294)；和经由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子(参见Ono S，Kusama M，Ogura R，Hiratsuka K.，“Evaluation ofthe Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression bythe Luciferase Bioluminescence Reporter System,”Biosci Biotechnol Biochem.2011Sep 23；75(9):1796-800)。其他感兴趣的化学调控型启动子包括四环素诱导型启动子和四环素阻遏型启动子(参见，例如，Gatz等，(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，和美国专利号5,814,618和5,789,156)。
其他感兴趣的可调控启动子包括其转录可分别响应于暴露于冷或热而产生的冷应答调控元件或热休克调控元件(Takahashi等，Plant Physiol.99:383-390，1992)；醇脱氢酶基因的启动子(Gerlach等，PNAS USA 79:2981-2985(1982)；Walker等，PNAS 84(19):6624-6628(1987))，可由厌氧条件诱导；以及源于豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因的光诱导型启动子(Yamamoto等(1997)Plant J.12(2):255-265)；光诱导型调节元件(Feinbaum等，Mol.Gen.Genet.226:449，1991；Lam和Chua，Science 248:471，1990；Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(20):9586-9590；Orozco等(1993)Plant Mol.Bio.23(6):1129-1138)，植物激素诱导型调控元件(Yamaguchi-Shinozaki等，Plant Mol.Biol.15:905，1990；Kares等，Plant Mol.Biol.15:225，1990)，等等。诱导型元件也可以是响应于苯磺酰胺除草剂安全剂的玉米In2-1或In2-2基因的启动子(Hershey等，Mol.Gen.Genet.227:229-237，1991；Gatz等，Mol.Gen.Genet.243:32-38，1994)、以及转座子Tn10的Tet阻抑物(Gatz等，Mol.Gen.Genet.227:229-237，1991)。应激诱导型启动子包括盐/水诱导型启动子，如P5CS(Zang等(1997)Plant Sciences 129:81-89)；冷诱导型启动子，如cor15a(Hajela等(1990)Plant Physiol.93:1246-1252)、cor15b(Wilhelm等(1993)Plant Mol.Biol.23:1073-1077)、wsc120(Ouellet等(1998)FEBS Lett.423-324-328)、ci7(Kirch等(1997)Plant Mol.Biol.33:897-909)、ci21A(Schneider等(1997)Plant Physiol.113:335-45)；干旱诱导型启动子，如Trg-31(Chaudhary等(1996)Plant Mol.Biol.30:1247-57)、rd29(Kasuga等(1999)Nature Biotechnology 18:287-291)；渗透压诱导型启动子，如Rab17(Vilardell等(1991)Plant Mol.Biol.17:985-93)和渗调蛋白(Raghothama等(1993)Plant Mol.Biol.23:1117-28)；和热诱导型启动子，如热休克蛋白(Barros等(1992)Plant Mol.19:665-75；Marrs等(1993)Dev.Genet.14:27-41)、smHSP(Waters等(1996)J.Experimental Botany 47:325-338)、以及来自欧芹泛素启动子的热休克诱导型元件(WO 03/102198)。其他应激诱导型启动子包括rip2(美国专利号5,332,808和美国公开号2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozaki等(1993)Mol.Gen.Genetics 236:331-340)。某些启动子可由创伤诱导，包括土壤杆菌pMAS启动子(Guevara-Garcia等(1993)Plant J.4(3):495-505)和土壤杆菌ORF13启动子(Hansen等，(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)。
组织优选启动子可用于在特定植物组织内靶向增强的转录和/或表达。当提及优先表达时，含义是指相比于在其他植物组织中的在特定植物组织中更高水平的表达。这些类型的启动子的例子包括种子优选表达，例如由菜豆蛋白启动子(Bustos等1989.The Plant Cell Vol.1，839-853)、以及玉米球蛋白-1基因(Belanger等1991Genetics 129:863-972)提供的。对于双子叶植物，种子优选启动子包括但不限于豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)，等等。对于单子叶植物，种子优选启动子包括但不限于，玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、γ-玉米醇溶蛋白、蜡质、超甜基因(shrunken)1、超甜基因2、球蛋白1，等等。种子优选启动子也包括主要对种子内的特异性组织指导基因表达的那些启动子，例如像γ-玉米醇溶蛋白的胚乳优选启动子、来自烟草的隐含启动子(Fobert等1994，T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoterin tobacco.Plant J.4:567-577)、来自玉米的P-基因启动子(Chopra等1996.Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encodeMyb-homologous proteins with C-terminal replacements.Plant Cell 7:1149-1158，Erratum in Plant Cell 1997，1:109)、来自玉米的球蛋白-1启动子(Belenger和Kriz.1991.Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1gene.Genetics 129:863-972)、以及对玉米粒的种皮或壳指导表达的启动子，例如果皮特异性谷氨酰胺合成酶启动子(Muhitch等,2002.Isolation of a PromoterSequence From the Glutamine Synthetase1-2Gene Capable of ConferringTissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize.Plant Science163:865-872)。
除了启动子之外，表达载体通常含有转录单位或表达盒，所述转录单位或表达盒包含在宿主细胞(原核或真核细胞)中的核酸的表达所需要的所有另外的元件。因而，典型的表达盒含有可操作地连接到例如编码蛋白质的核酸序列上的启动子、以及例如用于转录物的有效多腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点、或翻译终止所需要的信号。表达盒的附加元件可包括，例如，增强子和异源剪接信号。
可以包括所述载体的其他组分，这也取决于基因的预期用途。例子包括选择标记、靶向序列或调控序列、转运肽序列如优化的转运肽序列(参见美国专利号5,510,471)稳定序列，如RB7MAR(参见Thompson和Myatt，(1997)PlantMol.Biol.，34:687-692和WO9727207)或前导序列、内含子等等。植物表达载体和报告基因的一般描述和实例可见于Gruber等，“Vectors for PlantTransformation”in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick等编；CRC Press pp.89-119(1993)。适当的表达载体的选择将取决于宿主和将所述表达载体导入所述宿主中的方法。所述表达盒还包括在植物中起作用的在感兴趣的异源核苷酸序列的3'末端的转录终止区和翻译终止区。所述终止区可以与本公开的实施方案的启动子核苷酸序列是天然的，可以与感兴趣的DNA序列是天然的，或者可以从另一个来源获得。合宜的终止区可从根癌土壤杆菌的Ti质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶(nos)终止区(Depicker等，Mol.andAppl.Genet.1:561-573(1982)和Shaw等(1984)Nucleic Acids Research vol.12，No.20pp7831-7846(nos))；也参见Guerineau等Mol.Gen.Genet.262:141-144(1991)；Proudfoot，Cell 64:671-674(1991)；Sanfacon等Genes Dev.5:141-149(1991)；Mogen等Plant Cell 2:1261-1272(1990)；Munroe等Gene 91:151-158(1990)；Ballas等Nucleic Acids Res.17:7891-7903(1989)；Joshi等Nucleic AcidRes.15:9627-9639(1987)。
所述表达盒可以另外含有5'前导序列。这样的前导序列可用于增强翻译。翻译前导序列在本领域中已知并且包括，例如微小核糖核酸病毒前导序列、EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)、Elroy-Stein等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 86:6126-6130(1989)；马铃薯Y病毒前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)，Carrington和Freed，Journal of Virology，64:1590-1597(1990)，MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)，Allison等，Virology 154:9-20(1986)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，Macejak等，Nature 353:90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(AMV RNA 4)，Jobling等Nature 325:622-625(1987)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)，Gallie等(1989)Molecular Biology of RNA，237-256页；和玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)Lommel等Virology 81:382-385(1991)。也参见Della-Cioppa等PlantPhysiology 84:965-968(1987)。
所述构建体还可以含有增强翻译和/或mRNA的稳定性的序列，如内含子。一个这样的内含子的例子是拟南芥组蛋白H3.III变体的基因II的第一内含子。Chaubet等Journal of Molecular Biology，225:569-574(1992)。
在希望将异源核苷酸序列的表达产物定向到特定的细胞器特别是质体、淀粉体，或定向到内质网，或分泌在细胞表面或细胞外的那些情况下，表达盒还可以进一步包含转运肽的编码序列。这样的转运肽在本领域中是熟知的并且包括但不限于，用于酰基载体蛋白的转运肽、RUBISCO的小亚基、植物EPSP合酶以及向日葵(Helianthus annuus)(参见Lebrun等美国专利5,510,417)、玉蜀黍(Zea mays)Brittle-1叶绿体转运肽(Nelson等Plant Physiol 117(4):1235-1252(1998)；Sullivan等Plant Cell 3(12):1337-48；Sullivan等，Planta(1995)196(3):477-84；Sullivan等，J.Biol.Chem.(1992)267(26):18999-9004)等等。另外，嵌合叶绿体转运肽是本领域已知的，如优化的转运肽(参见美国专利号5,510,471)。另外的叶绿体转运肽先前已经描述于美国专利号5,717,084；5,728,925。本领域技术人员将很容易理解在将产物表达到特定细胞器中可用的许多选项。例如，大麦α淀粉酶序列通常被用于直接表达于内质网(Rogers,J.Biol.Chem.260:3731-3738(1985))。
本领域技术人员应当理解，通过操纵例如核酸分子在宿主细胞内的拷贝数、这些核酸分子转录的效率、所得到的转录物被翻译的效率、以及翻译后修饰的效率，使用重组DNA技术可以改进转染的核酸分子的表达控制。另外，所述启动子序列可能被基因工程改造以相比于天然启动子而提高表达水平。用于控制核酸分子表达的重组技术包括但不限于：核酸分子稳定地整合到一个或多个宿主细胞染色体中，将载体稳定性序列添加到质粒上，转录控制信号(例如，启动子、操纵基因、增强子)的取代或修饰，翻译控制信号(例如，核糖体结合位点、Shine-Dalgarno或Kozak序列)的取代或修饰，相应于宿主细胞的密码子使用的核酸分子的修饰，以及使转录物去稳定的序列的缺失。
用于选择转化的细胞或组织或植物部分或植物的报告基因或标记基因可以被包括在转化载体中。选择标记的例子包括赋予针对抗代谢物例如除草剂或抗生素的抗性的那些标记，例如赋予针对甲氨蝶呤的抗性的二氢叶酸还原酶(Reiss，Plant Physiol.(Life Sci.Adv.)13:143-149，1994；还参见Herrera Estrella等，Nature 303:209-213，1983；Meijer等，Plant Mol.Biol.16:807-820，1991)；赋予针对氨基糖苷类新霉素、卡那霉素、以及巴龙霉素的抗性的新霉素磷酸转移酶(Herrera-Estrella，EMBO J.2:987-995，1983和Fraley等Proc.Natl.Acad.Sci USA 80:4803(1983))，和赋予针对潮霉素的抗性的潮霉素磷酸转移酶(Marsh，Gene 32:481-485，1984；还参见Waldron等，Plant Mol.Biol.5:103-108，1985；Zhijian等，Plant Science 108:219-227，1995)；允许细胞利用吲哚而不是色氨酸的trpB；允许细胞利用组氨醇而不是组氨酸的hisD(Hartman，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 85:8047，1988)；允许细胞利用甘露糖的甘露糖-6-磷酸异构酶(WO 94/20627)；赋予针对鸟氨酸脱羧酶抑制剂的抗体的鸟氨酸脱羧酶、2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸(DFMO；McConlogue，1987，见于：CurrentCommunications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory ed.)；以及赋予针对杀稻瘟素(Blasticidin)S的抗性的来自土曲霉(Aspergillus terreus)的脱氨酶(Tamura，Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338，1995)。
另外的选择标记包括，例如，赋予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突变体乙酰乳酸合成酶，(Lee等，EMBO J.7:1241-1248，1988)、赋予针对阿特拉津的抗性的突变体psbA(Smeda等，Plant Physiol.103:911-917，1993)、或突变体原卟啉原氧化酶(参见美国专利号5,767,373)、或赋予针对除草剂例如草丁膦的抗性的其他标记。适合的选择标记基因的例子包括但不限于，编码针对以下物质的抗性的基因：氯霉素(Herrera Estrella等，EMBO J.2:987-992，1983)；链霉素(Jones等，Mol.Gen.Genet.210:86-91，1987)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard等，Transgenic Res.5:131-137，1996)；博来霉素(Hille等，Plant Mol.Biol.7:171-176，1990)；磺酰胺(Guerineau等，Plant Mol.Biol.15:127-136，1990)；溴苯腈(Stalker等，Science 242:419-423，1988)；草甘膦(Shaw等，Science233:478-481，1986)；草胺膦(DeBlock等，EMBO J.6:2513-2518，1987)，等等。
供选择基因使用的一个选项是编码草丁膦抗性的DNA，并且在一个实施方案中可以是草胺膦乙酰转移酶(pat)、在木薯叶脉花叶病毒启动子控制下的优化的玉米pat基因或bar基因。这些基因赋予针对双丙氨膦的抗性。参见，(参见，Wohlleben等，(1988)Gene 70:25-37)；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2:603；1990；Uchimiya等，BioTechnology 11:835，1993；White等，Nucl.Acids Res.18:1062，1990；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79:625-631，1990；以及Anzai等，Mol.Gen.Gen.219:492，1989)。pat基因的型式为描述于美国专利号6,096,947中的玉米优化的pat基因。
另外，可以采用这样的标记，其可促进含有编码所述标记的多核苷酸的植物细胞的鉴定。在存在产生可测量产物并且可产生所述产物而不破坏植物细胞的序列的情况下，可评分标记或筛选标记是有用的。例子包括β-葡糖醛酸糖苷酶或编码其多种生色底物已知的酶的uidA基因(GUS)(例如，美国专利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(Jefferson等The EMBO Journal vol.6No.13pp.3901-3907)；以及碱性磷酸酶。在一个优选的实施方案中，使用的标记物β-胡萝卜素或维生素A原(Ye等，Science 287:303-305-(2000))。所述基因已被用于提高水稻的营养，但在这种情况下它不是作为筛选标记而被使用的，而与目的基因连锁的所述基因的存在是通过提供的金色检测的。不像在所述基因被用于其对植物的营养贡献的情况下，较小量的蛋白质就足以用于标记的目的。其他筛选标记通常包括花色苷/类黄酮基因(参见Taylor和Briggs，在The Plant Cell(1990)2:115-127中的论述)，包括例如R-基因座基因，其编码在植物组织中调节花色苷色素(红色)的产生的产物(Dellaporta等，于Chromosome Structure and Function，Kluwer Academic Publishers，Appels和Gustafson编，pp.263-282(1988))；控制类黄酮色素的生物合成的基因，例如玉米C1基因(Kao等，Plant Cell(1996)8:1171-1179；Scheffler等Mol.Gen.Genet.(1994)242:40-48)和玉米C2(Wienand等，Mol.Gen.Genet.(1986)203:202-207)；B基因(Chandler等，Plant Cell(1989)1:1175-1183)、p1基因(Grotewold等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1991)88:4587-4591；Grotewold等，Cell(1994)76:543-553；Sidorenko等，Plant Mol.Biol.(1999)39:11-19)；Bronze基因座基因(Ralston等，Genetics(1988)119:185-197；Nash等，Plant Cell(1990)2(11):1039-1049)，及其他。
适合的标记的其他例子包括青色荧光蛋白(CYP)基因(Bolte等(2004)J.Cell Science 117:943-54和Kato等(2002)Plant Physiol.129:913-42)、黄色荧光蛋白基因(来自Evrogen的PHIYFPTM；参见Bolte等(2004)J.Cell Science117:943-54)；lux基因，其编码萤光素酶，可使用例如X-射线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、低照度摄影机、光子计数摄像机或多孔发光测定法(multiwellluminometry)检测其存在(Teeri等(1989)EMBO J.8:343)；绿色荧光蛋白(GFP)基因(Sheen等，Plant J.(1995)8(5):777-84)；和DsRed2，其中用该标记基因转化的植物细胞在颜色上呈红色，因而在视觉上可选择(Dietrich等(2002)Biotechniques 2(2):286-293)。另外的例子包括编码其各种发色底物(例如，PADAC，生色头孢菌素)已知的酶的β-内酰胺酶基因(Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75:3737)；xylE基因(Zukowsky等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:1101)，其编码可转化生色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶；α-淀粉酶基因(Ikuta等，Biotech.(1990)8:241)；以及酪氨酸酶基因(Katz等，J.Gen.Microbiol.(1983)129:2703)，其编码能够将酪氨酸氧化成DOPA和多巴醌(dopaquinone)的酶，所述酶进而凝聚形成可容易地检测的化合物黑色素。显然，许多这样的标记对于本领域技术人员是可获得且已知的。
在某些实施方案中，所述核苷酸序列可以任选地与另一种感兴趣的核苷酸序列组合。术语“感兴趣的核苷酸序列”是指可以为转录的RNA分子以及DNA分子的编码所希望的多肽或蛋白质的核酸分子(还可以称为多核苷酸)，但也可以是指不构成整个基因的并且不一定编码多肽或蛋白质的核酸分子(例如，启动子)。例如，在某些实施方案中，所述核酸分子可与另一种核酸分子组合或“堆叠”，所述另一种核酸分子提供另外的对草甘膦或另一种除草剂的抗性或耐受性，和/或提供选择昆虫或疾病的抗性和/或营养增强、和/或改进的农艺特征、和/或在饲料、食品、工业、制药或其他用途中有用的蛋白质或其他产品。可通过例如使用两个或更多个事件的常规植物育种、用含有感兴趣的序列的构建体转化植物、转基因植物的再转化、或者经由同源重组通过靶向整合添加新的性状来实现在植物基因组之内的感兴趣的两个或多个核酸序列的“堆叠”。
这样的感兴趣的核苷酸序列包括但不限于以下提供的那些例子：
1.赋予针对虫害或疾病的抗性的基因或编码序列(例如，iRNA)
(A)植物疾病抗性基因。植物防御常常是由植物中的疾病抗性基因(R)的产物与病原体中的相应无毒(Avr)基因的产物之间的相互作用激活的。可以用克隆的抗性基因将植物种类转化成抵抗特异性病原体株的工程植物。这样的基因的例子包括，抵抗黄枝孢菌(Cladosporium fulvum)的番茄Cf-9基因(Jones等，1994Science 266:789)、编码蛋白激酶的用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)的番茄Pto基因(Martin等，1993Science262:1432)、以及抵抗丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的拟南芥RSSP2基因(Mindrinos等，1994Cell 78:1089)。
(B)苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)蛋白、及其衍生物或在其上建模的合成多肽，如Btδ-内毒素基因的核苷酸序列(Geiser等，1986Gene 48:109)、以及营养杀虫(VIP)基因(参见，例如，Estruch等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。而且，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，Md.)，ATCC登录号为40098、67136、31995和31998。
(C)凝集素，如几种大花君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme等，1994Plant Molec.Biol.24:825)。
(D)维生素结合蛋白，如用作对抗昆虫害虫的杀幼虫剂的亲和素和亲和素同源物。参见美国专利号5,659,026。
(E)酶抑制剂，例如，蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这样的基因的例子包括水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Abe等，1987J.Biol.Chem.262:16793)、烟草蛋白酶抑制剂I(Huub等，1993Plant Molec.Biol.21:985)、以及α-淀粉酶抑制剂(Sumitani等，1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
(F)昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮激素和保幼激素或其变体，在其基础上的模拟物或其拮抗剂或激动剂，如克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达、保幼激素失活剂(Hammock等，1990Nature 344:458)。
(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受影响害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这样的基因的例子包括昆虫利尿激素受体(Regan，1994)、在蟑螂(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt，1989)、以及昆虫特异性麻痹性神经毒素(美国专利号5,266,361)。
(H)在自然界中由蛇、黄蜂等等产生的昆虫特异性毒液，如蝎昆虫毒性肽(scorpion insectotoxic peptide)(Pang，1992Gene 116:165)。
(I)负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物、或另一种具有杀昆虫活性的非蛋白质分子的酶。
(J)涉及生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶，例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、壳多糖酶(chitinase)和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。这样的基因的实例包括马蹄莲基因(PCT公开申请WO93/02197)、几丁质酶编码序列(例如可以登录号3999637和67152获自ATCC)、烟草钩虫几丁质酶(Kramer等，1993Insect Molec.Biol.23:691)、以及欧芹ubi4-2聚泛素基因(Kawalleck等，1993Plant Molec.Biol.21:673)。
(K)刺激信号转导的分子。这样的分子的例子包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella等，1994Plant Molec.Biol.24:757)和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess等，1994Plant Physiol.104:1467)。
(L)疏水矩肽。参见美国专利号5,659,026和5,607,914；后者教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽。
(M)膜通透酶，为一种通道离子载体(channel former)或通道阻滞剂，如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes等，1993Plant Sci.89:43)，其赋予转基因烟草植物针对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)的抗性。
(N)病毒侵入性蛋白或从其衍生的复合毒素。例如，在转化的植物细胞中的病毒外壳蛋白的积累赋予针对由所述外壳蛋白基因从其衍生的病毒以及由相关病毒所导致的病毒感染和/或疾病产生的抗性。对于转化植物已经赋予针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的外壳蛋白介导的抗性。参见，例如，Beachy等(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。
(O)昆虫特异性抗体或从其衍生的免疫毒素。因而，在昆虫消化道(gut)中靶向关键代谢功能的抗体将会使受影响的酶失活，从而杀死昆虫。例如，Taylor等(1994)第七届分子植物-微生物相互作用国际会议(Seventh Intl.Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions)摘要号497显示在转基因烟草中通过单链抗体片段的产生的酶失活。
(P)病毒特异性抗体。参见，例如，Tavladoraki等(1993)Nature 266:469显示表达重组抗体基因的转基因植物受到免于病毒攻击的保护。
(Q)在自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白。因而，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁高-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(homo-α-1,4-D-galacturonase)而促进真菌定植和植物营养素释放(Lamb等，1992)Bio/Technology 10:1436。编码豆内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白质的基因的克隆和表征描述于Toubart等(1992Plant J.2:367)。
(R)在自然界中由植物产生的发育阻滞蛋白，如提供增加的针对真菌病的抗性的大麦核糖体失活基因(Longemann等，1992)。Bio/Technology 10:3305。
(S)RNA干扰，其中RNA分子被用来抑制靶基因的表达。在一个例子中的RNA分子是部分双链或完全双链的，其触发沉默反应，导致dsRNA裂解成小干扰RNA，然后小干扰RNA被并入破坏同源mRNA的靶向复合物中。参见，例如Fire等，美国专利6,506,559；Graham等6,573,099。
2.赋予针对除草剂的抗性的基因
(A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂例如咪唑啉酮(imidazalinone)、磺酰苯胺或磺酰脲除草剂的抗性或耐受性的基因。在这个分类码中的示例性基因编码突变体ALS酶(Lee等，1988EMBO J.7:1241)，也被称为AHAS酶(Miki等，1990Theor.Appl.Genet.80:449)。
(B)编码针对草甘膦的抗性或耐受性的一种或多种另外的基因，所述抗性或耐受性由突变体EPSP合酶和aroA基因，或者通过基因例如GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)以及其他膦酰化合物如草丁膦(pat和bar基因；DSM-2)以及芳氧苯氧丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)的代谢失活而赋予。参见，例如，美国专利号4,940,835，其披露了赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以ATCC登录号39256获得，且所述突变体基因的核苷酸序列披露于美国专利号4,769,061。欧洲专利申请号0 333 033和美国专利号4,975,374披露了赋予针对除草剂例如L-草胺膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。草胺膦乙酰转移酶基因的核苷酸序列提供于欧洲专利申请号0 242 246中。De Greef等在(1989)Bio/Technology 7:61描述了表达编码草胺膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的生产。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类和环己二酮类例如烯禾啶(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子为Accl-S1、Accl-S2和Accl-S3基因，描述于Marshall等的(1992)Theor.Appl.Genet.83:435。
(C)编码针对抑制光合作用的除草剂如三嗪(psbA基因和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。Przibilla等在(1991)Plant Cell 3:169描述了编码转化衣藻属(Chlamydomonas)的突变体psbA基因的质粒的用途。腈水解酶基因的核苷酸序列描述于美国专利号4,810,648，且含有这些基因的DNA分子可以ATCC登录号53435、67441和67442而获得。编码谷胱甘肽S转移酶的DNA的克隆和表达由Hayes等在(1992)Biochem.J.285:173中描述。
(D)编码针对结合于羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性或耐受性的基因，所述酶催化其中将对羟基苯丙酮酸(HPP)转化成尿黑酸(homogentisate)的反应。这包括除草剂例如异噁唑类(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美国专利号5,424,276)，尤其是异噁唑草酮(为针对玉米的选择性除草剂)、二酮腈类(EP496630、EP496631)，尤其是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮、三酮类(EP625505、EP625508、美国专利号5,506,195)，尤其是磺草酮、以及吡唑啉酯类(pyrazolinates)。在植物中产生过多HPPD的基因可以提供针对这种除草剂的耐受性或抗性，所述基因包括，例如，在美国专利号6,268,549和6,245,968以及美国专利申请公开号20030066102中描述的基因。
(E)编码针对苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且也可以赋予针对芳氧苯氧丙酸酯(AOPP)除草剂的抗性和耐受性的基因。这样的基因的例子包括酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶(aad-1)基因，其被描述于美国专利号7,838,733中。
(F)编码针对苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且也可以赋予针对吡啶氧基生长素除草剂例如氟草烟或绿草定的抗性和耐受性的基因。这样的基因的例子包括酶α-酮戊二酸依赖性双加氧酶基因(aad-12)，其被描述于WO 2007/053482 A2中。
(G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(参见，例如美国专利公开号20030135879)。
(H)提供针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(参见美国专利号5,767,373)。
(I)提供针对三嗪类除草剂(例如阿特拉津)和尿素衍生物(例如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因，所述除草剂与光系统Ⅱ反应中心的核心蛋白(PSII)结合(参见Brussian等，(1989)EMBO J.1989，8(4):1237-1245。
3.赋予或贡献增值性状的基因
(A)修饰的脂肪酸代谢，例如，通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉蜀黍或芸苔属而增加所述植物的硬脂酸含量(Knultzon等，1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89:2624。
(B)减少的植酸含量
(1)导入植酸酶编码基因，例如黑曲霉(Aspergillus niger)植酸酶基因(VanHartingsveldt等，1993 Gene 127:87)，增强了植酸盐的分解，从而向转化的植物添加了更多游离磷酸盐。
(2)可导入降低植酸含量的基因。在玉米中，例如，这可以通过克隆进而再导入与负责玉米突变体(其特征为低植酸水平)的单个等位基因相关联的DNA来完成(Raboy等，1990 Maydica 35:383)。
(C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这样的酶的例子包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza等，1988)J.Bacteriol.170:810、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz等，1985Mol.Gen.Genet.200:220)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(Pen等，1992Bio/Technology 10:292)、番茄转化酶基因(Elliot等，1993)、大麦淀粉酶基因(Sogaard等，1993J.Biol.Chem.268:22480)、以及玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher等，1993Plant Physiol.102:10450)。
感兴趣的序列也可以是通过同源重组导入植物基因组的预定区域中的核苷酸序列。已经在本领域中描述了经由同源重组将多核苷酸序列稳定整合在植物细胞的特异性染色体位点中的方法。例如，描述于美国专利申请公开号2009/0111188 A1中的位点特异性整合涉及使用重组酶或整合酶来介导供体多核苷酸序列到染色体靶中的导入。另外，国际专利申请号WO 2008/021207描述了锌指介导的同源重组，以将一种或多种供体多核苷酸序列稳定地整合在基因组的特定位置中。可以利用重组酶例如如在美国专利号6,720,475中描述的FLP/FRT、或如在美国专利号5,658,772中描述的CRE/LOX的用途而将多核苷酸序列稳定地整合到特异性染色体位点中。最后，大范围核酸酶(meganuclease)将供体多核苷酸靶向到特异性染色体位置中的用途描述于Puchta等的PNAS USA 93(1996)pp.5055-5060)中。
用于在植物细胞内的位点特异性整合的其他不同的方法是普遍已知和适用的(Kumar等，Trends in Plant Sci.6(4)(2001)pp.155-159)。此外，已经在几种原核生物和低等真核生物中鉴定的位点特异性重组系统可适用于在植物中使用。这样的系统的例子包括但不限于：来自酵母鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSR1质粒的R/RS重组酶系统(Araki等(1985)J.Mol.Biol.182:191-203)、以及噬菌体μ的Gin/gix系统(Maeser和Kahlmann(1991)Mol.Gen.Genet.230:170-176)。
各种测定法可与本公开的某些实施方案的核酸分子结合使用。下面的技术是在各种情况下是有用的，并且在一个实施方案中，在检测所述核酸分子和/或在植物细胞中编码的多肽的存在中是有用的。例如，可以以多种方法来确定所述分子的存在，包括使用序列的引物或探针、检测所编码的蛋白质的ELISA测定法、检测蛋白质的Western印迹法、或检测RNA或DNA的Northern印迹法或Southern印迹法。可以采用用于检测酶DGT-14的酶测定法。此外，可以使用本领域公认的程序产生可检测DGT-14蛋白的存在的抗体。也可以使用另外的技术，如原位杂交、酶染色、以及免疫染色，来检测重组构建体在特异性植物器官和组织中的存在或表达。可以在植物的某些组织中或在不同的发展阶段选择性地表达转基因，或者所述转基因可基本上沿其整个生命周期表达于基本上所有植物组织中。然而，任何组合表达模式也可以适用。
Southern分析是常用的检测方法，其中用限制性内切核酸酶切割DNA，并且将其在琼脂糖凝胶上分级，以借助于分子量而分离DNA，然后转移到尼龙膜上。然后它与用32P(或其它探针标记物)放射性标记的探针片段杂交，并在SDS溶液中洗涤。
同样，Northern分析运用了类似的方案，其中用限制性内切核酸酶切割RNA，并且将其在琼脂糖凝胶上分级，以借助于分子量而分离RNA，然后转移到尼龙膜上。然后它与用32P(或其它探针标记物)放射性标记的探针片段杂交，并在SDS溶液中洗涤。从感兴趣的组织中分离的RNA(例如，mRNA)的分析可以指示相对表达水平。通常，如果mRNA存在或mRNA的量增加，可以假定相应的转基因被表达。可以使用Northern分析、或其他mRNA分析方案来确定导入的转基因或天然基因的表达水平。
在Western分析中，代替分离DNA/RNA，提取感兴趣的蛋白质并且将其置于丙烯酰胺凝胶上。然后蛋白质被印迹到膜上并且与标记物质接触。参见，例如，Hood等，“Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize；Characterization of Transformants,Production,Processing,Extraction andPurification”Molecular Breeding 3:291-306(1997)；Towbin等(1979)“Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulosesheets:procedure and some applications”Proc Natl Acad Sci USA 76(9):4350-4354；Renart等“Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera:a method for studying antibody specificity andantigen structure”Proc Natl Acad Sci USA 76(7):3116-3120。
本公开的实施方案的核酸分子或其区段可以用作PCR扩增的引物。在进行PCR扩增中，可容许一定程度的在引物与模板之间的错配。因此，例示引物的突变、缺失和插入(特别是在5'端的核苷酸添加)也落在题述公开的范围内。可以通过普通技术人员已知的方法在给定的引物中产生突变、插入和缺失。
检测方法的另一个例子是焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，如由Winge描述(Innov.Pharma.Tech.00:18-24，2000)。在这种方法中，设计了与邻接基因组DNA和插入DNA连接处重叠的寡核苷酸。将所述寡核苷酸杂交于来自目的区域的单链PCR产物(一个引物在插入序列中，而一个在侧翼基因组序列中)，并在DNA聚合酶、ATP、硫酰酶(sulfurylase)、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)、腺苷5'磷酰硫酸(adenosine 5'phosphosulfate)和萤光素的存在下温育。单独添加DNTP，且其掺入导致光信号，对该光信号进行测量。光信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基或多碱基延伸而导致的转基因插入/侧翼序列的存在。(该技术被用于初始测序，而不用于检测已知的特定基因。)
已描述了分子信标用于序列检测。简言之，设计了与侧翼基因组和插入DNA连接处重叠的FRET寡核苷酸探针。FRET探针的独特结构导致其含有保持荧光和淬灭部分接近的二级结构。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。在成功的PCR扩增之后，FRET探针对靶序列的杂交导致探针二级结构的去除以及荧光和淬灭部分的空间分离。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼基因组/转基因插入序列的存在。
水解探针测定法，或称为(Life Technologies，Foster City，Calif.)是一种检测并量化DNA序列存在的方法。简言之，FRET寡核苷酸探针设计为具有转基因中的一个寡核苷酸和在侧翼基因组序列中的一个寡核苷酸，用于事件特异性检测。在热稳定性聚合酶和dNTP存在下循环FRET探针和PCR引物(一个引物在插入DNA序列中，一个在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交导致FRET探针上的荧光部分从猝灭部分裂解和释放。荧光信号表明由于成功的扩增和杂交所致的侧翼/转基因插入序列的存在。
ELISA或酶联免疫测定自1971年以来是已知的。一般而言，溶解在缓冲液中的抗原被包被在塑料表面上。当加入血清时，抗体可附着于固相上的抗原。当与酶缀合时，可证明这些抗体的存在或不存在。加入适当的底物检测所结合的结合物的量(可被量化)。普通的ELISA测定法为使用生物素化的抗-(蛋白质)多克隆抗体和碱性磷酸酶缀合物的一种测定法。例如，用于定量测定漆酶水平的ELISA可以是利用商业获得的多克隆兔抗体的抗体夹心测定法。所述抗体与碱性磷酸酶缀合以用于检测。在另一个例子中，检测胰蛋白酶或胰蛋白酶原的ELISA测定法利用生物素化的抗胰蛋白酶或抗胰蛋白酶原多克隆抗体和抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶缀合物。
草甘膦，包含N-(膦酰基甲基)甘氨酸的组合物，是在除草剂中广泛使用的成分。草甘膦通常被配制为在水性液体浓缩物、固体浓缩物、乳液或微乳液中的盐。可按照任何制剂使用的草甘膦的适合盐形式包括，例如，碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、铵盐、二铵盐(如二甲基铵)、烷基胺盐(例如二甲基胺和异丙胺盐)、烷醇胺盐(例如乙醇胺盐)、烷基锍盐(alkylsulfonium salt)(例如三甲基锍盐)、氧化锍盐(sulfoxonium salt)、以及它们的混合物或它们的组合。草甘膦的商业制剂的例子包括但不限于：XRT、PLUS、ROUNDUPROUNDUP CT、EXTRA、BIOACTIVE、BIOFORCE、 SP、XRT、以及CONCENTRATE，所有这些均含有为其异丙胺盐(IPA)的草甘膦；DRY和RIVALTM含有为其胺盐的草甘膦；GEOFORCE为草甘膦钠制剂；TOUCHDOWNTM为草甘膦三甲基硫盐制剂，TOUCHDOWN IQTM为草甘膦二铵盐制剂，TOUCHDOWN TOTAL IQTM为草甘膦钾制剂，并且ROUNDUP为草甘膦钾制剂。草甘膦制剂可以包括安全剂、表面活性剂、以及佐剂。提供的抗草甘膦除草剂制剂的植物或植物细胞可以用于多种应用中，其中具有这种抗性的那些植物细胞可耐受暴露于用于控制在种植区域中的杂草的足够量的草甘膦。当在植物细胞中表达时，天然细菌dgt-14核苷酸序列的修饰可提供改进的除草剂草甘膦抗性。
草甘膦对于从出苗到贯穿不同的植物发育阶段的植物可过量施用。在美国和全世界，与草甘膦除草制剂结合使用的草甘膦耐受性植物种类已经是在作物生产中的杂草管理的标准程序。对于种植者而言，利用草甘膦耐受性性状(例如，dgt-14)的主要优点是，它允许简单和方便地应用草甘膦(广谱的芽后除草剂)，以控制不需要的植物和禾本科植物(即，“杂草”)，具有优良的作物安全性以及更低的对播前除草剂应用的依赖性。其他益处包括更好地适应免耕并且减少耕作系统。耐草甘膦作物扩大了杂草管理的选项，使杂草控制实践更容易、更便宜、并且更灵活。种植者报告，跨越田地施用除草剂的行程更短并且种植行程也更短，由此节省了燃料并且减少了土壤侵蚀。因此，耐草甘膦作物减少了由除草剂造成的环境风险，而同时增加了必需的化学杂草控制的功效。
相应地，在不同的实施方案中，提供了用于选择性地控制在含有抗草甘膦植物的培养区域中的杂草的方法。所述方法包括将足够量的除草草甘膦施用于作物的叶子和杂草，以控制杂草的生长。
存在于预期的除草组合物(即，颗粒状固体浓缩物，或液体浓缩物，或可替代地随时可用的组合物，或桶混(tank-mix)组合物)中的草甘膦的相对量可以变化，这取决于许多因素，包括例如，有待控制的杂草物种和施用方法。然而，一般而言，在除草组合物中使用的草甘膦和任选地表面活性剂和/或一些其他辅助剂或添加剂(如本文别处所述)的浓度足以控制在栽培区域内的杂草。
另外，在除草组合物中使用的草甘膦和任选地表面活性剂和/或一些其他辅助剂或添加剂(如本文别处所述)的浓度足以提供在栽培区域内的杂草再生长的控制。
因此，液体浓缩物组合物被配制成包含每升至少约50克，至少约75克，或至少约100、125、150、175、200、225、250、275、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690或700克(酸当量或a.e.)或更高浓度的草甘膦。草甘膦的浓度范围是，例如，从每升约50克至约680克(a.e.)，从每升约100克至约600克(a.e.)(gpl)，从每升约250克至约600克(a.e.)，或从每升约360克至约540克(a.e.)。当表示为基于所述草甘膦浓缩物的总重量的重量百分比时，液体浓缩物包含至少约10重量％，至少约15重量％，或至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、或68重量％或更多的草甘膦(酸当量或a.e.)。草甘膦的浓度范围是，例如，从约10重量％至约70重量％a.e.，从约20重量％至约68重量％a.e.，或从约25重量％至约45重量％a.e.。如果浓缩物被应用为随时可用的组合物，则草甘膦的浓度通常为从约1重量％至约3重量％a.e.，以及从约1重量％至约2重量％a.e。
当表示为基于所述草甘膦浓缩物的总重量的重量百分比时，固体浓缩物组合物被配制成包含至少约5重量％(酸当量或a.e.),至少约20重量％a.e.,或至少约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、或95重量％a.e.、或更高浓度的草甘膦。草甘膦的浓度范围是，例如，从约5重量％至约97重量％a.e.，从约30重量％至约85重量％a.e.，或从约50重量％至约75重量％a.e.。
喷雾组合物被配制为用于施用每英亩至少约1加仑(3.8L)，每英亩至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20加仑(75.7L)或更多的喷雾组合物。喷雾组合物的喷施体积的范围是，例如，对于空中施用而言，每英亩从约1加仑(3.8L)到100加仑(380L)，每英亩从约2加仑(7.6L)到约40加仑(151.4L)，以及每英亩从约2加仑(7.6L)到大约5加仑(18.9L)，并且对于地面施用而言，每英亩从约5加仑(18.9L)到约20加仑(75.7L)。
替代地，可以将草甘膦除草组合物以已经配制好的形式或以针对应用的所希望的稀释度(即，“随时可用”的组合物)、或者需要由最终用户稀释、分散、或溶解于水中的形式(即，“浓缩”组合物)提供给最终用户。这样的预配制的浓缩物可以是液体或颗粒状固体。
可以采用相对不溶于水的具有水相(其中草甘膦主要以盐的形式存在)和非水相(任选地含有第二除草活性成分)的液体浓缩物制剂。这样的制剂示例性地包括乳剂(包括粗乳液和微乳液、油包水、水包油、和水包油包水型)、悬液和悬乳剂。所述非水相可以任选地包含微囊化组分，例如微囊化除草剂。在具有非水相的制剂中，组合物中的草甘膦a.e.的浓度就整体而言仍然在本文中叙述的就水性浓缩物制剂而言的范围内。
应当指出的是，除草喷雾组合物是以水溶液或分散体的形式施用的，而不论它们是被制造为随时施用的形式还是从液体草甘膦浓缩物进一步稀释或向颗粒状固体草甘膦浓缩物加入水而得到。然而，如本文中使用的术语“水性”，并不意在排除一定量的少量的非水溶剂的存在，只要存在的主要溶剂是水即可。
本公开的实施方案涉及杀死或控制在含有作物(例如，转基因抗草甘膦植物的作物)的培养区域中的杂草或不需要的植物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括施用作为桶混制剂的草甘膦，并且将除草足够量的所述桶混制剂施用到被遗传转化为耐受草甘膦的植物的叶子上，并同时施用到生长在与这种植物接近的杂草的叶子上。使用这种方法导致杂草或不想要的植物的控制，同时使所述耐除草剂的植物基本上不受损害。
在本公开的实施方案中，可将水性草甘膦组合物施用于植物的叶面组织，以通过向植物的叶面组织施用水性草甘膦组合物杀死各种各样的不需要的植物(包括一年生和多年生禾本科植物以及阔叶杂草物种)或控制其生长。这样的植物可以包括但不限于，例如：苜蓿、大豆、棉花、油菜籽、亚麻子、玉米、水稻、臂形草(brachiaria)、小麦、红花、高粱、糖用甜菜、向日葵、烟草和草坪草。因此，可以选择任何植物物种或植物细胞。在实施方案中，本文中使用的植物细胞以及由其培育或衍生的植物包括但不限于：从如下可得到的细胞：欧洲油菜(Brassica napus)；印度芥菜(芥菜型油菜(Brassica juncea))；埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)；萝卜(turnip)(芜菁(Brassica rapa))；卷心菜(cabbage)(甘蓝(Brassica oleracea))；大豆(Glycine max)；亚麻子/亚麻(Linum usitatissimum)；玉米(也描述为玉蜀黍(Zea mays))；红花(Carthamus tinctorius)；向日葵(Helianthus annuus)；烟草(Nicotiana tabacum)；拟南芥(Arabidopsis thaliana)；巴西坚果(Betholettia excelsa)；蓖麻(Ricinus communis)；椰子(Cocus nucifera)；香菜(芫荽(Coriandrum sativum))；棉(棉属物种(Gossypium spp.))；落花生(Arachis hypogaea)；希蒙得木(Simmondsia chinensis)；油棕(Elaeis guineeis)；橄榄(Olea eurpaea)；大米(水稻(Oryza sativa))；南瓜(笋瓜(Cucurbita maxima))；大麦(Hordeum vulgare)；甘蔗(Saccharum officinarum)；大米(水稻)；小麦(小麦属物种(Triticum spp.)，包括硬粒小麦(Triticum durum)和普通小麦(Triticumaestivum))；和浮萍(浮萍科物种(Lemnaceae sp.))。在一些实施方案中，在植物物种之内的遗传背景可以变化。
以足以产生所希望的生物学结果的速率将除草组合物施用于植物，所述结果为：控制杂草生长而不显著影响耐草甘膦的作物植物。这些施用比率通常表示为所处理的每单位面积的草甘膦的量，例如每公顷的克数(克/公顷)。所构成“显著效果”的根据调查、开发、销售和使用的人的标准和实践而变化，并且将组合物选择为显著有效的施用比率也在本领域技术人员的技能范围之内。通常，如通过生长减弱或死亡率测量的，给出杂草物种的85％控制的每单位面积施用的组合物的量通常被用来定义商业比率。
足以控制在培养区域中的杂草的许多草甘膦除草剂施用比率的选择也在普通农业科学家的技能范围之内。本领域技术人员同样将认识到，个体植物状况、天气和生长条件、以及特异性活性成分以及它们在所述组合物中的重量比，将影响在实践本文披露的方法中实现的除草效力的程度。
可通过具有本领域技能的人员熟知的任何适当的方法将除草喷雾组合物施用于有待处理的植物的叶子上，所述方法包括空中施用和地面施用技术(例如，地面喷杆(ground boom)、手动喷雾器(hand sprayer)、药捻式(rope-wick)，等等)。
如果需要的话，当制备所述施用组合物时，用户可将一种或多种佐剂与本公开的组合物和用于稀释的水混合。这样的助剂可以包括另外的表面活性剂和/或无机盐(如硫酸铵)，目的在于进一步增强除草效果。
进一步的改进还包括与适当的安全剂一起使用，以进一步保护植物和/或增加对更多的除草剂的交叉抗性。安全剂通常通过激活/表达cP450而起到增强植物的免疫系统的作用。安全剂是通过生理或分子机制而降低除草剂对作物植物的植物毒性的化学剂，其不损害杂草控制效力。
除草剂安全剂包括解草嗪、解毒喹、解草胺腈、二氯丙烯胺、1-二氯乙酰基-六氢-3,3,8a-三甲基吡咯并[1,2-a]嘧啶-6(2H)-酮(dicyclonon)、O,O-二乙基二硫代磷酸酯(dietholate)、解草唑、解草啶、解草胺、氟草肟、解草噁唑、双苯噁唑酸、吡咯二酸(mefenpyr)、4-氯苯基甲基氨基甲酸酯(mephenate)、萘二甲酸酐、和解草腈。也可在题述公开的实施方案中使用植物活化剂(通过激活植物的防御机制而保护它们的一类新的化合物)。这些活化剂包括噻二唑素(acibenzolar)和噻菌灵(probenazole)。
商业化的安全剂可以用于保护大种子禾本科植物作物，如玉米、高粱、和湿法播种水稻，从而使其免受种植前掺入或出苗前施用的硫代氨基甲酸酯和氯乙酰苯胺族除草剂的影响。安全剂也已经被开发为保护冬季谷类作物如小麦，使其免受芳氧苯氧丙酸酯和磺酰脲除草剂的出苗后施用的影响。保护玉米和水稻免受磺酰脲、咪唑啉酮、环己二酮、异噁唑、和三酮除草剂的影响的安全剂的使用也已经确认。在安全化的植物中，安全剂诱导的除草剂解毒的增强被广泛接受为涉及安全剂作用的主要机制。安全剂诱导辅因子如谷胱甘肽以及除草剂解毒酶如谷胱甘肽S-转移酶、细胞色素P450单加氧酶和葡糖基转移酶。Hatzios KK，Burgos N(2004)“Metabolism-based herbicide resistance:regulationby safeners”,Weed Science:Vol.52，No.3pp.454-467。在本说明书中引证的所有出版物和已公开的专利文件均通过提述并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地并单独地指明通过提述而并入本文。
本公开的实施方案在以下实施例中进一步限定。应当理解，这些实施例仅通过说明的方式给出。根据以上讨论以及这些实施例，本领域技术人员可确定本公开的必要特征，并且可以做出本公开的实施方案的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件而不脱离其精神和范围。因此，除了那些本文中所示和描述的之外，根据前面的描述，本公开的实施方案的各种修改对于本领域技术人员将是显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求书的范围内。以下实施例是通过举例说明的方式提供的，而不意在限制本公开的范围。
实施例
实施例1：突变体EPSP合酶
在大肠杆菌5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合酶)中的单个氨基酸突变(G96A)可导致草甘膦不敏感(Padgette等，(1991)；Eschenburg等，(2002)；Priestman等，(2005)；Haghani等，(2008))。然而也已知这种突变赋予针对草甘膦的抗性不利地影响EPSP合酶与其天然底物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)结合。在底物结合效率方面产生的变化可导致突变的酶，所述突变的酶不适合提供针对草甘膦的原位(in planta)耐受性。
NCBI Genbank数据库对以下EPSP合酶蛋白和多核苷酸序列进行了计算机筛选：在EPSP合酶中在与导入所述酶的大肠杆菌变体中的G96A突变类似的位置处天然含有丙氨酸的EPSP合酶蛋白和多核苷酸序列(Padgette等，(1991)；Eschenburg等，(2002)；Priestman等，(2005)；Haghani等，(2008))；或可通过在类似的G96A位置处导入丙氨酸代替甘氨酸而被改变的EPSP合酶蛋白和多核苷酸序列。
从氧化亚铁深海铁杆菌(Mariprofundus ferrooxydans)鉴定的一种酶为DGT-14(GENBANK登录号ZP_01452683)。进一步的计算机数据采掘揭示了与DGT-14同源的五种其他的独特的酶，标记为DGT-11(GENBANK登录号YP_989551.1)、DGT-12(GENBANK登录号ZP_01622155.1)、DGT-18(GENBANK登录号NP_928909.1)、DGT-29(GENBANK登录号YP_322772.1)、以及DGT-30(GENBANK登录号ZP_02156189.1)。这些酶之一的DGT-11(SEQ ID NO:5)在EPSP合酶中在与导入所述酶的大肠杆菌变体中的G96A突变类似的位置处含有天然丙氨酸。由于来自不同生物的EPSP合酶蛋白具有不同长度，对于EPSP合酶的大肠杆菌变体的突变的编号不一定与对于来自其他生物的EPSP合酶的突变的编号相应。就草甘膦耐受性或PEP底物亲和力而言，以前没有表征天然的或用在甘氨酸氨基酸残基处导入的丙氨酸突变的这些鉴定的EPSP合酶。
获得了新颖的DGT-14、DGT-12、DGT-18、DGT-29以及DGT-30酶，并且在一个位置处将甘氨酸到丙氨酸的突变导入到EPSP合酶中，所述位置与针对EPSP合酶的大肠杆菌变体描述的G96A位置类似。通过在GENBANK登录号ZP_01452683的氨基酸残基101处导入丙氨酸代替内源甘氨酸而修饰了DGT-14蛋白序列，由此产生SEQ ID NO:1。通过在GENBANK登录号ZP_01622155.1的氨基酸残基111处导入丙氨酸代替内源甘氨酸而修饰了DGT-12蛋白序列，由此产生SEQ ID NO:7。通过在GENBANK登录号NP_928909.1的氨基酸残基96处导入丙氨酸代替内源甘氨酸而修饰了DGT-18蛋白序列，由此产生SEQ ID NO:9。通过在GENBANK登录号YP_322772.1的氨基酸残基96处导入丙氨酸代替内源甘氨酸而修饰了DGT-29蛋白序列，由此产生SEQ ID NO:11。通过在GENBANK登录号ZP_02156189.1的氨基酸残基96处导入丙氨酸代替内源甘氨酸而修饰了DGT-30蛋白序列，由此产生SEQ ID NO:13。
通过与I类EPSP合酶比较，表征了修饰的EPSP合酶、以及天然的DGT-11EPSP合酶的草甘膦耐受性和PEP底物亲和力。以下为I类EPSP合酶：将来自大豆的DGT-1、来自欧洲油菜的DGT-3(GENBANK登录号P17688)、以及来自小麦的DGT-7(GENBANK登录号EU977181)用作比较。合成且评估了I类EPSP合酶及其突变的变体。在EPSP合酶中在与所述酶的大肠杆菌变体G96A突变的类似位置处进行导入到植物EPSP合酶中的突变(包含甘氨酸到丙氨酸的突变)。另外，在这些I类EPSP合酶中在与如Funke等(2009)描述的大肠杆菌的EPSP合酶中的氨基酸97(T到I)和氨基酸101(P到S)类似的位置处导入了苏氨酸到异亮氨酸以及脯氨酸到丝氨酸的突变。
图1描绘了DGT-14、DGT-11、DGT-12、DGT-18、DGT-29和DGT-30与其他EPSP合酶的部分序列比对。作为对于DGT-14、DGT-12、DGT-18、DGT-29和DGT-30的丙氨酸取代甘氨酸的修饰的结果，这些DGT酶共享在aroA EPSP合酶氨基酸位置96处的保守性丙氨酸。这个氨基酸的位置由星号指示，并将氨基酸残基加下划线。
图2显示了DGT-1、DGT-3、以及DGT-7酶的比对。从甘氨酸突变成丙氨酸的氨基酸残基的位置由第一个星号指示。从苏氨酸突变成异亮氨酸的氨基酸残基的位置由第二个星号指示。从脯氨酸突变成丝氨酸的第三个氨基酸残基的位置由第三个星号指示。将这些突变导入不同的变体DGT-1、DGT-3、以及DGT-7。以下更详细地描述含有所述突变的基因的不同变体。
实施例2：用于在植物和细菌中表达的序列的优化
来自氧化亚铁深海铁杆菌(Mariprofundus ferrooxydans)的DGT-14编码序列的分析揭示了被认为对最佳植物表达有害的几个序列基序的存在、以及用于在双子叶植物和单子叶植物中表达的非最佳密码子组成。本公开的实施方案提供了植物优化的DGT-14编码基因的设计，以产生可以最佳地在双子叶植物或单子叶植物中表达的DNA序列，并且其中的序列修饰不妨碍翻译或转录。
由于由遗传密码的冗余/简并性(即，一些氨基酸由一个以上的密码子指定)提供的可塑性，在不同生物或生物类别中的基因组的演化已导致同义密码子的差异性使用。这种“密码子偏倚”反映在蛋白质编码区的平均碱基组成中。例如，具有较低G+C含量的基因组的生物利用更多的在同义密码子的第三位置中具有A或T的密码子，而那些具有较高G+C含量者利用更多的在所述第三位置中具有G或C的密码子。此外，人们认为在mRNA之内的“稀有”密码子的存在可降低所述mRNA的绝对翻译速率，尤其是在相应于所述稀有密码子的氨基酰tRNA的相对丰度较低时。这一推理的延伸在于，单独的稀有密码子的翻译速率的减低对于多个稀有密码子将会至少是加和的。因此，具有高相对含量的稀有密码子的mRNA将具有相应较低的翻译速率。这种速率可由编码的蛋白质的相应较低的水平反映。
在工程改造DGT-14编码基因以便在双子叶植物或单子叶植物(如棉花、卡诺拉/芸苔、烟草、玉米、大豆、小麦和水稻)中表达的过程中，例如通过使用可公开获得的DNA序列数据库找到关于植物基因组的密码子分布或各种植物基因的蛋白质编码区的信息，可以确定预期宿主植物的密码子偏倚。密码子偏倚是植物用于编码其蛋白质的氨基酸的密码子的统计分布。用于双子叶植物或单子叶植物(玉米)的优选密码子使用显示在表1中。
表1.来自单子叶植物(玉米％)和双子叶植物(双子叶植物％)基因的编码区的同义密码子表示显示在D栏、E栏、I栏、以及J栏中。针对植物优化的合成基因设计的平衡的偏倚的密码子表示集的值在C栏和H栏中。
*DNU＝未使用
密码子偏倚可以计算为单个密码子相对于全部氨基酸的密码子的频率。替代地，密码子偏倚可以计算为单个密码子相对于特定氨基酸的其他密码子(同义密码子)被用来编码所述氨基酸的频率。在设计用于植物表达的编码区的过程中，当存在多种选择时，应当确定所述植物优选的主要(“第一选择”)密码子、以及优选密码子的第二、第三、第四等选择。然后，可设计编码相同GT-14肽的氨基酸序列的新的DNA序列，但是所述新的DNA序列通过取代植物密码子(第一优选的、第二优选的、第三优选的、或第四优选的等等)来指定在所述氨基酸序列内的每个位置处的氨基酸而不同于原始DNA序列。然后针对所述新的序列分析可能通过修饰产生的限制性酶切位点。通过用第一、第二、第三、或第四选择优选的密码子代替所述密码子而进一步修饰经鉴定的位点。在所述序列中可影响感兴趣的基因的转录或翻译的的其他位点为茎环结构、外显子:内含子交界处(5’或3’)、多聚A添加信号、或RNA聚合酶终止信号；这些位点通过植物密码子的取代而被去除。进一步分析和修饰所述序列以降低TA或CG双联体的频率。除了这些双联体之外，具有相同的大约六个以上残基的G或C序列块可影响所述序列的转录或翻译。因此，可通过用下一个优选的密码子选择替换密码子的第一或第二选择等而有利地修饰这些块。
因而，许多种方法可以用来产生如本文中所述的基因。一个这样的途径的例子进一步说明于PCT申请WO 97/13402中。因而，在功能上等同于题述公开的dgt-14基因的合成基因可以用来转化包括植物在内的宿主。有关合成基因产生的另外的指南可见于，例如，美国专利号5,380,831。
为了工程改造植物优化的dgt-14编码基因，设计了DNA序列以利用确立自密码子偏倚表的冗余遗传密码来编码所述氨基酸序列，所述密码子偏倚表编译自特定宿主植物的蛋白质编码序列。在表1中，D栏和I栏呈现了每个氨基酸的同义密码子的分布(表示为所述氨基酸的全部密码子的使用％)，正如在单子叶植物(玉米)的编码区中所见。E栏和J栏呈现了每个氨基酸的同义密码子的分布(表示为所述氨基酸的全部密码子的使用％)，正如在双子叶植物的编码区中所见。一些氨基酸的某些同义密码子仅仅罕见地发现于植物基因中(例如，CGG)。通常，如果密码子代表约10％或更少的编码在任一植物类型的基因中的有关氨基酸的次数(在表1的C栏和H栏中指示为DNU)，则所述密码子被认为是很少使用的。为了平衡氨基酸的其余密码子选择的分布，使用以下公式计算加权平均值表示：
C1的加权平均值％＝1/(％C1+％C2+％C3+其他)x％C1x100，其中C1为讨论中的密码子，并且％C2、％C3、其他表示表1的其余同义密码子的双子叶植物的值％的平均值(有关密码子的平均值％取自C栏和H栏)。
每个密码子的加权平均％值在表1的C栏和H栏中给出。
利用发现于双子叶植物基因中的频繁使用的密码子的平衡密码子分布，设计了实质上编码DGT-14蛋白的氨基酸序列的新的DNA序列，以用于在双子叶植物中最佳地表达。利用发现于单子叶植物基因中的频繁使用的密码子的平衡密码子分布，设计了实质上编码DGT-14蛋白的氨基酸序列的第二DNA序列，以用于在单子叶植物中最佳地表达。通过取代植物(第一优选的、第二优选的、第三优选的、或第四优选的)密码子以指定在所述蛋白质氨基酸序列之内的每个位置处的适当氨基酸，两个新颖的DNA序列不同于编码dgt-14的原始DNA序列。通过反向翻译DGT-14蛋白序列的已经通过导入丙氨酸替换在氨基酸残基101处的内源甘氨酸而被修饰的蛋白质序列(GENBANK登录号ZP_01452683)而启动植物优化的DNA序列的设计。使用从表1的E栏和J栏构建的双子叶植物密码子偏倚表，将SEQ ID NO:1反向翻译。使用从表1的D栏和I栏构建的单子叶植物密码子偏倚表完成了SEQ ID NO:1第二反向翻译。然后，通过补偿密码子变化(同时保留总的加权平均密码子表示)以去除或添加限制性内切酶识别位点、去除高度稳定的链间次级结构、并去除可能对植物中的工程改造基因的克隆操作或表达有害的其他序列，从而修饰初始序列。然后针对所述DNA序列再分析可能已经通过修饰产生的限制性内切酶识别位点。通过用第一、第二、第三、或第四选择优选的密码子代替所述有关密码子而进一步修饰经鉴定的位点。在所述序列中可影响感兴趣的基因的转录或翻译的的其他位点包括外显子:内含子交界处(5’或3’)、多聚A添加信号、或RNA聚合酶终止信号。所述修饰的序列被进一步分析并被进一步修饰以降低TA或CG双联体的频率且增加TG或CT双联体的频率。除了这些双联体之外，具有大约六个以上[G+C]或[A+T]连续残基的序列块可影响所述序列的转录或翻译。因此，还通过用其他优选的密码子选择替换密码子的第一或第二选择等而修饰这些序列块。罕见使用的密码子并不在很大程度上被包括在基因设计中，只有当有必要调节不同于密码子组成本身的设计标准时才使用(例如，限制性内切酶识别位点的添加或缺失)。
新设计的双子叶植物优化的dgt-14 v2多核苷酸序列在SEQ ID NO:2中列出。新设计的单子叶植物优化的dgt-14 v5多核苷酸序列在SEQ ID NO:3中列出。产生的DNA序列具有较高程度的密码子多样性、令人希望的碱基组成，含有战略性地布置的限制性内切酶识别位点，并且没有可能干扰基因转录或产物mRNA翻译的序列。
一旦在纸上或计算机上设计了植物优化的DNA序列，可以在实验室中合成在序列上精确地与所设计的序列相应的实际DNA分子。这样的合成核酸分子可以被克隆且以别的方式严密控制，如同它们是从天然或自然来源衍生的一样。由商业供应商(DNA2.0，Menlo Park，CA)进行包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:3的DNA片段的合成，其含有另外的序列，例如6-框终止子(位于添加到编码序列的3'端的全部六个阅读框中的终止密码子)、以及用于克隆的5’限制性位点。然后将合成核酸分子克隆到表达载体中并且转化到如以下实施例中描述的植物或细菌中。
用于在细菌中表达的优化
设计了编码SEQ ID NO:1的DGT-14蛋白的新的DNA序列，其被优化以用于在大肠杆菌细胞中表达。使用来自GeneArt(Regensburg,Germany)的专有的密码子优化方案，通过SEQ ID NO:1的蛋白质序列的反向翻译，启动大肠杆菌优化的DNA序列的设计。通过补偿密码子变化(同时保留总的加权平均表示)以去除或添加限制性内切酶识别位点、去除高度稳定的链间次级结构以及可能对工程改造基因的克隆操作或表达有害的其他序列，从而修饰初始序列。在编码序列中避免的这样的有害序列的例子为16S核糖体RNA结合序列(“Shine-Dalgarno序列”)，例如AGGAGG，其可例如编码两个连续的精氨酸氨基酸，但是也可能用作基因内的(并因此是不希望的)翻译起始信号。编码SEQ ID NO:1的蛋白质的大肠杆菌偏好的dgt-14 v6DNA序列作为SEQ IDNO:4给出。
为了促进克隆并保证有效的翻译起始，将5’末端NdeI限制性内切酶识别序列置于ATG翻译起始密码子的上游。还为了促进克隆并保证正确的翻译终止，将编码两个TAA翻译终止密码子的碱基和XhoI限制性内切酶识别位点包括在所述编码区的3’端。由商业供应商GeneArt进行包含SEQ ID NO:4的DNA片段的合成。
使用相似的大肠杆菌密码子优化策略来设计dgt-11 v6、dgt-12 v6、dgt-18v6、dgt-29 v6、以及dgt-30 v6。这些基因的大肠杆菌密码子优化的变体分别列出为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、以及SEQ ID NO:14。
实施例3：用于赋予草甘膦耐受性的基因的细菌表达的载体的构建
用于大肠杆菌表达的pET表达载体dgt-14的构建
为了体外试验，将dgt-14 v6大肠杆菌优化的基因序列(SEQ ID NO:3)外包给GeneArt进行合成和克隆。经由添加的Nde I和Xho I限制性位点将合成的dgt-14 v6基因序列克隆到pET28表达载体中。使产生的构建体导入N-末端6X组氨酸标签和凝血酶结合基序。所述产生的构建体标记为pDAB100427(图3)。
在合成的dgt-14 v6上进行定向诱变以证实在氨基酸残基101的甘氨酸处导入的丙氨酸的作用。使用来自Stratagene(Santa Clara，CA)的Quick Change试剂盒来进行所述诱变。设计以下引物以产生氨基酸开关(amino acidswitch)。DGT14 MutF:(SEQ ID NO:155′ggATgCCggTAATgCAggAACCTgTgTTCgTCTgATgg),DGT14 MutR:(SEQ IDNO:165′CCATCAgACgAACACAggTTCCTgCATTACCggCATCC)。使用pDAB100427(dgt-14 v6)作为模板DNA，根据QuickChange方案建立PCR反应。将含有还原的dgt-14 v1野生型序列(SEQ ID NO:17)的构建体指定为pDAB102945(图4)并经由DNA测序进行证实。
另外的构建体，用于大肠杆菌表达的pET表达载体
为了体外试验，将dgt-11 v6、dgt-12 v6、dgt-18 v6、dgt-29 v6、以及dgt-30v6基因序列外包给GeneArt进行合成和克隆。将合成的基因克隆到pET28表达载体中。将产生的构建体标记为：含有dgt-11 v6的pDAB100431(图5)、含有dgt-11 v6的pDAB100432(图6)、含有dgt-18 v6的pDAB100435(图7)、含有dgt-29 v6的pDAB100446(图8)、以及含有dgt-30 v6的pDAB100436(图9)。
合成了另外的含有dgt-1、dgt-3和dgt-7的构建体。这些构建体用于dgt-1v5、dgt-1 v6、dgt-1 v7、dgt-1 v8、dgt-3 v6、dgt-3 v7、dgt-3 v8、dgt-7 v5、dgt-7v6、dgt-7 v7、以及dgt-7 v8基因序列的体外试验，将其外包给GeneArt进行合成和克隆。将合成的基因克隆到pET28表达载体中。将产生的构建体标记为：含有dgt-1 v5的pDAB102028、含有dgt-1 v6的pDAB102029、含有dgt-1 v7的pDAB102032、含有dgt-1 v8的pDAB102034、含有dgt-3 v6的pDAB100429、含有dgt-3 v7的pDAB100442、含有dgt-3 v8的pDAB100430、含有dgt-7 v5的pDAB102036、含有dgt-7 v6的pDAB102038、含有dgt-7 v7的pDAB102040、以及含有dgt-7 v8的pDAB102042。表达的这些构建体和DGT蛋白序列描述于美国专利申请号11975658，通过提述以其整体并入本文。
实施例4：体外生物化学酶动力学测定法
重组DGT酶的过表达和纯化
重组DGT蛋白在来自上述构建体的Rosetta2TM(DE3)细胞(Novagen，Madison，WI)中过表达。使用单个集落接种含有氯霉素(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的LB的50mL的起子培养物，将其在37℃培养过夜。使用过夜培养物来接种含有氯霉素(25μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)的1L的LB。在37℃培育这些培养物直到O.D.600＝0.6，然后置于冰水浴中持续10分钟。通过添加终浓度为500μM的IPTG实现靶蛋白的表达。进行诱导以在20℃进展过夜，然后在8,000rpm离心20分钟。将细胞沉淀在-80℃保存直到需要纯化时为止。所有纯化步骤均在4℃进行。
将来自1L培养物的细胞沉淀重悬于20-30mL的缓冲液A(50mM HEPESpH 7.5、150mM KCl、2mM DTT、1mM EDTA、20mM咪唑、以及5％甘油)中。添加COMPLETETM蛋白酶抑制剂混合物(1片/50mL，Roche，Indianapolis，IN)和溶菌酶(1mg/mL，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，并将悬浮液搅拌20分钟。使用Branson Sonifier 250(3x60秒爆破)进行细胞裂解，然后通过在16,000rpm离心45分钟去除细胞碎片。使用5mL HisTrap FF粗柱经由固定化金属亲和色谱(IMAC)以一个步骤将DGT酶纯化至同质。将所述柱在缓冲液A中平衡，并将样品加载到同样的缓冲液中。然后将所述柱用10个柱体积的缓冲液A洗涤，然后在0-100％的缓冲液B(50mM HEPES pH 7.5，200mM KCl，2mM DTT，1mM EDTA，500mM咪唑、以及5％甘油)线性梯度中以超过25个柱体积的进行洗脱。使用配备有10kDa截留分子量(MWCO)的Millipore超速离心装置，将如通过SDS-PAGE分析判别的含有靶蛋白的级分浓缩至2.5mL。使用PD-10柱(GE Healthcare)将纯化的DGT酶缓冲液交换至50mMHEPES pH 7.5、150mM KCl、2mM DTT、以及5％甘油，随后浓缩至～1mL。通常将样品以1:50稀释，且在Cary50Bio UV-可见光分光光度计上记录240-700nm的UV-可见光谱。然后基于在280nm处的吸光度(ExPASy,Geneva,Switzerland)利用理论消光系数来计算蛋白质浓度。
植物和细菌DGT酶的体外动力学表征
通过在由Lanzetta等(1979)描述的改良程序中的无机磷酸盐(Pi)产生来测量野生型(WT)和突变DGT的酶活性。Lanzetta P.,Alvarez L.,Reinach P.,和Candia O.,(1979)Anal Bioch.,100:95-97。在Spectra-Max 190酶标仪(plate reader)(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上以总体积50μL在96孔板中格式中进行测定。典型的测定含有50mM HEPES pH 7.5、150mM KCl、2mM DTT、以及1mM S3P。PEP和草甘膦浓度如指示而变化。从Sigma公司获得草甘膦，为游离酸，将其重悬在ddH2O中。通过加入KOH将草甘膦溶解，直到混合物为中性pH时为止。通过加入浓度在0.01μM到1μM之间变化的DGT酶启动测定。通过加入235μL的孔雀绿:钼酸铵溶液的3:1混合物终止反应。在完成显色之后(～1分钟)，记录在660nm处的吸光度变化，并根据标准曲线计算形成的Pi的量。没有酶的对照反应用来矫正背景吸光度。利用这种检测方法，高浓度的PEP(>2mM)和草甘膦(>30mM)贡献了显著量的背景吸光度。将数据拟合到Michaelis-Menten方程中，其允许确定Km和Vmax(方程式1)，而IC50是根据方程式2确定的，其中y为相对活性且s为希尔系数。使用GraFit版本5TM软件(Erithacus Software Limited，Horley，U.K.)分析数据。
方程式1:
v = V max . [ S ] K m + [ S ]
方程式2:
y = 100 % 1 + ( x IC 50 ) s
竞争性抑制剂的IC50值将取决于底物的浓度而变化，因此在表2中的IC50值是在1mM PEP和在60μM PEP(在植物中的细胞内PEP浓度的估计值)处获得的。仅仅应当比较在相同浓度的PEP处测量的IC50值。另外，通过Lanzetta的方法不能准确地测定高耐受性酶的IC50值，因此基于相对活性估计所述值。
植物DGT的动力学
首先检测具有未突变天然序列的两种酶DGT-1 v5和DGT-7 v5，以确立用于草甘膦敏感性的基线参数。两种蛋白质均显示出针对PEP的低Km值(约70μM)并且对草甘膦敏感，其中在1mM PEP处的IC50值为～20μM(表2)。如对于DGT-1 v6、DGT-3 v6、以及DGT-7 v6所观察的，从G到A的单个点突变显著提高了对草甘膦的耐受性(IC50值为8-21mM)，而且对于PEP的Km增加了～8倍。所有植物衍生的DGT(DGT-1 v7、DGT-3 v7、以及DGT-7 v7)的双突变(GAPS)也增强了草甘膦耐受性，但是再一次导致在PEP Km方面的显著升高(表2)。TIPS突变体(DGT-1 v8、DGT-3 v8、以及DGT-7 v8)对适度浓度的草甘膦(3-6mM)耐受，但是与GA突变体和GAPS突变体相反，Km水平保持接近野生型蛋白在60μM-200μM。图10表明在导入特定的突变之后的对于DGT-1(A)和DGT-7(B)的在草甘膦耐受性方面的变化。将PEP浓度保持在用于实验的1mM产生显示在图10中的数据，其很可能导致对于DGT-7 v8的IC50升高(>80mM)。进行进一步的程序来确定是否较低水平的PEP改变了对草甘膦的相对耐受性。生理学相关水平的PEP的范围是从5-60μM。对于60μM的PEP，IC50值显著降低(3.6mM)，表明初始测定受到过量PEP的影响，正如根据Michaelis-Menten动力学所预期和在表2中所指出。
图10显示在使用1mM PEP将不同的突变导入DGT-1(A)和DGT-7(B)中之后获得的IC50值。对于A和B两者的IC50曲线，实心三角形代表野生型，实心圆代表GA突变体，空心正方形代表GAPS突变体，并且实心正方形代表TIPS突变体。
表2.对于DGT酶的稳态动力学参数由于所用方法的限制，大于50的IC50值为估计值。*对于草甘膦的IC50是在100μM PEP处确定的。
细菌DGT的动力学
突变的DGT-14 v6(G101A突变)酶具有最有利的全部动力学参数和对草甘膦的耐受性(kcat/Km和升高的IC50)。所述酶耐受浓度>80mM的草甘膦并且显示出3x104M-1s-1的催化效率。正如预期的，野生型DGT-14 v1酶显示出显著较低的0.44mM的IC50(在60μM PEP处)，对于208.6μM的PEP的Km。天然酶或野生型酶也显示出高催化效率(5.3x104M-1s-1)。数据表明，即使DGT-14 v1相比于DGT-14 v6对草甘膦更敏感，它保留了一定的天生水平的高于天然植物酶的耐受性。由于在氨基酸残基101处导入丙氨酸残基取代甘氨酸，在1mM PEP处的IC50从～20.16mM变化到>80.00mM，并且从在60uMPEP处的0.44mM变化到>80mM。生理学相关水平的PEP的范围是从5μM到60μM。同样，在氨基酸101处引入丙氨酸残基取代甘氨酸导致对于PEP的Km从208.6μM增加到352.5μM。G101A突变的导入导致DGT-14 v6对草甘膦耐受性的提高。
另外，还针对五种其他细菌酶评估了它们对草甘膦的耐受性。除了DGT-11v6之外，全部都是甘氨酸突变成丙氨酸的变体，所述DGT-11v6包含野生型蛋白质序列并具有天然丙氨酸氨基酸残基。动力学参数和IC50值描述于表2中。在1mM PEP处，DGT-11v6、DGT-12 v6、DGT-18 v6、DGT-29 v6、以及DGT-30 v6酶分别对9.98mM、4.00mM、33.25mM、80mM、以及15.55mM浓度的草甘膦耐受。具有丙氨酸残基的酶的动力学参数和耐受性高于具有甘氨酸氨基酸残基的天然酶或野生型植物酶(DGT-1v5和DGT-7v5)。DGT-11v6、DGT-12 v6、DGT-18 v6、DGT-29 v6、以及DGT-30 v6具有指示所述酶耐受草甘膦的动力学参数。
实施例5：植物转化载体的克隆
植物二元载体的构建
标准克隆方法用于入门载体(entry vector)的构建中，所述入门载体含有与dgt-14连接为框内融合体的叶绿体转运肽多核苷酸序列。利用IN-FUSIONTMAdvantage Technology(Clontech,Mountain View,CA)，将含有与dgt-14融合的叶绿体转运肽(TraP)的入门载体装配。转运肽TraP4 v5(SEQ ID NO:18)、TraP5v1(SEQ ID NO:19)、TraP5 v2(SEQ ID NO:20)、TraP8 v2(SEQ ID NO:21)、TraP9 v2(SEQ ID NO:22)、TraP12 v2(SEQ ID NO:23)、以及TraP13 v2(SEQID NO:24)各自通过DNA2.0(Menlo Park，CA)合成且与dgt-14的5’端片段融合，直到并包括独特的AccI限制性内切核酸酶识别位点。
含有不同的TraP和dgt-14表达盒的二元质粒是由拟南芥(Arabidopsisthaliana)泛素10启动子(AtUbi10；Callis等(1990)J.Biol.Chem.，265:12486-12493)驱动的并且其侧翼为根癌土壤杆菌开放阅读框二十三3’非翻译区(AtuORF233’UTR；美国专利号5,428,147)。
使用Technology(Invitrogen，Carlsbad，CA)将组装的TraP和dgt-14表达盒工程改造且将其经由土壤杆菌介导的植物转化而转化到植物中。从New England BioLabs(NEB；Ipswich，MA)获得限制性核酸内切酶，且将T4DNA连接酶(Invitrogen)用于DNA连接。使用LR酶混合物(Invitrogen)进行Gateway反应，以将一种入门载体装配到单一目的载体中，所述目的载体含有选择标记盒木薯叶脉花叶病毒启动子(CsVMV；Verdaguer等，(1996)Plant Mol.Biol.，31:1129-1139)–DSM-2(美国专利申请号2007/086813)-根癌土壤杆菌开放阅读框一3’非翻译区(AtuORF13′UTR；Huang等(1990)J.Bacteriol.172:1814-1822)。遵循供应商的指示，使用Plasmid Kit(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)或Plasmid Midi KitTM(Qiagen)进行质粒制备。在琼脂糖Tris乙酸盐凝胶电泳之后，使用QIAquick Gel Extraction KitTM(Qiagen)分离DNA片段。
通过小量制备(miniprep)DNA的限制性消化初步筛选所有装配的质粒的集落。由商业测序商(Eurofins MWG Operon,Huntsville,AL)将所选择的克隆的质粒DNA进行测序。使用SEQUENCHERTM软件(Gene Codes Corp.,Ann Arbor,MI)将序列数据汇集并分析。
以下二元构建体表达不同的TraP:dgt-14融合体基因序列：pDAB107526(图11)含有TraP4 v5:dgt-14 v2(SEQ ID NO:25)；pDAB102787(图12)含有TraP5 v1:dgt-14 v2(SEQ ID NO:26)；pDAB105525(图13)含有TraP5 v2:dgt-14v2(SEQ ID NO:27)；pDAB105526(图14)含有TraP8 v2:dgt-14 v2(SEQ ID NO:28)；pDAB105527(图15)含有TraP9 v2:dgt-14 v2(SEQ ID NO:29)；以及pDAB105528(图16)含有TraP12 v2:dgt-14 v2(SEQ ID NO:30)；以及pDAB105529(图17)含有TraP13 v2:dgt-14 v2(SEQ ID NO:31)。
当构建框内融合体时，对dgt-14编码序列的初始甲硫氨酸残基进行微小修饰。例如，将pDAB105529、pDAB017526、pDAB105525、pDAB105526、pDAB105527、以及pDAB105528中的dgt-14编码序列中的甲硫氨酸改变为丙氨酸。pDAB102787中的甲硫氨酸保持不变。将所述修饰导入以促进叶绿体转运肽之后的dgt-14编码序列的克隆，且以上描述的序列表含有修饰的氨基酸残基。
实施例6：转化到拟南芥中并选择
拟南芥转化
使用来自Clough和Bent(1998)的浸花法转化拟南芥。使用含有上述二元质粒之一的选择的土壤杆菌集落接种一种或多种100mL的YEP培养液预培养物，所述培养液含有壮观霉素(100mg/L)和卡那霉素(50mg/L)。培养物在28℃以225rpm恒定搅拌温育过夜。在室温下使细胞在大约5000xg沉淀10分钟，并丢弃生成的上清液。将细胞沉淀轻柔地重悬于400mL的浸泡培养基(dunking media)中，所述培养基含有：5％(w/v)蔗糖、10μg/L 6-苄基氨基嘌呤、以及.04％Silwet L-77。将大约1月龄的植物浸渍在所述培养基中持续5-10分钟，并轻轻搅拌。将所述植物侧身放下并用透明或不透明的塑料袋覆盖2-3小时，然后直立放置。在22℃以16小时明/8小时暗光周期培育植物。在浸渍之后大约4周，收获种子。
转化植物的选择
使新近收获的T1种子[含有dgt-14和DSM-2表达盒]在室温下干燥7天。将T1种子播种于26.5cmx51cm的发芽盘中，每个盘接受200mg等分部分的分层的T1种子(～10,000粒种子)，所述种子先前已经悬浮于40mL的0.1％琼脂糖溶液中并且在4℃保存2天以完成休眠要求并保证同步种子萌发。
用细蛭石覆盖Sunshine Mix LP5并用Hoagland’溶液从地下灌溉直至潮湿，然后使其重力排水。用移液管将每40mL等分试样的分层的种子均匀地播种在蛭石上，并用保湿盖(humidity dome)覆盖4-5天。在使用草丁膦出苗后喷施进行初始转化体选择(选择共转化的DSM-2基因)之前1天将盖移除。
在七个种植后天数(DAP)以及还有11个DAP时，将T1植物(分别在子叶和2-4叶期)用0.2％的Liberty除草剂溶液(200g活性成分/L的草丁膦，BayerCrop Sciences，Kansas City，MO)以10ml/盘(703L/公顷)的喷施体积使用DeVilbiss压缩空气喷嘴进行喷施，从而每一施用递送有效率为280g活性成分/公顷的草丁膦。在最后喷施之后4-7天鉴定存活者(活跃生长的植物)，并将其逐一移植到3英寸(7.6厘米)的预备有盆栽基质(Metro Mix 360)的盆中。用保湿盖覆盖移栽的植物3-4天，将其如前置于22℃的生长室中或直接移动到温室中。随后将盖移除，在温室中培养植物(22±5℃，50±30％RH，14h明:10暗，最少500μE/m2s1天然光+补充光)。在存活T1植物上完成分子确认分析，以确认草甘膦耐受基因已经稳定整合到所述植物的基因组中。
分子确认
确认了在用pDAB105525、pDAB105526、pDAB105527、pDAB105528、pDAB105529、pDAB102787转化的拟南芥植物基因组中dgt-14和DSM-2转基因的存在。通过水解探针测定法(类似于TAQMANTM)初步筛选这些多核苷酸在T1拟南芥植物中的存在，从而确认DSM-2和dgt-14转基因的存在。通过基因表达盒PCR筛选事件，以确定dgt-14表达盒是否完全整合到植物基因组中而没有重排。使用从这些研究产生的数据来确定转基因拷贝数并鉴定选择拟南芥事件，以用于自体受精并推进到T2世代。也通过水解探针测定法筛选高等T2拟南芥植物以确认在所述植物染色体内DSM-2和dgt-14基因的存在并估计其拷贝数。下一步，使用Southern印迹测定法来确认在T1拟南芥植物子集上的估计拷贝数。最后，Western印迹试验验证所述事件表达了所述DGT-14蛋白。
水解探针测定法
使用下述水解探针测定法确定了在T1和T2拟南芥植物中的拷贝数。鉴定了具有不同数量的转基因的植物，将其用于后续草甘膦耐受性研究。
将组织样品收集在96孔板中，然后冷冻干燥2天。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠(Environ Metal Inc.,Sweet Home,Oregon)进行组织浸软。在组织浸软之后，使用Biosprint 96Plant(Qiagen,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量格式分离基因组DNA。用Quant-IT Pico Green DNA Assay KitTM(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)将基因组DNA定量。使用BIOROBOT3000TM自动移液器(Qiagen,Germantown,MD)将定量的基因组DNA调节至大约2ng/μL，以用于水解探针测定法。使用480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)通过实时PCR进行水解探针测定法确定转基因拷贝数。针对DSM-2、dgt-14以及内部参考基因TAFII15(GenbankID:NC003075；Duarte等,(201)BMC Evol.Biol.,10:61)来设计测定法。
为了扩增，制备了在10μL体积的多重反应物中的1X终浓度的480Probes母液混合物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，其含有针对DSM-2和dgt-14的0.1μM的各引物、针对TAFII15的0.4μM的各引物以及0.2μM的各探针(表3)。进行两步扩增反应，其中在60℃延伸40秒，并采集荧光。运行所有样品，并使用平均循环阈(Ct)值分析各个样品。利用相对定量模块且基于ΔΔCt方法，使用软件版本1.5进行实时PCR数据分析。为此，在每次运行中包括来自单拷贝校准器(single copycalibrator)的基因组DNA的样品以及已知的2个拷贝副本(check)。对于T1和T2转基因拟南芥植物确定水解探针筛选的拷贝数结果。
表3.用于DSM-2、dgt-14以及内部参考基因(TAFII15)的水解探针测定法的引物和探针信息。
引物名称 序列
DSM2A(SEQ ID NO:32) 5′AGCCACATCCCAGTAACGA 3′
DSM2S(SEQ ID NO:33) 5′CCTCCCTCTTTGACGCC3′
DSM2 Cy5探针(SEQ ID NO:34) 5′CAGCCCAATGAGGCATCAGC 3′
DGT14F(SEQ ID NO:35) 5′CCTCTTAGCTGGACTGTAT3′
DGT14R(SEQ ID NO:36) 5′CTTAGGATCAAGGCTAATCGTT 3′
UPL145探针 目录号04694317001(Roche,Indianapolis,IN)
TAFFY-HEX探针(SEQ ID NO:37) 5′AGAGAAGTTTCGACGGATTTCGGGC 3′
TAFII15-F(SEQ ID NO:38) 5′GAGGATTAGGGTTTCAACGGAG 3′
TAFII15-R(SEQ ID NO:39) 5′GAGAATTGAGCTGAGACGAGG 3′
通过Southern印迹分析确认dgt-14整合。
使用Southern印迹分析确立插入的T链DNA片段的整合模式并鉴定包含dgt-14的事件。产生数据来证明在拟南芥基因组内的转基因插入片段的整合和完整性。使用Southern印迹数据来鉴定T链DNA的完整拷贝的简单整合。使用对dgt-14基因表达盒特异的PCR扩增的探针进行详细的Southern印迹分析。探针与已经用特异性限制性内切酶消化的基因组DNA的杂交鉴定了具有特殊分子量的基因组DNA片段，其模式用于鉴定用于推进到下一个世代的全长的简单插入T1转基因事件。
将组织样品收集在2mL的锥形管(Eppendorf)中，然后冷冻干燥2天。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠进行组织浸软。在组织浸软之后，使用CTAB分离程序分离基因组DNA。使用Qiagen Genomic Tips试剂盒进一步纯化基因组DNA。用Quant-IT Pico Green DNATM测定试剂盒(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)将基因组DNA定量。为了浓度一致，将定量的基因组DNA调节到4μg。
对于每个样品，用限制性内切酶SwaI(New England Biolabs,Beverley,MA)充分消化4μg的基因组DNA，并将其在25℃温育过夜，然后将NsiI加入到反应中，然后在37℃温育6小时。通过用Quick Precipitation SolutionTM(EdgeBiosystems,Gaithersburg,MD)沉淀根据制造商的建议方案将消化的DNA浓缩。然后将基因组DNA重悬于25μL的65℃的水中持续1小时。将重悬的样品加载到在1X TAE中制备的0.8％琼脂糖凝胶上，在1X TAE缓冲液中以1.1V/cm电泳过夜。使所述凝胶依次经受变性(0.2M NaOH/0.6M NaCl)30分钟和中和(0.5M Tris-HCl(pH 7.5)/1.5M NaCl)30分钟。
通过借助于使用色谱纸芯和纸巾被动地芯吸20XSSC溶液过夜穿过所述凝胶到处理的IMMOBILONTMNY+转移膜(Millipore,Billerica,MA)上而进行DNA片段到尼龙膜的转移。在转移之后，将所述膜简单地用2XSSC洗涤，用STRATALINKERTM1800(Stratagene,LaJolla,CA)交联，在80℃真空烘焙3小时。
使用型号400杂交培养箱(Robbins Scientific,Sunnyvale,CA)在玻璃转瓶中用预杂交溶液(Perfect Hyb plus,Sigma,St.Louis,MO)在65℃将印迹物温育1小时。从含有完整编码序列的PCR片段制备探针。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒TM纯化PCR扩增子，并将其用α32P-dCTP通过Random RT Prime ITTM标记试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)进行标记。在65℃使印迹物与直接加入到杂交缓冲液中的变性探针杂交过夜，直到每印迹物每mL大约2百万个计数。杂交之后，依次将印迹物在65℃用0.1X SSC/0.1％SDS洗涤40分钟。最后，使印迹暴露于储磷成像屏并使用Molecular Dynamics Storm 860TM成像系统成像。
利用在这项研究中完成的SOUTHERN印迹分析来确定拷贝数并确认选定事件包含在拟南芥基因组中的dgt-14转基因。
通过PCR分析确认dgt-14基因表达盒
通过终点PCR反应检测包含在T1植物事件中的dgt-14基因表达盒的存在。将对dgt-14基因表达盒的AtuORF233′UTR v1区和AtUbi10启动子v2区特异的引物(参见表4)用于检测。
表4.用于dgt-14基因表达盒确认的寡核苷酸引物
引物名称 序列
正向寡核苷酸(SEQ ID NO:40) 5′CTGCAGGTCAACGGATCAGGATAT 3′
反向寡核苷酸(SEQ ID NO:41) 5′TGGGCTGAATTGAAGACATGCTCC 3′
PCR反应需要扩增基因表达盒的标准三步PCR循环方案。所有PCR反应均使用以下PCR条件完成：在94℃持续三分钟，随后为在94℃持续30秒、60℃持续30秒以及72℃持续三分钟的35个循环。使用EX-TAQ PCRTM试剂盒(TaKaRa Biotechnology Inc.Otsu,Shiga,Japan)按照制造商的指示完成所述反应。在最后的循环之后，将反应在72℃温育10分钟。利用TAE琼脂糖凝胶电泳来确定PCR扩增子大小。具有预期大小的PCR扩增子表明全长基因表达盒的存在在转基因拟南芥事件的基因组中存在。
通过定量反转录PCR分析确认dgt-14相对转录
将dgt-14转基因植物的组织样品收集在96孔板中并在80℃/-80℃冷冻。用KLECOTM组织粉碎机和钨珠(Environ Metal INC.,Sweet Home,Oregon)进行组织浸软。在组织浸软之后，使用Qiagen Rneasy 96TM试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)根据制造商建议的方案(包括在柱上的任选DNA酶Ⅰ处理)以高通量格式分离总RNA。这个步骤随后接着是洗脱的总RNA的附加DNA酶I(Ambion,Austin,TX)处理。使用总RNA作为模板，用高容量cDNA ReverseTranscriptionTM试剂盒(Applied Biosystems,Austin,TX)，遵循制造商的建议程序(添加寡核苷酸TVN)进行cDNA合成。表达的定量是通过水解探针测定法完成的并且通过实时PCR使用480系统(Roche AppliedScience,Indianapolis,IN)进行。使用Probe Design Software2.0，针对dgt-14和内部参考基因“未知的蛋白质”(Genbank登录号：AT4G24610)来设计测定法。为了扩增，制备了在10μL体积的单重反应物中的1X终浓度的480Probes母液混合物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，其含有0.4μM的各引物以及0.2μM的各探针(表5)。
进行两步扩增反应，其中在60℃延伸40秒，并采集荧光。以一式三份运行所有样品，并使用平均循环阈(Ct)值分析各个样品。对每个样品运行负反转录反应，以保证没有gDNA污染存在。基于ΔΔCt方法进行实时PCR数据分析。这种测定用来确定dgt-14在转基因拟南芥事件中的相对表达，所述事件被确定为是半合子的和纯合子的。dgt-14mRNA的相对转录水平的范围是内部对照的25.3倍到313.7倍高。这些数据表明，dgt-14转基因植物含有功能性的dgt-14基因表达盒，并且所述植物能够转录dgt-14转基因。
表5.用于dgt-14的定量反转录PCR分析的PCR引物
引物名称 序列
T26410LP(SEQ ID NO:42) 5′cgtccacaaagctgaatgtg 3′
T26410RP(SEQ ID NO:43) 5′cgaagtcatggaagccactt3′
PL146 目录号04694325001(Roche,Indianapolis,IN)
GT14F(SEQ ID NO:44) 5′CCTCTTAGCTGGACTGTAT3′
GT14R(SEQ ID NO:45) 5′CTTAGGATCAAGGCTAATCGTT 3′
PL145探针 目录号04694317001(Roche,Indianapolis,IN)
Western印迹分析
检测了获自转基因拟南芥植物的叶样品中的DGT-14。将来自dgt-14转基因植物的植物提取物和DGT-14蛋白标准品与8M尿素变性样品缓冲液在90℃温育5分钟，并在丙烯酰胺预制凝胶中进行电泳分离。然后利用制造商的方案将蛋白质电转移到硝酸纤维素膜上。在用Blocking Mix(Invitrogen)封闭之后，用抗DGT-14抗血清继之以山羊抗兔磷酸酶检测DGT-14蛋白。通过化学发光底物BCIP/NBT Western Analysis Reagent(KPL,Gaithersburg,MD)将检测的蛋白质可视化。经由Western印迹的完整DGT-14蛋白产生表明，所测定的dgt-14转基因植物表达了DGT-14蛋白。
实施例7：草甘膦耐受性
对含有dgt-14转基因的转基因T1拟南芥植物用不同比例的草甘膦喷施。将一系列不同浓度的草甘膦比例(包括升高的比例)应用于这项研究中来确定相对抗性水平(105、420、1,680或3,360g ae/公顷)。草甘膦的典型的1X大田使用比例是1,120g ae/公顷。在这项研究中使用的T1拟南芥植物在dgt-14转基因的拷贝数方面是可变的。使用上述分子确认测定法鉴定了低拷贝dgt-14T1拟南芥植物，并使其自花受粉且用来产生T2植物。表6显示相比于包含草甘膦除草剂抗性基因dgt-1(如美国专利申请号12558351中所述，通过引用将其全部内容并入本文)的对照植物、以及野生型对照的针对dgt-14转基因植物的抗性。
转化的dgt-14拟南芥植物的草甘膦选择结果
首先使用草丁膦选择方案从未转化种子的背景中选择拟南芥T1转化体。分析了三块平地(flats)或30,000粒种子的每一T1构建体。将以上选择的T1植物进行分子表征，随后将所述植物移栽到单独的盆中，并用如前所述的不同比例的商用草甘膦喷施。这些植物的剂量响应被提供为2个处理后周数(WAT)的视觉损伤％的形式。数据提供在表中，其显示个体植物展现出很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-40％)、或严重损伤(>40％)。提供了针对用于拟南芥转化的每一构建体的算术平均值和标准差。对于每一比例和转化的个体反应的范围也指示在最后一栏中。野生型非转化拟南芥(哥伦比亚栽培变种)用作草甘膦敏感对照。
植物响应水平在T1拟南芥植物中各不相同。这种变化可以归因于以下事实，即，每一植物代表独立的转化事件，因而感兴趣的基因的拷贝数在植物之间各不相同。以比例表示的总群体损伤平均值提供在表6中，表明对于不同的草甘膦比例由每个连接有叶绿体转运肽的dgt-14构建体相对于dgt-1和非转化野生型对照所提供的耐受性。所述事件含有连接有TraP8 v2(pDAB105526)、TraP9 v2(pDAB105527)、TraP12 v2(pDAB105528)以及TraP13 v2(pDAB105529)的dgt-14。来自T1植物的草甘膦选择数据表明，当dgt-14与这些叶绿体转运肽连接时，提供了针对高水平草甘膦的稳健的耐受性。比较而言，连接有TraP4 v5(pDAB107526)、TraP5 v2(pDAB105525)、以及TraP5 v1(pDAB102787)的dgt-14并不提供针对高浓度草甘膦处理的耐受性，但是相比于用同样比例的草甘膦处理的非转化(或野生型)对照，这些构建体更为耐受。另外，存在着当显示含有三个或更多个拷贝的dgt-14的事件对升高比例的草甘膦更为敏感时的情况。这些情况表示为在表6中显示的视觉损伤范围百分比。很有可能的是，在拟南芥植物内的转基因的高拷贝数的存在导致转基因沉默或其他后生效应，所述效应导致对草甘膦的敏感性，而不管dgt-14转基因的存在。
表6.与dgt-1(T2)分离群体和非转化对照相比较，dgt-14转化的T1拟南芥响应于一系列出苗后施用的草甘膦比例。2个施用后周数的视觉损伤％
使鉴定的含有低拷贝数(1-3个拷贝)转基因插入片段的选定T1拟南芥植物自体受精而产生用于另外评定草甘膦耐受性的第二世代。进一步表征含有1-3个拷贝dgt-14转基因的第二代拟南芥植物(T2)的草甘膦耐受性和草丁膦耐受性(草丁膦抗性表明，PAT表达盒是完整的并且在T1植物的自交过程中没有经历重排)。在T2代中，半合子植物和纯合子植物可用于检测每个事件，并因此而被包括用于检测每一草甘膦比例。相比于在一个基因座上含有两个相同的等位基因的纯合子植物，半合子植物在一个基因座上含有两个不同的等位基因。使用前述分子分析方案确认了T2植物的拷贝数和倍性水平。同样，使用如前所述的方法和比例施用草甘膦。所述植物的剂量响应被提供为2个处理后周数(WAT)的视觉损伤％的形式。数据提供为个体的直方图，其展现出很少或没有损伤(<20％)、中等损伤(20-40％)、或严重损伤(>40％)。提供了针对用于拟南芥转化的每一构建体的算术平均值和标准差。对于每一比例和转化的个体反应的范围也指示在最后一栏中。野生型非转化拟南芥(哥伦比亚栽培变种)用作草甘膦敏感对照。另外，包含草甘膦除草剂抗性基因dgt-1(如美国专利申请号12558351中所述，通过提述将其全部内容并入本文)的植物作为阳性对照而被包括在内。
在T2代中，表征了单拷贝和低拷贝(两个或三个拷贝)dgt-14事件的草甘膦耐受性。以比例表示的总群体损伤平均值提供在表7中，表明对于不同的草甘膦比例由每个连接有叶绿体转运肽的dgt-14构建体相对于dgt-1和非转化野生型对照所提供的耐受性。所述T2代事件含有连接有TraP8 v2(pDAB105526)、TraP9 v2(pDAB105527)、TraP12 v2(pDAB105528)以及TraP13 v2(pDAB105529)的dgt-14。所有这些事件对草甘膦均具有高度抗性。结果表明，T2拟南芥植物针对所有测试的草甘膦浓度的损伤范围小于20％。与含有其他TraP转运肽的其他dgt-14构建体相比，含有与TraP4 v5(pDAB107526)、TraP5v2(pDAB105525)、以及TraP5 v1(pDAB102787)连接的dgt-14的T2拟南芥事件没有提供针对草甘膦的稳健的耐受性。然而，与TraP4 v5(pDAB107526)、TraP5 v2(pDAB105525)、以及TraP5 v1(pDAB102787)连接的dgt-14构建体确实提供了低水平的草甘膦耐受性，其与非转化对照相比明显更高。总体上来说，结果显示，含有并表达DGT-14的植物产生了针对草甘膦的商用抗性水平，所述水平处于高达3倍的大田比例(1120g ae/公顷)的水平。
表7.与dgt-1(T2)分离群体和非转化对照相比较，dgt-14转化的T2拟南芥响应于一系列出苗后施用的草甘膦比例。2个施用后周数的视觉损伤％数据代表来自每一构建体的选择的单拷贝品系，所述单拷贝品系被分离为遗传度筛选中的单基因座。
使鉴定的含有低拷贝数(1-3个拷贝)转基因插入片段的随机选择的T2拟南芥植物自体受精而产生用于另外评定草甘膦耐受性的第三世代。将来自第三代(T3)的拟南芥种子种植，并使用如前所述的相同方案评估其草甘膦耐受性。检测了T3代中的事件，T3代含有来自纯合的每一品系的重复(正如通过使用草丁膦抗性筛选以鉴定是否任何高等植物显示出转基因的分离所确定的)。通过LC-MS-MS测定这些事件以确认所述植物表达了DGT-14蛋白。以草甘膦比例表示的T3代的总群体损伤平均值的结果提供在表8中，其显示了针对不同草甘膦比例的由每一dgt-14构建体提供的草甘膦耐受性。示例性的T3事件包含连接有TraP8 v2(pDAB105526)、TraP9 v2(pDAB105527)、TraP12 v2(pDAB105528)以及TraP13 v2(pDAB105529)的dgt-14。所有这些事件对草甘膦均具有高度抗性。结果表明，T3拟南芥植物针对所有测试的草甘膦浓度的损伤范围小于20％。与含有不同TraP转运肽的其他dgt-14构建体相比，含有与TraP5 v2(pDAB105525)以及TraP5 v1(pDAB102787)连接的dgt-14的T3拟南芥事件没有提供针对草甘膦的稳健的耐受性。然而，与TraP5 v2(pDAB105525)以及TraP5 v1(pDAB102787)连接的dgt-14构建体确实提供了低水平的草甘膦耐受性，其与非转化对照相比明显更高。总体上来说，结果显示，含有并表达DGT-14的植物产生了针对草甘膦的商用抗性水平，所述水平处于高达3倍的大田比例(1120g ae/公顷)的水平。
表8.与dgt-1(T2)分离群体和非转化对照相比较，dgt-14转化的T3拟南芥响应于一系列出苗后施用的草甘膦比例。2个施用后周数的视觉损伤％。数据代表来自每一构建体的选择的单拷贝群体，所述单拷贝群体被分离为T2遗传度筛选中的单基因座。
dgt-14用作选择标记
用上述拟南芥转化的植物测试了dgt-14作为草甘膦选择剂的选择标记的用途。将大约50粒T4代拟南芥种子(对于dgt-14为纯合的)掺入大约5,000粒野生型(对草甘膦敏感)种子中。使种子萌发，用选择剂量的草甘膦喷施小植物。比较了几种草甘膦处理；每盘植物接受以下处理方案之一中的草甘膦的一种或两种施用时间：7个DAP(种植后天数)、11个DAP、或7个DAP后继之以11个DAP。由于所有植物也含有在相同转化载体中的草丁膦抗性基因，用草甘膦选择的含有dgt-14的植物可以直接与用草丁膦选择的含有DSM-2或pat的对照植物比较。
草甘膦处理为用如前所述的DeVilbiss喷嘴施用。含有dgt-14的转基因植物被鉴定为“抗性的”或“敏感的”17DAP。在7个和11个种植后天数(DAP)时给予26.25-1680g ae/公顷草甘膦处理显示针对含有dgt-14的转基因拟南芥植物的有效选择。对敏感性植物和抗性植物计数，并发现耐草甘膦植物的数量与种植的含有dgt-14转基因的转基因种子的原始数目相关联。这些结果表明，dgt-14可以有效地用作针对转化的拟南芥群体的可选的选择标记。
dgt-14的遗传度
使确认的转基因T1拟南芥事件自花授粉而产生T2种子。这些种子为通过将含有草丁膦(200g ae/公顷)的IgniteTM除草剂施用到100株随机T2同胞而被测试的子代。在喷雾施用(履带喷雾器，以187L/公顷的施用比例)之前，将每一个体T2植物移栽到7.5cm的方盆中。对于如通过Chi方分析(P>0.05)确定的具有孟德尔遗传的优势遗传的单个基因座，将所述T1家族(T2植物)以预期的3抗性:1敏感模型分离。用预期的孟德尔遗传分离的T1家族的百分比展示在表9中，并证明dgt-14性状经由孟德尔遗传传递到T2世代。从5个到15个T2个体(T3种子)收集种子。来自3-4个随机选择的T2家族的每一个中的二十五个T3同胞为如前所述检测的子代。数据显示没有分离，因而证明dgt-14被稳定整合在染色体内并以孟德尔方式遗传到至少三世代。
表9.针对100株植物的子代测试的分离为单个孟德尔遗传的T1家族(T2植物)的百分比。
感兴趣的基因 在1基因座分离的测试的T1家族(％)
TraP4 v2-dgt-14 80％
TraP5 v1-dgt-14 80％
TraP5 v2-dgt-14 75％
TraP8 v2-dgt-14 100％
TraP9 v2-dgt-14 100％
TraP12 v2-dgt-14 100％
TraP13 v2-dgt-14 50％
yfp转基因对照 100％
实施例8：另外的作物种类的转化
可通过利用先前在WO 2007/053482的实施例11或实施例13中描述的相同技术，用dgt-14、dgt-11、dgt-12、dgt-18、dgt-29、或dgt-30基因转化大豆而提供高水平的针对除草剂草甘膦的抗性。
可通过利用先前在专利申请美国专利号7,838,733的实施例14或WO2007/053482(Wright等)的实施例12中描述的相同技术，用dgt-14、dgt-11、dgt-12、dgt-18、dgt-29、或dgt-30基因转化棉花而提供高水平的针对除草剂草甘膦的抗性。
可通过利用先前在专利申请美国专利号7,838,733的实施例26或WO2007/053482(Wright等)的实施例22中描述的相同技术，用dgt-14、dgt-11、dgt-12、dgt-18、dgt-29、或dgt-30基因转化卡诺拉/芸苔而提供高水平的针对除草剂草甘膦的抗性。
实施例9：其他作物的土壤杆菌介导的转化
根据题述公开，可根据题述公开的实施方案使用本领域已知的技术转化另外的作物。对于黑麦的土壤杆菌介导的转化，参见例如Popelka JC,Xu J,Altpeter F.,“Generation of rye with low transgene copy number after biolistic genetransfer and production of(Secale cereale L.)plants instantly marker-freetransgenic rye,”Transgenic Res.2003Oct；12(5):587-96.)。对于高粱的土壤杆菌介导的转化，参见例如，Zhao等,“Agrobacterium-mediated sorghumtransformation,”Plant Mol Biol.2000Dec；44(6):789-98。对于大麦的土壤杆菌介导的转化，参见例如，Tingay等,“Agrobacterium tumefaciens-mediated barleytransformation,”The Plant Journal,(1997)11:1369-1376。对于小麦的土壤杆菌介导的转化，参见例如，Cheng等,“Genetic Transformation of Wheat Mediatedby Agrobacterium tumefaciens,”Plant Physiol.1997Nov；115(3):971-980。对于水稻的土壤杆菌介导的转化，参见例如，Hiei等,“Transformation of ricemediated by Agrobacterium tumefaciens,”Plant Mol.Biol.1997Sep；35(1-2):205-18。
这些和其他植物的拉丁名称在下面给出。应当清楚的是，可使用其他的(非土壤杆菌)转化技术来将例如dgt-14转化到这些和其他植物中。例子包括但不限于；玉蜀黍(Zea mays)、小麦属物种(Triticum spp.)、水稻(稻属物种(Oryza spp.)和菰属物种(Zizania spp.))、大麦(大麦属物种(Hordeum spp.))、棉花(水麻(Abroma augusta)和棉属物种(Gossypium spp.))、大豆(Glycine max)、糖用甜菜和菜用甜菜(Beta spp.)、甘蔗(Arenga pinnata)、番茄(Lycopersicon esculentum和其他种类、粘果酸浆(Physalis ixocarpa)、黄水茄(Solanum incanum)和其他种类、以及树番茄(Cyphomandra betacea))、马铃薯(Solanum tuberosum)、甘薯(Ipomoeabatatas)、黑麦(Secale spp.)、椒类(辣椒(Capsicum annuum)、中国辣椒(chinense)、以及小米椒(Capsicum frutescens))、莴苣(山莴苣(Lactuca sativa)、宿根莴苣(perennis)、以及野莴苣(pulchella))、卷心菜(Brassica spp.)、芹菜(Apiumgraveolens)、茄子(Solanum melongena)、花生(Arachis hypogea)、高粱(Sorghumspp.)、苜蓿(Medicago sativa)、胡萝卜(Daucus carota)、豆类(菜豆属(Phaseolusspp.)和其他属)、燕麦(Avena sativa和strigosa)、豌豆(豌豆属(Pisum)、豇豆属(Vigna)、和Tetragonolobus spp.)、向日葵(Helianthus annuus)、瓜类(Cucurbitaspp.)、黄瓜(Cucumis sativa)、烟草(Nicotiana spp.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、草坪草(黑麦草属(Lolium)、剪股颖属(Agrostis)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、以及其他属)、三叶草(Trifolium)、巢菜(Vicia)。例如在题述公开的实施方案可中可预期用dgt-14、dgt-11、dgt-12、dgt-18、dgt-29、以及dgt-30基因转化这样的植物。
Dgt-14、dgt-11、dgt-12、dgt-18、dgt-29、以及dgt-30基因具有增加关键草甘膦除草剂在许多落叶木材作物系统和常绿木材作物系统中的时令用途中的适用性的潜力。草甘膦除草剂抗性木材种类将增加过多使用这些除草剂而无损伤之忧的灵活性。这些种类包括，但不限于；桤木(桤木属(Alnus spp.))、白蜡木(ash)(梣属(Fraxinus spp.))、白杨和杨树种类(杨属(Populus spp.))、山毛榉(山毛榉属(Fagus spp.))、桦树(桦木属(Betula spp.))、樱桃(李属(Prunus spp.))、桉树(桉树属(Eucalyptus spp.))、山胡桃树(山核桃属(Carya spp.))、枫树(枫属(Acer spp.))、橡树(栎属(Quercus spp.))、以及松树(松属(Pinus spp.))。
将草甘膦除草剂抗性用于观赏物种和结实物种的选择性杂草控制也在本公开的实施方案的范围之内。例子包括但不限于：玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、火焰卫矛(burning bush)(卫矛属(Euonymus spp.))、牵牛花(petunia)(矮牵牛属(Petunia spp.))、秋海棠(秋海棠属(Begonia spp.))、杜鹃花(杜鹃花属(Rhododendron spp.))、海棠或苹果(苹果属(Malus spp.))、梨(梨属(Pyrus spp.))、桃树(李属(Prunus spp.))、以及金盏花(万寿菊属(Tagetes spp.))。
实施例10：玉米转化
用于玉米转化的DNA构建体
如上所述的标准克隆方法用于构建供在玉米的根癌土壤杆菌介导的转化中使用的二元载体。以下基因元件用于在含有dgt-14的载体中使用；玉蜀黍泛素1启动子(ZmUbi1；美国专利号5,510,474)用来驱动dgt-14编码序列，所述dgt-14编码序列的侧翼为玉蜀黍脂肪酶3’非翻译区(ZmLip 3’UTR；美国专利号7179902)，选择标记盒包含/组成为玉蜀黍泛素1启动子，其用来驱动aad-1编码序列(美国专利号7,838,733)，所述aad-1编码序列的侧翼为玉蜀黍脂肪酶3’非翻译区。所述aad-1编码序列赋予针对苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)以及针对芳氧苯氧丙酸酯(AOPP)除草剂的耐受性。将dgt-14构建体构造为标准二元载体和土壤杆菌超二元系统载体(Japan Tobacco，Tokyo，JP)。
穗消毒和胚分离
为了获得玉米未成熟胚，在温室中培育玉蜀黍近交系B104的植物，并使其自花授粉或近缘授粉而产生穗。大约在授粉后9-12天收获穗。在实验日，通过将穗浸没在次氯酸钠(5％)的20％溶液中并且振摇20-30分钟进行表面消毒，接着在无菌水中漂洗三次。在消毒之后，将未成熟合子胚(1.5–2.4mm)从每个穗无菌切开，并随机分配到含有液体感染培养基(LS基础培养基，4.43gm/L；N6维生素溶液[1000X]，1.00mL/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；蔗糖，68.5gm/L；D(+)葡萄糖，36.0gm/L；10mg/ml的2,4-D，150μL/L)的微量离心管中。对于一组给定的实验，使用从三个穗汇集的胚用于每一转化。
土壤杆菌培养启动:
将含有上述二元转化载体的土壤杆菌的甘油储液划线接种在含有适当抗生素的AB基本培养基平板上，并在20℃培养3-4天。挑选单个集落并划线接种到含有相同抗生素的YEP平板上，在28℃温育1-2天。
土壤杆菌培养和共培养：
从YEP平板取得土壤杆菌集落，悬浮于在50mL的一次性管中的10mL的感染培养基中，使用分光光度计将细胞密度调整为在O.D.600nm的0.2-0.4。将土壤杆菌培养物置于在125rpm、室温下的回转摇床上，同时进行胚切开。从消毒的玉米粒中分离出在尺寸上为1.5-2.4mm的未成熟合子胚，置于1mL的感染培养基中，并在同样的培养基中洗涤一次。将土壤杆菌悬浮液(2mL)添加到每一管中，并将所述管置于摇床平台上持续10-15分钟。将所述胚转移到共培养培养基上(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM，3.00gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/mlAgNO3，15.0mg/L；DMSO，100μM)，使胚盘取向为面朝上并在25℃在50□摩尔m-2sec-1光强度24小时光照下温育3天。
愈伤组织选择和假定事件的再生
在共培养期之后，将胚转移到没有选择剂的静息培养基(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；1,2,3,5/4,6-环己六醇，100mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；Gelzan 2.30gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)中，在50μ摩尔m-2sec-1光强度24小时光照下在25℃温育3天。生长抑制剂量响应实验表明，0.25mM或更高的草甘膦浓度足以抑制未转化B104玉米品系中的细胞生长。将胚转移到含有0.5mM草甘膦的选择1培养基(MS盐，4.33gm/L；L-脯氨酸，700.0mg/L；肌醇，100.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)上，并在黑暗和/或50μ摩尔m-2sec-1光强度24小时光照下在28℃温育7-14天。将增生的胚性愈伤组织转移到含有1.0mM草甘膦的选择2培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-环己六醇，100mg/L；L-脯氨酸，700mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.500gm/L；酪蛋白酶水解物100.0mg/L；30mM麦草畏-KOH，3.3mg/L；蔗糖，30.0gm/L；GelzanTM2.30gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，15.0mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L；R-吡氟氯禾灵(酸)0.1810mg/L)上，并在黑暗和/或50μ摩尔m-2sec-1光强度24小时光照下在28℃温育14天。这个选择步骤允许转基因愈伤组织进一步增殖和分化。所述愈伤组织选择期持续三至四周。将增生的胚性愈伤组织转移到含有0.5mM草甘膦的PreReg培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-环己六醇，100mg/L；L-脯氨酸，350.0mg/L；MES[(2-(n-吗啉代)-乙磺酸)，游离酸]0.250gm/L；酪蛋白酶水解物50.0mg/L；NAA-NaOH 0.500mg/L；ABA-EtOH 2.50mg/L；BA 1.00mg/L；蔗糖，45.0gm/L；GelzanTM2.50gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；8.5mg/ml AgNO3，1.00mg/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)上，在50μ摩尔m-2sec-1光强度24-小时光照下在28℃培养7天。将具有芽样(shoot-like)出芽的胚性愈伤组织转移到含有0.5mM草甘膦的再生培养基(MS盐，4.33gm/L；1,2,3,5/4,6-环己六醇，100.0mg/L；蔗糖，60.0gm/L；结冷胶G434TM3.00gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；羧苄青霉素，125.0mg/L)上，在50μ摩尔m-2sec-1光强度24-小时光照下培养7天。将具有初生根的小芽转移到在植物盘(phytotray)中的生根培养基(MS盐，4.33gm/L；改良的MS-Vitamin[1000X]，1.00ml/L；1,2,3,5/4,6-环己六醇，100mg/L；蔗糖，60.0gm/L；结冷胶G434TM3.00gm/L；羧苄青霉素，250.0mg/L)上，以140-190μ摩尔m-2sec-1光强度的16/8小时明/暗周期在27℃温育7天。使用上述方案分析推定的转基因小植物的转基因拷贝数并将其转移到土壤中。
在玉米植物内dgt-14和aad-1转基因存在的分子确认
通过水解探针测定法确认dgt-14和aad-1多核苷酸序列的存在。经由类似于TAQMANTM的水解探针测定法初步筛选分离的T0玉米植物，从而确认aad-1和dgt-14转基因的存在。从这些研究产生的数据被用来确定转基因拷贝数并用来选择转基因玉米事件，以用于回交并推进到T1世代。
将组织样品收集在96孔板中，用KLECOTM组织粉碎机和不锈钢珠(Hoover Precision Products,Cumming,GA)在QiagenTMRLT缓冲液中进行组织浸软。在组织浸软之后，使用Biosprint 96TMPlant试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)根据制造商建议的方案以高通量格式分离基因组DNA。用Quant-IT PicoGreen DNA Assay试剂盒TM(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)将基因组DNA定量。使用BIOROBOT3000TM自动移液器(Qiagen,Germantown,MD)将定量的基因组DNA调节至大约2ng/μL用于水解探针测定。使用480系统(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)通过实时PCR进行水解探针测定法(类似于测定)确定转基因拷贝数。使用Probe Design Software 2.0，针对aad-1、dgt-14和内部参考基因Invertase(Genbank登录号U16123.1)设计测定。为了扩增，制备了在10μL体积的多重反应物中的1X终浓度的480Probes母液混合物(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)，其含有针对aad-1和dgt-14的0.4μM的各引物以及0.2μM的各探针。进行两步扩增反应，其中在60℃延伸40秒，并采集荧光。运行所有样品，并使用平均循环阈(Ct)值分析各个样品。利用相对定量模块，且基于ΔΔCt方法，使用软件版本1.5进行实时PCR数据分析。对照包括来自单拷贝校准器(single copy calibrator)的基因组DNA样品以及在每次运行中包括的已知的两个拷贝副本。
在dgt-14转化的T0玉米中的出苗后除草剂耐受性
使T0事件在温室中驯化并将其培育直到从轮生体(即，从组织培养过渡到温室生长条件的植物)出现二至四片新的外观正常的(normal looking)叶子时为止。在温室中在16小时光照:8小时黑暗的条件下在27℃培育植物。用添加有2％w/v硫酸铵的Durango DMATM(含有除草剂草甘膦)的商用制剂处理植物。用履带喷雾器以187L/公顷的喷施体积、50cm的喷施高度进行除草剂施用。用草甘膦范围为280-4480g ae/公顷的草甘膦喷施T0植物，所述范围能够显著损伤未转化的玉米品系。致死剂量被定义为引起B104近交株＞95％损伤的比例。
T0dgt-14玉米植物的结果证明，以高达4480g ae/公顷的比例实现了针对草甘膦的耐受性。使选择的T0植物自交或回交以进一步在下一代中表征。另外的实验包括在含有T1植物的选择的dgt-14品系上进行的100株植物子代测试。如前所述用140-1120g ae/公顷的草丁膦或105-1680g ae/公顷的草甘膦喷施所有植物。选择标记和草甘膦抗性基因两者均构建在相同的质粒上。因此，如果通过用除草剂喷施而选择一种耐除草剂基因，则这两种基因都被认为是存在的。在十四个DAT时，对抗性植物和敏感植物进行计数，以确定分离为单基因座、显性孟德尔性状(3R:1S)的品系的百分比，正如通过Chi方分析确定的。这些数据表明，dgt-14可作为稳健的草甘膦抗性基因在单子叶植物种类中遗传。将增加比例的草甘膦施用到T1或F1存活者上，以进一步表征由dgt-14基因提供的耐受性和保护。
草甘膦作为选择标记的出苗后除草剂耐受性用途
如前所述，将T0转化植物从组织培养物移除并使其在温室中驯化。检测的事件含有与几种不同的叶绿体转运肽连接的dgt-14。证明这些T0植物提供了稳健的高达4480g ae/公顷草甘膦的耐受性，而用低至280g ae/公顷浓度的草甘膦可控制非转化植物。这些数据表明，使用浓度范围为280-4480g ae/公顷的草甘膦，可利用dgt-14作为选择标记。
另一个实施方案包括将含有dgt-14转基因的一定数量的来自固定玉米品系的种子掺加到一定数量的非转化玉米种子中。将所述种子种植并培育到V1-V3发育阶段，此时用在280-4480g ae/公顷范围的选择剂量的草甘膦喷施小植物。在7-10天之后，对敏感性和抗性植物计数，并发现耐草甘膦植物的量与种植的含有dgt-14转基因的转基因种子的原始数目相关联。
实施例11：与其他性状的堆叠
含有昆虫抗性(IR)性状的转基因作物盛行于遍及北美洲的玉米、大豆、以及棉花植物中，这些性状的使用在全世界扩展。已经由多家种子公司开发了结合昆虫抗性和除草剂耐受性(HT)性状的商业转基因作物。这些包括苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)性状(例如，在网址lifesci.sussex.ac.uk，2006列出的Bt毒素)、非Bt昆虫抗性性状、以及任何或所有以上提及HT性状。通过IR性状控制多重虫害问题的能力是有价值的商业产品概念。然而，如果杂草控制和昆虫控制彼此独立，则这种产品概念的便利将受到限制。单独的或与一个或多个另外的HT性状堆叠的Dgt-14可以通过常规育种或联合地作为新颖的转化事件与一个或多个另外的输入性状(例如，昆虫抗性、真菌抗性、或应激耐受性等等)(参见www.isb.vt.edu)堆叠。示例性的IR性状可与dgt-14堆叠。在获得IR性状的编码序列之后，本领域技术人员可添加表达元件(例如，启动子、内含子、3′UTR，等等)，并通过重组DNA方法将IR性状与dgt-14在分子水平堆叠。示例性的IR性状候选物包括：Cry1F(美国专利号5,126,133；5,188,960；5,691,308；6,096,708；6,573,240；和6,737,273)、Cry1A(c)(美国专利号6,114,138；5,710,020；6,251,656；和6,229,004)、作为与任一dgt-14的三重堆叠的Cry1F和Cry1A(c)、Cry34Ab(1)(美国专利号7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,875,430；7,932,033；7,956,246；6,340,593)、Cry35 Ab(1)(美国专利号6,340,593；7,323,556；7,897,342；7,888,495；7,875,430；7,932,033；7,956,246)、或作为与任一dgt-14的三重堆叠的Cry35Ab(1)和Cry34Ab(1)。益处包括由dgt-14提供的并在前述实施例中描述的改进的杂草控制，这与管理昆虫害虫和或其他农学应激的能力关联。因而，题述公开的实施方案可以用来提供具有灵活且有成本效益地控制任何数量的农学问题的能力的改进的作物质量的完整农学包装。
组合的IR和HT性状可应用于大多数农艺学和园艺学/观赏作物和林业中。dgt-14与其相称的由任何数量的Bt或非Bt的IR基因提供的除草剂耐受性和昆虫抗性的组合可以应用于在实施例8和9中列出的(但不限于)作物种类。在杂草控制领域的技术人员将认识到，通过常规育种或基因工程，通过dgt-14转化及其与相应HT性状或IR性状堆叠，使得有可能使用任何描述的多种商业除草剂。可通过在CPR(Crop Protection Reference)书籍或类似编物中汇编的除草剂标签、在线(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的标签、或任何商业或学术作物保护指南(如来自Agriliance的Crop Protection Guide(2005))来确定代表这些化学品的除草剂的特殊比例。通过单独使用的、桶混的、或依次使用的dgt-14，使得每一替代性除草剂可用于HTC中，这是本公开的实施方案的范围内所考虑的。
实施例12：在任何作物中与AAD性状堆叠的DGT-14性状
通过经由常规育种或联合地作为新颖的转化事件将dgt-14性状与aad性状(例如，描述于美国专利号7838733中的aad-1；或描述于2007/053482 A2中的aad-12)堆叠，可以提高杂草控制效力、灵活性、以及管理杂草变化(shift)和除草剂抗性发展的能力。
具有aad-1的转化作物允许种植者选择性地将芳氧基链烷酸除草剂施用于单子叶作物中。这样的单子叶作物将具有更高的苯氧基生长素安全性界限。另外，可将苯氧基生长素选择性地施用于用aad-1转化的双子叶植物中。具有aad-12的转化作物允许种植者选择性地将吡啶氧基生长素和芳氧基链烷酸除草剂施用在双子叶作物中以控制杂草物种。通过使dgt-14与aad-1或aad-12性状堆叠，种植者被提供针对杂草管理的更广谱的除草剂。而且，使用除草剂组合将导致用于管理杂草物种内的除草剂抗性的更多的灵活性。
可以设想针对改进的杂草控制选项的若干方案，其中dgt-14性状和aad性状堆叠在任何单子叶或双子叶作物物种中。
a)可以标准出苗后施用比例(420到2160g ae/公顷，优选560到1120g ae/公顷)施用草甘膦，以便控制大多数禾本科植物和阔叶杂草物种。dgt-14性状可提供处于这些草甘膦施用比例的耐受性。为了控制抗草甘膦阔叶杂草例如小蓬草(Conyza canadensis)或用草甘膦固有地难以控制的杂草(例如，鸭跖草属物种(Commelina spp))，可以与草甘膦依次地、桶混地、或作为预混物施用280-2240g ae/公顷(优选560-1120g ae/公顷)的2,4-D，以提供另外的控制。aad-1和aad-12两者均提供针对2,4-D的耐受性。
另外，aad-12提供针对吡啶氧基生长素除草剂例如绿草定和氟草烟的耐受性。可以施用吡啶氧基生长素除草剂来控制草甘膦抗性阔叶杂草，如小蓬草(Conyza canadensis)或鸭跖草属物种(Commelina spp)。对于绿草定，施用率的范围将典型地为70-1120g ae/公顷，更典型地为140-420g ae/公顷。对于氟草烟，施用率的范围将典型地为35-560g ae/公顷，更典型地为70-280g ae/公顷。
b)可以标准出苗后施用比例(420到2160g ae/公顷，优选560到1120g ae/公顷)施用草甘膦，以便控制大多数禾本科植物和阔叶杂草物种。为了控制抗草甘膦禾本科植物种类例如硬直黑麦草(Lolium rigidum)或牛筋草(Eleusineindica)，可以与草甘膦依次地、桶混地、或作为预混物施用10-200g ae/公顷(优选20-100g ae/公顷)的喹禾灵以提供有效的控制。Aad-1提供针对喹禾灵的耐受性。在作物物种中堆叠aad-1与dgt-14组合将产生对上述除草剂耐受的作物。
c)草甘膦在控制禾本科植物种类而非阔叶杂草物种中是有效的。Aad-1和dgt-14堆叠的性状将允许施用禾本科植物有效的比例的草甘膦(105-840g ae/公顷，更优选地210-420g ae/公顷)。然后，可与禾本科植物有效的比例的草甘膦依次地、桶混地、或作为预混物施用2,4-D(以280-2240g ae/公顷，更优选地560-1120g ae/公顷)以提供必要的阔叶杂草控制。10-200g ae/公顷(优选地20-100g ae/公顷，且更优选地20-35g ae/公顷)的AOPP除草剂例如喹禾灵可用于更稳健地控制禾本科杂草和/或延迟抗草甘膦禾本科植物的产生。低草甘膦比例也将对阔叶杂草控制提供一定的益处；然而，初步控制将来自2,4-D。
d)同样，aad-12和dgt-14堆叠的性状将允许以禾本科植物有效的比例施用草甘膦(105-840g ae/公顷，更优选地210-420g ae/公顷)。然后，可与禾本科植物有效的比例的草甘膦依次地、桶混地、或作为预混物施用2,4-D(以280-2240g ae/公顷，更优选地560-1120g ae/公顷)，以提供必要的阔叶杂草控制。以上述比例使用的绿草定和氟草烟也将是处理方案中可接受的组分。低草甘膦比例也将对阔叶杂草控制提供一定的益处；然而，初步控制将来自2,4-D、绿草定、或氟草烟。
杂草控制领域的技术人员将认识到，通过将aad-12转化到作物中，使得可能单独地使用一种商业芳氧基生长素除草剂或多种商业芳氧基生长素除草剂的组合(依次地或独立地)。同样，通过aad-1，使得可能单独地使用一种商业苯氧基生长素除草剂或多种商业苯氧基生长素除草剂的组合(依次地或独立地)。这些性状的任一种与dgt-14的堆叠允许更稳健的杂草物种管理。可通过在CPR(Crop Protection Reference)书籍或类似编物中汇编的除草剂标签、在线(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的标签、或任何商业或学术作物保护指南(例如来自Agriliance的Crop Protection Guide(2005))来确定代表这些化学品的其他除草剂的特殊比例。无论通过单独使用的、桶混的还是依次使用的aad-12、aad-1、或dgt-14而使得每一替代性除草剂可用于HTC中，这是本公开的实施方案的范围内所考虑的。
实施例13：在任何作物中与AHAS性状堆叠的DGT-14
编码咪唑啉酮除草剂耐受性的性状(AHAS)目前存在于种植在北美的许多作物中，包括但不限于，玉米、水稻、向日葵、和小麦。一直在开发另外的耐咪唑啉酮作物(例如，棉花和糖用甜菜)，但迄今为止还没有商业推出。许多咪唑啉酮除草剂(例如，甲氧咪草烟、咪草烟、灭草喹、以及甲基咪草烟)目前选择性地用于各种常规作物中。通过咪唑啉酮耐受性性状，例如AHAS，使得可使用咪草烟、甲氧咪草烟、以及非选择性灭草烟。迄今为止的耐咪唑啉酮HTC具有非转基因的优点。这种化学类别也具有显著的土壤残留活性，因而能够提供超过施用时限的杂草控制，这不同于基于草甘膦或草丁膦的系统。然而，通过咪唑啉酮除草剂控制的杂草谱不如草甘膦宽(Agriliance，2003)。另外，咪唑啉酮除草剂具有许多杂草已经对它产生抗性的作用方式(抑制乙酰乳酸合酶ALS)(Heap I(2004)。抗除草剂杂草的国际调查可在www.weedscience.com获得)。通过经由常规育种或联合地作为新颖的转化事件将dgt-14与咪唑啉酮耐受性性状的堆叠，可以提高杂草控制效力、灵活性、以及管理杂草变化和除草剂抗性发展的能力。如在前述实施例中提及的，通过用dgt-14转化作物，人们可以选择性地将草甘膦除草剂施用于单子叶作物和双子叶作物中。可以设想针对改进的杂草控制选项的若干方案，其中dgt-14和咪唑啉酮耐受性性状堆叠在任何单子叶或双子叶作物物种中。
a)可以标准出苗后施用比例(35到280g ae/公顷，优选70到-140g ae/公顷)施用咪草烟，以便控制许多禾本科植物和阔叶杂草物种。
i)可通过以420到2160g ae/公顷，优选地560到1120g ae/公顷桶混草甘膦控制抗ALS抑制剂的阔叶杂草，例如具瘤苋(Amaranthus rudis)、三裂叶豚草(Ambrosia trifida)、白藜(Chenopodium album)(除其他之外，Heap，2004)。
ii)也可通过以420到2160g ae/公顷，优选地560到1120g ae/公顷桶混草甘膦控制固有更耐受咪唑啉酮除草剂的阔叶物种，例如番薯属物种(Ipomoea spp.)。
iii)可通过以420到2160g ae/公顷，优选地560到1120g ae/公顷桶混草甘膦控制抗ALS抑制剂的禾本科杂草，例如假高粱(Sorghum halepense)和黑麦草属物种(Lolium spp.)。
iv)也可通过以420到2160g ae/公顷，优选地560到1120g ae/公顷桶混草甘膦控制固有更耐受的禾本科杂草物种(例如偃麦草(Agropyron repens))。
在杂草控制领域的技术人员将认识到，通过常规育种或基因工程，通过dgt-14转化及其与任何咪唑啉酮耐受性性状堆叠，使得有可能单独地或以多种组合的形式使用任何不同的商业咪唑啉酮除草剂或草甘膦除草剂。可通过在CPR(Crop Protection Reference)书籍或类似编物中汇编的除草剂标签、在线(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)汇编的标签、或任何商业或学术作物保护指南(例如来自Agriliance的Crop Protection Guide(2005))来确定代表这些化学品的其他除草剂的特殊比例。通过单独使用的、桶混的或依次使用的dgt14和耐ALS性状而使得每一替代性除草剂可用于HTC中，这在本公开的范围内。
实施例14：大豆转化
通过大豆子叶节外植体的土壤杆菌介导的转化而产生含有稳定整合的dgt-14转基因的转基因大豆(Glycine max)。使用携带含有功能性dgt-14的二元载体的卸甲的(disarmed)土壤杆菌属菌株来启动转化。
使用Zeng等(Zeng P.,Vadnais D.A.,Zhang Z.,Polacco J.C.,(2004),PlantCell Rep.,22(7):478-482)的改良的半子叶节程序进行土壤杆菌介导的转化。简言之，使大豆种子(Maverick栽培变种)在基础培养基上萌发，将子叶节分离并用土壤杆菌感染。芽启动培养基、芽伸长培养基、以及生根培养基添加有头孢噻肟、特美汀和万古霉素，用于去除土壤杆菌。采用经由除草剂的选择来抑制非转化芽的生长。将选择的芽转移到生根培养基以使根发育，然后转移到土壤混合物以使小植物驯化。
用除草剂表面/局部处理(叶喷涂技术)选择的小植物的末端小叶来筛选推定的转化体。将筛选的小植物转移到温室中，使其驯化，然后在叶子上喷涂除草剂以再确认耐受性。对这些推定的转化T0植物采样，并使用分子分析来确认除草选择标记、以及dgt-14转基因的存在。使T0植物在温室中自体受精以产生T1种子。
可以使用第二种大豆转化方法来产生另外的转基因大豆植物。使用携带含有功能性dgt-14的二元载体的卸甲的(disarmed)土壤杆菌菌株来启动转化。
使用Paz等(Paz M.,Martinez J.,Kalvig A.,Fonger T.,和Wang K.,(2005)Plant Cell Rep.,25:206-213)的改良的半种子程序进行土壤杆菌介导的转化。简言之，在土壤杆菌介导的植物转化之前，用氯气将成熟大豆种子消毒过夜，并用无菌H2O浸渗二十个小时。通过沿着种脐纵向切割将种子切成两半以分离种子并去除种皮。切断胚轴，并且从子叶节去除任何主苗(axial shoot)/芽。用土壤杆菌感染所得的半种子外植体。芽启动培养基、芽伸长培养基、以及生根培养基添加有头孢噻肟、特美汀和万古霉素，用于去除土壤杆菌。采用除草剂选择来抑制非转化芽的生长。将选择的芽转移到生根培养基以使根发育，然后转移到土壤混合物以使小植物驯化。
用除草剂表面/局部处理(叶喷涂技术)选择的小植物的末端小叶来筛选推定的转化体。将筛选的小植物转移到温室中，使其驯化，然后在叶子上喷涂除草剂以再确认耐受性。对这些推定的转化T0植物采样，并使用分子分析来确认选择标记和dgt-14转基因的存在。若干事件被鉴定为含有所述转基因。这些T0植物继续用于进一步分析，并使其在温室中自体受精而产生T1种子。获得含有dgt-14转基因的大豆植物。用不同浓度的草甘膦喷施dgt-14大豆植物，所述植物显示提供了针对处于高达3360g ae/公顷的浓度的草甘膦的耐受性。
实施例15：在水稻中的DGT-14基因的转化
通过大豆子叶节外植体的土壤杆菌介导的转化而产生含有稳定整合的dgt-14转基因的转基因水稻(Oryza sativa)。使用携带含有功能性dgt-14的二元载体的卸甲的(disarmed)土壤杆菌菌株来启动转化。
用1M KOH将培养基调节至pH 5.8，然后用2.5g/l Phytagel(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)固化。将胚性愈伤组织在含有40ml的半固体培养基的100x20mm培养皿中培养。在MAGENTA箱中的50ml培养基中培育水稻小植物。将细胞悬浮液保持在含有35ml液体培养基的125ml锥形瓶中，在125rpm旋转。在黑暗中在25-26℃进行胚性培养物的诱导和维持，在光照室中以16小时光周期进行植物再生和全株植物培养(Zhang等，1996)。
如前所述(Li等1993)在改良的NB基础培养基上进行胚性愈伤组织的诱导和维持，其中将所述培养基调整为含有500mg/l的谷氨酰胺。启动悬浮培养并且维持在其中包含30g/l的蔗糖而不是麦芽糖的SZ液体培养基(Zhang等1998)中。包含NB培养基的高渗培养基(NBO)添加有甘露醇和山梨醇各0.256M。在补充有适当除草剂选择剂的NB培养基上选择抗除草剂愈伤组织，持续3-4周。在包含添加有2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1mg/l的α-萘乙酸(NAA)、5mg/l的脱落酸(ABA)和选择性除草剂的NB培养基的培养基(PRH50)上进行预再生，持续1周。小植物的再生采取(follow)在包含含有2,4-D、0.5mg/l NAA、以及选择性除草剂的NB培养基的再生培养基上(RNH50)的培养直到推定的转基因芽再生。将芽转移到补充有1％蔗糖和选择性除草剂的具有半强度(half-strength)Murashige和Skoog基础盐和Gamborg’s B5维生素的生根培养基。
如Zhang等(1996)所述将粳稻台北309栽培变种(Oryza sativa L.japonica cv.Taipei 309)的成熟干燥种子消毒。通过将消毒的成熟水稻种子在黑暗中在NB培养基上培养诱导胚性组织。从胚盘上移取直径大约1mm的初级愈伤组织并且用来启动在SZ液体培养基中的细胞悬浮。然后如Zhang 1996所述维持悬液。在先前传代培养之后3-5天从液体培养物移取源于悬液的胚性组织，并置于NBO高渗培养基上，以形成横穿培养皿的大约2.5cm的圆，并在轰击之前培养4小时。在轰击之后十六到二十小时，将组织从NBO培养基转移到NBH50选择培养基上，确保轰击的表面面朝上，并在黑暗中温育14-17天。然后将新形成的愈伤组织从原始轰击的外植体分离，并就近置于相同的培养基上。在另外8-12天之后，在视觉上鉴定相对紧密的、不透明的愈伤组织并转移到PRH50预再生培养基在黑暗中培养7天。然后将变得更紧密和透明的生长愈伤组织在RNH50再生培养基上在16小时光周期下传代培养14-21天的时间。将再生芽转移到含有1/2MSH50培养基的MAGENTA箱中。从单个外植体再生的多株植物被视为同胞并且作为一个独立的植物品系进行处理。如果一株植物产生了粗的白色根并且在1/2MSH50培养基上旺盛地生长，则它被评分为dgt-14基因阳性。一旦小植物达到MAGENTA箱的顶部，将它们转移到在6cm的盆中的土壤中，在100％湿度下保持一周，然后将它们移动到生长室，在14小时光周期在30℃然后在黑暗中在21℃培养2-3周，然后移栽到温室的13cm盆中。收集种子并在37℃干燥一周，然后在4℃保存。
对处于3-5片叶期的推定的转基因水稻小植物喷施草甘膦溶液。一旦喷施，使小植物干燥一个小时，然后从通风罩中移出。从10-14个处理后天数(DAT)完成针对草甘膦的敏感性或抗性的等级评定。鉴定含有dgt-14植物的完全整合拷贝的抗草甘膦水稻小植物。获得含有dgt-14转基因的水稻植物。用不同浓度的草甘膦喷施dgt-14水稻植物，所述植物显示提供了针对处于高达3360gae/公顷的浓度的草甘膦的耐受性。
实施例16：草坪草转化程序
通过从种子(Penn-A-4栽培变种)始发的胚性愈伤组织实现dgt-14转基因在匍匐翦股颖(creeping bentgrass)中的根癌土壤杆菌介导的遗传转化。参见“Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass(Agrostisstolonifera L)transformation”(Luo等，2004)。
用携带超二元载体的根癌土壤杆菌菌株感染愈伤组织细胞，所述载体含有由单子叶植物特异性启动子驱动的抗除草剂转基因(例如，dgt-14)。总的稳定转化效率的范围为18％到45％。Southern印迹和遗传分析证实在匍匐翦股颖基因组中的转基因整合以及所述转基因在T1代中的正常传递和稳定表达。所有独立的转化事件携带一个到三个转基因拷贝，并且大多数(60–65％)仅仅含有没有明显重排的单个转基因拷贝。
用砂纸将成熟种子去皮，在10％(v/v)CloroxTM漂白剂(6％次氯酸钠)加上0.2％(v/v)吐温20(聚山梨酯20)中在强力振摇下进行表面消毒90分钟。然后在无菌蒸馏水中冲洗五次，将种子置于愈伤组织诱导培养基(MS基础盐和维生素、30g/l的蔗糖、500mg/l的酪蛋白水解物、6.6mg/l的3,6-二氯-o-茴香酸(麦草畏)、0.5mg/l的6-苄基氨基嘌呤(BAP)和2g/l的Phytagel)上。将所述培养基的pH调节至5.7，然后在120℃高压灭菌20分钟。
将含有制备的种子外植体的培养板在室温下在黑暗中保持6周。在视觉上选择胚性愈伤组织，将其在新鲜的愈伤组织诱导培养基上在室温下在黑暗中传代培养1周，然后进行共培养。
在土壤杆菌介导的感染之前的一天，将胚性愈伤组织分为1mm-2mm的片，并放置在含有100μM的乙酰丁香酮的愈伤组织诱导培养基上。然后将10μl等分试样的携带dgt-14转基因的土壤杆菌悬浮液(在660nm的OD＝1.0)施用到每个愈伤组织片上，随后在黑暗中在25℃共培育3天。然后将愈伤组织转移到愈伤组织诱导培养基加125mg/l的头孢噻肟和250mg/l羧苄青霉素上并培养2周以抑制细菌生长。
当愈伤组织被移至含有250mg/l的头孢噻肟和除草剂的愈伤组织诱导培养基时进行转基因植物的选择。将愈伤组织材料在这种培养基上维持8周，其中选择传代培养间隔为3周。在室温下在黑暗中进行选择过程。
对于植物再生，首先将除草剂抗性的增殖的愈伤组织事件移动到补充有用于选择的头孢噻肟和除草剂的再生培养基(MS基础培养基、30g/l的蔗糖、100mg/l的肌醇、1mg/l的BAP和2g/l的Phytagel)上。将这些愈伤组织在室温下在黑暗中保持1周，然后将其移动到光中，培养2-3周以产生芽。
将产生的芽分离并转移到无激素的含有除草剂和头孢噻肟的再生培养基以促进根生长，同时保持选择压力并抑制任何剩余的土壤杆菌细胞。然后具有良好发育的根的小植物(3-5周)转移到土壤中并在温室中或在大田中培育。
将转基因植物保持在室外在围护苗圃(containment nursery)中(3-6个月)直到12月份的冬至。然后将春化处理的植物转移到温室中并在25℃在16/8小时光周期下保持，其周围为非转基因对照植物，所述对照植物将所述转基因植物与其他花粉源物理隔离。在移回温室之后3-4周，所述转基因植物开始开花。使这些植物与来自所述周围的对照植物的花粉进行异型杂交。使从每一个体转基因植物收集的种子在25℃在土壤中萌发，并且将T1植物在温室中培育用于进一步分析。
针对根据所描述的方案的dgt-14转化考虑的其他禾本科植物包括一年生早熟禾(Poa annua)、美洲雀稗(Bahiagrass)、翦股颖、狗牙根(Bermudagrass)、早熟禾(Bluegrass)、须芒草(Bluestems)、臂形草属、雀麦草(Bromegrass)、旱地翦股颖(Browntop bent)(细弱剪股颖(Agrostis capillaries))、野牛草(Buffalograss)、金丝雀草(Canary Grass)、地毯草(Carpetgrass)、百足草(Centipedegrass)、紫羊茅(Chewings fescue)(Festuca rubra commutate)、马唐草(Crabgrass)、葡茎剪股颖(匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera))、冠草(Crestedhairgrass)(洽草(Koeleria macrantha))、毛花雀稗(Dallisgrass)、牛毛草(Fescue)、Festolium、羊茅(Hard/sheeps fescue)(羊茅(Festuca ovina))、格兰马草(Gramagrass)、印度草(Indiangrass)、约翰逊草(Johnsongrass)、画眉草(Lovegrass)、混合牧草(mixes)(马牧草(Equine)、牧草(Pasture)等等)、天然牧草(NativeGrasses)、野茅(Orchardgrass)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、小糠草(Redtop)、扁穗雀麦(Rescuegrass)、一年生和多年生黑麦草(annual and perennial Ryegrass)、细匍匐紫羊茅(Slender creeping red fescue)(细弱匍匐紫羊茅(Festuca rubratrichophylla))、草地早熟禾(Smooth-stalked meadowgrass)(草地早熟禾(Poapratensis))、奧古斯丁草(St.Augustine)、强匍匐紫羊茅(Strong creeping redfescue)(匍匐紫羊茅(Festuca rubra rubra))、苏丹草(Sudangrass)、柳枝稷(Switchgrass)、高羊茅(Tall fescue)(苇状羊茅(Festuca arundinacea))、发菜(Tufted hairgrass)(发草(Deschampsia caespitosa))、草坪草(Turfgrasses)、小麦草(Wheatgrass)、以及结缕草(Zoysiagrass)。
实施例17：油菜籽(欧洲油菜(Brassica napus))中的DGT-14
用土壤杆菌介导的转化，使用赋予对草甘膦抗性的dgt-14基因来转化欧洲油菜NexeraTM710变种。
用10％商业漂白剂将欧洲油菜种子表面消毒10分钟，并用无菌蒸馏水冲洗3次。然后将种子置于一半浓度的MS基础培养基(Murashige和Skoog，1962)上，并维持在设置为25℃和16小时明/8小时暗的光周期的生长方案下。
从5-7日龄的幼苗切离下胚轴节段(3-5mm)，并置于愈伤组织诱导培养基K1D1(具有1mg/l的激动素和1mg/l的2,4-D的MS培养基)上培养3天作为预处理。然后将所述节段转移到培养皿上，并用含有包含dgt-14的构建体的根癌土壤杆菌菌株处理。在28℃在黑暗中在150rpm的摇床上将根癌土壤杆菌培育过夜，随后重悬于培养基中。
在用土壤杆菌将下胚轴节段处理30分钟之后，将这些节段放回到愈伤组织诱导培养基上培养3天。在共培养之后，将所述节段置于K1D1TC(含有250mg/l的羧苄青霉素和300mg/l的特美汀的愈伤组织诱导培养基)中进行一周的恢复。可选地，将所述节段直接置于选择培养基K1D1H1(具有除草剂的上述培养基)上。羧苄青霉素和特美汀为用来杀死土壤杆菌的抗生素。所述选择剂允许转化细胞的生长。
通过PCR测试来自分离的独立事件的愈伤组织样品。确认对于dgt-14的存在测试为阳性的样品并将其推进到培养基中进行再生。然后将愈伤的下胚轴节段置于B3Z1H1(MS培养基、3mg/l的苄基氨基嘌呤、1mg/l的玉米素、0.5gm/l的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]、5mg/l的硝酸银、选择性除草剂、羧苄青霉素和特美汀)芽再生培养基上。在3周后芽开始再生。将下胚轴节段连同所述芽转移到B3Z1H3培养基(MS培养基、3mg/l的苄基氨基嘌呤、1mg/l的玉米素、0.5gm/l的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]、5mg/l的硝酸银、选择性除草剂、羧苄青霉素和特美汀)上培养另外的3周。
从下胚轴节段切离芽并将其转移到芽伸长培养基MESH10(MS、0.5gm/lMES、选择性除草剂、羧苄青霉素、特美汀)上培养2-4周。将细长芽在MSI.1(具有0.1mg/l的吲哚丁酸的MS)培养以进行根诱导。一旦植物建立根系统，将植物移栽到土壤中。在控制的环境条件下在ConvironTM中将植物驯化1-2周，然后转移到温室。
使转化的T0植物在温室中自花授粉而获得T1种子。用一定浓度范围的草甘膦除草剂喷施T0植物和T1后代以确立受到dgt-14基因保护的水平。
实施例18：烟草转化
使用含有dgt-14转基因的根癌土壤杆菌转化烟草(Petit Havana栽培品种)叶片。将含有包含dgt-14转基因的质粒的单个集落接种到4mL的含有抗生素(用于选择含有dgt-14的载体)的YEP培养基中，在28℃在190rpm的摇床上温育过夜。随后，使用4mL的种子培养物接种在125mL的带挡板的锥形瓶中具有相同培养基的25mL的培养物。将这种培养物在28℃在190rpm振摇下温育，直到其达到约1.2的OD600。然后将十毫升的土壤杆菌悬液置于无菌的60x20mm的PetriTM培养皿中。将从在PhytaTrays(Sigma,St.Louis,MO)中在具有30g/L蔗糖的MS培养基(Phytotechnology Labs,Shawnee Mission,KS,)上无菌生长的植物新近切割的叶片(0.5cm2)浸泡在10mL的土壤杆菌的过夜培养物中持续几分钟，在无菌滤纸上吸干，进而置于添加有1mg/L的吲哚乙酸和1mg/L的6-苄基氨基嘌呤的相同培养基上。三天后，将与携带dgt-14转基因的土壤杆菌共培养的叶片转移到具有5mg/L的BastaTM和250mg/L的头孢噻肟的相同培养基上。在3周之后，将个体T0小植物转移到具有10mg/L的BastaTM和250mg/L的头孢噻肟的MS培养基上，然后在另外3周之后移栽到土壤并转移到温室中。使选择的T0植物(如使用上述分子分析方案鉴定的)自花授粉，并在蒴果(capsule)完全干燥时从其收集种子。筛选T1苗的接合性和报道基因表达(如下所述)，并鉴定含有dgt-14转基因的选择的植物。
虽然已经在某些实施方案中描述了本公开的方面，可以在本公开的精神和范围内进一步修改这些方面。因此，本申请旨在覆盖利用其一般原理的本公开实施方案的任何变型、用途、或适应。此外，当属于这些实施方案所涉及的并且落入所附权利要求的界限之内的已知实践或惯常实践时，本申请旨在覆盖这样的从本公开的偏离。

Claims (39)

1.一种分离的核酸分子，其选自下组：
a)包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的核酸分子；
b)编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽的核酸分子，以及
c)包含在高严格条件下与具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的另一核酸杂交的核苷酸序列的异源核酸。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸包含已设计为用于在植物中表达的合成序列。
3.一种载体，其包含权利要求1的核酸分子。
4.权利要求3的载体，其进一步包含编码异源多肽的核酸。
5.权利要求3的载体，其中所述核酸可操作地连接于启动子。
6.一种宿主细胞，其含有权利要求1的核酸分子作为可操作地连接于启动子的异源核酸。
7.权利要求5的载体，其中所述启动子是AtUbi10启动子。
8.权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。
9.一种转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞，其包含权利要求1的核酸。
10.权利要求9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞，其中当所述植物、植物部分、植物器官、植物种子和/或植物细胞与相同物种的野生型植物相比时对草甘膦是耐受的。
11.权利要求9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞，其中所述核酸不编码LGNAAT(SEQ ID NO:61)并且不编码ALLMXAPLT(SEQ ID NO:62)，其中X选自下组：丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
12.权利要求9的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞，其中所述核酸编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽，当与SEQ ID NO:1比对时，所述多肽包含在相应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处的丙氨酸。
13.从权利要求9的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞产生的可再生细胞的组织培养物。
14.从权利要求9的转基因植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞产生的原生质体。
15.权利要求13的组织培养物，其中所述可再生细胞产生自选自下组的组织类型：叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、茎和荚。
16.从权利要求13的组织培养物再生的植物，其中所述植物是抗草甘膦的。
17.权利要求9的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞，其中所述基因组包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少95％序列同一性的核酸分子。
18.产生抗草甘膦的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞的方法，所述方法包括：
a)用权利要求1的核酸转化植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞；并且
b)表达与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽。
19.根据权利要求18的方法，其中所述转化的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞是抗草甘膦的。
20.根据权利要求18的方法，其中所述多肽不包含LGNAAT(SEQ ID NO:61)和/或不包含ALLMXAPLT(SEQ ID NO:62)，其中X选自下组：丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸。
21.根据权利要求18的方法，其中当所述多肽与SEQ ID NO:1比对时包含在相应于SEQ ID NO:1的位置101的位置处的丙氨酸。
22.根据权利要求18的方法，其中所述核酸分子与SEQ ID NO:2或SEQID NO:3具有至少95％的序列同一性。
23.根据权利要求18的方法，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
24.一种用于控制在含有抗除草剂植物的耕作区域中的杂草的方法，所述方法包括：
a)将包含权利要求1的核酸分子的植物或植物种子种植在所述耕作区域中；并且
b)向所述耕作区域施用足够量的除草剂以控制在所述耕作区域中的杂草而不显著影响所述植物或植物种子。
25.根据权利要求24的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
26.根据权利要求24的方法，其中包含权利要求1的核酸分子的所述植物或植物种子包含编码异源多肽的第二核酸分子。
27.根据权利要求24的方法，其中所述第二核酸包含aad-1或aad-12。
28.在植物中赋予除草剂抗性的方法，所述方法包括：
a)用DNA构建体转化所述植物，所述构建体包含与权利要求1的核酸分子可操作地连接的启动子；
b)再生转化的植物；并且，
c)表达所述核酸分子，从而产生与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的多肽。
29.根据权利要求28的方法，其中所述除草剂是草甘膦。
30.根据权利要求28的方法，其中所述DNA构建体包含编码在所述植物中可表达的异源多肽的第二核酸分子。
31.根据权利要求30的方法，其中所述异源多肽包含aad-1或aad-12。
32.一种植物，其具有作为异源核酸稳定地整合入其基因组的权利要求1的核酸，其中所述核酸可操作地连接于启动子。
33.权利要求32的植物，其中所述植物是大豆植物。
34.权利要求32的植物，其中所述植物是玉米植物。
35.权利要求32的植物，其中所述植物选自下组：小麦、玉米、大豆、烟草、臂形草、水稻、小米、大麦、番茄、苹果、梨、草莓、柑桔类、苜蓿、棉花、胡萝卜、马铃薯、糖用甜菜、山药、莴苣、菠菜、牵牛花、玫瑰、菊花、草坪草、松树、冷杉、云杉、重金属积累植物、向日葵、红花、油菜籽和拟南芥。
36.权利要求32的植物，其中所述植物是选自下组的物种：天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、臂形草属(Brachiaria)、芸苔属(Brassica)、柑桔属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、飞蓬属(Erigeron)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、黑麦草属(Lolium)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、诸葛菜属(Orychophragmus)、稻属(Oryza)、鳄梨属(Persea)、菜豆属(Phaseolus)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)和玉蜀黍属(Zea)。
37.权利要求6的宿主细胞，其中所述宿主细胞不能再生而产生植物。
38.权利要求9的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞，其中所述植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞不能再生而产生植物。
39.根据权利要求18的方法，其中不能再生而产生植物的植物、植物部分、植物器官、植物种子、或植物细胞被转化。
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