TW201335365A - 合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽 - Google Patents

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TW201335365A
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plant
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sequence
dgt
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TW102104025A
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Justin M Lira
Robert Cicchillo
Carla N Yerkes
Andrew E Robinson
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Dow Agrosciences Llc
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Abstract

本發明之揭示係關於一種組成物與方法，以定向胜肽、多胜肽與蛋白質至含色素體細胞之色素體上。在一些實施例中，本發明之揭示係關於可導引一多胜肽至一色素體之葉綠體輸送胜肽，以及編碼該胜肽之核酸分子。在一些實施例中，本發明之揭示係關於生產含有一葉綠體輸送胜肽之一基因轉殖植物材料(例如，一基因轉殖植物)之方法，以及經由此方法產生之植物材料，與由此產生之植物商品。

Description

合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽 參考相關申請案
本申請案係申明補充於2012年2月1日提申之美國暫時專利申請案系列號61/593,555，以及於2012年4月17日提申之美國暫時專利申請案系列號61/625,222，每一者之內容皆在此併入本案以作為參考資料。
依據37 C.F.R.§ 1.821(c)或(e)之陳述-以AS ASCII TEXT檔 案提申之序列表
依據37 C.F.R.§ 1.821(c)或(e)，本申請案一併提申包含ASCII text版本之序列表之檔案，其內容在此併入本案以作為參考資料。
發明領域
本發明之揭示係關於基因性編碼與表現多胜肽之組成物與方法，該多胜肽可定向(target)至含色素體(plastid)細胞之色素體上。在某些實施例中，本發明之揭示係關於將多胜肽定向至葉綠體(例如，高等植物)之胺基酸序列，及/或編碼該胺基酸序列之核酸分子。在某些實施例中，本發明之揭示係關於一嵌合多胜肽，其含有調控輸送至色素體之胺基酸序列，及/或編碼該胺基酸序列之核酸分子。
發明背景
植物細胞含有不同胞器，通常稱為“色素體”，其由特定之膜系統區隔，並於細胞內執行特定功能。特別是，色素體負責光合作用，以及某些化學物質之合成和儲存。所有色素體皆源自原色素體(proplastids)，其存在於植物之分生區域(meristematic regions)。原色素體可發展成，例如：葉綠體、黃化體(etioplasts)、色質體(chromoplast)、老質體(gerontoplasts)、白色體(leucoplasts)、澱粉體(amyloplasts)、油粒體(elaioplastsm)與蛋白質體(proteinoplasts)。色素體以半自律(semi-autonomous)方式存於細胞內，其含有自身之基因系統與蛋白質合成機器，但在其發展與生合成活性時需仰賴與核質系統(nucleo-cytoplasmic system)之緊密合作。
在高等植物之光合葉細胞中，最醒目之色素體為葉綠體。葉綠體之最重要功能為進行光合作用之光驅動反應。但是，葉綠體亦進行許多其他對於植物細胞重要之生合成過程。舉例而言，所有細胞之脂肪酸係由位於葉綠體基質之酵素所產生，並使用該處現成之ATP、NAOPH與碳水化合物。此外，光激活電子之還原能力可於葉綠體內驅動亞硝酸根(NO2-)還原為氨；該氨可提供植物合成胺基酸與核苷酸所需之氮。
葉綠體於農藥工業亦具有特殊重要性。舉例而言，已知許多除草劑之作用為阻斷葉綠體內執行之功能。近來之研究已確認了幾種除草劑之特定標的。舉例而言， 三嗪(triazine)衍生之除草劑可於光系統II之32 kD多胜肽結合位置上，經由置換質體醌(plastoquinone)分子而抑制光合作用。該32 kD多胜肽係於葉綠體基因體內編碼，並由胞器機器合成。目前已可取得對於三嗪除草劑具有抗性之突變異體植物。這些植物含有32 kD多胜肽突變異體，其中質體醌可不再被三嗪除草劑置換。磺醯尿素(sulfonylureas)可抑制葉綠體之乙醯乳酸合成酶(acetolactate synthase)。乙醯乳酸合成酶係參與異白胺酸與纈胺酸之合成。草甘膦(glyphosate)可抑制5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸鹽合成酶(5-enol pyruvyl-3-phosphoshikimate synthase；EPSPS)之功能，其為參與芳族胺基酸合成之酵素。所有這些酵素皆由核基因體所編碼，但其可轉位至葉綠體，該處為實際胺基酸合成發生處。
大多數之葉綠體蛋白質於植物細胞核內編碼、於細胞質合成較大之前驅蛋白，並於轉譯後導入葉綠體。穿越外被膜與內被膜而導入基質，為蛋白質進入基質、類囊體膜(thylakoid membrane)與類囊體腔(thylakoid lumen)之主要方式。經導入之前驅蛋白於類囊體膜與類囊體腔之定向係由四種不同機制所完成，包括兩種同源於細菌之蛋白質傳輸系統。因此，蛋白質於葉綠體之定向，係部分源自原核內共生菌(prokaryotic endosymbiont)。Cline與Henry(1996),Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.12：1-26。
預定於葉綠體表現之前驅蛋白含有N端延伸區，稱為葉綠體輸送胜肽(CTPs)。輸送胜肽為用於葉綠體 表面產生特異性辨識之工具，並媒介先驅蛋白質轉譯後轉位穿越葉綠體被膜，並隨後進入葉綠體之各小隔間內(例如，基質、類囊體與類囊體膜)。這些N端輸送胜肽序列含有將葉綠體蛋白質導入色素體之所有必要訊息；輸送胜肽序列為必要且足以供色素體導入之用。
經報導具有先天上於N端編碼輸送胜肽序列之植物基因包括核酮-1,5-二磷酸羧化酶(RuBisCo)之葉綠體小型次單元(de Castro Silva-Filho et al.(1996),Plant Mol.Biol.30：769-80；Schnell et al.(1991),J.Biol.Chem.266：3335-42)；EPSPS(請見例如，Archer et al.(1990),J.Bioenerg.and Biomemb.22：789-810，與美國專利號6,867,293,7,045,684，與Re.36,449)；色胺酸合成酶(Zhao et al.(1995),J.Biol.Chem.270：6081-7)；質體藍素(plastocyanin)(Lawrence et al.(1997),J.Biol.Chem.272：20357-63)；分支酸合成酶(chorismate synthase)(Schmidt et al.(1993),J.Biol.Chem.268：27447-57)；光捕捉葉綠素a/b結合蛋白質(LHBP)(Lamppa et al.(1988),J.Biol.Chem.263：14996-14999)；以及阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)之葉綠體蛋白質(Lee et al.(2008),Plant Cell 20：1603-22)。美國專利公開號US 2010/0071090提供某些單胞藻科(Chlamydomonas sp)之葉綠體標的胜肽。
然而，葉綠體標的胜肽所編碼之結構需求資訊仍不清楚，由於其具有高度序列多樣性，並缺少共同或一致之序列模體(motif)，雖然其可能為不同亞型之葉綠體標的 胜肽，並具有獨立的結構模體。Lee et al.(2008)，同上。此外，並非所有這些序列均被用於高等植物葉綠體標的蛋白質之異源表現。
發明概要
本文係描述以多胜肽定向至植物色素體之組成物與方法。在一些實施例中，該組成物包含一核酸分子，其含有編碼一合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽(例如，TraP8胜肽與TraP9胜肽)之至少一核苷酸序列，並可與一感興趣之核苷酸序列呈操作性連接。在特定實施例中，此核酸分子可於單子葉植物和雙子葉植物中，表現與定向(targeting)由感興趣之核苷酸序列所編碼之多胜肽。本文另描述包含一核酸分子之載體，該核酸分子含有編碼合成之芸苔屬衍生葉綠體輸送胜肽之至少一核苷酸序列，其與一感興趣之核苷酸序列操作性連接。
在一些實施例中，編碼一合成之芸苔屬衍生的CTP之一核苷酸序列，可為源自一參照核苷酸序列之一核苷酸序列，其取自一芸苔屬基因(例如，西洋油菜(B.napus)、蕪菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea)與阿比西尼亞芥菜(B.carinata))，或其功能性變異體。在一些實施例中，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列可為一嵌合核苷酸序列，其含有取自於芸苔屬基因之編碼CTP之部分核苷酸序列，或其功能性變異體。在特定實施例中，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列，可含有連續之核苷酸序 列，係取自每一參考芸苔屬CTP，以及源自芸苔屬之不同基因、不同芸苔屬或不同生物體(例如，一植物、原核生物與低等光合真核生物)之CTP，或上述之任何功能性變異體。在特定實施例中，一連續之核苷酸序列可取自參考芸苔屬CTP之一同源核苷酸序列，其來自參考芸苔屬基因之一不同生物體之直系同源物(例如，不同之芸苔屬基因體)。在這些與其他實施例中，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列可為一嵌合核苷酸序列，其含有一種以上編碼CTP之核苷酸序列。
在一些範例中，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列可為一嵌合核苷酸序列，其含有取自西洋油菜與蕪菁之一部份CTP核苷酸序列，或其功能性變異體。在特定範例中，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列可包含連續之核苷酸序列，其取自西洋油菜與蕪菁，或其功能性變異體。
在一些實施例中，一組成物可含有一核酸分子，其包含至少一芸苔屬衍生工具，以將一多胜肽定向(targeting)至葉綠體。本文另外描述一些核酸分子，其包含內含有至少一芸苔屬衍生工具，以將一多胜肽定向至葉綠體，並可操作性地連接至一感興趣核苷酸序列之一核酸分子。在特定實施例中，此核酸分子可於單子葉植物和雙子葉植物中，表現與定向感興趣之核苷酸序列所編碼之多胜肽。針對本發明揭示之目的，用於將一多胜肽定向至葉綠體之一芸苔屬衍生工具，係指特定之合成核苷酸序列。在 特定實施例中，用於將一多胜肽定向至葉綠體之一芸苔屬衍生工具，係選自於編碼多胜肽，如本文中所稱TraP8與TraP9，之核苷酸序列所組成之族群。
在此亦描述含有一核酸分子之植物材料(例如，植物、植物組織與植物細胞，但不限於此)，該核酸分子包含編碼合成之芸苔屬衍生的CTP，並與一感興趣核苷酸序列操作性連接之至少一核苷酸序列。在一些實施例中，一植物材料可具有穩定融入其基因體之此一核酸分子。在一些實施例中，一植物材料可短暫表現一核酸分子產物，其含有編碼合成之芸苔屬衍生的CTP，並與一感興趣核苷酸序列操作性連接之至少一核苷酸序列。在一些實施例中，植物材料為一無法再生為植物之植物細胞。
本發明亦描述於含色素體細胞(例如，一植物)之色素體(例如，一葉綠體)中，表現一核苷酸序列之方法。在特定實施例中，一核酸分子，其含有編碼合成之芸苔屬衍生的CTP，並與一感興趣核苷酸序列操作性連接之至少一核苷酸序列，可用於轉型一植物細胞，如此可於植物細胞之細胞質產生一前驅融合多胜肽，其包含與感興趣核苷酸序列之表現產物融合之該合成芸苔屬衍生CTP，且該融合多胜肽隨後於體內傳輸至植物細胞之葉綠體。在一些實施例中，植物細胞無法再生為一植物。
本發明另外描述產生含有一核酸分子之基因轉殖植物之方法，該核酸分子含有編碼合成之芸苔屬衍生的CTP，並與一感興趣核苷酸序列操作性連接之至少一核苷 酸序列。本發明亦描述由此基因轉殖植物產生之植物商品(例如，種子)。在一些實施例中，這些基因轉殖植物或植物商品含有基因轉殖細胞，其無法再生為一植物。
由下列詳述之數個實施例與參照附圖，將使上述與其他特徵更臻清楚。
序列表
序列表所列之核酸序列係以核苷酸鹼基之標準縮寫字體顯示，並如37 C.F.R.§ 1.822所定義。每一核酸序列僅顯示一股，而互補股可理解為涵蓋任何參考之顯示股。在所附之序列表中：
序列辨識編號：1係顯示一西洋油菜EPSPS葉綠體輸送胜肽之胺基酸。
序列辨識編號：2係顯示一蕪菁EPSPS葉綠體輸送胜肽之胺基酸。
序列辨識編號：3係顯示一TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽之胺基酸。
序列辨識編號：4係顯示一TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽之胺基酸。
序列辨識編號：5係顯示編碼一TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：6係顯示編碼一TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：7係顯示編碼一連接子序列之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：8係顯示編碼一TraP8 v2嵌合葉綠體輸送胜肽之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：9係顯示編碼一TraP9 v2嵌合葉綠體輸送胜肽之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：10係顯示編碼一cry2aa基因之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：11係顯示編碼一vip3ab1v6基因之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：12係顯示編碼一vip3ab1v7基因之一多核苷酸序列。
序列辨識編號：13係顯示一胜肽具有胺基酸序列Ser-Val-Ser-Leu。
序列辨識編號：14係顯示編碼西洋油菜EPSPS葉綠體輸送胜肽EQ ID NO：1之多核苷酸序列。
序列辨識編號：15係顯示編碼蕪菁EPSPS葉綠體輸送胜肽EQ ID NO：2之一多核苷酸序列。
較佳實施例之詳細說明 I.幾個實施例之概述
葉綠體輸送胜肽(CTP)(或色素體輸送胜肽)之功能為共轉譯性或後轉譯性，以導引含有CTP之多胜肽至一色素體(例如，葉綠體)上。在本發明之某些實施例中，不論是內生性葉綠體蛋白質或異源性蛋白質，皆可導引至一葉綠體中，藉由表現包含CTP之較大前驅多胜肽之蛋白質而達成。特定實施例中，該CTP可衍生自來自芸苔屬基因之核苷酸序列，例如但不侷限於，併入至少一衍生自直系同源基因之連續序列，其得自不同生物體或其功能性變異體。
在一示範性實施例中，每一者皆編碼一CTP之核酸序列，係由得自於西洋油菜(NCBI Database Accession No.P17688)與蕪菁(NCBI Database Accession No.AAS80163)之EPSPS基因序列中分離出。該編碼CTP之核酸序列係藉由ChloroP預測伺服器分析，而分離出EPSPS基因序列。Emanuelsson et al.(1999),Protein Science 8：978-84(得自cbs.dtu.dk/services/ChloroP)。該分離出之編碼CTP之核酸序列之預測蛋白質產物，為接近60-70個胺基酸長度之輸送胜肽。在此範例中，原始西洋油菜CTP係使用作為參考序列， 用於設計示範性合成之芸苔屬衍生的CTPs，藉由將來自其他CTPs之連續序列，融合至西洋油菜CTP之特定向置上而達成。此種設計流程可發展出一種新穎的合成CTP，依據某些觀點，其來自芸苔屬核酸序列。這些示範性之合成芸苔屬衍生CTPs，在本文件中稱之為TraP8與TraP9。這些示範性合成TraPs係經色素體-定向功能測試，並發現具有色素體定向功能，至少傾向於各原始芸苔屬序列中所觀察到的現象。
在又一示範性實施例中，每一者皆編碼一本發明合成TraP胜肽之核酸序列，係經獨立合成，並可操作性地連接至一編碼黃色螢光蛋白(YFP)之核酸序列上，以產生一合成核酸分子，每一者皆編碼一嵌合TraP：YFP融合多胜肽。此類核酸分子，每一者皆編碼一嵌合TraP：YFP多胜肽，每一者皆引入至一雙偶型載體中，使得每一編碼TraP：YFP之核酸序列可操作性地連接至一AtUbi 10促進子上。
在又一示範性實施例中，含有編碼TraP：YFP之核酸序列之雙偶型載體，可操作性地連接至一AtUbi 10促進子上，每一者皆獨立地、短暫轉型至煙草(Nicotiana benthamiana)上，經由農桿菌-媒介之轉型作用。係使用共軛焦顯微鏡與西方墨漬分析法，確認每一TraP成功地將YFP定向至煙草葉綠體上。
在又一示範性實施例中，每一者皆編碼一本發明合成TraP胜肽之核酸序列，係經獨立地合成，並可操作性地連接至一編碼農業重要之基因序列之核酸序列上。該 TraP序列係融合至具除草性耐受性性狀基因上(如dgt-28與dgt-14)，以產生每一者皆編碼一嵌合TraP：DGT-28或TraP：DGT-14融合多胜肽之核酸分子。此類核酸分子，每一者皆編碼一嵌合TraP：DGT-28或TraP：DGT-14多胜肽，每一者皆引入至一雙偶型載體中，使得每一編碼TraP：dgt-28或TraP：dgt-14之核酸序列，可操作性地連接至一促進子與其他基因調控元件上。該含有編碼TraP：dgt-28或TraP：dgt-14之核酸序列之雙偶型，係用於轉型各植物物種。該基因轉殖植物係經試驗分析其除草劑耐受性，此為DGT-28或DGT-14酵素有表現並轉位至葉綠體之結果。
在又一示範性實施例中，每一者皆編碼一本發明合成TraP胜肽之核酸序列，係經獨立地合成，並可操作性地連接至一編碼農業重要之基因序列之核酸序列上。該TraP序列係融合至具昆蟲耐受性之性狀基因上(如cry2Aa與vip3ab1)，以產生每一者皆編碼一嵌合TraP：Cry2Aa或TraP：Vip3Ab1融合多胜肽之核酸分子。此類核酸分子，每一者皆編碼一嵌合TraP：Cry2Aa或TraP：Vip3Ab1多胜肽，每一者皆引入至一雙偶型載體中，使得每一編碼TraP：Cry2Aa或TraP：Vip3Ab1之核酸序列，可操作性地連接至一促進子與其他基因調控元件上。該含有編碼TraP：Cry2Aa或TraP：Vip3Ab1之核酸序列，係用於轉型各植物物種。該基因轉殖植物係經生物試驗分析其昆蟲抗性，此為Cry2Aa或Vip3Ab1酵素有表現並轉位至葉綠體之結果。
就前述可實施範例之詳細說明，本發明之合成芸 苔屬衍生的CTP序列，以及編碼該序列之核酸，可用於導引任一多胜肽至廣範圍含色素體細胞之色素體上。舉例而言，以此技術領域者可獲得之任一方法，包含合成之芸苔屬衍生的CTP序列與任一第二胜肽序列之N-端融合之嵌合多胜肽，可引入至(或表現於)一含色素體之宿主細胞中，用於將該第二胜肽序列定向至色素體上。因此，在特定實施例中，本發明之TraP胜肽可使希望表現於色素體中之胜肽，其輸入與加工效率增加，與原始CTP相較。
II.縮寫
CTP 葉綠體輸送胜肽
Bt 蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)
EPSPS 3-烯醇丙酮基莽草酸-5-磷酸鹽合成酶
YFP 黃色螢光蛋白質
Ti 腫瘤-引入(衍生自農桿菌(A.tumefaciens)之質體)
T-DNA 轉移DNA
III.術語
為了幫助瞭解本發明之各實施例，係提供下列術語說明：葉綠體輸送胜肽：使用於此，術語“葉綠體輸送胜肽”(CTP)(或“色素體輸送胜肽”)係指一胺基酸序列，當其出現於多胜肽之N-端時，可導引該多胜肽進入含色素體細胞(例如植物細胞，如整體植物或植物細胞培養物)之色素體中。CTP一般為導引蛋白質進入宿主細胞之色素體中(例如 一級、二級或三級色素體，如葉綠體)所必須且足夠的。假定之葉綠體輸送胜肽可藉由數種可獲得運算法(例如，PSORT與ChloroP(得自cbs.dtu.dk/services/ChloroP))之一者辨識出。ChloroP可提供特別良好之CTPs預測。Emanuelsson et al.(1999),Protein Science 8：978-84。然而，以目前之運算法預測功能性CTPs，並無法達到100%準確。因此，以體外或體內試驗方法，證實辨識出之假定CTP的確具有功能，是相當重要的。
葉綠體輸送胜肽可位於進入色素體之多胜肽之N-端。CTP可幫助含有CTP之多胜肽共轉錄或後轉錄運輸至色素體。葉綠體輸送胜肽一般包含約40至約100個胺基酸，且已觀察到，此CTPs含有某些共同特徵。例如：CTPs含有非常少，若有的話，負電性胺基酸(如天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺酸或麩醯胺酸)；CTPs之N端缺乏帶電荷之胺基酸、甘胺酸與脯胺酸；CTP之中心區域亦含有非常高之鹼性或羥基化胺基酸(如蘇胺酸與羥丁胺酸)；以及CTP之C-端富含精胺酸，並具有包含兩性β-折疊結構之能力。在多胜肽進入色素體後，色素體蛋白酶可切斷CTP與含CTP之多胜肽之其他部分。
接觸：使用於此，術語，與一細胞、組織或生物體(例如，植物細胞；植物組織；與植物)“接觸”或“攝入”，以核酸分子而言，包括將核酸分子內化入生物體中，例如但不侷限於：將該生物體與包含該核酸分子之組成物接觸；以及將該生物體浸入包含該核酸分子之溶液中。
內生性：使用於此，術語“內生性”係指物質(如核酸分子與多胜肽)源自於一特定之生物體、組織或細胞。舉例而言，表現於植物細胞中之“內生性”多胜肽，係指該多胜肽正常表現於來自同一物種之非基因改造植物之相同形式細胞中。在一些範例中，芸苔屬之內生性基因(例如EPSPS基因)可用於獲得芸苔屬CTP序列之參考物。
表現：使用於此，一編碼序列(舉例而言，基因或轉基因)之“表現”，係指一核酸轉錄單元(包括如基因體DNA或cDNA)之經編碼資訊，轉換為細胞之操作性、非操作性或結構部分之過程，通常包括蛋白質之合成。基因表現會受到外部訊號之影響；舉例而言，將細胞、組織或生物體暴露於可增加或降低基因表現之試劑中。基因表現可於DNA轉換為RNA再轉換為蛋白質之路徑中之任一處被調節。基因表現之調節，舉例而言，係經由控制作用或轉錄、轉譯、RNA運輸與加工、中間分子如mRNA降解，或經由活化、失活、空間劃分(compartmentalization)，或特定蛋白質分子製造後被降解，或這些過程之組合而達成。基因表現可以技術上已知測量RNA量或蛋白質量之方法而測定，例如但不侷限於：北方墨漬分析法；RT-PCR；西方墨漬分析法；或體外；原位；與體內蛋白質活性試驗法。
基因材料：使用於此，術語“基因材料”包括所有基因，以及核酸分子如DNA與RNA。
異源性：使用於此，術語“異源性”係指一物質(例如核酸分子與多胜肽)並非源自於一特定之生物體、組織 或細胞。舉例而言，表現於植物細胞中之一“異源性”多胜肽，係指該多胜肽並非正常表現於來自同一物種之非基因改造植物之相同形式細胞中(例如，表現於同一生物體之不同細胞或不同生物體之細胞中)。
分離：使用於此，術語“分離”係指一分子(例如核酸分子與多胜肽)實質上與同一種類之其他分子(例如，其他核酸分子與其他多胜肽)分離或純化，其中這些分子在天然產生此分子之生物體細胞中，正常地結合在一起。舉例而言，經分離之核酸分子可於天然產生此核酸分子之生物體細胞中，與染色體DNA或染色體外DNA實質上分離或純化。因此，此術語包括經生化方法純化，如移除其他核酸分子、多胜肽與細胞成分，之重組性核酸分子與多胜肽。此術語包括重組性核酸分子、化學合成之核酸分子，以及重組性製備之多胜肽。
術語“實質上經純化”，使用於此，係指與其他在原始狀態下相結合之其他分子分離。實質上經純化之分子可為組成物中存在之主要物質。實質上經純化之分子可為，舉例而言，至少60%不含、至少75%不含或至少90%不含其他分子，除了天然混合物中存在之溶劑外。術語“實質上經純化”並非指以原始狀態存在之分子。
核酸分子：使用於此，術語“核酸分子”係指聚合形式之核苷酸，包括正向與反向股RNA、cDNA、基因體DNA，以及上述物質之合成形式與混合聚合物形式。核苷酸係指核糖體核苷酸、去氧核糖體核苷酸或此二種核苷酸 之一之修飾形式。“核酸分子”使用於此係為“核酸”與“多核苷酸”之同義詞。核酸分子通常為至少10個鹼基長度，除非另有指出。此術語包括單-與雙股形式之DNA。核酸分子包括雙聚合(稱之為重複)形式，以及核酸分子之轉錄產物。核酸分子可包括天然發生之核苷酸與經修飾之核苷酸之一或二者，經由天然發生及/或非天然發生之核苷酸橋聯而聯結。
核酸分子可經化學性或生化性修飾，或可包含非天然或衍生核苷酸鹼基，如同技術上已知可立即實施者。此類修飾包括，舉例而言，標記、甲基化、將一或更多天然發生之核苷酸以類似物取代、核苷酸內修飾(例如，不帶電之橋聯：舉例而言，甲基磷酸酯、磷三酯、磷醯胺酯、胺基甲酸酯等；帶電橋聯：舉例而言，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；側鏈片段：舉例而言，胜肽；嵌入劑：舉例而言，吖啶、補骨脂素(psoralen)等；螯合劑；烷化劑；以及修飾性橋聯：舉例而言，α-端基異構核酸等)。術語“核酸分子”亦包括任何空間構形，包括單股、雙股、部分雙股、三股、髮夾狀、圓形與掛鎖形構形。
使用於此，就DNA之觀點而言，術語“編碼序列”、“結構性核苷酸序列”或“結構性核酸分子”，係指一核苷酸序列，當置於適當調控序列控制下，最終可經由轉錄與mRNA作用，轉譯為一多胜肽。就RNA而言，術語“編碼序列”係指一核苷酸序列，可轉譯為一胜肽、多胜肽或蛋白質。該編碼序列之邊界可由5'-端之轉譯起始密碼子，以及3'-端之轉譯終止密碼子定義出。編碼序列包括但不侷限於： 基因體DNA；cDNA；ESTs；以及重組性核苷酸序列。
在一些實施例中，本發明包括可經分離、純化或部分純化之核苷酸序列，舉例而言，使用分離方法如，舉例而言，離子交換層析法；分子大小排除純化法或親和性純化法；以於不同溶劑中溶解度不同之性質為基礎之分層技術；以及以基因工程法如倍增、選殖與次選殖。
序列等同度：術語“序列等同度”或“等同度”，使用於此係指二核酸或多胜肽序列之內容，當於特定比較視窗中進行最大對應度之對齊後，二序列之各殘基皆相同。
使用於此，術語“序列等同度百分比”係指在一比較視窗中比較二經最佳化對齊之序列(例如，核酸序列與胺基酸序列)，其中當與參考序列(其不包含加入或刪除殘基)比較時，比較視窗中之序列部分可加入或刪除殘基(亦即空白)，以求該二序列之最佳化對齊。百分比之計算係以二序列中出現之相同核苷酸或胺基酸殘基位置數目，產生配對位置數目，除以在該比較視窗中之總位置數目，再將該結果乘以100，以產生序列等同度百分比。
對齊序列以進行比較之方法為技術上已知。已有各種程式與對齊運算法描述於，如：Smith and Waterman(1981),Adv.Appl.Math.2：482；Needleman and Wunsch(1970),J.Mol.Biol.48：443；Pearson and Lipman(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444；Higgins and Sharp(1988),Gene 73：237-44；Higgins and Sharp(1989),CABIOS 5：151-3；Corpet et al.(1988),Nucleic Acids Res.16： 10881-90；Huang et al.(1992),Comp.Appl.Biosci.8：155-65；Pearson et al.(1994),Methods Mol.Biol.24：307-31；Tatiana et al.(1999),FEMS Microbiol.Lett.174：247-50。序列對齊法與相似度計算之詳細描述可見於如，Altschul et al.(1990),J.Mol.Biol.215：403-10。
生物技術資訊國家中心(NCBI)之基礎局部對齊搜尋工具(Basic Local Alignment Search Tool(BLASTTM；Altschul et al.(1990)))，可得自於數種來源，包括生物技術資訊國家中心(Bethesda,MD)，以及網路上，以連接數種序列分析程式。如何使用此程式決定序列等同度之描述，可見於該網頁上BLASTTM“尋求協助”一節。用於比較核酸序列，BLASTTM(Blastn)程式之“Blast 2序列”功能，可使用BLOSUM62矩陣組之預設值設定參數。當使用此方法評估時，具有與參考序列相當大之相似度之核酸序列，會顯示出等同度百分比增加。
特異性雜交/特異性互補：使用於此，術語“特異性雜交”與“特異性互補”係指有足夠程度之互補性，使得核酸分子與目標核酸分子間可發生穩定與特異性之結合。二核酸分子間之雜交涉及二核酸分子之核酸序列間之逆向平行對齊。之後該二分子可於相對股之對應鹼基間形成氫鍵，以形成雙股分子，若其足夠穩定，便可使用技術上已知之方法偵測。核酸分子並不需要與其目標序列呈100%互補才稱之為特異性雜交。然而，雜交過程之序列互補數目必須有一定量才稱之為特異性，其為所使用之雜交條件之 函數。
依雜交條件產生之特定程度嚴苛性，係依據所選用之雜交方法與組成物，以及雜交核酸序列等特性而定。一般而言，雜交溫度與雜交緩衝溶液之離子強度(尤其是Na+及/或Mg++濃度)，一般可決定雜交之嚴苛度，儘管清洗時間亦會影響嚴苛度。有關於需要達到特定嚴苛度之雜交條件計算，為技術上已知，並討論於，舉例而言，Sambrook et al.(ed.)Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters 9 and 11；and Hames and Higgins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985。關於核酸雜交之更詳細說明與指引係見於，舉例而言，Tijssen,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；以及Ausubel et al.,Eds.,Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。
使用於此，“嚴苛條件”包含在該條件下，雜交分子與目標核酸分子之類似序列間之雜交僅發生20%之未配對。“嚴苛條件”包括其他特定之嚴苛度。因此，使用於此，“中度嚴苛”條件為分子間有大於20%序列未配對而無法雜交；“高度嚴苛”條件為序列間有大於10%之未配對而無法雜 交；以及“非常高度嚴苛”條件為序列間有大於5%之未配對而無法雜交。
下列為代表性、非限制性之雜交條件。
高度嚴苛條件(偵測共享至少90%序列等同度之序列)：於65℃之5x SSC緩衝溶液中雜交16小時；以室溫之2x SSC緩衝液清洗二次，每次15分鐘；以及以65℃之0.5x SSC緩衝液清洗二次，每次20分鐘。
中度嚴苛條件(偵測共享至少80%序列等同度之序列)：於65-70℃之5x-6x SSC緩衝溶液中雜交16-20小時；以室溫之2x SSC緩衝液清洗二次，每次5-20分鐘；以及以55-70℃之1x SSC緩衝液清洗二次，每次30分鐘。
非嚴苛控制組條件(共享至少50%序列等同度之序列會進行雜交)：於55℃之6x SSC緩衝溶液中雜交16-20小時；以室溫之2x-3x SSC緩衝液清洗二次，每次20-30分鐘。
使用於此，術語，一連續核酸序列之“實質上相似”或“實質上相似度”，係指一連續核苷酸序列，可於嚴苛條件下與參考核酸序列進行雜交。舉例而言，實質上相似於參考核酸序列之核酸序列為在嚴苛條件下(例如，前述中度嚴苛條件)，可與參考核酸序列進行雜交者。實質上相似之序列具有至少80%序列等同度。舉例而言，實質上相似之序列具有約80%至100%序列等同度，如約81%；約82%；約83%；約84%；約85%；約86%；約87%；約88%；約89%；約90%；約91%；約92%；約93%；約94%約95%；約96%；約97%；約98%；約98.5%；約99%；約99.5%；以及約100%。 實質上相似之特性接近於特異性雜交。舉例而言，當互補程度足夠時，一核酸分子便可特異性地雜交，而避免在希望產生特異性結合之條件下，如嚴苛雜交條件下，該核酸與非目標序列進行非特異性結合。
使用於此，術語“直系同源物”(或“直系同源”)係指二或多個物種中之一基因，衍生自一共同祖先核苷酸序列，並可於該二或多個物種中維持相同功能。
於此所述，當一序列由5'端讀至3'端之每一個核苷酸，與另一序列由3'端讀至5'端之每一個核苷酸互補時，此二核酸序列分子被稱之為具有“完全互補性”。與參考核苷酸序列互補之核苷酸序列，具有與該參考核苷酸序列之反向互補序列等同之序列。這些術語與描述為技術上熟知，且可輕易地由此技術領域者瞭解。
當決定胺基酸序列間之序列等同度百分比，此技術領域者已知，在對齊時，特定位置之胺基酸等同度可不同，而不影響包含該對齊序列之多胜肽性質。在這些情況下，序列等同度百分比可經調整，以獲得經保守性取代之胺基酸間之類似性。這些調整為已知且為此技術領域者常用。請見，例如，Myers and Miller(1988),Computer Applications in Biosciences 4：11-7。
本發明之實施例包括示範性色素體輸送胜肽胺基酸序列之功能性變異體，與編碼該胺基酸序列之核酸序列。示範性輸送胜肽序列之功能性變異體可為，舉例而言，示範性輸送胜肽胺基酸序列之一片段(如N-端或C-端片 段)，或全長示範性輸送胜肽胺基酸序列之一經修飾序列，或示範性輸送胜肽胺基酸序列之一片段之一經修飾序列。於某些實施例中，示範性輸送胜肽胺基酸序列可藉由導入一或更多保守性胺基酸取代基而修飾。“保守性”胺基酸取代基，為其中胺基酸殘基經另一具有類似功能性側鏈、類似大小及/或類似疏水性之胺基酸殘基取代。相同家族之胺基酸可用於取代同一家族之另一胺基酸，以導入保守性取代，此為技術上已知。舉例而言，這些胺基酸家族包括：鹼性胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸與組胺酸)；酸性胺基酸(例如，天門冬胺酸與麩胺酸)；不帶電荷(於物理性pH值下)之極性胺基酸(例如，甘胺酸、天門冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸與胞嘧啶)；非極性胺基酸(例如，丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸，苯丙胺酸、蛋胺酸與色胺酸)；β-分支胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸與亮胺酸)；以及芳香性胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸與組胺酸)。請見，例如，Sambrook et al.(Eds.),supra；and Innis et al.,PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,1990,Academic Press,NY,USA。
可操作性地聯結：當該第一核苷酸序列與該第二核苷酸序列具有功能關係時，稱之為第一核苷酸序列“可操作性地聯結”至第二核苷酸序列。舉例而言，一促進子可操作性地連接至一編碼序列，若該促進子會影響該編碼序列之轉錄或表現。當經由重組性製造，可操作性地聯結之核苷酸序列一般會連續，且必要時，會聯結二蛋白質編碼區 域於相同序列讀碼區中。然而，核苷酸序列不需要呈連續才稱之為可操作性地聯結。
術語“可操作性地聯結”，當用於調控序列與編碼序列時，係指該調控序列會影響所聯結的編碼序列之表現。“調控序列”或“控制片段”係指一核苷酸序列，其會影響轉錄之時機與規模/量、RNA加工或穩定性，或所聯結之編碼序列之轉譯。調控序列可包括促進子；轉譯領導序列；內含子；增強子；莖環結構；抑制子結合序列；終止序列；多腺苷酸化辨識序列等。特定之調控序列可位於操作性地聯結之編碼序列之上游及/或下游。此外，可操作性地連接至一編碼序列上之特定調控序列，可位於雙股核酸分子之結合互補股上。
當用於二或更多胺基酸序列時，術語“可操作性地聯結”係指該第一胺基酸序列與至少一額外的胺基酸序列具功能上之關係。舉例而言，輸送胜肽(例如，CTP)可操作性地連接至包含該二序列之多胜肽之第二胺基酸序列，若該輸送胜肽會影響該多胜肽或第二胺基酸序列之表現或運送。
促進子：使用於此，術語“促進子”係指一DNA區域，其可位於轉錄起始處之上游，涉及RNA聚合酶與其他蛋白質之辨識與結合，以啟動轉錄作用。促進子可操作性地連接至一編碼序列上，以使其於細胞中表現，或促進子可操作性地連接至編碼一訊號序列之核苷酸序列上，該訊號序列可操作性地連接至一編碼序列上，以使其於細胞 中表現。“植物促進子”為可於植物細胞中啟動轉錄作用之促進子。發育控制之促進子範例包括傾向於某些組織中，如葉、根、種子、纖維、木質部導管、管胞或厚壁，啟動轉錄作用之促進子。此類促進子稱之為“組織-優選”。只在某些組織中啟動轉錄作用之促進子則稱之為“組織-特異”。“細胞類型-特異性”促進子主要會驅動於一或更多器官中之某類細胞類型中表現，舉例而言，根或葉之維管細胞。“誘發性”促進子為可於環境控制下作用之促進子。可使誘發性促進子啟動轉錄作用之環境條件範例包括厭氧條件與光之存在。組織-特異、組織-優選、細胞類型特異，以及誘發性促進子，構成“非組成性”促進子。“組成性”促進子為在大部分環境條件下皆具活性之促進子。
任一誘發性促進子皆可用於本發明之某些實施例中。請見Ward et al.(1993),Plant Mol.Biol.22：361-366。使用誘發性促進子，在誘發劑作用下，轉錄之速率會增加。示範性誘發性促進子包括，但不侷限於：來自ACEI系統之促進子，其對銅有反應；來自玉米之In2基因，其對苯磺醯胺除草劑安全劑有反應；來自Tn10之Tet抑制子；來自類固醇賀爾蒙基因之誘發性促進子，其轉錄活性可被醣皮質激素誘發(Schena et al.(1991),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：0421)。
組成性促進子範例包括，但不侷限於：來自植物病毒之促進子，如在CaMV之35S促進子；來自米肌動蛋白基因之促進子；泛素促進子；pEMU；MAS；玉米H3組蛋 白促進子；以及ALS促進子、西洋油菜ALS3結構基因之5'端Xba1/NcoI片段(或類似於該Xba1/NcoI片段之核苷酸序列)(國際PCT公開號WO 96/30530)。
此外，任一組織-特異性或組織-優選性促進子，皆可用於本發明之某些實施例中。經包含操作性地連接至組織-特異性促進子之編碼序列之核酸分子轉型之植物，可具專一性或傾向於某特定組織中，產生該編碼序列之產物。示範性組織-特異性或組織-優選性促進子包括，但不侷限於：根-優選促進子，如來自芸扁豆蛋白(phaseolin)基因；葉-特異與光-誘發促進子，如來自cab或rubisco；花藥-特異性促進子，如來自LAT52；花粉-特異性促進子，如來自Zm13；以及孢子-優選性促進子，如來自apg。
轉型：使用於此，術語“轉型”或“轉導”係指一或更多核酸分子傳送至細胞中。細胞經核酸分子轉入細胞中而“轉型”，當此核酸分子由細胞穩定複製，不論是核酸分子併入細胞基因體或以基因附體型複製。使用於此，術語“轉型”包含所有可將核酸分子導入此一細胞之技術。範例包括，但不侷限於：以病毒載體轉染；以質體載體轉型；電破法(Fromm et al.(1986),Nature 319：791-3)；脂質體轉染(Felgner et al.(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7)；微注射(Mueller et al.(1978),Cell 15：579-85)；農桿菌-媒介之轉移(Fraley et al.(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)；直接攝入DNA；以及微彈轟擊法(microprojectile bombardment)(Klein et al.(1987),Nature 327：70)。
轉基因：外源性核酸序列。在一些範例中，轉基因可為包含至少一合成芸苔屬衍生CT之多胜肽之一編碼序列。在特定範例中，轉基因可編碼包含至少一合成之芸苔屬衍生的CT之多胜肽，以及至少一額外的胜肽序列(例如，可提供除草劑抗性之胜肽序列)，其中希望表現色素體。在這些與其他範例中，轉基因可包含可操作性地連接至該轉基因(例如，促進子)之編碼序列之調控序列。就本發明之目的而言，當用於一生物體時(例如一植物)，術語“轉基因”係指包含該外源性核酸序列之生物體。在一些範例中，該包含外源性核酸序列之生物體可為其中該核酸序列經由分子轉型技術導入之生物體。在其他範例中，該包含外源性核酸序列之生物體可為其中該核酸序列係經由，舉例而言，滲入一植物或異花授粉而導入之生物體，。
傳輸：使用於此，術語“傳輸”、“定向”與“傳送”係指本發明之胺基酸序列，可幫助含有該胺基酸序列之多胜肽由宿主細胞之細胞核中，移動至宿主細胞之色素體中。在特定實施例中，此一胺基酸序列(亦即，合成之芸苔屬衍生的CTP序列)可傳送約100%、至少約95%、至少約90%、至少約85%、至少約80%，、至少約70%、至少約60%，及/或至少約50%之含有該胺基酸序列之多胜肽，進入宿主細胞之色素體中。
載體：一種被引入細胞中，舉例而言，以產生經轉型細胞之核酸分子。載體可包括可允許宿主細胞複製之 核酸序列，如複製源。載體之範例包括，但不侷限於：質體；黏質體(cosmid)；噬菌體；或帶有外源性DNA進入細胞之病毒。載體亦可包括一或更多基因、反義分子，及/或可挑選標記基因，以及其他技術上已知之基因片段。載體可轉導、轉型或感染一細胞，因而使該細胞表現由載體編碼之核酸分子及/或蛋白質。載體可任擇地包含可幫助核酸分子進入細胞之物質(例如，微脂體、蛋白質外衣等)。
除非另有指出或說明，使用於此之術語“一”與“該”代表“至少一”。
除非另有解釋，所有使用於此之技術與科學術語，皆與一般此技術領域者所認知的相同。在分子生物學所使用之一般術語定義可見於，舉例而言，如Lewin B.,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al.(eds.),The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)；and Meyers R.A.(ed.),Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)。所有百分比皆為重量百分比，所有溶劑混合物之比例皆以體積為基準，除非另有指出。所有溫度皆為攝氏。
IV.包含合成之芸苔屬衍生的CTP-編碼序列之核酸分子
在一些實施例中，本發明係提供一種核酸分子，包含至少一編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列，其操作性地連接至感興趣之核苷酸序列上。在特定實施例 中，該感興趣之核苷酸序列可為編碼一感興趣之多胜肽之核苷酸序列。在特定範例中，可提供單一核酸分子，其編碼一多胜肽，其中TraP8或TraP9序列係融合至感興趣多胜肽之N-端。
合成之芸苔屬衍生的CTP可衍生自芸苔屬EPSPS基因。在此類實施例之特定範例中，芸苔屬EPSPS基因可為包含序列辨識編號：14之核酸序列，或來自EPSPS基因之類似核酸序列，或包含序列辨識編號：14之芸苔屬EPSPS基因之核酸序列之同源基因(舉例而言，包含序列辨識編號：15核酸序列之芸苔屬EPSPS基因)。
在一些實施例中，合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽可為嵌合芸苔屬衍生的CTP。合成之嵌合芸苔屬衍生的CTP可衍生自參考芸苔屬CTP序列，藉由連接芸苔屬CTP序列中之第一連續胺基酸序列，與另一CTP序列(例如，第二芸苔屬CTP序列)之第二連續胺基酸序列。在特定實施例中，該包含第二連續胺基酸序列之另一CTP序列，可由參考序列之芸苔屬基因體以外之芸苔屬同源基因序列編碼(例如，不同之芸苔屬、非芸苔屬植物；較低等之光合真核生物，舉例而言，綠藻；以及原核生物，舉例而言，藍綠藻或農桿菌)。因此，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列可衍生自參考芸苔屬CTP-編碼基因序列，藉由融合該參考芸苔屬CTP序列之連續胺基酸序列之編碼核苷酸序列，與另一CTP序列之連續胺基酸序列之編碼核苷酸序列，其與參考芸苔屬CTP序列之剩餘部分同源。在這些 與其他範例中，參考芸苔屬CTP序列之連續胺基酸序列，可位於合成之芸苔屬衍生的CTP之5'端或3'端。
在一些實施例中，合成嵌合芸苔屬衍生的CTP可衍生自複數個芸苔屬CTP序列(包括參考芸苔屬CTP序列)，藉由結合一芸苔屬CTP序列中之連續胺基酸序列，與另一芸苔屬CTP序列中之連續胺基酸序列。在特定實施例中，複數個芸苔屬CTP序列可由另一芸苔屬物種之同源基因序列編碼。在一些範例中，複數個芸苔屬CTP序列可恰為二芸苔屬CTP序列。因此，編碼一合成嵌合芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列，可衍生自二同源(例如，實質上同源)芸苔屬CTP-編碼基因序列(例如，同源基因序列)，藉由融合一芸苔屬CTP序列之連續胺基酸序列之編碼核苷酸序列，與另一芸苔屬CTP序列之連續胺基酸序列之編碼核苷酸序列，其與該第一芸苔屬CTP序列之剩餘部分同源。TraP8與TraP9為此類合成嵌合芸苔屬衍生的CTP之範例。
此技術領域者應瞭解到，經過篩選參考芸苔屬CTP序列中之第一連續胺基酸序列後，依據前述推衍過程辨識與篩選同源CTP序列之剩餘部分之連續胺基酸序列，便為明確且自發性。在一些範例中，該第一連續胺基酸序列可為約25至約41個胺基酸長度(例如，24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41與42個胺基酸長度)。在一些實施例中，該參考芸苔屬CTP序列中之第一連續胺基酸序列係由3'端之“SVSL”(序列辨識編號：13)模體位置定義出，其在某些芸苔屬EPSPS基因 中為保守性。
前述方法中之合成嵌合芸苔屬衍生的CTP序列之範例為序列辨識編號：3與序列辨識編號：4。就基因密碼子之退化性(degeneracy)而言，編碼這些胜肽之核苷酸序列之屬(genus)，可由此技術領域者立即得知。此類多核苷酸序列之範例包括序列辨識編號：5、6、8與9。這些特定範例說明合成嵌合芸苔屬衍生的CTPs之結構特徵，其加入來自西洋油菜ESPSP基因之數個ESPSP直系同源物之一者之同源CTP之連續序列。
某些實施例包括合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽之功能性變異體，及/或編碼其之核酸。此類功能性變異體，包括如，但不侷限於：合成之芸苔屬衍生的CTP-編碼序列，其衍生自如序列辨識編號：14，及/或序列辨識編號：15之芸苔屬CTP-編碼序列一或二者之同源物及/或直系同源物，及/或由其編碼之CTP；包含如序列辨識編號：1及/或序列辨識編號：2之連續胺基酸序列之合成芸苔屬衍生的CTP之編碼核酸，及/或由其編碼之CTP；截斷之合成芸苔屬衍生的CTP-編碼序列，其包含如序列辨識編號：5、6、8與9之一連續核酸序列；截斷之合成芸苔屬衍生的CTP-編碼序列，其包含一實質上同源於序列辨識編號：5、6、8與9之一者之連續核酸序列；截斷之合成芸苔屬衍生的CTP，其包含如序列辨識編號：3與4之一之連續胺基酸序列；包含如序列辨識編號：5、6、8與9之一者之合成芸苔屬衍生的CTP之連續胺基酸序列之編碼核酸，及/或由其編 碼之CTP；包含如序列辨識編號：3與4之一者之合成芸苔屬衍生的CTP之連續胺基酸序列，其具有一或更多之保守性胺基酸取代基，之編碼核酸，及/或由其編碼之CTP；以及包含如序列辨識編號：3與4之一者之合成芸苔屬衍生的CTP之連續胺基酸序列，其具有一或更多之非保守性胺基酸取代基，可於含色素體細胞中直接操作聯結該胜肽至一色素體，之編碼核酸，及/或由其編碼之CTP。
因此，本發明之某些實施例包括一核酸分子，其包含編碼含有一或更多保守性胺基酸取代基之合成嵌合芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列。此一核酸分子可用於，舉例而言，幫助本發明CTP-編碼序列於分生技術中之操作。舉例而言，在一些實施例中，本發明之CTP-編碼序列可導入適當之載體中，以將該序列次選殖至表現載體上，或本發明之CTP-編碼序列可導引至一核酸分子上，其可幫助製造另一含有與一感興趣核苷酸序列操作性連接之CTP-編碼序列之核酸分子。在這些與其他實施例中，合成嵌合芸苔屬衍生的CTP序列上之一或更多胺基酸位置可被刪除。舉例而言，合成嵌合芸苔屬衍生的CTP序列可經修飾，使得序列位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20之胺基酸被刪除。同源CTP序列之對齊，可用於提供刪除哪一個胺基酸不會影響合成CTP之功能之資訊。
在特定範例中，合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽長度小於80個胺基酸。舉例而言，合成之芸苔屬衍生 的CTP可為79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60或更少之胺基酸長度。在某些範例中，合成之芸苔屬衍生的CTP可為約65、約68、約72或約74個胺基酸長度。在這些與其他範例中，合成之芸苔屬衍生的CTP可包含一胺基酸序列，如序列辨識編號：3與4之一，或前述任一者之功能性變異體。因此，合成之芸苔屬衍生的CTP可包含一胺基酸序列，其包含序列辨識編號：3與4之一，或其功能性變異體，其中合成之芸苔屬衍生的CTP之長度小於80個胺基酸長度。在某些範例中，合成之芸苔屬衍生的CTP可包含一，其，例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，或100%等同於序列辨識編號：3與4之一者。
所有編碼特定合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列，舉例而言，序列辨識編號：3之TraP8胜肽與序列辨識編號：4之TraP9胜肽，或前述任一者之功能性變異體，包括任一特定之刪除，及/或保守性胺基酸取代，皆可經由本揭示使此技術領域者瞭解。基因密碼子之退化演算係提供有限數目之特定胺基酸序列之編碼序列。編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之特定序列之篩選為操作者之考量。不同操作者可能會希望使用不同之編碼序列。舉例而言，為了增加合成之芸苔屬衍生的CTP於特定宿主中之表現，可選用宿主偏好使用之密碼子之編碼序列。例如，合成之芸苔屬衍生的CTP可由核苷酸序列序列辨識編號：5、6、8與9 編碼。
本發明某些實施例中提供之核酸分子，合成之芸苔屬衍生的CTP之編碼核苷酸序列之最後一個密碼子，與感興趣之核苷酸序列之第一個密碼子，可以任何數量之核苷酸三元體分隔，例如，不含內含子或“終止”訊號。在一些範例中，天然前驅多胜肽中，與葉綠體輸送胜肽結合之成熟蛋白質之第一個胺基酸之編碼序列，可存在於編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列之最後一個密碼子，與感興趣之核苷酸序列之第一個密碼子之間。分隔合成之芸苔屬衍生的CTP之編碼核苷酸序列之最後一個密碼子，與感興趣之核苷酸序列之第一個密碼子之序列，舉例而言，可由任一序列組成，使得該經編碼之胺基酸序列不會明顯改變嵌合多胜肽之轉譯，以及其於色素體中之轉位。在這些與其他實施例中，編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列之最後一個密碼子，可於相紀錄區(phase-register)與感興趣之核苷酸序列之第一個密碼子直接連續融合，或由短胜肽序列，如由合成核苷酸連接子(例如，用於達成融合之核苷酸連接子)編碼者，分隔。
在一些實施例中，希望修飾感興趣核苷酸序列上之核苷酸，及/或合成之芸苔屬衍生的CTP-編碼序列，其融合至單一編碼序列，舉例而言，以加強該編碼序列於特定宿主中之表現。基因密碼有64個可能密碼子，但大部分之生物體較喜歡使用這些密碼子之子群組。在某一物種中最常利用之密碼子稱之為最佳密碼子，而不常使用者則稱之 為罕用或低使用率密碼子。Zhang et al.(1991),Gene 105：61-72。密碼子可經替代，以反應特定宿主之較佳密碼子使用率，此過程有時稱之為“密碼子最佳化”。可製備含有原核或真核宿主偏好之密碼子之最佳化編碼序列，舉例而言，以增加轉譯速率或產生具希望特性之重組性RNA轉錄物(例如，較長之半生期，與非最佳化序列所產生之轉錄物相較)。
任何多胜肽皆可藉由加入合成之芸苔屬衍生的CTP序列，而定向至含色素體細胞之色素體上。舉例而言，在一些實施例中，多胜肽可聯結至合成之芸苔屬衍生的CTP序列上，以導引該多胜肽至細胞中之色素體上，其中該聯結之多胜肽-CTP分子係經表現。在特定實施例中，藉由加入合成之芸苔屬衍生的CTP序列而定向至色素體上之多胜肽，舉例而言，可為於細胞之色素體中正常表現之多胜肽，其中該多胜肽原始表現。例如，但不侷限於，藉由加入合成之芸苔屬衍生的CTP序列而定向至色素體上之多胜肽，可為涉及除草劑抗性、病毒抗性、噬菌體抗性、昆蟲抗性、線蟲抗性或黴菌抗性之多胜肽。請見如美國專利號5,569,823；5,304,730；5,495,071；6,329,504；以及6,337,431。藉由加入合成之芸苔屬衍生的CTP序列，而定向至色素體上之多胜肽，亦可為，例如，但不侷限於，涉及植物生命力或產率之多胜肽(包括涉及極端溫度、土壤條件、光量、水量與化學環境耐受度之多胜肽)，或可使用作為標記物，以辨識含有感興趣性狀之植物之多胜肽(例如， 可挑選標記基因產物、涉及種子顏色之多胜肽等)。
涉及除草劑抗性之多胜肽，其與本發明某些實施例之合成之芸苔屬衍生的CTP序列聯結之非限制性範例包括：乙酸乳醣合成酶(ALS)、經突變之ALS與ALS前驅物(請見如美國專利號5,013,659)；EPSPS(請見如美國專利號4,971,908與6,225,114)，如CP4 EPSPS，為第III族EPSPS或第IV族EPSPS；修飾色素體中之生理過程之酵素，包括光合作用，以及脂肪酸、胺基酸、油、類胡蘿蔔素、類萜與澱粉之合成。其他在特定實施例中，與合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽聯結之多胜肽範例包括：玉米黃質環氧酶、膽鹼單氧酶、亞鐵螯合酶、ω-3脂肪酸去飽和酶、麩醯胺酸合成酶、澱粉修飾酵素、涉及必需胺基酸合成之多胜肽、原維生素A、激素、Bt毒素蛋白質等。編碼前述胜肽之核苷酸序列為技術上已知，且此核苷酸序列可操作性地連接至編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列上，以表現包含該與合成之芸苔屬衍生的CTP聯結之感興趣多胜肽之多胜肽。此外，由任一前述之額外核苷酸序列編碼之多胜肽，可由此技術領域者辨識出(舉例而言，藉由選殖與特定多胜肽之編碼基因具有高同源性之其他基因而達成)。一旦此核苷酸序列被辨識出，便可直接設計包含有合成之芸苔屬衍生的CTP-編碼序列，其與辨識出之核苷酸序列操作性地連接，之核苷酸序列，或編碼其等效多胜肽之序列。
V.表現包含合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽之多胜肽
在一些實施例中，包含編碼一多胜肽之核苷酸序 列之至少一核酸分子，其中該多胜肽至少一合成之芸苔屬衍生的CTP或其功能等效物，可引入一細胞、組織或生物體中，以於其中表現該多胜肽。在特定實施例中，一核酸分子可包含一感興趣之核苷酸序列，其可操作性地連接至編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列上。舉例而言，核酸分子可包含一編碼序列，其編碼包含至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽，以及由感興趣核苷酸序列所編碼之至少一額外胜肽序列。在一些實施例中，本發明之核酸分子可引入含有色素體之宿主細胞、組織或生物體中(例如，植物細胞、植物組織與植物)，使得由該核酸分子表現之多胜肽可於該含色素體之宿主細胞、組織或生物體中表現，其中表現出之多胜肽包含至少一合成之芸苔屬衍生的CTP，以及由感興趣之核苷酸序列所編碼之至少一額外胜肽序列。在某些範例中，此經表現之多胜肽之合成芸苔屬衍生的CTP，可幫助含有該至少一額外胜肽序列之多胜肽之一部份，定向至宿主細胞、組織或生物體之色素體上。
在某些實施例中，本發明核酸分子可藉由使用此技術領域者所知之方法學，引入含色素體之細胞中。在特定實施例中，宿主細胞、組織或生物體可與本發明之一核酸分子接觸，以將該核酸分子引入該細胞、組織或生物體中。在特定實施例中，細胞可經本發明之核酸分子轉型，使得該核酸分子可引入該細胞，且該核酸分子可穩定融入細胞之基因體。在一些實施例中，包含至少一編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之核苷酸序列，其可操作性地連接至一 感興趣之核苷酸序列上，之核酸分子，可用於轉型一細胞，舉例而言，含色素體之細胞(例如，植物細胞)。為了啟動或增強表現，核酸分子可包含一或更多調控序列，其中調控序列可操作性地連接至該含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之編碼核苷酸序列上。
舉例而言，該核酸分子可為載體系統，包括如直線形或封閉式圓形質體。在特定實施例中，該載體可為一表現載體。本發明之核酸序列，舉例而言，可插入一載體中，使得該核酸序列可操作性地連接至一或更多調控序列上。依此目的可使用多種載體，而特定載體之篩選可依據，舉例而言，待插入載體之核酸大小，以及以該載體轉型之特定宿主細胞而定。載體一般包含各種組成，其等同度依據載體之功能(例如，用於複製DNA，以及表現DNA)，以及與該載體相容之特定宿主細胞而定。
某些實施例可包括植物轉型載體，其包含含有至少一上述之調控序列之核苷酸序列，該調控序列與編碼合成之芸苔屬衍生的CTP之一或更多核苷酸序列操作性地聯結。該一或更多核苷酸序列可於該調控序列之控制下，於植物細胞、組織或生物體中表現，以產生包含合成之芸苔屬衍生的CTP，其可使該多胜肽之至少一部分定向至植物細胞、組織或生物體之色素體。
在某些實施例中，可與編碼合成之芸苔屬衍生的CTP操作性地聯結之一或更多核苷酸序列之調控序列，可為促進子序列，其可作用於宿主細胞中，如細菌細胞，其 中該核酸分子可經倍增，或植物細胞，其中該核酸分子可經表現。適用於本發明核酸分子中之促進子，包括誘發性、病毒性、合成或組成性促進子，這些皆為技術上已知。可用於本發明實施例中之促進子非限制性範例可見於：美國專利號6,437,217(玉米RS81促進子)；5,641,876(米肌動蛋白促進子)；6,426,446(玉米RS324促進子)；6,429,362(玉米PR-1促進子)；6,232,526(玉米A3促進子)；6,177,611(組成性玉米促進子)；5,322,938、5,352,605、5,359,142與5,530,196(35S促進子)；6,433,252(玉米L3油體蛋白促進子)；6,429,357(米肌動蛋白2促進子，以及米肌動蛋白2內含子)；6,294,714(光誘發促進子)；6,140,078(鹽類誘發促進子)；6,252,138(病原誘發促進子)；6,175,060(磷缺乏誘發促進子)；6,388,170(雙向促進子)；6,635,806(γ-薏苡醇溶蛋白促進子)；以及美國專利申請系列號09/757,089(玉米葉綠體醛縮酶促進子)。
其他示範性促進子包括胭脂鹼合成酶(NOS)促進子(Ebert et al.(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-9)；章魚鹼合成酶(OCS)促進子(其帶有農桿腫瘤菌之腫瘤誘發質體)；花椰菜病毒促進子如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)19S促進子(Lawton et al.(1987),Plant Mol.Biol.9：315-24)；CaMV 35S促進子(Odell et al.(1985),Nature 313：810-2；玄參嵌合病毒35S-促進子(Walker et al.(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-8)；蔗糖合成酶促進子(Yang and Russell(1990),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-8)；R基因複合物促進子(Chandler et al.(1989), Plant Cell 1：1175-83)；葉綠素a/b結合蛋白質基因促進子；CaMV35S(美國專利號5,322,938、5,352,605、5,359,142與5,530,196)；FMV35S(美國專利號6,051,753與5,378,619)；PC1SV促進子(美國專利號5,850,019)；SCP1促進子(美國專利號6,677,503)；以及AGRtu.nos促進子(GenBank Accession No.V00087；Depicker et al.(1982),J.Mol.Appl.Genet.1：561-73；Bevan et al.(1983),Nature 304：184-7)。
在特定實施例中，本發明之核酸分子可包含組織-特異性促進子。組織-特異性促進子為一核苷酸序列，其可驅動組織中經可操作性地聯結之核苷酸序列進行大量轉錄，其中促進子具特異性，相對於生物體之其他組織而言。組織-特異性促進子之範例包括，但不侷限於：絨氈層-特異性促進子；花藥-特異性促進子；花粉-特異性促進子(請見，例如，美國專利號7,141,424，以及國際專利PCT公開號WO 99/042587)；胚珠-特異性促進子；(請見如美國專利申請號2001/047525 A1)；果實-特異性促進子(請見如美國專利號4,943,674與5,753,475)；以及種子-特異性促進子(請見如美國專利號5,420,034與5,608,152)。在一些實施例中，發育階段-特異性促進子(例如，在發育較晚期活化之促進子)可用於本發明之組成物或方法中。
在某些實施例中，可與一核酸分子操作性地連接之額外調控序列，包括位於促進子序列與編碼序列間之5' UTRs，其作用為轉譯領導序列。該轉譯領導序列可存在於完全加工之mRNA中，且可影響初級轉錄之加工，及/或RNA 穩定性。轉譯領導序列之範例包括玉米與矮牽牛熱休克蛋白質領導序列(美國專利號5,362,865)、植物病毒外衣蛋白質領導序列、植物rubisco領導序列，以及其他領導序列。請見，例如，Turner and Foster(1995),Molecular Biotech.3(3)：225-36。5' UTRs之非限制性範例係提供於：GmHsp(美國專利號5,659,122)；PhDnaK(美國專利號5,362,865)；AtAnt1；TEV(Carrington and Freed(1990),J.Virol.64：1590-7)；以及AGRtunos(GenBank Accession No.V00087；and Bevan et al.(1983),Nature 304：184-7)。
在某些實施例中，可與一核酸分子操作性地連接之額外調控序列，亦包括3'非-轉譯序列、3'轉錄終止區域，或聚腺苷酸化區域。這些為位於核苷酸序列下游之基因元件，並包括可提供聚腺苷酸化訊號，及/或其他可影響轉錄或mRNA加工之調節訊號之多核苷酸。在植物中，聚腺苷酸化訊號之作用會使聚腺苷酸加至mRNA前驅物之3'端。聚腺苷酸化序列可衍生自各種植物基因或T-DNA基因。3'轉錄終止區域之非限制性範例為胭脂合成酶3'端區域(nos 3'；Fraley et al.(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)。使用不同之3'端非-轉譯序列之範例係提供於Ingelbrecht et al.,(1989),Plant Cell 1：671-80.Non-limiting examples of polyadenylation signals include one from a Pisum sativum RbcS2 gene(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi et al.(1984),EMBO J.3：1671-9)，以及AGRtu.nos(GenBank Accession No.E01312)。
本發明之重組性核酸分子或載體可包含一可挑選(selectable)標記物，其可使經轉型之細胞如植物細胞，產生可挑選表型。可挑選標記物亦可用於篩選含有本發明重組性核酸分子之植物或植物細胞。該標記物可編碼殺蟲劑抗性、抗生素抗性(例如，卡那黴素、遺傳黴素(G418)、博萊黴素、潮黴素等)，或除草劑抗性(例如，草甘膦等)。可挑選標記物之範例包括，但不侷限於：neo基因，其編碼卡那黴素抗性，並可使用卡那黴素、G418等篩選；pat或bar基因，其編碼雙丙氨磷抗性；EPSP合成酶突變異體基因，其編碼草甘膦抗性；腈水解酶基因，其提供溴苯腈抗性；乙醯乳酸合成酶突變異體基因(ALS)，其提供咪唑啉酮或磺脲抗性；以及氨甲喋呤抗性DHFR基因。目前已可取得多重可挑選標記物，其可產生安比西林、博萊黴素、氯黴素、慶大霉素、潮黴素、卡那黴素、林可黴素、氨甲喋呤、草銨膦、嘌呤黴素、觀黴素、利福平、鏈黴素與四環黴素，以及類似物之抗性。此類可挑選標記物之範例示於例如，美國專利號5,550,318；5,633,435；5,780,708與6,118,047。
本發明之重組性核酸分子或載體亦可包含或另包含一可篩選(screenable)標記物。可篩選標記物可用於監控表現情況。示範性可篩選標記物包括β-葡萄糖醛酸酶或uidA基因(GUS)，已知其編碼各種顯色物質(Jefferson et al.(1987),Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405)；R-locus基因，其編碼可調節植物組織中產生花青素染料(紅色)之產物(Dellaporta et al.(1988),“Molecular cloning of the Corn R-nj allele by transposon tagging with Ac.”In 18 th Stadler Genetics Symposium,P.Gustafson and R.Appels,eds.(New York：Plenum),pp.263-82)；β-內醯胺酶基因(Sutcliffe et al.(1978),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：3737-41)；已知其編碼各顯色受質之酵素(例如，PADAC、顯色頭孢黴素)；螢光素酶基因(Ow et al.(1986),Science 234：856-9)；xylE基因，其編碼兒茶酚雙加氧酶，其可轉換顯色兒茶酚(Zukowski et al.(1983),Gene 46(2-3)：247-55)；澱粉酵素基因(Ikatu et al.(1990)Bio/Technol.8：241-2)；酪胺酸酶基因，其編碼可將酪胺酸酶氧化成DOPA與多巴醌，之後可縮合為黑色素之酵素(Katz et al.(1983),J.Gen.Microbiol.129：2703-14)；以及α-半乳醣苷酶。
可使宿主細胞轉型之適當方法包括可將DNA引入細胞之任一方法，例如但不侷限於：藉由原生質體之轉型(請見如美國專利號5,508,184)；藉由乾燥/抑制媒介之DNA吸收(請見，例如，Potrykus et al.(1985),Mol.Gen.Genet.199：183-8)；藉由電破法(請見，例如，美國專利號5,384,253)；藉由與碳化矽纖維一同攪拌(請見，例如，美國專利號5,302,523與5,464,765)；藉由農桿菌-媒介轉型(請見，例如，美國專利號5,563,055、5,591,616、5,693,512、5,824,877、5,981,840與6,384,301)；以及藉由DNA-塗佈顆粒加速法(請見如美國專利號5,015,580、550,318、538,880、160,208、399,861與6,403,865)等。經由施加這些技術，實質上各物種之細胞皆可被穩定轉型。在某些實施例中，轉 型用DNA係融入宿主細胞之基因體中。就多細胞物種而言，基因轉殖細胞可再生為基因轉殖生物體。或者，該基因轉殖細胞無法再生成為一植物。此類技術之任一者可用於產生一基因轉殖植物，舉例而言，該基因轉殖植物之基因體中包含一或更多本發明之核酸序列。
將表現載體引入植物最廣泛使用之方法，係以農桿菌之天然轉型系統為基礎。根癌農桿菌與發根農桿菌為植物病原土壤細菌，其可基因轉型植物細胞。根癌農桿菌與發根農桿菌之Ti與Ri質體，分別帶有可使植物基因轉型之基因。Ti(腫瘤誘發)-質體含有大片段，已知為T-DNA，其可傳送至經轉型之植物中。Ti質體之另一片段，vir區域，功用為T-DNA之傳送。T-DNA區域由末端重複界定邊界。在某些經修飾之雙元載體中，該腫瘤誘發基因經刪除，vir區域之功能便可用於傳送外來之DNA，其由T-DNA邊界序列界定邊界。該T-區域亦可包含如可挑選標記物，以有效地回收基因轉殖植物與細胞，以及插入序列之多重選殖位置，以傳送如合成之芸苔屬衍生的CTP-編碼核酸。
因此，在一些實施例中，植物轉型載體可衍生自根癌農桿菌之Ti質體(請見如美國專利號4,536,475、4,693,977、4,886,937與5,501,967；以及歐洲專利EP 0 122 791)，或發根農桿菌之Ri質體。額外之植物轉型載體包括如，但不侷限於，Herrera-Estrella et al.(1983),Nature 303：209-13；Bevan et al.(1983),Nature 304：184-7；Klee et al.(1985),Bio/Technol.3：637-42；以及歐洲專利號EP 0 120 516中所描述者，以及衍生自前述任一者。其他細菌如中華根瘤菌、根瘤菌與慢生根瘤菌，其可與植物自然地作用，可經修飾以媒介基因傳送至數種多樣化植物中。這些與植物共生之細菌可由卸甲(disarmed)Ti質體與適當之二元載體合併而傳送基因。
將外源性DNA提供至受體細胞中後，經轉型之細胞一般經辨識出，而進一步培養與植物再生。為了增進辨識轉型細胞之能力，希望使用如前所述之可挑選或可篩選標記基因，以及與用於產生轉型物之載體結合。若使用可挑選標記物，便可藉由將細胞暴露於篩選試劑或試劑群下，於有轉型潛力之細胞族群中辨識出經轉型之細胞。若使用可篩選標記物，可挑選出具有希望標記基因性狀之細胞。
可於挑選試劑暴露環境下存活之細胞，或於篩選試驗中評估為陽性之細胞，可培養於支持植物再生之培養基中。在一些實施例中，任何適當之植物組織培養基(例如，MS與N6培養基)，皆可藉由加入其他物質而修飾，如生長調節劑。組織可維持於具有生長調節劑之基礎培養基中，直到獲得可啟動植物再生效應之足夠組織，或重複數回人工篩選，直到組織型態適合再生(例如至少2週)，之後轉移至可誘發地上部形成之培養基中。培養物可週期性地轉移，直到地上部形成。一旦地上部形成，其便被轉移至可誘發根部形成之培養基中。一旦形成足夠之根部，此植物便可轉移至土壤中，進一步生長與成熟。
為了確認感興趣之核酸分子(舉例而言，編碼包 含至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列)存在於一再生殖物中，可進行各種試驗。此類試驗包括如：分子生物試驗如南方與北方墨漬分析、PCR與核酸定序；生化試驗如偵測蛋白質產物之出現，例如，以免疫方法(ELISA及/或西方墨漬分析法)或酵素功能；植物部分試驗法如葉或根試驗；以及整體再生植物表型之分析。
舉例而言，融合品系可經PCR倍增法分析，使用如特異於感興趣核苷酸序列之寡核苷酸引子。PCR基因型鑑定法包括，但不侷限於，基因體DNA之聚合酶連鎖反應(PCR)倍增，其衍生自分離出之宿主植物組織，預測該組織含有融入基因體之感興趣核酸分子，之後以標準選殖與定序法分析該PCR倍增產物。PCR基因鑑定之方法已描述(請見如，Rios,G.et al.(2002),Plant J.32：243-53)，並可應用於衍生自任一植物物種之基因體DNA(例如，Z.mays或G.max)或組織類型，包括細胞培養物。
使用農桿菌-依賴性轉型方法形成之基因轉殖植物，一般會含有單一重組性DNA序列插入一染色體中。該單一重組性DNA序列稱之為“基因轉殖品系”或“融入品系”。此基因轉殖植物為插入DNA序列之異型合子。在一些實施例中，與一轉基因呈同型合子之基因轉殖植物，可與獨立分離體基因轉殖植物，其含有單一外源性基因序列，舉例而言，F0植物，交配(自交)，以產生F1種子。所產生的F1種子有四分之一，與該轉基因為同型合子。使F1種子發芽，可產生經測試為異型合子之植物，一般使用SNP試驗 或熱倍增試驗，其可分辨出異型合子與同型合子(亦即，接合性試驗)。
在特定實施例中，包含至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之至少一多胜肽複本，可於含色素體細胞中製造，該細胞引入至少一核酸分子，其含有編碼該至少一合成芸苔屬衍生的CTP之至少一多胜肽之核苷酸序列。每一含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽，可表現自多重核酸序列，其引入不同之轉型品系中，或表現自單一核酸序列，其引入單一轉型品系中。在一些實施例中，複數個此類多胜肽係於單一促進子控制下表現。在其他實施例中，複數個此類多胜肽係於多個促進子之控制下表現。單一多胜肽可以包含多個胜肽序列之方式表現，每一者皆定向至一色素體。
除了以重組性核酸分子直接轉型一植物，基因轉殖植物亦可由具有至少一基因轉殖品系之第一植物，與缺乏此類品系之第二植物交配而得。舉例而言，含有編碼包含至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列之重組性核酸分子，可引入第一植物株中而轉型，以產生基因轉殖植物，該基因轉殖植物可與第二植物株交配，以使編碼該多胜肽之核苷酸序列基因滲入該第二植物株。
VI.包含合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽-導引之多胜肽之植物材料
在一些實施例中，係提供一植物細胞，其中該植物細胞包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多 胜肽之核苷酸序列。在特定實施例中，此植物細胞可經由轉型無法再生製造植物之植物細胞而產生。在一些實施例中，係提供一植物，其中該植物包含一植物細胞，其包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列。在特定實施例中，此一植物可由一植物組織或植物細胞轉型，以及由整株植物再生而製造。在其他實施例中，此一植物可由商業來源獲得，或經由包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列，基因滲入至種源而得。在特定實施例中，此一植物包含無法再生製造一植物之植物細胞，其包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列。係提供一種植物材料，其包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列之植物細胞。此一植物材料可由包含該植物細胞之植物獲得。
包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之核苷酸序列之基因轉殖植物、非再生性植物細胞或植物材料，於某些實施例中可具有一或更多下列特徵：於植物之細胞中表現該多胜肽；於植物之細胞之色素體中表現該多胜肽之一部分；將該多胜肽由植物細胞之細胞質輸入至細胞之色素體中；於植物之細胞中，色素體-特異性地表現該多胜肽；及/或於植物之細胞中局部定位該多胜肽。此一植物可額外地具有一或更多希望之性狀，除了表現該經編碼之多胜肽外。此性狀可包括如：昆蟲抗性、其他害蟲抗性以及致病試劑抗性；除草劑耐受性；增強之 穩定性、產率或儲存期；環境耐受性；藥物製造；工業產物製造；以及營養強化。
本發明之基因轉殖植物為可以本發明核酸分子轉型之任一植物。雙子葉或單子葉。可用於本發明方法之雙子葉植物之非限制性範例包括阿拉伯芥屬、紫花苜蓿、豆類、花椰菜、捲心菜、胡蘿蔔、花菜、芹菜、白菜、棉花、黃瓜、茄子、萵筍、甜瓜、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、南瓜、蘿蔔、油菜、菠菜、大豆、南瓜(squash)、甜菜、向白葵、煙草、番茄和西瓜。可用於本發明方法之單子葉植物之非限制性範例包括玉米、芸苔屬、洋蔥、米、高粱、小麥、黑麥，粟、甘蔗、燕麥、黑麥、柳枝稷，和草坪(turfgrass)。本發明之基因轉殖植物可以任何方式使用或培養。
某些實施例亦提供編碼含有至少一合成芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之一或更多核苷酸序列之商品產物，舉例而言，得自含有一或更多此類核苷酸序列之重組性植物或種子之商品產物。含有一或更多核苷酸序列之商品產物，其中該一或更多核苷酸序列編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽，包括如，但不侷限於：食物產物、餐飲產品、油類，或壓碎或全穀物，或包含編碼含有至少一合成芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之一或更多核苷酸序列之植物。於一或更多商品或商品產物中刪除編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之一或更多核苷酸序列，提供證據說明該商品或商品產物至少一部分，係 由包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之一或更多核苷酸序列之植物製造。在特定實施例中，本發明之商品產物包含一可偵測量之核酸序列，其編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽。在一些實施例中，此類商品產物可由基因轉殖植物，以及由其製備之食物或飼料中獲得。
在一些實施例中，基因轉殖植物、非再生植物細胞，或包含編碼含有至少一合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之轉基因，其基因體中亦可包含至少一其他轉基因品系，包括，但不侷限於：由iRNA分子轉錄而得之轉基因品系；編碼殺蟲性蛋白質之基因(例如，蘇雲金芽胞桿菌殺蟲性蛋白質)；除草劑耐受性基因(例如，提供可耐受草甘膦之基因)；提供基因轉殖植物希望之表型(例如，產率增加、改變脂肪酸代謝或回復細胞質雄性不育)之基因。
VII.合成之芸苔屬衍生的葉綠體輸送胜肽-媒介之基因產物局部定位至色素體上
本發明之某些實施例提供表現及/或局部定位基因產物至色素體(例如，葉綠體)之方法。在特定實施例中，基因產物可為標記基因產物，舉例而言，螢光分子。基因產物之表現可為多胜肽一部份，亦含有合成之芸苔屬衍生的CTP，可提供評估特定合成之芸苔屬衍生的CTP序列之色素體-局部定位能力之系統。在一些實施例中，標記基因產物之表現，作為含合成之芸苔屬衍生的CTP之多胜肽之一部分，係用於將標記基因產物之表現物，定向至細胞之色 素體中，其中該多胜肽於該處表現。在某些實施例中，此一標記基因產物係局部定位至宿主細胞之色素體中。舉例而言，該標記基因產物於宿主細胞色素體中之表現量高於細胞質或其他胞器；該標記基因產物可於色素體中表現相當高量；該標記基因產物可實質上僅於色素體中表現；或該標記基因產物可完全於色素體中表現，使得於細胞質或非色素體胞器中之表現無法偵測到。
在一些實施例中，含有合成之芸苔屬衍生的CTP之功能變異體之多胜肽，其中該多胜肽可與一標記基因產物操作性地連接，係用於評估功能變異體胜肽之特徵。舉例而言，合成之芸苔屬衍生的CTP序列可，例如，藉由引入至少一保守性突變至合成之芸苔屬衍生的CTP中而產生變異，所產生之變異體胜肽可與一標記基因產物聯結。於適當宿主細胞中(舉例而言，其中表現構築體上之一或更多調控元件具可操作性之細胞)表現後，可測定標記基因產物之表現。比較參考合成之芸苔屬衍生的CTP-標記構築體，與變異胜肽-標記構築體間，標記基因產物之細胞內局部定位，可決定該變異體胜肽是否可提供，舉例而言，較佳之色素體局部定位，或實質上相等之色素體局部定位。此一變異體可視為一種功能性變異體。藉由辨識出可提供較佳色素體局部定位之合成芸苔屬衍生的CTP功能性變異體，此類變異物中之突變可加入其他合成之芸苔屬衍生的CTPs變異體中。重複進行此評估流程數次，之後加入辨識出之較佳突變於合成之芸苔屬衍生的CTP序列上，可產生一重 複流程，使合成之芸苔屬衍生的CTP序列最佳化。此經最佳化之合成芸苔屬衍生的CTP序列，以及編碼其之核苷酸序列，視為本發明之一部份，不論此經最佳化之合成芸苔屬衍生的CTP序列是否有進一步以額外地突變進行最佳化。
所有於此引用之參考文獻，包括公開案、專利與專利申請案，皆在此併入本案以作為參考資料，其內容與本揭示之明確細節並無不一致之處，因此每一單獨與特定指出之文獻皆完整併入本案以作為參考資料。於此所討論之參考文獻僅提供本發明申請日之前之揭示。於此揭示之內容不應被解釋為本發明人無權憑藉先前之發明揭示本發明。
下列範例提供某些特定特徵及/或觀點之說明。這些範例不應解釋為將本揭示限制於所描述之特定特徵或觀點中。
範例 範例1：嵌合葉綠體輸送胜肽(TraP)序列之設計與生產
色素體為高等植物之胞器，並存在於所有植物組織。葉綠體為一特定類型之色素體，並發現於綠色光合組織中，其負責重要之生理功能。舉例而言，此一重要之生理功能為合成植物所需之芳香族胺基酸。此生合成途徑需要細胞核所編碼之酵素，並由細胞質傳輸至葉綠體內部。這些細胞核編碼之酵素通常具有一N端輸送胜肽，其作用於葉綠體膜以加速胜肽傳輸至葉綠體基質。Bruce B.(2000)Chloroplast transit peptides：structure,function,and evolution.Trends Cell Bio.10：440-447。在導入時，基質胜 肽酶切割該輸送胜肽，使成熟之具功能性蛋白質進入葉綠體。Richter S,Lamppa GK.(1999)Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts.Journ.Cell Bio.147：33-43。葉綠體輸送胜肽為可變之序列，其在長度、組成物與組織方面具有高度多樣性。Bruce B.(2000)Chloroplast transit peptides：structure,function,and evolution.Trends Cell Bio.10：440-447。不同植物物種之同源蛋白質間的葉綠體輸送胜肽序列，其相似性明顯分歧。葉綠體輸送胜肽之間的分歧度無法預測，由於不同植物物種之同源蛋白質，當比較其經加工後之成熟具功能性蛋白質時，具有相當高程度之序列相似性。
新型之嵌合葉綠體輸送胜肽序列係於植物中設計、生產與檢測。此新型之嵌合葉綠體輸送胜肽顯示具有效之轉位與加工特性，以導入農業上重要蛋白質至葉綠體。起初，以ChloroPTM電腦程式分析不同植物物種之原始5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸鹽合成酶(EPSPS)蛋白質序列，以辨別假定之葉綠體輸送胜肽序列(Emanuelsson O,Nielsen H,von Heijne G,(1999)ChloroP,a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites,Protein Science 8；978-984)，可參照http：//www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/。在原始之葉綠體輸送胜肽確認後，將第一葉綠體輸送胜肽序列，與第二生物體之第二葉綠體輸送胜肽序列進行比對。圖 18係圖示說明西洋油菜(NCBI登錄號：P17688)與蕪菁(NCBI登錄號：AAS80163)之EPSPS葉綠體輸送胜肽序列之比對。利用葉綠體輸送胜肽序列之比對，藉由1：1之約略比例將第一生物體之第一半部葉綠體輸送胜肽序列，與第二生物體之第二半部葉綠體輸送胜肽序列結合，以設計新型之嵌合葉綠體輸送胜肽。新設計之嵌合葉綠體輸送胜肽之示範序列為TraP8(序列辨識編號：3)與TraP9(序列辨識編號：4)。這些新型之嵌合葉綠體輸送胜肽序列係源自西洋油菜[ATCC登錄號：P17688]與蕪菁[ATCC登錄號：AAS80163]之EPSPS蛋白質。TraP8(序列辨識編號：3)嵌合葉綠體輸送胜肽序列，包含源自西洋油菜之N端，以及源自於蕪菁之C端之葉綠體輸送胜肽。TraP9(序列辨識編號：4)葉綠體輸送胜肽序列包含源自於蕪菁之N端，以及源自於西洋油菜之C端之葉綠體輸送胜肽。嵌合葉綠體輸送胜肽以多重試驗進行檢測，其中包括短暫之植物內表現系統，以及穩定轉型之品系，其包含融合至一農業上重要之轉基因序列之基因表現片段。
範例2：嵌合葉綠體輸送胜肽(TraP)序列之短暫植物內檢測煙草短暫試驗：
TraP8與TraP9之嵌合葉綠體輸送胜肽序列，初步以一短暫植物內試驗進行檢測。合成編碼TraP8(序列辨識編號：5)與TraP9(序列辨識編號：6)嵌合葉綠體輸送胜肽序列之多核苷酸序列。將一連接子序列(序列辨識編號：7)併入TraP序列與yfp編碼序列之間。所得之構築體含有兩個植物轉錄單元(PTU)。第一個PTU包含阿拉伯芥泛素10促進子 (AtUbi10促進子；Callis,et al.,(1990)J.Biol.Chem.,265：12486-12493)、TraP-黃色螢光蛋白融合基因(TraP-YFP；美國專利申請號2007/0298412)，以及農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)ORF 23 3'非轉譯區(AtuORF23 3'UTR；美國專利號5,428,147)。第二個PTU包含木薯葉脈鑲嵌病毒(Cassava Vein Mosaic Virus)促進子(CsVMV促進子；Verdaguer et al.,(1996)Plant Molecular Biology,31：1129-1139)、草胺膦乙醯轉移酶(phosphinothricin acetyl transferase)(PAT；Wohlleben et al.,(1988)Gene,70：25-37)，以及農桿菌ORF 1 3'非轉譯區(AtuORF1 3'UTR；Huang et al.,(1990)J.Bacteriol.,172：1814-1822)。構築體pDAB101977包含TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽(圖2)。構築體pDAB101978包含TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽(圖3)。本研究構築並涵蓋一對照組質體，101908，其yfp基因上游不含葉綠體輸送胜肽序列(圖4)。構築體以限制酶切割與定序進行確認。最後，將構築體轉型至農桿菌中，並以甘油保存。
自農桿菌甘油儲存液中，將一充滿冷凍培養液之圈環接種於含有2 ml YPD(100 μg/ml觀黴素)之14 ml無菌管內。經接種培養基係於28℃下，以200 rpm搖晃隔夜。翌日以約100 μl培養液接種於含25 ml YPD(100 μg/ml觀黴素)之125 ml無菌三角震盪培養瓶中，並28℃下以200 rpm搖晃至隔日培養。翌日培養液以無菌ddH2O(pH 8.0)稀釋至OD600值0.5。以1：1之比例將經稀釋之農桿菌屬菌種，與含有P19輔助蛋白之第二種農桿菌屬菌種混合。此培養液用於 菸葉滲入反應，其方法係參照Voinnet O,Rivas S,Mestre P,and Baulcombe D.,(2003)An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus,The Plant Journal,33：949-956。將滲入之菸草植物置於ConvironTM套組，並於24℃下光照16小時，全程三天直到試驗為止。
顯微鏡結果：
由植物上切下經農桿菌屬滲入之菸葉，並置於含有水之培養皿中，以防止脫水。利用Dark Reader Hand LampTM(Clare Chemical Research Co.；Dolores,CO)，以藍色激發光結合固定式長通濾鏡(long-pass filter glasses)，觀察經滲入之菸葉，以找出葉面上未受損區域，其係成功表現YFP報導蛋白之處。由葉上切下特定辨識出之區域，並浸入水中以進行共軛焦顯微鏡(Leica TCS-SP5 AOBSTM；Buffalo Grove,IL)之影像觀察。YFP報導蛋白以514 nm雷射光線激發，係採用多線束氬離子雷射。利用一未表現(暗色)之控制組葉片樣本，調整偵測狹縫之寬度，以排除葉子之自體螢光背景。葉綠素之自體螢光係同時收集於第二通道，並直接與螢光報導蛋白之訊號相對照，以確認其於葉綠體中之位置。
顯微鏡之影像結果顯示，含有TraP8或TraP9葉綠體輸送胜肽之YFP螢光蛋白，係累積於菸草細胞質之葉綠體內部，並可與對照組YFP螢光蛋白相比較，其並未轉位至菸草細胞質之葉綠體中(圖5與圖6)。這些顯微鏡影像結果 指出，YFP蛋白轉位至葉綠體，係由TraP8或TraP9葉綠體輸送胜肽所造成。如圖5與圖6所示，YFP之螢光訊號位於葉綠體，其於顯微鏡造影條件下之自體螢光亦可顯現紅色螢光。相較而言，圖7係提供由對照組構築體pDAB101908所滲入之菸葉組織顯微鏡影像，其未含有葉綠體輸送胜肽。葉綠體於此影像中僅顯現紅色螢光，係因其於顯微鏡造影條件下之自體螢光所造成，且TraP滲入之菸草細胞未出現任何YFP螢光訊號。相反地，對照組菸草植物細胞之YFP螢光訊號卻散佈於整個菸草植物細胞之細胞質。
西方墨漬法結果：
經滲入之菸草植物樣本係以西方墨漬法分析。收集葉片碎屑並進行滾珠研磨。將大約100-200 mg之葉片材料混合於2 BBs(鋼珠)(Daisy；Rogers,AR)與500 ml之PBST中，並於KlecoTM珠磨機內研磨3分鐘。樣本隨後於4℃下，以14,000 x g離心沈澱。移去上清液，並直接以西方墨漬法分析，或進行免疫沈澱。免疫沈澱法係利用Pierce Direct IP kitTM(Thermo Scientific；Rockford,IL)進行，並參照廠商提供之方法。大約50 μg之YFP抗體會結合至樹脂。樣本與樹脂於4℃反應至隔日。接著，樣本於隔天清晨清洗與沖提，並於備妥後加入等量之2X 8M尿素樣本緩衝溶液，使樣本煮沸5分鐘，以進行分析。經煮沸樣本於4-12% SDS-Bis Tris凝膠與MOPS緩衝溶液之條件下，進行跑膠40分鐘。凝膠隨後以Invitrogen iBlotTM(Life Technologies；Carlsbad,CA)墨染，並參照廠商提供之方法。經墨染之薄膜以溶於 PBS-Tween之5%脫脂奶粉溶液，進行10分鐘之阻斷反應。薄膜以溶於PBS-Tween之5%脫脂奶粉溶液，並以1：1000比例稀釋之一級抗體(兔之GFP單株抗體)，進行探測反應1小時。接著，薄膜以PBS-Tween浸濕五分鐘，並重複三次，以移除所有未結合之一級抗體。之後薄膜以稀釋比例為1：1000之二級單株羊抗兔抗體(Life Technologies)探測，歷時60分鐘。薄膜以前述方式清洗，並加入Themo BCIP/NBT受質以進行顯影。該比色受質可顯影5-10分鐘，接著經墨染之薄膜可於乾燥前浸於水中。
西方墨漬法之結果顯示，YFP蛋白係於經滲入之菸草細胞中表現。由pDAB101977與pDAB101978所滲入之菸草植物葉片組織，皆表現YFP蛋白，係如所產生之蛋白質層帶，其對於YFP抗體產生反應，且其分子量大小等同於YFP對照組構築體滲入之菸草植物葉片組織之YFP蛋白層帶。此外，這些結果顯示，TraP嵌合葉綠體輸送胜肽係經加工，且由YFP蛋白上切去。TraP8-YFP與TraP9-YFP構築體表現出一未經加工之蛋白質層帶，其分子量大於對照組YFP蛋白。西方墨漬法所呈現之層帶，若分子大小等同於對照組YFP，意指TraP8與TraP9葉綠體輸送胜肽序列經加工，因此YFP分子變小，並等同於YFP對照組。
玉米原生質體短暫試驗：
將編碼Trap8嵌合葉綠體輸送胜肽之多核苷酸序列(序列辨識編號：5)，與編碼連接子之多核苷酸序列(序列辨識編號：7)，選殖至黃色螢光蛋白基因之上游，接著併入 構築體pDAB106597(圖8)，並經由玉米原生質體進行短暫植物內試驗。所得之構築體含有單一植物轉錄單元(PTU)。PTU含有玉米泛素1促進子(ZmUbi1促進子；Christensen,A.,Sharrock R.,and Quail P.,(1992)Maize polyubiquitin genes：structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation,Plant Molecular Biology,18：675-689)、TraP-黃色螢光蛋白融合基因(TraP8-YFP；美國專利申請號2007/0298412)，以及玉米過氧化酶5之3'非轉譯區(ZmPer5 3'UTR；美國專利號6384207)。構築體以限制酶切割與基因定序進行確認。
將玉米變種株B104之種子置於50% Clorox(3%次氯酸鈉)中，其含有2-3滴Tween 20，並劇烈搖晃約20分鐘以進行表面除菌。種子以無菌蒸餾水徹底清洗。將滅菌種子平鋪在含有½ MS培養基之Phytatrays或類似種類之箱內，並使其於黑暗中(28℃)生長12至20日。進行玉米原生質體之短暫試驗，以取得並轉染B104玉米葉之玉米原生質體。此玉米原生質體試驗係修正自Yoo,S.-D.,Cho,Y.-H.,and Sheen,J.,(2007),Arabidopsis Mesophyll Protoplasts：A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis,Nature Protocols,2：1565-1572所述之系統。溶液之製備係如Yoo等人(2007)所述，除了以下實驗中所使用之甘露醇濃度改為0.6 M以外。
在室溫下，將100至500 μl之原生質體(1-5x105) 加入內含約40 μg質體DNA(pDAB106597)之2 ml微離心管內，以完成轉染。DNA之體積較佳為維持在約10%之原生質體體積。原生質體與DNA於5分鐘反應過程中，間歇性地混合。將等體積之PEG溶液緩慢加入原生質體與DNA中，每次2滴，並於PEG溶液滴入間隔時間內混合。微離心管反應約10分鐘，並間歇地和緩混合。接著，加入1ml之W5+溶液，並來回混合微離心管數次。微離心管於4℃下以75 x g離心5分鐘。最終，移去上清液，並以1 ml之WI溶液再懸浮沈澱物，接著將原生質體置於小型培養盤(35 x 10mm)或6-孔之多孔培養盤，並於室溫避光下培養至隔日。經12小時培養後，以顯微鏡觀察YFP之螢光。以前述之顯微鏡條件進行影像觀察。
顯微鏡之影像結果顯示，含有TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽之YFP螢光蛋白，係累積於玉米細胞質之葉綠體內部，並可與對照組YFP螢光蛋白相比較，其並未轉位至玉米細胞質之葉綠體(圖9)。這些顯微鏡之影像結果顯示，YFP蛋白轉位至葉綠體係由TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽造成。
範例3：於阿拉伯芥屬中表現農業上重要轉基因之嵌合葉綠體輸送胜肽(TraP)序列
大腸桿菌5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸鹽合成酶酵素(EPSP合成酶)之單一胺基酸突變(G96A)，可導致草甘膦不敏性(glyphosate insensitivity)(Padgette et al.,(1991)；Eschenburg et al.,(2002)；Priestman et al.,(2005)；Haghani et al.,(2008))。雖然此突變可產生草甘膦耐受性，其亦發現 其對於EPSP合成酶與其天然受質磷酸烯醇丙酮酸鹽(phosphoenolpyruvate；PEP)之結合有不良影響。此受質結合功效之改變，使該突變酵素不適於提供植物內草甘膦耐受性。
登錄NCBI Genbank數據庫，並以電腦篩選EPSP合成酶蛋白質與多核苷酸序列，相對於導入大腸桿菌之G96A突變酵素，其於EPSP合成酶酵素之類似位置含有天然丙胺酸(Padgette et al.,(1991)；Eschenburg et al.,(2002)；Priestman et al.,(2005)；Haghani et al.,(2008))。
有一種酵素經確認於該位置含有天然丙胺酸，即源自蘇氏鏈黴菌(Streptomyces sviceus)ATCC29083之DGT-28(GENBANK ACC NO：ZP_06917240.1)。進一步之電腦數據搜尋顯示，有三種其他獨特之鏈黴菌屬(Streptomyces)酵素具有優於DGT-28之同源性，即DGT-31(GENBANK ACC NO：YP_004922608.1)；DGT-32(GENBANK ACC NO：ZP_04696613)；以及DGT-33(GENBANK ACC NO：NC_010572)。相對於導入大腸桿菌之G96A突變酵素，這些酵素之每一者於EPSP合成酶酵素之類似位置皆含有天然丙胺酸。圖1。
由於不同生物體之EPSP合成酶蛋白質長度不同，故大腸桿菌EPSP合成酶酵素之突變位置編號，無須相符於其他生物體EPSP合成酶酵素之突變位置編號。這些新發現的EPSP合成酶酵素，先前並未確認其草甘膦耐受性或PEP受質親和性。此外，這些EPSP合成酶酵素代表一種新 類型之EPSP合成酶酵素，且不含任何過去已確認之EPSP合成酶酵素序列模體，包括第I類(植物衍生之序列，進一步揭示於美國專利號RE39247)、第II類(細菌衍生之序列，進一步揭示於美國專利號RE39247)，以及第III類(細菌衍生之序列，進一步揭示於國際專利申請號WO 2006/110586)。
藉由相較於第I類EPSP合成酶酵素，以確認新型之DGT-14、DGT-28、DGT-31、DGT-32與DGT-33酵素之草甘膦耐受性與PEP受質親和性。以下第I類酵素；源自大豆(Glycine max)之DGT-1、源自西洋油菜之DGT-3(GENBANK ACC NO：P17688)，以及源自小麥(Triticum aestivum)之DGT-7(GENBANK ACC NO：EU977181)係用於比較。合成並評估第I類EPSP合成酶酵素及其突變異體。於大腸桿菌EPSP合成酶酵素G96A突變異體之類似位置，導入一甘胺酸置換為丙胺酸之突變於植物EPSP合成酶酵素。此外，於Funke等人(2009)所揭示大腸桿菌EPSP合成酶之胺基酸97(T換成I)與胺基酸101(P換成S)之類似位置，將蘇胺酸換成異白胺酸及脯胺酸置換為絲胺酸之突變體，導入該第I類EPSP合成酶酵素。
DGT14：
利用Clough與Bent(1998)著作於Plant J.16：735-743之浸花法(floral dip method)，生產含有將dgt-14轉基因融合至TraP8與TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽之基因轉殖T1阿拉伯芥屬植物。所得之基因轉殖阿拉伯芥屬植物，經分子確認法確認含有轉基因。基因轉殖植物以不同比例 噴灑草甘膦。本研究利用草甘膦噴灑率所造成不同濃度之分佈，包括上升速率，以決定抗性之相對表現(105、420、1,680或3,360 g ae/ha)。草甘膦之典型1X田野施加率為1,120 g ae/ha。本研究所採用T1阿拉伯芥屬植物之dgt-14轉基因拷貝數為可變。利用分子確認試驗辨別低拷貝之dgt-14 T1阿拉伯芥屬植物，並進行自花授粉以產生T2植物。表1顯示dgt-14基因轉殖植物之抗性，其可與含有草甘膦除草劑抗性基因dgt-1(如美國專利登錄號12558351所揭示，在此併入本案以作為參考資料)之對照組植物，以及野生型對照組相比較。
利用固殺草(glufosinate)篩選法，首先由未轉型種子背景中篩選阿拉伯芥屬T1轉型體。每一T1構築體進行三個單位或30,000個種子的分析。所篩選之T1植物經分子確認，隨後將植物移植至各盆中，並噴灑不同比例之前述商業草甘膦。這些植物的劑量反應係以處理2週後(WAT)之視覺上損傷百分比表示。數據列於下表，其顯示個別植物出現些微或無損傷(<20%)、中度損傷(20-40%)，或嚴重損傷(>40%)。用於阿拉伯芥屬轉型作用之每一構築體，皆以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別劑量反應範圍亦於最後一列標明。以野生之未轉型阿拉伯芥屬(c.v.Columbia)作為草甘膦敏感性對照組。
T1阿拉伯芥屬植物之植物反應程度不一。此變化歸因於一事實，即每一植物代表一獨立轉型品系，因此感興趣基因之拷貝數因植物而不同。由施加率造成之整體族 群損傷平均值列於表1，以證實每一連接至TraP8 v2或TraP9 v2葉綠體輸送胜肽之dgt-14構築體，相較於dgt-1與未轉型之野生型對照組，所產生不同草甘膦施加率之耐受性。該品系含有構築體pDAB105526(圖10)，其中dgt-14與TraP8 v2相連結(序列辨識編號：8)，以及構築體pDAB105527(圖11)，其中dgt-14與TraP9 v2相連結(序列辨識編號：9)。T1植物之草甘膦挑選數據證實，當以dgt-14連接於這些葉綠體輸送胜肽時，對於高濃度之草甘膦可產生強大耐受性。相較而言，當處理類似比例之草甘膦時，未轉型(或野生型)對照組對於高濃度之草甘膦不產生耐受性。此外，當dgt-14具有三或更多之基因拷貝數時，對於升高之草甘膦施加率感受性增加。這些例子證實於表1所列之視覺上損傷範圍百分比。可能的原因是，阿拉伯芥屬植物存在高拷貝數之轉基因，使得轉基因沈默(silencing)或其他表觀遺傳效應(epigenetic effects)，對於草甘膦產生敏感性，儘管存在dgt-14轉基因。
以判定含有低拷貝數轉基因插入子(1-3拷貝數)之經篩選T1阿拉伯芥屬植物進行自花授粉，產生第二代以 額外評估其草甘膦耐受性。將含有1-3拷貝數之dgt-14轉基因之第二代阿拉伯芥屬植物(T2)，融合至TraP8與TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽，並進一步確認其草甘膦耐受性與固殺草耐受性(固殺草抗性表示PAT表現卡匣為完整的，且於T1植物自花授粉時未經重排)。在T2子代中，可得到半合子與同型合子植物進行各種檢測，因此涵蓋各種比例之草甘膦。相較於同型合子植物之基因座含有兩個相同對偶基因，半合子植物之基因座含有兩個不同對偶基因。利用分子分析方法確認T2植物之基因拷貝數與套數(ploidy levels)。同樣地，利用前述之方法與比例施加草甘膦。植物之劑量反應係以處理2週後(WAT)之視覺上損傷百分比表示。數據列於下表，其顯示個別植物出現些微或無損傷(<20%)、中度損傷(20-40%)，或嚴重損傷(>40%)。用於阿拉伯芥屬轉型作用之每一構築體均以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別反應範圍亦於最後一列標明。以野生之未轉型阿拉伯芥屬(c.v.Columbia)作為草甘膦敏感性對照組。此外，以含有草甘膦除草劑抗性基因dgt-1(如美國專利登錄號12558351所揭示，在此併入本案以作為參考資料)之植物作為陽性對照組。
在T2子代中，進行單一拷貝與低拷貝數(二或三拷貝數)dgt-14植物之草甘膦耐受性確認。由施加率造成之整體族群損傷平均值列於表2，以證實每一連接於葉綠體輸送胜肽之dgt-14構築體，相較於dgt-1與未轉型之野生型對照組，所產生不同草甘膦施加率之耐受性。T2子代品系含 有以dgt-14連接至TraP8 v2(pDAB105526)與TraP9 v2(pDAB105527)之構築體。此二品系均具有高度草甘膦抗性。這些結果顯示，T2阿拉伯芥屬植物對於所有受測草甘膦濃度之損傷範圍，皆低於20%。相較而言，當處理類似比例之草甘膦時，未轉型(或野生型)對照組對於高濃度之草甘膦不產生耐受性。整體而言，這些結果顯示，含有並表現DGT-14與TraP8與TraP9嵌合輸送胜肽之融合蛋白質之植物，產生商業層級之草甘膦抗性，並為田野施加率(1120 g ae/ha)之3倍。
以判定含有低拷貝數轉基因插入子(1-3拷貝數)之經隨機挑選T2阿拉伯芥屬植物，進行自花授粉，產生第三代以額外評估其草甘膦耐受性。種植阿拉伯芥屬第三代(T3)種子，並利用前述之相同方法評估其草甘膦耐受性。在T3子代中，受測之每一品系為同型合子，且具有每一植株之複製物(如使用固殺草抗性篩選之測定，以辨別是否任何高等植物具有分離之轉基因)。這些品系經由LC-MS-MS分析，以確認植物表現DGT-14蛋白質。由草甘膦施加率造成T3子代整體族群損傷平均值之結果列於表3，其顯示每一dgt-14構築體對於不同草甘膦施加率之耐受性。示範性之具抗性T3品系包含以dgt-14連接至TraP8 v2(pDAB105526)與TraP9 v2(pDAB105527)。此二品系對於草甘膦具有高度抗 性。這些結果顯示，T3阿拉伯芥屬植物對於所有受測草甘膦濃度之損傷範圍皆低於20%。相較而言，當處理類似比例之草甘膦時，未轉型(或野生型)對照組對於高濃度之草甘膦不產生耐受性。整體而言，這些結果顯示，含有並表現DGT-14之植物，產生商業層級之草甘膦抗性，並為田野施加率(1120 g ae/ha)之3倍。
數據顯示，所表現之具草甘膦抗性酵素(例如，DGT-28)，以結合TraP輸送胜肽所形成之融合蛋白定向至植物細胞葉綠體時，可提供植物細胞與含此類細胞植物草甘膦抗性。
DGT-28、DGT-31、DGT-32與DGT-33：
新設計之雙子葉植物，其最佳化之dgt-28 v5多核苷酸序列係列於序列辨識編號：16。新設計之單子葉植物，其最佳化之dgt-28 v6多核苷酸序列係列於序列辨識編號：17；此序列係略作修飾，包括於第二個胺基酸加入丙胺酸，以導入一限制酶位置。所得之DNA序列具有較高程度之密碼多樣性，即為希望之鹼基組成物，含有策略性置入之限制酶辨識位置，且不具有可能干擾基因轉錄或產物mRNA轉譯之序列。
合成包括序列辨識編號：16與序列辨識編號：17之DNA片段，其含有額外之序列，如6-讀碼區終止區(加至編碼序列3'端之所有六種讀碼區皆具備終止密碼子)，以及用 於選殖之5'限制酶位置，係以商業上供給而進行(DNA2.0,Menlo Park,CA)。經合成之核酸分子隨後選殖至表現載體，並轉型至植物或細菌，係如以下之範例所述。
類似之密碼子最佳化策略亦用於設計dgt-1、dgt-3 v2(G173A)、dgt-3 v3(G173A；P178S)、dgt-3 v4(T174I；P178S)、dgt-7 v4(T168I；P172S)、dgt-32 v3、dgt-33 v3與dgt-31 v3。這些基因之密碼子最佳化版本係分別列於序列辨識編號：18、序列辨識編號：19、序列辨識編號：20、序列辨識編號：21、序列辨識編號：22、序列辨識編號：23、序列辨識編號：24與序列辨識編號：25。
植物雙偶型載體之構築。利用標準選殖方法構築輸入載體(entry vector)，其含有葉綠體輸送胜肽之多核苷酸序列與dgt-28連結之框內融合物。含有以輸送胜肽(TraP)融合至dgt-28之輸入載體，係利用IN-FUSIONTM Advantage Technology(Clontech,Mountain View,CA)進行組合。融合之結果顯示，第一個胺基酸甲硫胺酸係由dgt-28移除。輸送胜肽TraP4 v2(序列辨識編號：26)、TraP5 v2(序列辨識編號：27)、TraP8 v2(序列辨識編號：28)、TraP9 v2(序列辨識編號：29)、TraP12 v2(序列辨識編號：30)與TraP13 v2(序列辨識編號：31)之每一者係以DNA 2.0(Menlo Park,CA)合成，並融合至dgt-28之5'端片段，其包含一獨特限制性核酸內切酶辨識位置。
含有各種TraP與dgt-28表現卡匣之雙偶型質體，係經由阿拉伯芥泛素10促進子驅動(AtUbi10 v2；Callis,et al.,(1990)J.Biol.Chem.,265：12486-12493)，且側邊為農桿菌開放讀碼區23之3'非轉譯區(AtuORF23 3' UTR v1；美國專利號5,428,147)。
經組合之TraP與dgt-28表現卡匣係以GATEWAY® Technology(Invitrogen,Carlsbad,CA)進行選殖，並經由農桿菌屬媒介之植物轉型作用轉型至植物中。限制性核酸內切酶係購自New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)，且T4 DNA Ligase(Invitrogen)，用於DNA連接。利用GATEWAY® LR CLONASE®酵素混合物(Invitrogen)進行匣道反應，將輸入載體組合成單一目的載體(destination vector)，其中包含選擇性標記卡匣木薯葉脈鑲嵌病毒促進子(CsVMV v2；Verdaguer et al.,(1996)Plant Mol.Biol.,31：1129-1139)-DSM-2(美國專利申請號2007/086813)-農桿菌開放讀碼區1之3'非轉譯區(AtuORF1 3' UTR v6；Huang et al.,(1990)J.Bacteriol.172：1814-1822)。利用NUCLEOSPIN® Plasmid Kit(Macherey-Nagel Inc.,Bethlehem,PA)或Plasmid Midi Kit(Qiagen)進行質體製備，並參照供應商之說明。於瓊脂Tris-醋酸鹽膠體電泳之後，利用QIAquickTM Gel Extraction Kit(Qiagen)分離DNA片段。
所有組合質體之菌落，其初步篩選係以限制酶切割其小量製備之DNA。挑選出之選殖株質體DNA係藉由商業上序列供應商(EurofinsTM MWG Operon,Huntsville,AL)進行定序。利用SEQUENCHERTM軟體(Gene Codes Corp., Ann Arbor,MI)進行序列數據之組合與分析。
利用下列雙偶型構築體表現各種TraP：dgt-28融合體基因序列：pDAB107527(圖19)，含有TraP4 v2：dgt-28 v5(序列辨識編號：32)；pDAB105530(圖20)，含有TraP5 v2：dgt-28 v5(序列辨識編號：33)；pDAB105531(圖21)，含有TraP8 v2：dgt-28 v5(序列辨識編號：34)；PDAB105532(圖22)，含有TraP9 v2：dgt-28 v5(序列辨識編號：35)；pDAB105533(圖23)，含有TraP12 v2：dgt-28 v5(序列辨識編號：36)；以及pDAB105534(圖24)，含有TraP13 v2：dgt-28 v5(序列辨識編號：37)。pDAB105534之dgt-28 v5序列係經修改，其中第一個密碼子(GCA)改成(GCT)。
其他植物雙偶型載體之構築。利用類似於上述之選殖策略，以構築含有dgt-31、dgt-32、dgt-33、dgt-1、dgt-3與dgt-7之雙偶型質體。
微生物衍生之基因；dgt-31、dgt-32與dgt-33，係融合於不同葉綠體輸送胜肽，並如前面所述。使用下列葉綠體輸送胜肽；TraP14 v2(序列辨識編號：38)、TraP23 v2(序列辨識編號：39)、TraP24 v2(序列辨識編號：40)。pDAB107532(圖25)，含有與TraP14 v2融合之dgt-32 v3(序列辨識編號：41)、pDAB107534(圖26)，含有與TraP24 v2融合之dgt-33 v3(序列辨識編號：42)，以及pDAB107533(圖27)，含有與TraP23 v2融合之dgt-31 v3(序列辨識編號：43)。dgt表現卡匣係經由阿拉伯芥泛素10促進子驅動(AtUbi10促進子v2)，且側邊為農桿菌開放讀碼區23之3'非轉譯區 (AtuORF23 3' UTR v1)。含有木薯葉脈鑲嵌病毒促進子(CsVMV v2)之DSM-2選擇性標記卡匣-DSM-2-農桿菌開放讀碼區1之3'非轉譯區(AtuORF1 3' UTR v6)，亦存在於雙偶型載體中。
構築其他雙偶體，其中dgt-31 v3、dgt-32 v3與dgt-33 v3，係與前述之葉綠體輸送胜肽序列融合。舉例而言，TraP8 v2序列係與dgt-31 v3、dgt-32 v3與dgt-33 v3融合，並選殖至前述之雙偶型載體上。
構築含有第I類基因(dgt-1、dgt-3與dgt-7)之雙偶型載體。下列雙偶型載體係經構築並轉型至植物中：pDAB4104(圖28)，其含有dgt-1 v4序列，如美國專利申請公開號2011/0124503所揭示，其側邊具有煙草滲透蛋白(Nicotiana tabacum Osmotin)序列，如美國專利申請公開號2009/0064376所揭示；pDAB102715(圖29)；pDAB102716(圖30)；pDAB102717(圖31)；以及pDAB102785(圖32)。與dgt-28、dgt-31、dgt-32與dgt-33融合之各種TraP葉綠體輸送胜肽，則不加入第I類基因，係因這些植物所衍生之序列產生原始植物葉綠體輸送胜肽。這些載體係進一步詳述於表4。
阿拉伯芥轉型反應。利用Clough與Bent(1998)之浸花法，進行阿拉伯芥屬之轉型反應。將挑選出含有前述雙偶型質體之一者之農桿菌屬菌落，接種於含有觀黴素(100 mg/L)與康黴素(kanamycin；50 mg/L)之一或更多100 mL YEP培養液中進行預培養。培養液於28℃以225 rpm持續搖晃並培養至隔日。細胞於室溫下以大約5000 x g沈澱10分鐘，並移去上清液。細胞沈澱物和緩地再懸浮於含有5%(w/v)蔗糖、10 μg/L 6-芐基胺基嘌呤與0.04% SilwetTM L-77之400 mL浸泡培養液中。將大約1個月大的植物浸入培養液中，並和緩搖晃5-10分鐘。將植物側邊平放，並覆蓋透明或不透明塑膠袋2-3小時，隨後直立放置。植物於22℃生長，其照光週期為16小時照光/8小時黑暗。浸入約4週後，收取種子。
經轉型植物之挑選。新鮮收取之T1種子[含有dgt與DSM-2表現卡匣]於室溫下乾燥7天。將T1種子播種在26.5 x 51-cm發芽盤上，每盤分裝200 mg份量之層積T1種子(~10,000個種子)，其預先懸浮於40 mL之0.1%瓊脂溶液，並於4℃保存2天，以達到休眠需求並確保種子同步發芽。
Sunshine Mix LP5以細密蛭石(vermiculite)加蓋，並以荷阿格蘭溶液(Hoagland’s solution)澆灌直到濕 潤，隨後使其因重力而流出。每40 mL份量之層積種子係以移液管均勻地播種在蛭石上，並蓋上加濕罩4-5天。在使用固殺草進行出苗後噴灑，以進行初步轉型體挑選(以挑選出經共轉型之DSM-2基因)的前一日，移去上罩。
種植七天後(DAP)與再次11 DAP，T1植物(分別於子葉與2-4-lf階段)係噴灑0.2%之Liberty除草劑溶液(200 g ai/L固殺草，Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)，其噴灑體積為10 mL/盤(703 L/ha)，並使用DeVilbiss壓縮空氣噴嘴，以達到有效施加率為280 g ai/ha固殺草。確認噴灑4-7天後存活之植物(積極生長之植物)，並個別移植至含盆栽培養基(Metro Mix 360)之3吋盆上。經移植之植物係以加濕罩覆蓋3-4天，並置於22℃生長室或直接移至溫室。上罩隨即移除，並於溫室內培育植物(22±5℃，50±30% RH，14小時照光：10小時黑暗，最低500 μE/m2s1自然+補充光線)。進行可存活T1植物之分子確認分析，以確認草甘膦耐受性基因穩定融入植物之基因體。
分子確認。確認經pDAB107527、pDAB105530、pDAB105531、pDAB105532、pDAB105533、或pDAB105534轉型至阿拉伯芥屬植物基因體之dgt-28與DSM-2轉基因之存在。這些多核苷酸序列之存在係以水解探針試驗、基因表現卡匣PCR(亦稱作植物轉錄單元PCR--PTU PCR)、南方墨漬法分析，以及定量反轉錄PCR分析進行確認。
T1阿拉伯芥屬植物初步以水解探針試驗，一種TAQMANTM類似物，進行篩選，以確認DSM-2與dgt-28轉基 因之存在。各品系以基因表現卡匣PCR篩選，以測定dgt表現卡匣是否完全融入植物基因體，而未經重排。利用這些研究產生之數據計算轉基因拷貝數，並篩選阿拉伯芥屬進行自花授粉以生產T2子代。產生之T2阿拉伯芥屬植物亦以水解探針試驗進行篩選，以確認DSM-2與dgt基因是否存在於植物染色體內，並計算其拷貝數。最終，以南方墨漬法確認經評估之T1阿拉伯芥屬植物子集之拷貝數。
使用類似之試驗，以確認dgt-1轉基因是否存在於經pDAB4101轉型之植物中、dgt-32轉基因是否存在於經pDAB107532轉型之植物中、dgt-33轉基因是否存在於經pDAB107534轉型之植物中、dgt-3轉基因是否存在於經pDAB102715轉型之植物中、dgt-3轉基因是否存在於經pDAB102716轉型之植物中、dgt-3轉基因是否存在於經pDAB102717轉型之植物中，以及dgt-7轉基因是否存在於經pDAB102785轉型之植物中。
水解探針試驗。利用下述之水解探針試驗決定T1與T2阿拉伯芥屬植物之拷貝數。辨別含有不同轉基因數量之植物，並進行草甘膦耐受性研究。
以96孔培養盤收集組織樣本，並冷凍乾燥2天。利用KLECOTM組織磨碎器與鎢珠(Environ Metal INC.,Sweet Home,Oregon)進行組織浸解(tissue maceration)。在組織浸解後，利用BiosprintTM 96 Plant kit(QiagenTM,Germantown,MD)之高效能模式，並參照廠商之建議方法，分離出基因體DNA。利用QUANT-ITTM PICO GREEN DNA ASSAY KIT(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)定量基因體DNA。利用BIOROBOT3000TM自動液體處理機(Qiagen,Germantown,MD)，將定量之基因體DNA調至約2 ng/μL以進行水解探針試驗。利用LIGHTCYCLER®480系統(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)之即時PCR進行水解探針試驗，以決定轉基因拷貝數。該試驗係針對DSM-2、dgt-28與內部參考基因TAFII15(Genbank ID：NC 003075；Duarte et al.,(201)BMC Evol.Biol.,10：61)而設計。
在基因放大方面，LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)係配製為1X最終濃度，於10 μL多重反應體積中，其包含0.1 μM之DSM-2與dgt-28之各引子、0.4 μM之TAFII15之各引子與0.2 μM之各探針。
表5。進行二步驟之基因放大反應，於60℃進行延長反應40秒，並收取螢光值。所有樣本上機，並以平均之週期閾值(Ct)進行各樣本之分析。利用LightCyclerTM軟體1.5版進行即時PCR數據之分析，其採用相對定量模組並以△△Ct方法為主。同時，每次上機還包括來自單一拷貝數校正劑之基因體DNA樣本，與已知之2拷貝數檢查樣本。係測定T1與T2基因轉殖阿拉伯芥屬植物之水解探針篩選之拷貝數結果。
經由南方墨漬法分析確認dgt-28之融入。南方墨漬法分析係用於建立經插入T股DNA片段之融入情況，並鑑定含有dgt-28之品系。所產生之數據證實其融入，且阿拉伯芥屬基因體內插入完整之轉基因。南方墨漬法數據係用於鑑定T股DNA完整拷貝之簡單融入。進行詳盡之南方墨漬法分析，係利用特異於dgt-28基因表現卡匣之PCR放大探針。以探針雜交於經特定限制酶切割之基因體DNA，可鑑定具特定分子量之基因體DNA片段，此方式可用於確認全長、簡單插入之T1基因轉殖品系，以產生下一代。
組織樣本係收集於2 mL錐形管中(EppendorfTM)，並冷凍乾燥2天。利用KLECKOTM組織磨碎器與鎢珠進行組織浸解。在組織浸解後，利用CTAB分離步驟分離出基因體DNA。基因體DNA進一步以QiagenTM Genomic Tips套組進行純化。基因體DNA係以Quant-ITTM Pico Green DNA試驗套組(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)進行定量。經定量之基因體DNA係調至4 μg之一致濃度。
針對每一樣本，4 μg之基因體DNA全部以限制酶SwaI(New England Biolabs,Beverley,MA)切割，並於25℃ 反應至隔日，隨後於反應中加入NsiI，並於37℃培養6小時。經切割之DNA係以Quick Precipitation SolutionTM(Edge Biosystems,Gaithersburg,MD)沈澱濃縮，參照廠商之建議方法。基因體DNA隨即於65℃下再懸浮於25 μL之水中1小時。將再懸浮樣本填入以1X TAE製備之0.8%瓊脂凝膠中，並以1.1 V/cm之1X TAE緩衝溶液進行電泳至隔日。凝膠依序進行30分鐘之變性反應(0.2 M NaOH/0.6 M NaCl)，以及30分鐘之中和反應(0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)/1.5 M NaCl)。
將DNA片段轉移至尼龍薄膜上之步驟，係經由被動吸取20 X SSC溶液至隔日，使DNA片段穿越凝膠，而轉移至經處理IMMOBILONTM NY+轉移薄膜上(Millipore,Billerica,MA)，並使用層析紙芯與紙巾。轉移後，薄膜以2X SSC簡單清洗、與STRATALINKERTM 1800(Stratagene,LaJolla,CA)進行交聯，並於80℃真空烘烤3小時。
墨染薄膜係靜置於雜交前溶液中(Perfect Hyb plus,Sigma,St.Louis,MO)，於65℃下反應1小時，係置於玻璃滾筒瓶中，並使用400型雜交培養箱(Robbins Scientific,Sunnyvale,CA)。探針係以含有完整編碼序列之PCR片段製備。利用QIAEXTM II凝膠萃取套組純化PCR放大子，並以Random RT Prime ITTM標記套組(Stratagene,La Jolla,CA)進行α32P-dCTP標記。墨染薄膜於65℃下雜交至隔日，係以經變性之探針直接加入雜交緩衝溶液中，使每一墨染薄膜之每毫升計數達到大約2百萬。在雜交反應後，墨染薄膜於65℃下依序以0.1X SSC/0.1% SDS清洗40分鐘。最終，將墨 染薄膜暴露於儲存磷光影像之屏幕下，並以Molecular Dynamics Storm 860TM影像系統造影。
本研究進行南方墨漬法分析，以決定拷貝數，並確認挑選出之阿拉伯芥屬品系基因體內含有dgt-28轉基因。
經由PCR分析進行dgt-28基因表現卡匣之確認。利用終點PCR反應，偵測dgt-28基因表現卡匣是否存在於T1植物品系。以特異於dgt-28基因表現卡匣AtUbi10促進子v2，與AtuORF23 3'UTR v1區域之引子(表6)進行偵測。
PCR反應需要標準之三步驟PCR循環方法，以放大基因表現卡匣。所有的PCR反應皆以下列PCR條件完成：94℃歷時三分鐘，接著為94℃歷時三十秒，進行35次循環、60℃歷時三十秒，以及72℃歷時三分鐘。反應係以EX-TAQTM PCR套組(TaKaRa Biotechnology Inc.Otsu,Shiga,Japan)完成，並參照廠商之說明。在最終循環後，反應於72℃下進行10分鐘。利用TAE瓊脂凝膠電泳確認PCR放大子之大小。如預期大小之PCR放大子，顯示全長之基因表現卡匣存在於基因轉殖阿拉伯芥屬品系之基因體中。
經由定量反轉錄PCR分析進行dgt-28之相對轉錄確認。 Dgt-28基因轉殖植物之組織樣本係收集於96孔培養盤中，並冷凍於-80℃。利用KLECOTM組織磨碎器與鎢珠 (Environ Metal INC.,Sweet Home,Oregon)進行組織浸解。在組織浸解後，利用QiagenTM Rneasy 96套組(QiagenTM,Germantown,MD)之高效能模式分離出總RNA，並參照廠商之建議方法，包括任擇地將DnaseI加入管柱中。隨後，於沖提出之總RNA中額外加入DnaseI(AmbionTM,Austin,TX)。以總RNA作為模板，利用High Capacity cDNA Reverse TranscriptionTM套組(Applied Biosystems,Austin,TX)進行cDNA合成，並參照廠商之建議步驟且加入寡核苷酸、TVN。利用水解探針試驗完成表現後之定量，係以即時PCR結合LIGHTCYCLER®480系統(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)進行。利用LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0設計dgt-28與內部參考基因“未知蛋白質”(Genbank登錄號：AT4G24610)，並進行試驗。在基因放大方面，LIGHTCYCLER®480 Probe Master mix(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)係配製為1X最終濃度，於10 μL單一反應體積中，其包含0.4 μM之各引子，以及0.2 μM之各探針。表7。
進行二步驟之基因放大反應，係於60℃進行延長反應40秒，並收取螢光值。所有樣本以三重複上機，並以平均之週期閾值(Ct)進行各樣本之分析。每一樣本進行負反轉錄反應，以確保不存在gDNA污染。即時PCR數據之分析，係以△△Ct方法進行。此試驗用於測定dgt-28於基因轉殖阿拉伯芥屬品系內之相對表現量，並可定為半合子與同型合子。Dgt-28 mRNA之相對轉錄量，其範圍係由2.5倍至207.5倍高於內部對照組。這些數據顯示，dgt-28基因轉殖植物含有一功能性dgt-28基因表現卡匣，且該植物可轉錄dgt-28轉基因。
西方墨漬法分析。經基因轉殖之阿拉伯芥植物葉子樣本可偵測出DGT-28。取自dgt-28基因轉殖植物之植物萃取物，與DGT-28蛋白質標準品，係於90℃下溶於含有DTT之NUPAGE® LDS樣本之緩衝溶液中(Invitrogen,Carlsbad,CA)10分鐘，接著以丙烯醯胺預製凝膠進行電泳分離。蛋白質隨後參照廠商之方法，經電轉移至硝酸纖維素薄膜上。經WESTERNBREEZE® Blocking Mix(Invitrogen)之阻斷反應後，DGT-28蛋白質先以DGT-28抗體血清偵測，接著使用山羊抗兔磷酸酶抗體偵測。偵測出之蛋白質係以化學放光受質BCIP/NBT Western Analysis Reagent(KPL,Gaithersburg,MD)成像。經由西方墨漬法所觀察到的DGT-28蛋白質顯示，所分析之dgt-28基因轉殖植物可表現DGT-28蛋白質。
以不同比例之草甘膦，噴灑含有dgt-28轉基因之 基因轉殖T1阿拉伯芥屬植物。本研究提高施加率以測定相對抗性(105、420、1,680或3,360 g ae/ha)。可抑制未轉型阿拉伯芥之草甘膦典型1X使用比例為420 g ae/ha。以添加硫酸銨之草甘膦配方施加於T1植物上，其履帶噴霧器校準為187 L/ha。本研究所使用T1阿拉伯芥屬植物之dgt-28轉基因拷貝數不盡相同。以低拷貝數之dgt-28 T1阿拉伯芥屬植物進行自花授粉，以產生T2植物。表8係顯示dgt-28基因轉殖植物之比較，包括草甘膦除草劑抗性基因、dgt-1，以及野生型對照組。表9係顯示dgt-32與dgt-33之比較，包括草甘膦除草劑抗性基因、dgt-1，以及野生型對照組。表10係顯示於草甘膦施加率為1,680 g ae/ha之條件下，新型細菌EPSP合成酶酵素，與第I類EPSP合成酶酵素及對照組之比較。
經dgt-28轉型之阿拉伯芥屬植物之草甘膦挑選結果。利用固殺草挑選流程，首先由未轉型種子背景中挑選阿拉伯芥屬T1轉型體。每一T1構築體進行三個平面或30,000個種子的分析。所挑選之T1植物經分子鑑定，隨後將各拷貝數之代表植物移植至各盆中，並噴灑不同比例之前述商業草甘膦。這些植物的劑量反應係以處理2週後(WAT)之視覺上損傷百分比表示。數據列於表中，其顯示個別植物出現些微或無損傷(<20%)、中度損傷(20-40%)，或嚴重損傷(>40%)。用於阿拉伯芥屬轉型作用之每一構築體，皆以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別劑量反應範圍亦於最後一列標明。以野生之未轉型阿拉伯芥屬(c.v.Columbia)作為草甘膦敏感性對照組。
植物之反應程度不一。此變異歸因於一事實，即每一植物代表一獨立轉型品系，因此感興趣基因之拷貝數因植物而不同。據指出，某些含轉基因之植物不產生草甘膦耐受性；且測定這些植物是否表現轉基因之完整分析尚未完成。可能的原因是，T1阿拉伯芥屬植物存在高拷貝數之轉基因，導致轉基因沈默或其他表觀遺傳效應對於草甘膦產生敏感性，儘管dgt-28轉基因存在。
由1,680 g ae/ha草甘膦施加率所造成之整體族群損傷平均值列於表10，以證實經由dgt-3、dgt-7、dgt-28、dgt-32與dgt-33轉型之植物，與於dgt-1與野生型對照組植物有明顯差異。
由新型細菌EPSP合成酶所提供之耐受性，依據特定酵素而改變。DGT-28、DGT-32與DGT-33意外地提供顯著之草甘膦耐受性。dgt基因提供除草劑抗性於個別T1阿拉伯芥屬植物中，並涵蓋所有受測輸送胜肽。因此，使用額外之葉綠體輸送胜肽(亦即，TraP8-dgt-32或TraP8-dgt-33)，將提供類似程度之草甘膦耐受性，如同所報導經特定處理之結果。
表9 與dgt-1(T4)同型合子抗性族群與未轉型對照組比較，經dgt-32與dgt-33轉型之T1阿拉伯芥屬，於出苗後對於一定範圍之草甘膦施加率產生反應。施加14天後之視覺上%損傷。
以dgt-28作為可挑選之標記。以dgt-28作為可挑選之標記，用於上述阿拉伯芥屬轉型植物之草甘膦挑選。將約50個T4子代之阿拉伯芥屬種子(dgt-28之同型合子)混 入約5,000個野生型(具草甘膦敏感性)種子中。種子發芽後，以某一草甘膦之挑選劑量噴灑於種苗上。比較數個草甘膦處理組；每盤植物以下列其中之一處理方式，選擇一或兩種草甘膦施加時間：7 DAP(種植後之天數)、11 DAP、或7之後其次為11 DAP。由於所有植物之相同轉型載體亦具有一固殺草抗性基因，故經草甘膦篩選之含dgt-28植物，可直接相比於經固殺草篩選之含DSM-2或pat植物。
如前述以DeVilbissTM噴嘴施加草甘膦。基因轉殖植物含有dgt-28者，被確認為具有“抗性”或“敏感性”17 DAP。26.25-1680 g ae/ha之草甘膦處理組，係於種植7與11天後(DAP)施加，其中含dgt-28之基因轉殖阿拉伯芥屬植物，顯示為有效挑選。計算敏感性與抗性之植物數量，並發現草甘膦耐受性植物之數量與經種植之含dgt-28基因轉殖種子之原始數量有關。這些結果顯示，dgt-28可有效作為一經轉型之阿拉伯芥屬族群之另一可挑選標記。
遺傳力。經確認之基因轉殖T1阿拉伯芥屬品系進行自花授粉，以產生T2種子。進行這些種子的子代檢測，係以含固殺草(200 g ae/ha)之IgniteTM除草劑，施加於100個隨機之T2姐妹子代而進行。在施加噴灑之前(履帶式噴霧器之施加率187 L/ha)，將每一個別T2植物移植至7.5平方公分盆內。利用孟德爾式遺傳(Mendelian inheritance)之顯性遺傳單一基因座，將T1家族(T2植物)分離為預期之3抗性：1敏性模式，係以卡方分析判定(P>0.05)。由預期之孟德爾式遺傳所分離之T1家族百分比，列於表11，其證實gt-28性 狀可經由孟德爾式遺傳而傳遞至T2子代。由5至15個T2個體(T3種子)收集種子。由3-4個隨機篩選之T2家族之每一者中，取出二十五個T3姐妹子代，並進行前述之子代檢測。數據顯示無分離情形，因此證實gt-28與dgt-3係穩定融入染色體內，並以孟德爾方式遺傳至少三個子代。
T 2 阿拉伯芥屬之數據。經挑選出含有低拷貝數dgt-28轉基因之T1阿拉伯芥屬品系之第二代植物(T2)，係進一步確認其草甘膦耐受性。草甘膦之施加係如先前所述。植物之劑量反應係以2週處理後(WAT)之視覺上損傷百分比表示。數據列於下表，其顯示個別植物出現些微或無損傷(<20%)、中度損傷(20-40%)，或嚴重損傷(>40%)。用於阿 拉伯芥屬轉型作用之每一構築體，皆以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別劑量反應範圍，亦於最後一列標明。以野生之未轉型阿拉伯芥屬(c.v.Columbia)作為草甘膦敏感性對照組。在T2子代中，可得到半合子與同型合子植物進行每一品系之檢測，因此涵蓋各種比例之草甘膦。相較於同型合子植物之基因座含有兩個相同對偶基因，半合子植物之基因座含有兩個不同對偶基因。預期T2子代之草甘膦反應具變異性，係因相較於同型合子植物，半合子之基因劑量不同。草甘膦之反應變異性係以標準差與反應範圍反映。
在T2子代中，單一拷貝數與多重拷貝數之dgt-28品系皆進行草甘膦耐受性確認。在一品系中，單一拷貝數植物顯示具有類似程度之草甘膦耐受性。單一拷貝數T2品系之特徵數據列於表12。相較於含有其他TraP輸送胜肽之dgt-28構築體，含有與TraP5 v2連接之dgt-28之品系，不產生穩健草甘膦耐受性。然而，相較於未轉型之哥倫比亞對照組，dgt-28 TraP5構築體不產生低程度之草甘膦耐受性。有範例顯示，含有二或更多dgt-28拷貝數之品系，對於升高之草甘膦施加率感受性增加(數據未顯示)。這些例子證實於表1所列之視覺上損傷範圍百分比。可能的原因是，阿拉伯芥屬植物存在高拷貝數之轉基因，使得轉基因沈默或其他表觀遺傳效應對於草甘膦產生敏感性，儘管dgt-14轉基因存在。此草甘膦敏感性之增加，類似於前述T1植物之數據，其亦含有高拷貝數之dgt-28基因轉殖。可能的原因是，阿拉 伯芥屬植物存在高拷貝數之轉基因，使得轉基因沈默或其他表觀遺傳效應對於草甘膦產生敏感性，儘管其存在有dgt-28轉基因。
這些品系含有與TraP5 v2(pDAB105530)、TraP12 v2(pDAB105533)與TraP13 v2(pDAB105534)連接之dgt-28。
除了dgt-28，以dgt-3轉型之T2阿拉伯芥屬品系列於表13。如表12所描述之dgt-28品系，該數據表中包含一代表品系，其特徵在於每一構築體對於草甘膦皆有反應。在dgt-3之確認方面，含有單一PTU(植物轉型單元)與dgt-3基因之構築體係經由AtUbi10促進子驅動(pDAB102716，圖30與pDAB102715，圖29)，並以其相較於含有2 PTUs之相同基因構築體(pDAB102719，圖33；pDAB102718，圖34)。含有2 PTU之構築體係以AtUbi10促進子驅動一拷貝數之基因，並以CsVMV促進子驅動其他拷貝。雙PTU之使用，在於併入後可比較dgt-3基因轉殖植物與含有兩拷貝轉基因之dgt-28基因轉殖植物。數據證實，相較於受測之單一拷貝數dgt-28品系，僅含單一PTU之單一拷貝數T2 dgt-3品系之草甘膦，其易感受性較高，但耐受性優於未轉型對照組。相較於1 PTU之構築體，含有2 PTUs之dgt-3基因的T1家族，可產生較高程度之草甘膦視覺上耐受性。在此二例中，係以T1家族相較於dgt-1與野生型對照組。T2數據證實，dgt-28可提供如單一拷貝數品系之穩健耐受性。
T 3 阿拉伯芥屬之數據。含有低拷貝數dgt-28轉基因之經挑選T2阿拉伯芥屬品系之第三代植物(T3)，係進一步確認其草甘膦耐受性。如前述，以固殺草篩選每一品系之二十五株植物，且各受測構築體之品系，其可挑選之標記基因並未分離。草甘膦之施加係如先前所述。植物之劑量反應係以2週處理後(WAT)之視覺上損傷百分比表示。數據列於下表，其顯示個別植物出現些微或無損傷(<20%)、中度損傷(20-40%)，或嚴重損傷(>40%)。用於阿拉伯芥屬轉型作用之每一構築體，皆以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別劑量反應範圍，亦於最後一列標明。以野生之未轉型阿拉伯芥屬(c.v.Columbia)作為草甘膦敏感性對照組。
經轉型植物之挑選。將新鮮收取之T1種子[dgt-31、dgt-32與dgt-33 v1基因]置於室溫乾燥，並寄至Indianapolis進行檢測。將T1種子播種在26.5 x 51-cm發芽盤上(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)，每盤分裝200 mg份量之層積T1種子(~10,000個種子)，其預先懸浮於40 mL之0.1%瓊脂溶液中，並於4℃保存2天，以達到休眠需求並確保種子同步發芽。
Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)以細密蛭石加蓋，並以荷阿格蘭溶液澆灌直到濕潤，隨後使其因重力而流出。每40 mL份量之層積種子係以移液管均勻地播種在蛭石上，並蓋上加濕罩(KORDTM Products,Bramalea,Ontario,Canada)歷時4-5天。一旦植物發芽即移去上罩，之後利用固殺草於出苗後噴灑，以進行初步轉型體篩選(以篩選經共轉型之dsm-2基因)。
種植六天後(DAP)與再次10 DAP，T1植物(分別於子葉與2-4-lf階段)係噴灑0.1%之IGNITETM除草劑溶液(280 g ai/L固殺草，Bayer Crop Sciences,Kansas City,MO)，其噴灑體積為10 mL/盤(703 L/ha)，並使用DeVilbissTM壓縮空氣噴嘴，以達到有效之每一施加率200 g ai/ha固殺草。在最終之噴灑後，確認噴灑4-7天後存活之植物(積極生長之植物)。將存活之植物個別移植至含盆栽培養基(Metro Mix 360TM)之3吋盆上。以組織採樣進行拷貝數分析之前，將植物置於溫室中培養至少1天。
進行T1植物之取樣，並完成dgt-31、dgt-32與 dgt-33 v1基因之拷貝數分析。將T1植物分配至各比例草甘膦組別中，因而每一比例皆有一定範圍之拷貝數。就阿拉伯芥屬而言，26.25 g ae/ha草甘膦係一有效劑量，可由有意義之抗性植物中分辨出敏感性植物。本研究提高施加率以測定相對抗性(105、420、1,680或3,360 g ae/ha)。表15係顯示與dgt-1之比較結果。
所有草甘膦除草劑之施加皆使用履帶式噴霧器，並以體積187 L/h噴灑。所使用之草甘膦為商業Durango二甲基胺鹽配方(480 g ae/L,Dow AgroSciences,LLC)。若低拷貝數T1植物對固殺草或草甘膦展現耐受性，則進一步評估其T2子代。
利用dgt-31、dgt-32與dgt-33 v1進行首次阿拉伯芥屬轉型作用。利用固殺草篩選法，首先由未轉型種子背景中挑選出T1轉型體。每一T1構築體進行三個單位或30,000個種子的分析。計算轉型頻率，且T1 dgt-31、dgt-32與dgt-33構築體之結果列於表15。
上述挑選出之T1植物隨後移植至各盆中，並噴灑不同比例之商業草甘膦。表16係以dgt-31、dgt-32與dgt-33 v1與對照組基因比較，其導入草甘膦抗性至阿拉伯芥屬T1轉型體後之反應。劑量反應係以2 WAT之視覺上損傷百分比表示。數據列於下表，其顯示個別植物出現些微或無損傷(<20%)、中度損傷(20-40%)，或嚴重損傷(>40%)。每一處理組以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別劑量反應範圍，亦於最後一列標明。以野生之未轉型阿拉伯芥屬(c.v.Columbia)作為草甘膦敏感性對照組。相較於陰性對照組，含有輸送胜肽TraP23之DGT-31(v1)基因，可導入輕微除草劑耐受性至個別T1阿拉伯芥屬植物中，但是含有輸送胜肽TraP8之基因則展現增進之耐受性。DGT-32與DGT-33兩者證實，含有TraP8與含有其他個別不同之葉綠體輸送胜肽(分別為TraP14與TraP24)，對於受測比例之草甘膦具有穩健之耐受性。在一特定之處理中，植物之劑量反應變化極大，其可歸因於一事實，即每一植物代表一獨立轉型品系，因此感興趣基因之拷貝數因植物而不同。重點在於，在每一受測之草甘膦比例，有些個體較其他具有較高耐受性。由施加率造成之整體族群損傷平均值列於表16，以證實由dgt-31、dgt-32與dgt-33 v1轉型之植物，與dgt-1 v1或野生型對照組具明顯差異。
玉米之轉型作用。以前述之標準選殖方法構築雙偶型載體，用於玉米之農桿菌媒介轉型作用。表17係列出用於玉米轉型作用之構築載體。下列基因片段係用於含有dgt-28之載體：玉米泛素1促進子(ZmUbi1；美國專利號5,510,474)，用於驅動dgt-28編碼序列，其側邊為玉米脂肪酶之3'非轉譯區(ZmLip 3'UTR；美國專利號7179902)、可挑選之標記卡匣，包含玉米泛素1促進子，用於驅動aad-1編碼序列(美國專利號7,838,733)，其側邊為玉米脂肪酶3'非轉譯區。aad-1編碼序列係提供苯氧基生長素除草劑，例如2,4-二氯苯氧基醋酸(2,4-D)與芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草劑，之耐受性。
將dgt-28構築體製成標準雙偶型載體與農桿菌屬超雙偶型系統載體(Japan Tobacco,Tokyo,JP)。標準雙偶型載體包括pDAB107663、pDAB107664、pDAB107665，以及pDAB107665。農桿菌屬超雙偶型系統載體包括pDAB108384、pDAB108385、pDAB108386，以及pDAB108387。
完成額外之構築體，其包含一黃色螢光蛋白(yfp；美國專利申請號2007/0298412)報導基因。pDAB109812包含一yfp報導基因卡匣，其由玉米泛素1促進子驅動，且側邊為玉米過氧酶5之3'非轉譯區(Zm per5 3'UTR；美國專利號7,179,902)、可挑選之標記卡匣包含甘蔗桿狀病毒促進子(SCBV；美國專利號5,994,123)，其用於驅動aad-1之表現，且側邊為玉米脂肪酶3'非轉譯區。 pDAB101556包含一yfp卡匣，其由玉米泛素1促進子驅動，且側邊為玉米每5 3'非轉譯區、可挑選之標記卡匣包含玉米泛素1促進子，其用於驅動aad-1之表現，且側邊為玉米脂肪酶3'非轉譯區。pDAB107698包含一dgt-28卡匣，其由玉米泛素1促進子驅動，且側邊為玉米脂肪酶3'非轉譯區、一yfp卡匣，由玉米泛素1促進子驅動，且側邊為玉米每5 3'非轉譯區、可挑選之標記卡匣包含甘蔗桿狀病毒促進子，其用於驅動aad-1之表現，且側邊為玉米脂肪酶3'非轉譯區。所有這三種構築體皆為標準雙偶型載體。
穗(ear)之除菌與胚之分離。欲取得玉米之未成熟 胚，將玉米自交系B104植物種植於溫室，並進行自發或近親授粉以產生穗。穗於授粉後約9-12天收取。在實驗當天，將穗浸於20%次氯酸鈉溶液(5%)，並搖晃20-30分鐘以進行表面除菌，接著以無菌水清洗三次。除菌後，在無菌條件下由每一穗切下未成熟合子胚(1.5-2.4 mm)，並使其隨機分佈於含有液體感染培養基之微離心管中(LS基礎培養基，4.43 gm/L；N6維生素溶液[1000X]，1.00 mL/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；蔗糖，68.5 gm/L；D(+)葡萄糖，36.0 gm/L；10 mg/ml之2,4-D，150 μL/L)。在一特定之實驗中，將三個穗中取得之胚混合，並用於每一轉型反應。
開始農桿菌屬培養：
將上述含有雙偶型轉型載體之農桿菌屬甘油儲存液，塗抹於含適量抗生素之AB最低培養基培養盤上，並於20℃下生長3-4天。挑選單一菌落，並塗抹於含相同抗生素之YEP培養基上，接著於28℃下生長1-2天。
農桿菌屬之培養與共培養。由YEP培養盤挑選農桿菌屬菌落、懸浮於含有10 mL感染培養基之50 mL拋棄式試管中，並利用分光光度計將細胞密度調整為OD600 nm 0.2-0.4。室溫下，將農桿菌屬培養液置於125 rpm旋轉搖晃床，並進行胚切除。由除菌之玉米核分離出大小介於1.5-2.4 mm之未成熟合子胚，並置於1 mL之感染培養基中，接著以相同培養基清洗一次。將農桿菌屬懸液(2 mL)加入各試管，並將試管置於搖晃平台上10-15分鐘。將胚移至共培養基上(MS鹽類，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌醇， 100.0 mg/L；酪蛋白酵素水解物100.0 mg/L；30 mM Dicamba-KOH，3.3 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；GelzanTM，3.00 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5 mg/ml AgNo3，15.0 mg/L；DMSO,100 μM)、子葉盤朝上，並於25℃之24-小時光線強度50 μmole m-2 sec-1下照光培養3天。
假定品系癒合組織之篩選與再生。在共培養期之後，將胚移至不含篩選試劑之靜止培養基(MS鹽類，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；1,2,3,5,4,6-六羥基環己烷，100 mg/L；MES[(2-(正-嗎啉基)-乙磺酸)，自由酸]0.500 gm/L；酪蛋白酵素水解物100.0 mg/L；30 mM Dicamba-KOH，3.3 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；Gelzan 2.30 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5mg/ml AgNo3,15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)，並於25℃之24-小時光線強度50 μmole m-2 sec-1下照光培養3天。
生長抑制劑量反應實驗顯示，草甘膦濃度0.25 mM與更高者，足以抑制未轉型B104玉米品系之細胞生長。將胚移至含0.5 mM草甘膦之挑選1培養基(MS鹽類，4.33 gm/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；肌醇，100.0 mg/L；MES[(2-(正-嗎啉基)-乙磺酸)，自由酸]0.500 gm/L；酪蛋白酵素水解物100.0 mg/L；30mM Dicamba-KOH，3.3 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；GelzanTM 2.30 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5mg/ml AgNo3,15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)，並於28℃之避光及/或24-小時光線強度50 μmole m-2 sec-1下照光培養7-14天。
將增生之胚性癒合組織，移至含1.0 mM草甘膦之篩選2培養基中(MS鹽類，4.33 gm/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100mg/L；L-脯胺酸，700.0 mg/L；MES[(2-(正-嗎啉基)-乙磺酸)，自由酸]0.500 gm/L；酪蛋白酵素水解物100.0 mg/L；30 mM Dicamba-KOH，3.3 mg/L；蔗糖，30.0 gm/L；GelzanTM 2.30 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5mg/mL AgNo3,15.0 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L；R-甲基合氯氟酸(R-Haloxyfop acid)0.1810 mg/L)，並於28℃之避光及/或24-小時光線強度50 μmole m-2 sec-1下照光培養14天。此篩選可使基因轉殖癒合組織進一步增生與分化。癒合組織篩選期係持續三至四週。
將增生之胚性癒合組織移至含0.5 mM草甘膦之PreReg培養基中(MS鹽類，4.33 gm/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100 mg/L；L-脯胺酸，350.0 mg/L；MES[(2-(正-嗎啉基)-乙磺酸)，自由酸]0.250 gm/L；酪蛋白酵素水解物50.0 mg/L；NAA-NaOH 0.500 mg/L；ABA-EtOH 2.50 mg/L；BA 1.00 mg/L；蔗糖，45.0 gm/L；GelzanTM 2.50 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；8.5mg/ml AgNo3，1.00 mg/L；卡本西林，250.0 mg/L)，並於28℃之24-小時光線強度50 μmole m-2 sec-1下照光培養7天。
將芽狀之胚性癒合組織，移至含0.5 mM草甘膦之再生培養基(MS鹽類，4.33 gm/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100.0 mg/L；蔗糖，60.0 gm/L；Gellan Gum G434TM 3.00 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；卡本西林， 125.0 mg/L)，並於24-小時光線強度50 μmole m-2 sec-1下照光培養7天。
將初生根之地上部移至含生根培養基(MS鹽類，4.33 gm/L；經調整之MS-維生素[1000X]，1.00 ml/L；1,2,3,5/4,6-六羥基環己烷，100 mg/L；蔗糖，60.0 gm/L；Gellan Gum G434TM 3.00 gm/L；卡本西林，250.0 mg/L)之培養盤中，並於27℃之光線強度140-190 μmole m-2 sec-1且16/8小時之照光/避光下培養7天。利用上述方法分析假定之基因轉殖植物苗之轉基因拷貝數，並移至土壤中。
分子確認玉米植物內dgt-28與aad-1轉基因之存在。利用水解探針試驗確認dgt-28與aad-1多核苷酸序列之存在。經分離之T0玉米植物初步以水解探針試驗，一種TAQMANTM類似物，進行篩選，以確認其存在有aad-1與dgt-28轉基因。利用這些研究產生之數據計算轉基因拷貝數，並用於挑選進行回交(back crossing)之基因轉殖玉米品系，以產生T1子代。
以96孔培養盤收集組織樣本，並以KLECOTM組織磨碎器與不鏽鋼珠(Hoover Precision Products,Cumming,GA)於QiagenTM RLT緩衝溶液中進行組織浸解。在組織浸解後，利用Biosprint 96TM Plant kit(Qiagen,Germantown,MD)之高效能模式分離基因體DNA，並參照廠商之建議方法。利用Quant-ITTM Pico Green DNA試驗套組(Molecular Probes,Invitrogen,Carlsbad,CA)定量基因體DNA。利用BIOROBOT3000TM自動液體處理機(Qiagen,Germantown, MD)，將定量之基因體DNA調至約2 ng/μL，以進行水解探針試驗。利用LIGHTCYCLER®480系統(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)之即時PCR進行水解探針試驗，一種TAQMAN®試驗類似物，以決定轉基因拷貝數。利用LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0設計aad-1、dgt-28與一內部參考基因，轉化酶(Genbank登錄號：U16123.1)，並進行試驗。在基因放大方面，以將LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)配製成最終濃度1X之10 μL體積多重反應溶液，其包含0.4 μM之aad-1與dgt-28之各引子，以及0.2 μM之各探針(表18)。
進行二步驟之基因放大反應，其中60℃延長反應進行40秒，並收取螢光值。進行所有樣本之上機，並以平均之週期閾值(Ct)進行各樣本之分析。利用LightCycler®軟體1.5版進行即時PCR數據之分析，其採用相對定量模組，並以△△Ct方法為主。在每次上機時，對照組包括單一拷貝數之校正用基因體DNA樣本，以及已知之二拷貝數檢查樣本。表19列出水解探針試驗之結果。
經dgt-28轉型玉米之除草劑耐受性。玉米dgt-28轉型品系(T0)於溫室內馴化，並持續培養直到植物由組織培養體轉變為溫室生長條件(亦即，2-4片新的、正常樣貌之葉子以葉序呈現)。植物於27℃之16小時照光：8小時避光條件之溫室中生長。植物隨即以DURANGO DMATM(含有除草劑草甘膦)商業配方處理，並加入2% w/v硫酸銨。以履帶式噴霧器施加除草劑，其噴灑體積為187 L/ha、噴灑高度為50-cm。T0植物以一定範圍之草甘膦，即為280-4480 g ae/ha 草甘膦，噴灑，其可明顯損害未轉型之玉米品系。致死劑量定義為造成B104自交系>95%損傷之施加率。
T0 dgt-28玉米植物之結果證實，對於草甘膦施加率之耐受性達到4480 g ae/ha。一特定類型培養基係用於T0子代。相較於未轉型對照組，經轉型植物之最小植株矮化與整體植物生長情形，證實dgt-28與TraP5、TraP8，以及TraP23葉綠體輸送胜肽連接時，可提供穩健之草甘膦耐受性。
挑選出之T0植物係進行自交或回交，以進一步確認下一子代。選取100株含T1植物之dgt-28品系，並噴灑140-1120 g ae/ha固殺草或105-1680 g ae/ha草甘膦。可挑選標記與草甘膦抗性基因兩者皆構築至同一質體上。因此，若除草劑耐受性基因由噴灑除草劑而挑選出，則被認為存在該二基因。在14 DAT時，計數抗性與敏感性植物，以測定品系以單一基因座、顯性孟德爾式性狀(3R：1S)分離出之百分比，此以卡方分析測定。這些數據證實，dgt-28可於單子葉物種內遺傳為穩健之草甘膦抗性基因。增加草甘膦施加率於T1或F1存活體，以進一步確認dgt-28基因所提供之耐受性與保護性。
經dgt-28轉型之T 0 玉米出苗後之除草劑耐受性。以dgt-28連接至TraP4、TraP5、TraP8與TraP23之T0品系，係由農桿菌屬轉型作用產生，並使其於經控制之生長室條件下馴化，直到2-4片新的、正常樣貌之葉子以葉序呈現。植物係指定個別識別號碼，並取樣進行dgt-28與aad-1 之拷貝數分析。依據拷貝數分析，挑選植物進行蛋白質表現分析。將植物移植至具備新生長培養基之較大的盆中，並於27℃之16小時照光：8小時避光條件之溫室中生長。剩餘之未取樣以進行蛋白質表現之植物，隨後以DURANGO DMATM(草甘膦)商業配方處理，並加入2% w/v硫酸銨。該處理係分散進行，故每組植物包含不同拷貝數之T0品系。以履帶式噴霧器施加除草劑，其噴灑體積為187 L/ha、噴灑高度為50-cm。T0植物以一定範圍之草甘膦噴灑，即280-4480 g ae/ha之草甘膦，其可明顯損害未轉型之玉米品系。致死劑量定義為造成B104自交系>95%損傷之施加率。B104係轉型體之遺傳背景。
T0 dgt-28玉米植物之結果證實，對於草甘膦之耐受性達到4480 g ae/ha。表20。相較於未轉型對照組，經轉型植物之最小植株矮化與整體植物生長情形，證實dgt-28與TraP5、TraP8，以及TraP23連接時，可提供穩健之草甘膦保護性。
以標準ELISA進行之蛋白質表現分析，證實所有受測構築體之DGT-28蛋白質平均範圍為12.6-22.5 ng/cm2。
於溫室條件下確認F 1 子代之草甘膦耐受性。將未噴灑之單一拷貝數T0植物回交至未轉型背景B104，以進一 步於下一子代進行確認。在T1子代，評估其草甘膦耐受性以確認dgt-28基因之遺傳情形。在T1植物方面，於V1生長階段施加除草劑ASSURE IITM(35 g ae/ha快伏草-甲基(quizalofop-methyl))以篩選AAD-1蛋白質。可挑選標記與草甘膦抗性基因兩者皆構築至同一質體。因此，若一基因被挑選出，則被認為存在該二基因。在7 DAT之後，計數抗性與敏感性植物，並由族群中移去無效(null)植物。這些數據證實，dgt-28(v1)可於單子葉物種內遺傳為穩健之草甘膦抗性基因。進行植物取樣，並以標準ELISA與RNA轉錄程度鑑定DGT-28蛋白質。以前述之560-4480 g ae/ha草甘膦噴灑抗性植物。數據證實，以dgt-28連接至葉綠體輸送胜肽TraP4、TraP5、TraP8與TraP23，對於草甘膦之穩健耐受性可高達4480 g ae/ha。表21。
蛋白質表現數據證實，所有受測T1品系與構築體之平均DGT-28蛋白質範圍為42.2-88.2 ng/cm2，因此建立了T1子代之蛋白質表現。
在田野條件下確認dgt-28玉米。將單一拷貝數之 T1品系送至田野場地，以建立雜交半合子與自交同型合子種子，並進行額外之確認。將玉米轉型系B104之T1品系交配於自交系4XP811而生成雜交種子，所產生之雜交族群為1：1(半合子：無效)分離之品系。將取得之種子寄至2不同地點。將每一構築體之全部五個單一拷貝數品系種植在各地點，係以三重複之隨機完全區集設計(randomized complete block design)方式進行。該田野係經規劃，可於V4生長階段施加草甘膦，以及一獨立類別之植物於V8生長階段施加。以4XP811/B104之一般雜交作為陰性對照組。
各實驗列係以184 g ae/ha ASSURE IITM(106 g ai/L快伏草-甲基)處理，以去除無效分離體(null segregants)。有關ASSURE IITM施加之所有實驗項目皆以1：1(敏感性：抗性)(p=0.05)分離。經篩選之抗性植物係取樣自各品系，並以標準ELISA進行DGT-28蛋白質定量。
在V4或V8生長階段，快伏草-甲基抗性植物係以商業除草劑DURANGO DMATM(480 g ae/L草甘膦)處理，並添加2.5% w/v硫酸銨。以桿架式噴霧器施加除草劑，並調整供應體積為187 L/ha，噴灑高度為50-cm。植物以一定範圍之草甘膦噴灑，係由1120-4480 g ae/ha之草甘膦，其可明顯損害未轉型之玉米品系。致死劑量定義為造成4XP811自交系>95%損傷之施加率。進行視覺上損傷評估，為7、14與21 DAT(處理後天數)之視覺上黃化百分比、壞死百分比、生長抑制百分比與總視覺上損傷。該評估係比較每一品系之未處理樣本與陰性對照組。
所有評估時間點之視覺上損傷數據證實，對於DURANGO DMATM於兩地點與施加時間點之穩健耐受性達到4480 g ae/ha。於V4施加之代表品系可由一地點表示，係一致於其他品系、施加時間點與地點。表22。源自含有以dgt-28連接至TraP23之構築體(pDAB107665)之一品系，對於ASSURE IITM之AAD-1蛋白質篩選具有耐受性，但對於所有草甘膦施加率具有敏感性。
在施加4480 g ae/ha草甘膦比例之生殖生長階段，進行額外之評估。雄花序(tassels)、授粉時間點與穗結實之視覺上評估，各品系所有構築體之未處理樣本、施加時間點與地點皆類似。DGT-28蛋白質之定量結果證實，其平均蛋白質表現範圍為186.4-303.0 ng/cm2。數據證實，在田野條件下，經dgt-28轉型玉米之穩健耐受性，在整個生殖生長階段達到4480 g ae/ha草甘膦。以噴灑耐受性之結果為主之數據亦呈現了DGT-28蛋白質之偵測與功能。
Dgt-28玉米於同型合子狀態下之遺傳力與耐受性之確認。將T1S2種子種植於前述之溫室條件下。相同五個單一拷貝數品系於田野條件下確認，其係於均質狀態下之確認。植物生長至V3生長階段，並分成三個草甘膦比例，範圍由1120-4480 g ae/ha草甘膦(DURANGO DMATM)，且每組進行四重複。以前述之履帶式噴霧器施加，並以2.0% w/v硫酸銨配製。各品系施加硫酸銨，以作為未處理組。處理7與14天後，進行前述之視覺上評估。數據證實，所有受測品系之穩健耐受性達到4480 g ae/ha草甘膦。表23。
源自pDAB107665之品系於田野條件下無耐受性，證實其對於草甘膦不具有耐受性，因此符合田野觀察結果(數據未顯示)。除了先前提及的一個品系以外，以草甘膦處理之所有品系樣本，對於草甘膦皆不具有敏感性。因此，數據證實，dgt-28玉米同質族群之遺傳力屬於孟德爾式遺傳。利用標準ELISA確認DGT-28蛋白質之表現，證實所有具草甘膦耐受性之單一拷貝數品系，平均蛋白質表現範圍為27.5-65.8 ng/cm2。數據證實，所有子代之DGT-28蛋白質為功能性蛋白質且穩定。
使用草甘膦作為可挑選標記之出苗後除草劑耐受性。如前所述，將T0轉型植物移出組織培養基，並於溫室馴化。受測品系含有與TraP5、TraP8及TraP23葉綠體輸送胜肽連接之dgt-28於。經證實，這些T0植物所提供之穩健耐受性達到4480 g ae/ha草甘膦，而未轉型植物則受制於草甘膦，其濃度低至280 g ae/ha。這些數據證實，dgt-28可作為一可挑選標記，且所使用之草甘膦濃度範圍為280-4480 g ae/ha。
將含有dgt-28轉基因之些許固定品系玉米種子，混入些許未轉型玉米種子。種植這些種子並使其成長至V1-V3發育階段，此時以範圍280-4480 g ae/ha之草甘膦篩選劑量噴灑這些種苗。在7-10天後，計數敏感性與抗性植物，發現草甘膦耐受性植物之數量與經種植之含dgt-28基因轉殖種子之原始數量有關。
Dgt-28玉米之疊加(Stacking)。依研究目的，以 AAD-1蛋白質作為dgt-28轉型玉米之可挑選標記。aad-1基因亦可作為玉米之除草劑耐受性性狀，以提供一作物於V8階段施加時之穩健2,4-D耐受性。以源自構築體pDAB107663(TraP4：：dgt-28)、pDAB107664(TraP8：：dgt-28)與pDAB107666(TraP5：：dgt-28)之四種品系，確認其對於草甘膦與2,4-D之混合包裝桶施加後之耐受性。在室溫條件下，以F1種子完成確認研究。以前述之履帶式噴霧器進行施加，其比例如下：1120-2240 g ae/ha草甘膦(篩選dgt-28基因)、1120-2240 g ae/ha 2,4-D(篩選aad-1基因)、或兩種除草劑以所述比例製成之混合包裝桶。植物於7與14 DAT時評分。施加2240 g ae/ha除草劑之噴灑結果係顯示於表24。
結果證實，dgt-28可成功地疊加aad-1，因而增加了以除草劑施加於感興趣作物之機會(草甘膦+苯氧基醋 酸，分別用於dgt-28與aad-1)。在作物生產時，很難控制闊葉雜草或抗性雜草，若生物型具有疊加基因，則可作為雜草控制之方法，並保護感興趣之作物。其他輸入型或輸出型性狀亦可疊加於玉米與其他植物之dgt-28基因。
大豆之轉型作用。經由農桿菌屬媒介之大豆子葉結外植體(cotyledonary node explants)轉型作用，產生含有一穩定融入dgt-28轉基因之基因轉殖大豆(Glycine max)。利用攜帶一含功能性dgt-28之雙偶型載體之經改造農桿菌屬菌種進行轉型作用。
以修正Zeng等人提出的半子葉結方法，進行農桿菌屬媒介之轉型作用(Zeng P.,Vadnais D.A.,Zhang Z.,Polacco J.C.,(2004),Plant Cell Rep.,22(7)：478-482)。簡言之，大豆種子(cv.Maverick)於基礎培養基上發芽，分離子葉結並以農桿菌屬感染。用於幼芽萌發、幼芽延伸與生根之培養基皆補充西弗士林(cefotaxime)、特泯菌(timentin)與萬古黴素(vancomycin)，以移除農桿菌屬。進行除草劑篩選，以抑制未轉型幼芽之生長。將篩選之幼芽移至生根培養基以進行根部發育，接著移至混合土以馴化種苗。
經篩選種苗之頂端小葉，係經除草劑局部處理(葉片塗抹技術)，以篩選假定之轉型體。經篩選種苗轉移至溫室，使其馴化並隨即以除草劑進行葉片塗抹，以再次確認其耐受性。這些假定的轉型T0植物係經取樣，並以分子分析方法確認除草劑可挑選標記與dgt-28轉基因之存在。T0植物於溫室內自體授精，以產生T1種子。
可使用第二種大豆轉型方法，以產生額外的基因轉殖大豆植物。利用攜帶一含功能性dgt-28之雙偶型載體之經改造農桿菌屬菌種，進行轉型作用。
以修正Paz等人提出的半種子方法，進行農桿菌屬媒介之轉型作用(Paz M.,Martinez J.,Kalvig A.,Fonger T.,and Wang K.,(2005)Plant Cell Rep.,25：206-213)。簡言之，進行農桿菌屬媒介植物轉型作用之前，成熟之大豆種子以氯氣除菌隔夜，並浸泡於無菌H2O中二十小時。沿著種臍(hilum)將種子縱向切半以分開種子，並移去種皮。切下胚軸，並由子葉結上移去任何軸向幼芽。所得之半種子外植體(explants)以農桿菌屬感染。用於幼芽萌發、幼芽延伸與生根之培養基皆補充西弗士林、特泯菌與萬古黴素，以移除農桿菌屬。進行除草劑篩選，以抑制未轉型幼芽之生長。將篩選之幼芽移至生根培養基以進行根部發育，接著移至混合土以馴化種苗。
假定的轉型T0植物係經取樣，並以分子分析方法確認可挑選標記與dgt-28轉基因之存在。數個品系經辨識含有轉基因。以這些T0植物進行進一步分析，並於溫室內自體授精，以產生T1種子。
Dgt-28對於T1子代之遺傳力確認。以下列二方法之一評估DGT-28蛋白質對於T1子代之遺傳力。第一種方法包括將T1種子種植至Metro-mix培養基，並於發芽植物之首次三葉生長階段施加411 g ae/ha IGNITETM 280 SL。第二種方法包含以滾珠軸承與研磨機(genogrinder)將種子均質為 全部8重複之樣本。隨後以偵測PAT蛋白質的ELISA條帶試驗，檢測遺傳品系，係因可挑選標記與dgt-28位於相同質體。無論以何種方法，若單一植物具有固殺草耐受性，或可由PAT ELISA條帶試驗檢測出，則該品系證實對於T1子代具有遺傳力。
以全部五個構築體進行前述之遺傳力篩選。質體含有與TraP4、TraP8與TraP23連接之dgt-28。所有構築體之品系證實，PAT：：DGT-28蛋白質對於T1子代具有68%遺傳力。
Dgt-28轉型T 1 大豆之出苗後除草劑耐受性。前述之篩選方法所測出具有遺傳力之T1品系種子，於溫室條件下種植於Metro-mix培養基。植物生長至首次三葉期後，以前述之411 g ae/ha IGNITETM 280 SL處理，以篩選pat基因。賦予各品系之抗性植物獨特之標識，並取樣進行dgt-28基因之合子型(zygosity)分析。利用合子型數據，將2半合子與2同型合子之重複物指定各草甘膦施加率，當植物存活數足夠時，每一處理組總共4重複。以這些植物相較於野生型Petite havana菸草。所有植物以履帶式噴霧器噴灑，並設定為187 L/ha。該植物係噴灑範圍560-4480 g ae/ha之DURANGOTM二甲基胺鹽(DMA)。所有施加率皆以水配製，並加入2% w/v硫酸銨(AMS)。植物於處理7與14天後進行評估。植物依據整體視覺上植株矮化、黃化與壞死進行損傷分級。T1子代分離，故預期會出現某些可變異反應，係因合子型不同。
Dgt-28對於T 2 子代之草甘膦比例升高具有保護作用。以dgt-28每一構築體之二至五個T2品系，進行45個植物子代試驗。依據先前子代所完成的合子型分析，選取同型合子品系。種子之種植如前述。植物隨即以411 g ae/ha IGNITE 280 SL噴灑，以篩選如前述之pat可挑選標記。在3 DAT後，計數抗性與敏感性植物。
針對含有TraP4與dgt-28連接之構築體(pDAB107543與pDAB107548)，十二種受測品系中有九種未分離，因此確認T2子代之均質品系。針對含有TraP8與dgt-28(pDAB107545)連接之品系，四種品系中有兩種不產生分離體，證實孟德爾式遺傳於大豆中橫跨至少兩個dgt-28子代。組織樣本係取自抗性植物，並以標準ELISA方法定量DGT-28蛋白質。於受測之非分離T2品系中，數據證實DGT-28蛋白質之平均範圍為32.8-107.5 ng/cm2。構築體pDAB107553(TraP23：：dgt-28)之品系先前並未以固殺草挑選，且草甘膦之劑量反應，係用於檢測對於草甘膦比例升高之同質性與耐受性。構築體pDAB107553之品系之各重複數，對於草甘膦比例範圍由560-4480 g ae/ha皆具有耐受性，並因此確認其為同質性族群，且可遺傳至少兩代。
如前述，以比例範圍由560-4480 g ae/ha之DURANGO DMA草甘膦施加於之2-3個三葉大豆。14 DAT之視覺上損傷數據確認，並證實T1子代之耐受性結果。
水稻之dgt-28轉型作用。經由農桿菌屬媒介之除菌水稻種子轉型作用，產生含有一穩定融入dgt-28轉基因之基因轉殖水稻(Oryza sativa)。利用攜帶一含功能性dgt-28之雙偶型載體之經改造農桿菌屬菌種，進行轉型作用。
培養基以1 M KOH調整至pH 5.8，並以2.5 g/l植物凝膠(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)進行固化。將胚性癒合組織培養於含有30 ml半固體培養基之100 x 20 mm培養皿中。水稻種苗生長在含有50 ml培養基之MAGENTA盒內。將細胞懸浮液置於含有35 mL液體培養基之125 ml錐形瓶內，並以125 rpm旋轉。在25-26℃之避光環境中誘發與維持胚性培養物，而植物再生與全植物培養則於具備16-h光照之照明房間內進行(Zhang等人，1996)。
胚性癒合組織之誘發與維持，係於一經修飾之NB基礎培養基中進行(Li等人，1993)，其中培養基改為含 有500 mg/L麩醯胺酸。將懸浮培養液置於SZ液體培養基中(Zhang等人，1998)，並加入30 g/L蔗糖以取代麥芽糖。滲透培養基(NBO)內含NB培養基，並加入各0.256 M之甘露醇與山梨醇。利用含有適當除草劑挑選試劑之NB培養基，挑選除草劑抗性癒合組織，歷時3-4週。以NB培養基加入2,4-二氯苯氧基醋酸(2,4-D)、1 mg/l α-萘乙酸(NAA)、5 mg/l離層酸(ABA)與挑選用除草劑作為培養基(PRH50)，進行預再生作用(pre-regeneration)1週。以NB培養基加入2,4-D、0.5 mg/l NAA與篩選用除草劑作為再生培養基(RNH50)，於培養後進行種苗再生，直到假定之基因轉殖地上部再生為止。將幼芽移至生根培養基，內含半強度MS(Murashige and Skoog)基礎鹽類與Gamborg’s B5維生素，並輔以1%蔗糖與挑選用除草劑。
水稻台北309(Oryza sativa L.japonica cv.Taipei 309)之成熟乾燥種子係以Zhang等人(1996)所述之方法進行除菌。經除菌之成熟水稻種子於避光下培養於NB培養基中，以誘發胚性組織。初期癒合組織之直徑約1 mm，將其由子葉盤取下並於SZ液體培養基進行細胞懸浮。懸浮液隨後以Zhang 1996所述方法維持。於前述之繼代培養3-5天後，自液體培養基內取出懸浮液衍生之胚性組織，並置於NBO滲透培養基上，使其於培養皿內形成約2.5 cm寬之圈環，且於轟擊(bombardment)前培養4 h。轟擊後十六至二十小時，組織由NBO培養移至NBH50篩選培養基，其轟擊表面朝上，並避光培養14-17天。接著由原始經轟擊外植體上 分離出新形成之癒合組織，並置於同一培養基附近。經過8-12天，視覺上可辨別出緊實、不透光之癒合組織，將其移至PRH50預再生培養基，並避光培養7天。生長中的癒合組織變得更緊實與不透光，隨即將其繼代培養於RNH50再生培養基，並於16-h照光下歷時14-21天。將再生之幼芽移至含有½ MSH50培養基之MAGENTA盒中。將單一外植體再生之多重植物當作姐妹子代，並視為一獨立之植物品系。若植物產生厚實白色根部，並於½ MSH50培養基上蓬勃生長，則其dgt-28基因判定為陽性。一旦種苗到達MAGENTA盒之頂端，則將其移至含有土壤之6-cm盆中，並於100%濕度下，歷時一週，接著移至具備30℃之14-h光照期與21℃之避光生長箱中2-3週，最後移至溫室內之13-cm盆中。收集種子，於4℃保存之前，置於37℃乾燥一週。
Dgt-28水稻之T 0 分析。將農桿菌屬轉型法取得之經移植水稻轉型體移植至培養基內，並於溫室條件下馴化。取樣所有植物，進行dgt-28之PCR偵測，結果證實pDAB110827(TraP8：：dgt-28)具有二十二個PCR陽性品系，而pDAB110828(TraP23：：dgt-28)具有最少六個PCR陽性品系。PCR陽性品系之dgt-28南方墨漬法分析證實，兩種構築體皆產生簡單之(1-2拷貝數)品系。挑選出之T0品系之蛋白質表現證實，DGT-28之蛋白質表現範圍由低於偵測值至130 ng/cm2。源自構築體pDAB110828之經篩選T0品系，係以如前述之2240 g ae/ha DURANGO DMATM處理，並於處 理後7與14天進行評估。數據證實，對於施加之草甘膦比例具有穩健耐受性。所有PCR陽性植物皆產生T1種子，以進行進一步確認。
水稻之Dgt-28遺傳力。以含有葉綠體輸送胜肽TraP8之dgt-28構築體pDAB110827之四個T1品系，進行100個植物子代檢測。將種子種植於填充培養基之盆中。所有植物隨即噴灑560 g ae/ha DURANGO DMATM，以挑選出如前述之dgt-28基因。在7 DAT後，計數抗性與敏感性植物。經由卡方分析，各構築體之受測四個品系中，有兩個以單一基因座分離並具有明顯孟德爾性狀(3R：1S)。在多個物種之中，Dgt-28為一具遺傳力之草甘膦抗性基因。
Dgt-28轉型之T 1 水稻出苗後之除草劑耐受性。賦予用於子代檢測之各品系T1抗性植物獨特之標識，並取樣進行dgt-28基因之合子型分析。利用合子型數據，將2半合子與2同型合子之重複數指定各草甘膦施加率，使每一處理組總共4重複。以這些植物相較於野生型kitaake水稻。所有植物以履帶式噴霧器噴灑，並設定為187 L/ha。該植物以範圍560-2240 g ae/ha之DURANGO DMATM噴灑。所有施加率皆以水配製，並加入2% w/v硫酸銨(AMS)。植物於處理7與14天後進行評估。植物依據整體視覺上植株矮化、黃化與壞死進行損傷分級。T1子代分離，故預期會出現某些可變異反應，係因合子型不同。
噴灑結果證實，於7 DAT(處理後天數)，可測得對於草甘膦比例升高之最小植物損傷(數據未顯示)。
以源自pDAB110827之所有四個受測T1品系之重複樣本進行DGT-28蛋白質測定。數據證實，半合子與同型合子重複樣本之DGT-28平均蛋白質範圍，分別為20-82 ng/cm2以及21-209 ng/cm2。這些結果證實，T1子代之蛋白質表現穩定，且施加560 g ae/ha草甘膦進行挑選之後，dgt-28水稻之草甘膦耐受性達到2240 g ae/ha。
菸草之dgt-28轉型作用。以含有dgt-28轉基因之農桿菌進行煙草(cv.Petit Havana)葉片轉型作用。將含有dgt-28轉基因之質體的單一菌落，接種於含有觀黴素(50 μg/mL)與鏈黴素(125 μg/mL)之4 mL YEP培養基，並於28℃之搖晃器中以190 rpm培養至隔日。隨後，將該4 mL種菌培養液接種於一含有25 mL相同培養基之125 mL Erlenmeyer三角錐形瓶中。此培養液於28℃之190 rpm搖晃中培養，直到OD600到達~1.2。隨後將10 mL農桿菌屬懸浮液置於除菌之60 x 20 mm PetriTM培養盤中。
由植物上切下新鮮葉片(0.5 cm2)，於無菌條件下生長於PhytaTraysTM(Sigma,St.Louis,MO)，內為含有30 g/L蔗糖之MS培養基(Phytotechnology Labs,Shawnee Mission,KS,)，接著浸泡於10 mL之農桿菌屬隔夜培養液數分鐘、以無菌濾紙吸乾，並隨即置於外加有1 mg/L吲哚乙酸與1 mg/L 6-芐基胺基嘌呤之相同培養基中。三天後，葉片與含有dgt-28轉基因之農桿菌屬的共培養體，移至含有5 mg/L BastaTM與250 mg/L西弗士林之相同培養基中。
三週後，將個別T0種苗移至含有10 mg/L BastaTM與250 mg/L西弗士林之MS培養基，並於移植至土壤與移至溫室之前額外培養三週。挑選出之T0植物(如前述之分子分析方法所確認)進行自花授粉，並於種皮完全乾燥時收集種子。進行T1種苗之合子型與報導基因表現(如下所述)篩選，辨識含有dgt-28轉基因之經篩選植物。
將植物移至溫室，係藉由清洗根部之瓊脂、移植至含土壤之13.75 cm方盆、將花盆放入Ziploc®袋(SC Johnson & Son,Inc.)、將自來水放入袋子底部，並置於具備間接光線之30℃溫室中一週而完成。3-7天後，打開袋子；植物完成 授精，並於開口袋內生長直到植物於溫室內馴化，屆時移去袋子。植物於一般溫室條件下生長(白天27℃、夜晚24℃、白天16小時、最小天然光+補充光=1200 μE/m2s1)。
在繁殖之前，自T0植物取樣以進行DNA分析，係以即時PCR測定插入之dgt-28拷貝數。將新鮮組織放入試管中，並於4℃冷凍乾燥2天。組織完全乾燥之後，將鎢珠(Valenite)放入試管中，並以Kelco珠磨機進行1分鐘之樣本乾燥研磨。接著進行標準DNeasyTM DNA分離流程(Qiagen,DNeasy 69109)。經萃取DNA之一分液隨即以Pico Green(Molecular Probes P7589)染色，並以螢光儀(BioTekTM)結合標準品判讀，以取得ng/μl程度之濃度。以100 ng之總DNA作為模板。PCR反應係以9700 GeneampTM熱循環儀(Applied Biosystems)進行，包括樣本於94℃反應3分鐘，及35次循環之94℃反應30秒鐘、64℃反應30秒鐘與72℃反應1分鐘，以及72℃反應10分鐘，而後再經45秒鐘。PCR產物利用電泳進行分析，係使用1%瓊脂凝膠，並加入EtBr染色，並以南方墨漬法確認。
取5-9個PCR呈陽性之品系，其具有來自三個構築體之1-3拷貝數之dgt-28基因，該三個構築體含有不同葉綠體輸送胜肽序列(TraP4、TraP8與TraP23)，進行再生反應，並移至溫室。
自所有PCR呈陽性之植物取樣，並以標準ELISA進行DGT-28蛋白質之定量。所有PCR呈陽性之植物皆可測得DGT-28蛋白質，且dgt-28拷貝數增加者之蛋白質濃度，具有增加趨勢。
菸草之aad-12(v1)遺傳力。選取dgt-28各構築體 之五種T1植株，進行100植物子代之檢測。構築體包含下列葉綠體輸送胜肽序列之一：TraP4、TraP8或TraP23。種子經層積、播種與移植，其流程非常類似前述阿拉伯芥屬之範例，除了在移植前，無效植物未於初步篩選時移除。所有植物隨即噴灑280 g ae/ha IGNITE 280 SL，以篩選如前述之pat可挑選標記。3 DAT後，計數抗性與敏感性植物。
經由卡方分析，各構築體之受測五個品系中，有四個以單一基因座分離，並具有明顯孟德爾性狀(3R：1S)。在多個物種之中，Dgt-28為一具遺傳力之草甘膦抗性基因。
經dgt-28轉型之T 1 菸草出苗後之除草劑耐受性。賦予用於子代檢測之各品系T1抗性植物獨特之標識，並取樣進行dgt-28基因之合子型分析。利用合子型數據，將2半合子與2同型合子之重複數指定各草甘膦施加率，使每一處理組總共4重複。以這些植物相較於野生型Petite havana菸草。所有植物以履帶式噴霧器噴灑，並設定為187 L/ha。該植物係以範圍560-4480 g ae/ha之DURANGO DMATM噴灑。所有施加率皆以水配製，並加入2% w/v硫酸銨(AMS)。植物於處理7與14天後進行評估。植物依據整體視覺上植株矮化、黃化與壞死進行損傷分級。T1子代分離，故預期會出現某些可變異反應，係因合子型不同。
噴灑結果證實，於7 DAT(處理後天數)，可測得對於草甘膦比例升高之最小植物損傷(數據未顯示)。在14 DAT後，視覺上損傷數據證實，相較於構築體含TraP8與TraP23之單一拷貝數品系，構築體含TraP4之單一拷貝數品系損傷增加。表28。
這些結果證實，dgt-28之草甘膦耐受性達到4480 g ae/ha，以及葉綠體輸送胜肽序列與dgt-28基因連接所產生的耐受性差異。
T 2 子代中Dgt-28對於草甘膦施加率升高之防範。選取dgt-28各構築體中三種T2植株之兩種，進行25植物子代之檢測。依據先前子代完成之合子型分析，選擇同型合子品系。種子經層積、播種與移植，係如前所述。所有植物隨即噴灑280 g ae/ha Ignite 280 SL，以篩選如前述之pat可挑選標記。3 DAT後，計數抗性與敏感性植物。各構築體之所有受測植株並未分離，因此確認T2子代之同質性植株，並證實孟德爾式遺傳可於菸草延續至少兩代之dgt-28。
如前述，DURANGO DMATM草甘膦以比例範圍由420-3360 g ae/ha施加至2-3葉菸草。14 DAT之視覺上損傷數據，確認了T1子代之耐受性結果。含TraP4構築體之兩拷貝品系的葉片結果證實，其耐受性類似單一拷貝數之TraP8與TraP23植株(數據未顯示)。
數據證實，相較於未轉型對照組，dgt-28菸草之草甘膦穩健耐受性達到3360 g ae/ha，並延續兩代。
在施加草甘膦之前，自各品系所選取之植物取樣，利用標準DGT-28 ELISA進行DGT-28蛋白質分析。數據證實，全部構築體之單純(1-2拷貝數)品系中，DGT-28平均蛋白質表現之範圍為72.8-114.5 ng/cm2。數據證實，dgt-28可於經轉型菸草之T2子代中表現蛋白質，且耐受性數據確認DGT-28為功能性蛋白質。
Dgt-28之疊加以增加菸草(cv.Petit Havana)之除 草劑耐受性範圍。將同型合子dgt-28(pDAB107543與pDAB107545)與aad-12 v1(pDAB3278)植物(針對後者，請見PCT/US2006/042133，在此併入本案以作為參考資料)兩者相互交配，並收集F1種子。各基因之兩相互交配F1種子出現層積，且各交配組之6重複樣本皆以1120 g ae/ha草甘膦處理(以篩選dgt-28基因)、1120 g ae/ha 2,4-D(以篩選aad-12基因)，或以所述之比例混合兩種除草劑。植物於14 DAT進行分級。噴灑結果列於表30。
結果確認，dgt-28可順利疊加至aad-12(v1)，因此增加了施加至感興趣農作物之除草劑範圍(草甘膦+苯氧基醋酸，分別針對dgt-28與aad-12)。農作物生產時，很難控制闊葉雜草或存在抗性雜草生物型，疊加作用可作為雜草控制並保護感興趣農作物之工具。亦可疊加額外的輸入或輸出性狀至dgt-28基因。
小麥之草甘膦抗性。生產編碼DGT-28之雙偶型載體。利用本領域中習知之技藝與技術，設計與組合含有DGT-28表現與PAT篩選卡匣之雙偶型載體。各DGT-28表現卡匣包含促進子、5'非轉譯區與玉米泛素(Ubi)基因之內含子(Toki et al.,Plant Physiology 1992,100 1503-07)，接著為 一編碼序列，包含以四種輸送胜肽之一(TraP4、TraP8、TraP23或TraP5)融合至經合成5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸鹽合成酶基因(DGT-28)之5'端，係經密碼子最佳化以於植物中表現。DGT-28表現卡匣終止於3'非轉譯區(UTR)，其含有轉錄終止子與玉米脂肪酶基因(Vp1)之聚腺苷酸化作用位置(Paek et al.,Mol.Cells 1998 30；8(3)336-42)。PAT篩選卡匣包含促進子、5'非轉譯區與水稻肌動蛋白(Act1)基因之內含子(McElroy et al.,The Plant Cell 1990 2(2)163-171)，接著為一經合成之綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes)草胺膦乙醯轉移酶(PAT)基因，係經密碼子最佳化，以於植物中表現。PAT基因係編碼一具有麩胺酸合成酶抑制劑，包括草胺膦、固殺草與雙丙胺磷，抗性之蛋白質(Wohlleben et al.,Gene 1988,70(1),25-37)。篩選卡匣終止於3' UTR，其含有轉錄終止子與花椰菜鑲嵌病毒(cauliflower mosaic virus；CaMV)35s基因之聚腺苷酸化作用位置(Chenault et al.,Plant Physiology 1993 101(4),1395-1396)。
篩選卡匣由商業上基因合成供應商所合成(GeneArt,Life Technologies)，並選殖至一匣道可用之(gateway-enabled)雙偶型載體。將DGT-28表現卡匣選殖至pDONR221。所得之ENTRY選殖株係用於LR Clonase II(Invitrogen,Life Technologies)反應中，其中該匣道可用之雙偶型載體係編碼草胺膦乙醯轉移酶(PAT)表現卡匣。所有經組合質體之菌落，以限制酶切割其經純化DNA，以進行初步 篩選，所使用之限制性內切酶購自New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)與Promega(Promega Corporation,WI)。利用QIAprep Spin Miniprep套組(Qiagen,Hilden)或Pure Yield Plasmid Maxiprep System(Promega Corporation,WI)進行質體DNA之製備，並參照供應商之說明。利用ABI Sanger Sequencing與Big Dye Terminator v3.1循環定序法(Applied Biosystems,Life Technologies)進行經篩選選殖株質體DNA之定序。利用SEQUENCHERTM軟體(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)組合與分析序列數據。
所得之四種雙偶型表現選殖株：pDAS000122(TraP4-DGT28)、pDAS000123(TraP8-DGT28)、pDAS000124(TraP23-DGT28)與pDAS000125(TraP5-DGT28)係各自轉型至農桿菌菌種EHA105。
以dgt-28表現構築體生產基因轉殖小麥品系。利用農桿菌屬媒介轉型作用與供體小麥植株山齒鶉(Bobwhite)MPB26RH，生產四種DGT-28表現構築體之一的基因轉殖小麥植物，其方法類似Wu et al.,Transgenic Research 2008,17：425-436。進行假定T0基因轉殖品系之草胺膦(phosphinothricin；PPT)耐受性篩選，以PAT可挑選標記確認其表型，並移至土壤。T0植物係於溫室隔絕環境中生長，並生產T1種子。整體而言，各DGT-28表現構築體約產生45個單獨T0品系。
Dgt-28小麥品系之T 0 小麥的草甘膦抗性。T0品系於溫室馴化，並持續生長直到直到2-4片新的、正常樣貌之 葉子以葉序呈現(亦即，植物由組織培養轉移至溫室生長條件)。植物於25℃溫室之12小時補充照明下生長直到成熟。所有的草甘膦耐受性初步篩選與Taqman分析，皆於T1植物完成，並於前述相同條件下生長。數據可用於決定欲進一步確認之遺傳力T1品系。在溫室條件下，補種六個低拷貝數(1-2拷貝數)與兩個多重拷貝數之T1品系，並生長至3葉階段。以範圍由420-3360 g ae/ha之草甘膦(Durango DMATM)商業配方噴灑T1植物，其可明顯損害未轉型小麥品系。施加配方內另加入2% w/v硫酸銨。致死劑量定義為，相較於山齒鶉MPB26RH之未轉型對照組，造成>75%損傷之比例。
在此範例中，草甘膦之施加，用於測定T1子代之dgt-28基因分離情形，以及證實對於草甘膦比例增加之耐受性。植物之反應係以處理21天後(DAT)視覺上損傷之規模表示。數據列於表中，分別為小於25%之視覺上損傷(4)、25%-50%之視覺上損傷(3)、50%-75%之視覺上損傷(2)與大於75%之損傷(1)。用於小麥轉型作用之每一構築體，皆以算數平均與標準差表示。每一噴灑比例與轉型之個別反應分級範圍亦於最後一列標明。以野生之未轉型小麥(c.v.山齒鶉MPB26RH)作為草甘膦敏感性對照組。在T1子代中，可得到半合子與同型合子植物進行每一品系之檢測，因此涵蓋各種比例之草甘膦。半合子植物含有同型合子植物一半之基因劑量，因此預期T1子代之草甘膦反應多變。
T1 dgt-28小麥植物之結果證實，藉由與葉綠體輸送胜肽TraP4、TraP5、TraP8與TraP23連接，草甘膦耐受性 比例達到3360 g ae/ha。表31。數據為一低拷貝數之T1品系，但代表各構築體之族群。
在21 DAT，計數抗性與敏感性植物，以確定以單-基因座、顯性孟德爾式性狀(3R：1S)分離之植株百分比，係以卡方分析判定。表32。這些數據證實，dgt-28可於單子葉物種內遺傳為穩健之草甘膦抗性基因。
範例4：用於表現玉米中農業上重要的轉基因之嵌合葉綠體輸送胜肽(TraP)序列 Cry2Aa：
來自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)之Cry2Aa蛋白質，展現出對抗棉鈴蟲(Helicoverpa zea(CEW))與玉米螟(Ostrinia nubilalis(ECB))之活性。單一拷貝數之cry2Aa基因(序列辨識編號：10)，玉米之偏移密碼子，係於玉米中測試。在此實驗中，Cry2Aa係於玉米中單獨評估，以及與TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽組合評估，以測定昆蟲耐受活性，並評估TraP8 v2嵌合葉綠體輸送胜肽序列對於Cry2Aa蛋白質在玉米中表現之影響。
含有Trap8 v2嵌合葉綠體輸送胜肽序列(序列辨 識編號：8)與GCA密碼子連接子之pDAB109807構築體，係選殖至cry2Aa基因之上游，並導入構築體pDAB109807(圖12)中，以於玉米植物中測試昆蟲耐受性。所得之構築體含有該二植物轉錄單元(PTU)。第一PTU含有玉米泛素1促進子(ZmUbi1 promoter；Christensen,A.,Sharrock R.,and Quail P.,(1992)玉米polyubiquitin gene：structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation,Plant Molecular Biology,18：675-689)、TraP8-cry2Aa融合基因(TraP8 Cry2Aa)，以及玉米脂解酶3'非轉譯區域(ZmLip 3'UTR；美國專利號7,179,902)。該構築物經限制酶切割與定序而確認。第二PTU包含甘蔗桿狀病毒促進子(SCBV促進子；美國專利號6,489,462)、含有MSV領導序列之aad-1除草劑耐受性基因，以及酒精脫氫酶1內含子6(AAD-1：美國專利號7,838,733，以及MSV領導序列：Genbank Acc.No.FJ882146.1，以及酒精脫氫酶內含子：Genbank Acc.No.EF539368.1)，以及玉米脂解酶3'非轉譯區域(ZmLip 3'UTR)。控制組質體，pDAB107687，其未包含cry2Aa基因上游之葉綠體輸送胜肽序列，係經建構並包含於研究中(圖13)。該質體導入農桿菌中，以進行植物轉型。
來自玉米品系B104之穗係於授粉後10-12天收成。經收成之穗係經去殼，並浸入20%市售漂白水溶液(Ultra Clorox® Germicidal Bleach,6.15%過濾酸鈉)進行表面滅菌 處理，並滴上2滴Tween 20，20分鐘，之後於層流罩抽風櫃中，以經滅菌之去離子水潤洗三次。無菌切除每一穗中未成熟之胚(1.8-2.2 mm長)，並分配至一或更多微量離心管中，其中含有2.0 ml農桿菌懸浮液，其中加入2 μl之10% Break-Thru® S233界面活性劑。
胚單離活性完全後，將含有胚之小管關上，並置於搖臂平台上5分鐘。之後管中內容物倒入共培植培養基之盤上，以滅菌、拋棄式轉移微量吸管移除農桿菌懸浮液。含有胚之共培植盤係半掩蓋置於層流抽風櫃後面30分鐘；之後使用顯微鏡將胚定位為內子葉向上。含有胚之共培植盤之後繼續半掩蓋置於層流抽風櫃後面15分鐘。之後將盤蓋上，以3M Micropore膠帶密封，並置於25℃培養箱中照射24小時/日光，強度約為60 μmol m-2 s-1。
經共培植階段後，將胚轉移至休止培養基中。每一盤移入不超過36個胚。培養盤纏上3M micropore膠帶，並於27℃培養24小時/日光強度約為50 μmol m-2 s-1，照射7-10日。經癒合之胚之後轉移至第I部分培養基上。每一第I部分培養盤中移入不超過18個經癒合之胚。各盤纏上3M micropore膠帶，並於27℃培養，照射24小時/日光，強度約50 μmol m-2 s-1，照射7日。經癒合之胚之後轉移至第II部分培養基上。每一第II部分培養盤中移入不超過12個經癒合之胚。各盤纏上3M micropore膠帶，並於27℃培養，照射24小時/日光，強度約50 μmol m-2 s-1，照射14日。
在此階段，抗性癒合組織移入預再生培養基中。 每一預再生培養盤中移入不超過9個經癒合組織。各盤纏上3M micropore膠帶，並於27℃培養，照射24小時/日光，強度約50 μmol m-2 s-1，照射7日。再生癒合組織之後轉移至PhytatraysTM之再生培養基上，並於28℃培養，照射16小時日光/8小時黑暗每日，光強度約為150 μmol m-2 s-1，照射7-14日，或直到地上部發育出。每一預PhytatrayTM盤中移入不超過5個癒合組織。具有主根之小地上部之後分離出，並轉移至地上部/根培養基中。約6 cm或更小之發根植株係轉植於土壤中，並移出至生長箱中，以使幼苗健化。
基因轉殖植物以獨特標識標記出，並由常規培養箱轉移至溫室中。植物係由PhytatraysTM轉植至小瓶中(T.O.塑膠，3.5-英吋SVD,700022C)，其中填充有生長培養液(Premier Tech Horticulture,ProMix BX,0581 P)，並覆蓋上濕罩(humidomes)以幫助植物適應。植物種於ConvironTM生長箱中(28℃/24℃，16-小時光照期間，50-70% RH,200 μmol光強度)，直至達到V3-V4階段。此步驟可幫助植物適應土壤與更嚴苛之溫度條件。之後植物移至溫室中(光線暴露種類：光或同化；高光限制：1200 PAR；16-小時日照長度；27℃白晝/24℃黑夜)，並由小瓶中轉植至5.5英吋瓶中。轉殖至較大瓶後約1-2週，植物經樣本製備以進行生物試驗。每一品系係試驗一株植物。
選出之品系經辨識以進行下一代演化，以基因之拷貝數為基礎，蛋白質經西方墨漬法偵測，並偵測對抗生物試驗中之昆蟲之活性。含有觀黴素抗性基因之品系係標 記出，但不一定要省略演化。經選出進行演化之品系係轉植至5加侖瓶中。定期觀察以追蹤任何異常之表型。在絲狀物出現前將地上部套上地上部袋，以預防游離花粉之交叉污染。任何在套袋前產生絲狀物之地上部係經標記，並移除。該第二地上部之後經覆蓋並用於授粉。在資料庫中紀錄下產生異常或無地上部之植物。在授粉前一日剪下絲狀物，以提供均勻刷面接受花粉，植物自行授粉。
用於T1篩選之植物在播種後第7日進行噴灑。這些植物生長於4-英吋瓶中，內含有Metro 360瓶裝土壤，每一層15瓶。種子生長階段為V1-V1.5。發芽情況不良或含有非常小植物(葉序未開展)之瓶係經標記，使其不包含於篩選評估中。整面植物之後置於第二傳送盤中，以進行履帶式噴霧機之噴灑步驟。在Mandel履帶式噴霧機中每次放入兩盤，經校正以傳送體積為187 L/ha至目標區域中，使用8002E平面風扇噴嘴(Tee Jet)。配製35 g ae/ha Assure II(quizalofop)+1% COC(農作物油濃縮液)之溶液，以用於施加。使用15 mls./每次噴灑之體積，以計算所需之總噴灑溶液。計算公式：(35 g ae/ha)x(1 ha/187L)x(1 L/97.7 g ae Assure II)=0.192%溶液或28.74 μl/15 ml H2O+1% v/v)。施加後，植物可於噴灑實驗室中乾燥1小時，之後送回溫室。轉殖至較大瓶後約1-2週，植物經樣本製備以進行生物試驗。每一品系係試驗一株植物。
所有通過分子分析篩選之T0品系，係分析其Cry2Aa蛋白質表現量。來自控制組構築物之品系， pDAB107687，其包含Cry2Aa但不包含TraP，具有明顯較高之Cry2Aa平均表現量(15.0 ng/cm2)，與來自pDAB109807(5.0 ng/cm2)品系，其含有TraP8者相較。儘管pDAB109807品系之表現量較低，這些品系仍會表現Cry2Aa蛋白質。
亦分析T1品系之Cry2Aa蛋白質表現量。來自控制組構築物pDAB107687之品系，其含有Cry2Aa但不包含TraP，具有明顯較高之Cry2Aa平均表現量(55與60 ng/cm2)，與來自pDAB109807(約20至40 ng/cm2)之品系，其含有TraP8相較。儘管pDAB109807品系之表現量較低這些品系仍會表現Cry2Aa蛋白質。
含有單一Bt基因之基因轉殖植物，係於生物試驗中測試其殺蟲劑活性，加入新生鱗翅目幼蟲至基因轉殖植物上。測試之鱗翅種為歐洲玉米螟，玉米螟(棉鈴蟲)(Ostrinia nubilalis(Hübner)(ECB))，以及玉米穗蟲，棉鈴蟲(Helicoverpa zea(CEW))。
32-孔盤(C-D International,Pitman,NJ)係部分填充2%洋菜溶液，待洋菜固化。每一植物取下約1 in2葉子部分，並單獨置於32-孔盤之各孔中。每一孔置入一個葉片，每一植物與每一昆蟲測試二片葉子。昆蟲使用油漆刷大量感染，每孔置入10隻新生幼蟲。各盤以穿孔黏性上蓋密封，可在測試時維持透氣。各盤置於28℃，40% RH，16小時光照：8小時黑暗，三天。測試期間過後，每一葉片進行簡單百分比損傷評分。每一測試損傷評分係經平均，並同時用於蛋白質表現分析，以導入關連性分析。
由T0與T1之生物試驗結果顯示，TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽序列具功能性，而pDAB109807品系則提供保護對抗測試之昆蟲。在T1品系中，表現Cry2Aa蛋白質但無TraP(pDAB107687)之植物，其平均葉片損傷較不明顯，與同時表現Cry2Aa蛋白質與TraP8(pDAB109807)之植物相較，對於所有測試昆蟲。這些結果令人驚訝地顯示出，表現Cry2Aa蛋白質但無TraP(pDAB107687)之植物，會表現出較高量之蛋白質，與同時表現Cry2Aa蛋白質與TraP8(pDAB109807)之植物相較。
VIP3Ab1：
來自蘇雲金芽孢桿菌之Vip3Ab1蛋白質呈現出對抗棉鈴蟲(CEW)與秋黏蟲(FAW)之活性，以及秋黏蟲(rFAW)抗性。vip3Ab1 v6(序列辨識編號：11)與vip3Ab1 v7(序列辨識編號：12)基因係經表現，並測試其於玉米中之昆蟲耐受性。在此試驗中，vip3Ab1v6與vip3Ab1 v7係單獨評估，以及與玉米之TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽結合評估，以測定其昆蟲耐受活性，並評估TraP8 v2嵌合葉綠體輸送胜肽序列，對於玉米中Vip3Ab1 v6與Vip3Ab1 v7蛋白質表現之影響。
含有Trap8 v2嵌合葉綠體輸送胜肽-編碼多核苷酸序列(序列辨識編號：8)，與一GCA密碼子連接子之pDAB111481(圖14)構築物，係選殖至vip3ab1 v6基因之上游，並測試其於玉米植物中對於昆蟲之耐受性。所得之構築物含有二個植物轉錄單元(PTU)。第一PTU含有玉米泛素 1促進子(ZmUbi1 promoter；Christensen,A.,Sharrock R.,and Quail P.,(1992)玉米polyubiquitin gene：structure,thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation,Plant Molecular Biology,18：675-689)、TraP8-vip3ab1 v6融合基因(TraP8-Vip3Ab1v6)，以及玉米過氧酶5之3'非轉譯區域(ZmPer 5 3'UTR)。該構築物經限制酶切割與定序而確認。第二PTU包含甘蔗桿狀病毒促進子(SCBV促進子；美國專利號6,489,462)、含有MSV領導序列之aad-1除草劑耐受性基因，以及酒精脫氫酶1內含子6(AAD-1：美國專利號7,838,733，以及MSV領導序列：Genbank Acc.No.FJ882146.1，以及酒精脫氫酶內含子：Genbank Acc.No.EF539368.1)，以及玉米脂解酶3'非轉譯區域(ZmLip 3'UTR)。控制組質體，pDAB111479，其未包含vip3ab1 v6基因上游之葉綠體輸送胜肽序列，係經建構並包含於研究中(圖15)。該質體導入農桿菌中，以進行植物轉型。
含有Trap8 v2嵌合葉綠體輸送胜肽-編碼多核苷酸序列(序列辨識編號：8)，與一GCA密碼子連接子之pDAB111338(圖16)構築物，係選殖至vip3ab1 v7基因之上游，並測試其於玉米植物中對於昆蟲之耐受性。所得之構築物含有二個植物轉錄單元(PTU)。第一PTU含有玉米泛素1促進子(ZmUbi1 promoter；Christensen,A.,Sharrock R.,and Quail P.,(1992)玉米polyubiquitin gene：structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation,Plant Molecular Biology,18：675-689)、TraP8-Vip3Ab1v7融合基因(TraP8-vip3ab1 v7)，以及玉米過氧酶5之3'非轉譯區域(ZmPer 5 3'UTR)。該構築物經限制酶切割與定序而確認。第二PTU包含甘蔗桿狀病毒促進子(SCBV促進子；美國專利號6,489,462)、含有MSV領導序列之aad-1除草劑耐受性基因，以及酒精脫氫酶1內含子6(AAD-1：美國專利號7,838,733，以及MSV領導序列：Genbank Acc.No.FJ882146.1，以及酒精脫氫酶內含子：Genbank Acc.No.EF539368.1)，以及玉米脂解酶3'非轉譯區域(ZmLip 3'UTR)。控制組質體，pDAB112710，其未包含Vip3Ab1v7基因上游之葉綠體輸送胜肽序列，係經建構並包含於研究中(圖17)。該質體導入農桿菌中，以進行植物轉型。
玉米轉型、蛋白質表現與昆蟲生物試驗係依據前述之流程進行，結果列於表33。昆蟲生物試驗結果指出，TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽序列具功能性，而pDAB111338與pDAB111481品系則提供保護對抗測試之昆蟲。在測試品系中，表現Vip3Ab1蛋白質但無TraP(pDAB112710與pDAB111479)之植物，其平均葉片損傷較不明顯，與同時表現Vip3Ab1蛋白質與TraP8(pDAB111338與pDAB111481)之植物相較。結論為，由西方墨漬生物試驗指出，所有品系皆表現Vip3 Ab1蛋白質。
範例5：嵌合葉綠體輸送胜肽(TraP)序列於植物中之切割
TraP8與TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽之切割位置係經由MALDI質譜分析與N-端Edman降解定序而測定。植物材料得自基因轉殖植物，其含有TraP8-dgt14、TraP8-dgt28、TraP9-dgt14與TraP9-dgt28融合基因，並經試驗以測定在葉綠體中轉移位置時發生之嵌合葉綠體輸送胜肽切割處。
MALDI結果：
來自植物樣本之半純化蛋白質係經SDS-PAGE分離。由凝膠上切下相等於YFP分子量大小之蛋白質帶、退染並乾燥。之後，經乾燥之蛋白質帶進行凝膠中切割作用，使用胰蛋白酶(trypsin)(Promega；Madison,WI)於37℃， 25 mM碳酸氫銨溶液中反應整夜。胜肽經C18 ZipTipTM(Millipore,Bedford,MA)純化，並以50%乙腈/0.1% TFA沖提。樣本與基質α-氰-4-羥基肉桂酸以1：1之比例混合，混合物移至MALD樣本盤上，並空氣乾燥。
胜肽質譜係使用Voyager DE-PRO MALDI-TOF Mass SpectrometerTM(Applied Biosystems；Framingham,MA)產生。使用Calibration Mixture 2TM(Applied Biosystems)進行外部校正。使用胰蛋白酶自動分析尖峰，位置為m/z 842.508、1045.564與2211.108，進行內部校正。所有質譜皆於正離子反射器模式下收集。導入胜肽質譜指紋(PMF)分析，係使用得自Proteometrics LLC之PAWSTM(蛋白質分析工作表)免費軟體進行，以樣本之PMF與目標蛋白質之理論PMF進行比對，以辨識該樣本是否為目標蛋白質。此蛋白質辨識係以資料庫進行，使用MASCOT(MatrixScience,London,UK)與NCBI NR蛋白質資料庫進行。
經由Edman化學降解法進行N-端定序：
N-端定序係於Procise蛋白質定序儀(model 494)，購自Applied Biosystems(Foster City,CA)，上進行。蛋白質樣本首先以SDS-PAGE分離，之後轉印至PVDF薄膜上。由薄膜上切下蛋白質帶，並載入至Procise序列儀。每一樣本進行Edman化學降解循環8次，得N-端五個AA殘基。每一樣本與20 PTH-胺基酸(Applied Biosystems)之標準混合物一同反應。每一次Edman化學降解所得之胺基酸殘基，係以其於C-18管柱中之滯留時間測定，與標準品相較。
MALDI定序結果指出，DGT-28與DGT14蛋白質有被表現出，且加工有TraP嵌合葉綠體輸送胜肽序列。表34列出經加工之序列，其使用N-端Edman降解與MALDI定序法而得。
圖1係圖示說明一mRNA分子，其代表編碼合成之芸苔屬衍生的CTP(舉例而言，針對TraP8與TraP9)，並與一感興趣核苷酸序列操作性連接之核苷酸序列特定範例。在一些實施例中，一mRNA分子(如圖中所示)可由一含有開放讀碼區(open reading frame)之DNA分子轉錄，該DNA分子包括合成芸苔屬衍生的CTP-編碼序列，其與感興趣核苷酸序列操作性連接。在一些實施例中，感興趣之核苷酸序列可為一感興趣胜肽，例如但不侷限於，標記基因產物或可定向至色素體之胜肽，之編碼序列。
圖2係圖示說明pDAB101977之質體圖譜。
圖3係圖示說明pDAB101978之質體圖譜。
圖4係圖示說明pDAB101908之質體圖譜。
圖5包括一顯微鏡圖像，顯示滲入菸葉組織之TraP8-YFP係轉位至菸葉組織之葉綠體。
圖6包括一顯微鏡圖像，顯示滲入菸葉組織之TraP9-YFP係轉位至菸葉組織之葉綠體。
圖7包括一顯微鏡圖像，顯示滲入菸葉組織之非標的性YFP控制組係未併入菸葉組織之葉綠體。
圖8係圖示說明pDAB106597之質體圖譜。
圖9包括TraP8-YFP構築體轉型至玉米原生質體之一顯微鏡圖像，顯示其轉位至玉米原生質體之葉綠體。
圖10係圖示說明pDAB105526之質體圖譜。
圖11係圖示說明pDAB105527之質體圖譜。
圖12係圖示說明pDAB109807之質體圖譜。
圖13係圖示說明pDAB107687之質體圖譜。
圖14係圖示說明pDAB111481之質體圖譜。
圖15係圖示說明pDAB111479之質體圖譜。
圖16係圖示說明pDAB111338之質體圖譜。
圖17係圖示說明pDAB112710之質體圖譜。
圖18包括西洋油菜(序列辨識編號：1)與蕪菁(序列辨識編號：2)之經預測EPSPS蛋白質葉綠體輸送胜肽之比對。星號表示序列進行分割與重組以形成TraP8與Trap9。
圖19係圖示說明pDAB107527之質體圖譜。
圖20係圖示說明pDAB105530之質體圖譜。
圖21係圖示說明pDAB105531之質體圖譜。
圖22係圖示說明pDAB105532之質體圖譜。
圖23係圖示說明pDAB105533之質體圖譜。
圖24係圖示說明pDAB105534之質體圖譜。
圖25係圖示說明pDAB107532之質體圖譜。
圖26係圖示說明pDAB107534之質體圖譜。
圖27係圖示說明pDAB107533之質體圖譜。
圖28係圖示說明pDAB4104之質體圖譜。
圖29係圖示說明pDAB102715之質體圖譜。
圖30係圖示說明pDAB102716之質體圖譜。
圖31係圖示說明pDAB102717之質體圖譜。
圖32係圖示說明pDAB102785之質體圖譜。
圖33係圖示說明pDAB102719之質體圖譜。
圖34係圖示說明pDAB102718之質體圖譜。
圖35係圖示說明pDAB107663之質體圖譜。
圖36係圖示說明pDAB107664之質體圖譜。
圖37係圖示說明pDAB107665之質體圖譜。
圖38係圖示說明pDAB107666之質體圖譜。
圖39係圖示說明pDAB109812之質體圖譜。
圖40係圖示說明pDAB101556之質體圖譜。
圖41係圖示說明pDAB107698之質體圖譜。
圖42係圖示說明pDAB108384之質體圖譜。
圖43係圖示說明pDAB108385之質體圖譜。
圖44係圖示說明pDAB108386之質體圖譜。
圖45係圖示說明pDAB108387之質體圖譜。
<110> 陶氏農業科學公司
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<210> 1
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<212> PRT
<213> 西洋油菜(brassica napus)
<400> 1
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 西洋油菜(brassica napus)
<400> 2
<210> 3
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TraP8嵌合葉綠體輸送胜肽
<400> 3
<210> 4
<211> 65
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TraP9嵌合葉綠體輸送胜肽
<400> 4
<210> 5
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚核苷酸編碼TraP8
<400> 5
<210> 6
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚核苷酸編碼TraP9
<400> 6
<210> 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 7
<210> 8
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚核苷酸編碼TraP8 v2
<400> 8
<210> 9
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚核苷酸編碼TraP9 v2
<400> 9
<210> 10
<211> 1902
<212> DNA
<213> 蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 10
<210> 11
<211> 2364
<212> DNA
<213> 蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 11
<210> 12
<211> 2364
<212> DNA
<213> 蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)
<400> 12
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SVSL序列
<400> 13
<210> 14
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚核苷酸編碼西洋油菜(brassica napus)EPSPS
<400> 14
<210> 15
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 聚核苷酸編碼蕪菁(brassica rapa)EPSPS
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<212> DNA
<213> 鏈黴菌(Streptomyces sviceus)
<400> 16
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<211> 1251
<212> DNA
<213> 蘇氏鏈黴菌(Streptomyces sviceus)
<400> 17
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<212> DNA
<213> 大豆(Glycine max)
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<212> DNA
<213> 西洋油菜(brassica napus)
<400> 19
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<212> DNA
<213> 西洋油菜(brassica napus)
<400> 20
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<211> 1551
<212> DNA
<213> 西洋油菜(brassica napus)
<400> 21
<210> 22
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<212> DNA
<213> 小麥(Triticum aestivum)
<400> 22
<210> 23
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<212> DNA
<213> 玫瑰孢鏈黴菌(Streptomyces roseosporus)
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<211> 1248
<212> DNA
<213> 灰色鏈黴菌(Streptomyces griseus)
<400> 24
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DGT-31 v3核苷酸
<400> 25
<210> 26
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 26
<210> 27
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 27
<210> 28
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 28
<210> 29
<211> 198
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 29
<210> 30
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 30
<210> 31
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 31
<210> 32
<211> 1464
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP4 v2之讀碼區內融合物
<400> 32
<210> 33
<211> 1434
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP5 v2之讀碼區內融合物
<400> 33
<210> 34
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP8 v2之讀碼區內融合物
<400> 34
<210> 35
<211> 1446
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP9 v2之讀碼區內融合物
<400> 35
<210> 36
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP12 v2之讀碼區內融合物
<400> 36
<210> 37
<211> 1455
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dgt-28 v5與TraP13 v2之讀碼區內融合物
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<213> 人工序列
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<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 38
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<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 39
<210> 40
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 葉綠體輸送胜肽
<400> 40
<210> 41
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dqt-32 v3與TraP14 v2之讀碼區內融合物
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<213> 人工序列
<220>
<223> DGT-31與TRAP23之構築物
<400> 43
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 44
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 45
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探針序列
<400> 46
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 47
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 48
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探針序列
<400> 49
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 50
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 51
<210> 52
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 52
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 53
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 54
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 55
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 56
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 57
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 58
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探針序列
<400> 59
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 60
<210> 61
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探針序列
<400> 61
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 62
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 63
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 64
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸探針序列
<400> 65
<210> 66
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 寡核苷酸引子序列
<400> 66

Claims (76)

  1. 一種經分離之核酸分子，包含有：一合成之芸苔屬衍生的核苷酸序列，其編碼包含一第一芸苔屬葉綠體輸送胜肽之一連續胺基酸序列之胜肽，該胜肽更包含一第二葉綠體輸送胜肽之一連續胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其更包含一與該合成之芸苔屬衍生的核苷酸序列操作性地連接之感興趣核苷酸序列。
  3. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該第一芸苔屬葉綠體輸送胜肽係源自西洋油菜(Brassica napus)或蕪菁(Brassica rapa)。
  4. 如申請專利範圍第3項之經分離之核酸分子，其中該第二葉綠體輸送胜肽係源自該第一芸苔屬葉綠體輸送胜肽以外之芸苔屬(Brassica sp.)。
  5. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該第一芸苔屬葉綠體輸送胜肽係源自3-烯醇丙酮基莽草酸-5-磷酸鹽合成酶(3-enolpyruvylshikimate-5-phosphate synthetase)基因。
  6. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該第二葉綠體輸送胜肽係源自3-烯醇丙酮基莽草酸-5-磷酸鹽合成酶基因。
  7. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該胜肽 係至少80%等同於選自於由序列辨識編號：3與4所組成族群之一葉綠體輸送胜肽。
  8. 如申請專利範圍第7項之經分離之核酸分子，其中該胜肽係至少85%等同於選自於由序列辨識編號：3與4所組成族群之一葉綠體輸送胜肽。
  9. 如申請專利範圍第8項之經分離之核酸分子，其中該胜肽係至少90%等同於選自於由序列辨識編號：3與4所組成族群之一葉綠體輸送胜肽。
  10. 如申請專利範圍第9項之經分離之核酸分子，其中該胜肽係至少95%等同於選自於由序列辨識編號：3與4所組成族群之一葉綠體輸送胜肽。
  11. 如申請專利範圍第10項之經分離之核酸分子，其中該胜肽係至少98%等同於選自於由序列辨識編號：3與4所組成族群之一葉綠體輸送胜肽。
  12. 如申請專利範圍第11項之經分離之核酸分子，其中該胜肽係選自於由序列辨識編號：3與4所組成之族群。
  13. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中該感興趣之核苷酸編碼序列並未編碼胜肽序列辨識編號：1或序列辨識編號：2。
  14. 如申請專利範圍第1項之經分離之核酸分子，其中編碼該胜肽之核苷酸序列係可特異性地雜交至一選自於由序列辨識編號：5、6、8與9所組成之族群之核苷酸序列。
  15. 如申請專利範圍第2項之經分離之核酸分子，其更包含至少一額外的核苷酸序列，每一者皆編碼一葉綠體輸送胜 肽，其中該額外的核苷酸序列係可操作性地連接至該感興趣之核苷酸序列上。
  16. 如申請專利範圍第15項之經分離之核酸分子，其中該至少一額外的核苷酸序列係源自選自於由原核生物、低等光合真核生物與綠藻所組成族群之一生物體。
  17. 如申請專利範圍第2項之經分離之核酸分子，其中該合成之芸苔屬衍生的核苷酸序列與該感興趣之核苷酸序列，係可操作性地連接至一或更多調控序列上。
  18. 如申請專利範圍第2項之經分離之核酸分子，其中該核酸分子編碼一嵌合多胜肽，其包含一由感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽，以及一由合成之芸苔屬衍生的核苷酸序列所編碼之胜肽。
  19. 一種由申請專利範圍第18項之核酸分子所編碼之嵌合多胜肽。
  20. 如申請專利範圍第19項之嵌合多胜肽，其中該由感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽，係定向(target)至一含色素體細胞之色素體上。
  21. 如申請專利範圍第20項之嵌合多胜肽，其中該多胜肽包含一葉綠體輸送胜肽，其於該感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽定向至色素體時被移除。
  22. 如申請專利範圍第19項之嵌合多胜肽，其中該感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽為一生物活性胜肽。
  23. 如申請專利範圍第19項之嵌合多胜肽，其中該感興趣之核苷酸序列胜肽所編碼之胜肽為一螢光胜肽。
  24. 如申請專利範圍第22項之嵌合多胜肽，其中該生物活性胜肽為一酵素。
  25. 如申請專利範圍第22項之嵌合多胜肽，其中該生物活性胜肽係正常表現於一細胞之色素體中，於該細胞之色素體中該胜肽係原生地表現。
  26. 如申請專利範圍第22項之嵌合多胜肽，其中該生物活性胜肽係參與一選自於由以下所組成之族群之過程：除草劑抗性、病毒抗性、細菌病原體抗性、蟲抗性、線蟲抗性、真菌抗性、植物生命力、植物產量、溫度耐受性、土壤條件耐受性、低光度耐受性、低水位耐受性、高水位耐受性、化學環境耐受性、種子顏色、澱粉修飾、胺基酸合成、光合作用、脂肪酸合成、油合成、類胡蘿蔔素(carotenoids)合成、類萜(terpenoids)合成、澱粉合成與除草劑抗性。
  27. 如申請專利範圍第22項之嵌合多胜肽，其中該生物活性胜肽係選自於由玉米黃質環氧酶(zeaxanthin epoxidase)、膽鹼單氧酶(choline monooxygenase)、亞鐵螯合酶(ferrochelatase)、ω-3脂肪酸去飽和酶、麩醯胺酸合成酶(glutamine synthetase)、原維生素A、激素、Bt毒素蛋白質，與用於識別含有感興趣性狀之植物之標記物所組成之族群。
  28. 如申請專利範圍第26項之嵌合多胜肽，其中該生物活性胜肽係參與抗除草劑性。
  29. 如申請專利範圍第24項之嵌合多胜肽，其中該生物活性 胜肽係選自於由乙醯乳酸合成酶(acetolactase synthase；ALS)、經突變之ALS、ALS之前驅物、3-烯醇丙酮基莽草酸-5-磷酸鹽合成酶(EPSPS)、CP4 EPSPS、第III類EPSPS與第IV類EPSPS所組成之族群。
  30. 一種植物表現載體，包含有如申請專利範圍第2項之核酸分子。
  31. 一種植物材料，包含有如申請專利範圍第2項之核酸分子。
  32. 如申請專利範圍第31項之植物材料，其中該植物材料係選自於由一植物細胞、一植物組織、一植物組織培養物、一癒合組織培養物、一植物部位，以及一整體植物所組成之族群。
  33. 如申請專利範圍第31項之植物材料，其更包含一含有該胜肽之多胜肽。
  34. 如申請專利範圍第33項之植物材料，其中感興趣之核苷酸序列係編碼該多胜肽之一部份，其定向至該植物材料細胞之色素體。
  35. 如申請專利範圍第31項之植物材料，其中該核酸分子係穩定融入該植物材料細胞之基因體。
  36. 如申請專利範圍第31項之植物材料，其中該植物材料為一整體植物。
  37. 如申請專利範圍第31項之植物材料，其中該植物材料為一植物細胞，該植物細胞無法再生以產生一植物。
  38. 如申請專利範圍第31項之植物材料，其中該植物材料係 源自一選自於由以下所組成之族群之植物：阿拉伯芥屬(Arabidopsis)、苜蓿、芸苔屬、豆類、青花菜、高麗菜、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、大白菜、棉花、黃瓜、茄子、萵苣、甜瓜、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、南瓜(pumpkin)、蘿蔔、油菜、菠菜、大豆、南瓜(squash)、甜菜、向日葵、煙草、蕃茄、西瓜、玉米、洋蔥、稻米、高樑、小麥、黑麥、小米、甘蔗、燕麥、黑小麥、柳枝稷草(switchgrass)與草坪草(turfgrass)。
  39. 一種製造一基因轉殖植物材料之方法，該方法包含有：獲得如申請專利範圍第2項之經分離之核酸分子；以及轉型該核酸分子至一植物材料中。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該植物材料係選自於由一植物細胞、一植物組織、一植物組織培養物、一癒合組織培養物、一植物部位，以及一整體植物所組成之族群。
  41. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該植物材料並非一整體植物。
  42. 一種基因轉殖植物材料，係以如申請專利範圍第39項之方法產生。
  43. 如申請專利範圍第42項之基因轉殖植物材料，其中該植物材料為一植物細胞，且該植物細胞無法再生而產生一植物。
  44. 一種基因轉殖植物，其經由如申請專利範圍第42項之基因轉殖植物材料再生而成。
  45. 一種基因轉殖植物商品，其由如申請專利範圍第42項之植物材料製成。
  46. 如申請專利範圍第42項之基因轉殖植物材料，其中該感興趣之核苷酸序列係編碼一生物活性胜肽。
  47. 如申請專利範圍第46項之基因轉殖植物材料，其中該生物活性胜肽係參與一選自於由以下所組成之族群之過程：除草劑抗性、病毒抗性、細菌病原體抗性、蟲抗性、線蟲抗性、真菌抗性、植物生命力、植物產量、溫度耐受性、土壤條件耐受性、低光度耐受性、低水位耐受性、高水位耐受性、化學環境耐受性、種子顏色、澱粉修飾、胺基酸合成、光合作用、脂肪酸合成、油合成、類胡蘿蔔素合成、類萜合成、澱粉合成與除草劑抗性。
  48. 如申請專利範圍第46項之基因轉殖植物材料，其中該生物活性胜肽係選自於由玉米黃質環氧酶、膽鹼單氧酶、亞鐵螯合酶、ω-3脂肪酸去飽和酶、麩醯胺酸合成酶、原維生素A、激素、Bt毒素蛋白質，以及用於識別含有該感興趣性狀之植物之標記物所組成之族群。
  49. 如申請專利範圍第47項之基因轉殖植物材料，其中該生物活性胜肽係參與除草劑抗性。
  50. 如申請專利範圍第46項之基因轉殖植物材料，其中該生物活性胜肽係選自於由乙醯乳酸合成酶(ALS)、經突變之ALS、ALS之前驅物、3-烯醇丙酮基莽草酸-5-磷酸鹽合成酶(EPSPS)、CP4 EPSPS與一第III類EPSPS所組成之族群。
  51. 如申請專利範圍第49項之基因轉殖植物材料，其中該植物材料相較於相同品種之一野生型植物材料時，呈現出增加之除草劑抗性或除草劑耐受性。
  52. 一種經分離之核酸分子，包含有一芸苔屬衍生工具，以定向一多胜肽至一葉綠體上。
  53. 如申請專利範圍第52項之經分離之核酸分子，其更包含有一感興趣之核苷酸序列，其可操作性地連接至該芸苔屬衍生工具，以定向一多胜肽至一葉綠體。
  54. 如申請專利範圍第53項之經分離之核酸分子，其中該核酸分子係編碼一嵌合多胜肽，其含有該感興趣之核苷酸序列所編碼之一胜肽。
  55. 一種嵌合多胜肽，由如申請專利範圍第54項之核酸分子所編碼。
  56. 如申請專利範圍第55項之嵌合多胜肽，其中該感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽，係定向至一含色素體細胞之色素體上。
  57. 如申請專利範圍第56項之嵌合多胜肽，其中該多胜肽包含一葉綠體輸送胜肽，其於該感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽定向至色素體時被移除。
  58. 如申請專利範圍第55項之嵌合多胜肽，其中該感興趣之核苷酸序列所編碼之胜肽為一生物活性胜肽。
  59. 如申請專利範圍第58項之多胜肽，其中該生物活性胜肽係參與一選自於由以下所組成之族群之過程：除草劑抗性、病毒抗性、細菌病原體抗性、蟲抗性、線蟲抗性、 真菌抗性、植物生命力、植物產量、溫度耐受性、土壤條件耐受性、低光度耐受性、低水位耐受性、高水位耐受性、化學環境耐受性、種子顏色、澱粉修飾、胺基酸合成、光合作用、脂肪酸合成、油合成、類胡蘿蔔素合成、類萜合成、澱粉合成與除草劑抗性。
  60. 如申請專利範圍第58項之多胜肽，其中該生物活性胜肽係選自於由玉米黃質環氧酶、膽鹼單氧酶、亞鐵螯合酶、ω-3脂肪酸去飽和酶、麩醯胺酸合成酶、原維生素A、激素、Bt毒素蛋白質，以及用於識別含有感興趣性狀之植物之標記物所組成之族群。
  61. 如申請專利範圍第58項之多胜肽，其中該生物活性胜肽係選自於由乙醯乳酸合成酶(ALS)、經突變之ALS、ALS之前驅物、3-烯醇丙酮基莽草酸-5-磷酸鹽合成酶(EPSPS)、CP4 EPSPS，以及一第III類EPSPS所組成之族群。
  62. 一種植物表現載體，包含有如申請專利範圍第53項之核酸分子。
  63. 一種植物材料，包含有如申請專利範圍第53項之核酸分子。
  64. 如申請專利範圍第63項之植物材料，其中該核酸分子係穩定融入該植物材料細胞之基因體。
  65. 如申請專利範圍第63項之植物材料，其中該植物材料一整體植物。
  66. 如申請專利範圍第63項之植物材料，其中該植物材料為 一植物細胞，且該植物細胞無法再生以產生一植物。
  67. 如申請專利範圍第63項之植物材料，其中該植物材料係源自一植物選自於由阿拉伯芥屬、苜蓿、芸苔屬、豆類、青花菜、高麗菜、胡蘿蔔、花椰菜、芹菜、大白菜、棉花、黃瓜、茄子、萵苣、甜瓜、豌豆、胡椒、花生、馬鈴薯、南瓜(pumpkin)、蘿蔔、油菜、菠菜、大豆、南瓜(squash)、甜菜、向日葵、煙草、蕃茄、西瓜、玉米、洋蔥、稻米、高樑、小麥、黑麥、小米、甘蔗、燕麥、黑小麥、柳枝稷草，以及草坪草所組成之族群。
  68. 一種製造一基因轉殖植物材料之方法，該方法包含有：獲得如申請專利範圍第53項之經分離之核酸分子；以及轉型該核酸分子至一植物材料中。
  69. 如申請專利範圍第68項之方法，其中該植物材料係選自於由一植物細胞、一植物組織、一植物組織培養物、一癒合組織培養物、一植物部位，與一整體植物所組成之族群。
  70. 如申請專利範圍第68項之方法，其中該植物材料並非一整體植物。
  71. 一種基因轉殖植物材料，係如申請專利範圍第68項之方法所產生。
  72. 一種基因轉殖植物，其經由申請專利範圍第68項之基因轉殖植物材料再生而成。
  73. 如申請專利範圍第71項之植物材料，其中該基因轉殖植 物材料為一整體植物。
  74. 如申請專利範圍第71項之植物材料，其中該基因轉殖植物材料為一植物細胞，且該植物細胞無法再生以產生一植物。
  75. 一種基因轉殖植物商品，其由申請專利範圍第71項之基因轉殖植物材料製成。
  76. 如申請專利範圍第71項之基因轉殖植物材料，其中感興趣之核苷酸序列係編碼一生物活性胜肽。
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