BRPI0712871A2

BRPI0712871A2 - molÉcula de Ácido nuclÉico e polipeptÍdeo isolados, vetor, cÉlula hospedeira, planta trasngÊnica, semente, mÉtodos para produzir um polipeptÍdeo com atividade de resistÊncia a herbicida, para conferir resistÊncia a um herbicida em uma planta, para gerar uma variante de polinucleotÍdeo, para aumentar o vigor ou o rendimento em uma planta, e para conferir resist~encia a glifosato em uma planta

Info

Publication number: BRPI0712871A2
Application number: BRPI0712871-1A
Authority: BR
Inventors: Brian Carr; Cheryl Peters; De Berg Brian Van; Daniel John Tomso
Original assignee: Athenix Corp
Priority date: 2006-06-09
Filing date: 2007-06-08
Publication date: 2013-05-07
Also published as: AU2007257851A1; EP2336306A3; EP2027261B1; EP2336306A2; WO2007146765A3; NZ573073A; WO2007146765A2; CN101490252A; AR061313A1; EP2027261A2; HK1127784A1; ATE491786T1; DE602007011258D1; CA2654242A1

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E POLIPEPTÍDEO ISOLADOS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PLANTA TRANSGÊNICA, SEMENTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE RESISTÊNCIA A HERBICIDA, PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A UM HERBICIDA EM UMA PLANTA, PARA GERAR UMA VARINATE DE POLINUCLEOTÍDEO, PARA AUMENTAR OVIGOR OU O RENDIMENTO EM UMA PLANTA, E PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A GLIFOSATO EM UMA PLANTA. São providos composições e métodos para conferir resistência ou tolerância a herbicida em bactérias, plantas, células vegetais, tecidos e sementes. Composições compreendendo uma sequência codificadora para um polipeptídeo que confere resistência ou tolerância a herbicidos de glifosato são providas. As sequências codificadoras podem ser usadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para transformação em plantas. Composições também compreendem bactérias, plantas, células, tecidos e sementes vegetais transformadas. Em particular, moléculas de ácido nucléico correspondendo a sequências de ácido nucléiico resistentes a glifosato são providas. Adicionalmente, sequências de aminoácidos correspondendo aos polinucleotideos são englobadas. Em particular, a presente invenção provê moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo sequência de nucleotideos que codificam a sequência de aminoácido mostrada em SEO ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14, ou a sequência de nucleotídeo definida em SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29 30, 31, 33, ou 34.

Description

molécula de ácido nucléico e polipeptídeo isolados, vetor, célula hospedeira, planta transgênica, semente, métodos para produzir um polipeptídeo com atividade de resistência a herbicida, para conferir resistência a um herbicida em uma planta, para gerar uma variante de polinucleotídeo, para aumentar o vigor ou o rendimento em uma planta, e para conferir resistência a glifosato em uma planta

campo da invenção

A presente invenção fornece novos genes que codificam 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase que proporcionam resistência a herbicida. Esses genes são úteis em biologia vegetal, melhoramento vegetal, e na cultura de células vegetais.

fundamentos da invenção

N-fosfonometilglicina, comumente referido como glifosato, é um importante produto químico agronômico. O glifosato inibe a enzima que converte o ácido fosfoenolpirúvico (PEP) e o ácido 3-fosfochiquímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfochiquímico. A inibição desta enzima (5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase; aqui referida como "EPSP sintase") mata as células vegetais por encerrar a via do chiquimato, assim, inibindo a biossíntese do ácido aromático. Uma vez que herbicidas da classe glifosato inibem a biossíntese de aminoácidos aromáticos, eles não só matam células vegetais, mas também são tóxicos para células bacterianas. 0 glifosato inibe muitas EPSP sintases bacterianas e, portanto, é tóxico para essas bactérias. No entanto, certas EPSP sintases bacterianas têm uma alta tolerância ao glifosato.

Células vegetais resistentes à toxicidade do glifosato podem ser produzidas por transformar células vegetais para expressar EPSP sintases bacterianas glifosato-resistentes. Notavelmente, o gene da bactéria Agrobacterium tumefaciens estirpe CP4 tem sido utilizado para conferir resistência ao herbicida sobre células vegetais seguida da expressão em plantas. Uma mutação EPSP sintase de Salmonella typhimurium estirpe CT7 confere resistência ao glifosato nas células bacterianas, e confere resistência ao glifosato, em células vegetais (Patentes U.S. nos. 4.535.060, 4.769.061

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e

5.094.945).

A patente U.S. 6.040.497 relata enzimas EPSP sintase mutantes de milho com substituições de treonina para isoleucina na posição 102 e prolina para serina na posição 106 (a mutação -TIPS-). Essas alterações conferem resistência ao glifosato sobre as enzimas de milho. Uma mutação EPSP sintase de Salmonella typhimurium estirpe CT7 confere resistência ao glifosato nas células bacterianas, e é relatado para conferir resistência ao glifosato nas células vegetais (Patentes U.S. nos. 4.535.060, 4.769.061 e 5.094.945). He et al. ((2001) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6) desenvolveram EPSP sintases com maior tolerância ao glifosato por mutagênese e recombinação entre os genes da EPSP sintase de E. coli e Salmonella typhimurium, e sugerem que mutações na posição 42 (T42M) e posição 230 (Q230K) são provavelmente responsáveis pela resistência observada.

Trabalho posterior (He et al. (2003) Biosci. Biotech.

Biochem. 67:1405-1409) mostra que a mutação T42M (treonina

para metionina) é suficiente para melhorar a tolerância de

ambos as enzimas de E. coli e Salmonella typhimurium. Estas

enzimas contêm substituições de aminoácidos em seus sítios

ativos que impedem a ligação do glifosato, sem afetar a

ligação por PEP ou S3P. As mutações que ocorrem na região

dobrada entre os dois domínios globulares de EPSP sintase

foram mostradas para alterar a afinidade de ligação do

glifosato não PEP (He et al, 2003, supra). Portanto, as

enzimas têm alta atividade catalítica, mesmo na presença de glifosato.

Devido às inúmeras vantagens que plantas com resistência ao herbicida fornecem, métodos para a identificação de genes com resistência a herbicida com atividade de resistência ao glifosato são desejáveis. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para conferir resistência ou tolerância a herbicida em bactérias, plantas, células, tecidos e sementes são fornecidos. Composições incluem moléculas de ácidos nucléicos codificando polipeptídeos com resistência ou tolerância a herbicida, vetores compreendendo as moléculas de ácidos nucléicos, e células hospedeiras compreendendo os vetores. Composições também incluem anticorpos contra polipeptídeos com resistência ou tolerância a herbicida. Como observado, as seqüências de nucleotídeo da invenção podem ser utilizadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo plantas e microorganismos. Composições também compreendem bactérias transformadas, plantas, células, tecidos e sementes. Além disso, métodos são fornecidos para a produção do polipeptídeos codificados pelos nucleotídeos sintéticos da invenção.

Em particular, moléculas de ácidos nucléicos isolados e

variantes destas, codificando polipeptídeos com resistência ou tolerância a herbicida são apresentadas. Adicionalmente, aminoácidos e variantes, codificados pelos polinucleotídeos que conferem resistência ou tolerância a herbicida são englobados. Em particular, a presente invenção prevê moléculas de ácidos nucléicos isolados compreendendo as seqüências nucleotídicas estabelecidas nas SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, uma seqüência nucleotídica codificando a seqüência de aminoácidos mostrada nas SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14, a seqüência nucleotídica resistente a herbicida depositada em hospedeiros bacterianos com Nos. de Acesso NRRL B-30911, NRRL B-30912, NRRL B-30913, NRRL B-30914 N, NRRL B -30915, NRRL B-30916 N, ou NRRL B-30917 N, bem como variantes e fragmentos destes. Seqüências nucleotídicas que são complementares a uma seqüência nucleotídica da invenção, ou que hibridizam uma seqüência da invenção também são englobadas.

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DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras IA-IE mostram um alinhamento da seqüência de aminoácidos GRG25 (SEQ ID NO: 2), GRG26 (SEQ ID NO: 4), GRG27 (SEQ ID NO: 6), GRG28 (SEQ ID NO: 8), GRG29 (SEQ ID NO: 10), GRG30 (SEQ ID NO: 12), e GRG31 (SEQ ID NO: 14) com outra de genes EPSP sintase tolerantes ao glifosato, incluindo GRGl (SEQ ID NO: 15), GRG5 (SEQ ID NO: 16), GRG6 (SEQ ID NO: 17), GRG7 (SEQ ID NO: 18), GRG8 (SEQ ID NO: 19), GRG9 (SEQ ID NO: 20), GRGlO (SEQ ID NO: 21) , GRG 12 (SEQ ID NO: 22), GRG 15 (SEQ ID NO: 23), GRG20 (SEQ ID NO: 24), GRG21 (SEQ ID NO: 25), GRG22 (SEQ ID NO: 26), e GRG23 (SEQ ID NO: 27). O símbolo [*] indica que os resíduos são idênticos em todas as seqüências do alinhamento, o símbolo [:] indica substituições conservadoras, o símbolo [.] indica substituições semi- conservadoras. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é esquematizada para composições e métodos de regulação da resistência a herbicida nos organismos, em particular nas plantas ou células vegetais. Os métodos envolvem transformar organismos com uma seqüência nucleotídica que codifica um gene com resistência ao glifosato da invenção. Em especial, uma seqüência nucleotídica da invenção é útil para preparar plantas que apresentam maior tolerância ao herbicida glifosato. Assim, são fornecidas bactérias transformadas, plantas, células, tecidos vegetais e sementes. Composições incluem ácidos nucléicos e proteínas relacionadas à tolerância a herbicida em microorganismos e plantas, bem como bactérias transformadas, plantas, tecidos vegetais e sementes. Mais particularmente, seqüências de nucleotídeos de genes com resistência ao glifosato (grg25, grg26, grg21, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31) e as seqüências de aminoácidos a proteínas assim codificadas são descritas. As seqüências encontram uso na construção de vetores de expressão para posterior transformação em plantas de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes de resistência ao glifosato, como marcadores selecionáveis, e coisas do gênero. Assim, por gene com "resistência ao glifosato" ou "tolerância ao glifosato" da invenção é destinado a seqüência nucleotídica estabelecida nas SED ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 13 e fragmentos e variantes destas (por exemplo, SEQ ID no: 28-34) que codificam um polipeptídeo com resistência ou tolerância ao glifosato. Do mesmo modo, um polipeptídeo com "resistência ao glifosato" ou "tolerância ao glifosato" da invenção é um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos estabelecida nas SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14, e fragmentos e variantes destas, que confere resistência ou tolerância ao glifosato em uma célula hospedeira.

Plasmídios contendo seqüências nucleotídicas com resistência a herbicida da invenção foram depositados na coleção permanente do Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos da América, em 19 de abril de 2006, e foram atribuídos os Nos. de Acesso N NRRL B-30911 (para grg25 \ NRRL B-30912 (para grg26), NRRL B-30913 (para grg27) , NRRL B-30914 N (para grg28), NRRL B-30915 (para grg29) , NRRL B-30916 N (para grg30), e NRRL B-30917 (para grg31). Este depósito será mantido de acordo com os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para fins de Processo de Patente. Este depósito foi feito apenas como uma conveniência para os versados na técnica e não é uma admissão de que um depósito é exigido sob a 35 U.S.C. [seção] 112.

Por "glifosato" é entendido qualquer forma herbicida de N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal do mesmo) e de outras formas, que resultem na produção do anion glifosato na planta. Uma "proteína com resistência a herbicida" ou proteína resultante da expressão de uma "molécula de ácido nucléico com codificação de resistência a herbicida" incluem proteínas que conferem a uma célula a capacidade de tolerar uma concentração mais elevada de um herbicida que células que não expressam a proteína, ou a tolerar uma determinada concentração de um herbicida para um período de tempo mais longo do que células que não expressam a proteína. Uma "proteína com resistência ao glifosato" inclui uma proteína que confere a uma célula a capacidade de tolerar uma concentração maior de glifosato do que células que não expressam a proteína, ou a tolerar uma certa concentração de glifosato para um período de tempo mais longo do que células que não expressam a proteína. Por "tolerar" ou "tolerância" entende-se sobreviver, ou realizar funções celulares essenciais, como a síntese protéica e a respiração de uma forma que não é facilmente discernível a partir de células não tratadas.

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Moléculas de Ácido Nucléico Isolado, e Variantes e Fragmentos Destes

Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácidos nucléicos isoladas ou recombinantes compreendendo seqüências nucleotídicas que codificam proteínas com resistência a herbicida e polipeptídios ou partes biologicamente ativas dos mesmos, bem como moléculas de ácidos nucléicos suficientes 10

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para uso como sondas de hibridização para identificar ácidos

nucléicos codificando resistência a herbicida. Conforme

utilizado aqui, o termo "molécula de ácido nucléico" destina-

se a incluir moléculas de DNA (por exemplo, o DNA

recombinante, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por

exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados utilizando

nucleotídeos análogos. As moléculas de ácidos nucléicos podem

ser de fita única ou fita dupla, mas de preferência são DNA de fita dupla.

Seqüências nucleotídicas codificando as proteínas da presente invenção incluem as seqüências estabelecidas nas SEQ ID Nos.: 1, 3, 5, 7, 9, 11, l3/ 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, a seqüência nucleotídica com resistência ao herbicida depositada em um hospedeiro bacteriano com Nos. de Acesso NRRL B-30911, NRRL B-30912, NRRL B-30913, NRRL B-30914 N, NRRL B-30915, NRRL B-30916 N, e N NRRL B-30917, e variantes, fragmentos, e complementos da mesma. Por "complementar" entende-se uma seqüência nucleotídica que seja suficientemente complementar a uma determinada seqüência nucleotídica que possa hibridizar a dada seqüência de nucleotídeos, para assim, formar uma forma estável duplex. As seqüências de aminoácidos correspondentes para as proteínas com resistência a herbicida codificadas por estas seqüências nucleotídicas são estabelecidas nas SEQ ID Nos. : 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 14. A invenção também inclui moléculas de ácidos nucléicos compreendendo seqüências nucleotídicas que codificam proteínas com resistência a herbicida de comprimento parcial, e complementos da mesma.

Uma molécula de ácido nucléico ou proteína "isolada" ou "purificada", ou parte biologicamente ativa dela, é praticamente isenta de outros materiais celulares, ou meio de cultura, quando produzidas por técnicas recombinantes, ou substancialmente livres de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. De preferência, um ácido nucléico "isolado" é livre de seqüências (de preferência seqüências que codificam proteínas) que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (ou seja, seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucléico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucléico é derivado. Para efeitos da invenção, o termo "isolado" quando usado para referir-se a moléculas de ácido nucléico isoladas exclui cromossomos. Por exemplo, em vários experimentos, moléculas isoladas de ácido nucléico que codificam a resistência ao glifosato podem conter menos de cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüências nucleotídicas que naturalmente flanqueiam as moléculas de ácido nucléico no DNA genômico da célula a partir da qual é derivado o ácido nucléico. Uma proteína de resistência a herbicida que é substancialmente livre de materiais celulares inclui preparações de proteína com menos de cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de proteína não-resistente a herbicida (também aqui referida como "proteína contaminante"). Moléculas de ácidos nucléicos que são fragmentos dessas seqüências nucleotidicas com codificações de resistência a herbicidas também são abrangidas pela presente invenção. Por "fragmento" é entendido uma parte de uma seqüência nucleotídica que codifica uma proteína de resistência a herbicida. Um fragmento de uma seqüência nucleotídica pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína resistente a herbicida, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou iniciador de PCR utilizando métodos descritos abaixo. Moléculas de ácidos nucléicos que são fragmentos de seqüências nucleotidicas com resistência a herbicida compreendem, pelo menos, cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400 de nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em todo o comprimento da seqüência nucleotídica que codifica resistência ao herbicida descrita aqui (por exemplo, 1404 nucleotídeos para SEQ ID NO: 1; 1395 nucleotídeos para SEQ ID NO: 3, 1368 nucleotídeos para SEQ ID NO: 5, etc), dependendo da utilização pretendida. Por nucleotídeos "contíguos" é entendido resíduos de nucleotídeo que são imediatamente adjacentes um ao outro.

Fragmentos das seqüências nucleotidicas da presente invenção geralmente irá codificar fragmentos de proteínas que mantêm a atividade biológica proteína de resistência ao glifosato de comprimento integral, ou seja, de atividade de resistência a herbicida. Por "mantém atividade de resistência a herbicida" entende-se que o fragmento terá pelo menos cerca

de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou

pelo menos cerca de 80% de atividade de resistência a

herbicida de todo o comprimento da proteína de resistência ao

glifosato descrito aqui como SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12

ou 14. Métodos para medir a atividade de resistência a

herbicida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por

exemplo, Patentes U.S. nos. 4.535.060 e 5.188.642, cada um

dos quais aqui incorporados por referência, na sua totalidade.

Um fragmento de uma seqüência nucleotídica codificando resistência a herbicida que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção vai codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presentes em todo o comprimento de uma proteína de resistência ao herbicida da invenção (por exemplo, 467 aminoácidos de SEQ ID NO: 2; 464 para SEQ ID NO: 4, 455 aminoácidos de SEQ ID NO: 6, etc.).

Proteínas de resistência a herbicida preferidas da presente invenção são codificadas por uma seqüência nucleotídica suficientemente idêntica à seqüência de nucleotídeos SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34. O termo "suficientemente idênticos" é entendido como um aminoácido ou seqüência nucleotídica que tem pelo menos cerca de 60% ou 65% de identidade de

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25 seqüência, cerca de 70% ou 75% de identidade de seqüência, cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, ou cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação com uma identidade de seqüência referência usando uma seqüência de programas de alinhamento aqui descritos utilizando parâmetros padrão. Aquele versado na técnica vai reconhecer que estes valores podem ser devidamente adaptados para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas seqüências nucleotídicas, tendo em conta a degeneração de códon, a similaridade de aminoácidos, o posicionamento da fase de leitura, e coisas do gênero.

Para determinar a identidade percentual de duas seqüências de aminoácidos ou dos dois ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadas para uma comparação ótima. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas partilhados pelas seqüências (ou seja, identidade percentual = número de posições idênticas / número total de posições (por exemplo, sobreposição de posições) χ 100). Em um experimento, as duas seqüências têm o mesmo comprimento. A identidade percentual entre as duas seqüências pode ser determinada utilizando técnicas semelhantes às descritas abaixo, com ou sem permitir lacunas. No cálculo da identidade percentual, tipicamente correspondências exatas são contadas.

A determinação da identidade percentual entre duas seqüências pode ser realizada utilizando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das duas seqüências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87:2264, modificado como no Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90: 5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Pesquisas de nucleotídeo no BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, escore = 100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de proteína resistentes ao glifosato da invenção. BLAST proteína pesquisas podem ser realizadas com o programa BLASTX, escore = 50, wordlength = 3, para obter aminoácidos homóloga à proteína herbicida resistência moléculas da invenção. Para obter alinhamentos lacunados para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado tal como descrito no Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, o PSI- Blast pode ser utilizado para a realização de uma pesquisa que detecta relações distantes entre as moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supracitado. Quando se utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser utilizados. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo não limitante de algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). ClustalW compara seqüências, e alinha a totalidade dos aminoácidos ou seqüência de DNA, e assim pode fornecer dados sobre a conservação da seqüência de aminoácidos de toda a seqüência. 0 algoritmo ClustalW é utilizado em vários software comercialmente disponíveis de análise de soluções de DNA/aminoácido, tais como o módulo ALIGNX do Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . Após o alinhamento das seqüências de aminoácidos com ClustalW, o percentual da identidade de aminoácidos pode ser avaliado. Um exemplo não limitante de um programa de software útil para a análise de alinhamentos ClustalW é o GENEDOC (TM). GENEDOC (TM) (Karl Nicholas) permite a avaliação da similaridade de aminoácidos (ou DNA) e de identidade entre várias proteínas. Outro exemplo não limitante de iam algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que faz parte do software de alinhamento da seqüência GCG (disponível por Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, Califórnia, E.U.A.). Quando utilizar o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma mesa de resíduo PAM de peso 120, lima lacuna de comprimento 12, e um desnível 4 podem ser usados.

Salvo indicação em contrário, o GAP Versão 10, que utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (1970) supra, será utilizado para determinar a identidade de seqüência ou similaridade com os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade de uma seqüência nucleotídica usando Peso GAP de 50 e Peso de Comprimento 3, e o escore nwsgapdna. cmp matriz; % de identidade ou % de similaridade de uma seqüência de aminoácidos utilizando peso GAP de 8 e peso de comprimento 2, e o programa de escore BLOSUM62. Programas equivalentes também podem ser utilizados. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de seqüência que, para quaisquer duas seqüências em questão, gera um alinhamento com resíduo de nucleotídeo idêntico e uma percentagem idêntica de identidade de seqüência, quando comparado com o alinhamento correspondente gerado pelo GAP Versão 10.

A invenção também engloba variantes de moléculas de ácidos nucléicos. "Variantes" de seqüências nucleotídicas que codificam resistência a herbicida incluem estas seqüências que codificam uma proteína de resistência a herbicida descrita aqui, mas que diferem conservativamente devido à degeneração do código genético, bem como aqueles que são suficientemente idênticos como discutido anteriormente. Variantes alélicos ocorrendo naturalmente podem ser identificados com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como a reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como descritas abaixo. Seqüências nucleotídicas variantes também incluem seqüências nucleotídicas derivadas sinteticamente que foram geradas, por exemplo, utilizando mutagênese sítio-dirigida, mas que ainda codificam proteínas de resistência a herbicida descritas na presente invenção como discutido abaixo. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, mantêm a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, atividade de resistência a herbicida. Por "mantém a atividade de resistência a herbicida" entende-se a variante que terá pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% de atividade de resistência a herbicida da proteína nativa. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Patentes U.S. nos 4.535.060 e 5.188.642, cada uma das quais aqui incorporadas por referência, na sua totalidade.

O versado na técnica irá apreciar ainda que mudanças podem ser introduzidas por mutação nas seqüências nucleotídicas da invenção, assim, levando a alterações na seqüência de aminoácidos da proteína codificada de resistência ao herbicida, sem alterar a atividade biológica das proteínas. Assim, variantes de moléculas de ácidos nucléicos isoladas podem ser criadas através da introdução de uma ou mais substituições nucleotídicas, acréscimos ou supressões na seqüência nucleotídica correspondente descrita aqui, de tal forma que um ou mais substituições de aminoácidos, acréscimos ou supressões são introduzidos na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas pelas técnicas convencionais, como a mutagênese sítio-dirigida e a mutagênese mediada por PCR. Essas variantes de seqüências nucleotídicas são igualmente abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, substituições aminoácidas conservativas podem ser feitas em uma ou mais situações previsíveis, de preferência resíduos de aminoácidos desnecessários. Um resíduo de aminoácido "desnecessário" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência do tipo selvagem de uma proteína de resistência ao herbicida sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substituição conservativa de aminoácidos" é uma na qual o resíduo de aminoácido seja substituído por um resíduo de aminoácido que tenha uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas no estado da técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não modificadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retêm função. Em geral, essas substituições não seriam feitas de resíduos de aminoácidos conservados, ou de resíduos de aminoácidos que residem dentro de um motivo conservado, onde esses resíduos são essenciais para a atividade protéica. No entanto, um versado na técnica irá compreender que variantes funcionais podem ter alterações menos conservadas ou não conservadas nos resíduos conservados. Exemplos de resíduos que sejam conservados e que podem ser essenciais para a atividade protéica incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas no alinhamento da figura 1. Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições conservativas de aminoácidos e que ainda mantêm atividade incluem, por exemplo, resíduos que têm apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento da figura 1.

Lys-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386, e Lis-411, são resíduos conservados da EPSP sintase de E. coli (Schõnbrunn et al. (2001) Proc. Natl. Acad. E.U.A. 98: 1376- 1380) . Resíduos conservados importantes para a atividade de EPSP sintase também incluem Arg-100, Asp-242, e Asp-3 84 (Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374: 253-256). Arg- 27 liga-se à S3P (Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38: 296-302) .

Alternativamente, seqüências nucleotídicas variantes podem ser feitas através da introdução aleatória de mutações ao longo de todo ou parte do código da seqüência, como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para a capacidade de conferir atividade de resistência a herbicida para identificar mutantes que mantêm atividade. Após mutagênese, as proteínas codificadas podem ser expressas recombinantemente e, a atividade da proteína pode ser determinada usando ensaios de técnicas padrão.

Utilizando métodos como PCR, hibridização, e similares, seqüências com resistência a herbicida correspondente podem ser identificadas, tais seqüências com identidade substancial para as seqüências da invenção. Ver, por exemplo, Sambrook J., e Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).

Em um método de hibridização, a totalidade ou parte da seqüência nucleotídica com resistência a herbicida pode ser utilizada para rastrear cDNA genômico ou bibliotecas. Métodos para a construção de tais cDNA e bibliotecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook e Russell, 2001, supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser marcadas com um grupo detectável, como P, ou qualquer outro marcador detectável, como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator enzimático. Sondas de hibridização podem ser feitas por marcação de oligonucleotídeos sintéticos baseados nas seqüências nucleotídicas com codificação de resistência a herbicida conhecidas e descritas aqui. Iniciadores degenerados concebidos com base em aminoácidos ou resíduos de nucleotídeos conservados nas seqüências de nucleotídeos ou seqüências de aminoácidos codificados podem também ser utilizados. A sonda tipicamente inclui uma região de seqüência nucleotídica que hibridiza sob condições estringentes de, pelo menos, cerca de 12, de preferência de cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1300 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência nucleotídica com codificação de resistência a herbicida da invenção ou um fragmento ou variante deste. Métodos para a preparação de sondas para hibridização são geralmente conhecidos no estado da técnica e são descritos em Sambrook e Russell, 2001, supra e Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque) , ambos os quais são aqui incorporados por referência.

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Por exemplo, uma seqüência inteira de resistência a herbicida descrita aqui, ou uma ou mais partes dela, pode ser utilizada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente as seqüências de resistência ao herbicida correspondente e RNAs mensageiros. Para atingir hibridização específica em uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que são únicas e são, pelo menos, cerca de 10 nucleotídeos em comprimento, ou pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Essas sondas podem ser utilizadas para amplificar seqüências de resistência ao herbicida de um organismo escolhido por PCR. Esta técnica pode ser utilizada para isolar seqüências codificantes adicionais a partir de um desejado organismo ou como um teste diagnóstico para determinar a presença de seqüências codificantes em um organismo. Técnicas de hibridização incluem triagem de hibridação em bibliotecas de DNA plaqueado (ou placas ou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

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Hibridização dessas seqüências pode ser realizada sob condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" entende-se as condições em que uma sonda irá hibridizar a sua seqüência alvo para um maior grau detectável do que de outras seqüências (por exemplo, pelo menos 2 vezes acima). Condições estringentes são dependentes da seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Ao controlar a estringência da hibridização e/ou condições de lavagem, seqüências-alvo que são 100% complementares ao da sonda podem ser identificadas (sonda homóloga). Alternativamente, condições estringentes podem ser ajustadas para permitir algumas inadequações em seqüências como graus menores de similaridade ser detectados (sonda heteróloga). Geralmente, uma sonda é inferior a cerca de 1000 nucleotídeos em comprimento, de preferência com menos de 500 nucleotídeos em comprimento. Tipicamente, condições estringentes serão aquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íon Na (ou de outros sais) empH7,0a8,3ea temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (por exemplo, maior que 50 nucleotídeos). Condições estringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, como formamida. Condições exemplares de baixa estringência incluem hibridização com uma solução-tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e uma lavagem Ix ou 2x em SSC (2Ox SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M de citrato trissódico) a 50 a 55°C. Condições exemplares de moderada estringência incluem hibridização em 40 a 45% de formamida, 1,0 M de NaCli 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem 0. 5x a Ix em SSC a 55 a 60°C. Condições exemplares de elevada estringência incluem hibridização em 50% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem 0.Ix em SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente, tampões de lavagem podem incluir cerca de 0,1% para cerca de 1% de SDS. A duração de hibridização é geralmente inferior a cerca de 24 horas, normalmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

A especificidade é normalmente a função de lavagens pós- hibridação, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução final de lavagem. Para híbridos DNA- DNA, a TM pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500 / L, onde M é a molaridade de cátions monovalentes, % GC é o percentual de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a percentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) em que 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza perfeitamente para uma sonda marcada. Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de inadequações; assim, Tm, hibridação e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para hibridizar para seqüências de identidade pretendida. Por exemplo, se seqüências com ^ 90% de identidade são procurados, a TM pode ser diminuída 10°C. Geralmente, são selecionadas as condições estringentes para ser cerca de 50C inferior ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sua seqüência específica e complementar a um força iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridação e/ou lavagem com 1, 2, 3 ou 40C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm); condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridação e/ou lavar a 6, 7, 8, 9 ou IO0C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm), condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridação e/ou lavar a 11, 12, 13, 14, 15 ou 2 0°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm). Usando a equação, hibridização e composições de lavagem, e Tm desejado, os versados na técnica irão entender que as variações na severidade da hibridação e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritos. Se o grau desejado de resultados inadequados em um Tm de menos de 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida) , será preferível aumentar a concentração do SSC, para que uma temperatura mais elevada possa ser utilizada. Um extenso guia para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, Nova Iorque); e Ausubel et ai. , eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nova Iorque).

Proteínas Isoladas e Variantes e Fragmentos Destas

Proteínas com resistência a herbicidas também são englobadas no âmbito da presente invenção. Por "proteína com resistência à herbicida" é entendido uma proteína com seqüência de aminoácidos estabelecidos nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 14. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e variantes destes, são também fornecidos, e podem ser utilizados para a prática dos métodos da presente invenção.

"Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeos compreendendo uma porção de uma seqüência de aminoácidos codificando uma proteína de resistência a herbicida, tal como estabelecido nas SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 14, e que mantém atividade de resistência a herbicida. Uma porção biologicamente ativa de uma proteína com resistência a herbicida pode ser um polipeptídeo que é, por exemplo, 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos em comprimento. Essas porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para atividade de resistência a herbicida. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Patentes U.S. nos. 4.535.060 e 5.188.642, cada um dos quais aqui incorporadas por referência, na sua totalidade. Conforme utilizado aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 14. A invenção engloba outros fragmentos, porém, como em qualquer fragmento de proteína superior a cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, ou 400 aminoácidos.

Por "variantes" é entendido polipeptídeos ou proteínas tendo uma seqüência de aminoácidos que é, pelo menos, cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, ou 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ou 14. Variantes incluem também polipeptídeos codificados por um ácido nucléico que hibridiza a molécula de ácido nucléico das SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, ou um complemento das mesmas, sob condições estringentes. Variantes incluem polipeptídeos que diferem na seqüência de aminoácidos devido a mutagênese. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, mantendo atividade de resistência a herbicida. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicida são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Patentes U.S. nos. 4.535.060 e 5.188.642, cada um dos quais aqui incorporados por referência, na sua totalidade.

Genes bacterianos, tais como os genes grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31 desta invenção, muitas vezes possuem códons de iniciação múltiplos de metionina na proximidade com o início da fase aberta de leitura. Muitas vezes, o início da tradução um ou mais destes códons iniciadores levará à geração de uma proteína funcional. Estes códons iniciadores podem incluir códons ATG. No entanto, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como um códon iniciador, e as proteínas que iniciam a tradução dos códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Além disso, não é muitas vezes determinada a priori qual destes códons são utilizados naturalmente na bactéria. Assim, é entendido que a utilização de um dos códons alternativos de metionina pode levar a geração de variantes de grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, syngrg31 que conferem resistência a herbicida. Essas proteínas de resistência a herbicidas são englobadas na presente invenção e podem ser utilizadas nos métodos da presente invenção. Anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção, ou para as variantes ou fragmentos destes, também estão englobados. Métodos de produção de anticorpos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Patente U.S. No. 4.196.265).

Variantes Alteradas ou aperfeiçoadas

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É reconhecido que seqüências de DNA de grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31 podem ser alteradas por vários métodos, e que estas alterações podem resultar em seqüências de DNA que codificam proteínas com seqüências de aminoácidos diferentes do que as codificadas por grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, ou grg31, respectivamente. Esta proteína pode ser alterada de várias maneiras, incluindo substituições de aminoácidos, supressões, truncações, e inserções de um ou mais aminoácidos das SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, incluindo-se cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30 , cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100 ou mais substituições de aminoácidos, supressões ou inserções. Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, variantes da seqüência de aminoácidos de proteínas GRG descritas aqui podem ser preparadas por mutações no DNA. Isso também pode ser realizado por uma das várias formas de mutagênese e/ou em evolução dirigida. Em alguns aspectos, as alterações codificadas na seqüência de aminoácidos não irão afetar substancialmente a função da proteína. Essas variantes vão possuir a atividade de resistência a herbicida desejada. No entanto, entende-se que a capacidade de GRG25, GRG2 6, GRG27, GRG28, GRG29, GRG30, ou GRG31 para conferir resistência a herbicida pode ser melhorada através da utilização de uma dessas técnicas sobre as composições da presente invenção. Por exemplo, um pode expressar GRG25, GRG26, GRG27, GRG28, GRG29, GRG30, ou GRG31 em células hospedeiras que apresentam elevadas taxas de incorporação de base durante a replicação do DNA, como o XL-I Red (Stratagene, La Jolla, CA). Depois de propagação nessas linhagens, pode-se isolar o DNA da invenção (por exemplo, através da preparação do DNA plasmidial, ou por 2 0 amplificação por PCR e clonagem do fragmento resultante da PCR em um vetor) , cultivar mutações grg em uma estirpe não- mutagênica, e identificar genes mutantes com melhor resistência a um herbicida tal como o glifosato, como, por exemplo, cultivando células de cultura em concentrações crescentes de glifosato e testando para clones que conferem a capacidade de tolerar elevadas concentrações de glifosato. Alternativamente, alterações podem ser feitas para a seqüência de proteína no amino ou carboxi terminal de muitas proteínas sem afetar sensivelmente a atividade. Isto pode incluir inserções, deleções, ou alterações introduzidas pelos modernos métodos moleculares, como PCR, incluindo amplif icações PCR que alteram ou aumentam a seqüência de proteína codificante em virtude da inclusão de seqüências de aminoácidos codificando seqüências nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as seqüências protéicas acrescentadas podem incluir toda a codificação de seqüências de proteínas, como as usadas comumente no estado da técnica de produzir fusões protéicas. Essas proteínas fusionadas são freqüentemente utilizadas para (1) aumentar expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática, ou epítopo para facilitar a purificação protéica, detecção de proteína, ou outras utilizações experimentais conhecidas no estado da técnica, ou, (3) secreção alvo ou tradução de uma proteína de uma organela subcelular, tais como o espaço periplasmático de bactérias gram-negativas, ou do retículo endoplasmático de células eucarióticas, o último dos quais muitas vezes resulta em glicosilação da proteína.

Nucleotídeos variantes e seqüências de aminoácidos da presente invenção também englobam seqüências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos tais como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, uma ou mais diferentes proteínas com resistência a herbicidas codificando regiões podem ser usadas para criar uma nova proteína com resistência a herbicida possuindo as propriedades desejadas. Desta forma, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de seqüências de polinucleotídeos relacionados compreendendo regiões da seqüência que têm uma identidade de seqüência substancial e que podem ser recombinadas homologamente in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, seqüências-motivo codificando um domínio de interesse podem ser embaralhados entre o gene de resistência a herbicida da invenção e outros genes de resistência a herbicida conhecidos para obter um novo gene que codifica para uma proteína com uma melhoria da propriedade de interesse, tais como um aumento da atividade de resistência ao glifosato. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et ai. (1997) J. Mol Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291, e Patente U.S. nos. 5.605.793 e 5.837.458.

Espectro de Temperatura

Vários estudos de metabolismo do glifosato nas plantas têm sido realizados, e revelam que o glifosato não é metabolizado pelas plantas ou é metabolizado muito lentamente. 0 glifosato penetra a cutícula rapidamente, e é translocado completamente nas plantas em um período considerável de tempo (revisto em Kearney e Kaufman, Eds (1988) Herbicides; Chemistry, Degradation & Mode of Action Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, 3: 1-70 e Grossbard e Atkinson, Eds. (1985) The Herbieide Glyphosate Butterworths, Londres, p. 25-34). Assim, é provável que a tolerância ao glifosato seja necessária durante um longo período de tempo após a exposição ao glifosato em plantas agronomicamente importantes. Onde as temperaturas excedem com freqüência os 3O0C durante a época de crescimento, seria vantajoso empregar uma EPSP sintase com tolerância ao glifosato que mantivesse atividade em temperaturas elevadas.

Em uma concretização da presente invenção, a EPSP sintase apresenta estabilidade térmica, a uma temperatura que é superior ou inferior à temperatura ambiental do ambiente. Por "estabilidade térmica" entende-se que a enzima está ativa em uma maior ou menor temperatura ambiente superior a temperatura ambiente por um longo período de tempo superior a EPSP sintase que não é estável termicamente a essa temperatura. Por exemplo, uma EPSP sintase estável termicamente possui atividade enzimática para mais de cerca de 1 hora, mais de cerca de 2 horas, a cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11 , cerca de 12, cerca de 13, cerca de 14, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25 horas, ou mais, a xima temperatura que é superior ou inferior à temperatura ambiente do meio. Para efeitos da presente invenção, temperatura "ambiente" do meio é de cerca de 30°C. Em algumas concretizações, uma temperatura superior a uma temperatura ambiente é a temperatura igual ou superior a cerca de 32°C, cerca de 34°C, cerca de 37°C, cerca de 40°C, cerca de 45°C, cerca de 50°C, cerca de 55°C, cerca de 60°C, cerca de 65°C ou superior. Uma inferior a temperatura ambiente é uma temperatura igual ou inferior a cerca de 28°C, abaixo de cerca de 27°C, cerca de 26°C, cerca de 25°C, cerca de 23°C, cerca de 20°C, cerca de 18°C, cerca de 15°C, cerca de 10°C, ou menos cerca de 5°C, ou seja, cerca de 0°C. Métodos de ensaio para a atividade da EPSP sintase são discutidos em mais detalhes a seguir noutros trechos. Para efeitos da presente invenção, uma EPSP sintase termicamente estável é considerada ativa quando ela funciona em cerca de 90% a 100%, cerca de 80% para cerca de 90%, cerca de 70% para cerca de 80%, cerca de 60% para cerca de 70% ou cerca de 50% para cerca de 60% do nível máximo de atividade observada à temperatura ótima para essa enzima.

Em outra concretização, a temperatura ótima para uma enzima EPSP sintase da invenção é superior ou inferior à temperatura ótima de uma enzima EPSP sintase de tipo selvagem com tolerância ao glifosato. Para efeitos da presente invenção, uma enzima EPSP sintase de tipo selvagem com tolerância ao glifosato é uma enzima que tem máxima atividade em temperatura ambiental do ambiente (por exemplo, a enzima EPSP sintase com tolerância ao glifosato descrita no GRG23 no Pedido de Patente U.S. No. 11/605.824, depositado em 29 de novembro de 2006, aqui incorporado por referência na sua totalidade). Por "ótima" se entende a maior atividade observada para uma enzima EPSP sintase, por exemplo, guando medida em várias faixas de temperatura. Nos exemplos não limitantes, a EPSP sintase empregada nos métodos da invenção pode ter ótima atividade de cerca de 0°C a cerca de 10°C, cerca de 10°C a cerca de 20°C, cerca de 20°C a cerca de 30°C, cerca de 30°C a cerca de 40°C, cerca de 40°C a cerca de 50°C, cerca de 50°C a cerca de 60°C, cerca de 60°C a cerca de 70 °C, ou cerca de 70°C a cerca de 80°C.

Assim, aqui são fornecidos métodos e composições para o aumento da tolerância ao glifosato, a temperaturas superiores ou inferiores às temperaturas ambientais do ambiente. Em uma concretização, os métodos compreendem incluir em uma planta uma seqüência nucleotídica que codifica uma enzima EPSP sintase com tolerância ao glifosato que é termicamente estável, com uma temperatura superior ou inferior à temperatura ambiente, e cultivar a planta a uma temperatura que é superior ou inferior, respectivamente, à temperatura ambiental do ambiente. Em concretizações específicas, a temperatura crescente é superior ou inferior à temperatura ambiente para uma média de pelo menos cerca de 2 horas por dia, pelo menos cerca de 3 horas por dia, pelo menos cerca de 4 horas por dia, pelo menos cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 11, cerca de 12, cerca de 14, cerca de 16, cerca de 18, cerca de 20, pelo menos, cerca de 22 horas por dia, ou até cerca de 24 horas por dia durante o período vegetativo da planta.

Em outra concretização, o método compreende introduzir em uma planta uma seqüência nucleotídica que codifica uma enzima EPSP sintase tolerante ao glifosato diferente da SEQ ID NO: 35, 36, ou 37, que tem uma ótima temperatura ambiente superior a temperatura ambiental do ambiente, contatando a planta com uma concentração com efeito herbicida de glifosato, e cultivando a dita planta a uma temperatura ambiente superior a temperatura ambiental do ambiente durante pelo menos 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4 ou mais horas por dia para, pelo menos, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias após o glifosato ser aplicado nas plantas, em que os dias em que a temperatura excede a temperatura ambiente do meio ocorrem durante o período vegetativo da planta. Em outra concretização, o método compreende introduzir em uma planta uma seqüência nucleotídica que codifica uma enzima EPSP sintase tolerante ao glifosato diferente da SEQ ID NO: 38, que tem uma temperatura ambiente ótima inferior a temperatura ambiente, contatando a planta com uma concentração com efeito herbicida de glifosato, e cultivando a dita planta a uma temperatura inferior a temperatura ambiente durante, pelo menos, cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4 ou mais horas por dia para, pelo menos, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias após o glifosato ser aplicado às plantas, em que os dias em que a temperatura excede a temperatura ambiente do meio ocorrerem durante o período vegetativo da planta.

Em outra concretização, o método compreende introduzir em uma planta uma seqüência nucleotídica que codifica uma EPSP sintase tolerante ao glifosato que é estavelmente térmica a temperaturas superiores a temperatura ambiente do meio, contatando a planta com uma concentração com efeito herbicida de glifosato, e cultivando a planta em uma temperatura que é superior a temperatura ambiente do meio, onde a temperatura é superior a temperatura ambiente do meio durante, pelo menos, cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4 ou mais horas por dia, durante pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias após o glifosato ser aplicado à planta, onde os dias em que a temperatura excede a temperatura ambiente do meio ocorrem durante o período vegetativo da planta. Em um exemplo não limitante, a enzima EPSP sintase termicamente estável é estabelecida na SEQ ID NO: 14. Alternativamente, o método compreende introduzir em uma planta uma seqüência nucleotídica que codifica uma enzima EPSP sintetase tolerante ao glifosato que é térmicamente estável em temperaturas inferiores a temperatura ambiente, contatando a planta com uma concentração com efeito herbicida de glifosato, e cultivando a planta, a uma temperatura que é inferior à temperatura ambiente do meio, por pelo menos, cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4 ou mais horas por dia para, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias após o glifosato ser aplicado às plantas, em que os dias em que a temperatura excede a temperatura ambiente do meio ocorrem durante o estado vegetativo da planta.

Em várias concretizações, a enzima EPSP sintase com tolerância ao glifosato que é termicamente estável em temperaturas superiores ou inferiores às temperaturas ambiente do meio, ou que tenha um ótimo térmico a uma temperatura inferior ou superior à temperatura ambiente, não é xima EPSP sintase derivada de planta. Por "derivada de planta" entende-se a seqüência EPSP sintase da planta nativa, ou lima seqüência que é, pelo menos, cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% idêntica à seqüência da planta nativa. Ver, por exemplo, as seqüências EPSP sintase derivadas de plantas com tolerância ao glifosato descritas nos Pedidos de Patente U.S. nos. 20060143727, 20030049814, 20030079246, 20030200560, 2004148650 e 20050223436; Patentes U.S. nos. 5188642, 6040497, 7214535, 7169970, 6867293, 7183110, 5094945, 6225114, 7141722, 7045684, 5312910, 6566587, e RE037287, cada um dos quais aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Transformação de bactérias ou células vegetais

Aqui são fornecidos novos genes isolados que conferem resistência a um herbicida. São fornecidas, também, as seqüências de aminoácidos das proteínas GRG da invenção. A proteína resultante da tradução deste gene permite às células funcionar na presença de concentrações de um herbicida tóxicas para as células, incluindo células vegetais e células bacterianas. Em um aspecto da invenção, os genes grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31 são úteis como marcadores para avaliar a transformação de bactérias ou células vegetais. Métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão vegetal (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc), sementes, células vegetais, propágulo, embrião ou descendentes dos mesmos são bem conhecidos no estado da técnica.

Através da engenharia dos genes da invenção a serem expressos a partir de um promotor conhecido por estimular a transcrição no organismo a ser testado e devidamente traduzido para gerar um peptídeo GRG intacto, e colocar as células de uma outra concentração tóxica de herbicida, pode- se identificar as células que foram transformadas com o DNA, por força da sua resistência ao herbicida. Por "promotor" entende-se uma seqüência de ácidos nucléicos que funciona para dirigir a transcrição de uma seqüência codificante à jusante. 0 promotor, em conjunto com outras seqüências de ácidos nucléicos regulatórias transcricional e translacional, (também denominado como "seqüências controle") são necessários para a expressão de uma seqüência de DNA de interesse.

A transformação de células bacterianas é realizada por uma das várias técnicas conhecidas no estado da técnica, incluindo mas não limitadas a eletroporação ou transformação química (ver, por exemplo, Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Indianapolis, IN). Marcadores conferindo resistência a substâncias tóxicas são úteis na identificação de células transformadas (retomado e expressado o DNA teste) a partir de células não-transformadas (aquelas que não contenham ou não expressam o DNA teste) . Em um aspecto da invenção, os genes grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31 são úteis como marcadores para avaliar a transformação de bactérias ou células vegetais.

A transformação de células vegetais pode ser realizada no mesmo estilo. Por "plantas" entende-se a planta inteira, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, sementes, embriões e descendentes do mesmo. Células vegetais podem ser diferenciadas ou

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20 indiferenciadas (por exemplo, calos, células cultivadas em suspensão, protoplastos, células foliares, células da raiz, células do floema, pólen). "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ou plantas "estavelmente transformadas" ou tecidos ou células referem-se a plantas que tenham incorporado ou integrado seqüências de ácido nucléico exógeno ou fragmentos de DNA na célula vegetal. Por "transformação estável" é entendido a construção de nucleotideo introduzido em uma planta que se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pelos descendentes destes.

Os genes grg da invenção podem ser modificados para obter ou melhorar a expressão nas células vegetais. As seqüências com resistência a herbicida da invenção podem ser fornecidas em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. "Cassete de expressão vegetal" inclui construções de DNA, incluindo construções de DNA recombinante, que são capazes de resultar na expressão de uma proteína a partir de uma fase aberta de leitura na célula vegetal. 0 cassete vai incluir na direção 5'-3' da transcrição, uma região de iniciação transcricional (ou seja, promotor, particularmente um promotor heterólogo) operacionalmente ligado a toma seqüência de DNA da invenção, e/ou uma região terminal transcricional e traducional (ou seja, a região terminal) funcional nas plantas. 0 cassete pode também conter, pelo menos, um gene adicional a ser co transformado para o organismo, como um gene marcador selecionável. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(s) podem ser fornecidos em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é fornecido com uma pluralidade de restrições locais para a inserção da seqüência de resistência a herbicida para estar sob a regulação transcricional de regiões reguladoras.

0 promotor pode ser nativo ou análogo, ou externo ou heterólogo, para a planta hospedeira e/ou para a seqüência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou, alternativamente, uma seqüência sintética. Onde o promotor é "nativo" ou "homólogo" para a planta hospedeira, pretende-se que o promotor seja encontrado na planta nativa em que o promotor é introduzido. Onde o promotor é "externo" ou "heterólogo" para a seqüência de DNA da invenção, pretende-se que o promotor não seja o nativo ou que ocorre naturalmente para a seqüência de DNA operacionalmente ligada da invenção. "Heterólogo" geralmente se refere às seqüências de ácido nucléico que não são endógenas para a célula ou parte do genoma nativo em que estão presentes, e foram adicionados à célula por infecção, transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou coisas do gênero. Por "operacionalmente ligado" entende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, onde a seqüência do promotor inicia e medeia a transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as seqüências do ácido nucléico sendo ligadas são contíguas e 10

onde necessário para juntar duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e na mesma fase de leitura.

Muitas vezes, essas construções também irão conter regiões 5' e 3'não traduzidas. Essas construções podem conter uma "seqüência sinal" ou "seqüência líder" para facilitar o transporte co-traducional ou pós-traducional do peptídeo de interesse para determinadas estruturas intracelulares, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático, ou aparelho de Golgi, ou a serem secretadas. Por exemplo, o gene pode ser projetado para conter um peptídeo sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Por "seqüência sinal" entende-se uma seqüência que é conhecida ou suspeita para resultar em transporte de peptídeo cotraducional ou pós-traducional através da membrana celular. Em eucariotos, esta normalmente envolve secreção no aparelho de Golgi, com alguma glicosilação resultante. Por "seqüência líder" entende-se qualquer seqüência que, quando traduzida, resulta em uma seqüência de aminoácidos suficientes para desencadear o transporte co-traducional da cadeia peptídica para uma organela sub-celular. Assim, esta inclui seqüências líder objetivando transporte e/ou glicosilação pela passagem para o retículo endoplasmático, passagem de vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias, e coisas do gênero. Também pode ser preferível a engenharia do cassete de expressão para conter um íntron, de tal forma que o

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20 processamento do mRNA no íntron é necessário para a expressão.

Por "região 3' não traduzida" entende-se uma seqüência nucleotídica localizada a jusante da seqüência codificante. Seqüências sinal de poliadenilação e outras seqüências codificando sinais reguladores susceptíveis de afetar a adição de ácido poliadenílico para a extremidade 3' de precursores do mRNA são regiões 3' não traduzidas. Por "região 5' não traduzida" entende-se uma seqüência nucleotídica localizada a montante de uma seqüência codificante. Outros elementos não traduzidos a montante ou a jusante incluem promotores.

Promotores são seqüências nucleotídicas que agem no

sentido de aumentar a expressão de uma região promotora.

Promotores são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não

estão limitados a, região promotora SV40 e elemento promotor 35S.

A região terminal pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a seqüência de resistência a herbicida da presente invenção, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo-Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação octopina sintase e nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogm et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891- 7903; e Joshi et al. (1987) Nucleie Aeid Res. 15: 9627-9639.

Em um aspecto da invenção, seqüências de DNA sintéticas, são concebidas para um determinado polipeptídeo, como os polipeptídeos da invenção. A expressão da fase aberta de leitura da seqüência de DNA sintético numa célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. Seqüências de DNA sintéticas podem ser úteis para simplesmente remover sítios de restrição de endonuclease indesejados, para facilitar estratégias de clonagem do DNA, para alterar ou remover qualquer códon potencial, para modificar ou melhorar conteúdo GC, para remover ou alterar sítios fases de leitura, e/ou para alterar ou remover sítios de reconhecimento de íntron/exon, sítios de poliadenilação, seqüências Shine- Delgarno, elementos promotores não desejados e similares que podem estar presentes em uma seqüência de DNA nativo. Também é possível que seqüências sintéticas de DNA possam ser utilizadas para introduzir outras melhorias em uma seqüência de DNA, tais como a introdução de uma seqüência íntron, a criação de uma seqüência de DNA que, expressada como uma proteína de fusão de seqüências de organelas alvo, como peptídeos de trânsito do cloroplasto, apoplasto/peptídeos vacuolares alvo, ou seqüências de peptídeo que resultem na manutenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Genes sintéticos também podem ser sintetizados utilizando 4b / 75 códons preferenciais da célula hospedeira para uma melhor expressão, ou podem ser sintetizados utilizando códons de códons hospedeiros preferidos de freqüência útil. Ver, por exemplo, Campbell e Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11; Patente U.S. n« 6.320.100, 6.075.185, 5.380.831 e 5.436.391, Pedidos Publicados U.S. nos. 20040005600 e 20010003849, e Murray et ai. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, aqui incorporados por referência.

Em uma concretização, os ácidos nucléicos de interesse são orientados para o cloroplasto para expressão. Desta forma, quando o ácido nucléico de interesse não está diretamente inserido no cloroplasto, o cassete de expressão irá conter adicionalmente um ácido nucléico codificando um peptídeo de trânsito para orientar o produto de gene de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.

Os ácidos nucléicos de interesse a serem orientados para o cloroplasto podem ser otimizados para a expressão em cloroplasto para ter em conta as diferenças em um códon útil entre o núcleo da planta e esta organela. Desta forma, os ácidos nucléicos de interesse podem ser sintetizados utilizando códons de cloroplastos preferidos. Ver, por

exemplo, Patente U.S. No. 5.380.831, aqui incorporada por referência.

Normalmente este "cassete de expressão vegetal» será

inserido em um "vetor de transformação". Por "vetor de

transformação" entende-se uma molécula de DNA que é

necessária para uma transformação de uma célula. Essa

molécula pode ser constituída por um ou mais cassetes de

expressão, e pode ser organizada em mais de uma molécula de

DNA "vetor". Por exemplo, vetores binários são vetores de

transformação de plantas que utilizam dois vetores não

contíguos de DNA para codificar todas as funções eis- e

trans- de transformação de células vegetais (Hellens e

Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451).

"Vetor" refere-se a uma construção de ácido nucléico

concebido para o transporte entre as diferentes células

hospedeiras. "Vetor de expressão" refere-se a um vetor que

tem a capacidade de incorporar, integrar e expressar

seqüências de DNA heterólogas ou fragmentos de uma célula externa.

Este vetor de transformação vegetal pode ser composto apenas por um ou mais vetores de DNA necessários para a realização da transformação de plantas. Por exemplo, é uma prática comum na técnica utilizar vetores de transformação de plantas que são compostos por mais de um segmento contíguo de DNA. Esses vetores são muitas vezes referidos no estado da

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25 técnica como "vetores binários." Vetores binários, bem como vetores com plasmídios são mais freqüentemente utilizados para transformação mediada por Agrobacteriuml onde a dimensão e complexidade dos segmentos de DNA necessários para alcançar eficiente transformação são muito grandes, e é vantajoso para separar as funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários normalmente contêm um vetor de plasmideo que contém seqüências de ação eis- exigidas para a transferência T-DNA (como a borda esquerda e a borda direita) , um marcador selecionável que está projetado para ser capaz de expressar em uma célula vegetal, e um "gene de interesse" (um gene projetado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal para geração de plantas transgênicas que é desejado) . Também presentes neste vetor plasmidial estão seqüências necessárias para a replicação bacteriana. As seqüências de ação cis- estão dispostas em uma forma eficiente para permitir a transferência em células vegetais e a expressão. Por exemplo, o gene marcador selecionável e o gene de interesse estão localizados entre as bordas esquerda e direita. Muitas vezes um segundo vetor plasmidial contém fatores de ação trans- que medeiam a transferência do T-DNA de Agrobacterium de células vegetais. Este plasmidio contém freqüentemente funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção das células vegetais por Agrobacterium, e a transferência de DNA pela clivagem nas seqüências da borda e transferência de DNA mediada por vir, como é entendida na técnica (Hellens e Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5: 446-451) . Vários tipos de cepas de Agrobacterium (por exemplo, LBA4404, GV3101, EHAlOl, EHAlO5, etc) podem ser utilizadas para a transformação de plantas. 0 segundo vetor plasmidial não é necessário para transformar as plantas através de outros métodos, como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.

Transformação vegetal

Métodos da invenção envolvem a introdução de uma construção de nucleotídeo em uma planta. Por "introdução" entende-se apresentar à planta a construção de nucleotídeo de forma a que os ganhos da construção acessem o interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não exigem que um determinado método para a introdução de uma construção de nucleotídeo em uma planta seja utilizado, só que a construção de nucleotídeo ganhe acesso no interior de, pelo menos, uma célula da planta. Métodos para introduzir construções de nucleotídeo em plantas são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.

Em geral, métodos de transformação de plantas envolvem transferência heteróloga de DNA em células vegetais alvo (por exemplo, embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calos indiferenciados, protoplastos, etc), seguida pela aplicação de um nível limiar máximo adequado de seleção (em função do gene marcador selecionável e, neste caso "glifosato") para recuperar células vegetais transformadas de um grupo de massa celular não transformada. Explantes normalmente são transferidos para um novo suprimento do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Posteriormente, as células transformadas são diferenciadas em brotações após a colocação do meio suplementado de regeneração com um limite de nível máximo de agente de seleção (por exemplo, "glifosato"). Os brotos são então transferidos para um meio seletivo de enraizamento para recuperar o enraizado ou as pequenas plantas. As pequenas plantas transgênicas então crescem em plantas maduras e produzem sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750). Explantes normalmente são transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para a geração de plantas transgênicas é encontrada em Ayres e Park (1994) Criticai Reviews in Plant Science 13: 219-239 e Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Uma vez que o material transformado contém muitas células, ambas células transformadas e não transformadas estão presentes em qualquer parte do calo alvo ou tecido ou grupo de células objetivados. A capacidade de matar células não transformadas e permitir células transformadas para multiplicar resulta em culturas de plantas transformadas. Muitas vezes, a capacidade de eliminar células não transformadas é uma limitação para recuperação rápida de células vegetais transformadas e para geração bem sucedida de plantas transgênicas. Métodos bioquímicos e moleculares podem então ser utilizados para confirmar a presença do gene de heterólogo integrado de interesse no genoma da planta transgênica.

A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um de vários métodos, incluindo, mas não limitados a introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium) , bombardeamento de células vegetais com DNA heterólogo externo aderido às partículas, e vários outros métodos mediados diretamente por não-partículas (por exemplo, Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6: 271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750; Ayres e Park (1994) Criticai Reviews in Plant Science 13: 219-239; Bommineni e Jauhar (1997) Maydica 42: 107 - 120) para transferir DNA.

Métodos de transformação de cloroplastos são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 87: 8526-8530; Svab e Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 90: 913-917; Svab e Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. 0 método baseia-se na descarga de partícula de DNA contendo um marcador selecionável e alvo do DNA para o genoma plastidial através de recombinação homóloga. Além disso, transformação plastidial pode ser realizada através de uma transativação do transgene do plastídeo silencioso por expressão de um tecido preferido de uma RNA polimerase plastídeo-dirigida e núcleo- codificada. Esse sistema tem sido relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 91: 7301-7305.

As células que foram transformadas em plantas podem ser cultivadas de acordo com as formas convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Estas plantas podem então ser cultivadas, por polinização com a mesma linhagem transformada ou diferentes linhagens, e os híbridos resultantes tendo expressão constitutiva de característica fenotípica pretendida identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão das características fenotípicas desejadas seja mantida estável e herdável e, em seguida, as sementes colhidas a fim de garantir que a expressão das características fenotípicas pretendidas tenha sido alcançada. Desta forma, a presente invenção prevê semente transformada (também referida como "semente transgênica") , com uma construção de nucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em seu genoma.

Plantas

A presente invenção pode ser utilizada para a transformação de qualquer espécie vegetal, incluindo mas não limitadas a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentão, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza, Brassica sp., alfafa, centeio, milheto, cártamo, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, citricos, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, mamão, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, legumes, plantas ornamentais, e coníferas.

Vegetais incluem, mas não estão limitados a, tomate, alface, feijão verde, feijões, ervilhas, e os membros do gênero Curcumis tais como pepino, melão, melancia e almiscar. Plantas ornamentais incluem, mas não estão limitadas a, azaléia, hortência, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravo, poinsétia e crisântemo. Preferencialmente, as plantas da presente invenção são espécies vegetais (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentão, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de- açúcar, tabaco, cevada, colza, etc).

Esta invenção é particularmente adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas, incluindo, mas não se limitando a, milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana-de-açúcar, abacaxi, batata doce, cebola, banana, coco, e as palmas.

Avaliação da Transformação Vegetal

Após a introdução de DNA heterólogo externo em células vegetais, a transformação ou integração de genes heterólogos no genoma vegetal é confirmada por vários métodos, como a análise de ácidos nucléicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.

Análise por PCR é iam método rápido de selecionar células transformadas, tecidos ou brotos para a presença de genes incorporados na fase anterior, antes do transplante para o solo (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . A PCR é realizada utilizando oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene de interesse ou vetor Agrobacterium, etc.

A transformação vegetal pode ser confirmada por análise de Southern blot do DNA genômico (Sambrook e Russell, 2001, supra). Em geral, o DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas restrição apropriadas, fracionado em um gel de agarose e transferido para uma membrana de nitrocelulose ou nylon. A membrana ou "mancha" é, então, analisada, por exemplo, com fragmentos de DNA alvo radiomarcados com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma vegetal, de acordo com as técnicas padrão (Sambrook e Russell, 2001, supra). Na análise Northern, o RNA é isolado a partir de tecidos específicos de transformantes, fracionado em um gel de formaldeído agarose, manchado em um filtro de nylon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente utilizados na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificado por grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, gfg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31 é, então, testada por hibridização do filtro para uma sonda radioativa proveniente de um polinucleotídeo da invenção, através de métodos conhecidos na técnica (Sambrook e Russell, 2001, supra).

Western Blot e testes bioquímicos e semelhantes podem ser realizados sobre as plantas transgênicas para determinar a presença da proteína codificada pelo gene de resistência a herbicida por procedimentos padrões (Sambrook e Russell, 2001, supra), utilizando anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos presentes na proteína de resistência a herbicida.

Métodos para o aumento da produção vegetal

Métodos para aumentar as características de produção de plantas são fornecidos. Os métodos incluem introdução em uma planta ou uma célula vegetal de polinucleotídeo compreendendo uma seqüência grg descrita aqui. Tal como definido aqui, o "rendimento" da planta se refere à qualidade e/ou à quantidade de biomassa produzida pelas plantas. Por "biomassa" entende-se qualquer medida de produto vegetal. Um aumento na produção de biomassa é uma melhora no rendimento medido do produto vegetal. 0 aumento de produção vegetal tem várias aplicações comerciais. Por exemplo, o aumento da biomassa vegetal foliar pode aumentar o rendimento das hortaliças folhosas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, o aumento da biomassa foliar pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos ou industriais derivados de plantas. Um aumento no rendimento pode incluir qualquer aumento estatisticamente significativo, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos um aumento de 1%, pelo menos um aumento de 3%, pelo menos um aumento de 5%, pelo menos um aumento de 10%, pelo menos um aumento de 20%, pelo menos um aumento de 30%, pelo menos um de 50%, pelo menos um de 70%, pelo menos um de 100% ou um aumento maior.

Nos métodos específicos, a planta é tratada com uma concentração efetiva de um herbicida, onde a aplicação do herbicida resulta numa maior produtividade vegetal. Por "concentração efetiva" é entendido a concentração que permite o aumento da produtividade na planta. Essas concentrações eficazes de herbicidas de interesse geralmente são conhecidas na técnica. O herbicida pode ser aplicado pré- ou pós- emergência, de acordo com técnicas usuais para a aplicação de herbicida compreendendo culturas que têm sido tornadas resistentes ao herbicida pela expressão heteróloga de um gene grg da invenção.

Métodos para conferir resistência a um herbicida em uma planta ou parte vegetal são também fornecidos. Nestes métodos, \im polinucleotídeo grg descrito aqui é introduzido na unidade, onde a expressão dos polinucleotídeos resulta em tolerância ou resistência ao glifosato. Plantas produzidas por este método podem ser tratadas com uma concentração efetiva de um herbicida e exibirem uma maior tolerância ao herbicida. Uma "concentração efetiva" de um herbicida no presente pedido é uma quantidade suficiente para desacelerar ou parar o crescimento de plantas ou de partes das plantas que não são naturalmente resistentes ou tornadas resistentes ao herbicida.

Em outra concretização, métodos para conferir resistência a um herbicida em uma planta ou partes de plantas são fornecidos, onde a planta ou parte da planta é cultivada sob temperatura superior ou inferior à ambiental, como descrito acima. Enzimas EPSP sintase tolerantes ao glifosato com estabilidade térmica em temperaturas altas ou baixas, ou ter temperatura ótima em maior ou menor temperatura, são úteis para conferir tolerância ao glifosato nas plantas que são cultivadas em tais condições.

Métodos de controle de plantas daninhas em um campo

Métodos para controlar seletivamente ervas daninhas em

um campo contendo uma planta também são fornecidos. Em uma concretização, as sementes de plantas ou plantas são resistentes ao glifosato como resultado de um polinucleotídeo grg descrito aqui sendo inserido nas sementes de plantas ou plantas. Nos métodos específicos, a planta é tratada com uma concentração efetiva de um herbicida, onde a aplicação do herbicida resulta em um controle seletivo de ervas daninhas ou outras plantas não transformadas. Por "concentração efetiva" entende-se a concentração que controla o crescimento ou a propagação de plantas daninhas ou outras plantas não transformadas sem afetar significativamente a planta ou a sementes das plantas resistentes ao glifosato. Essas concentrações eficazes de herbicidas de interesse geralmente são conhecidas no estado da técnica. O herbicida pode ser aplicado pré- ou pós-emergência, de acordo com técnicas usuais para aplicação de herbicida nos campos compreendendo plantas ou sementes de plantas que tenham sido tornadas resistentes ao herbicida.

Os exemplos seguintes são oferecidos a título de ilustração e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Isolamento de ATX8909

ATX8909 foi isolado por plaqueamento de amostras de solo em Meio HEPES Mineral Salts (HMSM) contendo glifosato como a única fonte de fósforo. Desde que HMSM não contém aminoácidos aromáticos, uma estirpe deve ser resistente ao glifosato a fim de crescer sobre este meio.

Dois gramas de solo foram suspensos em aproximadamente ml de água, vortexado durante 15 segundos e permitido liquidar durante 15 minutos. Uma alçada de ΙΟμΙ desta suspensão foi adicionada a 3ml de HMSM suplementado com 10 inM de glifosato (pH 7,0). 0 HMSM contém (por litro): IOg de glicose, 2g de NH4SO4, 9,53g de HEPES, l,0ml 0,8M de MgSO4, l,0ml 0, IM de CaCl2, IfOml de Trace Elements Solution (em IOOml de solução IOOOx: 0,lg de FeSO4.7H20, 0. 5mg de CuSO4. SH2O, IfOmg de H3B03, IfOmg de MnS04.SH20, 7, Omg de ZnSO4.7H20f IfOmg de MoO3f 4f0g de KCl) . A cultura foi cultivada em uma incubadora com agitador por quatro dias a 28°C e em seguida 20μ1 foi usado para inocular 2f5ml de HMSM fresco contendo IOmM de glifosato como a única fonte de fósforo. Após dois dias, 20μ1 foi usado para inocular 2,5ml de outra cultura fresca. Após 5 dias, 20μ1 foi usado para inocular 2,5ml de uma nova cultura. Após crescimento suficiente, a cultura foi plaqueada em meios sólidos por estriamento com alça com Ιμΐ sobre a superfície de placas de ágar contendo ágar HMSM contendo 10OmM de glifosato como a única fonte de fósforo e armazenados a 28°C. A cultura foi então replaqueada para isolamento. Uma estirpe, designada ATX8909, foi escolhida devido a sua capacidade de crescer na presença de altas concentrações de glifosato.

As cepas ATX1367, ATX1394, ATX21307, ATX21310, ATX21315 e ATX21318 foram isoladas, como descrito acima e foram colocadas para crescer em iam meio líquido mínimo contendo até 300 mm de glifosato. Cada uma das cepas foi testada por sequenciamento 16S de rDNA ou pelo teor de ácidos graxos por métodos conhecidos na técnica para identificar a estirpe. As identificações das estirpes são apresentadas na Tabela 1: Tabela 1.

Nome da Cepa ID da Cepa Nome do gene EPSP sintase ATX8909 Arthrobacter arilait grg25 ATX21307 Arthrobacter ramosus grg26 ATX21310 Gram+ (nenhuma correspondência a database MIDI) grg27 ATX21315 Arthrobacter ureafaciens grg28 ATX1367 Paenibacillus pabuli grg29 ATX1394 Paenibaeillus pabuli grg30 ATX21318 Sphingobacterium multivorum/faeeium grg31

Exemplo 2. Clonagem de glvphosate-resistente EPSP sintases

0 DNA genômico foi extraído das cepas descritas na Tabela Ieo DNA resultante foi parcialmente digerido com enzima de restrição Sau3A 1 para produzir fragmentos de DNA com aproximadamente 5 kilobases de tamanho. Estas moléculas de DNA foram selecionadas com base no tamanho nos géis de agarose, purificadas e ligadas em partes de vetores LAMBDA ZAP (R) pré-digeridos com BamH I. As partes de vetores ligadas foram então embaladas em partículas fago, e fagos determinados como conhecido no estado da técnica. As bibliotecas resultantes foram amplificadas através de métodos conhecidos na técnica para gerar uma biblioteca de títulos entre 3 χ IO7 e 3 χ IO8 PFLVmL. Para cada biblioteca independente, E. coli (XLl Blue MRF') foi então co- transfectada com fagos a partir de uma biblioteca amplificada, bem como por fago auxiliar M13 para permitir a excisão em massa da biblioteca, sob a forma de um ssDNA circular infectante como conhecido na técnica (Short et al. (1988) Nucleic Acids Research 16: 7583-7600). Após centrifugação das células co-infectadas, o sobrenadante contendo o fago foi aquecido a 65-70°C durante 15-20 minutos, para neutralizar qualquer resíduo de partículas fago lambda. Diluições da biblioteca plasmidial resultante de ssDNA foram transfectadas em uma cultura fresca de células de E. coli competente XL-Blue MRF' (aroA) (XLl Blue MRF'). As células transfectadas resultantes foram plaqueadas em placas M63 contendo kanamicina, 0,1 mM de IPTG e OmM, 20mM ou 50mM de glifosato.

A E. coli XL-Blue MKF' (aroA) utilizada para a transfecção expressa a F-pilus, e também contém uma supressão do gene aroA que codifica a enzima EPSP sintase endógena de E. coli. Esta estirpe é também referida aqui como AaroA. Esta estirpe AaroA não é capaz de crescer em meios mínimos sem aminoácidos aromáticos, a não ser complementado por uma EPSP sintase funcional. Desde que o glifosato é um potente inibidor de EPSP sintases sensíveis ao glifosato típicas, tais como EPSP sintases tipo I, clones transf ectados expressando uma EPSP sintase não-resistente ao glifosato seria capaz de cultivar em placas M63 sem glifosato, mas seria incapaz de crescer em M63 contendo 2 OmM ou 5OmM de glifosato. A fim de crescer em placas M63 contendo 20mM ou 50mM de glifosato, as células devem conter um plasmídeo que expressa uma EPSP sintase que é ambos (1) capaz de cl / 7 5 complementar a mutação AaroA destas células, e (2) resistente ao glifosato. Assim, este método de rastreio permite a identificação de clones contendo EPSP sintases resistentes ao glifosato.

Colônias crescendo em 20mM ou 50mM de glifosato foram colhidas e seus plasmídios analisadas por digestão de restrição para identificar plasmídios que partilham padrões de restrição. Plasmídios individuais foram sequenciados por métodos conhecidos na técnica, com a preferência dada a plasmídios que conferem resistência a 50mM de glifosato.

Usando esta abordagem, como por vezes modificada para cada biblioteca como conhecida e apreciada na técnica, bibliotecas de clones contendo genes EPSP sintase foram identificadas para cada uma das sete cepas da Tabela 1.

Exemplo 3. Seqüências de DNA e proteínas EPSP sintases

As seqüências de DNA de EPSP sintases resistentes ao glifosato foram determinadas para cada um dos clones na Tabela 2 por métodos bem conhecidos na técnica.

grg25. A seqüência de DNA de grg25 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 1. O produto da tradução previsto de grg25 (GRG2 5) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 2. 62 , 7 5 grg26. A seqüência de DNA de grg26 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 3. O produto da tradução previsto de grg26 (GRG26) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 4.

grg27. A seqüência de DNA de grg27 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 5. O produto da tradução previsto de grg27 (GRG27) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 6.

gfg28. A seqüência de DNA de grg28 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 7. 0 produto da tradução previsto de grg28 (GRG2 8) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 8.

grg29. A seqüência de DNA de grg29 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 9. 0 produto da tradução previsto de grg29 (GRG29) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 10.

grg30. A seqüência de DNA de grg30 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 11. O produto da tradução previsto de grg30 (GRG30) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 12.

grg31. A seqüência de DNA de grg31 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 13. O produto da tradução previsto de grg31 (GRG31) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 14.

syngrg31. A seqüência de DNA sintético de syngrg31 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 28. O produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg31, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 14. syngrg2 5. A seqüência de DNA sintético de syngrg25 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 29. 0 produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg25, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 2.

syngrg26. A seqüência de DNA sintético de syngrg26 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 30. O produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg26, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 4.

syngrg27. A seqüência de DNA sintético de syngrg27 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 31. O produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg27, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 6.

syngrg28. A seqüência de DNA sintético de syngrg28 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 32. 0 produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg28, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 8.

syngrg29. A seqüência de DNA sintético de syngrg29 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 33. O produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg29, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 10.

syngrg30. A seqüência de DNA sintético de syngrg30 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 34. O produto da tradução previsto de syngrgl é idêntico ao de grg30, e é fornecido aqui como SEQ ID NO: 12.

Clones contendo cada um dos genes EPSP sintase grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, e grg31 foram depositados em NRRL, e atribuiu depósito números como na Tabela 2.

Tabela 2. Clones contendo EPSP sintases resistentes ao glifosato

EPSPS Cepa com EPSPS Isolado original em pBKCMV Número NRRL GRG25 ATX8909 PAX1932 NRRL B-30911 GRG2 6 ATX21307 PAX1933 NRRL B-30912 GRG27 ATX21310 PAX1934 NRRL B-30913 GRG28 ATX21315 PAX1935 NRRL B-30914 N GRG31 ATX21318 PAX1936 NRRL B-30915 GRG30 ATX1394 PAX1937 NRRL B-30916 N GRG29 ATX1367 PAX1938 NRRL B-30917 N

Cada uma das proteínas GRG25 - GRG31 mostrou homologia com enzimas EPSP sintase na base de dados NCBI pela pesquisa BLAST. A enzima EPSPS com a maior identidade de seqüência protéica a cada enzima GRG está listada na tabela a seguir. 65 /' 75 Tabela 3. Homologia de GRG25-GRG31 para as EPSP sintases conhecidas

Proteína Cepa com enzima EPSP sintase homóloga % de identidade GRG25 Nocardia farcinica 50, 5 GRG26 Arthrobacter sp. FB24 82,9 GRG27 Arthrobacter sp. FB24 78 GRG28 Arthrobacter sp. FB24 81,4 GRG29 Symbiobacterium thermophilum 51, 6 GRG30 Symbiobacterium thermophilum 51,3 GRG31 Bacteroides fragilis 43,3

Exemplo 4. Clonagem de novas EPSP sintases resistentes ao glifosato em um vetor de expressão de E. coli

Os genes EPSP sintase contidos nos clones da Tabela 2 foram sub-clonados no vetor de expressão de E. coli pRSFlb (Invitrogen). Clones resultantes foram confirmados pelo sequenciamento de DNA, e utilizados para induzir a expressão de cada EPSP sintase de E. coli. A proteína His-tagged expressa foi, então, purificada tal como é conhecido no estado da técnica.

Exemplo 5. Resistência ao glifosato de EPSP sintases

Os clones pRSFlb foram plaqueados em para placas M63+ contendo antibiótico e OmM ou 50mM de glifosato. 0 crescimento foi avaliado após dois dias de um crescimento a 37 0C. Todas as sete EPSP sintases foram observadas para conferir resistência a 50mM de glifosato em células de E. coli (Tabela 4).

Tabela 4. Painel de glifosato

EPSPS Clone em pRSFlB Crescimento em 50mM de glifosato Vetor _ GRG25 PAX1939 +++ GRG26 PAX1940 +++ GRG27 PAX1941 +++ GRG28 PAX1942 +++ GRG30 PAX1943 +++ GRG29 PAX1944 +++ GRG31 PAX1945 +++ Exemplo 6. A temperatura ótima da atividade enzimática de

GRG31

Um vetor que coloca expressão de GRG31 sob o controle do promotor viral T7 foi construído (pAX3535) e utilizado para transformar uma estirpe de E. coli possuindo o gene viral T7 imediatamente 3' de um promotor de lactose induzível. Após indução de IPTG, a proteína GRG31 foi purificada à homogeneidade por métodos padrões. Para medir a atividade enzimática, a enzima GRG31 purificada foi diluída para uma análise adequada da concentração em tampão contendo HEPES (50 mM, pH 7) e 50 UM de KCl, e, em seguida, incubada durante 15 minutos em cada 10, 20, 30, 40, 50 ou 60°C. Após a incubação, a enzima foi aquecida a 90°C por 1 minuto de desnaturação da enzima e, em seguida, resfriada a 4°C. O fosfato gerado por cada reação foi então adicionado a um segundo ensaio contendo inosina, nucleosídeo fosforilase purina, xantina oxidase, peroxidase rábano silvestre, e o substrato fluorescente AMPLEX (R) Vermelho (Pedido de Patente U.S. No. 60/741.166, depositado em 1 de dezembro de 2005). Após incubação por 15 minutos em temperatura ambiente, o produto fluorescente foi quantificado utilizando um espectrofluorômetro Gemini XPS (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA) . A formação do produto EPSP sintase foi avaliada, e é expressa na Tabela 5, como uma percentagem de atividade máxima.

Tabela 5. Temperatura ótima para GRG31

Temperatura 0C Percentagem de atividade máxima 42% 62% 69% 40 80% 50 100% 60 96% 70 67% 80 36%

Exemplo 7. Estabilidade térmica da atividade enzimática de GRG31

Um vetor que coloca expressão de GRG31 sob o controle do promotor viral T7 foi construído (pAX3535) e utilizado para transformar uma estirpe de E. coli possuindo o gene viral T7 imediatamente 3' de um promotor induzivel de lactose. Após indução de IPTG, a proteína GRG31 foi purificada à homogeneidade por métodos padrões. Para medir a atividade enzimática, a enzima GRG31 purificada foi diluída para uma análise adequada da concentração em tampão contendo HEPES (50 mM, pH7) e 50 niM de KCl, e então incubada a 370C por 0, 2, 6 ou 22 horas. Uma amostra controle foi incubada juntamente a 4°C. Em cada ponto de tempo, uma alíquota de cada amostra foi removida e ensaios enzimáticos foram realizados em um volume final de 50 μΐ contendo 0,5mM de chiquimato-3-fosfato, 200uM de fosfoenolpiruvato-(PEP) , lu/ml de xantina oxidase, 2U/ml de nucleosídeo fosforilase, 2,25mM de inosina, lu/ml de peroxidase horseradish, 2mM de glifosato, 50mM de HEPES/KOH PH 7,0, IOOmM de KCl, e AMPLEX® Vermelho (Invitrogen) , de acordo com as instruções do fabricante. Os ensaios foram iniciados pela adição do chiquimato-3-fosfato. A atividade da EPSP sintase foi medida utilizando um espectrômetro de fluorescência Spectramax Gemini XPS (Molecular Dynamics, excitação: 555nm; emissão: 590 nm). A estabilidade térmica da EPSP sintase foi calculada como o percentual de atividade enzimática em cada ponto de tempo a 3 7 0C em relação à atividade enzimática na amostra controle incubada juntamente a 4°C (Tabela 6). Tabela 6. Estabilidade térmica de GRG31

Tempo, Percentagem de horas controle 0 100% 2 86% 6 68% 22 29% I

Exemplo 8. Engenharia de çrrg25. grg26, arq27, qra28. ara29.

SISHl-Slãàl_e_syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrcj28.

syngrg29, syngrg30. e syngrq31 para Transformação Vegetal

A fase aberta de leitura (ORF) para cada um dos genes grg ê amplificado por PCR a partir de um modelo de cDNA de comprimento total. Sítios de restrição Hind III são adicionados a cada extremidade da ORF durante a PCR. Adicionalmente, a seqüência nucleotídica ACC é adicionada imediatamente na extremidade 5' para o códon de início do gene para aumentar a eficiência traducional (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15: 8125-8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15: 6643-6653). 0 produto da PCR é clonado e sequenciado, usando técnicas bem conhecidas no estado da técnica, a fim de assegurar que nenhuma mutação seja introduzida durante a PCR. 0 plasmídio contendo o produto grg da PCR é digerido, por exemplo, com Hind III e o fragmento contendo o ORF intacto é isolado. Podem-se gerar construtos similares que contêm uma seqüência do cloroplasto alvo ligada ao polinucleotídeo da invenção por métodos conhecidos no estado da técnica.

Um fragmento de DNA contendo a EPSP sintase (e, ainda contendo ou não contendo uma seqüência do cloroplasto alvo) é clonado em um plasmídeo, por exemplo, no sítio Hind Iii de PAX200. ΡΑΧ200 é um vetor de expressão vegetal que contém o promotor actina de arroz (McElroy et al. (1991) Molec. Gen. Genet. 231: 150-160), e o terminador PinIII (An et al. (1989) The Plant Cell 1: Il5 -122). 0 fragmento promotor-gene- terminador (ou o fragmento promotor-líder-gene-terminador) a partir deste plasmídio intermediário é subclonado em um plasmídeo, como pSBll (Japan Tobacco, Inc.) para formar um plasmídeo final, aqui referido como, por exemplo, pSBHGRG25. PSB11GRG25 é organizado tal como um fragmento de DNA contendo, por exemplo, a construção promotor-grg25-terminador (ou a construção promotor-líder-grg25-terminador), e podem ser excisados por enzimas de restrição adequadas e também utilizados para transformação de plantas, por exemplo , por feixe de injeção aerossol. A estrutura do pSBllGRG25 é verificada pela digestão por restrição e eletroforese em gel, bem como pelo sequenciamento entre os diversos cruzamentos da clonagem. Os mesmos métodos podem ser utilizados para gerar um plasmídio final para cada um dos genes grg aqui descritos. 0 plasmídio é mobilizado em Agrobacterium tumefaciens estirpe LBA4404 que também abriga o plasmídeo pSBl (Japan Tobacco, Inc.), utilizando procedimentos triparentais de acasalamento 7 χ / 7 5 bem conhecidos no estado da técnica, e plaqueamento em meio contendo antibiótico. Plasmid pSBl 1GRG25 transporta espectinomicina resistência, mas é uma estreita faixa plásmido acolhimento e não pode replicar em Agrobacterium.

Resistentes aos antibióticos colônias surgem quando PSB11GRG25 integra-se na ampla gama de hospedeiros do plasmídio pSBl através de recombinação homóloga. 0 produto cointegrado resultante é verificado por hibridação de Southern. A estirpe de Agrobacterium abrigando o cointegrado pode ser utilizada para transformar milho, por exemplo, pelo método PureIntro (Japan Tobacco).

Exemplo 9. Transformação de grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, e syngrg31 em células vegetais

Espigas de milho são melhor colhidas 8-12 dias após a polinização. Embriões são isolados das espigas, e os embriões de tamanho 0,8-l,5mm são preferidos para uso em transformação. Embriões são plaqueados com o escutelo para cima sobre um meio de incubação adequado, tais como meio DN62A5S (3,98 g/L de Sais N6; lmL/L de Vitaminas N6 (de IOOOx de Solução estoque) ; 800 mg/L de L-asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol, l,4g/L de L-prolina, lOOmg/L de ácidos Casamino; 50g/L de sacarose; lmL/L (de 1 mg/ml de estoque) 2,4-D). No entanto, meio e sais outros que DN62A5S que são adequados são conhecidos no estado da técnica. Embriões são incubados por toda a noite a 25°C no escuro. No entanto, não

20

25 e necessario, por si so incubar os embri5es durante toda a noite.

Os explantes resultantes s3o transferidos para uma malha quadrada (30-40 por placa), transferidos para meios osm0ticos por cerca de 30-45 minutos e, em seguida, transferidos para uma placa feixeada (ver, por exemplo, Publicagao PCT No. W0/0138514 e Patente U.S. n«. 5.240.842).

Constru?5es de DNA concebidos para expressar proteinas

GRG da presente invengSo em c^lulas vegetais s3o acelerados em tecido vegetal utilizando urn feixe de aerossol acelerador, utilizando essencialmente condig5eS/ como descritas na Publicagao PCT No. WO/0138514. Ap0s ο enfeixamento, os embriaes sao incubados por cerca de 30 minutos sobre meios osm0ticos, e colocados no meio de incubagao por toda a noite, a 25°C no escuro. Para evitar danificar os explantes, estes sao incubados por pelo menos 24 horas antes da transferencia para ο meio de recuperagao. Os embriSes s3o entao espalhados em meio para um periodo de recuperagSo, por cerca de 5 dias, a 25°C, no escuro, e em seguida, transferidos para um meio de selegao. Explantes s3o incubados em meios de selegao para por at^ oito semanas, dependendo da natureza e caracteristicas de cada selegao utilizada. Ap6s ο periodo de selegao, ο calo resultante έ transferido para ο meio de matura?3o de embriao, at^ a formagao de embrides somdticos maduros ser observada. Os embri5es somdticos maduros resultantes sSlo entao colocados sob baixa luminosidade, e ο processo de regeneragSo ά iniciado atraves de metodos conhecidos no estado da tecnica. Os turiSes resultantes s3o possibilitados de eniraizar sobre ο meio de enraizamento, e as plantas resultantes sSo transferidas para potes creches e propagadas como plantas transgenicas.

Materials

Tabela 7. Meio DN62A5S

Componentes Por litro Amostra Mistura de Sal Basal Chu's N6 (Prod. No. C 416) 3,98g/L Phytotechnology Labs Solugao de Vitamina Chu's N6 (Prod. No. C 149) lmL/L (de Estoque IOOOx) Phytotechnology Labs L-asparagina 800mg/L Phyto technology- Labs Mio-inositol lOOmg/L Sigma L-prolina l,4g/L Phytotechnology Labs Acidos Casamino lOOmg/L Fisher Scientific Sucrose 50g/L Phytotechnology Labs 2,4-D (Prod. No. D- 7299) lmL/L (de Img/mL de Estoque) Sigma O pH da solugao e ajustado para pH5,8 com IN de K0H/1N de KCl, Gelrite (Sigma) e adicionado a uma concentragao de ate 3g/L, e ο meio έ autoclavado. Apos arrefecimento a 50°C, 2ml/L de um 5mg/ml de solu?ao estoque de nitrate de prata (Phytotechnology Labs) έ adicionado.

Exempl0 10. Transformacao de 卿25, ara26, Qrcr27. ara2R. grg29' grg3°' <^rg31, svnarg25, synara26, syngrcr27, synQrg28. syngrg29,__ou syncfrcr31 em celulas veqetais de Milho Por Transformacao Mediada por Aarobacterium

Espigas sao melhor colhidas 8-12 dias ap0s a polinizagao. EmbriSSes s3o isolados das espigas, e os embri5es de tamanho 0,8-1,5mm s3o preferidos para uso em transformagao. Embriaes sSo plaqueados com escutelo para cima -5 sobre um meio de incubagSo adeguado, e incubados por toda a noite a 25。C no escuro. No entanto, η3ο ό necessario, por si 80 incubar os embriSes durante toda a noite. EmbriSes s3o contatados com uma estirpe de Agrobacterium contendo os vetores apropriados de transferencia mediada por plasmidio Ti O por cerca de 5-10 minutos, e entao plaqueados em meio de co-

Cultivo durante cerca de 3 dias (25。C no escuro)· Depois do co-cultivo, os explantes sao transferidos para um meio para um periodo de recuperagSo por cerca de cinco dias (a 25。C no escuro). Explantes sao incubados em meios de selegSo por at0 oito semanas' dependendo da natureza e caracteristicas de cada selegao utilizada. Ap0s ο period。 de selegSo, ο calo resultante e transferido para ο meio de maturagao de eitibriao, at^ a forma^ao de embriSes somdticos maduros ser observada. Os embri5es somaticos maduros resultantes sao entSo colocados sob baixa luminosidade, e ο processo de regenera?ao έ iniciado como conhecido no estado da t^cnica. Os turi5es resultantes s3o possibilitados de enraizar em um meio de enraizamento, e as plantas resultantes s3o transferidas para potes creches e propagadas como plantas transgenicas.

Todas as publicagaes e pedidos de patentee mencionados na especificagao s3o indicativos do nivel de habilidade das

pessoas versadas na t^cnica k Qtual pertence esta invengao. Todas as publica?Ses e pedidos de patentes s3o aqui incorporados por referenda k mesma medida, como se cada publicagao ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referencia.

Apesar de a invencao exposta ter sido descrita em algum detalhe a titulo de ilustra?ao e de exemplo para fins de clareza de entendimento, serd evidente que algumas modifica?Ses e alterag5es possam ser praticadas no ambito das reivindicagSes anexas. gcg Ala

ctg Leu

gcc Ala

get Ala

ttc Phe 95

C y g 1 g G

288

ate

lie

age Ser

cgc

Arg

gac Asp

acc Thr 85

gaa

Glu

ctg Leu

atg

Met

ctc Leu

Listagem de Sequencias

<110> Depositante: Athenix Corporation Brian Vande Berg Cheryl Peters Brian Carr Daniel John Tomso

<120> Titulo da invengao： Molecula de acido nucleico e polipeptideo isolados, vetor, celula hospedeira, planta transgenica, semente, metodos para produzir um polipeptideo com atividade de resistencia a herbicida, para conferir resistencia a um herbicida em uma planta, para gerar uma variante de polinucleotideo, para aumentar ο vigor ou ο rendimento em uma planta, e para conferir resistencia a glifosato em uma planta

<130> Referencia do documento: 45600/329201

<150> Niimero do documento de prioridade: 60/812, 3 60

<151> Data de deposito do documento de prioridade: 09-06-2006

<160> Quantidade de SEQ ID NOs: 38

<170> Software: FastSEQ for Windows Version

4.0

<210> SEQ ID NO: 1 <211> Comprimento: 1404

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Arthrobacter arilaiti

<220> Caracteristicas: <221> Nome/Chave: CDS <222> Localizagao: (1)

(1404)

<400> Seqiiencia: atg ctg ctg cgc

Met 1

Leu Leu Arg

1 acc Thr 5

g1 t a g V

aaa

Lys

aca Thr

tgc Cys

ctc Leu 10

gag Glu

ccg

Pro

aag

Lys

gat

Asp

cta Leu 15

cca Pro

48

ate lie

tgt Cys

act Thr

gca

Ala 20

age

Ser

gcc

Ala

cct Pro

gga Gly

age

Ser 25

cca Pro

acc Thr

gat

Asp

aag

Lys

ctg Leu 30

cac His

aac Asn

96

gca

Ala

gaa

Glu

aag

Lys 35

acc Thr

tgg Trp

gcc

Ala

gcg Ala 40

cct Pro

cat

His

gcc Ala

acc Thr 45

ggc Gly

ctg Leu

gac Asp

144

gcc

Ala

ate

工Ie 50

gtc Val

tcg

Ser

g 1 t a g V

ccc Pro

get Ala 55

tcg Ser

aag Lys

tcc Ser

ttg Leu

acc Thr 60

aac Asn

egg Arg

tat Tyr

ctg Leu

192

ate

lie 65

ctg Leu

gcg Ala

gcc Ala

ctg Leu

gcc

Ala 70

tcc

Ser

tcg

Ser

cca Pro

tcc Ser

acc Thr

75

ate lie

cac His

aac Asn

acg

Thr

ctc Leu 80

240 C y g1 g G

C e t 1 a I

ate

lie

a U O a 1 O gG 1

cgc Arg

acc Thr

acg

Thr

cag

Gln

cca Pro 105

gat Asp

C y g1 g G

tcc Ser

acc

Thr

acc Thr 110

g1 t a g V

gcc Ala

336

ate acc 工Ie Thr

ccg Pro 115

ggc Gly

aag

Lys

ctg Leu

gcc Ala

acc Thr 120

ggc Gly

ccg Pro

ctg Leu

tcc Ser

ate lie 125

gac Asp

tgc Cys

C y g1 g G

384

ctg gcc Leu Ala 130

ggc Gly

acc

Thr

gtc

Val

atg Met

cgc Arg 135

ttc Phe

gtt Val

ccg Pro

ctg

Leu 140

gcc Ala

gtt Val

gcc Ala

432

ggt gcc Gly Ala 145

age

Ser

gtg Val

gca

Ala

ttc Phe 150

gat Asp

ggc Gly

t P a S gA

gaa

Glu

a a 5 C 1 5 gAl

gcc

Ala

cgc

Arg

gtg Val

cgc Arg

ccg

Pro 160

480

atg gcc Met Ala

ccg

Pro

gtg Val

ctc

Leu 165

gac

Asp

gcc Ala

ttg Leu

gaa

Glu

acc

Thr 170

ctg Leu

ggt Gly

gcc

Ala

egg Arg

ate

lie 175

gaa

Glu

528

tat gcc

Tyr Ala

ggc Gly

act

Thr 180

CCC

Pro

ggc Gly

atg Met

ctg Leu

ccc

Pro 185

ttc Phe

acc

Thr

atg

Met

gac

Asp

Cao C 1 9 g A 1

age

Ser

gca

Ala

576

ttg cag

Leu Gln

g U 5 a 1 9 g G 1

cgc

Arg

cac

His

gag Glu

g1 t a g V

ctc

Leu 200

ate

lie

gac

Asp

gcc

Ala

tcg

Ser

ggc Gly 205

age

Ser

tcc Ser

cag

Gln

624

ttc ate Phe lie 210

tcc

Ser

gca Ala

ctg Leu

ctg

Leu 215

gtc Val

ggc Gly

caa

Gln

gca Ala

ctg Leu 220

CCC

Pro

ggt Gly

g y

^ 1 g G

ctg Leu

672

aag ctg

Lys Leu 225

egg Arg

gcc

Ala

gcc Ala

gcg Ala 230

ggg

Gly

cat His

ate lie

gcc

Ala

tcc Ser 235

cct Pro

gac

Asp

cac

His

att lie

Cao C 1 4 g A 2

720

atg acc Met Thr

g1 t a g V

caa

Gln

acc

Thr 245

ctg Leu

cgc Arg

gaa

Glu

ctg Leu

ggc Gly 250

gtc

Val

gag Glu

gta Val

gcc Ala

g 1 5 t a 5

g仏 2

C y g1 g G

768

gag gat Glu Asp

gca Ala

cgc Arg 260

age

Ser

tgg Trp

tcc Ser

ate

lie

aam

C 1 6

^ A 2

ccg Pro

ggt Gly

cag Gln

ctt Leu

tcc Ser 270

gy

g'1 gG

ttc Phe

816

act ate

Thr lie

acc Thr 275

g 1

t a g V

gaa

Glu

ccg Pro

gac Asp

ctg Leu 280

tcc Ser

aac Asn

gcc

Ala

t y g1 g G

CCC

Pro 285

ttc Phe

ctg Leu

gcg Ala

864

gcc gcc Ala Ala 290

ttg Leu

gcc

Ala

acc Thr

aac Asn

ggc Gly 295

acc Thr

g 1 t a

gV

cgc Arg

gtg Val

ccc Pro 300

ttc Phe

tgg Trp

cct Pro

gca

Ala

912

tcc acc Ser Thr 305

acc

Thr

cag

Gln

g 1

t a gV

ggc Gly 310

ggc Gly

Lys

tgg Trp

g1 t a gV

cag

Gln 315

ate

lie

cta Leu

age Ser

egg Arg

atg

Met 320

960

ggc gca Gly Ala

gaa Glu

ate lie

age

Ser 325

cac His

ggc Gly

gag Glu

gac Asp

gga Gly 330

gtg Val

ctc Leu

acc Thr

gta Val

C g 5 g'r 3 C A 3

ggc Gly

1008

acc gga gtg ate cgc ggc ate gac tac gcc gat gcc tcc gaa ttg get

1056 cag Gln

taa

1404

<210> SEQ ID NO: 2

<211> Comprimento： 467 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Arthrobacter arilaiti <400> Seqiiencia ： 2

Met Leu Leu Arg Thr Val Lys Thr Cys Leu Glu Pro Lys Asp Leu Pro

1 5 10 15

lie Cys Thr Ala Ser Ala Pro Gly Ser Pro Thr Asp Lys Leu His Asn

25 30

Ala Glu Lys Thr Trp Trp Ala Ala Pro His Ala Ala Thr Gly Leu Asp

40 45

Ala lie Val Ser Val Pro Ala Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Tyr Leu

50 55 60

工Ie Leu Ala Ala Leu Ala Ser Ser Pro Ser Thr lie His Asn Thr Leu 65 70 75 80

lie Ser Arg Asp Thr Glu Leu Met Leu Asp Ala Leu Ala Ala Phe Gly

85 90 95

lie Gly lie Glu Arg Thr Thr Gln Pro Asp Gly Ser Thr Thr Val Ala

100 105 110

lie Thr Pro Gly Lys Leu Ala Thr Gly Pro Leu Ser 工Ie Asp Cys Gly

115 120 125

Leu Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Val Pro Pro Leu Ala Ala Val Ala

130 135 140

Gly Ala Ser Val Ala Phe Asp Gly Asp Glu Ala Ala Arg Val Arg Pro

Thr Gly Val lie Arg Gly lie Asp Tyr Ala Asp Ala Ser Glu Leu Ala 340 345 350

ccc Pro

acc Thr

ctg Leu 355

gcc

Ala

gcg Ala

ctg Leu

tgc Cys

acc Thr 360

ctg Leu

gcg Ala

gac Asp

tcc Ser

ccc Pro 365

age

Ser

aag Lys

ctg Leu

1104

acc Thr

Cyo gl 7 g'G 3

ate

工Ie

ggg

Gly

cac

His

ctg Leu

cgc Arg 375

ggg

Gly

cac

His

gaa

Glu

acg

Thr

Cpo a S 8 ^ A 3

egg Arg

ctg Leu

gcg Ala

gca Ala

1152

ctg Leu 385

gaa Glu

acc Thr

gag Glu

ctt Leu

Cao C 1 9 g A 3

aag

Lys

gtc Val

ggt Gly

gcc Ala

acg Thr 395

g 1 t a

gV

acc Thr

tcc Ser

acc Thr

Cpo a S O gA 4

1200

gac

Asp

gcg Ala

ttg Leu

gaa

Glu

ate

工Ie 405

att lie

CCC

Pro

gga Gly

acc Thr

ctg Leu 410

cag

Gln

gca

Ala

gcc

Ala

gat Asp

ctg Leu 415

gac Asp

1248

tcc Ser

tac Tyr

gag Glu

t P O a S 2 gA 4

cac

His

egg Arg

atg Met

gcc Ala

acc

Thr 425

gca

Ala

ggc Gly

gca

Ala

ctg Leu

ctg

Leu 430

ggc Gly

ctg Leu

1296

gcc Ala

ate

lie

gaa

Glu 435

ggg Gly

gtg Val

cgc

Arg

gtg Val

a U O a 1 4 g G 4

aat Asn

ate lie

gcc Ala

acc

Thr

acc Thr 445

gcc

Ala

aag

Lys

acc

Thr

1344

atg Met

ccc Pro 450

gac Asp

ttc Phe

ccg Pro

caa

Gln

ctc Leu 455

tgg Trp

acc Thr

gac

Asp

atg Met

Cao

C 1 6

gA 4

gcc

Ala

acc

Thr

gca

Ala

aag

Lys

1392

G

C y 5 g 1 6 gG 4 get tcc gcg ctt ccc ctg tgg ccc gca ccc ttc gcc age cac cct Ala Ser Ala Leu Pro Leu Trp Pro Ala Pro Phe Ala Ser His Pro 25 30

145 Met

Tyr

Leu

Phe

Lys 225 Met

Glu

Thr

Ala

Ser 305 Gly

Thr

Pro

Thr

Leu 385 Asp

Ser

Ala

Met

Gly 465

Ala

Gln

lie 210 Leu

Thr

Asp

lie

Ala 290 Thr

Ala

Gly

Thr

Gly 370 Glu

Ala

Tyr

lie

Pro 450 Gln

Pro Val Leu 165

Gly Thr Pro 180 Glu Arg His 195

Ser Ala Leu

Arg Ala Ala

Val Gln Thr 245

Ala Arg Ser 260 Thr Val Glu 275

Leu Ala Thr

Thr Gln Val

Glu lie Ser 325

Val lie Arg

340 Leu Ala Ala 355

lie Gly His

Thr Glu Leu

Leu Glu 工Ie 405

Glu Asp His

420 Glu Gly Val 435

Asp Phe Pro Gly

150 Asp

Gly

Glu

Leu

Ala 230 Leu

Trp

Pro

Asn

Gly 310 His

Gly

Leu

Ala 390 lie

Arg

Gln

Ala

Met

Val

Leu 215 Gly

Arg

Ser

Asp

Gly 295 Gly

Gly

lie

Cys

Arg 375 Lys

Pro

Met

Val

Leu 455

Leu Glu Leu

Leu

200 Val

His

Glu

lie

Leu 280 Thr

Lys

Glu

Asp

Thr 360 Gly

Val

Gly

Ala

Glu 440 Trp

Pro

185 lie

Gly

lie

Leu

Ala 265 Ser

Val

Trp

Asp

Tyr 345 Leu

His

Gly

Thr

Thr 425 Asn

Thr 170 Phe

Asp

Gln

Ala

Gly 250 Pro

Asn

Arg

Val

Gly 330 Ala

Ala

Glu

Ala

Leu 410 Ala

lie Thr Asp

155 Leu

Thr

Ala

Ser 235 Val

Gly

Ala

Val

Gln 315 Val

Asp

Thr

Thr 395 Gln

Gly

Ala

Met

Gly

Met

Ser

Leu 220 Pro

Glu

Gln

Gly

Pro 300 lie

Leu

Ala

Ser

Asp 380 Val

Ala

Thr

Ala 460

Ala Arg Asp

Gly 205 Pro

Asp

Val

Leu

Pro 285 Phe

Leu

Thr

Ser

Pro 365 Arg

Thr

Ala

Leu

Thr 445 Ala

Ala 190 Ser

Gly

His

Ala

Ser 270 Phe

Trp

Ser

Val

Glu 350 Ser

Leu

Ser

Asp

Leu 430 Ala

lie 175 Ser

Ser

Gly

lie

Val 255 Gly

Leu

Pro

Arg

Arg 335 Leu

Lys

Ala

Thr

Leu 415 Gly

Lys Thr Ala

160 Glu

Ala

Gln

Leu

Ala 240 Gly

Phe

Ala

Met 320 Gly

Ala

Leu

Ala

Asp 400 Asp

Leu

Thr

Lys

<210> SEQ ID NO: 3

<211> Comprimento: 1395

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Arthrobacter ramosus

<220> Caracteristicas: <2 21> Nome/Chave： CDS <222> Localizagao： (1)

(1395)

<400> Seqiiencia: 3 atg cca gga acc ccc gcc Met Pro Gly Thr Pro Ala 1 5

acg cag Thr Gln

aca

Thr

gac Asp 10

gat Asp

tea Ser

ggg Gly

acg Thr

age

Ser 15

aca Thr

48

96

g 1 t a g V t P a S gA

gcc Ala

acg Thr 35

gtc

Val

acg

Thr

gtt Val

cct Pro

ggt Gly 40

tcg Ser

aag

Lys

tcg Ser

ctg Leu

acc Thr 45

aac Asn

cgc Arg

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ctg Leu

gtc

Val 50

ctg Leu

gcg Ala

gca

Ala

ttg Leu

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aac Asn

ggc Gly

ccc Pro

age

Ser

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ttg Leu

cgt Arg

gca

Ala

CCC

Pro

192

ttg Leu 65

cat His

tcg Ser

cgc Arg

gat

Asp

tcg Ser 70

gcg Ala

ctg Leu

atg Met

gtc Val

gag Glu 75

gcc Ala

ctg Leu

cgc

Arg

egg Arg

ctt Leu 80

240

ggc Gly

gcc Ala

acc Thr

att lie

aca Thr 85

gag Glu

gtt Val

CCC

Pro

ggc Gly

gat Asp 90

a y g 1 g G

cag

Gln

tac Tyr

gga Gly

ccg

Pro 95

gac Asp

288

ctt Leu

gaa

Glu

gtc

Val

acc

Thr 100

ccg

Pro

ate

lie

gac

Asp

cct

Pro

ga 5 Clo g'A 1

gcg Ala

gca

Ala

tcg

Ser

g U O

all gG 1

acc

Thr

gcc

Ala

336

ate lie

gac Asp

tgc Cys 115

ggc Gly

ctg Leu

gcc Ala

ggc Gly

acg Thr 120

gtc Val

atg

Met

cgc Arg

ttc Phe

g 1 5 t a 2

g V 1

ccg

Pro

ccg Pro

ctt Leu

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a a O C 1 3 A 1

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cgc

Arg

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C y g1 gG

get

Ala 135

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g 1 t a g V

ttt Phe

gac

Asp

ggc Gly 140

gat Asp

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Pro

cac

His

gca

Ala

432

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cag

Gln

cgt

Arg

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ggc Gly 150

acc

Thr

ate

lie

ate

lie

gaa Glu

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ctc Leu

egg Arg

acc

Thr

ctc Leu

gga Gly 160

480

g1 t a g V

gac

Asp

gtc

Val

age

Ser

C a 5

C 1 6 g A 1

atg Met

gac

Asp

ggg Gly

aag

Lys

g a O C 1 7 g'A 1

ccg Pro

C y g 1 g G

tcc Ser

ttg Leu

ccg

Pro 175

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528

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gtc

Val

tcc Ser

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C y g 1 gG

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g 1 t a

gV

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C y g 1 gG

cac His

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g 1 O t a 9 g V 1

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Ser

t a 5 C 1 9 g A 1

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tcg Ser

cag

Gln

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gcc

Ala

ctg Leu

ctc Leu 205

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ggt Gly

gcc Ala

624

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gaa

Glu

gag

Glu

ggc Gly

ctg Leu

cac

His 215

CtC

Leu

gag Glu

cat

His

gtc Val

ggc Gly 220

aag

Lys

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g1 t a

gV

ccg

Pro

672

age Ser 225

ctc Leu

gac Asp

cac His

ate lie

aac

Asn 230

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act

Thr

g 1 t a gV

gcg Ala

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ctg Leu

cgc Arg

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Gly

gtt Val

a y O gl 4 gG 2

720

gtc

Val

cag

Gln

gta Val

gat Asp

C P 5 a S 4 A 2

tcc Ser

g 1 t a gV

ccg Pro

aac Asn

cat

His 250

tgg Trp

cga

Arg

gtc

Val

tcc Ser

ccc Pro 255

ggc Gly

768

gcc Ala

ate lie

cag

Gln

g a O

C 1 6

A 2

ttc Phe

gac Asp

gag Glu

cga

Arg

ate lie 265

gaa

Glu

cag Gln

gac Asp

ctc Leu

tcc Ser 270

aac Asn

gcg Ala

816 tcc Ser

gag Glu

ate lie

ctg Leu

ggc Gly 330

gcg Ala

gac Asp

ttc Phe

gac

Asp

gaa

Glu 335

acg Thr

1008

aca gtc acc ggc

Thr Val Thr Gly

cat His

age

Ser 405

tac

Tyr

gcc Ala

gac Asp

cac His

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atg Met

get Ala

acg

Thr

gcg Ala

C y 5 gl 1 g G 4

gcc Ala

1248

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ctt Leu

ggg Gly

CtC

Leu 420

gcc

Ala

gtc Val

gag Glu

ggt Gly

gtc Val 425

egg Arg

gtc

Val

gaa

Glu

gac Asp

Ceo t 1 3 a I 4

gcg Ala

acg

Thr

1296

acg Thr

tcc Ser

aag Lys 435

acc Thr

atg Met

CCC

Pro

gaa

Glu

ttc Phe 440

ccg Pro

cag Gln

ate lie

tgg Trp

acg Thr 445

tcg Ser

atg

Met

ctc Leu

1344

agt Ser

gca Ala 450

ggg Gly

cca Pro

gcg Ala

gcc Ala

gaLn

C 1 5 gA 4

gcc Ala

ggt Gly

tea

Ser

acg Thr 460

gag Glu

aca

Thr

age

Ser

aac Asn

1392

tga

1395

<210> <211> <212> <213

SEQ 工D N〇：4 Comprimento: 464 Tipo: PRT > Organismo： Arthrobacter ramosus

<400> Seqilencia: 4

Met Pro Gly Thr Pro Ala Thr Gln Thr Asp Asp Ser Gly Thr Ser 10 15

Thr

age

Ser

gaa

Glu

ctc Leu

Cao C 1 4 g'A 3

ccc

Pro

acg

Thr

gta

Val

gcg Ala

a a 5 C 1 4 bi A 3

ttg Leu

tgc

Cys

gcc

Ala

ttg Leu

a a O C 1 5 9 A 3

acc

Thr

age Ser

1056

cct

Pro

tcc Ser

egg Arg 355

ctc Leu

acc Thr

C y g1 gG

ate

lie

gcg Ala 360

cac His

ctg Leu

cgc Arg

gga Gly

cac His 365

gag Glu

acg Thr

gac Asp

1104

agg Arg

ctg

Leu 370

gcc Ala

gcg Ala

ctc Leu

gtc

Val

C a 5 C 1 7 gA 3

gaa

Glu

ate

工Ie

aac Asn

egg Arg

ctt Leu 380

ggc Gly

C y g 1 gG

gac

Asp

gcc

Ala

1152

gu 5 a 1 8 g«G 3

gaa

Glu

acc

Thr

age

Ser

gac Asp

ggc Gly 390

ctg Leu

gta Val

ate

工Ie

egg Arg

ccc Pro 395

gca

Ala

gcg Ala

ctg Leu

cac

His

tcc Ser 400

1200

ggt ccc ttc ctc gcc gcg gcg ctc gcc acg aag gga acc gtg egg ate 864

Gly Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Lys Gly Thr Val Arg 工Ie 275 280 285

ccc aac tgg cct gcc age acc acg caa gtc gga gat ctc tgg egg aac 912 Pro Asn Trp Pro Ala Ser Thr Thr Gln Val Gly Asp Leu Trp Arg Asn 290 295 300

att ctt gcc acc atg ggc get acc gtc acg ctg gac aac ggg acc ctg 960 lie Leu Ala Thr Met Gly Ala Thr Val Thr Leu Asp Asn Gly Thr Leu 305 310 315 320

t y 5 gl 2 O- G 3

g1 t a gV

gtc Val

g G Ala

Asp

Leu

65

Gly

Leu

lie

Ala

Arg 145 Val

Lys

Ala

Arg

Ser 225 Val

Ala

Gly

Pro

lie 305 Thr

Ser

Pro

Arg

Glu 385 Gly

工Ie

Thr

Ser

Ser Ala Ala

Val

50

His

Ala

Glu

Asp

Ala 130 Gln

Asp

Val

Ser

Phe 210 Leu

Gln

lie

Pro

Asn 290 Leu

Val

Glu

Ser

Leu 370 Glu

Val

Leu

Ser

Ala 450

Thr

35

Leu

Ser

Thr

Val

Cys 115 Leu

Arg

Val

Ser

Ala 195 Glu

Asp

Val

Gln

Phe 275 Trp

Ala

Thr

Leu

Arg 355 Ala

Thr

Val

Gly

Lys 435 Gly

Leu

20 Val

Ala

Arg

工Ie

Thr 100 Gly

Arg

Pro

Ser

Gly 180 Ser

Glu

His

Asp

Ala 260 Leu

Pro

Thr

Gly

Ala 340 Leu

Ala

Ser

His

Leu 420 Thr

Pro

Thr

Ala

Asp

Thr

85

Pro

Leu

Asn

Met

Ala 165 Thr

Ser

Gly

lie

Asp 245 Phe

Ala

Met

Gly 325 Pro

Thr

Leu

Asp

Ser 405 Ala

Met Pro Ala

Leu

Val

Leu

Ser

70

Glu

lie

Ala

Gly

Gly 150 Met

Gly

Gln

Leu

Asn 230 Ser

Asp

Ala

Ser

Gly 310 Ser

Thr

Gly

Val

Gly 390 Tyr

Val

Pro

Ala

Trp Pro Pro

Ala

55

Ala

Val

Asp

Gly

Ala 135 Thr

Asp

Ser

Phe

His 215 Met

Val

Glu

Ala

Thr 295 Ala

Glu

Val

lie

Ala 375 Leu

Ala

Glu

Ala 455

Gly

40

Asn

Leu

Pro

Thr 120 Ser

lie

Gly

Val

Val 200 Leu

Thr

Pro

Arg

Leu 280 Thr

Thr

lie

Ala

Ala 360 Glu

Val

Asp

Gly

Phe 440 Ala

Ala

25

Ser

Gly

Met

Gly

Ala 105 Val

Val

lie

Lys

Arg 185 Ser

Glu

Val

Asn

lie 265 Ala

Gln

Val

Leu

Ala 345 His

工Ie

His

Val 425 Pro

Pro

Lys

Pro

Val

Asp

90

Ala

Met

Phe

Glu

Ala 170 Gly

Ala

His

Ala

His 250 Glu

Thr

Val

Thr

Gly 330 Leu

Leu

Asn

Arg

Arg 410 Arg

Gln Ala Gly

Phe

Ser

Glu

75

Gly

Ala

Arg

Asp

Ala 155 Pro

Gly

Leu

Val

Val 235 Trp

Gln

Lys

Gly

Leu 315 Ala

Cys

Arg

Pro 395 Met

Val

lie

Ser

Ala

Leu

Arg 60 Ala

Gln

Ala

Phe

Gly 140 Leu

Gly

His

Leu

Gly 220 Leu

Arg

Asp

Gly

Asp 300 Asp

Asp

Ala

Gly

Leu 380 Ala

Ala

Glu

Trp

Thr 460

Ser His Pro Val 30

Asn Arg Tyr

Thr

45

Leu

Tyr

Ser

Val 125 Asp

Arg

Ser

Leu

Leu 205 Lys

Arg

Val

Leu

Thr 285 Leu

Asn

Phe

Leu

His 365 Gly

Ala

Thr

Asp

Thr 445 Glu

Arg Ala Pro

Arg Arg Leu 80

Gly Pro Asp 95

Glu Thr Ala 110

Pro Pro Leu

Pro His Ala

Thr Leu Gly 160

Leu Pro Phe 175

Val lie Asp 190

Val Gly Ala

Pro Val Pro

Gly Val Gly 240

Ser Pro Gly

255 Ser Asn Ala 270

Val Arg lie

Trp Arg Asn

Gly Thr Leu 320

Asp Glu Thr 335

Ala Thr Ser 350

Glu Thr Asp

Gly Asp Ala

Leu His Ser 400

Ala Gly Ala

415 lie Ala Thr 430

Ser Met Leu Thr Ser Asn

<210> SEQ ID NO: 5 <211> Comprimento: 1368 <212> Tipo: DNA gcc act 96 Ala Thr

ccg gcc cct tac gcc aat ggg cca

Pro Ala Pro Tyr Ala Asn Gly Pro 25

ctc ccg cta Leu Pro Leu

g 1 t a g V

aca Thr

gtc Val 35

CCC

Pro

t y g1 gG

tea

Ser

aaa

Lys

tcg

Ser 40

ctg Leu

acc Thr

aac Asn

egg Arg

C e 5 t h 4 t P

ctg Leu

g1 t a gV

ctg Leu

144

gca

Ala

gcc Ala 50

ttg Leu

gcg Ala

gac

Asp

t y g1 g G

ccc Pro 55

tcg Ser

egg Arg

ctc Leu

egg Arg

gcc Ala 60

cca Pro

ctg Leu

cat His

tea Ser

192

cgc

Arg 65

gat Asp

tct Ser

gcc Ala

ctg Leu

atg

Met 70

ate

lie

caa

Gln

gcc Ala

ctt Leu

gg5 g r 7

C A

cag

Gln

ttg Leu

ggt Gly

gcc

Ala

acc

Thr 80

240

gtc Val

acc

Thr

gag Glu

gta

Val

CCC

Pro 85

ggt Gly

gac Asp

ggt Gly

gac Asp

tat Tyr 90

ggg Gly

ccc

Pro

gac

Asp

ctg Leu

gag Glu 95

ate 工Ie

288

acg Thr

CCC

Pro

ctg Leu

gac Asp 100

CCC

Pro

tcc Ser

gcc

Ala

gcg Ala

C y 5 g 1 O g G 1

tea

Ser

age

Ser

acc Thr

gcc Ala

ate lie 110

gac Asp

tgc Cys

336

ggc Gly

ctg Leu

gcg Ala 115

ggt Gly

acg Thr

gtc Val

atg Met

O-O-O

g r 2 a A 1

ttc Phe

gtt Val

ccc

Pro

ccg

Pro

ctt Leu 125

get Ala

gcc

Ala

ctg Leu

384

cgc

Arg

age

Ser 130

ggc Gly

gca

Ala

acc

Thr

gtc Val

ttc Phe 135

gac

Asp

C y g 1 g G

gat Asp

ccc Pro

cat His 140

gcc

Ala

cgc Arg

aac Asn

cgt Arg

432

CCC

Pro 145

atg

Met

gga Gly

acc Thr

ate lie

ate lie 150

gag Glu

gca Ala

ctt Leu

C a 5 C 1 5 g A 1

ttg Leu

gga Gly

gtc Val

cct Pro

t 1 O t a 6

gv 1

480

gca

Ala

gcc Ala

gaa

Glu

ggc Gly

ggc Gly 165

agg Arg

acg Thr

ccg Pro

tcg Ser

Cao C 1 7 gA 1

Ctt

Leu

ccc Pro

ttc Phe

acg

Thr

9 15 t a 7 gv 1

gaa Glu

528

ggc Gly

acc

Thr

ggc Gly

gag Glu 180

g1 t a

gV

cgc

Arg

ggc Gly

cac His 185

ttg Leu

gtc Val

ate lie

gac

Asp

Cao C 1 9 g'A 1

age

Ser

get Ala

576

<213> Organismo: bacteria Gram positiva

<220> Caracteristicas:

<221> Nome/Chave: misc_feature

<222> Localizagao： (0)...(O)

<223> Outras informagoes： bacteria Gram+

cepa desconhecida

<221> Nome/Chave: CDS <222> Localizagao： (1)

(1368)

<400> Seqliencia： atg aca ggt acc

Met 1

Thr Gly Thr

5

acc Thr 5

gcc Ala

aat Asn

acc Thr

gaa Glu 10

ccg Pro

gac Asp

aaa Lys

gcc Ala

gcc

Ala 15

age

Ser

48

Cpo a S 3 g A

g1 t a g V gcc Ala

ctg Leu 370

gtt Val

gcc

Ala

gag Glu

ate

lie

aac

Asn 375

agg Arg

ctt Leu

t y g 1 gG

ggt Gly

gat Asp 380

gcg Ala

gaa

Glu

gag Glu

acc Thr

1152

gca

Ala 385

gat Asp

gga Gly

ctg Leu

ctt Leu

att lie 390

cgc

Arg

ccc Pro

gcc Ala

acc Thr

ctc Leu 395

cac

His

ggc Gly

g1 t a

g V

ate

lie 400

1200

cac His

agt Ser

tac

Tyr

gca Ala

C P 5 a S O gA 4

cac His

egg Arg

atg Met

gcc

Ala

act Thr 410

gcc

Ala

ggc Gly

gcc Ala

ate

lie

ctg Leu 415

gy

^ 1 g G

1248

ctc Leu

gcc Ala

gtt Val

Cpo a S 2 g A 4

C y g 1 gG

gtc Val

cag

Gln

gtt Val

a U 5 a 1 2 g G 4

gac Asp

ate lie

gcc Ala

acg Thr

aca Thr 430

tcc Ser

aag

Lys

1296

cgc ctc gcc 1104 Arg Leu Ala

gga cac gag acg

Gly His Glu Thr

ctg act ggc ate gcc cac ctt Leu Thr Gly 工Ie Ala His Leu 355

ctc tcc Leu Ser

aat Asn

gcc Ala

gga Gly 270

CCC

Pro

ttc 816 Phe

get Ala

ttt Phe

gac Asp

cag Gln 260

egg Arg

ate

lie

gag Glu

cag

Gln

ctg Leu

gcc Ala

C a 5 C 1 7 g'A 2

gcc Ala

ctg Leu

gcc

Ala

act

Thr

cat

His 280

ggc Gly

act Thr

gtc

Val

cgc Arg

att lie 285

CCC

Pro

aac Asn

tgg Trp

864

CCC

Pro

att lie 290

ggc Gly

acc Thr

acg Thr

cag

Gln

gl 5 t a 9 gv 2

ggc Gly

gat Asp

ctc Leu

tgg Trp

egg Arg 300

acc Thr

ate

lie

ctc Leu

get Ala

912

C a 5 Clo g'A 3

atg Met

ggc Gly

gcg Ala

acc Thr

Clo t a 1 gv 3

acc Thr

ctc Leu

gac Asp

gy

g 1 gG

gga Gly 315

acg

Thr

ctg Leu

aca Thr

g 1 t a g V

acc Thr 320

960

ggc Gly

ggg

Gly

aat Asn

gag

Glu

ate

lie 325

aag

Lys

ggt Gly

gcc

Ala

gat Asp

ttc Phe 330

gac

Asp

gaa

Glu

acc

Thr

age

Ser

a U 5 ^13 gG 3

CtC Leu

1008

gcg Ala

ccg Pro

acg

Thr

a 1 O t a 4 gv 3

get

Ala

gcc Ala

ctt Leu

tgc

Cys

C a 5 C 1 4 0- A 3

ctg Leu

gcc Ala

acc Thr

ggt Gly

cca Pro 350

tcg Ser

cga Arg

1056

9/44

tcc tcc cag ttt gtt tcg gca ttg ctg ttg gtg ggc gcc cgc ttc acc 624 Ser Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Arg Phe Thr 195 200 205

gaa ggc ctg cac ttg gag cac gtg ggc aaa ccc gtt ccc age ctg gat 672 Glu Gly Leu His Leu Glu His Val Gly Lys Pro Val Pro Ser Leu Asp 210 215 220

cac ate acc atg acc gtt gag gtg ctt egg age gtg ggt gtc acc gtg 720 His lie Thr Met Thr Val Glu Val Leu Arg Ser Val Gly Val Thr Val 225 230 235 240

gat gac tcc gta ccc aac cac tgg cgc gta tcg cct ggc aag ate acc 768 Asp Asp Ser Val Pro Asn His Trp Arg Val Ser Pro Gly Lys 工Ie Thr 245 250 255

gat Asp 365

t P 5 a S 6 gA 2 aac

Asn 455

tga

1368

aac gag gcc Asn Glu Ala

<210> SEQ ID NO: 6

<211> Comprimento: 455

<212> Tipo: PRT

<213> Organismo： bacteria Gram positiva

<400> Seqiiencia ： Met Thr Gly Thr 1

Leu

Val

Ala

Arg

65

Val

Thr

Gly

Arg

Pro 145 Ala

Gly

Ser

Glu

His 225 Asp

Ala

Leu

Pro

Ala 305 Gly

Ala

Leu

Pro Leu Thr

Ala

50

Asp

Thr

Pro

Leu

Ser 130 Met

Ala

Thr

Ser

Gly 210 lie

Asp

Phe

Ala

lie 290 Met

Gly

Pro

Thr

Val

35

Leu

Ser

Glu

Leu

Ala 115 Gly

Gly

Glu

Gly

Gln 195 Leu

Thr

Ser

Asp

Ala 275 Gly

Gly

Asn

Thr

Gly 355

Trp 20 Pro

Ala

Val

Asp 100 Gly

Ala

Thr

Gly

Glu 180 Phe

His

Met

Val

Gln 260 Ala

Thr

Ala

Glu

Val 340 lie

6

Thr

5 Pro

Gly

Asp

Leu

Pro

85

Pro

Thr

lie

Gly 165 Val

Val

Leu

Thr

Pro 245 Arg

Leu

Thr

lie 325 Ala

Ala

Ser

Gly

Met

70

Gly

Ser

Val

lie 150 Arg

Arg

Ser

Glu

Val 230 Asn

lie

Ala

Gln

Val 310 Lys

Ala Ala His

Ala

Pro

Lys

Pro

55

lie

Asp

Ala

Met

Phe 135 Glu

Thr

Gly

Ala

His 215 Glu

His

Glu

Thr

Val 295 Thr

Gly

Leu

Asn Thr Tyr

Ser

40

Ser

Gln

Gly

Ala

Arg 120 Asp

Ala

Pro

Gly

Leu 200 Val

Val

Trp

Gln

His 280 Gly

Leu

Ala

Cys

Arg 360

Ala

25

Leu

Arg

Ala

Asp

Gly 105 Phe

Gly

Leu

Ser

His 185 Leu

Gly

Leu

Arg

Asp 265 Gly

Asp

Ala 345 Gly

Glu 10 Asn

Thr

Leu

Tyr

90

Ser

Val

Asp

Leu

Ala 170 Leu

Leu

Lys

Arg

Val 250 Leu

Thr

Leu

Gly

Phe 330 Leu

Pro

Gly

Asn

Arg

75

Gly

Ser

Pro

Ala 155 Leu

Val

Pro

Ser 235 Ser

Ser

Val

Trp

Gly 315 Asp

Ala His Glu

Asp

Pro

Arg

Ala 60 Gln

Pro

Thr

Pro

His 140 Leu

Pro

lie

Gly

Val 220 Val

Pro

Asn

Arg

Arg 300 Thr

Glu

Thr

Lys Ala Val

Phe

45

Pro

Leu

Asp

Ala

Leu 125 Ala

Gly

Phe

Asp

Ala 205 Pro

Gly

Ala

lie 285 Thr

Leu

Thr

Gly

Asp 365

Asp

30

Leu

Gly

Leu

lie 110 Ala

Arg

Val

Thr

Ala 190 Arg

Ser

Val

Lys

Gly 270 Pro

lie

Thr

Ser

Pro 350 Arg

Ala

15

Ala

Val

His

Ala

Glu

95

Asp

Ala

Asn

Pro

Val 175 Ser

Phe

Leu

Thr

lie 255 Pro

Asn

Leu

Val

Glu 335 Ser

Ser

Thr

Leu

Ser

Thr 80 lie

Cys

Leu

Arg

Val 160 Glu

Ala

Thr

Asp

Val 240 Thr

Phe

Trp

Ala

Thr 320 Leu

Arg Leu Ala

acc atg

Thr Met

CCC

Pro 435

gag Glu

ttc Phe

ccg

Pro

gag Glu

atg tgg gca Met Trp Ala 440

aga

Arg

atg

Met

ctt Leu 445

gac Asp

tcc gcc Ser Ala

1344

ggc

Gly

ggc acg Gly Thr Ala

Ala 385 His

Leu

Thr

Gly

Leu 370 Asp

Ser

Ala

Met

Thr 450

Val

Gly

Tyr

Val

Pro 435 Asn

Ala

Leu

Ala

Asp 420 Glu

Glu lie Leu

P 5 y sol A 4 G

Phe Glu Ala

lie 390 His

Val

Pro

Gly

Asn

375 Arg

Arg

Gln

Glu

Asn 455

Arg

Pro

Met

Val

Met 440

Leu

Ala

Glu 425 Trp

Gly Gly Thr

Thr 410 Asp

Leu 395 Ala

lie Ala Arg

Asp

380 His

Gly

Ala

Met

Ala

Gly

Ala

Thr

Leu 445

Glu Glu Thr Gly lie

Thr 430 Asp

Val lie 400 Leu Gly 415

Ser Lys

Ser Ala

<210> SEQ ID NO: 7 <211> Comprimento: 1386 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo： Arthrobacter ureafaciens

<220> Caracteristicas: <2 21> Nome/Chave: CDS <222> Localizagao: (1)

(1386)

<400> Sequencia: atg aca ggt acc

Met 1

Thr Gly Thr

7 acc Thr 5

gca

Ala

gca

Ala

aac Asn

acg

Thr

ggt Gly 10

tea Ser

aac Asn

tcc

Ser

gtc Val

gac Asp 15

acc Thr

48

ctg Leu

ccc Pro

ctc Leu

tgg Trp 20

gca Ala

get

Ala

CCC

Pro

tac

Tyr

gcc Ala 25

acc

Thr

agg Arg

cca Pro

gtg Val

gat Asp 30

gcc

Ala

aca 96

Thr

g 1 t a g V

acg Thr

gtg Val 35

ccg Pro

ggc Gly

tea Ser

aaa

Lys

tcg Ser 40

ctc Leu

acc Thr

aac Asn

cgt Arg

ttc Phe 45

ctg Leu

gtc Val

ctc Leu

144

gca Ala

gca Ala 50

ttg Leu

gcc

Ala

gac

Asp

C y g1 g G

cct Pro 55

tcc Ser

cgc

Arg

ctg Leu

egg Arg

gcc Ala 60

CCC

Pro

ctt Leu

cac

His

tcc Ser

192

cgc Arg

65

gat

Asp

tcc Ser

gtc

Val

ctt Leu

atg Met 70

att lie

cag Gln

gcg Ala

CtC

Leu

a g 5 Di r 7 a A

caa

Gln

ctg Leu

ggt Gly

gcc Ala

acc Thr 80

240

gtc

Val

acc Thr

gag Glu

gta

Val

ccc Pro 85

C y g 1 gG

gac Asp

ggt Gly

gat Asp

tat Tyr 90

a y g1 g G

ccg Pro

gac

Asp

ctt Leu

gu 5 a 1 9 g G

ate lie

288

act Thr

ccc Pro

atg Met

t P O a S O g A 1

cct

Pro

tcg Ser

get Ala

tcg

Ser

ggt Gly 105

gcg Ala

gag Glu

act Thr

gcc

Ala

ate lie 110

gat

Asp

tgc

Cys

336

ggc Gly

ctt Leu

gcc

Ala 115

ggt Gly

acg

Thr

gtt Val

atg

Met

Cgo g r 2

CAl

ttc Phe

gtt Val

cca Pro

cct Pro

tta Leu 125

get Ala

gcg Ala

cta Leu

384

cgc Arg

aat Asn 130

t y g1 gG

cca Pro

acc Thr

acg

Thr

ttc Phe 135

gac

Asp

C y g1 g G

gat Asp

ccc Pro

cat His 140

gcc Ala

cgt Arg

aag

Lys

egg Arg

432 egg ctc gcc 1104 Arg Leu Ala

ggc cat gaa acc Gly His Glu Thr

ctg acc ggc ate gcg cac ctc

Leu Thr Gly lie Ala His Leu 355

CCC

Pro 145

atg Met

gga Gly

acc Thr

ate

lie

ate lie 150

gaa Glu

gcg Ala

ctg Leu

CtC

Leu

C a 5

C 1 5 g A 1

ctc Leu

gga Gly

gtt Val

cct Pro

Clo t a 6 gv 1

480

gcc Ala

acc Thr

gaa

Glu

ggc Gly

gga Gly 165

agg Arg

acg Thr

ccg Pro

tcg Ser

Cao C 1 7 gA 1

Ctt

Leu

CCC

Pro

ttc Phe

tct Ser

gl 5 t a 7 gvl

gat

Asp

528

ggc Gly

act Thr

ggc Gly

gag Glu 180

gtt Val

egg Arg

ggc Gly

cat

His 185

ctg Leu

g 1 t a gV

ate

lie

gat Asp

Cao C 1 9 gA 1

age

Ser

gca

Ala

576

tcg Ser

tcc Ser

cag

Gln 195

ttc Phe

gtt Val

tcg Ser

gcc Ala

ttg Leu 200

ctg Leu

ctt Leu

gta

Val

ggc Gly

gcc Ala 205

aga

Arg

ttc Phe

acc

Thr

624

gaa

Glu

ggc Gly 210

ctt Leu

cac His

ctg Leu

gaa

Glu

cac His 215

gtt Val

ggc Gly

aag

Lys

cct

Pro

Clo t a 2

g V 2

ccc Pro

age

Ser

ctg Leu

gac Asp

672

cac

His 225

ate

lie

aat Asn

atg Met

acc

Thr

t 1 O t a 3 gv 2

tcc Ser

gtc Val

ctt Leu

cgc Arg

gga Gly 235

gtg Val

ggc Gly

gtc

Val

aag

Lys

g 1 O t a 4 g V 2

720

gac

Asp

gat Asp

tcg

Ser

gta

Val

ccc Pro 245

aac Asn

cac

His

tgg Trp

egg Arg

gtc Val 250

gca

Ala

cct

Pro

ggc Gly

CCC

Pro

ate

工Ie 255

cac His

768

gcc Ala

ttc Phe

gac

Asp

cag

Gln 260

egg Arg

ate 工Ie

gaa

Glu

cag

Gln

C P 5 a S 6 ^ A 2

ctt Leu

tcc Ser

aac Asn

gcc Ala

ggc Gly 270

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ttc Phe

816

ctt Leu

gcc

Ala

aa 5 C 1 7 g A 2

gcc Ala

ctg Leu

gca

Ala

acc Thr

cgc

Arg 280

gga Gly

acc Thr

gtc Val

egg Arg

ate lie 285

CCC

Pro

aac Asn

tgg Trp

864

CCC

Pro

acc Thr 290

cag Gln

acc Thr

cag Gln

gl m t a 9 gv 2

t y g 1 gG

gat Asp

Ctt

Leu

tgg Trp

egg Arg 300

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ate

lie

ctg Leu

gtt Val

912

gu 5 a 1 O g'G 3

atg Met

t y g1 gG

gcc

Ala

acg Thr

gl O t a 1 g V 3

aca

Thr

ctc Leu

gaa

Glu

aac Asn

C y 5 9 11 g G 3

acg Thr

ctc Leu

acg

Thr

gtt Val

aag

Lys 320

960

ggc Gly

ccg Pro

gaa

Glu

ate lie 325

aaa

Lys

ggc Gly

gcc Ala

gac Asp

ttc Phe 330

gac Asp

gaa Glu

acc Thr

age

Ser

Gi U 5 a 1 3 G 3

CtC

Leu

1008

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ccc

Pro

acg

Thr

Clo t a 4 gv 3

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Ala

gcg Ala

ctg Leu

tgc

Cys

aa5 C 1 4 gA 3

ctg Leu

gcc Ala

aca Thr

C y g 1 gG

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egg Arg

1056

gcg Ala

ctg Leu 370

gcc

Ala

get Ala

gaa

Glu

ate 工Ie

aat Asn 375

egg Arg

ctc Leu

ggc Gly

gga Gly

gac Asp 380

gca

Ala

gaa

Glu

gaa Glu

aca

Thr

1152

gat

Asp 365 get Ala 385

gac Asp

ggc Gly

ctg Leu

ate lie

ate lie 390

cgc Arg

ccg Pro

gcc Ala

act Thr

ctg Leu 395

cat His

ccc Pro

ggc Giy

gtc Val

a 1 O t a O g V 4

1200

cac

His

CtC

Leu

age

Ser

gcc

Ala

tac

Tyr

gtt Val

gcc Ala

gag Glu 420

C P 5 Cy a S O g 1 a- A 4gG

cac His

gtc

Val

cgc

Arg

cag Gln

atg Met

g1 t a g V

get Ala

gag Glu 425

acg

Thr 410

gat Asp

gcc Ala

ate lie

ggc Gly

get Ala

acc Thr

att lie

acc Thr 430

ttg Leu 415

tcc Ser

ggg Gly

aag Lys

1248

丄296

acg Thr

acg

Thr

gtg Val

ggc Gly 450

CCC

Pro 435

gag Glu

gaa

Glu

gac Asp

ttt Phe

gaa Glu

ccg Pro

acc Thr

cag

Gln

C 1 5 t a 5 gv 4

atg Met 440

acc Thr

tgg Trp

agt Ser

gag Glu

gcc Ala

atg

Met

Cro g e 6 a S 4

ctg Leu 445

aac Asn

cag

Gln

tga

cag

Gln

ggc Gly

1344

1386

<210> SEQ ID NO: 8 <211> Comprimento: 461 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Arthrobacter ureafaciens

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Leu

Val

Ala

Arg

65

Val

Thr

Gly

Arg

Pro 145 Ala

Gly

Ser

Glu

His 225 Asp

Pro Leu Thr

Ala

50

Asp

Thr

Pro

Leu

Asn 130 Met

Thr

Ser

Gly 210 lie

Asp Ala Phe

Val

35

Leu

Ser

Glu

Met

Ala 115 Gly

Gly

Glu

Gly

Gln 195 Leu

Asn

Ser

Asp

Trp 20 Pro

Ala

Val

Asp 100 Gly

Pro

Thr

Gly

Glu 180 Phe

His

Met

Val

Gln

8 Thr 5

Ala

Gly

Asp

Leu

Pro

85

Pro

Thr

lie

Gly 165 Val

Val

Leu

Thr

Pro 245 Arg

Ala

Ser

Gly

Met

70

Gly

Ser

Val

Thr

lie 150 Arg

Arg

Ser

Glu

Val 230 Asn

Ala

Pro

Lys

Pro

55

lie

Asp

Ala

Met

Phe 135 Glu

Thr

Gly

Ala

His 215 Ser

Asn Thr Tyr

His lie Glu

Ser

40

Ser

Gln

Gly

Ser

Arg 120 Asp

Ala

Pro

Gly

Leu 200 Val

Val

Trp

Gln

Ala

25

Leu

Arg

Ala

Asp

Gly 105 Phe

Gly

Leu

Ser

His 185 Leu

Gly

Leu

Arg

Asp

Gly 10 Thr

Thr

Leu

Tyr

90

Ala

Val

Asp

Leu

Ala 170 Leu

Leu

Lys

Arg

Val 250 Leu

Ser

Arg

Asn

Arg

75

Gly

Glu

Pro

Ala 155 Leu

Val

Pro

Gly 235 Ala

Asn

Pro

Arg

Ala 60 Gln

Pro

Thr

Pro

His 140 Leu

Pro

lie

Gly

Val 220 Val

Pro Ser Asn

Ser

Val

Phe

45

Pro

Leu

Asp

Ala

Leu 125 Ala

Gly

Phe

Asp

Ala 205 Pro

Gly

Ala

Val Asp Thr 15

Ala Thr

Asp

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Leu

Gly

Leu

lie 110 Ala

Arg

Val

Ser

Ala 190 Arg

Ser Val Lys Pro Gly

Val Leu

His Ser

Ala Thr 80

Glu lie 95

Asp Cys

Ala Leu

Lys Arg

Pro Val 160 Val Asp 175

Ser Ala Phe Thr Leu Asp

Val 240 工Ie His 255

Pro Phe ttc 288 Phe

gat gtg cgt gaa tta aat gta ggc aat

Asp Val Arg Glu Leu Asn Val Gly Asn 85

gcg ggt gca gtg ctg Ala Gly Ala Val Leu 90

Leu Ala Pro

Glu 305 Gly

Ala

Leu

Ala

Ala 385 His

Leu

Thr

Thr 290 Met

Gly

Pro

Thr

Leu 370 Asp

Ser

Ala

Val

Gly 450

Ala 275 Gln

Gly

Pro

Thr

Gly 355 Ala

Gly

Tyr

Val

Pro 435 Glu

260 Ala

Thr

Ala

Glu

Val 340 lie

Ala

Leu

Ala

Glu 420 Glu

Leu

Thr

lie 325 Ala

Ala

Glu

lie

Asp 405 Gly

Ala Thr Gln

Phe Asp Glu

Val 310 Lys

Ala

His

lie

lie 390 His

Val

Pro

Thr

Val 295 Thr

Gly

Leu

Asn 375 Arg

Arg

Gln

Val 455

Arg 280 Gly

Leu

Ala

Cys

Arg 360 Arg

Pro

Met

Val

Met 440 Thr

265 Gly

Asp

Glu

Asp

Ala 345 Gly

Leu

Ala

Glu 425 Trp

Thr

Leu

Asn

Phe 330 Leu

His

Gly

Thr

Thr 410 Asp

Val Arg Trp

Glu Ser Glu

Gly 315 Asp

Ala

Glu

Gly

Leu 395 Ala

lie

Ala

Arg 300 Thr

Glu

Thr

Asp 380 His

Gly

Ala

Met

Ser 460

lie 285 Ser

Leu

Thr

Gly

Asp 365 Ala

Pro

Ala

Thr

Leu 445 Asn

270 Pro

工Ie

Thr

Ser

Pro 350 Arg

Glu

Gly

lie

Thr 430 Gln

Asn

Leu

Val

Glu 335 Ser

Leu

Glu

Val

Leu 415 Ser

Trp

Val

Lys 320 Leu

Arg

Ala

Thr

Val 400 Gly

Lys

Gln Gly

<210> SEQ ID NO: 9 <211> Comprimento： 1296 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo： Paenibacillus pabuli

<220> Caracteristicas：

<221> Nome/Chave： CDS <222> Localizagao： (1)

(1296)

<400> Seqiiencia： atg gac gtt ate

Met 1

Asp Val lie

9

gtt Val 5

aaa

Lys

cca

Pro

acc Thr

cca Pro

tcc Ser 10

ctg Leu

aac Asn

ggg Gly

gaa

Glu

att lie 15

gga Gly

48

get Ala

ttg Leu

tct Ser

tcc Ser 20

aag

Lys

aac Asn

tac Tyr

acc Thr

aca

Thr 25

cgc Arg

tac

Tyr

ttg Leu

cta Leu

get

Ala 30

get Ala

gcg Ala

96

ctg Leu

gca

Ala

gaa

Glu 35

ggc Gly

aca

Thr

agt

Ser

acg

Thr

att lie 40

cat

His

tac Tyr

cct

Pro

get Ala

cac

His 45

agt

Ser

gaa

Glu

gat Asp

144

agt

Ser

gac Asp 50

get

Ala

atg Met

cgc Arg

aga

Arg

tgt Cys 55

att lie

agt Ser

gat Asp

ctt Leu

gga Gly 60

gcg Ala

g1 t a g V

CtC

Leu

gaa

Glu

192

gaa

Glu 65

gat Asp

age

Ser

aaa

Lys

ate

lie 70

gtt Val

att lie

cag Gln

ggc Gly

ttc Phe 75

C y g1 gG

age Ser

cat

His

cca

Pro

cgt

Arg 80

240

t g 5 gr9

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gcg Ala

aca Thr

gac

Asp

g a O

Cll

gA 3

gtt Val

ttg Leu

gcc

Ala

atg Met

a 1 5 t a 1 gv 3

gcg Ala

gca

Ala

g 1 t a gV

ttt Phe 320

960

gcg Ala

gaa

Glu

ggc Gly

acc Thr

tea Ser 325

egg Arg

ttc Phe

tat Tyr

aat Asn

a 1 O t a 3 gv3

gag Glu

aac Asn

tta Leu

cgt Arg

tac

Tyr 335

aag

Lys

1008

ctg Leu

atg

Met

ggg

Gly

gta

Val 100

acg

Thr

gca

Ala

ctt Leu

tgt Cys

cct Pro 105

gat Asp

gtt Val

acg

Thr

ttt Phe

a 1 O t a 1 g V 1

aat Asn

acg Thr

336

tac

Tyr

ccg Pro

t P 5 a S 1 A 1

tct Ser

ctg Leu

ggc Gly

aaa

Lys

cgo g r 2

CAl

cca Pro

cat His

t P a S gA

gac Asp

ctg Leu 125

ate

lie

gat

Asp

gcg Ala

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t y O gl 3 gG 1

cag

Gln

ctt Leu

ggt Gly

gtt Val

O- U 5 a 1 3 g G 1

gta Val

caa

Gln

cac His

gaa

Glu

caa Gln 140

gga Gly

cgc Arg

ttg Leu

cca Pro

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ate lie 145

acg Thr

ate lie

aaa

Lys

ggg

Gly

ggt Gly 150

cag

Gln

gcc

Ala

aag

Lys

ggt Gly

gga Gly 155

cat His

ate lie

cgt Arg

gta Val

tcc

Ser 160

480

t y g1 g G

tcg Ser

gtc Val

age Ser

tct Ser 165

cag

Gln

tat Tyr

ttg Leu

age Ser

g a O C 1 7 g A 1

tta Leu

ctg Leu

ttt Phe

gta Val

act Thr 175

cct Pro

528

ctt Leu

ctg Leu

gcc

Ala

gaa Glu 180

gac Asp

age

Ser

acg Thr

att 工Ie

a U 5 a 1 8 gG 1

gta Val

tta Leu

aac Asn

gac

Asp

ttg Leu 190

aaa

Lys

tcc Ser

576

Lys

g 1 t a gV

t 1 5 t a 9 gv 1

att lie

ggc

Gly

cag

Gln

acg Thr

ctg Leu 200

gaa

Glu

gta

Val

ttg Leu

gaa

Glu

cag

Gln 205

gcg Ala

C y g 1 gG

ate lie

624

gtc

Val

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cat

His

gcg Ala

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Ser

t P a S gA

t P 5 a S 1 g'A 2

tac Tyr

atg

Met

tcc

Ser

ttc Phe

cgc Arg 220

gta

Val

cct Pro

C y g 1 g G

ggt Gly

672

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Gln 225

gcc Ala

tat Tyr

aaa

Lys

cca Pro

caa

Gln 230

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Thr

tat Tyr

acg Thr

gtt Val

caa

Gln 235

gga Gly

gac

Asp

tat Tyr

ccg Pro

t y O gl 4 g G 2

720

tea

Ser

gca

Ala

get

Ala

gtc

Val

ctc Leu 245

gcg Ala

gcc Ala

gcg Ala

get Ala

Clo t a 5 g V 2

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Thr

caa

Gln

tcg Ser

gat Asp

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aaa

Lys

768

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ttg Leu

cga

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ttg Leu 260

atg Met

gaa

Glu

cag Gln

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aaa Lys 265

caa

Gln

ggt Gly

gag Glu

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Cao C 1 7 gA 2

att lie

gta

Val

816

gac Asp

gtt Val

ctg Leu 275

cgc Arg

atg

Met

atg Met

gaa

Glu

Q-Io t a 8 g V 2

ccg Pro

ttg Leu

acg Thr

cat

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a U 5 a 1 8 gG 2

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t P a S g A

gtg Val

864

gta Val

cac

His 290

g 1 t a

gV

caa

Gln

ggt Gly

aac Asn

ggt Gly 295

aca

Thr

ttg Leu

aaa

Lys

gcc

Ala

g 1 O t a O gv3

gaa

Glu

ttc Phe

gat

Asp

a y g1 gG

912

t P 5 a S O g'A3 gcg ctt ggc gcc tcg gtt caa tgg gta aaa gag taa 1296 Ala Leu Gly Ala Ser Val Gln Trp Val Lys Glu * 425 430

gat cat ttg Asp His Leu

Asn

Leu

Ala

Gly 60 Gly

Ala

Thr

Asp

Gln 140 His

Leu

Asn

Glu

<210> SEQ ID NO: 10 <211> Comprimento: 431 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo： Paenibacillus pabuli

<400> Sequencia: Met Asp Val 工Ie

1

Ala

Leu

Ser

Glu

65

Asp

Leu

Tyr

Leu

lie 145 Gly

Leu

Lys

Val

Gln

Leu Ser Ala

Asp

50 Asp

Val

Met

Pro

Gly 130 Thr

Ser

Leu

Val

lie 210 Ala

Glu

35

Ala

Asp

Arg

Gly

Asp 115 Gln

lie

Val

Ala

Val 195 His

Ser

20

Gly

Met

Ser

Glu

Val 100 Ser

Leu

Lys

Ser

Glu 180 lie

Ala Tyr Lys

10 Val

5 Lys

Thr

Arg

Lys

Leu

85

Thr

Leu

Gly

Ser 165 Asp

Gly

Ser

Pro

Lys

Asn

Ser

Arg

lie

70

Asn

Ala

Gly

Val

Gly 150 Gln

Ser

Gln

Asp

Gln

Pro

Tyr

Thr

Cys

55

Val

Leu

Lys

Glu 135 Gln

Tyr

Thr

Asp 215 Thr

Thr Pro Thr

lie

40

lie

Gly

Cys

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Ala

Leu

lie

Leu 200 Tyr

Tyr

Thr

25

His

Ser

Gln

Asn

Pro 105 Pro

Gln

Lys

Ser

Glu 185 Glu

Met

Thr

Ser Leu 10

Arg Tyr

Tyr Pro

Asp Leu

Gly Phe 75

Ala Gly 90

Asp Val

His Asp

His Glu

Gly Gly 155 Ala Leu 170

Val Leu Val Leu Ser Phe Val Gln

Gly Glu lie Gly 15

Leu Ala Ala Ala 30

His Ser Glu Asp 45

Ala Val Leu Glu

Ser His Pro Arg 80

Val Leu Arg Phe 95

Phe Val Asn Thr 110

Leu lie Asp Ala 125

Gly Arg Leu Pro

工Ie Arg Val Ser 160

Phe Val Thr Pro 175

Asp Leu Lys Ser 190

Gln Ala Gly lie 205

Val Pro Gly Gly Asp Tyr Pro Gly

gaa tgt gac cga att aca gat tat ttg aac gaa ctg egg aag gca gga 1056 Glu Cys Asp Arg 工Ie Thr Asp Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Lys Ala Gly 340 345 350

gcc aac gta gaa gaa cgt cag gcc gag att ate gta cat ggt cgt ccg 1104 Ala Asn Val Glu Glu Arg Gln Ala Glu 工Ie lie Val His Gly Arg Pro 355 360 365

gaa ggc gtc gaa ggc ggc gtt gag att aac get cac tac gat cat cgc 1152 Glu Gly Val Glu Gly Gly Val Glu 工Ie Asn Ala His Tyr Asp His Arg 370 375 380

gta att atg gca ctg acc gtt gtc ggt ctg cgt tcc aaa gaa ccg ctt 1200 Val lie Met Ala Leu Thr Val Val Gly Leu Arg Ser Lys Glu Pro Leu 385 390 395 400

cgt att egg gat gca cac cat gta gcc aag tct tat ccg caa tat ttc 1248 Arg lie Arg Asp Ala His His Val Ala Lys Ser Tyr Pro Gln Tyr Phe 405 410 415

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220 Gly gat gtg cgt gaa tta aat

Asp Val Arg Glu Leu Asn 85

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Val Gly Asn Ala Gly Ala Val Leu 90

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get Ala

atg Met

cgc Arg

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Arg

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cgc Arg

gat Asp

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gga Gly 60

gca

Ala

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gaa

Glu

192

gaa

Glu 65

gat

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gac Asp

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Lys

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lie

cag

Gln

ggc Gly

ttt Phe 75

ggc Gly

age Ser

cat

His

cca Pro

cat His 80

240

225 Ser

lie

Asp

Val

Asp 305 Ala

Glu

Ala

Glu

Val 385 Arg

Ala

Leu

Val

His 290 Ala

Glu

Cys

Asn

Gly 370 lie

Ala Val Arg

lie Asp His

Leu 275 Val

Ala

Gly

Asp

Val 355 Val

Met

Arg

Leu

Leu 260 Arg

Gln

Thr

Arg 340 Glu

Glu

Ala

Asp

Gln 420

Leu

245 Met

Met

Gly

Asp

Ser 325 lie

Glu

Gly

Leu

Ala 405 Ala

230 Ala

Glu

Met

Asn

Ala 310 Arg

Thr

Arg

Gly

Thr 390 His

Ala

Gln

Glu

Gly 295 Val

Phe

Asp

Gln

Val 375 Val

Ala Ala Ser

His Leu Gly

Val 280 Thr

Leu

Tyr

Ala 360 Glu

Val

Ala

Lys 265 Pro

Leu

Ala

Asn

Leu 345 Glu

lie

Gly

Ala

Ser 425

Val 250 Gln

Leu

Lys

Met

Val 330 Asn

lie

Asn

Leu

Lys 410 Val

235 Thr

Gly

Thr

Ala

Val 315 Glu

Glu

lie

Ala

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Gln

Glu

His

Val 300 Ala

Asn

Leu

Val

His 380 Ser

Ser Asp Arg

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Ala

Leu

Arg

His 365 Tyr

Lys

Pro

Val

Ala 270 Asn

Phe

Ala

Arg

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Asp

Glu

Gln

Lys 430

Val 255 lie

Asp

Val

Tyr 335 Ala

Arg

His

Pro

Tyr 415 Glu

240 Lys

Val

Gly

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Gly

Pro

Arg

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<210> SEQ ID NO: 11 <211> Comprimento： 1296 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo： Paenibacillus pabuli

<220> Caracteristicas：

<2 21> Nome/Chave: CDS <222> Localizagao: (1)

(1296)

<400> Sequencia: atg gac gtt ate

Met 1

Asp Val 工Ie

11 gtt Val 5

aaa

Lys

ccg

Pro

acc Thr

cca Pro

tcc Ser 10

ctg Leu

aac Asn

gga Gly

gaa

Glu

att lie 15

a y g1 g G

48

get Ala

ttg Leu

tct Ser

tcc Ser 20

aaa Lys

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tac Tyr

acc

Thr

aca

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tac Tyr

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cta Leu

get Ala 30

get Ala

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tac

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gcg Ala

gca Ala

gca

Ala

Di 1 t a

gV

ttt Phe 320

960

gcg Ala

gaa

Glu

ggc Gly

acc Thr

tea Ser 325

egg Arg

ttc Phe

tat Tyr

aat Asn

a 1 O ta3 g V 3

gag Glu

aac Asn

tta Leu

cgt Arg

tac Tyr 335

aag

Lys

1008

cta Leu

atg Met

ggg Gly

gta Val 100

aca

Thr

gca

Ala

ctt Leu

tgt Cys

cct Pro 105

gag Glu

g1 t a g V

acg Thr

ttt

Phe

a 1 O t a 1 g V 1

aat Asn

acg

Thr

336

tac

Tyr

ccg Pro

t P 5 a S 1 g A 1

tct Ser

ctt Leu

ggc Gly

aaa

Lys

cgc Arg 120

cca Pro

cat His

gat Asp

gac Asp

ctg

Leu 125

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lie

gat Asp

gcg Ala

384

ctt Leu

t y O gl 3 g G 1

cag Gln

ctc Leu

ggt Gly

gtt Val

gag Glu 135

gta Val

cag

Gln

cac His

gaa

Glu

caa

Gln 140

gga Gly

cgc Arg

ttg Leu

cca Pro

432

ate lie 145

acg

Thr

ate

lie

aaa Lys

t y g 1 gG

ggt Gly 150

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Gln

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aag

Lys

ggt Gly

gga Gly 155

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cgt

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gta

Val

tcc

Ser 160

480

t y g 1 gG

tct Ser

gtc Val

age

Ser

tcc Ser 165

cag

Gln

tat Tyr

ttg Leu

age

Ser

gcg Ala 170

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ctg Leu

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gta Val

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528

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ctg Leu

gcc

Ala

a U O a 1 8 g G 1

gac

Asp

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Ser

aca

Thr

att lie

a U 5 a 1 8 gG 1

gta Val

ttg Leu

aat Asn

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Lys

tcc

Ser

576

aaa

Lys

g 1 t a gV

t 1 5 t a 9 gv 1

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ggt Gly

cag

Gln

acg

Thr

ctg

Leu 200

gaa

Glu

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Val

ctg Leu

gaa

Glu

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Gln 205

gcg Ala

t y g 1 gG

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lie

624

gtc Val

att lie 210

cat His

gcg Ala

agt Ser

gat Asp

t P 5 a S 1 g'A 2

tac Tyr

atg

Met

tcc

Ser

ttc Phe

cgc Arg 220

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cct

Pro

C y g1 gG

ggc Gly

672

caa

Gln 225

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tat Tyr

aaa

Lys

ccg

Pro

caa

Gln 230

aca

Thr

tat Tyr

acg

Thr

gtt Val

caa

Gln 235

gga

Gly

gac

Asp

tat Tyr

ccg Pro

t y O 9 14 gG 2

720

tea Ser

gca Ala

get Ala

gtc Val

ctc Leu 245

gcg Ala

get Ala

gcg Ala

Clo t a 5 gv 2

act

Thr

caa

Gln

tcc Ser

gat Asp

t 1 5 t a 5 g V 2

Lys

768

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ttg Leu

cga

Arg

ttg Leu 260

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Met

gaa

Glu

cag

Gln

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Ser

aaa

Lys 265

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Gln

ggt Gly

gag Glu

cgt

Arg

t a O C 1 7 gA 2

att lie

gtt Val

816

gac

Asp

gtt Val

ctg

Leu 275

cgc Arg

atg Met

gaa

Glu

g 1 O t a 8 g V 2

ccg Pro

ttg Leu

acg Thr

cat His

gu 5 a 1 8 tn G 2

aac Asn

gat

Asp

gtg Val

864

gtt Val

cac His 290

g1 t a

gV

caa

Gln

ggt Gly

aac Asn

ggt Gly 295

act

Thr

ttg Leu

aaa

Lys

gcc

Ala

g 1 O t a O gv3

gaa

Glu

ttc Phe

gat

Asp

a y g1 g G

912

t P 5 a S O ^ A 3 gcc Ala

gaa Glu

gta Val 385

cgt Arg

gat

Asp

aac Asn

ggc Gly 370

att lie

ate

lie

cat His

a 1 5 Cl t a 5 t a gv.3gv

atg Met

egg Arg

ttg Leu

gaa Glu

gaa

Glu

gca

Ala

gat

Asp

cag Gln 420

gaa Glu

ggc Gly

ctg Leu

gca

Ala 405

gcg Ala

cgt Arg

ggc Gly

acc Thr 390

cac His

ctt Leu

cag Gln

gtt Val 375

gtt Val

cat His

ggc Gly

gcc

Ala 360

gag Glu

gtc

Val

gta

Val

gcc

Ala

gag Glu

att lie

ggt Gly

gcc

Ala

tcg Ser 425

att lie

aac Asn

ctg Leu

aag

Lys 410

gtt Val

ate lie

get Ala

cgt

Arg 395

tct Ser

caa

Gln

gta

Val

cac His 380

tcc Ser

tat Tyr

tgg Trp

cat His 365

tac Tyr

ggt Gly

gat

Asp

aaa

Lys

ccg Pro

gta Val

gaa Glu

caa

Gln

aaa

Lys 430

cgt Arg

cat His

ccg Pro

tat Tyr 415

gag

Glu

ccg Pro

cgc Arg

ctt Leu 400

ttc Phe

taa

1104

1152

1200

1248

1296

<210> SEQ ID NO: 12 <211> Comprimento: 431 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo： Paenibacillus pabuli

<400> Seqiiencia Met Asp Val lie 1

Ala

Leu

Ser

Glu

65

Asp

Leu

Tyr

Leu

lie 145 Gly

Leu

Lys

Val

Gln

Leu Ser Ala

Asp

50

Asp

Val

Met

Pro

Gly 130 Thr

Ser

Leu

Val

lie 210 Ala

Glu

35

Ala

Asp

Arg

Gly

Asp 115 Gln

lie

Val

Ala

Val 195 His

Ser

20

Gly

Met

Ser

Glu

Val 100 Ser

Leu

Lys

Ser

Glu 180 lie

Ala Tyr Lys

12 Val 5

Lys

Thr

Arg

Lys

Leu

85

Thr

Leu

Gly

Ser 165 Asp

Gly

Ser

Pro

Lys

Asn

Ser

Arg

lie

70

Asn

Ala

Gly

Val

Gly 150 Gln

Ser

Gln

Asp

Gln

Pro

Tyr

Thr

Cys

55

Val

Leu

Lys

Glu 135 Gln

Tyr

Thr

Asp 215 Thr

Thr Pro Thr

lie

40

lie

Gly

Cys

Arg 120 Val

Ala

Leu

lie

Leu 200 Tyr

Thr

25

His

Arg

Gln

Asn

Pro 105 Pro

Gln

Lys

Ser

Glu 185 Glu

Met Tyr Thr

Ser 10 Arg

Tyr

Asp

Gly

Ala

90

Glu

His

Gly

Ala 170 Val

Val

Ser

Val

Leu

Tyr

Pro

Leu

Phe

75

Gly

Val

Asp

Glu

Gly 155 Leu

Leu

Phe

Gln

Asn Gly Glu Leu Ala

Gly 60 Gly

Ala

Thr

Asp

Gln 140 His

Leu

Asn

Glu

Arg 220 Gly

Leu Ala

30 His Ser 45

Ala Val

Ser His

Val Leu

Phe Val 110 Leu lie 125

Gly Arg

lie Arg

Phe Val

Asp Leu 190 Gln Ala 205

Val Pro

工Ie

15

Ala

Glu

Leu

Pro

Arg

95

Asn

Asp

Leu

Val

Thr 175 Lys

Gly Gly Asp Tyr Pro

Gly

Ala

Asp

Glu

His 80 Phe

Thr

Ala

Pro

Ser 160 Pro

Ser

lie

Gly

gaa

Glu

tgt

Cys

gac

Asp

cga

Arg 340

att lie

acg

Thr

gat Asp

tat Tyr

ttg Leu 345

aac Asn

gaa Glu

ctg Leu

egg Arg

aag

Lys 350

gca

Ala

1056

a y g1 g G 225 230 235 240

Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Val Thr Gln Ser Asp Val Lys

245 250 255

lie Leu Arg Leu Met Glu Gln Ser Lys Gln Gly Glu Arg Ala lie Val

260 265 270

Asp Val Leu Arg Met Met Glu Val Pro Leu Thr His Glu Asn Asp Val

275 280 285

Val His Val Gln Gly Asn Gly Thr Leu Lys Ala Val Glu Phe Asp Gly

290 295 300

Asp Ala Ala Thr Asp Ala Val Leu Ala Met Val Ala Ala Ala Val Phe 305 310 315 320

Ala Glu Gly Thr Ser Arg Phe Tyr Asn Val Glu Asn Leu Arg Tyr Lys

325 330 335

Glu Cys Asp Arg lie Thr Asp Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Lys Ala Gly

340 345 350

Ala Asn Val Glu Glu Arg Gln Ala Glu lie lie Val His Gly Arg Pro

355 360 365

Glu Gly Val Glu Gly Gly Val Glu lie Asn Ala His Tyr Asp His Arg

370 375 380

Val lie Met Ala Leu Thr Val Val Gly Leu Arg Ser Lys Glu Pro Leu 385 390 395 400

Arg lie Arg Asp Als His His Val Als Lys Ser Tyx Pro Gln Tyx Phe

405 410 415

Asp His Leu Gln Ala Leu Gly Ala Ser Val Gln Trp Val Lys Glu 420 425 430

<210> SEQ ID NO: 13 <211> Comprimento： 1251 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Sphingobacterium multivorum/faecium

<220> Caracteristicas： <221> Nome/Chave: CDS <222> Localizagao： (1)

(1251)

<400> Seqiiencia： atg aat caa caa

Met 1

Asn Gln Gln

13 gtc Val 5

ate lie

acg

Thr

ctg Leu

acg Thr

cat His 10

cct Pro

tea Ser

aaa

Lys

aaa

Lys

ata

lie 15

cag Gln

48

ggt Gly

acg Thr

gtt Val

caa Gln 20

ctc Leu

aca

Thr

ggt Gly

tea Ser

aaa

Lys 25

tct Ser

gag Glu

age Ser

aac Asn

cgt Arg 30

get

Ala

ctt Leu

96

att lie

ate

lie

cag

Gln 35

tea Ser

ttg Leu

age Ser

aaa

Lys

gga Gly 40

caa

Gln

gtt

Val

gaa

Glu

ata lie

gcc Ala 45

aac Asn

ctt Leu

tct Ser

144

gaa

Glu

get Ala 50

gca

Ala

gat Asp

acg Thr

gta

Val

acg

Thr 55

tta Leu

aac Asn

cgt

Arg

gtg

Val

cta

Leu 60

caa Gln

att lie

get Ala

tea

Ser

192

t P 5 a S 6 gA

ccg

Pro

aaa

Lys

cca Pro

a y g 1 g G

ttc Phe 70

aac Asn

aca Thr

att lie

gac Asp

ate lie 75

ggt Gly

cca

Pro

gcg Ala

gga Gly

acg Thr 80

240

gcc Ala

atg

Met

cga Arg

ttc Phe

tta Leu 85

acg Thr

get Ala

tac Tyr

ctc Leu

aac

Asn 90

ctt Leu

gtc Val

aaa

Lys

gga Gly

aat Asn 95

ttt Phe

288 gag ggt gaa

Glu Gly Glu

tta Leu 180

acc

Thr

tcc

Ser

aga cct

Arg Pro

ate gcg gca cta

lie Ala Ala Leu

caa Gln 335

aag 1008 Lys

gag

Glu

acc Thr

tta Leu

aaa

Lys

att 工Ie 325

aag

Lys

gag

Glu

act Thr

tea atg acc ttg gat atg 576

Ser Met Thr Leu Asp Met 190

ctg Leu

aaa

Lys

agt

Ser 195

gtc Val

gy

g1 g G

att lie

cag

Gln

cat

His 200

gaa

Glu

tgg Trp

aaa

Lys

aac Asn

aat

Asn 205

gcg Ala

att lie

aaa

Lys

624

att lie

Q- a O

Cll g'A 2

ccg Pro

cag Gln

gca

Ala

ttt Phe

gu5 all gG 2

aaa

Lys

caa

Gln

aca Thr

ata lie

tat Tyr 220

gtc Val

gag Glu

cca Pro

t P a S g A

672

tgg Trp 225

age

Ser

get

Ala

get Ala

tcc Ser

tat Tyr 230

tgg Trp

tac

Tyr

get

Ala

ate

工Ie

C a 5 C 1 3 g A 2

gca

Ala

cta Leu

gca

Ala

gat Asp

a a O C 1 4 g A 2

720

aac Asn

gca Ala

tcg

Ser

ate

lie

a 1 5 t a 4 gv 2

ttg Leu

ccc Pro

gga Gly

tta Leu

aga

Arg 250

aaa

Lys

aac Asn

age

Ser

tta Leu

cag

Gln 255

ggt Gly

768

gat Asp

att lie

get Ala

att lie 260

ata

lie

age Ser

att lie

atg

Met

g U 5

a 1 6 g'G 2

cat His

ttt Phe

ggt Gly

gta Val

caa

Gln 270

tcg

Ser

age

Ser

816

ttt Phe

gaa

Glu

tcg Ser 275

gac Asp

a y g·1 g G

tta Leu

cac His

tta Leu 280

aat Asn

aaa

Lys

aag

Lys

gta Val

ate

lie 285

ggt Gly

tcg Ser

t P a S gA

864

gta Val

age

Ser 290

tta Leu

ttt Phe

aac Asn

ttt Phe

aaa

Lys 295

gaa

Glu

tgt Cys

ccc Pro

gat Asp

ctc Leu 300

gca Ala

caa Gln

act Thr

gta Val

912

t 1 5 t a O g V 3

gtt Val

gtc

Val

gcg Ala

get

Ala

Q- a O

Cll

61A3

tta Leu

aaa Lys

cga Arg

gat Asp

a 1 5 t a 1 g V 3

tct Ser

ttt Phe

acg Thr

ggc Gly

ttg Leu 320

960

ate ctt aca ggt act gaa cgc atg caa cag cgt cct ata ggt ata tta 336 lie Leu Thr Gly Thr Glu Arg Met Gln Gln Arg Pro lie Gly lie Leu 100 105 110

gtt gat gcc atg aaa gaa att ggt gca gac ate cac tat gac aag aaa 384 Val Asp Ala Met Lys Glu 工Ie Gly Ala Asp lie His Tyr Asp Lys Lys 115 120 125

gtc gga tac cct cct ttg aaa att gag ggc ggg ctg ttt caa gaa aaa 432 Val Gly Tyr Pro Pro Leu Lys 工Ie Glu Gly Gly Leu Phe Gln Glu Lys 130 135 140

gac cgt gtc aag att aaa ggt aat ate age age caa tat ata tea gcc 480 Asp Arg Val Lys lie Lys Gly Asn lie Ser Ser Gln Tyr lie Ser Ala 145 150 155 160

ctc tta tta att gca cct gca tta aaa aaa ggg ctt act tta gag att 528 Leu Leu Leu lie Ala Pro Ala Leu Lys Lys Gly Leu Thr Leu Glu lie 165 170 175

tat gta

1 a

V

r 5 y 8 T 1 acc tac 1056 Thr Tyr

ttc gat 1104 Phe Asp

gaa

Glu

att

lie

gcg Ala

aaa

Lys 340

ttt

Phe

a y g1 g G

gcc Ala

gag Glu

cta Leu 345

att

lie

gaa Glu

aat Asn

cat

His

tta Leu

cag

Gln

σ- a O

Cll

gA4

caa

Gln

get

Ala

ttt

Phe

gtc

Val

att

工Ie

415

gaa

Glu

1248

tat cct gat ttt Tyr Pro Asp Phe

cag cct gaa gag gtt act

Gln Pro Glu Glu Val Thr 365

cat ctg aaa aca gcg cag

His Leu Lys Thr Ala Gln 355

tag

1251

<210> SEQ ID NO: 14 <211> Comprimento: 416 <212> Tipo： PRT

<213> Organismo： Sphingobacterium multivorum/faecium

<400> Seqiiencia Met Asn Gln Gln 1

Gly

lie

Glu

Asp

65

Ala

lie

Val

Asp 145 Leu

Glu

Leu

lie

Trp 225

Thr Val lie

Ala

50

Pro

Met

Leu

Asp

Gly 130 Arg

Leu

Gly

Lys

Gln

35

Ala

Lys

Arg

Thr

Ala 115 Tyr

Val

Leu

Glu

Ser 195 Pro

Ala 210

Ser Ala

Gln

20

Ser

Asp

Pro

Phe

Gly 100 Met

Pro

Lys

工Ie

Leu 180 Val

Gln

Ala

14 Val 5

Leu

Thr

Gly

Leu

85

Thr

Lys

Pro

lie

Ala 165 Thr

Gly

Ala

lie

Thr

Ser

Val

Phe

70

Thr

Glu

Leu

Lys 150 Pro

Ser

lie

Phe

Ser Tyr 230

Thr

Gly

Lys

Thr

55

Asn

Ala

Arg

lie

Lys 135 Gly

Ala

Arg

Gln

Glu 215 Trp

Leu Thr Ser

Gly

40

Leu

Thr

Tyr

Met

Gly 120 工Ie

Asn

Leu

Pro

His 200 Lys

Lys

25

Gln

Asn

lie

Leu

Gln 105 Ala

Glu

lie

Lys

Tyr 185 Glu

Gln Tyr Ala

His 10 Ser

Val

Arg

Asp

Asn

90

Gln

Asp

Gly

Ser

Lys 170 Val

Trp

Thr

lie

Pro

Glu

Val

lie

75

Leu

Arg

工Ie

Gly

Ser 155 Gly

Ser

Lys

lie

Ala 235

Ser

lie

Leu 60 Gly

Val

Pro

His

Leu 140 Gln

Leu

Met

Asn

Tyr 220 Ala

Lys Lys Asn

Ala

45

Gln

Pro

Lys

lie

Tyr 125 Phe

Tyr

Thr

Asn 205 Val

Arg

30

Asn

lie

Ala

Gly

Gly 110 Asp

Gln

lie

Leu

Leu 190 Ala

Glu Leu Ala

lie

15

Ala

Leu

Ala

Gly

Asn

95

lie

Lys

Glu

Ser

Glu 175 Asp

lie

Pro

Asp

Gln

Leu

Ser

Thr 80 Phe

Leu

Lys

Ala 160 lie

Met

Lys

Asp

Ala 240

act tac gaa gat cat cgc atg gcg atg gcg ttc gca cca ctg gca tta 1152 Thr Tyr Glu Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ala Pro Leu Ala Leu 370 375 380

gtt ttc gac cag att aag att get gaa cct caa gtt gta gaa aaa tea 1200 Val Phe Asp Gln 工Ie Lys 工Ie Ala Glu Pro Gln Val Val Glu Lys Ser 385 390 395 400

gat ggc gat Asp Gly Asp 350

tgg

Trp 405 Asn

Asp

Phe

Val

Val 305 Glu

Glu

His

Thr

Val 385 Tyr

Ala

lie

Glu

Ser 290 Val

Thr

lie

Leu

Tyr 370 Phe

Ser lie Ala

Ser 275 Leu

Val

Leu

Ala

Lys 355 Glu

Asp

Pro Asp

lie 260 Asp

Phe

Ala

Lys

Lys 340 Thr

Asp

Gln

Phe

Val 245 lie

Gly

Asn

Ala

工Ie 325 Phe

Ala

His

lie

Trp 405

Leu

Ser

Leu

Phe

Ala 310 Lys

Gly

Gln

Arg

Lys 390 Asn

Pro

lie

His

Lys 295 Leu

Glu

Ala

Val

Met 375 lie

Gly Leu Met

Leu 280 Glu

Lys

Thr

Glu

Tyr 360 Ala

Ala His Leu

Glu 265 Asn

Cys

Arg

Asp

Leu 345 Gln

Met

Glu

Gln

Arg

250 His

Lys

Pro

Asp

Arg 330 lie

Pro

Ala

Pro

Ala 410

Lys

Phe

Lys

Asp

Val 315 lie

Glu

Phe

Gln 395 Gln

Asn

Gly

Val

Leu 300 Ser

Ala

Asp

Glu

Ala 380 Val

Ser

Val

lie 285 Ala

Phe

Ala

Gly

Val 365 Pro

Leu Gln Gly 255

Ser Ser

Val Ala Phe

Gln 270 Gly

Gln

Thr

Leu

Asp 350 Thr

Leu

Glu

Val

Ser Asp

Thr Val

Gly Leu 320 Gln Lys 335

Thr Tyr

Phe Asp

Ala Leu

Lys Ser 400 lie Glu 415

<210> <211> <212> <213>

SEQ ID NO: 15 Comprimento: 431 Tipo: PRT

Organismo: Enterobacteriaceae sp.

<400> Met 1

Pro

Seqiiencia ； Val Thr

Ala

Lys

Gln

65

Ala

Thr

Gly

His

lie 145 Ser

Ala

lie

Glu

Asp 225 Gly

Lys Ala Ser Lys

Ala

50

Pro

Ser

Leu 130 Gln

Ser

Asp

Asn 210 Glu

Gly

35

Ala

Asp

Phe

lie

Leu 115 Gly

Gly

Gln

Asp

Leu 195 Arg

Thr Ala Phe

Lys

20 lie

Arg

Gly

lie

Val 100 Val

Val

Pro

Phe

Val 180 Thr

Asn

Lys

Leu

15 lie 5

Ser

Asp

Ser

Asp

85

Ala

Thr

Lys

Leu

Leu 165 Ala

Leu

Tyr

Met

Leu

Gln

Ser

Glu

lie

Leu

70

Cys

Leu

Arg

Val

Lys 150 Thr

lie

Asp

Glu

Gln 230 Val

Pro

Met

lie

Val

55

Gln

Gly

Ser

Pro

Lys 135 Pro

Gly

Lys

Val

Glu 215 Arg

Gly Asp Gln

lie

40

Ser

lie

Glu

Lys

Met 120 Ser

Ala

Leu

Val

Met 200 Phe

Tyr Ala Gly

Arg

25

Asn

Arg

Thr

Ser

Glu 105 Asp

Asn

Asp

Leu

Thr 185 Lys

Tyr

Thr

Ala

Leu 10 Ala

Pro

Leu

Ser

Gly

90

Glu

Phe

Gln

Val

Leu 170 Asn

Arg

Phe

Val

lie

Thr

Cys

Gly

Glu

75

Leu

Val

Phe

Gly

Thr 155 Ala

Leu

Phe

Lys

Glu 235 Ala

Gly

Ala

His

Ala 60 Gly

Ser

Thr

Asp

Lys 140 Val

Tyr

Lys

Gly

Ala 220 Gly

lie

Ala

Ser

45

Arg

Val

lie

Glu 125 Leu

Asp

Ala

Ser

Leu 205 Gly

Leu Gln Ser 15

Leu Val

Asp

Gly Pro

Ala

30

Asn

Leu

Lys

Arg

Lys 110 lie

Pro

Gly

Ala

Arg 190 Lys

Asn

Trp

lie

Asp Asp

Glu Asp

Pro Val 80

Met Phe 95

Gly Ser

Leu Pro

Leu Val

Ser Leu 160 Ala Asp 175

Pro Tyr

Thr Pro

Val Tyr

Ser Gly 240 Thr Val Arg

Ala

Lys

Cys 305 Gly

Asp

lie

Lys

Cys 385 Ala

Gly Leu Leu

Leu

290 Pro

Glu

Arg

His

Gly 370 Ala

Glu Gln Leu

Met 275 His

Asp

Thr

Gly

Leu 355 Ala

Val

Ala

Gly

Asp

260 Ser

Pro

Leu

Lys

Leu 340 Glu

Glu

Ala

Val

Gly 420

245 lie

Ala

Phe

工Ie 325 Thr

Ala

Asn

Asp

Pro 310 Lys

Ser Thr Ala

Leu

Gly Asp

Val Ser

Ala Leu 390 Asn Lys 405

Val Val

Leu 295 Pro

Gly

Gln

Leu

Ser 375 Lys

Ser

Gly 280 Asn

Leu

Val

Asp

Met 360 Arg

Ala

Tyr

Leu

Gln 265 lie

Ala

Val

Ser

Glu 345 Arg

His

Val

Pro

Asn 425

250 Ala

Ala

Phe

Ala

Arg 330 Phe

Val

Asp

Gly

Asp 410 His

Asp Lys Ala lie Asp

Glu Phe 300 Leu Ala 315

Leu Ala

Gly Lys

lie Gly

His Arg 380 Glu Thr 395

Phe Tyr

Ala 285 Asp

Ser

His

Met

Gly 365 lie

Thr Ser Gln Phe Asn

lie 270 Lys

Ala

Tyr

Lys

Gly 350 Lys

Ala

lie

Asp

Phe 430

255 Val

Glu

Thr

Cys

Glu 335 Val

Gln

lie

Asp

Lys 320 Ser

Glu

Gly Val

Met Ala

Glu His 400 Leu Lys 415 Ser

<210> SEQ ID NO: 16 <211> Comprimento: 418 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo ： Pseudomonas syringae cepa 1448a

<400> Sequencia: Met Arg Pro Gln

1

Val

Leu

Gly

65

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Gly

Asp

Pro

Ser 145 Gly

Leu

Thr

Ala

Trp 225

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Lys

50 Val

Gly

Thr

Phe

Leu 130 Gly

Arg

Leu

Gly

Met 210 Lys

Leu

35 Ser

Gln

His

Ala

Val 115 Val

Cys

lie

Met

Ser 195 Gln

Val 20 Ala

Asp

Val

Trp

Thr 100 Val

Asp

Pro

Glu

Ala 180 Glu

Ala Val Ser

16 Ala 5

Ser

Gly

Asp

Gln

85

Arg

Asp

Ala

Pro

lie 165 Gly

lie

Phe

Ala

Thr

Pro

Leu

Thr

Glu

70

Ala

Phe

Gly

Leu

Val 150 Asp

Ala

Gly

Thr 230

Leu

Pro

Ala

Arg

55

Pro

Leu

Asp

Gln 135 Ala

Gly

Cys

Ala

Ala 215 Gly

Thr Val Gly

Lys

40

Val

Asp

Gln

Thr

Glu 120 Arg

lie

Asn

Gly

Arg 200 Glu

Ser

25 Gly

Met

Asp

Gln

Ala 105 Tyr

Met

Lys

Leu

Lys 185 Gly

Val Tyr Arg

Leu

10 Lys

Thr

Ser

Ala

90

Ala

Met

Gly

Ser 170 Gly

Tyr

Gln

Ala

Pro Val Glu Arg Ser Ser Glu

Thr

75

Leu

Arg

Val

Lys 155 Ser

Pro

Val

Ala

Thr 235

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Arg Leu Thr 45

Ala Leu Arg 60

Phe Val Val

Phe Leu Gly

Ala Asn Phe 110

Lys Arg Pro 125

Glu Val Ser 140

Gly Gly Leu

Gln Tyr Val

Val Glu Val 190

Asp Leu Thr

205 lie Gly Glu 220

Asp Phe His

Pro Leu

15

Arg Ala

Gly Ala

Leu Met

Thr Ser 80

Asn Ala 95

Glu Gly

lie Gly

Ala Pro

Glu Ala 160 Ser Ala 175

Ala Leu

Leu Ala

Thr Ala

lie Glu 240 Pro Asp

Glu Gly

Asp Ala

Val 工Ie 290 Leu Ala 305

Leu Arg

Cys Ala

Val His

Asp Thr 370 Leu Lys 385

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Ala

Asp

Leu 275 Asp

Ala

Val

lie

Ala 355 His

lie

Pro

Ser

lie 260 Ala

Gly

Phe

Lys

Ala 340 Asn

Ser

Ala

Gly

Ala 245 Asp

Ser

Asn

Glu 325 Pro

Pro

Asp

Gly

Tyr 405

Ala

Leu

Gln

Arg 310 Cys

Gly

Ala

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Gly

lie

Met 295 Gln

Asp

Leu

Arg 375 Arg

Asp

Tyr

Val

lie 280 Gln

Pro

Arg

Ala

Ala 360 lie

lie

Ala

Leu

Ala 265 Ala

Asp

Val

lie

Val 345 Gly

Ala

Leu

Trp 250 Ser

Ser

Ala

Arg

Ser 330 Glu

Thr

Met

Asp

Ala 410

Ala

Asp

Phe

lie

Phe 315 Ala

Glu

Thr

Cys

Pro 395 Ser

Ala

Pro

Pro 300 Val

Leu

Gly

Val

Phe 380 Asp

Leu

Gln

Phe

Asn 285 Thr

Gly

Ser

Asp

Asp 365 Ala

Cys

Gly

Ala

Thr 270 Met

Leu

lie

His

Asp 350 Ala

Leu

Val

Leu Thr 255

Gln Pro

Pro Ala

Ala Val

Ala Asn 320 Gly Leu 335

Leu Leu

Leu lie

Ala Gly

Gly Lys 400 Arg Val 415

<210> SEQ ID NO: 17 <211> Comprimento： 418 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo ： Pseudomonas syringae cepa DC3 000

<400> Seqiiencia: Met Arg Pro Gln 1

Val

Leu

Gly

65

Ser

Gly

Asp

Pro

Ser 145 Gly

Leu

Thr

Ala

Trp

Gly Arg Leu

Lys

50

Val

Gly

Thr

Phe

Leu 130 Gly

Arg

Leu

Gly

Met 210 Lys

Leu

35 Ser

Gln

His

Ala

Val 115 Val

Cys

lie

Met

Ser 195 Gln

Val 20 Ala

Asp

Val

Trp

Thr 100 Val

Asp

Pro

Glu

Ala 180 Glu

Ala Val Ser

17 Ala

5 Ser

Gly

Asp

Gln

85

Arg

Asp

Ala

Pro

lie 165 Gly

lie

Phe

Ala

Thr

Pro

Leu

Thr

Glu

70

Ala

Phe

Gly

Leu

Val 150 Asp

Ala

Gly

Thr

Leu

Pro

Ala

Arg

55

Pro

Leu

Asp

Gln 135 Ala

Gly

Cys

Ala

Ala 215 Gly

Thr Val Gly

Lys

40

Val

Asp

Gln

Thr

Glu 120 Arg

lie

Asn

Gly

Arg 200 Glu

Ser

25 Gly

Met

Asp

Gln

Ala 105 Tyr

Met

Lys

Leu

Lys 185 Gly

Val Tyr His

Met 10 Lys

Thr

Ser

Ala

90

Ala

Met

Gly

Ser 170 Gly

Tyr

Gln

Ala

Pro

Ser

Glu

Thr

75

Leu

Arg

Val

Lys 155 Ser

Ser

Val

Ala

Thr

Val

工Ie

Arg

Ala 60 Phe

Phe

Ala

Lys

Glu 140 Gly

Gln

Leu

Asp

lie 220 Asp

Glu Arg Thr

Leu

45

Leu

Val

Leu

Asn

Arg 125 lie

Gly

Tyr

Glu

Leu 205 Gly

Asn

30

Thr

Arg

Val

Gly

Phe 110 Pro

Ser

Leu

Val

Val 190 Thr

Asp

Phe His

Pro Leu 15

Arg Ala

Gly Ala

Leu Met

Thr Ser 80

Asn Ala 95

Glu Gly

工Ie Gly

Ala Pro

Gln Ala 160 Ser Ala 175

Ala Leu Leu Ala Ala Ala lie Glu 225 Pro

Glu

Asp

Val

Leu 305 Leu

Cys

Val

Asp

Leu 385 Thr

Asp

Gly

Ala

lie 290 Ala

Arg

Ala

His

Thr 370 Lys

Ala Ser Asn

Tyr Gln Arg

Leu 275 Asp

Ala

Val

lie

Ala 355 His

lie

Pro

lie 260 Ala

Gly

Phe

Lys

Ala 340 Asn

Ser

Lys

Gly

Ala 245 Asp

Ser

Asn

Glu 325 Pro

Pro

Asp

Gly

Tyr 405

230 Ala

Leu

Gln

Arg 310 Cys

Gly

Ala

His

工Ie 390 Trp

Thr

Gly

lie

Met 295 Gln

Asp

Leu

Arg 375 His

Tyr Leu

Val

lie 280 Gln

Pro

Arg

Ala

Ala 360 lie

lie Asp Ala

Ala 265 Asp

Asp

Val

lie

Val 345 Gly

Ala

Gln

Leu

Trp 250 Ser

Ser

Ala

Arg

Ser 330 Glu

Thr

Met

Asp

Ala 410

235 Ala

Asp

Phe

lie

Phe 315 Ala

Glu

Thr

Cys

Pro 395 Ser

Ala

Pro

Pro 300 Val

Leu

Gly

Val

Phe 380 Asp

Gln

Phe

Asn 285 Thr

Gly

Cys

Asp

Asn 365 Ala

240

Ala Leu Thr 255

Gln Pro

Cys Leu Gly

Thr 270 Met

Leu

lie

Asp

Asp 350 Ala

Leu

Val

Pro Ala

Ala Val

Ala Asn 320 Gly Leu 335

Leu lie

Leu 工Ie

Ala Gly

Ala Lys 400 Ser Val 415

<210> SEQ ID NO: 18 <211> Comprimento： 418 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Pseudomonas syringae cepa B728

<400> Seqiiencia： Met Arg Pro Gln 1

Val Gly Arg Leu Leu

Leu Lys

50 Gly Val 65

Ser Gly

Gly Thr

Asp Phe

Pro Leu 130 Ser Gly 145

Gly Arg

Leu Leu

Thr Gly

Ala Met 210

Leu

35

Ser

Gln

His

Ala

Val 115 Val

Cys

lie

Met

Ser 195 Arg

Val 20 Ala

Asp

Val

Trp

Thr 100 Val

Asp

Pro

Glu

Ala 180 Glu

18 Ala

5 Ser

Gly

Asp

Gln

85

Arg

Asp

Ala

Pro

lie 165 Gly

lie Ala Phe

Thr

Pro

Leu

Thr

Glu

70

Ala

Phe

Gly

Leu

Val 150 Asp

Ala

Gly

Leu

Pro

Ala

Arg

55

Pro

Leu

Asp

Gln 135 Ala

Gly

Cys

Ala

Ala 215

Thr Val Gly

Lys

40

Val

Asp

Gln

Thr

Glu 120 Arg

lie

Asn

Gly

Arg 200 Glu

Ser

25

Gly

Met

Asp

Gln

Ala 105 Tyr

Met

Lys

Leu

Lys 185 Gly

Leu

10 Lys

Thr

Ser

Ala

90

Ala

Met

Gly

Ser 170 Gly

Tyr

Val Gln

Pro

Ser

Glu

Thr

75

Leu

Arg

Val

Lys 155 Ser

Pro

Leu

Ala

Val

lie

Arg

Ala 60 Phe

Phe

Ala

Lys

Glu 140 Gly

Gln

Val

Asp

lie 220

Glu Arg Thr

Leu

45

Leu

Val

Leu

Asn

Arg 125 Val

Gly

Tyr

Glu

Leu 205 Gly

Asn

30 Thr

Arg

Val

Gly

Phe 110 Pro

Ser

Leu

Val

Val 190 Thr

Pro Leu 15

Arg Ala

Gly Ala

Leu Met

Thr Ser 80

Asn Ala 95

Glu Gly

lie Gly

Ala Pro

Glu Ala 160 Ser Ala 175

Ala Leu

Leu Ala Asp Ala Ala Trp 225 Pro

Glu

Asp

Val

Leu 305 Leu

Cys

Val

Asp

Leu 385 Thr

Lys

Asp

Gly

Ala

lie 290 Ala

Arg

Ala

Thr

Thr 370 Lys

Tyr Gln Arg

Val

Ala

Leu 275 Asp

Ala

Val

工Ie

Ala 355 His

lie

Pro

Ser Ala Ser

lie 260 Ala

Gly

Phe

Lys

Ala 340 Asn

Ser

Ala

Gly

Ala 245 Asp

Ser

Asn

Glu 325 Pro

Pro

Asp

Gly

Tyr 405

Thr 230 Ala

Leu

Gln

Arg 310 Cys

Gly

Thr

His

lie 390 Trp

Gly

Thr

Gly

lie

Met 295 Gln

Asp

Leu

Arg 375 Arg

Tyr

Val

lie 280 Gln

Pro

Arg

Ala

Ala 360 lie

Arg Ala Leu

lie Asp Ala

Ala 265 Ala

Asp

Val

lie

Val 345 Gly

Ala

Leu

Trp

250 Ser

Ser

Ala

Arg

Ser 330 Glu

Thr

Met

Asp

Ala 410

Thr 235 Ala

Asn

Phe

lie

Phe 315 Ala

Glu

Thr

Cys

Pro 395 Ser

Asp

Ala

Pro

Pro 300 Val

Leu

Gly

Val

Phe 380 Asp

Phe

Gln

Phe

Asn 285 Thr

Gly

Ser

Asp

Asp 365 Ala

His 工Ie Ala

Cys Leu Gly

Thr 270 Met

Leu

lie

Asn

Asp 350 Ala

Leu

Val

Leu

255 Gln

Pro

Ala

Gly 335 Leu

Leu

Ala

Ser 415

Glu 240 Thr

Pro

Ala

Val

Asn 320 Leu

lie

Gly

Lys 400 Val

<210> SEQ ID NO: 19 <211> Comprimento: 419 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo ： Brevundomonas vesicularis

<400> Met 1

Leu

Seqiiencia: Met Gly

Ala

Met

65

Gly

Ala

Gly

Glu 145 Ala

Ala

Leu

Ala

Met

Thr Gly Leu

Leu

50

Gly

Ser

Gly

Lys

Pro 130 Thr

Ser

Leu

Ala

Leu

35

Lys

Val

Gly

Thr

Val 115 Leu

Gly

Arg

Leu

Gly 195 Met

Arg 20 Leu

Ser

Thr

Lys

Ala 100 lie

Val

Cys

Val

Met 180 Glu

Arg

19 Arg 5

Ala

Asp

lie

Leu

85

Thr

Val

Asp

Pro

Gln 165 Met

His

Ala

Met

Gly

Asp

70

Gln

Arg

Asp

Ala

Pro 150 lie

Ala

lie

Phe

Lys

Pro

Leu

Thr

55

Glu

Pro

Phe

Gly

Leu 135 Val

Asp

Ala

Gly

Leu Thr Pro

Ala

40

Arg

Pro

Leu

Asp 120 Arg

Thr

Gly

Ala 200 Ala

Gly

25

Lys

Tyr

Asp

Ala

Thr 105 Ala

Ser

lie

Gly

Gly 185 Leu

Lys

lie

10

Ser

Gly

Met

Asp

Ala

90

Ala

His

Leu

Asn

Leu 170 Asp

Gly

Val

lie

Lys

Thr

Ala

Thr

75

Pro

Ala

Met

Gly

Gly 155 Ser

Arg

Tyr

Glu

Pro

Ser

Glu 60 Thr

Leu

Ala

Arg

lie 140 Thr

Ser

Ala

lie

Arg

Pro Gly lie

Arg

45

Ala

Phe

Ala

Lys 125 Asp

Gly

Gln

Val

Asp 205 Val

Thr

30

Leu

lie

Leu

Leu 110 Arg

Ala

Arg

Tyr

Asp 190 Leu

Lys

15 Asn

Thr

Arg

Val

Gly

95

Val

Pro

Ser

Phe

Val 175 Val

Thr Ser Pro

Pro

Arg

Gly

Ala

Lys 80 Asn

Asp

lie

Ala

Glu 160 Ser

Glu

Val

Val Ala 225 Glu

Ser

Pro

Ala

Val 305 Asn

Leu

lie

Gly 385 Lys

210 Trp

Pro

Gly

Asp

Val 290 Leu

Leu

Ser

lie

Asp 370 Leu

Thr Tyr Glu

Arg

Asp

Gly

Ala 275 lie

Ala

Arg

Ala 355 Ser

Lys

Phe

Asp

Val Glu Ala

Lys

260 Lys

Asp

Ala

Val

工Ie 340 Ser

Phe

lie

Pro

Ser 245 lie

Ala

Gly

Phe

Lys 325 Val

Asp

Ala

Gly

Ser 405

Pro 230 Ala

Asp

Tyr

Ser

Asn 310 Glu

Pro

Asp

Gly 390 Tyr

215 Thr

Ala

Leu

Asp

Gln 295 Glu

Cys

Asn

Ser

His 375 lie

Gly

Thr

Gly

Leu 280 Met

Met

Asp

Leu

Leu 360 Arg

Thr Trp Asn

Tyr His Tyr

Thr 265 lie

Gln

Pro

Arg

Gly 345 Ala

lie

工Ie

Val

Leu 250 Pro

Ser

Asp

Val

lie 330 Thr

Gly

Ala

Leu

Leu 410

Ala 235 Trp

Ala

Lys

Ala

Arg 315 Arg

Asp

395 Ser

220 Ala

Ala

Glu

Phe

lie 300 Phe

Asp

Ala

Gln

Pro 285 Pro

Glu Lys 工Ie Met

Val Ala Leu Glu Gly

Ser 380 Pro

Leu 365 Phe

Asp Ser Leu

Phe Val lie 240

Glu Val Leu

255 Phe Ser Gln 270

His Leu Pro

Thr Leu Ala

Gly 工Ie Glu 320

Ser Ser Gly 335

Asp Asp Leu 350

Thr Ala Glu

Ala Leu Ala

Cys Val Ala 400

Gly Val Ala 415

<210> SEQ ID NO: 20 <211> Comprimento： 425 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo： Agrobacterium tumefaciens cepa C58

<400> Sequencia： Met 工Ie Glu Leu 1

Val

Ala

Asp

Val

65

Leu

Thr

lie

Gln

Pro 145 Val

Met

Glu

Glu Pro Gly

Asp

50

Thr

Gln

Arg

Asp

Ala 130 Pro

Thr

Ala

Glu

Leu

35 Thr

Glu

Gln

Phe

Gly 115 Leu

Val

lie

Ala

lie 195

Pro 20 Ala

Leu

Pro

Leu 100 Asp

Arg

Thr

Asp

Ala 180 Gly

：20 Thr 5

Gly

Lys

Tyr

Asp

Glu

85

Thr

Glu

Ala

Val

Ala 165 Cys

lie

Ser

Gly

Met

Ala

70

Lys

Ala

His

Leu

Arg 150 Asn

Gly Ala Lys

Thr

Lys

Ala

55

Thr

Pro

Ala

Met

Gly 135 Gly

Leu

Asp

Gly

Pro Pro

Ser

40

Glu

Thr

Leu

Gly

Arg 120 Val

Lys

Ser

Lys

Tyr 200

lie

25

His

Ala

Phe

Ala 105 Lys

Glu

Gly

Ser

Pro 185 lie

Gly 10 Thr

Leu

Val

Leu

90

Leu

Arg

Ala

Met

Gln 170 Val

His

Asn

Ser

Arg

Val

75

Gly

Val

Pro

Asp

Gly 155 Tyr

Pro Leu

Arg Ala

Gly Ala

45 Glu Met 60

Glu Gly Asn Ala Asp Gly lie

Asp

Asp Leu

Ala 140 Phe

Val

lie

Thr

Leu

125 Pro

Pro

Ser

lie

Thr 205

Ser Gly Lys 15

Leu Leu

Leu

30 Leu

Gly

Thr

Gly

Ala 110 Pro

Thr

Lys

Ala

Leu 190 Ser

Lys Ser

Val Lys

Gly Val 80 Thr Ala 95

Val lie

Leu Val

Gly Cys

Gly Ser 160 Leu Leu 175

Lys Gly Ala Met Glu

Val 225 Ala

Ala

Lys

Asp

Ala 305 Val

Ala 210 His

Ser

lie

Ala

Gly 290 Phe

Lys 工Ie Arg Ala Asp

Phe Ala 370 lie Gly 385

Pro Gly

Phe

Pro

Ala

Asp

Tyr 275 Ser

Asn

Glu

Pro 355 Asp

Gly Tyr Lys Glu Ser

Gly

Thr

Ala

工Ie 260 Glu

Gln

Glu

Cys

Gly 340 Ser

His

工Ie

Trp

Ala 420

Ala Lys Gly

Thr 245 Gly

Val

Met

Thr

Asp 325 Leu

Leu

Arg

Ala

Lys 405 Ala

Tyr 230 Tyr

Thr

Met

Gln

Pro 310 Arg

Ala

工Ie

lie 390 Ala

Val 215 Thr

Leu

Pro

Ala

Asp 295 Val

工Ie

His

Gly

Ala 375 Gln

Leu

Glu Pro

Glu

Ala

Trp

Ala

Gln 280 Ala

Arg

Glu

Gln 360 Met

Asn

Ala

Gln

Arg

Thr

Gly

Asp 265 Phe

lie

Phe

Ala

Glu 345 Thr

Ser

Pro

Ser

His 425

Val Ser Asp

Ala 250 Lys

Pro

Val

Val 330 Gly

Val

Phe

Ala

Leu 410

Phe 235 Glu

Phe

His

Thr

Gly 315 Ser

Asp

Ala

Cys 395 Gly

Asn

220 His

Leu

Thr

Leu

lie 300 lie

Leu

Asp

Ala

Leu 380 Val

Ala

lie

Leu

Gln

Pro 285 Ala

Ala

Gly

Leu

Ser 365 Ala

Ala Val Asp

lie

Glu

Thr

Pro 270 Ala

Val

Asn

Leu

lie 350 lie

Ala

Lys

Tyr

Trp Arg Pro

Gly 255 Asp

Glu

lie

Leu

Asn 335 Val

Asp

Leu

Thr

Thr 415

Poy a e a O-Ou S r S r O U S 4 1 1 1 1 r 2 1 i h y Yol A 2 G A I A A 3 G H T L T 4 G

<210> SEQ ID NO: 21 <211> Comprimento： 428 <212> Tipo: PRT <213 > Organismo

<400> Seqilencia: Met Asn Cys Val 1

lie

Leu

lie

Glu

65

Val

Phe

Asn

Val 145 Leu

Leu

Glu

Pro Pro

Ser

Lys

50

Asp

Ser

Arg

Asp

lie 130 Leu

Pro

Ser

Glu

35

Ala

Lys

Phe

Gly 115 Phe

Pro

Gly

Phe

Val

Clostridium acetobutylicum Cys

Ser

20

Glu

Thr

Lys

Glu

Leu 100 Gln

Asp

Leu

Asn

Leu 180 Gly

21 Lys 5

Lys

Glu

Cys

Asp

Lys

85

lie

Gly

Glu

Gln

lie 165 Glu

lie

Ser

lie

Asn

70

Val

Pro

Lys

lie 150 Ser

Gly Tyr Val

Asn

Leu

Thr

Gly

55

Ser

Tyr

lie

Leu

Glu 135 Lys

Ser

Asp

Pro

Gly

lie

40

Met

Thr

lie

Ser

Ser 120 lie

Gly

Gln

Ser

Met

His

25

Glu

Ser

Leu

Asp

Leu 105 Tyr

Ala

Arg

Phe

工Ie 185 Thr

Cys 10 Arg

Asn

Lys

Cys

90

lie

Arg

Tyr

Leu

工Ie 170 lie

Leu

Ala

lie

Leu

lie

75

Ser

Glu

Pro

Ser

Lys 155 Ser

Asn

lie Asp

Lys

lie

Ser

Gly 60 Lys

Glu

Leu

His 140 Ala

Gly

lie

Met

Gly Asp lie

Tyr

45

Ala

Lys

Ser

Arg

Asp 125 Pro

Gly

Leu

Thr

Leu

Cys

30

Ser

Leu

Gln

Gly

Asn 110 Ser

Glu

Met

Thr 190 Lys

lie

15

Ala

Lys

lie

Lys

Ser

95

Val

Tyr

Gly

Phe

Phe 175 Asn

Lys

Ala

Asp

lie

Leu 80 Thr

Val

Phe

Lys

Asn 160 Ser

Leu Lys Phe Gly

Asn 225 Gln

Cys

Asp

Ser

Pro 305 Thr

Arg

Val

Gly

Gly 385 Glu

lie 210 Gln

Ala

Lys

lie

Lys 290 Asp

Thr

Leu

Glu

Gly 370 lie

Cys Leu Gly

195 Glu

Lys

Ala

Asp

Leu 275 Lys

Leu

Lys

Leu 355 Glu

Ala

Val

Gly

lie

Cys

Phe

Leu 260 Lys

Ser

Val

lie

Ala 340 Glu

Val

Ala

Ser

Asp 420

Glu

Lys

Trp 245 Asn

Lys

His

Pro

Val 325 Met

Asp

Glu

Leu

Lys 405 Val

200

Asn Lys Ala

215 Gly Thr Lys 230

Leu Ser Ala

lie Ser Ser

Met Gly Gly 280

Thr His Gly

295 lie Leu Ser 310

Asn Ala Ala

Ala Thr Glu

Gly Leu Leu 360

Ser Trp Asn

375 Arg Cys Glu 390

Ser Tyr Pro His Glu Trp

Tyr

Gly

Leu 265 Ala

工Ie

Val

Arg

Leu 345 lie

Asp

Glu

Gln

Ser 425

Lys Ser Lys

lie 250 Gln

lie

Val

Leu 330 Asn

Glu

His

Ser

Phe 410 Leu

Val 235 Leu

Gly

Asp

lie

Ala 315 Arg

Lys

Gly

Arg

Val 395 Trp

Phe 220 Glu

Asn

Asp

Glu

Asp 300 Ala

lie

Leu

Lys

lie 380 Thr

Ser Gly Glu

205 Phe

Gly

Lys

Lys 285 Ala

Leu

Lys

Gly

Glu 365 Ala

lie

Asp

lie Lys Gly Asp Asn

Val 270 Ser

Ser

Glu

Ala 350 Lys

Met

Asn

Leu

Phe Ser 240 工Ie Asn 255

lie Leu

Phe Ser

Gln Cys

Glu Gly 320 Ser Asp 335

Glu Val

Leu Lys

Ala Leu

Gly Ser 400 Lys Gln 415

<210> SEQ ID NO: 22 <211> Comprimento: 444 <212> Tipo: PRT

< 213 > Organismo： Ochrobactrum/Brucella

<400> Seqiiencia； Met Ala Cys Leu 1

Pro

Val

Pro

Ala

65

Arg

Pro

Leu

Asp 145 Gly

Pro Cys Thr

Gly

50

Lys

His

Asp

Ala

Thr 130 Glu

Gln Thr Val

Val

35

Ser

Gly

Met

Asp

Gln 115 Ala

Tyr

Asn

His

Leu 20 Thr

Lys

Thr

Ser

Thr 100 Pro

Ala

Met

Gly

Gly 180

22 Pro 5

Asp

Pro

Ser

Val

85

Thr

Leu

Val

Gln

lie 165 Ala

Asp

Gln

Pro

lie

Arg

70

Ala

Phe

Ala

Lys 150 Gln

Asp

Glu

Asn

Thr

55

Leu

Val

Leu

Thr 135 Arg

Ser Gly Pro

Val Gly Lys

Phe

40

Asn

Ser

Arg

Val

Gly 120 Val

Pro

Asp

Val

Cys

25

Pro

Arg

Gly

Gln

Thr 105 Asn

Gln

lie

Ser

Gln 185

Pro 10 Thr

Leu

Ala

Met

90

Ser

Ala

Gly

Pro 170 Ala

His

Leu

Thr

Leu

75

Gly

Gln

Gly

Thr

Pro 155 Thr

Val

Ser

Gly

Leu 60 Lys

Val

Gly

Thr

Val 140 Leu

Gly Arg Arg

Gly

Ser

Lys

45

Leu

Ser

Thr

Ser

Ala 125 Val

Leu

Cys

Phe

His Ser Thr 15

Gln Lys Thr 30

Val Ala Pro

Ala Ala Leu

Asp Asp Thr 80

lie Asp Glu 95

Leu Gln Leu 110

Met Arg Phe

Leu Asp Gly

Ala Thr Leu 160

Pro Pro Val 175

Glu 工Ie Asp 190 Gly Gly Cys

Ala 225 Ala

Gly

Thr

Gly

Val 305 Met

Thr

Asp

Leu

Leu 385 Arg

Arg

Lys

Gly 210 Arg

Gln

Tyr

Val 290 lie

Gln

Pro

Arg

Ala 370 Ala

lie

Ala

Leu 195 Glu

Gly

Val

Thr

Leu 275 Ala

Ala

Asp

Val

Val 355 Thr

Gly

Ala

Gln

Leu 435

Ser

Ala

Tyr

Asp

Ala 260 Trp

Ala

Gln

Ala

Arg 340 Gln

工Ie

Thr

Met

Asp 420 Ala

Ser

Pro

Val

lie 245 His

Ala

Gln

Phe

工Ie 325 Phe

Ala

Glu

Ala

Cys 405 Pro

Gln Tyr lie

Asp 230 Val

Asp

Ala

Asp

Pro 310 Pro

Thr

Leu

Gly

Cys 390 Phe

Asp Ser Leu

Glu 215 Leu

Asp

Tyr

Glu

Phe 295 Asn

Thr

Glu

His

Asp 375 Thr

Ala

Cys

Gly

Val 200 Val

Thr

Asp

Leu

Val 280 Thr

Met

Leu

Asp 360 Asp

Ala

Leu

Val

Val 440

Ser

Ala

Leu

Thr

lie 265 Leu

Gln

Ala

Ala 345 Gly

Leu

Ala

Ala 425 His

Ala

Leu

Asp

Thr 250 Glu

Thr

Pro

Ala

Val 330 Asn

Leu

lie

Gly 410 Lys

Leu Leu

Thr

Cys 235 Trp

Pro

Gly

Asp

Thr 315 Leu

Leu

Asn

Val

Asp 395 Leu

Thr Leu Ser

Gly 220 Met

Arg

Asp

Gly

Ala 300 Val

Ala

Arg

Glu

Ala 380 Thr

Lys

Tyr

Met 205 Lys

Arg

Val

Ala

Arg 285 Lys

Val

Ala

Val

工Ie 365 Ser

His

Val

Pro

Leu

Asp

Ala

Ser 270 lie

Ala

Gly

Phe

Lys 350 Arg

Asp

Ala

Ser

Asp 430

Ala Ala

lie Gly

Phe Gly 240 Pro Thr 255

Ala Ala

Asp lie

Gln Ala

Ser Gln 320 Asn Asn 335

Glu Cys

Pro Gly

Pro Ala

Asp His 400 Gly lie 415

Tyr Trp

<210> SEQ ID NO: 23 <211> Comprimento： 42 5 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo ： Agrobacterium tumefaciens cepa C58

<400> Sequencia： Met 工Ie Glu Leu

1

Val

Ala

Asp

Val

65

Leu

Thr

工Ie

Glu

Pro 145 Val

Glu Pro Gly

Asp

50

Thr

His

Arg

Asp

Ala 130 Pro

Leu

35

Thr

Glu

Gln

Phe

Gly 115 Leu

Val Thr lie

Pro

20

Ala

Leu

Pro

Leu 100 Asp

Arg

Thr

Asp

23 Thr 5

Gly

Lys

Tyr

Asp

Glu

85

Thr

Glu

Ser

Val

Ala

lie

Ser

Gly

Met

Ala

70

Lys

Ala

His

Leu

Cys 150 Asn

Thr

Lys

Ala

55

Thr

Pro

Ala

Met

Gly 135 Gly

Pro Pro Ser

Ser

40

Glu

Thr

Leu

Ala

Arg 120 Val

Lys Leu Ser

lie

25

Arg

Ala

Phe

Ala 105 Lys

Glu

Gly

Ser

Gly 10 Thr

Leu

Val

Leu

90

Leu

Arg

Ala

Thr

Gln

His

Asn

Thr

Arg

Val

75

Gly

Val

Pro

Glu

Pro

Arg

Gly

Glu 60 Glu

Asn

Asp

lie

Ala 140 Phe

Gly 155

Tyr Val

Leu

Ala

45

Met

Ser

Ala

Gly

Met 125 Pro

Pro

Ser

Ser Gly Lys 15

Leu Leu

Leu

30 Leu

Gly

Ser

Gly

Ala 110 Pro

Thr

Lys

Ala

Lys Ser

Val Lys

Gly Gly 80

Thr Ala 95

Val lie

Leu Val

Gly Cys

Gly Ser 160 Leu Leu Asp Phe

235 Ala Glu 250

Lys Phe Pro His Pro Thr

Arg Phe Val Gly 315

Arg Ala Val Ser 330

Glu Glu Gly Asp 345

Gln Thr Val Asn 360

Met Ser Phe Ala

Asn Pro Ala Cys 395

Ala Ser Leu Gly 410

Gln His 425

solfataricus

Ser Lys 工Ie Ser 10

lie Arg Leu lie 25

Leu Val Leu Ser 40

Leu Gly Val Lys

Leu Glu lie Lys 75

Leu Arg Met Leu 90

lie Asp Ala Asp 105

Gln Ala Leu Ser 120

Leu Thr 工Ie Thr

Asp Glu Ser Ser 155

170

Lys Pro Val Asp 185

Tyr lie Asp Leu 200

Glu Arg Val Ser

lie

Thr

Asn 220 His

Leu

Thr

Leu

lie 300 lie

Leu

Asp

Ala

Leu 380 Val

Val

Gly

Phe

Glu

Val 60 Glu

lie

Glu

Asn

Gly 140 Gln

lie

Thr 205 Ala

lie

Leu

Gln

Pro 285 Ala

Ala

Gly

Leu

Ser 365 Ala

Gly

Glu

lie

Leu

Asp

45

Lys

Arg

Pro

Ser

Tyr 125 Lys

Tyr

Leu 190 Ser

lie

Glu

Thr

Pro 270 Ala

Val

Asn

Leu

lie 350 lie

Ala

Lys

Tyr

lie

Ser

30

Val

Asn

Phe

lie

Leu 110 Gly

Leu

lie

175 Lys

Ala

Trp

Pro

Gly 255 Asp

Glu

Leu

Asn 335 Val

Asp

Leu

Thr

Ser 415

Lys

15

Leu

lie

Asn

lie

Leu

95

Arg

lie

Ser

Gly

Met

Arg

Asp 240 Gly

Ala

lie

Ala

Arg 320 Glu

His

Thr

Lys

Tyr 400 Glu

Ala

Phe

Asp

Ser

Lys 80 Ala

Arg

Ser

Gly 160

Met

Glu

Val 225 Ala

Ala

Lys

Asp

Ala 305 Val

工Ie

Ser

Phe

lie 385 Pro

Ala Ala Glu

Ala 210 His

Ser

lie

Ala

Gly 290 Phe

Lys

Arg

Asp

Ala 370 Gly

Gly Lys Glu

lie 195 Phe

Pro

Ala

Asp

His 275 Ser

Asn

Glu

Asp

Pro 355 Asp

Gly

Tyr

Thr

Ala 180 Gly

Gly

Thr

Ala

lie 260 Glu

Gln

Glu

Cys

Gly 340 Ser

His

lie

Trp

Ala 420

165 Cys

Ala

Gly

Thr 245 Gly

Val

Met

Thr

Asp 325 Leu

Leu

Arg

Ala

Lys 405 Ala

Gly

Lys

Tyr 230 Tyr

Thr

Met

Gln

Pro 310 Arg

Ala

lie

lie 390 Ala

Asp

Gly

Val 215 Thr

Leu

Pro

Ala

Asp 295 Val

lie

His

Gly

Ala 375 Gln

Leu Glu Pro

<210> SEQ 工D NO: 24 <211> Comprimento: 414 <212> Tipo: PRT <213> Organismo： Sulfolobus

<400> Seqiiencia： Met lie Val Lys 1

Pro

Thr

Ala

Glu

65

Leu

Ala

Arg

Phe

Asn 145

Gln Ser Arg

lie

50

Phe

Lys

lie

Pro

Ser 130 Glu

Val

35

Lys

lie

Gly

Leu 115 Ser

Lys 20 Tyr

Ser

Pro

Ser

Gly 100 Asn

Tyr

工Ie Lys

24 lie 5

Ser

Leu

Val

Pro

Ala

85

Glu

Arg

Ser

lie

Tyr

Leu

His

Arg

Glu

70

Thr

Val

lie

Leu

Ser 150

Pro

Ala

Asn

Ala

55

Lys

Thr

Val

Pro 135 Gly 工Ie

Gly

Arg

Leu 335 lie

Leu

Asn

Val 15 工Ie

Ser

Gly

Lys

Asn

95

Lys

Pro

Ser

Gly

Leu

lie 175 Leu

His

Gly

Glu 270 Pro

Ala

Glu

lie

Leu 350 Cys

Val

Pro

Glu

Leu

Tyr

30

lie

Leu

Ser

Cys

Val 110 Arg

Cys

Ser

Gly

Leu

Phe

Val

Tyr

Gly 240 His

Lys

Leu

Leu 320 Gly

Phe

Asn

Gly

Tyr 400

Gly

lie

Tyr

Ala

Thr 80 Glu

Glu

Leu

Ser

Val 160 Leu

Leu

Pro

Lys

Asn

Gly 225 lie

Ser

Asp

lie

Ser 305 Arg

Leu

Gly

Asp

Gly 385 Trp

lie

Pro

Arg

Pro 210 Leu

Thr

lie

Gly

Asp 290 Ala

lie

Tyr

lie

His 370 Val

Tyr Ala

lie

Phe 195 Asn

Ala

工Ie

Val

Arg 275 lie

lie

Lys

Gly

Asn 355 Arg

lie Gln Asp

Ser 180 Gly

Asn

Ser

Thr

Lys 260 Trp

Asp

Ala

Glu

Val 340 Lys

Val

Thr

Leu

Leu 165 Ser

Ser

Leu

Phe

Asn 245 lie

Phe

Asp

Glu

Ser 325 Gly

Gly

Ala

Ser

Leu 405

His

Lys

Asp

Val

Tyr 230 Leu

Phe

Val

Ala

Gly 310 Asp

Ser

Met

Ala 390 Ser

lie

Ser

Val

Glu 215 Ala

Trp

Ser

Lys

Pro 295 Thr

Arg

Glu

Leu

Met 375 Glu

Leu Asn Tyr

Lys 200 Phe

Leu

Glu

Ala 280 Asp

Ser

lie

Val

Asn 360 Ser

Cys Leu Asn

工Ie 185 Phe

Gln

Ser

Pro

Met 265 Lys

Leu

Glu

Lys 345 Ser

Ser

Val

Ala

Gly 170 Leu

Tyr

Gly

Ala

Lys 250 Gly

Asp

Ala

lie

Ser 330 Tyr

Pro

Ala

Gly

Lys 410

Gly

Leu

Gly

Glu

Leu 235 Glu

Ala

Lys

Met

lie 315 lie

Asn

Val

Leu

Lys 395 lie

Ser

Thr

Ser

Val 220 Val

Tyr

Ser

Tyr

Thr 300 Gly

Arg

Ser

Thr

Ala 380 Ser

lie

Lys 205 Ala

Ser

Phe

Ser

Ser 285 lie

lie

Lys

lie

Asp 365 Leu

Asn Ser 工Ie

<210> SEQ ID NO: 25 <211> Comprimento： 424 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo： Fusobacterium nucleatum

<400> Seqiiencia: Met Arg Asn Met 1

Glu

Ala

Ser

Asn

65

Phe

Ser

Asn

Ser

lie 145 Tyr

Val Thr Ser

Asp 50 工Ie

Asp

Gly

Lys

Pro 130 Asn

Ser

35

Asp

Glu

Lys

Ser

lie 115 Tyr

Glu Glu 工Ie

Pro

20

Leu

lie

Lys

Glu

Thr 100 Leu

Phe

Asn

Asp

25 Asn

5 Pro

Ala

lie

Lys

Tyr

85

Leu

Phe

Glu

Lys

Gly

Lys

Pro

Lys

Ala

Asp

70

Leu

Arg

Lys

Asn

lie 150 Asn

Lys

Ser

Gly

Thr

55

Asn

Phe

Gly

Phe 135 Leu

工Ie lie Lys

lie

40

lie

Tyr

Asn

Leu

Lys 120 Asp

Leu lie Ser

Ser

25

Ser

Glu

Leu

Asp

Phe 105 Gly

Lys

Asp

Ser

Lys 10 Val

Lys

Ala

Leu

Ser

90

Pro

Lys

Tyr

Gly

Gln

Ala

Leu

lie

Met

lie

75

Glu

Leu

Gln

Glu 155 Phe

Asp

His

Glu

Lys 60 Asp

lie

Ser

Phe

lie 140 Leu

Lys

Arg

Asn

45

Lys

Gly

Asp

lie

Lys 125 Lys

Lys

lie Thr

Asp

Gly

Asp 255 Tyr Phe

Lys

Glu 225 Tyr

lie

Leu

Leu 305 Arg

Leu

lie

Ser

Ala 385 Val

Ser Leu Leu

Phe 210 Gly

Ser

Lys

lie

lie 290 Lys

Leu

Ser

Asn

Leu 370 Ser

Lys Gly Lys

Glu 195 Gly

Asn

Gln

lie

Asp 275 Leu

Ala

Arg

Lys

Ser 355 Ser

Thr

Lys

工Ie

Pro 180 Ser

lie

Gln

Val

Asn 260 Phe

Asp

Cys

lie

Leu 340 Arg

Ser

Cys

Ser

Tyr 420

165 Leu

Ser

Asn

Thr

Ala 245 Gly

lie

Gly

lie

Lys 325 Gly

Lys

His

Tyr

Tyr 405 Glu

Leu

Ser

lie

Tyr 230 Phe

Leu

Ser

Ser 310 Glu

Phe

Asn

Ser

Glu 390 Pro

Asn

Tyr

lie 215 Lys

Phe Asn Val Glu

Gly Asn 185 lie Asp 200

Asn Asn Ser Gly Leu Val

Glu 295 Lys

Ser

Asp

Phe

Asp 375 Gly

lie 280 Thr

Asn 265 Asp

Pro Lys Glu Asp Arg Leu

Asn

Tyr Leu

Asn 360 His

Glu

Phe

Gly

lie 345 Glu

Arg

lie

Trp

170 Ser

工Ie

Ser

Asn

Ala 250 Ser

Asn

Asp

lie

Leu 330 Glu

lie

Glu 410

Lys

Thr

Tyr

Tyr 235 Asn

Leu

Trp

工Ie

Glu 315 Ser

Lys

Ser

Ala

Leu 395 Val

工Ie

Leu

Lys 220 Gln

Ser

Gln

Thr

lie 300 lie

Ala

Glu

Asn

Met 380 Asp

175

lie 工Ie Lys Gly 190

Cys Leu Asn

Asp

205 Glu

Val

lie

Gly

Lys 285 Pro

Val

Thr

Asp

Asn 365 Thr

Asn Phe Leu

Phe lie lie

Glu Ala Asp 240

Gly Ser Asn

255 Asp Lys Lys 270

Asn Glu Lys

lie Leu Ser

Asn lie Ala 320

Val Gln Glu

335 Ser lie Leu 350

Ser Pro 工Ie

Val Ala lie

Leu Asp Cys 400

Ser Leu Gly 415

<210> SEQ ID NO: 26 <211> Comprimento: 428 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Methanopyrus kandleri

<400> Seqiiencia： Met Lys Arg Val 1

Cys

Ser

Asp

65

Asp

Thr

Leu

Val 145

Pro Pro Leu

Val

50

Val

Ser

Thr

lie

Leu 130 Arg

Cys

35

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu 115 Ala

Pro

20

Asp

Ala

Gly

Arg

Arg 100 Thr

Ala Gly Glu

26 Glu

5 Ser

Gly

Thr

Glu

Ala

85

Leu

Gly

Leu

Glu

Leu

Lys

Ser

Leu

Glu

70

Pro

Gly

Asp

Arg

Tyr 150

Glu

Ser

Thr

Arg

55

Arg

Glu

Cys

Asp

Ser 135 Pro

Gly 工Ie Gly

Glu

40

Leu

Asp

Gly

Ser 120 Leu

Ser

25

Leu

Cys

Glu

Val

Leu 105 Leu

Gly Pro Val

Pro 10 His

Trp

Arg

Ala

Val

90

Ala

Arg

Val

Glu

Arg

Asn

Met

Thr

75

Asp

Ala

Ser

Asp

工Ie 155

Val

Ala

Val

Leu 60 Val

Cys

Leu

Arg

Ala 140 Ser

Arg Gly Leu

Leu

45

Gly

Ser

Gly

Val

Pro 125 Arg

lie

30

Asp

Ala

Gly

Asn

Glu 110 Val

Gly Gly Arg

Thr

15

Ala

Glu

Phe

Ser

95

Gly

Arg

Pro

Val

Ala

Glu

Val

Gly 80 Gly

Thr

Asp

Val

Leu 160 Arg Glu Arg Val Ala Val Tyr Gly Asp Val Ser Ser Gln Phe Val Ser

165 170 175

Ala Leu Leu Phe Leu Gly Ala Gly Leu Gly Ala Leu Arg Val Asp Val

180 185 190

Val Gly Asp Leu Arg Ser Arg Pro Tyr Val Asp Met Thr Val Glu Thr

195 200 205

Leu Glu Arg Phe Gly Val Ser Val Val Arg Glu Gly Ser Ser Phe Glu

210 215 220

Val Glu Gly Arg Pro Arg Ser Pro Gly Lys Leu Arg Val Glu Asn Asp 225 230 235 240

Trp Ser Ser Ala Gly Tyr Phe Val Ala Leu Gly Ala 工Ie Gly Gly Glu

245 250 255

Met Arg 工Ie Glu Gly Val Asp Leu Asp Ser Ser His Pro Asp Arg Arg

260 265 270

lie Val Glu lie Thr Arg Glu Met Gly Ala Glu Val Arg Arg lie Asp

275 280 285

Gly Gly 工Ie Val Val Arg Ser Thr Gly Arg Leu Glu Gly Val Glu Val

290 295 300

Asp Leu Ser Asp Ser Pro Asp Leu Val Pro Thr Val Ala Ala Met Ala 305 310 315 320

Cys Phe Ala Glu Gly Val Thr Arg lie Glu Asn Val Gly His Leu Arg

325 330 335

Tyr Lys Glu Val Asp Arg Leu Arg Ala Leu Ala Ala Glu Leu Pro Lys

340 345 350

Phe Gly Val Glu Val Arg Glu Gly Lys Asp Trp Leu Glu lie Val Gly

355 360 365

Gly Glu Pro Val Gly Ala Arg Val Asp Ser Arg Gly Asp His Arg Met

370 375 380

Ala Met Ala Leu Ala Val Val Gly Ala Phe Ala Arg Gly Lys Thr Val 385 390 395 400

Val Glu Arg Ala Asp Ala Val Ser 工Ie Ser Tyr Pro Arg Phe Trp Glu

405 410 415

Asp Leu Ala Ser Val Gly Val Pro Val His Ser Val 420 425

<210> SEQ ID NO: 27 <211> Comprimento: 436 <212> Tipo： PRT

<213> Organismo： Arthrobacter globiformis <400> Seqiiencia: 27

Met Ala Leu Glu Arg Gly Gln His Gly Arg Ser Arg Arg Leu Phe Gly

10 15

Ala Ser Leu Glu Arg lie Thr Met Glu Thr Asp Arg Leu Val lie Pro

25 30

Gly Ser Lys Ser lie Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ala Ala

40 45

Lys Gly Thr Ser Val Leu Val Arg Pro Leu Val Ser Ala Asp Thr Ser

50 55 60

Ala Phe Lys Thr Ala lie Gln Ala Leu Gly Ala Asn Val Ser Ala Asp 65 70 75 80

Gly Asp Asn Trp Val Val Glu Gly Leu Gly Gln Ala Pro His Leu Asp

85 90 95

Ala Asp lie Trp Cys Glu Asp Ala Gly Thr Val Ala Arg Phe Leu Pro

100 105 110

Pro Phe Val Ala Ala Gly Gln Gly Lys Phe Thr Val Asp Gly Ser Glu

115 120 125

Gln Leu Arg Arg Arg Pro Leu Arg Pro Leu Val Asp Gly 工Ie Arg His

130 135 140

Leu Gly Ala Arg Val Ser Ser Glu Gln Leu Pro Leu Thr lie Glu Ala 145 Ser

Gln

Leu

Thr

Ala 225 lie

Val

Gln

Val

Asn 305 Thr

Asn

Glu

Trp

His 385 Val

Pro

Thr

Gly

Phe

Arg

Leu 210 Thr

Glu

Ser

Gly

His 290 Gly

Leu

lie

Thr

Met 370 Arg

Asp

Gly

Leu

Leu Ala Ala

Val 195 Arg

Val

Pro

Gly

Asp 275 Trp

Asp

Ala

Gly

Asn 355 Arg

Asp

Gly

Phe

Pro 435

Ser 180 Arg

Met

Ser

Asp

Arg 260 Thr

Ala

lie

Ala

His 340 Leu

lie

His

lie

Phe 420 Gly

Gly 165 Gly

lie

Met

Val

Ala 245 Ser

Ser

Pro

Glu

lie 325 Ma

Arg

Tyr

Arg

Thr 405 Asp

150 Gly

Leu

Pro

Arg

Pro 230 Ser

Phe

Asn

Val 310 Ala

Arg

Thr

Pro

lie 390 Leu

Glu

lie

Asn

Asp 215 Pro

Thr

Glu

Phe

Ser 295 Asp

Pro

Leu

Ser 375 Ala

Tyr Glu lie 170

Met Ala Ala 185

Pro Val Ser 200

Phe Gly Leu

Gly Arg Tyr

Ala Ser Tyr 250

Phe Gln Gly 265

Asn Val Leu 280

Val Thr lie

Met Gly Glu

Leu Ala Asp 330

Lys Glu Ser 345

Gly Val Gln 360

Thr Pro His Met Ala Phe

Asp Tyr Leu

155 Glu

Pro

Gln

Glu

Thr 235 Phe

Leu

Gly

Ser

lie 315 Gly

Asp

Thr

Gly

Ser 395 Cys

Asp Pro Gln 410

Gly Arg Leu Phe 425

Ala

Tyr

Pro

Thr 220 Ala

Ala

Gly

Arg

Gly 300 Ser

Pro

Arg

Asp

Gly 380 lie

Val

Pro

His Gln Ala

Tyr 205 Ser

Arg

Ala

Thr

Leu 285 Pro

Asp

lie

工Ie

Val 365 Arg

Leu

Gly

Glu

Arg 190 Leu

Thr

Arg

Ala

Asp 270 Gly

Glu

Thr

Ser 350 Gly

Val

Gly

Lys

Lys 430

Ser 175 Gln

Thr

Asp

Tyr

Ser 255 Ser

Ala

Arg

Phe

工Ie 335 Ala

His

Asn

Leu

Thr 415 Ala

160 Ser

Gly

Met

Gly

Glu 240 Ala

lie

Glu

Leu

Met 320 Thr

Met

Asp

Cys

Arg 400 Phe

Leu

<210> SEQ ID NO: 28 <211> Comprimento: 1251 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Sequencia Artificial

<220> Caracteristicas：

<223> Outras informagoes： seqiiencia sintetica codificando GRG31 (syngrg31)

<400> Sequencia: 28 atgaaccagc aggtgatcac cttgacacat ctcaccggca gcaagagcga gagcaacagg caagtggaga tcgccaacct ctcagaagct caaattgctt cagatccaaa gcctggcttc gccatgaggt tcttgacggc ctacctcaac actgaaagga tgcagcagcg gcccatcggc gccgacatcc actacgacaa gaaggtgggc ttccaagaga aggaccgcgt caagatcaag ctgctgctca tcgcgccggc gctgaagaag acatcaaggc cttatgtgag catgacgctg gaatggaaga acaacgccat caagattgct gtggagccag attggagcgc cgcctcatat aatgcaagca tcgtgctgcc agggctgagg

ccaagcaaga agatccaagg caccgtgcag 60

gcgctcatca ttcagagctt gagcaagggc 120

gctgacaccg tcaccctcaa cagggtgctg 180

aacaccatcg acattgggcc ggccggcacc 240

ctggtgaagg gcaacttcat cctcaccggc 300 atcctggtgg acgccatgaa ggagatcggc 360

tacccgccgc taaagattga aggaggcctc 420

ggcaacatca gcagccagta catctcggcg 480

gggctgacgc tggagattga aggagagctg 540

gacatgctga agagcgtcgg catccagcat 600

cctcaagcat ttgagaagca gaccatctat 660

tggtacgcca tcgccgcgct ggctgatgca 720

aagaacagcc tccaaggaga catcgccatc 780 atcagcatca aacaagaagg gctcaaacag gagacgctga ttcggcgccg cagccagaag ccgctagctc tacccggact

tggagcattt tgattggaag tggtggtggt agatcaagga agctgattga aagtcacctt tggtgttcga tctggaacca

tggagttcaa tgatgtgagc ggcggcggcg gaccgacagg agatggagac cgacacctat ccagatcaag cctccaagct

agttcatttg ctcttcaact ctgaagagag atcgccgcgc acctaccacc gaagatcaca attgctgaac caagccttcg

agagcgacgg tcaaggagtg atgtgagctt tacagaagga tcaagacggc ggatggcaat ctcaagtggt tcatcgagta

cctccacctc cccagatctt caccggcctg gatcgccaag gcaggtgtac ggccttcgcg ggagaagagc

g

840 900 960 1020 1080 1140 1200 1251

<210> SEQ ID NO: 29 <211> Comprimento: 1401 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqiiencia Artificial <220> Caracteristicas：

<223> Outras inf ormagoes: seqiiencia sintetica codif icando GRG2 5 (syngrg2 5)

<400> Sequencia: 29 atgctgctga ggacggtgaa gacctgcttg tcggcgccgg gctcgccgac ggacaaactt ccgcacgccg ccaccggcct ggacgccatc aacagatatt tgatcctggc ggcgctggca atctcaaggg acaccgagct gatgctggac aggacaactc aacctgatgg aagcaccacc gggccgctga gcatcgactg cggcctcgcc gccgccgtcg ccggcgcctc agtggcattt atggcgccgg tgctggacgc gctggagacg ccgggcatgc tgcccttcac aatggatgct attgatgctt ctggaagctc tcagttcatc cctggaggcc tcaagctccg cgccgccgcc atgacagttc aaacattgag ggagctcggc agctggagca tcgcgccggg gcagctctca agcaacgccg gccccttcct ggcggcggcg ttctggccgg caagcaccac tcaagttgga ggcgccgaga tctctcatgg agaagatggc cgcggcatcg actatgctga tgcttcagag ctcgccgact cgccaagcaa gctcaccggc cggctggcgg cgctggagac agagctggcc gacgcgctgg agatcatccc tggaactctt cacaggatgg ccaccgccgg cgcgctgctg aacatcgcca ccaccgccaa gaccatgccg gcgacggcca agggccaagg a

gagcccaagg acctgcccat ctgcaccgcc 60 cacaatgctg agaagacatg gtgggcggcg 120 gtctccgtgc cggcatcaaa gagcctcacc 180 agctcgccaa gcaccatcca caacaccttg 240 gcgctggcgg ccttcggcat cggcatcgag 3 00 gtcgccatca cgccgggcaa gctggccacc 3 60 ggcaccgtga tgaggttcgt gccgccgctc 420 gatggagatg aagcagcaag ggtgcggcca 480 ctgggagcaa ggattgagta cgccggcacg 540 tctgctcttc aagaaaggca tgaggtgctg 600 tcggcgctgc tgctggtggg ccaagctcta 660 ggccacatcg cctcgcctga tcacatcgcc 720 gtggaggtgg cggtgggaga agatgcaaga 780 ggcttcacca tcaccgtgga gcctgatttg 840 ctggcaacaa atggcaccgt ccgcgtgccc 900 ggaaaatggg tgcaaatcct ctcaaggatg 960 gtgctgaccg tccgcggcac cggcgtcatc 1020 ctggcgccga cgctggcggc gctctgcacc 1080 atcggccacc tccgcggcca tgaaacagat 1140 aaggtgggcg ccaccgtgac aagcaccgac 1200 caagctgctg atctggattc atatgaagat 1260 gggctggcca ttgaaggagt gagggtggag 1320 gacttcccgc agctgtggac ggacatggcg 1380

1401

<210> SEQ ID NO: 30 <211> Comprimento： 1392 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqiiencia Artificial

<220> Caracteristicas： <223> Outras informagoes ：

seqii 〜encia sintetica codif icando GRG2 6 (syngrg2 6)

<400> Sequencia: 30

atgcctggga ccgctgtggc agcaagagcc ctccgcgcgc ggcgccacca cccatcgacc gtgatgaggt gatcctcatg gtggatgttt

cgccggcgac cggcgccctt tcaccaacag cgcttcattc tcactgaagt cggcggcggc tcgtgccgcc caaggcagcg cagcaatgga

gcagacagat cgccagccat atatttggtg aagagattcg tcctggagat ggcgtcggag gctggcggcg gccaatgggc tggcaaggcg

gattctggaa cctgttgatg ctggcggcgc gcgctgatgg ggtcaatatg acggccatcg ctgaggaatg accatcatcg ccgggcagct

caagcaccgc ccaccgtcac tggcaaatgg tggaggcgct gaccagatct actgcggcct gagcttcagt aggcgctgag tgcccttcaa

ctcggcgctg cgtgcctgga gccatcaagg ccgccgcctc ggaggtgacg cgccggcacc ttttgatgga gacgctcggc ggtgagcggc

60

120

180

240

300

360

420

480

540 accggcagcg tccgcggcgg ccacctggtg tcggcgctgc tgctggtggg agcaagattt aagccggtgc caagcctgga ccacatcaac gtgcaagttg atgattcagt tccaaatcat tttgatgaaa gaattgagca agatctttca gccaccaagg gcaccgtcag gattccaaat ctttggagga acatcctggc aacaatgggc accgtcaccg gcggcagcga gatcctcggc ccgacggtgg cggcgctctg cgcgctagca cacctccgcg gccatgaaac agatcggctg ggcggcgacg ccgaggagac aagtgatggg ggagtggtgc acagctatgc tgatcacagg gccgtggaag gagtgagggt ggaggacatc ccgcagatct ggacaagcat gctctccgcc gagacaagca ac

attgatgctt cagcaagctc tcaatttgtg 600 gaagaaggcc tccacctgga gcatgttggc 660 atgacggtgg cggtgctgcg cggcgtcggc 720 tggagggtga gccccggcgc catccaagca 780 aatgctggac ccttcctggc ggcggcgctg 840 tggccggcaa gcaccactca agttggagat 900 gccaccgtga cgctggacaa tggcaccctc 960 gccgactttg atgaaacttc agagctggcg 1020 acctcgccat caaggctcac cggcattgct 1080 gcggcgctgg tggcggagat caacaggctc 1140 ctggtgatea ggccggcggc gctgcactca 1200 atggccaccg ccggcgccat cctcggcctc 1260 gccaccacca gcaagaccat gccggagttc 1320 gggccggcgg cggcggcggc cggcagcacc 1380

1392

<210> SEQ ID NO: 31 <211> Comprimento: 13 65 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqiiencia Artificial <220> Caracteristicas:

<223> Outras inf ormagoes ： seqiiencia sintetica codif icando GRG27 (syngrg27 )

<400> Seqiiencia: 31

atgaccggca ccggcgccat ctcaccaaca cctcttcatt gtcaccgagg ccaagcgccg ttcgtgccgc gcaaggaaca gctgctgaag gtgcgcggcg ctgctggtgg ccaagcctgg gatgattcag aggatcgagc ggcaccgtga accatcctgg ggcggcaatg gcggcgctct ggccatgaaa gctgaagaaa cacagctacg ggcgtccagg tgggcaagga

ccaccgccgc atgcaaatgg ggttcctggt caagagattc tgccaggaga ccggcagcag cgctggcggc ggccaatggg gaggaaggac gccacctggt gcgcgcgctt atcacatcac ttcccaacca aagatctttc ggattccaaa cggcaatggg agatcaaagg gcgcgctggc cagatcggct ctgctgatgg ccgaccacag tggaggacat tgctggacag

caacaccgag gccggtggac gctggcggcg ggcgctgatg tggagattat caccgccatc gctgagatca caccatcatc gccgtcggcg gattgatgct cacagaaggc catgacggtg ctggagggtg aaatgctgga ttggcccatc cgccaccgtc agctgatttt caccgggcca ggcggcgctg gctgctgatc gatggccacc cgccaccacc cgccggcacc

ccggacaagg gccaccgtca ctggctgatg atccaagctc ggacctgatc gactgcggcc ggcgccaccg gaggcgctgc ctgcccttca tcagcaagct ctccacctgg gaggtgctga tcgccgggca cccttcctgg ggcaccactc accttggacg gatgaaactt tcaaggctga gtggcggaga aggccggcga gccggcgcca agcaagacca aacgaggccg

cggcgtcgct ccgtgcctgg ggccatcaag ttcggcagct tggagatcac tcgccggcac tctttgatgg tggcgctggg ccgtggaagg ctcaatttgt agcatgttgg ggagcgtcgg agatcaccgc cggcggcgct aagttggtga gcggcaccct cagagctggc ccggcattgc tcaacaggct cgctacatgg tcctcggcct tgccggagtt gcaac

gccgctgtgg aagcaagagc gctccgcgcg cggcgcca.cc gccgctggac cgtgatgagg agatcctcat agttcctgtt caccggcgag gtcggcgctg caagccggtg cgtcaccgtg cttcgaccag ggcaactcat tctttggagg caccgtcacc gccgacggtg tcacctccgc gggaggagdt cggcgtcatc cgccgtcgac cccggagatg

60

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1365

<210> SEQ ID NO: 32 <211> Comprimento: 1383 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo ： Seqiiencia Artificial

<220> Caracteristicas：

<223> Outras informagoes： sequencia sintetica codificando GRG2 8 (syngrg2 8)

<400> Seqiiencia： 32

atgaccggca ccaccgccgc caacaccggc

gcggcgccat atgcaacaag gccggtggac

ctcaccaaca ggttcctggt gctggcggcg

agcaacagcg tggacacctt gccgctctgg 60 gccaccgtca ccgtgcctgg aagcaagagc 120 ctggctgatg ggccaagccg cctccgcgcg 180 cctcttcatt gtcaccgagg ccttcagcaa ttcgtgccgc gcaaggaaga gcaacagaag gtgcgcggcg ctgctggtgg ccaagcctgg gatgattcag aggatcgagc ggaacagtga agcatcctgg ggaggaccag gcggcgctct ggccatgaaa gctgaagaaa cattcatatg ggagttcaag tgggaggcca aac

caagagattc tgcccggcga gcggcgccga cgctggcggc ggccaatggg gaggaaggac gccacctggt gagcaaggtt atcacatcaa ttcccaacca aagatctttc ggattccaaa tggagatggg agatcaaagg gcgcgctggc cagatcggct ctgctgatgg ctgatcacag tggaggacat tgctgcaaca

tgtgctgatg cggcgactat gacggccatc gctgaggaat caccatcatc gccgtcggcg gattgatgct cacagaaggc catgaccgtc ctggagggtg aaatgctgga ttggccgacg cgccaccgtc agctgatttt caccgggcca ggcggcgctg cctcatcatc gatggccacc cgccaccacc aggaactgga

atccaggcgc ggacctgatc gactgcggcc gggccaacaa gaggcgctgc ctgcccttct tcagcaagct ctccacctgg tccgtgctgc gcgccgggcc cccttcctgg cagacaactc accttggaga gatgagacct tcaaggctga gcggcggaga aggccggcga gccggcgcca agcaagacgg gaagatgaga

tgcggcagct tggagatcac tcgccggcac catttgatgg tggcgctagg ccgtggatgg ctcaatttgt agcatgttgg gcggcgtcgg ccatccatgc cggcggcgct aagttggtga atggcaccct ccgagctggc ccggcattgc tcaacaggct cgctgcatcc tcctcggcct tgccagaatt ccgtcacctc

cggcgccacc gccgatggac cgtgatgagg agatcctcat agttcctgtg caccggcgag gtcggcgctg caagccggtg cgtcaaggtg cttcgaccag ggcaacaaga tctatggagg caccgtcaaa gccgacggtg tcacctccgc gggaggagat tggagtagtt cgccgtggaa tcctcaaatg agaagcaagc

240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1383

<210> SEQ ID NO: 33 <211> Comprimento: 1293 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Sequencia Artificial

<220> Caracteristicas:

<223> Outras informagoes: sequencia sintetica codificando GRG2 9 (syngrg29)

<400> Sequencia: 33 atggatgtca tcgtcaagcc gacgccaagc aagaactaca caacaagata tttgctggcg cactaccctg ctcattcaga agattctgat gccgtgctgg aagaagatga cagcaagatc gatgtgaggg agctcaatgt tggaaatgct acggcgctct gccctgatgt caccttcgtc cctcatgatg acctcatcga cgcgctgggg ggaaggctgc ccatcaccat caaaggagga ggaagcgtca gctctcagta cctctcggcg gacagcacca tcgaggtgct aaatgacctc gaggtgctgg agcaagctgg catcgtcatc gtgcccggcg gccaagccta caagccgcag agcgccgccg tgctggccgc cgccgccgtc atggagcaat caaagcaagg agaaagagca ccgctcaccc atgaaaatga tgtggtgcat gagtttgatg gagatgctgc aacagatgct gctgaaggaa catcaagatt ctacaatgtg atcaccgact acctcaacga gctgaggaag gagatcattg ttcatggaag gccagaagga tacgaccacc gcgtcatcat ggcgctaaca aggatcagag atgctcatca tgtggccaag gctctcggcg cctccgtgca gtgggtgaag

ctcaatggag agatcggcgc gctgagcagc 60 gcggcgctgg cagaaggaac aagcaccatc 12 0 gccatgagaa gatgcatctc cgacctcggc 180 gtcatccaag gcttcggctc acatccaaga 240 ggcgccgtgc tgcgcttctt gatgggcgtg 300 aacacctacc ccgacagcct cggcaagagg 360 cagctaggag tggaggtgca gcatgagcaa 420 caagccaagg gcggccacat cagagtttct 480 ctgctcttcg tgacgccgct gctggcggag 540 aagagcaagg tggtgatcgg ccagacgctg 600 catgcttcag atgactacat gagcttccgc 660 acctacaccg tccaaggaga ttatcctgga 72 0 acccaaagtg atgtgaagat cctccggctg 780 attgttgatg tgctgaggat gatggaggtg 840 gttcaaggaa atggcacctt gaaggcggtg 900 gtgctggcaa tggtggcggc ggcggtgttt 960 gagaacttga gatacaagga atgtgacagg 1020 gccggcgcca atgtggagga gaggcaagct 1080 gtggagggcg gcgtggagat caatgctcac 1140 gtggtggggc tgaggagcaa ggagccgctg 1200 agctaccctc aatattttga tcatcttcaa 1260 gag 1293

<210> SEQ ID NO: 34 <211> Comprimento: 1293 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo： Seqiiencia Artificial <220> Caracteristicas：

<223> Outras informagoes: sequencia sintetica codificando GRG3 0 (syngrg3 0) <400> Sequencia： 34 atggatgtca tcgtcaagcc gacgccaagc aagaactaca caacaagata tttgctggcg cactaccctg ctcattcaga agattctgat gccgtgctgg aagaagatga cagcaagatc gatgtgaggg agctcaatgt tggaaatgct acggcgctct gcccggaggt gaccttcgtc cctcatgatg acctcatcga cgcgctgggg ggaaggctgc ccatcaccat caaaggagga ggaagcgtca gctctcagta cctctcggcg gacagcacca tcgaggtgct aaatgacctc gaggtgctgg agcaagctgg catcgtcatc gtgcccggcg gccaagccta caagccgcag agcgccgccg tgctggcggc ggcggcggtg atggagcaat caaagcaagg agaaagagca ccgctcaccc atgaaaatga tgtggtgcat gagtttgatg gagatgctgc caccgacgcc gctgaaggaa catcaagatt ctacaatgtg atcaccgact acctcaacga gctgaggaag gagatcattg ttcatggaag gccagaagga tacgaccacc gcgtcatcat ggcgctaaca aggatcagag atgctcatca tgtggccaag gctctcggcg cctccgtgca gtgggtgaag

ctcaatggag agatcggcgc gctgagcagc 60 gcggcgctgg cagaaggaac aagcaccatc 120 gccatgagaa gatgcatcag ggacctcggc 180 gtcatccaag gcttcggctc acatcctcat 240 ggcgccgtgc tgcgcttctt gatgggcgtg 300 aacacctacc ccgacagcct cggcaagagg 3 60 cagctaggag tggaggtgca gcatgagcaa 420 caagcaaaag gaggccacat cagagtttct 480 ctgctcttcg tgacgccgct gctggcggag 540 aagagcaagg tggtgatcgg ccagacgctg 600 catgcttcag atgactacat gagcttccgc 660 acctacaccg tccaaggaga ttatcctgga 720 acacaaagtg atgtgaagat cctccggctg 780 attgttgatg tgctgaggat gatggaggtg 840 gttcaaggaa atggcacctt gaaggcggtg 900 gtgctggcaa tggtggcggc ggcggtgttt 960 gagaacttga gatacaagga atgtgacagg 1020 gccggcgcca atgtggagga gaggcaagct 1080 gtggagggcg gcgtggagat caatgctcac 1140 gtggtggggc tgaggagcaa ggagccgctg 1200 agctaccctc aatattttga tcatcttcaa 1260 gag 1293

<210> SEQ ID NO: 35 <211> Comprimento： 431 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo： Enterobacteriaciae

<400> Sequencia： Met Lys Val Thr 1

Pro

Ala

Lys

Gln

65

Ala

Thr

Gly

His

lie 145 Ser

Ala

lie

Glu

Asp 225

Ala Ser Lys

Ala

50

Pro

Ser

Leu 130 Gln

Ser

Asp

Asn 210 Glu

Gly

35

Ala

Asp

Phe

lie

Leu 115 Gly

Gly

Gln

Asp

Leu 195 Arg

Lys

20 lie

Arg

Gly

lie

Val 100 Val

Val

Pro

Phe

Val 180 Thr

Asn

Thr Lys

35 lie 5

Ser

Asp

Ser

Asp

85

Ala

Thr

Lys

Leu

Leu 165 Ala

Leu

Tyr

Met

Gln

Ser

Glu

lie

Leu

70

Cys

Leu

Arg

Val

Lys 150 Thr

lie

Asp

Glu

Gln 230

Pro

Met

lie

Val

55

Gln

Gly

Ser

Pro

Lys 135 Pro

Gly

Lys

Val

Glu 215 Arg

Gly Asp Gln

lie

40

Ser

lie

Glu

Lys

Met 120 Ser

Ala

Leu

Val

Met 200 Phe

Arg

25 Asn

Arg

Thr

Ser

Glu 105 Asp

Asn

Asp

Leu

Thr 185 Lys

Tyr Tyr Thr

Leu 10 Ala

Pro

Leu

Ser

Gly

90

Glu

Phe

Gln

Val

Leu 170 Asn

Arg

Phe

Val

Thr

Cys

Gly

Glu

75

Leu

Val

Phe

Gly

Thr 155 Ala

Leu

Phe

Lys

Glu 235

Gly

Ala

His

Ala 60 Gly

Ser

Thr

Asp

Lys 140 Val

Tyr

Lys

Gly

Ala 220 Gly

lie lie Ala

Ser

45

Arg

Val

lie

Glu 125 Leu

Asp

Ala

Ser

Leu 205 Gly

Ala

30

Asn

Leu

Lys

Arg

Lys 110 工Ie

Pro

Gly

Ala

Arg 190 Lys

Asn Asp Trp

Gln

15

Leu

Asp

Glu

Pro

Met

95

Gly

Leu

Ser

Ala 175 Pro

Thr

Val

Ser

Val

Asp

Val 80 Phe

Ser

Pro

Val

Leu 160 Asp

Tyr

Pro

Tyr

Gly 240 Gly

Arg

Ala

Lys

Cys 305 Gly

Asp

lie

Lys

Cys 385 Ala

Ala

Gly

Leu

Leu 290 Pro

Glu

Arg

His

Gly 370 Ala

Phe Leu Leu

Glu Gln Leu

Met 275 His

Asp

Thr

Gly

Leu 355 Ala

Val

Ala

Gly

Asp

260 Ser

Pro

Leu

Lys

Leu 340 Glu

Glu

Ala

Val

Gly 420

Leu

245 工Ie

Ala

Phe

工Ie 325 Thr

Gly

Val

Ala

Asn 405 Val

Val

Ala

Asn

Asp

Pro 310 Lys

Leu

Asp

Ser

Leu 390 Lys

Ala

Ser

Ala

Leu 295 Pro

Gly

Gln

Leu

Ser 375 Lys

Gly Ala Thr

Ser Val Ser

Gly 280 Asn

Leu

Val

Asp

Met 360 Arg

Ala

Tyr

Leu

Gln 265 工Ie

Ala

Val

Ser

Glu 345 Arg

His

Val

Pro

Asn 425

lie 250 Ala

Ala

Phe

Ala

Arg 330 Phe

Val

Asp

Gly

Asp 410 His

Ala

Asp

lie

Glu

Leu 315 Leu

Gly

lie

His

Glu 395 Phe

Gly

Lys

Asp

Phe 300 Ala

Ala

Lys

Gly

Arg 380 Thr

Tyr Gln Phe

Pro

Ala

Ala 285 Asp

Ser

His

Met

Gly 365 工Ie

Thr

Ser

Asn

<210> <211> <212> <213>

SEQ 工D NO: 36 Comprimento: 414 Tipo: PRT

Organismo： Sulfolobus solfataricus

<400> Met 1

Pro

Seqiiencia ： Val Lys

Thr

Ala

Glu

65

Leu

Ala

Arg

Phe

Asn 145 Leu

Pro

Lys

Asn

Gly

工Ie Gln Ser Arg

lie

50

Phe

Lys

lie

Pro

Ser 130 Glu

lie

Pro

Arg

Pro 210 Leu

Val

35

Lys

lie

Gly

Leu 115 Ser

lie

Tyr

lie

Phe 195 Asn

Lys 20 Tyr

Ser

Pro

Ser

Gly 100 Asn

Tyr

Lys

Ala

Ser 180 Gly

Asn Ala Ser

36 工Ie

5 Ser

Leu

Val

Pro

Ala

85

Glu

Arg

Ser

lie

Leu 165 Ser

Ser

Leu

Phe

Tyr

Leu

His

Arg

Glu

70

Thr

Val

lie

Leu

Ser 150 His

Lys

Asp

Val

Tyr

Pro

Ala

Asn

Ala

55

Lys

Thr

Val

Pro 135 Gly

工Ie

Ser

Val

Glu 215 Ala

Ser Lys lie

Leu

40

Leu

lie

Gln 120 Leu

Asp

Leu

Tyr

Lys 200 Phe

Arg

25

Val

Gly

Glu

Arg

Asp 105 Ala

Thr

Glu

Asn

lie 185 Phe

Gln Leu Ser

工Ie 10 Leu

Leu

Val

lie

Met

90

Ala

Leu

lie

Ser

Gly 170 Leu

Tyr

Gly

Ala

Ser

lie

Ser

Lys

75

Leu

Asp

Ser

Thr

Ser 155 Gly

Leu

Gly

Glu

Leu

Gly Phe Glu

lie

Leu

Asp

45

Lys

Val 60

Glu Arg

lie Pro

Glu Ser

Asn Tyr 125 Gly Lys 140

Gln Tyr

Ser lie

Thr 工Ie

Ser Lys 205 Val Ala 220

Val Ser

lie

lie 270 Lys

Ala

Tyr

Lys

Gly 350 Lys

Ala

lie

Asp

Phe 430

lie

Ser

30

Val

Asn

Phe

lie

Leu 110 Gly

Leu

lie

Glu

Thr Val 255

Val Gln

Glu lie

Thr Asp

Cys Lys 320 Glu Ser 335

Val Glu

Gly Val

Met Ala

Glu His 400 Leu Lys 415 Ser

Lys Ala 15

Leu Phe

lie Asp

Asn Ser

lie Lys 80 Leu Ala 95

Arg Arg

lie Ser

Ser Ser

Ser Gly 160 lie Leu 175

Leu Phe His Val Asp Tyr Gly Gly

Asp

190 lie

Gly

Gly Gly

Arg

Leu 335 lie

Leu

Asn

Ser

15

Asp

Ser

Asp

Ala

Thr

95

Lys

Leu

Ala

Leu 175 Tyr

Met

Leu

lie

235 Glu

Ala

Lys

Met

lie 315 lie

Asn

Val

Leu

Lys 395 lie

Ala

Lys

Gln

Ala

Thr

75

Gly

His

lie

Ser

Ala 155 lie

Glu

225 lie

Ser

Asp

lie

Ser 305 Arg

Leu

Gly

Asp

Gly 385 Trp

Thr

lie

Gly

Asp 290 Ala

lie

Tyr

lie

His 370 Val

工Ie Thr Val

Arg 275 lie

lie

Lys

Gly

Asn 355 Arg

lie Gln Asp

Lys 260 Trp

Asp

Ala

Glu

Val 340 Lys

Val

Thr

Leu

Asn

245 lie

Phe

Asp

Glu

Ser 325 Gly

Gly

Ala

Ser

Leu 405

230 Leu

Phe

Val

Ala

Gly 310 Asp

Ser

Met

Ala 390 Ser

Trp

Ser

Lys

Pro 295 Thr

Arg

Glu

Leu

Met 375 Glu

Glu Pro Glu

Ala 280 Asp

Ser

lie

Val

Asn 360 Ser

Cys Leu Asn

Met 265 Lys

Leu

Glu

Lys 345 Ser

Ser

Val

Ala

Lys 250 Gly

Asp

Ala

lie

Ser 330 Tyr

Pro

Ala

Gly

Lys 410

<210> SEQ ID NO: 37 <211> Comprimento: 409 <212> Tipo: PRT

<213 > Organismo : Pseudomonas putida

<400> Seqiiencia： Met Gln Arg Ala 1 lie

Val

Gln

Gly

65

Ser

Pro

Lys

Pro

Gly 145 Lys

Val

Glu

Arg

Ala 225

lie Asn Ser

lie

50

Glu

Lys

Met

Ser

Ala 130 Leu

Val

Met

Phe

Tyr 210 Gly

Arg

35 Thr

Ser

Glu

Asp

Asn 115 Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr 195 Thr

Pro 20 Leu

Ser

Gly

Glu

Phe 100 Gln

Val

Leu

Asn

Arg 180 Phe

Val Ala lie

37 Cys 5

Gly

Glu

Leu

Val

85

Phe

Gly

Thr

Ala

Leu 165 Phe

Lys

Glu

Ala

His

Ala

Gly

Ser

70

Thr

Asp

Lys

Val

Tyr 150 Lys

Gly

Ala

Gly

Gly 230

Ala

Ser

Arg

Val

55

lie

Glu

Leu

Asp 135 Ala

Ser

Leu

Gly

Asp 215 Pro

Ala Leu Asn

Leu

40

Lys

Arg

Lys

lie

Pro 120 Gly

Ala

Arg

Lys

Asn 200 Trp

Asp

25

Glu

Pro

Met

Gly

Leu 105 Leu

Ser

Ala

Pro

Thr 185 Val

Ser lie Thr

Val 10 Asp

Asp

Val

Phe

Ser

90

Pro

Val

Leu

Asp

Tyr 170 Pro

Tyr

Gly

Val

240 His

Lys

Leu

Leu 320 Gly

Phe

Asn

Gly

Tyr 400

Glu

lie

Leu

Cys

Leu 80 Arg

Val

Lys

Thr

工Ie 160 Asp

Glu

Gln

Val

Ala 240

Tyr Phe Gly

Ser Ser Glu 270

Tyr Ser Pro 285

Thr lie Ala 300

Gly 工Ie Glu

Arg Lys lie

Ser lie Leu 350

Thr Asp Cys 365

Ala Leu Val 380

Ser Asn Pro Ser lie Glu

Lys Gly 工Ie

Ala Ala Arg 30

Pro Asp Gly 45

Pro Phe lie 60

Pro lie Val

Ser Leu Val

Leu Gly Val 110

Gln Gly Pro

125 Ser Gln Phe 140

Ser Asp Val

Asp Leu Thr

Asn Arg Asn 190

Glu Thr Lys

205 Ala Phe Leu 220

Gly Leu Asp

Asp

255 Tyr

lie

Asp

Gly

Arg 235 Ser

Ala

Leu

Pro

Gly 305 Gln

Leu

Ser

Lys

Ser 385 Ser

Thr

Gly

Asn

Leu 290 Val

Asp

Met

Arg

Ala 370 Tyr

Gln Ala Asp 245

lie Ala lie 260 Ala Phe Glu 275

Val Ala Leu

Ser Arg Leu

Glu Phe Gly 325

Arg Val lie

340 His Asp His 355

Val Gly Glu Pro Asp Phe

Leu Asn His Gln 405

Lys

Asp

Phe

Ala

Ala 310 Lys

Gly

Arg

Thr

Tyr 390 Phe

Ala

Asp

Ser 295 His

Met

Gly

lie

Thr 375 Ser

lie Val Lys

Ala 280 Tyr

Lys

Gly

Lys

Ala 360 lie

Asp Asn Phe

Glu 265 Thr

Cys

Glu

Val

Gly 345 Met

Glu

Leu

Ser

Gln 250 lie

Asp

Lys

Ser

Glu 330 Val

Ala

His

Lys

Ala

Lys

Cys

Gly

Asp 315 lie

Lys

Cys

Ala

Gln 395

Leu

Pro

Glu 300 Arg

His

Gly

Ala

Glu 380 Leu

Met

His

Asp 285 Thr

Gly

Leu

Ala

Val 365 Ala

Ser Ala Asn

255 Pro Ala Asp 270

Leu Phe Pro

Lys lie Lys

Leu Thr Leu 320

Glu Gly Asp 335

Glu Val Ser 350

Ala Ala Leu Val Asn Lys

Gly Gly Val Val 400

<210> SEQ ID NO: 38 <211> Comprimento: 419 <212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Brevundomonas vesicularis

<400> Seqiiencia： Met Met Met Gly 1

Leu

Ala

Met

65

Gly

Ala

Gly

Glu 145 Ala

Ala

Leu

Ala

Ala 225 Glu

Thr Gly Leu

Leu

50

Gly

Ser

Gly

Lys

Pro 130 Thr

Ser

Leu

Ala 210 Trp

Leu

35 Lys

Val

Gly

Thr

Val 115 Leu

Gly

Arg

Leu

Gly 195 Met

Arg Pro Asp

Arg 20 Leu

Ser

Thr

Lys

Ala 100 lie

Val

Cys

Val

Met 180 Glu

Arg

Val

Ala

38 Arg 5

Ala

Asp

lie

Leu

85

Thr

Val

Asp

Pro

Gln 165 Met

His

Ala

Glu

Ser

Ala

Met

Gly

Asp

70

Gln

Arg

Asp

Ala

Pro 150 lie

Ala

lie

Phe

Pro 230 Ala

Lys

Pro

Leu

Thr

55

Glu

Pro

Phe

Gly

Leu 135 Val

Asp

Ala

Gly

Gly 215 Thr

Leu Thr Pro

Ala

40

Arg

Pro

Leu

Asp 120 Arg

Thr

Gly

Ala 200 Ala

Gly Ala Thr

Gly

25

Lys

Tyr

Asp

Ala

Thr 105 Ala

Ser

lie

Gly

Gly 185 Leu

Lys

Tyr

lie

10

Ser

Gly

Met

Asp

Ala

90

Ala

His

Leu

Asn

Leu 170 Asp

Gly

Val

His

Leu

lie

Lys

Thr

Ala

Thr

75

Pro

Ala

Met

Gly

Gly 155 Ser

Arg

Tyr

Glu

Ala 235 Trp

Pro

Ser

Glu 60 Thr

Leu

Ala

Arg

lie 140 Thr

Ser

Ala

lie

Arg 220 Ala

Pro

lie

Arg

45

Ala

Phe

Ala

Lys 125 Asp

Gly

Gln

Val

Asp 205 Val

Asp Ala Ala

Gly Lys Pro 15

Thr Asn Arg 30

Leu Thr Gly

Leu Arg Ala

lie Val Lys 80

Leu Gly Asn 95

Leu Val Asp 110

Arg Pro lie

Ala Ser Ala

Arg Phe Glu 160

Tyr Val Ser 175

Asp Val Glu 190

Leu Thr Val

Ser Pro Val

Phe Val 工Ie 240

Glu Val Leu Ser

Pro

Ala

Val 305 Asn

Leu

lie

Gly 385 Lys

Gly Gly Asp

Val 290 Leu

Leu

Ser

lie

Asp 370 Leu

Thr Tyr Glu

Ala 275 lie

Ala

Arg

Ala 355 Ser

Lys

Phe

Asp

Lys 260 Lys

Asp

Ala

Val

lie 340 Ser

Phe

lie

Pro

245 lie

Ala

Gly

Phe

Lys 325 Val

Asp

Tyr

Ser

Asn 310 Glu

Leu Gly Asp

Pro Asp Pro Ala Asp

Gln 295 Glu

Cys

Asn

Ser

His 375 lie

Gly Gly 390 Ser Tyr Trp 405

Leu 280 Met

Met

Asp

Leu

Leu 360 Arg

Thr

Asn

Thr 265 lie

Gln

Pro

Arg

Gly 345 Ala

lie

Val

250 Pro

Ser

Asp

Val

lie 330 Thr

Gly

Ala

Leu

Leu 410

Ala

Lys

Ala

Arg 315 Arg

Glu

Lys

Met

Asp 395 Ser

Glu

Phe

lie 300 Phe

Ala

Glu

lie

Ser 380 Pro

255

Gln Phe Ser Gln 270

His Leu Pro

Pro 285 Pro

Val

Leu

Gly

Leu 365 Phe

Asp Ser Leu

Thr Leu Ala

Gly 工Ie Glu 320

Ser Ser Gly

335 Asp Asp Leu 350

Thr Ala Glu

Ala Leu Ala

Cys Val Ala 400

Gly Val Ala 415

Claims

1. Molecula de acido nucleico isolada caracterizada por compreender uma sequencia de nucleotideos selecionada a partir do grupo consistindo de: a) sequencia de nucleotideo de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, If 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, ou um complemento desta; b) seqiiencia de nucleotideos apresentando pelo menos 90% de identidade de sequencia com a seqiiencia de nucleotideo de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, If 9, 11, 28, 29,30, 31, 32, 33, ou 34, ou um complemento desta; c) seqiiencia de nucleotideos de resistencia a herbicida do insert〇 de DNA do plasmideo depositad〇 com os Nos. de Acesso NRRL B — 3〇915, NRRL B—30 911, NRRL B — 3O 912, NRRL B—30913, NRRL B—30914 N, NRRL B-30916 N, NRRL B-30917 N, ou um complemento destas; d) seqiiencia de nucleotideos que codif ica um polipeptideo compreendendo a sequencia de aminoacidos de SEQ ID NOS: 14, 2’ 4, 6, 8, 10, ou 12; e, e) seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS:14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12.

2. Ácido nucléico isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida seqüência de ácido nucléico é uma seqüência sintética que foi projetada para expressão em uma planta.

3. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ainda compreender uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptideo heterólogo.

5. Célula hospedeira caracterizada por conter o vetor de acordo com a reivindicação 3.

6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5 caracterizada por ser uma célula hospedeira bacteriana.

7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5 caracterizada por ser uma célula vegetal.

8. Planta transgênica caracterizada por compreender a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 7.

9. Planta de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a referida planta é selecionada do grupo consistindo em milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, cruciferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza.

10. Semente transformada caracterizada por ser da planta de acordo com a reivindicação 8.

11. Polipeptideo isolado, caracterizado por ser selecionado a partir do grupo consistindo de: a) polipeptideo compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12; b) polipeptideo codificado pela seqüência de nucleotideos de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34; c) polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS:14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12, aonde o referido polipeptideo tem atividade de resistência a herbicida. d) polipeptideo que é codificado por uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 90% idêntica a seqüência de nucleotideos de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34; aonde o referido polipeptideo tem atividade de resistência a herbicida; e e) polipeptideo que é codificado pela seqüência de nucleotideos de resistência a herbicida do inserto de DNA do plasmideo depositado com os Nos. de Acesso NRRL B-30915, NRRL B-30911, NRRL B-30912, NRRL B-30913, NRRL B-30914 N, NRRL B-30916 N, NRRL B-30917 N.

12. Polipeptideo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por ainda compreender uma seqüência heteróloga de aminoácidos.

13. Método pára produzir um polipeptideo com atividade de resistência a herbicida, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5 sob condições nas quais uma molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptideo é expressa, o referido polipeptideo sendo selecionado a partir do grupo consistindo de: a) polipeptideo compreendendo a seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12; b) polipeptideo codificado pela seqüência de nucleotideos de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34; 15 c) polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS:14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12, aonde o referido polipeptideo tem atividade de resistência a herbicida. d) polipeptideo codificado por uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 90% idêntica a seqüência de nucleotideos de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34; aonde o referido polipeptídeo tem atividade de resistência a herbicida. e) polipeptídeo que é codificado pela seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicida do inserto de DNA do plasmídeo depositado com os Nos. de Acesso NRRL B-30915, NRRL B-30911, NRRL B-30912, NRRL B-30913, NRRL B-30914 N, NRRL B-30916 N, NRRL B-30917 N.

14. Método para conferir resistência a um herbicida em uma planta, caracterizado por transformar a referida planta com uma construção de DNA, a referida construção compreendendo um promotor que conduz a expressão em uma célula vegetal, operacionalmente ligado à uma seqüência de nucleotídeos, e regenerar uma planta transformada, aonde a referida seqüência de nucleotídeos é selecionada a partir do grupo consistindo de: a) seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, ou um complemento desta; b) seqüência de nucleotídeos apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, .30, 31, 32, 33, ou 34, ou um complemento desta, aonde a referida seqüência de nucleotideos codifica um polipeptideo que apresenta atividade de resistência a herbicida. c) seqüência de nucleotideos de resistência a herbicida do inserto de DNA do plasmídeo depositado com os Nos. de Acesso NRRL B-30915, NRRL B-30911, NRRL B-30912, NRRL B-30913, NRRL B-30914 N, NRRL B-30916 N, NRRL B-30917 N, ou um complemento destas; d) seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12; e, e) seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptideo apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS:14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12, em que o referido polipeptideo apresenta atividade de resistência a herbicida.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a referida planta produz um polipeptideo que apresenta atividade de resistência a herbicida.

16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o herbicida ser um glifosato.

17. Planta caracterizada por ter estavelmente incorporada em seu genoma uma construção de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotideos que codifica uma proteína apresentando atividade de resistência a herbicida, em que a referida seqüência de nucleotídeo é selecionada a partir do grupo consistindo de: a) seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34; b) seqüência de nucleotideos apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, aonde a referida seqüência de nucleotideos codifica um polipeptídeo que apresenta atividade de resistência a herbicida; c) seqüência de nucleotideos que codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS: 14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12; d) seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo apresentando pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NOS:14, 2, 4, 6, 8, 10, ou 12, em que o referido polipeptideo apresenta atividade de resistência a herbicida; e e) seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicida do inserto de DNA do plasmídeo depositado com os Nos. de Acesso NRRL B-30915, NRRL B-30911, NRRL B-30912, NRRL B-30913, NRRL B-30914 N, NRRL B-30916 N, NRRL B-30917 N; em que a referida seqüência de nucleotídeos está operacionalmente ligada a um promotor que conduz a expressão de uma seqüência codificante em uma célula vegetal.

18. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que dita planta é uma célula vegetal.

19. Método para gerar uma variante de polinucleotídeo caracterizado por ser de um polinucleotídeo parental grg25, grg26, grg27, grg28, grg29, grg30, grg31, syngrg25, syngrg26, syngrg27, syngrg28, syngrg29, syngrg30, ou syngrg31, compreendendo usar a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOS: 13, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 28, 29, 30, 31, 32, 33, ou 34, ou um fragmento desta, em um procedimento recombinogênico, e testar um polipeptideo codificado pela seqüência de nucleotideo resultante para uma atividade de interesse.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a atividade de interesse é a atividade de resistência a glifosato.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptideo codificado pela seqüência de polinucleotideo resultante tem maior atividade de resistência ao glifosato do que um polipeptideo codificado pelo referido polinucleotideo parental.

22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido procedimento recombinogênico é embaralhamento de DNA.

23. Método para aumentar o vigor ou o rendimento em uma planta,caracterizado por: a) introduzir na referida planta uma seqüência de nucleotideos codificando uma enzima EPSP sintase de tolerância a glifosato diferente de SEQ ID NO:35, 36, ou 37 que apresentam uma temperatura ótima mais alta do que a temperatura ambiente. b) colocar a referida planta em contato com uma concentração efetiva de glifosato; e, c) crescer a referida planta sob condições em que a temperatura é mais alta do que a temperatura ambiente por pelo menos duas horas consecutivas por dia por pelo menos 4 dias após o contato com o referido glifosato, em que os referidos dias seguintes ao contato estão dentro da temporada de crescimento da planta, aonde o vigor ou o rendimento da referida planta é maior do que o vigor ou o rendimento de uma planta expressando uma EPSP sintase de tolerância a glifosato que não tem uma temperatura ótima mais alta do que a temperatura ambiente.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a referida EPSP sintase não é uma EPSP sintase derivada de planta.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a referida enzima EPSP sintase tem uma temperatura ótima em torno de 35°C a cerca de 55°C e a temperatura na etapa (c) é em torno de 35°C a cerca de 55°C.

26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a enzima EPSP sintase é definida em SEQ ID NO: 14 e a temperatura na etapa (b) é em torno de 45°C a cerca de 55°C.

27. Método para conferir resistência a glifosato em uma planta caracterizado por compreender: a) introduzir na referida planta uma seqüência de nucleotideos codificando uma enzima EPSP sintase de tolerância a glifosato diferente de SEQ ID NO:35, 36, ou 37 que apresentam uma temperatura ótima mais alta do que a temperatura ambiente. b) colocar a referida planta em contato com uma concentração efetiva de glifosato; e, c) crescer a referida planta sob condições em que a temperatura é mais alta do que a temperatura ambiente por pelo menos duas horas consecutivas por dia por pelo menos 4 dias após o contato com o referido glifosato, em que os referidos dias seguintes ao contato estão dentro da temporada de crescimento da planta.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida EPSP sintase não é uma EPSP sintase derivada de planta.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida enzima EPSP sintase tem estabilidade térmica a uma temperatura de cerca de 32°C até aproximadamente 60°C e a temperatura na etapa (b) e de cerca de 32°C até em torno de 60 °C.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a referida enzima EPSP sintase tem estabilidade térmica a uma temperatura de cerca de 35°C até aproximadamente 45°C e a temperatura na etapa (b) e de cerca de 35°C até em torno de 45 °C.

31. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a referida enzima EPSP sintase está definida em SEQ ID NO:14 e a temperatura na etapa (b) é em torno de 37°C.