BR112014019043B1 - Polipeptídeos quiméricos de trânsito de cloroplasto, moléculas de ácido nucleico isoladas, vetores de expressão vegetal, e métodos para a produção de material vegetal transgênico - Google Patents

Polipeptídeos quiméricos de trânsito de cloroplasto, moléculas de ácido nucleico isoladas, vetores de expressão vegetal, e métodos para a produção de material vegetal transgênico Download PDF

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Robert M. Cicchillo
Andrew E. Robinson
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Abstract

POLIPEPTÍDEOS QUIMÉRICOS DE TRÂNSITO DE CLOROPLASTO, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO, VETORES DE EXPRESSÃO, MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE MATERIAL VEGETAL TRANSGÊNICO E USO DO MESMO. Esta divulgação refere-se a composições e métodos para o direcionamento de peptídeos, polipeptídeos e proteínas para os plastídeos de células que contêm plastídeos. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a peptídeos de trânsito de cloroplasto que podem direcionar um polipeptídeo para um plastídeo e moléculas de ácidos nucleicos que codificam os mesmos. Em algumas modalidades, a divulgação refere-se a métodos para a produção de um material vegetal transgênico por exemplo, uma planta transgênica) que compreende um peptídeo de trânsito de cloroplasto, bem como materiais vegetais produzidos por tais métodos e produtos de consumo vegetais produzidos partindo dos mesmos.

Description

Reivindicação Prioritária
[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente U.S. Provisório N°. de Série 61/593,555 depositado em 1o de fevereiro de 2012 e também ao Pedido de Patente U.S. Provisório N°. de Série 61/625,222, depositado em 1o de abril de 2012.DECLARAÇÃO DE ACORDO COM 37 C.F.R. § 1.821(c) ou (e) -LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA NA FORMA DE ARQUIVO DE TEXTO ACSII
[002] De acordo com 37 C.F.R. § 1.821(c) ou (e), um arquivo contendo uma versão de texto de ASCII da Listagem de Sequências foi submetido concomitante com este pedido de patente.
Campo Técnico
[003] Esta divulgação refere-se a composições e métodos para codificar geneticamente e expressar polipeptídeos que são direcionados para os plastídeos de células que contêm plastídeo. Em certas modalidades, a divulgação refere-se a sequências de aminoácidos que direcionam polipeptídeos para cloroplastos (por exemplo, de plantas superiores) e/ou moléculas de ácidos nucleicos que codificam os mesmos. Em certas modalidades, a divulgação refere-se a polipeptídeos quiméricos que compreendem uma sequência de aminoácidos que controla o trânsito dos polipeptídeos quiméricos para os plastídeos e/ou moléculas de ácidos nucleicos que codificam os mesmos.
Antecedentes
[004] As células vegetais contêm organelas subcelulares distintas, referidas de forma geral como "plastídeos", que são delimitados por sistemas de membrana característicos e realizam funções especializadas dentro da célula. Os plastídeos particulares são responsáveis pela fotossíntese, bem como pela síntese e pelo armazenamento de certos compostos químicos. Todos os plastídeos são derivados de proplastídeos que estão presentes nas regiões meristemáticas da planta. Os proplastídeos podem se desenvolver em, por exemplo: cloroplastos, etioplastos, cromoplastos, gerontoplastos, leucoplastos, amiloplastos, elaioplastos e proteinoplastos. Os plastídeos existem de uma maneira semiautônoma dentro da célula, contendo seu próprio sistema genético e maquinário de síntese de proteínas, mas contando com uma cooperação íntima com o sistema núcleo-citoplásmico em seu desenvolvimento e atividades biossintéticas.
[005] Nas células foliares fotossintéticas de plantas superiores, os plastídeos mais notáveis são os cloroplastos. A função mais essencial dos cloroplastos é o desempenho das reações controladas pela luz da fotossíntese. Entretanto, os cloroplastos também podem realizar muitos outros processos biossintéticos de importância para a célula vegetal. Por exemplo, todos os ácidos graxos da célula são produzidos por enzimas localizadas no estroma do cloroplasto, utilizando o ATP, NAOPH e carboidratos facilmente disponíveis ali. Além disso, o poder de redução de elétrons ativados pela luz controla a redução de nitrito (NO2-) em amônia (NH3) no cloroplasto; esta amônia fornece à planta nitrogênio necessário para a síntese de aminoácidos e nucleotídeos.
[006] O cloroplasto também faz parte de processos de importância particular na indústria agroquímica. Por exemplo, é sabido que muitos herbicidas atuam através do bloqueio das funções que são realizadas dentro do cloroplasto. Estudos recentes identificaram o alvo específico de vários herbicidas. Por exemplo, herbicidas derivados de triazina inibem a fotossíntese através do deslocamento de uma molécula de plastoquinona de seu sítio de ligação no polipeptídeo de 32 kD do fotossitema II. Este polipeptídeo de 32 kD é codificado no genoma do cloroplasto e sintetizado pelo maquinário da organela. Foram obtidas plantas mutantes que são resistentes a herbicidas de triazina. Estas plantas contêm um polipeptídeo de 32 kD mutante do qual a plastoquinona não pode mais ser deslocada pelos herbicidas de triazina. As sulfoniluréias inibem a acetolactato sintase no cloroplasto. A acetolactato sintase está envolvida na síntese de isoleucina e valina. O glifosato inibe a função de 5-enol piruvil-3-fosfoshikimato sintase (EPSPS), que é uma enzima envolvida na síntese de aminoácidos aromáticos. Todas estas enzimas são codificadas pelo genoma nuclear, mas estas são translocadas para dentro do cloroplasto onde a síntese de aminoácidos real ocorre.
[007] A maioria das proteínas do cloroplasto é codificada no núcleo da célula vegetal, sintetizadas na forma de proteínas precursoras maiores no citosol importadas de forma pós-tradução para dentro do cloroplasto. A importação através das membranas do envelope externas e internas para dentro do estroma é o meio principal para a entrada de proteínas destinadas para o estroma, a membrana tilacoide e o lúmen tilacoide. A localização de proteínas precursoras importadas na membrana tilacoide e no lúmen tilacoide é realizada através de quatro mecanismos distintos, incluindo dois que são homólogos aos sistemas de transporte de proteínas bacterianas. Assim, os mecanismos para localização de proteínas no cloroplasto são, em parte, derivados do endossimbionte procariótico. Cline e Henry (1996), Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26.
[008] As proteínas precursoras destinadas para a expressão no cloroplasto contêm extensões N-terminais conhecidas como peptídeos de trânsito para o cloroplasto (CTPs). O peptídeo de trânsito é colaborador para o reconhecimento específico da superfície do cloroplasto e na mediação da translocação pós-tradução de pré- proteínas através do envelope do cloroplasto e, dali, para os vários compartimentos dentro do cloroplasto (por exemplo, estroma, tilacoide e membrana tilacoide). Estas sequências de peptídeos de trânsito N-terminais contêm toda a informação necessária para a importação da proteína do cloroplasto para dentro de plastídeos; as sequências dos peptídeos de trânsito são necessárias e suficientes para a importação para o plastídeo.
[009] Os genes de plantas relatados como possuindo sequências de peptídeos de trânsito codificadas naturalmente em seu N-terminal incluem a subunidade pequena do cloroplasto de ribulose-1,5-bisfosfato caroxilase (RuBisCo) (de Castro Silva-Filho e outros (1996), Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schnell e outros (1991), J. Biol. Chem. 266:3335-42); EPSPS (see, por exemplo, Archer e outros (1990), J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810 e Patentes U.S. 6.867.293, 7.045.684 e Re. 36.449); triptofano sintase (Zhao e outros (1995), J. Biol. Chem. 270:6081-7); plastocianina (Lawrence e outros (1997), J. Biol. Chem. 272:20357-63); corismato sintase (Schmidt e outros (1993), J. Biol. Chem. 268:27447-57); a proteína de ligação à clorofila a/b de captura da luz (LHBP) (Lamppa e outros (1988), J. Biol. Chem. 263:14996-14999); e proteína do cloroplasto de Arabidopsis thaliana (Lee e outros (2008), Plant Cell 20:1603-22). A Publicação de Patente dos Estados Unidos da América N°. US 2010/0071090 fornece certos peptídeos que se direcionam ao protoplasto de Chlamydomonas sp.
[0010] Entretanto, as exigências estruturais para a informação codificada pelos peptídeos que se direcionam ao protoplasto permanecem evasivas, devido a seu alto nível de diversidade de sequência e falta de motivos de sequência comuns ou consensos, embora seja possível que haja subgrupos distintos de peptídeos que se direcionam ao protoplasto com motivos estruturais independentes. Lee e outros (2008), supra. Ainda, nem todas estas sequências foram úteis na expressão heteróloga de proteínas direcionadas para cloroplasto em plantas superiores.
Divulgação da Invenção
[0011] São descritos aqui composições e métodos para o direcionamento para o plastídeo de polipeptídeos em uma planta. Em algumas modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético (por exemplo, um peptídeo TraP12 e um peptídeo TraP13) ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em modalidades particulares, tais moléculas de ácidos nucleicos podem ser úteis para a expressão e para o direcionamento de um polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse em uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea. São adicionalmente descritos vetores que compreendem uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse.
[0012] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeos que é derivada de uma sequência de nucleotídeos de referência obtida de um gene de Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea e B. carinata) ou uma variante funcional do mesmo. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeos quimérica que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica CTP parcial partindo de um gene de Brassica sp. ou uma variante funcional do mesmo. Em modalidades específicas, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode conter sequências de nucleotídeos contíguas obtidas partindo de cada um de um CTP de Brassica sp. de referência e um CTP partindo de um gene diferente da Brassica sp., uma Brassica sp. diferente ou um organismo diferente (por exemplo, uma planta, um procarioto e um eucarioto fotossintético inferior) ou variantes funcionais de qualquer um dos anteriores. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotídeos contígua pode ser obtida partindo de uma sequência de nucleotídeos ortóloga do CTP de Brassica de referência que é obtido partindo de um ortólogo de organismo diferente do gene de Brassica sp. de referência (por exemplo, um genoma de Brassica sp. diferente). Nestas e em modalidades adicionais, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeos quimérica que compreende mais de uma sequência de nucleotídeos que codifica CTP.
[0013] Em alguns exemplos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode ser uma sequência de nucleotídeos quimérica que compreende uma sequência de nucleotídeos de CTP parcial de B. napus ou variantes funcionais da mesma. Em exemplos específicos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode conter sequências de nucleotídeos contíguas obtidas de B. napus ou variantes funcionais das mesmas. Ainda em exemplos adicionais, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode conter uma sequência de nucleotídeos contígua obtida partindo de um gene de Brassica sp. ou variante funcional do mesmo e uma sequência de nucleotídeos contígua obtida partindo de um gene de Arabidopsis sp. ou variante funcional do mesmo.
[0014] Em algumas modalidades, uma composição compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um meio derivado de Brassica para o direcionamento de um polipeptídeo para um cloroplasto. São adicionalmente descritas moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos um meio derivado de Brassica para o direcionamento de um polipeptídeo para um cloroplasto ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em modalidades particulares, tais moléculas de ácidos nucleicos podem ser úteis para a expressão e para o direcionamento de um polipeptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse em uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Para as finalidades da presente divulgação, um meio derivado de Brassica para o direcionamento de um polipeptídeo para um cloroplasto refere-se a sequências de nucleotídeos sintéticas particulares. Em modalidades particulares, um meio derivado de Brassica para o direcionamento de um polipeptídeo para um cloroplasto é selecionado do grupo que consiste nas sequências de nucleotídeos referidas aqui como TraP12 e TraP13.
[0015] Também são descritos aqui materiais vegetais (por exemplo, e sem limitação, plantas, tecidos vegetais e células vegetais) que compreendem uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em algumas modalidades, um material vegetal pode ter tal uma molécula de ácido nucleico integrada de forma estável em seu genoma. Em algumas modalidades, um material vegetal pode expressar de forma transitória um produto de uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse.
[0016] São também descritos métodos para a expressão de uma sequência de nucleotídeos em uma célula que contém plastídeo (por exemplo, uma planta) em um plastídeo (por exemplo, um cloroplasto) da célula que contém plastídeo. Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser utilizada para transformar uma célula vegetal, de forma que um polipeptídeo de fusão precursor que compreende o CTP derivado de Brassica sintético fundido a um produto da expressão da sequência de nucleotídeos de interesse seja produzido no citoplasma da célula vegetal e o polipeptídeo de fusão é então transportado in vivo para dentro de um cloroplasto da célula vegetal.
[0017] São adicionalmente descritos métodos para a produção de uma planta transgênica que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Também são descritos produtos consumíveis vegetais (por exemplo, sementes) obtidos partindo de tais plantas transgênicas.As características anteriores e outras se tornarão mais evidentes partindo da descrição detalhada a seguir de várias modalidades, que prossegue com referência às figuras em anexo.
Breve Descrição das Figuras
[0018] A Figura 1 ilustra moléculas de mRNA que são representativas de exemplos particulares de uma sequência de nucleotídeos que codifica CTP derivado de Brassica sintético (por exemplo, TraP12 e TraP13) ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em algumas modalidades, uma molécula de mRNA (tal como aquelas mostradas) pode ser transcrita partindo de uma molécula de DNA que compreende um quadro aberto de leitura que inclui a sequência que codifica CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional à sequência de nucleotídeos de interesse. A sequência de nucleotídeos de interesse pode ser, em algumas modalidades, uma sequência que codifica um peptídeo de interesse, por exemplo, e sem limitação, um produto de gene marcador ou um peptídeo que será direcionado para um plastídeo.
[0019] A Figura 2 inclui um alinhamento dos peptídeos de trânsito para o cloroplasto previstos para a proteína EPSPS de Brassica napus (SEQ ID NO: 2) e Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 4). O asterisco indica onde as sequências foram divididas e recombinadas para formar TraP12 e Trap13.
[0020] A Figura 3 ilustra um mapa do plasmídeo pDAB101981.
[0021] A Figura 4 ilustra um mapa do plasmídeo pDAB101989.
[0022] A Figura 5 ilustra um mapa do plasmídeo pDAB101908.
[0023] A Figura 6 inclui uma imagem de microscopia de TraP12-YFP infiltrado dentro do tecido foliar do tabaco que foi translocado para dentro dos cloroplastos do tecido foliar do tabaco.
[0024] A Figura 7 inclui uma imagem de microscopia de TraP13-YFP infiltrado dentro do tecido foliar do tabaco que foi translocado para dentro dos cloroplastos do tecido foliar do tabaco.
[0025] A Figura 8 inclui uma imagem de microscopia de controles de YFP não direcionados que foram infiltrados dentro do tecido foliar do tabaco que não foram incorporados dentro dos cloroplastos do tecido foliar do tabaco.
[0026] A Figura 9 inclui uma imagem de microscopia de TraP12-YFP transformado dentro de protoplastos do milho que foi translocado para dentro dos cloroplastos do protoplasto do milho.
[0027] A Figura 10 ilustra um mapa do plasmídeo pDAB105528.
[0028] A Figura 11 ilustra um mapa do plasmídeo pDAB105529.
[0029] A Figura 12 ilustra um mapa plasmideal de pDAB107686.
[0030] A Figura 13 ilustra um mapa plasmideal de pDAB107687.
[0031] A Figura 14 ilustra um mapa plasmideal de pDAB112711.
[0032] A Figura 15 ilustra um mapa plasmideal de pDAB11479.
[0033] A Figura 16 ilustra um mapa plasmideal de pDAB112712.
[0034] A Figura 17 ilustra um mapa plasmideal de pDAB112710.
[0035] A Figura 18 ilustra um mapa plasmideal de pDAB017540. A Figura 19 ilustra um mapa plasmideal de pDAB107617.
Modo(s) para a Realização da Invenção Visão Geral de Várias Modalidades
[0036] Um peptídeo de trânsito para o cloroplasto (CTP) (ou peptídeo de trânsito para o plastídeo) funciona de forma cotradução ou de forma pós-tradução para direcionar um polipeptídeo que compreende o CTP para um plastídeo (por exemplo, um cloroplasto). Em algumas modalidades da invenção, proteínas de cloroplasto endógenas ou proteínas heterólogas podem ser direcionadas para um cloroplasto através da expressão de tal proteína na forma de um polipeptídeo precursor maior que compreende um CTP. Em modalidades particulares, o CTP pode ser derivado de uma sequência de nucleotídeos obtida partindo de um gene de Brassica sp., por exemplo, e sem limitação, através da incorporação de pelo menos uma sequência contígua proveniente de um gene ortólogo obtido de organismo diferente ou uma variante funcional do mesmo.
[0037] Em um exemplo de modalidade, sequências de ácidos nucleicos, cada uma codificando um CTP, foram isoladas partindo das sequências do gene EPSPS obtido de Brassica napus (No. de Acesso do Banco de Dados NCBI P17688). As sequências de ácidos nucleicos que codificam CTP foram isoladas através da análise da sequência do gene EPSPS com o servidor de previsão ChloroP. Emanuelsson e outros (1999), Protein Science 8:978-84 (disponível em cbs.dtu.dk/services/ChloroP). Os produtos protéicos previstos das sequências que codificam CTP isoladas são peptídeos de trânsito de aproximadamente 60-70 aminoácidos de comprimento. As sequências de ácidos nucleicos que codificam CTP foram isoladas partindo de genes EPSPS ortólogos obtidos de Arabidopsis thaliana (No. de Acesso do NCBI NP_182055). Neste exemplo, o CTP nativo de B. napus foi utilizado como uma sequência de referência para planejar exemplos de CTPs derivados de Brassica sintéticos através da fusão das sequências contíguas provenientes de um CTP de Arabidopsis em uma posição particular no CTP de B. napus. Este processo de planejamento ilustra o desenvolvimento de um novo CTP sintético, de acordo com alguns aspectos, partindo de uma sequência de ácido nucleico de Brassica e Arabidopsis sp.. Estes exemplos de CTPs derivados de Brassica sintéticos são referidos ao longo de toda esta divulgação como TraPs12 e 13. Estes exemplos de TraPs sintéticos foram testados em relação à função de direcionamento para o plastídeo e foi observado que exibem direcionamento para o plastídeo que era pelo menos tão favorável quanto o observado para as sequências de Brassica nativas individualmente.
[0038] Em um exemplo de modalidade adicional, as sequências de ácidos nucleicos, cada uma codificando um peptídeo TraP sintético da invenção, foram sintetizadas independentemente e ligadas de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína fluorescente amarela (YFP) para produzir moléculas de ácidos nucleicos sintéticas, cada uma codificando um polipeptídeo de fusão TraP:YFP quimérico. Tais moléculas de ácidos nucleicos, cada uma codificando um polipeptídeo TraP:YFP quimérico, foram cada uma introduzidas dentro de um vetor binário, de forma que cada sequência de ácido nucleico que codifica TraP:YFP fosse ligada de forma operacional a um promotor AtUbi 10.
[0039] Ainda em um exemplo de modalidade adicional, os vetores binários que compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica TraP:YFP ligada de forma operacional a um promotor AtUbi 10 foram cada um independentemente, transitoriamente transformados no tabaco (Nicotiana benthamiana) via transformação mediada por Agrobacterium. Análises de microscopia confocal e Western blot confirmaram que cada TraP direcionava de forma bem-sucedida a YFP para os cloroplastos do tabaco.
[0040] Em um exemplo de modalidade adicional, as sequências de ácidos nucleicos, cada uma codificando um peptídeo TraP sintético da invenção, foram sintetizadas independentemente e ligadas de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de gene importante agronomicamente. As sequências de TraP foram fundidas a características tolerantes a herbicida (por exemplo, dgt-28 e dgt-14) para produzir moléculas de ácidos nucleicos sintéticas, cada uma codificando um polipeptídeo de fusão TraP:DGT-28 ou TraP:DGT-14 quimérico. Tais moléculas de ácidos nucleicos, cada uma codificando um polipeptídeo TraP:DGT-28 ou TraP:DGT-14 quimérico, foram cada uma introduzidas dentro de um vetor binário, de forma que cada sequência de ácido nucleico que codifica TraP:dgt-28 ou TraP:dgt-14 fosse ligada de forma operacional a um promotor e outros elementos reguladores do gene. O vetor binário que contém a sequência de ácido nucleico que codifica TraP:dgt-28 ou TraP:dgt-14 foi utilizado para transformar várias espécies de plantas. As plantas transgênicas foram analisadas em relação à tolerância a herbicida como um resultado da expressão e da translocação das enzimas DGT-28 ou DGT-14 para o cloroplasto.
[0041] Em um exemplo de modalidade adicional, as sequências de ácidos nucleicos, cada uma codificando um peptídeo TraP sintético da invenção, foram sintetizadas independentemente e ligadas de forma operacional a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de gene importante agronomicamente. As sequências de TraP foram fundidas a características de tolerância a insetos (por exemplo, cry2Aa, vip3ab1, cry1F, cry1Ac e cry1Ca) para produzir moléculas de ácidos nucleicos sintéticas, cada uma codificando um polipeptídeo de fusão TraP:Cry2Aa, TraP:Vip3Ab1, TraP:Cry1F, TraP:Cry1Ac ou TraP:Cry1Ca quimérico. Tais moléculas de ácidos nucleicos, cada uma codificando um polipeptídeo TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac ou TraP:cry1Ca quimérico, foram cada uma introduzidas dentro de um vetor binário, de forma que cada sequência de ácido nucleico que codifica TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac ou TraP:cry1Ca fosse ligada de forma operacional a um promotor e outros elementos reguladores do gene. O vetor binário contendo a sequência de ácido nucleico que codifica TraP:cry2Aa, TraP:vip3ab1, TraP:cry1F, TraP:cry1Ac ou TraP:cry1Ca foi utilizado para transformar várias espécies de plantas. As plantas transgênicas foram analisadas biologicamente em relação à resistência a insetos como um resultado da expressão e da translocação das enzimas Cry2Aa, Vip3Ab1, Cry1F, Cry1Ac ou Cry1Ca para o cloroplasto.Em vista dos exemplos de trabalho detalhados mencionados anteriormente, as sequências de CTP derivado de Brassica sintético da invenção e ácidos nucleicos que codificam as mesmas, podem ser utilizadas para direcionar qualquer polipeptídeo para um plastídeo em uma faixa ampla de células que contêm plastídeo. Por exemplo, através de métodos disponibilizados para os peritos na arte através da presente divulgação, um polipeptídeo quimérico que compreende uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético fundida ao N-terminal de qualquer segunda sequência peptídica pode ser introduzido dentro (ou expresso em) uma célula hospedeira que contém plastídeo para o direcionamento para o plastídeo da segunda sequência peptídica. Assim, em modalidades particulares, um peptídeo TraP da invenção pode fornecer maior eficiência de importação e processamento de um peptídeo para o qual a expressão do plastídeo é desejada, quando comparado com um CTP nativo. Abreviações CTP peptídeo de trânsito para o cloroplasto Bt Bacillus thuringiensis EPSPS 3-enolpiruvilshikimato-5-fosfato sintetase YFP proteína fluorescente amarela Ti indutor de tumor (plasmídeos derivados de A. tumefaciens) T-DNA DNA de transferência
Termos
[0042] Com a finalidade de facilitar a revisão das várias modalidades da divulgação, são fornecidas as explicações a seguir de termos específicos:
[0043] Peptídeo de trânsito para o cloroplasto: Como utilizado aqui, o termo "peptídeo de trânsito para o cloroplasto" (CTP) (ou "peptídeo de trânsito para o plastídeo") pode se referir a uma sequência de aminoácidos que, quando presente no N-terminal de um polipeptídeo, direciona a importação do polipeptídeo para dentro de um plastídeo de uma célula que contém plastídeo (por exemplo, uma célula vegetal, tal como em uma planta inteira ou cultura de células vegetais). Um CTP é geralmente necessário e suficiente para direcionar a importação de uma proteína para dentro de um plastídeo (por exemplo, um plastídeo primário, secundário ou terciário, tal como um cloroplasto) de uma célula hospedeira. Um suposto peptídeo de trânsito para o cloroplasto pode ser identificado por um de vários algoritmos disponíveis (por exemplo, PSORT e ChloroP (disponível em cbs.dtu.dk/services/ChloroP)). O ChloroP pode fornecer uma previsão particularmente boa de CTPs. Emanuelsson e outros (1999), Protein Science 8:978-84. Entretanto, a previsão de CTPs funcionais não é conseguida na eficiência de 100% por qualquer algoritmo existente. Portanto, é importante verificar que um suposto CTP identificado funciona verdadeiramente como pretendido, por exemplo, em uma metodologia in vitro ou in vivo.
[0044] Os peptídeos de trânsito para o cloroplasto podem estar localizados no N-terminal de um polipeptídeo que é importado para dentro de um plastídeo. O CTP pode facilitar o transporte co- ou pós- tradução de um polipeptídeo que compreende o CTP para dentro do plastídeo. Os peptídeos de trânsito para o cloroplasto compreendem tipicamente entre aproximadamente 40 e aproximadamente 100 aminoácidos e foi observado que tais CTPs contêm certas características comuns. Por exemplo: os CTPs contêm muito poucos, se algum, aminoácidos carregados negativamente (tal como ácido aspártico, ácido glutâmico, asparaginas ou glutamina); as regiões N- terminais dos CTPs não possuem aminoácidos carregados, glicina e prolina; é também provável que a região central de um CTP contenha uma proporção muito alta de aminoácidos básicos ou hidroxilados (tais como serina e treonina); e é provável que a região C-terminal de um CTP seja rica em arginina e possua a capacidade de compreender uma estrutura de folha beta anfipática. As proteases do plastídeo podem clivar o CTP do restante de um polipeptídeo que compreende o CTP após a importação do polipeptídeo para dentro do plastídeo.
[0045] Contato: Como utilizado aqui, o termo "contato com" ou "captura por" uma célula, um tecido ou um organismo (por exemplo, uma célula vegetal; um tecido vegetal; e uma planta), em consideração a uma molécula de ácido nucleico, inclui a internalização da molécula de ácido nucleico dentro do organismo, por exemplo, e sem limitação: colocando em contato o organismo com uma composição que compreende a molécula de ácido nucleico; e imergindo os organismos com uma solução que compreende a molécula de ácido nucleico.
[0046] Endógeno: Como utilizado aqui, o termo "endógeno" refere-se a substâncias (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos) que se originam de dentro de um organismo, um tecido ou uma célula particular. Por exemplo, um polipeptídeo "endógeno" expresso em uma célula vegetal pode se referir a um polipeptídeo que é normalmente expresso em células do mesmo tipo de plantas não engenheiradas geneticamente da mesma espécie. Em alguns exemplos, um gene endógeno (por exemplo, um gene EPSPS) de uma Brassica sp. pode ser utilizado para a obtenção de uma sequência de CTP de Brassica de referência.
[0047] Expressão: Como utilizado aqui, "expressão" de uma sequência codificadora (por exemplo, um gene ou um transgene) refere- se ao processo através do qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão gênica pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, um tecido ou um organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão gênica. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer lugar na via de DNA para RNA para proteína. A regulação da expressão gênica ocorre, por exemplo, através de controles que atuam sobre a transcrição, a tradução, o transporte e o processamento de RNA, a degradação de moléculas intermediárias tal como mRNA ou através de ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas após estas terem sido produzidas ou através de combinações das mesmas. A expressão gênica pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína através de qualquer método conhecido na arte, por exemplo, e sem limitação: Northern blot; RT-PCR; Western blot; ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro; in situ; e in vivo.
[0048] Material genético: Como utilizado aqui, o termo "material genético" inclui todos os genes e as moléculas de ácidos nucleicos, tais como DNA e RNA.
[0049] Heterólogo: Como utilizado aqui, o termo "heterólogo" refere- se a substâncias (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos) que não se originam de dentro de um organismo, um tecido ou uma célula particular. Por exemplo, um polipeptídeo "heterólogo" expresso em uma célula vegetal pode se referir a um polipeptídeo que não é normalmente expresso em células do mesmo tipo de plantas não engenheiradas geneticamente da mesma espécie (por exemplo, um polipeptídeo que é expresso em células diferentes do mesmo organismo ou células de um organismo diferente).
[0050] Isolado: Como utilizado aqui, o termo "isolado" refere-se a moléculas (por exemplo, moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos) que são substancialmente separadas ou purificadas de outras moléculas do mesmo tipo (por exemplo, outras moléculas de ácidos nucleicos e outros polipeptídeos) com as quais a molécula está normalmente associada na célula do organismo no qual a molécula ocorre naturalmente. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada pode ser substancialmente separada ou purificada do DNA cromossômico ou do DNA extracromossômico na célula do organismo no qual a molécula de ácido nucleico ocorre naturalmente. Assim, o termo inclui moléculas de ácidos nucleicos e polipeptídeos recombinantes que são purificados bioquimicamente de forma que tais outras moléculas de ácidos nucleicos, polipeptídeos e componentes celulares sejam removidos. O termo inclui ainda moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, moléculas de ácidos nucleicos sintetizadas quimicamente e polipeptídeos produzidos de forma recombinante.
[0051] O termo "substancialmente purificada", como utilizado aqui, refere-se a uma molécula que está separada de outras moléculas normalmente associadas com a mesma em seu estado nativo. Uma molécula substancialmente purificada pode ser a espécie predominante presente em uma composição. Uma molécula substancialmente purificada pode ser, por exemplo, pelo menos 60% livre, pelo menos 75% livre ou pelo menos 90% livre de outras moléculas além de um solvente presente em uma mistura natural. O termo "substancialmente purificada" não se refere às moléculas presentes em seu estado nativo.
[0052] Molécula de ácido nucleico: Como utilizado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico" refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir tanto fitas senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos anteriores. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" como utilizado aqui é sinônima de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico possui geralmente pelo menos 10 bases de comprimento, a não ser que seja especificado de outra maneira. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA. As moléculas de ácidos nucleicos incluem formas diméricas (as assim chamadas em tandem) e os produtos da transcrição de moléculas de ácidos nucleicos. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um ou tanto nucleotídeos que ocorrem naturalmente quanto modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeos que ocorrem naturalmente e/ou não ocorrem naturalmente.
[0053] As moléculas de ácidos nucleicos podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeos não naturais ou derivatizadas, que serão facilmente consideradas pelos peritos na arte. Tais modificações incluem, por exemplo, marcações, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos que ocorrem naturalmente por um análogo, modificações internucleotídeos (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos etc.; grupamentos pendentes: por exemplo, peptídeos; agentes intercalantes: por exemplo, acridina, psoralen etc.; quelantes;alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anonéricos etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" inclui ainda qualquer conformação topológica, incluindo conformações em fita simples, em fita dupla, parcialmente em dúplex, em tríplex, em grampo de cabelo, circulares e trancadas.
[0054] Como utilizado aqui em relação ao DNA, o termo "sequência codificadora", "sequência de nucleotídeos estrutural" ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é em última análise traduzida em um polipeptídeo, via transcrição e mRNA, quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Em relação ao RNA, o termo "sequência codificadora" refere-se a uma sequência de nucleotídeos que é traduzida em um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína. Os limites de uma sequência codificadora são determinados através de um códon de início da tradução no terminal a 5' e um códon de término da tradução no terminal a 3'. As sequências codificadoras incluem, mas não estão limitadas a: DNA genômico; cDNA; ESTs; e sequências de nucleotídeos recombinantes.
[0055] Em algumas modalidades, a invenção inclui sequências de nucleotídeos que podem ser isoladas, purificadas ou parcialmente purificadas, por exemplo, utilizando métodos de separação tal como, por exemplo, cromatografia de troca iônica; através da exclusão baseada no tamanho molecular ou através de afinidade; através de técnicas de fracionamento baseado na solubilidade em solventes diferentes; e métodos de engenharia genética tais como amplificação, clonagem e subclonagem.
[0056] Identidade de sequência: O termo "identidade de sequência" ou "identidade", como utilizado aqui no contexto de duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídicas, pode se referir aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhadas para correspondência máxima ao longo de uma janela de comparação especificada.
[0057] Como utilizado aqui, o termo "porcentagem de identidade de sequência" pode se referir ao valor determinado através da comparação de duas sequências alinhadas de forma ótima (por exemplo, sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos) ao longo de uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, espaços) quando comparada com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições nas quais o nucleotídeo ou o resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as sequências para fornecer o número de posições combinadas, dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para fornecer a porcentagem de identidade de sequência.
[0058] Os métodos para o alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na arte. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo, em: Smith e Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970), J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988), Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989), CABIOS 5:151-3; Corpet e outros (1988), Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e outros (1992), Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson e outros (1994), Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana e outros (1999), FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada dos métodos de alinhamento de sequências e de cálculos de homologia pode ser encontrada, por exemplo, em Altschul e outros (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10.
[0059] The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul e outros (1990)) está disponível em várias fontes, incluindo the National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD) e na internet, para uso em associação com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência utilizando este programa está disponível na internet na seção "ajuda" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácidos nucleicos, a função "Blast 2 sequences" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada utilizando a matriz BLOSUM62 preestabelecida ajustada nos parâmetros preestabelecidos. As sequências de ácidos nucleicos com similaridade ainda maior às sequências de referência exibirão maior porcentagem de identidade quando avaliadas através deste método.
[0060] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Como utilizado aqui, os termos "Especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade, de forma que uma ligação estável e específica ocorra entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácidos nucleicos envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as sequências de ácidos nucleicos das duas moléculas de ácidos nucleicos. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes na fita oposta para formar uma molécula em dúplex que, se esta for suficientemente estável, é detectável utilizando métodos bem conhecidos na arte. Uma molécula de ácido nucleico não precisa ser 100% complementar a sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. Entretanto, a quantidade de complementaridade de sequência que tem que existir para a hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização utilizadas.
[0061] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e do comprimento das sequências de ácidos nucleicos que se hibridizam. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização determinarão a estringência da hibridização, embora os tempos de lavagem também influenciem a estringência. Os cálculos em relação às condições de hibridização necessárias para atingir graus particulares de estringência são conhecidos pelos peritos comuns na arte e são discutidos, por exemplo, em Sambrook e outros (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e diretrizes detalhadas adicionais em consideração à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel e outros, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.
[0062] Como utilizado aqui, "condições estringentes" abrangem condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos de 20% de pareamento errado entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico alvo. "Condições estringentes" incluem ainda níveis particulares de estringência. Assim, como utilizado aqui, condições de "estringência moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais de 20% de pareamento errado de sequência não irão se hibridizar; condições de "estringência alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 10% de pareamento errado não irão se hibridizar; e condições de "estringência muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 5% de pareamento errado não irão se hibridizar.
[0063] As seguintes são condições de hibridização não limitantes representativas.
[0064] Condição de estringência alta (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em 5x tampão SSC a 65°C durante 16 horas; lavar duas vezes em 2x tampão SSC à temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavar duas vezes em 0,5x tampão SSC a 65°C durante 20 minutos cada.
[0065] Condição de estringência moderada (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em 5x-6x tampão SSC a 65-70°C durante 16-20 horas; lavar duas vezes em 2x tampão SSC à temperatura ambiente durante 5-20 minutos cada; e lavar duas vezes em 1x tampão SSC a 55-70°C durante 30 minutos cada.
[0066] Condição de controle não estringente (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência irão se hibridizar): Hibridização em 6x tampão SSC à temperatura ambiente a 55°C durante 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes em 2x-3x tampão SSC à temperatura ambiente a 55°C durante 20-30 minutos cada.
[0067] Como utilizado aqui, o termo "substancialmente homóloga" ou "homologia substancial", em consideração a uma sequência de ácido nucleico contígua, refere-se a sequências de nucleotídeos contíguas que se hibridizam sob condições estringentes com a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácido nucleico de referência são aquelas sequências de ácidos nucleicos que se hibridizam sob condições estringentes (por exemplo, as condições de Estringência Moderada apresentadas, supra) à sequência de ácido nucleico de referência. Sequências substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, as sequências substancialmente homólogas podem ter de aproximadamente 80% até 100% de identidade de sequência, tal como aproximadamente 81%; aproximadamente 82%; aproximadamente 83%; aproximadamente 84%; aproximadamente 85%; aproximadamente 86%; aproximadamente 87%; aproximadamente 88%; aproximadamente 89%; aproximadamente 90%; aproximadamente 91%; aproximadamente 92%; aproximadamente 93%; aproximadamente 94% aproximadamente 95%; aproximadamente 96%; aproximadamente 97%; aproximadamente 98%; aproximadamente 98,5%; aproximadamente 99%; aproximadamente 99,5%; e aproximadamente 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada à hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando houver um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do ácido nucleico às sequências que não são alvo sob condições em que a ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização estringentes.
[0068] Como utilizado aqui, o termo "ortólogo" refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluiu partindo de uma sequência de nucleotídeos ancestral comum e pode manter a mesma função nas duas ou mais espécies.
[0069] Como utilizado aqui, é dito que duas moléculas de sequências de ácidos nucleicos exibem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma sequência lida na direção 5' para 3' for complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3' para 5'. Uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de nucleotídeos de referência exibirá uma sequência idêntica à sequência do complemento inverso da sequência de nucleotídeos de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na arte e são facilmente entendidos pelos peritos comuns na arte.
[0070] Quando se determina a porcentagem de identidade de sequência entre sequências de aminoácidos, é bem conhecido pelos peritos na arte que a identidade do aminoácido em certa posição fornecida por um alinhamento pode diferir sem afetar as propriedades desejadas dos polipeptídeos que compreendem as sequências alinhadas. Nestes casos, a porcentagem de identidade de sequência pode ser ajustada para fornecer similaridade entre os aminoácidos substituídos de forma conservativa. Estes ajustes são bem conhecidos e comumente utilizados pelos peritos na arte. Ver, por exemplo, Myers e Miller (1988), Computer Applications in Biosciences 4:11-7.
[0071] As modalidades da invenção incluem variantes funcionais de exemplos de sequências de aminoácidos do peptídeo de trânsito para o plastídeo e sequências de ácidos nucleicos que codificam as mesmas. Uma variante funcional de um exemplo de sequência de peptídeo de trânsito pode ser, por exemplo, um fragmento de um exemplo de sequência de aminoácidos do peptídeo de trânsito (tal como um fragmento N-terminal ou C-terminal) ou uma sequência modificada de um exemplo de sequência de aminoácidos do peptídeo de trânsito de comprimento completo ou fragmento de um exemplo de sequência de aminoácidos do peptídeo de trânsito. Um exemplo de sequência de aminoácidos do peptídeo de trânsito pode ser modificado em algumas modalidades para introduzir uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas. Uma substituição de aminoácido "conservativa" é uma em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral funcional similar, tamanho similar e/ou hidrofobicidade similar. As famílias de aminoácidos que podem ser utilizadas para substituir outro aminoácido da mesma família com a finalidade de introduzir uma substituição conservativa são conhecidas na arte. Por exemplo, estas famílias de aminoácidos incluem: Aminoácidos básicos (por exemplo, lisina, arginina e histidina); aminoácidos ácidos (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico); aminoácidos polares não carregados (em pH fisiológico) (por exemplo, glicina, asparaginas, glutamina, serina, treonina, tirosina e citosina); aminoácidos não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano); aminoácidos beta ramificados (por exemplo, treonina, valina e isoleucina); e aminoácidos aromáticos (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina). Ver, por exemplo, Sambrook e outros (Eds.), supra; e Innis e outros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, NY, USA.
[0072] Ligada de forma operacional: Uma primeira sequência de nucleotídeos está "ligada de forma operacional" com uma segunda sequência de nucleotídeos quando a primeira sequência de nucleotídeos estiver em uma relação funcional com a segunda sequência de nucleotídeos. Por exemplo, um promotor está ligado de forma operacional a uma sequência codificadora se o promotor afetar a transcrição ou a expressão da sequência codificadora. Quando produzidas de forma recombinantes, as sequências de nucleotídeos ligadas de forma operacional são geralmente contíguas e, quando necessário ligar duas regiões que codificam proteína, no mesmo quadro de leitura. Entretanto, as sequências de nucleotídeos não precisam ser contíguas para estarem ligadas de forma operacional.
[0073] O termo, "ligada de forma operacional", quando utilizado em referência a uma sequência reguladora e uma sequência codificadora, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência codificadora ligada. "Sequências reguladoras" ou "elementos de controle" referem-se a sequências de nucleotídeos que influenciam o momento e o nível/quantidade de transcrição, o processamento ou a estabilidade de RNA ou a tradução da sequência codificadora associada. As sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; intensificadores; estruturas de haste-volta; sequências que se ligam ao repressor; sequências de término; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. As sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência codificadora ligada de forma operacional às mesmas. Ainda, as sequências reguladoras particulares ligadas de forma operacional a uma sequência codificadora podem estar localizadas sobre a fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.
[0074] Quando utilizado em referência a duas ou mais sequências de aminoácidos, o termo "ligada de forma operacional" significa que a primeira sequência de aminoácidos está em uma relação funcional com pelo menos uma das sequências de aminoácidos adicionais. Por exemplo, um peptídeo de trânsito (por exemplo, um CTP) está ligado de forma operacional a uma segunda sequência de aminoácidos dentro de um polipeptídeo que compreende ambas as sequências se o peptídeo de trânsito afetar a expressão ou o tráfego do polipeptídeo ou da segunda sequência de aminoácidos.
[0075] Promotor: Como utilizado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início da transcrição e que pode estar envolvida no reconhecimento e na ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser ligado de forma operacional a uma sequência codificadora para a expressão em uma célula ou um promotor pode estar ligado de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência sinal que pode estar ligada de forma operacional a uma sequência codificadora para a expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Os exemplos de promotores sob controle do desenvolvimento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueído ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferidos pelo tecido". Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "específicos para o tecido". Um promotor "específico para o tipo de célula" primariamente controla a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "que pode ser induzido" pode ser um promotor que pode estar sob controle do ambiente. Os exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição através de promotores que podem ser induzidos incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Os promotores específicos para o tecido, preferidos pelo tecido, específicos para o tipo de célula e que podem ser induzidos constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais.
[0076] Qualquer promotor que pode ser induzido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Ver Ward e outros (1993), Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor que pode ser induzido, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Os exemplos de promotores que podem ser induzidos incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que respondem ao cobre; gene In2 do milho que responde a fitoprotetores de herbicida de benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor que pode ser induzido de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade de transcrição pode ser induzida por um hormônio glucocorticosteroide (Schena e outros (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421).
[0077] Os exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não estão limitados a: Promotores de vírus de plantas, tal como o promotor 35S do CaMV; promotores dos genes da actina do arroz; promotores da ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; e o promotor ALS, fragmento de Xba1/NcoI a 5' do gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma similaridade de sequências de nucleotídeos ao dito fragmento de Xba1/NcoI) (Publicação PCT Internacional N°. WO 96/30530).
[0078] Adicionalmente, qualquer promotor específico para o tecido ou preferido pelo tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência codificadora ligada de forma operacional a um promotor específico para o tecido podem produzir o produto da sequência codificadora exclusivamente ou preferencialmente, em um tecido específico. Os exemplos de promotores específicos para o tecido ou preferidos pelo tecido incluem, mas não estão limitados a: Um promotor preferido pela raiz, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico para a folha e induzido pela luz tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor preferido pela antera tal como aquele de LAT52; um promotor específico para o pólen tal como aquele de Zm13; e um promotor específico para o micrósporo tal como aquele de apg.
[0079] Transformação: Como utilizado aqui, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos para dentro de uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida para dentro da célula quando a molécula de ácido nucleico se torna replicada de forma estável pela célula, através da incorporação da molécula de ácido nucleico dentro do genoma celular ou através da replicação epissomal. Como utilizado aqui, o termo "transformação" abrange todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida dentro de tal célula. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores plasmidiais; eletroporação (Fromm e outros (1986), Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner e outros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller e outros (1978), Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley e outros (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); captura direta do DNA; e bombardeio de microprojéteis (Klein e outros (1987), Nature 327:70).
[0080] Transgene: Uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em exemplos particulares, um transgene pode codificar um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético e pelo menos uma sequência peptídica adicional (por exemplo, uma sequência peptídica que confere resistência a herbicida), para o qual a expressão no plastídeo é desejável. Em estes e outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras ligadas de forma operacional a uma sequência codificadora do transgene (por exemplo, um promotor). Para as finalidades desta divulgação, o termo "transgênico", quando utilizado para se referir a um organismo (por exemplo, uma planta), refere-se a um organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, o organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógena pode ser um organismo dentro do qual a sequência de ácido nucleico foi introduzida via técnicas de transformação molecular. Em outros exemplos, o organismo que compreende a sequência de ácido nucleico exógena pode ser um organismo dentro do qual a sequência de ácido nucleico foi introduzida, por exemplo, através de introgressão ou polinização cruzada em uma planta.
[0081] Transporte: Como utilizados aqui, os termos "transporte(s)","alvo(s)" e "transferência(s)" referem-se à propriedade de certas sequências de aminoácidos da invenção que facilita o movimento de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos partindo do núcleo de uma célula hospedeira para dentro de um plastídeo da célula hospedeira. Em modalidades particulares, tal sequência de aminoácidos (isto é, uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético) pode ser capaz de transportar aproximadamente 100%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 60% e/ou pelo menos aproximadamente 50% de um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos para dentro dos plastídeos de uma célula hospedeira.
[0082] Vetor: Uma molécula de ácido nucleico que é introduzida dentro de uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácidos nucleicos que permitem que este se replique na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Os exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; um cosmídeo; um bacteriófago; ou um vírus que carrega DNA exógeno para dentro de uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na arte. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, fazendo assim com que a célula expresse as moléculas de ácidos nucleicos e/ou as proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui opcionalmente materiais para auxiliar a conseguir a entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossomo, um revestimento de proteína etc.).
[0083] A não ser que seja especificamente indicado ou implicado o contrário, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um(a)", como utilizado aqui.A não ser que seja especificamente explicado o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado que é comumente entendido pelos peritos comuns na arte à qual esta divulgação pertence. Definições de termos comuns na biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e outros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens estão em peso e todas as proporções de misturas de solventes estão em volume a não ser que seja citado de outra maneira. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.
Moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma sequência que codifica um CTP derivado de Brassica sintético
[0084] Em algumas modalidades, esta divulgação fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em modalidades particulares, a sequência de nucleotídeos de interesse pode ser uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse. Em exemplos particulares, é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo em que uma sequência de TraP12 ou de TraP13 está fundida ao N-terminal de um polipeptídeo de interesse.
[0085] Um CTP derivado de Brassica sintético pode ser derivado de um gene EPSPS de Brassica. Em exemplos particulares de tais modalidades, o gene EPSPS de Brassica pode compreender a sequência de ácido nucleico apresentada como a SEQ ID NO: 1, uma sequência de ácido nucleico homóloga de um gene EPSPS diferente ou um ortólogo do gene EPSPS de Brassica que compreende a sequência de ácido nucleico apresentada como a SEQ ID NO: 1.
[0086] Em algumas modalidades, um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético pode ser um CTP derivado de Brassica quimérico. Um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivado de uma sequência de CTP de Brassica de referência através da ligação de uma primeira sequência de aminoácidos contíguos compreendida dentro da sequência de CTP de Brassica de referência a uma segunda sequência de aminoácidos contíguos compreendida dentro de uma sequência de CTP diferente (por exemplo, uma sequência de CTP obtida de uma Arabidopsis sp.). Em modalidades particulares, a sequência de CTP diferente que compreende a segunda sequência de aminoácidos contíguos pode ser codificada por uma sequência gênica homóloga de um genoma sem ser aquele da Brassica sp. da qual a sequência de referência foi obtida (por exemplo, uma Brassica sp. diferente, uma planta sem ser uma Brassica sp.; um eucarioto fotossintético inferior, por exemplo, um Chlorophyta; e um procarioto, por exemplo, uma Cyanobacterium ou uma Agrobacterium). Assim, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético pode ser derivada de uma sequência gênica que codifica CTP de Brassica de referência através da fusão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contíguos da sequência de CTP de Brassica de referência com uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos contíguos de uma sequência de CTP diferente que é homóloga ao restante da sequência de CTP de Brassica de referência. Nestes e em outros exemplos, a sequência de aminoácidos contíguos da sequência de CTP de Brassica de referência pode estar localizada na extremidade a 5' ou na extremidade a 3' do CTP derivado de Brassica sintético.
[0087] Em algumas modalidades, um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivado de um grande número de sequências de CTP de Brassica (incluindo uma sequência de CTP de Brassica de referência) através da ligação de uma sequência de aminoácidos contíguos compreendida dentro de uma sequência de CTP de Brassica a uma sequência de aminoácidos contíguos compreendida dentro de uma sequência de CTP de Brassica diferente. Em modalidades particulares, o grande número de sequências de CTP de Brassica pode ser codificado por sequências gênicas ortólogas em espécies de Brassica diferentes. Em alguns exemplos, o grande número de sequências de CTP de Brassica pode ser exatamente duas sequências de CTP de Brassica. Assim, uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivada de duas sequências gênicas que codificam CTP de Brassica homólogas (por exemplo, substancialmente homólogas) (por exemplo, sequências gênicas ortólogas) através da fusão da sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contíguos de uma das sequências de CTP de Brassica com a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos contíguos da outra das sequências de CTP de Brassica que é homóloga ao restante da primeira sequência de CTP de Brassica. TraP12 e TraP13 são exemplos ilustrativos de tal CTP derivado de Brassica quimérico sintético.
[0088] Em algumas modalidades, um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivado de uma sequência de CTP de Brassica de referência através da ligação de uma sequência de aminoácidos contíguos compreendida dentro da sequência de CTP de Brassica de referência a uma sequência de aminoácidos contíguos compreendida dentro de uma segunda sequência de CTP obtida de um organismo diferente. Em modalidades particulares, a segunda sequência de CTP pode ser codificada por uma sequência gênica ortóloga no organismo diferente. Uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser derivada de uma sequência de CTP de Brassica de referência através da fusão de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos contíguos da sequência de CTP de Brassica de referência com uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos contíguos de uma sequência gênica que codifica CTP homóloga (por exemplo, substancialmente homóloga) (por exemplo, uma sequência gênica ortóloga) da sequência de CTP do organismo diferente que é homóloga ao restante da sequência de CTP de Brassica de referência. TraPs12 e 13 são exemplos ilustrativos de tal CTP quimérico sintético, que compreende sequências de CTP que são derivadas de Brassica e Arabidopsis thaliana.
[0089] Um perito comum na arte entenderá que, após a seleção de uma primeira sequência de aminoácidos contíguos dentro de uma sequência de CTP de Brassica de referência, a identificação e a seleção da sequência de aminoácidos contíguos do restante de uma sequência de CTP homóloga de acordo com o processo de derivação anterior são não ambíguas e automáticas. Em alguns exemplos, a primeira sequência de aminoácidos contíguos pode ter entre aproximadamente 25 e aproximadamente 41 aminoácidos de comprimento (por exemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e 42 aminoácidos de comprimento). Em algumas modalidades, a primeira sequência de aminoácidos contíguos dentro da sequência de CTP de Brassica de referência é definida pela posição na extremidade a 3' de um motivo "SVSL" (SEQ ID NO: 9) que é conservado dentro de alguns genes EPSPS de Brassica.
[0090] Os exemplos de sequências de CTP derivado de Brassica quimérico sintético de acordo com o processo anterior são representados pelas SEQ ID NOs: 6 e 8. Em vista da degeneração do código genético, o gênero de sequências de nucleotídeos que codificam estes peptídeos irá ser imediatamente previsto por um perito comum na arte. Estes exemplos particulares ilustram as características estruturais de CTPs derivados de Brassica quiméricos sintéticos através da incorporação de sequências contíguas de um CTP homólogo de um de vários ortólogos de ESPSP de um gene ESPSP de B. napus.
[0091] Algumas modalidades incluem variantes funcionais de um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético e/ou ácidos nucleicos que codificam os mesmos. Tais variantes funcionais incluem, por exemplo, e sem limitação: uma sequência que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que é derivada de um homólogo e/ou um ortólogo de sequências que codificam CTP de Brassica apresentado como a SEQ ID NO: 1 e/ou um CTP codificado pelo mesmo; um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que compreende uma sequência de aminoácidos contíguos dentro da SEQ ID NO: 2 e/ou um CTP codificado pela mesma; uma sequência que codifica CTP derivado de Brassica sintético truncado que compreende uma sequência de ácido nucleico contígua dentro de uma das SEQ ID NOs: 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17 e 19; uma sequência que codifica CTP derivado de Brassica sintético truncado que compreende uma sequência de ácido nucleico contígua que é substancialmente homóloga a uma das SEQ ID NOs: 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17 e 19; um CTP derivado de Brassica sintético truncado que compreende uma sequência de aminoácidos contíguos dentro de uma das SEQ ID NOs: 6 e 8; um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que compreende uma sequência de aminoácidos contíguos dentro de uma das SEQ ID NOs: 6 e 8 e/ou um CTP codificado pela mesma; um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que compreende uma sequência de aminoácidos contíguos dentro de uma das SEQ ID NOs: 6 e 8 que possui uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas e/ou um CTP codificado pela mesma; e um ácido nucleico que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que compreende uma sequência de aminoácidos contíguos dentro de uma das SEQ ID NOs: 6 e 8 que possui uma ou mais substituições de aminoácidos não conservativas que são demonstradas para direcionar um peptídeo ligado de forma operacional para um plastídeo em uma célula que contém plastídeo e/ou um CTP codificado pela mesma.
[0092] Assim, algumas modalidades da invenção incluem uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica quimérico sintético que compreende uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas. Tala molécula de ácido nucleico pode ser útil, por exemplo, na facilitação da manipulação de uma sequência que codifica CTP da invenção em técnicas de biologia molecular. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência que codifica CTP da invenção pode ser introduzida dentro de um vetor adequado para a subclonagem da sequência dentro de um vetor de expressão ou uma sequência que codifica CTP da invenção pode ser introduzida dentro de uma molécula de ácido nucleico que facilita a produção de uma molécula de ácido nucleico adicional que compreende a sequência que codifica CTP ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse. Nestas e em modalidades adicionais, uma ou mais posições de aminoácidos na sequência de um CTP derivado de Brassica quimérico sintético podem ser deletadas. Por exemplo, a sequência de um CTP derivado de Brassica quimérico sintético pode ser modificada de forma que o(s) aminoácido(s) nas posições 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 na sequência seja(m) deletado(s). Um alinhamento de sequências de CTP homólogas pode ser utilizado para fornecer orientação de quais aminoácidos podem ser deletados sem afetar a função do CTP sintético.
[0093] Em exemplos particulares, um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético tem menos que 80 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, um CTP derivado de Brassica sintético pode ter 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60 ou menos aminoácidos de comprimento. Em certos exemplos, um CTP derivado de Brassica sintético pode ter aproximadamente 65, aproximadamente 68, aproximadamente 72 ou aproximadamente 74 aminoácidos de comprimento. Nestes e em exemplos adicionais, um CTP derivado de Brassica sintético pode compreender uma sequência de aminoácidos apresentada em uma das SEQ ID NOs: 6 e 8 ou uma variante funcional de qualquer uma das anteriores. Assim, um CTP derivado de Brassica sintético pode compreender uma sequência de aminoácidos que compreende uma das SEQ ID NOs: 6 e 8 ou uma variante funcional da mesma, em que o comprimento do CTP derivado de Brassica sintético tem menos que 80 aminoácidos de comprimento. Em certos exemplos, um CTP derivado de Brassica sintético pode compreender uma sequência de aminoácidos que é, por exemplo, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica a uma das SEQ ID NOs: 6 e 8.
[0094] Todas as sequências de nucleotídeos que codificam um CTP derivado de Brassica sintético particular, por exemplo, o peptídeo TraP12 da SEQ ID NO: 6, o peptídeo TraP13 da SEQ ID NO: 8 ou variantes funcionais de qualquer um dos anteriores incluindo quaisquer deleções e/ou substituições de aminoácidos conservativas específicas, serão reconhecidas pelos peritos na arte em vista da presente divulgação. A degeneração do código genético fornece um número finito de sequências codificadoras para uma sequência de aminoácidos particular. A seleção de uma sequência particular para codificar um CTP derivado de Brassica sintético está dentro do critério do perito. Sequências codificadoras diferentes podem ser desejáveis em aplicações diferentes. Por exemplo, para aumentar a expressão do CTP derivado de Brassica sintético em um hospedeiro particular, pode ser selecionada uma sequência codificadora que reflete a tendência de uso de códons do hospedeiro. Com a finalidade de exemplo, um CTP derivado de Brassica sintético pode ser codificado por uma sequência de nucleotídeos apresentada como uma das SEQ ID NOs: 5, 7, 11, 12, 13, 15, 17 e 19.
[0095] Nas moléculas de ácidos nucleicos fornecidas em algumas modalidades da invenção, o último códon de uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético e o primeiro códon de uma sequência de nucleotídeos de interesse podem ser separados por um número de tripletos de nucleotídeos, por exemplo, sem codificar um íntron ou um "STOP". Em alguns exemplos, uma sequência que codifica os primeiros aminoácidos de uma proteína madura normalmente associada com um peptídeo de trânsito para o cloroplasto em um polipeptídeo precursor natural pode estar presente entre o último códon de uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético e o primeiro códon de uma sequência de nucleotídeos de interesse. Uma sequência que separa uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético e o primeiro códon de uma sequência de nucleotídeos de interesse pode, por exemplo, consistir de qualquer sequência, de forma que seja improvável que a sequência de aminoácidos codificada altere significativamente a tradução do polipeptídeo quimérico e sua translocação para um plastídeo. Nestas e em modalidades adicionais, o último códon de uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético pode ser fundido em registro de fase com o primeiro códon da sequência de nucleotídeos de interesse diretamente contíguo ao mesmo ou separado do mesmo por não mais que uma sequência peptídica curta, tal como aquela codificada por um ligante nucleotídico sintético (por exemplo, um ligante nucleotídico que pode ter sido utilizado para conseguir a fusão).
[0096] Em algumas modalidades, pode ser desejável modificar os nucleotídeos de uma sequência de nucleotídeos de interesse e/ou uma sequência que codifica um CTP derivado de Brassica sintético fundida à mesma em uma única sequência codificadora, por exemplo, para aumentar a expressão da sequência codificadora em um hospedeiro particular. O código genético é redundante com 64 códons possíveis, mas a maioria dos organismos preferencialmente utiliza um subconjunto destes códons. Os códons que são utilizados mais frequentemente em uma espécie são chamados de códons ótimos e aqueles não utilizados muito frequentemente são classificados como raros ou códons de baixo uso. Zhang e outros (1991), Gene 105:61-72. Os códons podem ser substituídos para refletir o uso de códons preferido de um hospedeiro particular em um processo algumas vezes referido como "otimização dos códons". As sequências codificadoras otimizadas que contêm os códons preferidos por um hospedeiro procariótico ou eucariótico particular podem ser preparadas, por exemplo, para aumentar a taxa de tradução ou para produzir produtos da transcrição de RNA recombinantes que possuem propriedades desejáveis (por exemplo, uma meia-vida mais longa, quando comparados com os produtos da transcrição obtidos partindo de uma sequência não otimizada).
[0097] Qualquer polipeptídeo pode ser direcionado para um plastídeo de uma célula que contém plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético. Por exemplo, um polipeptídeo pode ser ligado a uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético em algumas modalidades, de forma a direcionar o polipeptídeo para um plastídeo em uma célula em que a molécula de polipeptídeo ligado-CTP é expressa. Em modalidades particulares, um polipeptídeo direcionado para um plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético pode ser, por exemplo, um polipeptídeo que é normalmente expresso em um plastídeo de uma célula em que o polipeptídeo é expresso de forma nativa. Por exemplo, e sem limitação, um polipeptídeo direcionado para um plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético pode ser um polipeptídeo envolvido na resistência a herbicida, na resistência a vírus, na resistência a agentes patogênicos bacterianos, na resistência a insetos, na resistência a nematoides ou na resistência a fungos. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.569.823; 5.304.730; 5.495.071; 6.329.504; e 6.337.431. Um polipeptídeo direcionado para um plastídeo através da incorporação de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético pode alternativamente ser, por exemplo, e sem limitação, um polipeptídeo envolvido no vigor ou no rendimento da planta (incluindo polipeptídeos envolvidos na tolerância a temperaturas extremas, condições do solo, níveis de luz, níveis de água e ambiente químico) ou um polipeptídeo que pode ser utilizado como um marcador para identificar uma planta que compreende uma característica de interesse (por exemplo, um produto de gene marcador que pode ser selecionado, um polipeptídeo envolvido na coloração da semente etc.).
[0098] Os exemplos não limitantes de polipeptídeos envolvidos na resistência a herbicida que podem ser ligados a uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético em algumas modalidades da invenção incluem: acetolactase sintase (ALS), ALS mutada e precursores de ALS (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.013.659); EPSPS (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 4.971.908 e 6.225.114), tal como um CP4 EPSPS ou um EPSPS de classe III; enzimas que modificam um processo fisiológico que ocorre em um plastídeo, incluindo fotossíntese e síntese de ácidos graxos, aminoácidos, óleos, arotenoides, terpenoides, amido etc. Outros exemplos não limitantes de polipeptídeos que podem ser ligados a um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético em modalidades particulares incluem: zeaxantina epoxidase, colina mono-oxigenase, ferroquelatase, ácido graxo ômega- 3 dessaturase, glutamina sintetase, enzimas que modificam o amido, polipeptídeos envolvidos na síntese de aminoácidos essenciais, pró- vitamina A, hormônios, proteínas da toxina Bt etc. As sequências de nucleotídeos que codificam os peptídeos mencionados anteriormente são conhecidas na arte e tais sequências de nucleotídeos podem ser ligadas de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético que será expresso dentro de um polipeptídeo que compreende o polipeptídeo de interesse ligado ao CTP derivado de Brassica sintético. Além disso, sequências de nucleotídeos adicionais que codificam qualquer um dos polipeptídeos mencionados anteriormente podem ser identificadas pelos peritos na arte (por exemplo, através da clonagem de genes com alta homologia a outros genes que codificam o polipeptídeo particular). Uma vez que tal sequência de nucleotídeos foi identificada, é um processo direto planejar uma sequência de nucleotídeos que compreende uma sequência que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional à sequência de nucleotídeos identificada ou uma sequência que codifica um polipeptídeo equivalente.
Expressão de polipeptídeos que compreendem um peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético
[0099] Em algumas modalidades, pelo menos uma (ou mais) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) que compreende(m) uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético ou equivalente funcional da mesma, pode(m) ser introduzida(s) em uma célula, um tecido ou um organismo para a expressão do polipeptídeo ali. Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos de interesse ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência codificadora que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético e pelo menos uma sequência peptídica adicional codificada por uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser introduzida em uma célula, um tecido ou um organismo hospedeiro que contém plastídeo (por exemplo, uma célula vegetal, um tecido vegetal e uma planta), de forma que um polipeptídeo possa ser expresso partindo da molécula de ácido nucleico na célula, no tecido ou no organismo hospedeiro que contém plastídeo, em que o polipeptídeo expresso compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético e pelo menos uma sequência peptídica adicional codificada por uma sequência de nucleotídeos de interesse. Em certos exemplos, o CTP derivado de Brassica sintético de tal polipeptídeo expresso pode facilitar o direcionamento de uma porção do polipeptídeo que compreende pelo menos a sequência peptídica adicional para um plastídeo da célula, do tecido ou do organismo hospedeiro.
[00100] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser introduzida em uma célula que contém plastídeo através de uma de qualquer uma das metodologias conhecidas pelos peritos na arte. Em modalidades particulares, uma célula, um tecido ou um organismo hospedeiro pode ser colocado em contato com uma molécula de ácido nucleico da invenção com a finalidade de introduzir a molécula de ácido nucleico na célula, no tecido ou no organismo. Em modalidades particulares, uma célula pode ser transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção de forma que a molécula de ácido nucleico seja introduzida na célula e a molécula de ácido nucleico seja integrada de forma estável dentro do genoma da célula. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeos que codifica um CTP derivado de Brassica sintético ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser utilizada para a transformação de uma célula, por exemplo, uma célula que contém plastídeo (por exemplo, uma célula vegetal). Com a finalidade de iniciar ou aumentar a expressão, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma ou mais sequências reguladoras, cujas sequências reguladoras podem ser ligadas de forma operacional à sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético.
[00101] Uma molécula de ácido nucleico pode, por exemplo, ser um sistema de vetor que inclui, por exemplo, um plasmídeo linear ou um circular fechado. Em modalidades particulares, o vetor pode ser um vetor de expressão. As sequências de ácidos nucleicos da invenção podem, por exemplo, ser inseridas dentro de um vetor, de forma que a sequência de ácido nucleico seja ligada de forma operacional a uma ou mais sequências reguladoras. Muitos vetores estão disponíveis para esta finalidade e a seleção do vetor particular pode depender, por exemplo, do tamanho do ácido nucleico que será inserido dentro do vetor e da particular célula hospedeira que será transformada com o vetor. Um vetor tipicamente contém vários componentes, cuja identidade depende de uma função do vetor (por exemplo, amplificação de DNA e expressão de DNA) e da(s) célula(s) hospedeira(s) particular(es) com a qual o vetor é compatível.
[00102] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma sequência de nucleotídeos que compreende pelo menos uma das sequências reguladoras descritas anteriormente ligada de forma operacional a uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. A uma ou mais sequências de nucleotídeos podem ser expressas, sob o controle da(s) sequência(s) reguladora(s), em uma célula, um tecido ou um organismo vegetal para produzir um polipeptídeo que compreende um CTP derivado de Brassica sintético que direciona pelo menos uma porção do polipeptídeo para um plastídeo da célula, do tecido ou do organismo vegetal.
[00103] Em algumas modalidades, uma sequência reguladora ligada de forma operacional a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético, pode ser uma sequência promotora que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana na qual a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada ou uma célula vegetal na qual a molécula de ácido nucleico deve ser expressa. Os promotores adequados para uso nas moléculas de ácidos nucleicos da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, dos quais todos são bem conhecidos na arte. Os exemplos não limitantes de promotores que podem ser úteis nas modalidades da invenção são fornecidos por: Patentes U.S. N°s. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores constitutivos do milho); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S); 6.433.252 (promotor da L3 oleosina do milho); 6.429.357 (promotor da actina 2 do arroz e íntron da actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores que podem ser induzidos pela luz); 6.140.078 (promotores que podem ser induzidos por sal); 6.252.138 (promotores que podem ser induzidos por agentes patogênicos); 6.175.060 (promotores que podem ser induzidos por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Pedido de Patente U.S. N°. de Série 09/757.089 (promotor da aldolase de cloroplasto do milho).
[00104] Exemplos adicionais de promotores incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); o promotor da octopina sintase (OCS) (que é carregado em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens); os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e outros (1987), Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S do CaMV (Odell e outros (1985), Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus mosaico da escrofulária (Walker e outros (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler e outros (1989), Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína que seliga à clorofila a/b; CaMV35S (Patentes U.S. Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); FMV35S (Patentes U.S. Nos. 6.051.753 e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente U.S. N°. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. N° 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (N°. de Acesso do GenBank V00087; Depicker e outros (1982), J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan e outros (1983), Nature 304:184-7).
[00105] Em modalidades particulares, as moléculas de ácidos nucleicos da invenção podem compreender um promotor específico para o tecido. Um promotor específico para o tecido é uma sequência de nucleotídeos que direciona um nível mais alto de transcrição de uma sequência de nucleotídeos ligada de forma operacional no tecido para o qual o promotor é específico, em relação aos outros tecidos do organismo. Os exemplos de promotores específicos para o tecido incluem, sem limitação: promotores específicos para o revestimento de células; promotores específicos para a antera; promotores específicos para o pólen (ver, por exemplo, a Patente U.S. N°. 7.141.424 ePublicação PCT Internacional N°. WO 99/042587); promotores específicos para o óvulo; (ver, por exemplo, o Pedido de Patente U.S. N°. 2001/047525 A1); promotores específicos para o fruto (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.943.674 e 5.753.475); e promotores específicos para a semente (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s. 5.420.034 e 5.608.152). Em algumas modalidades, um promotor específico para o estágio do desenvolvimento (por exemplo, um promotor ativo em um estágio tardio no desenvolvimento) pode ser utilizado em uma composição ou um método da invenção.
[00106] Sequências reguladoras adicionais que podem em algumas modalidades ser ligadas de forma operacional a uma molécula de ácido nucleico incluem 5' UTRs localizadas entre uma sequência promotora e uma sequência codificadora que funcionam como uma sequência líder da tradução. A sequência líder da tradução está presente no mRNA completamente processado e pode afetar o processamento do produto da transcrição primário e/ou a estabilidade do RNA. Os exemplos de sequências líderes de tradução incluem líderes de proteínas de choque térmico do milho e da petúnia (Patente U.S. N°. 5.362.865), líderes de proteínas do revestimento de vírus de planta, líderes de rubisco de planta e outros. Ver, por exemplo, Turner e Foster (1995), Molecular Biotech. 3(3):225-36. Os exemplos não limitantes de 5' UTRs são fornecidos por: GmHsp (Patente U.S. N°. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. N° 5.362.865); AtAntl; TEV (Carrington e Livred (1990), J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (No. de Acesso do GenBank V00087; e Bevan e outros (1983), Nature 304:184-7).
[00107] Sequências reguladoras adicionais que podem em algumas modalidades ser ligadas de forma operacional a uma molécula de ácido nucleico incluem ainda sequências não traduzidas a 3', regiões de término da transcrição a 3' ou regiões de poliadenilação. Estas são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeos e incluem polinucleotídeos que fornecem sinal de poliadenilação e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou o processamento do mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados na extremidade a 3' do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de término da transcrição a 3' é a região a 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley e outros (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não traduzidas a 3' diferentes é fornecido em Ingelbrecht e outros, (1989), Plant Cell 1:671-80. Os exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi e outros (1984), EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (N°. de Acesso do GenBank E01312).
[00108] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável a uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Os marcadores selecionáveis também podem ser utilizados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina etc.) ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato etc.). Os exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado utilizando canamicina, G418 etc.; um gene bar que codifica resistência a bialaphos; um gene de EPSP sintase mutante que codifica resistência ao glifosato; um gene da nitrilase que confere resistência a bromoxinil; um gene da acetolactato sintase (ALS) mutante que confere resistência à imidazolinona ou sulfoniluréia; e um gene de DHFR resistente ao metotrexato. Estão disponíveis vários marcadores selecionáveis que conferem resistência à ampicilina, à bleomicina, ao cloramfenicol, à gentamicina, à higromicina, à canamicina, à lincomicina, ao metotrexato, à fosfinotricina, à puromicina, à espectinomicina, à rifampicina, à estreptomicina e à tetraciclina e similares. Os exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados,por exemplo, nas Patentes U.S. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.
[00109] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vetor da presente invenção também pode ou alternativamente inclui um marcador que pode ser verificado. Os marcadores que podem ser verificados podem ser utilizados para monitorar a expressão. Os exemplos de marcadores que podem ser verificados incluem um gene da β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson e outros (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene do lócus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (coloração vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta e outros (1988), "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging com Ac". Em 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson e R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene da β-lactamase (Sutcliffe e outros (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow e outros (1986), Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski e outros (1983), Gene 46(2-3):247-55); um gene de amilase (Ikatu e outros (1990), Bio/Technol. 8:241-2); um gene tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez se condensa em melanina (Katz e outros (1983), J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma α-galactosidase.
[00110] Os métodos adequados para a transformação de células hospedeiras incluem qualquer método através do qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo, e sem limitação: através de transformação de protoplastos (ver, por exemplo, a Patente U.S.5.508.184); através da captura do DNA mediada por dessecação/inibição (ver, por exemplo, Potrykus e outros (1985), Mol. Gen. Genet. 199:183-8); através de eletroporação (ver, por exemplo, a Patente U.S. 5.384.253); através de agitação com fibras de carbureto de silício (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765); através de transformação mediada por Agrobacterium (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.824.877, 5.981.840 e 6.384.301); e através de aceleração de partículas revestidas com DNA (ver, por exemplo, as Patentes U.S. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865); etc. Através da aplicação de técnicas tais como estas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser transformadas de forma estável. Em algumas modalidades, o DNA transformante é integrado dentro do genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma destas técnicas pode ser utilizada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos da invenção no genoma da planta transgênica.
[00111] O método mais amplamente utilizado para a introdução de um vetor de expressão em plantas se baseia no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para plantas que transformam geneticamente células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indutores de tumor) contêm um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para as plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região vir, é responsável pela transferência do T-DNA. A região do T-DNA é delimitada por repetições terminais. Em alguns vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram deletados e as funções da região vir são utilizadas para transferir o DNA estranho delimitado pelas sequências de borda do T-DNA. A região T também pode conter, por exemplo, um marcador selecionável para a recuperação eficiente de plantas e células transgênicas e um sítio de clonagem múltipla para a inserção de sequências para transferência tal como um ácido nucleico que codifica CTP derivado de Brassica sintético.
[00112] Assim, em algumas modalidades, um vetor de transformação de planta pode ser derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (ver, por exemplo, as Patentes U.S. N°s. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e a Patente Europeia EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de plantas adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella e outros (1983), Nature 303:209-13; Bevan e outros (1983), Nature 304:184-7; Klee e outros (1985), Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia EP 0 120 516 e aqueles derivados de qualquer um dos anteriores. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência gênica para um número de plantas distintas. Estas bactérias simbióticas associadas às plantas podem ser tornadas competentes em relação à transferência gênica através da aquisição tanto de um plasmídeo Ti desarmado quanto de um vetor binário adequando.
[00113] Após o fornecimento do DNA exógeno às células receptoras, as células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração de plantas. Com a finalidade de aprimorar a capacidade de identificar as células transformadas, pode ser desejado empregar um gene de marcador selecionável ou que pode ser verificado, como apresentado anteriormente, com o vetor utilizado para gerar o transformante. No caso em que um marcador selecionável é utilizado, as células transformadas são identificadas dentro da população de células potencialmente transformadas através da exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso em que um marcador que pode ser verificado é utilizado, as células podem ser selecionadas em relação à característica gênica do marcador desejado.
[00114] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou as células que foram classificadas como positivas em um ensaio de verificação, podem ser cultivadas em meio que suporta a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado através da inclusão de substâncias adicionais, tais como reguladores do crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores do crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para iniciar os esforços de regeneração da planta ou após rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então transferido para meio que conduz à formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até que a formação de brotos suficiente tenha ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, estes são transferidos para meio que conduz à formação de raízes. Uma vez que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento adicional e maturidade.
[00115] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético) em uma planta em regeneração, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios de biologia molecular, tais como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tal como a detecção da presença de um produto protéico, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou através de função enzimática; ensaios de partes de plantas, tais como ensaios de folhas ou raízes; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.
[00116] Com a finalidade de exemplo, eventos de integração podem ser analisados por amplificação através da PCR utilizando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para uma sequência de nucleotídeos de interesse. A genotipagem através da PCR é entendida como incluindo, mas não sendo limitada a amplificação através da reação em cadeia da polimerase (PCR) do DNA genômico derivado do tecido vegetal hospedeiro isolado previsto que contenha uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada dentro do genoma, seguida pela clonagem padronizada e da análise de sequência dos produtos da amplificação através da PCR. Os métodos de genotipagem através da PCR foram bem descritos (ver, por exemplo, Rios, G. e outros (2002), Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas de células.
[00117] Uma planta transgênica formada utilizando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma única sequência de DNA recombinante inserida dentro de um cromossomo. A única sequência de DNA recombinante é referida como um "evento transgênico" ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigotas em relação à sequência de DNA inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota em relação a um transgene pode ser obtida através de cruzamento sexual (autocruzamento) de uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência gênica exógena com ela mesma, por exemplo, uma planta F0, para produzir semente Fl. Um quarto da semente Fl produzida será homozigoto em relação ao transgene. A germinação da semente Fl resulta em plantas que podem ser testadas em relação à heterozigosidade, utilizando tipicamente um ensaio de SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio zigosidade).
[00118] Em modalidades particulares, cópias de pelo menos um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético são produzidas em uma célula que contém plastídeo, dentro da qual foi introduzida pelo menos uma (ou mais) molécula(s) de ácido(s) nucleico(s) que compreende(m) uma sequência de nucleotídeos que codifica o pelo menos um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Cada polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode ser expresso partindo de várias sequências de ácidos nucleicos introduzidas em eventos de transformação diferentes ou partindo de uma única sequência de ácido nucleico introduzida em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, um grande número de tais polipeptídeos é expresso sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, um grande número de tais polipeptídeos é expresso sob o controle de vários promotores. Podem ser expressos polipeptídeos isolados que compreendem várias sequências peptídicas, das quais cada uma das sequências peptídicas deve ser direcionada para um plastídeo.
[00119] Em adição à transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, as plantas transgênicas podem ser preparadas através do cruzamento de uma primeira planta que possui pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta que não possui tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode ser introduzida dentro de uma primeira linhagem de planta que é suscetível à transformação, para produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para a introgressão da sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo dentro da segunda linhagem de planta.
Materiais vegetais que compreendem um polipeptídeo direcionado para o peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético
[00120] Em algumas modalidades, é fornecida uma planta, em que a planta compreende uma célula vegetal que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em modalidades particulares, tal planta pode ser produzida através da transformação de um tecido vegetal ou uma célula vegetal e da regeneração de uma planta inteira. Em modalidades adicionais, tal planta pode ser obtida partindo de uma fonte comercial ou através da introgressão de um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético dentro de um germoplasma. Os materiais vegetais que compreendem uma célula vegetal que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético também são fornecidos. Tal material vegetal pode ser obtido partindo de uma planta que compreende a célula vegetal. Em modalidades adicionais, o material vegetal é uma célula vegetal que é incapaz de se regenerar para produzir uma planta.
[00121] Uma planta ou um material vegetal transgênico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético pode em algumas modalidades exibir uma ou mais das características a seguir: expressão do polipeptídeo em uma célula da planta; expressão de uma porção do polipeptídeo em um plastídeo de uma célula da planta; importação do polipeptídeo partindo do citosol de uma célula da planta para dentro de um plastídeo da célula; expressão específica para o plastídeo do polipeptídeo em uma célula da planta; e/ou localização do polipeptídeo em uma célula da planta. Tal planta pode adicionalmente ter uma ou mais características desejáveis sem ser a expressão do polipeptídeo codificado. Tais características podem incluir, por exemplo: resistência a insetos, outras pragas e agentes causadores de doenças; tolerâncias a herbicidas; maior estabilidade, rendimento ou vida de prateleira; tolerâncias ambientais; produção farmacêutica; obtenção do produto industrial; e aprimoramentos nutricionais.
[00122] Uma planta transgênica de acordo com a invenção pode ser qualquer planta capaz de ser transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Consequentemente, a planta pode ser uma dicotiledônea ou uma monocotiledônea. Os exemplos não limitantes de plantas dicotiledôneas que podem ser utilizadas nos presentes métodos incluem Arabidopsis, alfalfa, feijões, brócolis, repolho, cenoura, couve flor, aipo, acelga, algodão, pepino, berinjela, alface, melão, ervilha, pimenta, amendoim, batata, jerimum, rabanete, semente de colza, espinafre, soja, abóbora, beterraba, girassol, tabaco, tomate, melancia. Os exemplos não limitantes de plantas monocotiledôneas que podem ser utilizadas nos presentes métodos incluem milho, Brassica, cebola, arroz, sorgo, trigo, centeio, painço, cana de açúcar, aveia, triticale, Panicum virgatum e turfa. As plantas transgênicas de acordo com a invenção podem ser utilizadas ou cultivadas de qualquer maneira.
[00123] Algumas modalidades fornecem ainda produtos consumíveis que contêm uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético, por exemplo, um produto consumível obtido partindo de uma planta ou uma semente recombinante que contém uma ou mais de tais sequências de nucleotídeos. Os produtos consumíveis que contêm uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético incluem, por exemplo, e sem limitação: produtos alimentícios, farinhas grossas, óleos ou grãos ou sementes trituradas ou inteiras de uma planta que compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. A detecção de uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético em um ou mais consumíveis ou produtos consumíveis é de facto evidência de que o consumível ou o produto consumível foi pelo menos em parte produzido partindo de uma planta que compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em modalidades particulares, um produto consumível da invenção compreende uma quantidade detectável de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético. Em algumas modalidades, tais produtos consumíveis podem ser produzidos, por exemplo, através da obtenção de plantas transgênicas e do preparo de alimento ou produto alimentício partindo das mesmas.
[00124] Em algumas modalidades, uma planta ou uma semente transgênica que compreende um transgene que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos um CTP derivado de Brassica sintético também pode compreender pelo menos outro evento transgênico em seu genoma, incluindo sem limitação: um evento transgênico partindo do qual é transcrita uma molécula de iRNA; um gene que codifica uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene que fornece tolerância ao glifosato); e um gene que contribui para um fenótipo desejável na planta transgênica (por exemplo, maior rendimento, metabolismo de ácidos graxos alterado ou restauração de esterilidade do sexo masculino citoplasmática).
Localização mediada pelo peptídeo de trânsito para o cloroplasto derivado de Brassica sintético de produtos gênicos nos plastídeos
[00125] Algumas modalidades da presente invenção fornecem um método para a expressão e/ou para a localização de um produto gênico em um plastídeo (por exemplo, um cloroplasto). Em modalidades particulares, o produto gênico pode ser um produto de gene marcador, por exemplo, uma molécula fluorescente. A expressão do produto gênico como parte de um polipeptídeo que também compreende um CTP derivado de Brassica sintético pode fornecer um sistema para avaliar as capacidades de localização no plastídeo de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético particular. Em algumas modalidades, a expressão de um produto de gene marcador como parte de um polipeptídeo que contém CTP derivado de Brassica sintético é utilizada para direcionar a expressão do produto de gene marcador para um plastídeo de uma célula em que o polipeptídeo é expresso. Em certas modalidades, tal produto de gene marcador é localizado no(s) plastídeo(s) da célula hospedeira. Por exemplo, o produto de gene marcador pode ser expresso em níveis mais altos no(s) plastídeo(s) do que no citosol ou outras organelas da célula hospedeira; o produto de gene marcador pode ser expresso em níveis muito mais altos no(s) plastídeo(s); o produto de gene marcador pode ser expresso essencialmente apenas no(s) plastídeo(s); ou o produto de gene marcador pode ser expresso inteiramente no(s) plastídeo(s), de forma que a expressão no citosol ou nas organelas que não são plastídeo não possa ser detectada.
[00126] Em algumas modalidades, um polipeptídeo que compreende uma variante funcional de um CTP derivado de Brassica sintético, em que o polipeptídeo é ligado de forma operacional a um produto de gene marcador é utilizado para avaliar as características do peptídeo variante funcional. Por exemplo, a sequência de um CTP derivado de Brassica sintético pode ser variada, por exemplo, através da introdução de pelo menos uma (ou mais) mutação(ões) conservativa(s) no CTP derivado de Brassica sintético e o peptídeo variante resultante pode ser ligado a um produto de gene marcador. Após a expressão em uma célula hospedeira adequada (por exemplo, uma célula em que um ou mais elementos reguladores na construção de expressão são operacionais), a expressão do produto de gene marcador pode ser determinada. Através da comparação da localização subcelular do produto de gene marcador entre a construção de CTP derivado de Brassica sintético de referência-marcador e a construção de peptídeo variante-marcador, pode ser determinado se o peptídeo variante fornece, por exemplo, melhor localização no plastídeo ou localização no plastídeo substancialmente idêntica. Tal variante pode ser considerado uma variante funcional. Através da identificação de variantes funcionais de CTP derivado de Brassica sintético que fornecem melhor localização no plastídeo, as mutações em tais variantes podem ser incorporadas em variantes adicionais de CTPs derivados de Brassica sintéticos. A realização de várias rodadas deste processo de avaliação e a incorporação subsequente de mutações favoráveis identificadas em uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético, podem fornecer um processo iterativo para a otimização de uma sequência de CTP derivado de Brassica sintético. Tais sequências de CTP derivado de Brassica sintético otimizadas e sequências de nucleotídeos que codificam as mesmas, são consideradas parte da presente invenção, podendo ou não tais sequências de CTP derivado de Brassica sintético otimizadas ser adicionalmente otimizadas através de mutação adicional.
[00127] As referências discutidas aqui são fornecidas exclusivamente para sua divulgação antes da data de depósito do presente pedido de patente. Nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que os inventores não são autorizados a antecipar tal divulgação em virtude da invenção anterior.
[00128] Os Exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitantes da divulgação às características ou aos aspectos particulares descritos.
EXEMPLOS Exemplo 1:Planejamento e Produção de Sequências de Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto (TraP) Quimérico
[00129] Os plastídeos são organelas citoplasmáticas encontradas em espécies de plantas superiores e estão presentes em todos os tecidos vegetais. Os cloroplastos são um tipo específico de plastídeo encontrado em tecidos fotossintéticos verdes que são responsáveis pelas funções fisiológicas essenciais. Por exemplo, uma tal função fisiológica primária é a síntese de aminoácidos aromáticos requeridos pela planta. Enzimas codificadas no núcleo são requeridas nesta via biossintética e são transportadas partindo do citoplasma para o interior do cloroplasto. Estas enzimas codificadas pelo núcleo geralmente possuem um peptídeo de trânsito N-terminal que interage com a membrana do cloroplasto para facilitar o transporte do peptídeo para o estroma do cloroplasto. Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447. Após a importação, as peptidases do estroma clivam o peptídeo de trânsito, deixando a proteína funcional madura importada dentro do cloroplasto. Richter S, Lamppa GK. (1999) Estromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147:33 - 43. Os peptídeos de trânsito para o cloroplasto são sequências variáveis que são altamente divergentes em relação ao comprimento, à composição e à organização. Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10:440 - 447. As similaridades de sequência dos peptídeos de trânsito para o cloroplasto divergem significativamente entre as proteínas homólogas de espécies de plantas diferentes. A quantidade de divergência entre os peptídeos de trânsito para o cloroplasto é inesperada dado que as proteínas homólogas obtidas partindo de espécies de plantas diferentes tipicamente compartilham níveis relativamente altos de similaridade de sequência quando são comparadas com a proteína funcional madura processada.
[00130] Novas sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico foram planejadas, produzidas e testadas in planta. Foi mostrado que os novos peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos possuem propriedades de translocação e de processamento eficazes para a importação de proteínas de importância agronômica dentro do cloroplasto. Inicialmente, sequências da proteína 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) nativa provenientes de espécies de plantas diferentes foram analisadas via o programa de computador ChloroP™ para identificar supostas sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto (Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science 8; 978-984), disponível em http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/. Após os peptídeos de trânsito para o cloroplasto nativos serem identificados, uma primeira sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto foi alinhada com uma segunda sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto proveniente de um segundo organismo. A Figura 2 ilustra o alinhamento das sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto de EPSPS de Brassica napus (No de Acesso do NCBI: P17688) e de Arabidopsis thaliana (No. de Acesso do NCBI NP_182055). Utilizando o alinhamento de sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto, novos peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos foram planejados através da combinação da primeira metade da sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto proveniente do primeiro organismo com a segunda metade da sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto proveniente do segundo organismo em uma proporção aproximada de 1:1. Os exemplos de sequências dos peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos recém-planejados são TraP12 (SEQ ID NO: 6) e TraP13 (SEQ ID NO: 8). Estas novas sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico são derivadas das proteínas EPSPS de Brassica napus (No de Acesso do NCBI: P17688) e de Arabidopsis thaliana (No de Acesso do NCBI: NP_182055). A sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 (SEQ ID NO: 6) compreende um N-terminal que é derivado de Brassica napus e o terminal C do peptídeo de trânsito para o cloroplasto é derivado de Arabidopsis thaliana. A sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto TraP13 (SEQ ID NO: 8) compreende um N-terminal que é derivado de Arabidopsis thaliana e o C-terminal do peptídeo de trânsito para o cloroplasto é derivado de Brassica napus. Os peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos foram testados através de vários ensaios que incluíam um sistema de expressão transitória in planta e de forma transgênica como um evento de transformação estável que compreende um elemento de expressão gênica fundido a uma sequência de transgene de importância agronômica.
Exemplo 2: Teste Transitório In Planta de Sequências de Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto (TraP) Quimérico Ensaio Transitório no Tabaco:
[00131] As sequências dos peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 e TraP13 foram inicialmente testadas através de um ensaio transitório in planta. Sequências de polinucleotídeos que codificam as sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 (SEQ ID NO: 5) e TraP13 (SEQ ID NO: 7) foram sintetizadas. Uma sequência ligante (SEQ ID NO: 10) foi incorporada entre as sequências de TraP e a sequência codificadora yfp. As construções resultantes continham duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU era compreendida do promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbi10; Callis, e outros, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493), do gene de fusão TraP-proteína fluorescente amarela (TraP-YFP; Pedido de Patente U.S. 2007/0298412) e da região não traduzida a 3' do ORF 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3'UTR; Patente U.S. N°. 5.428.147). A segunda PTU era compreendida do promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca (promotor do CsVMV; Verdaguer e outros, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139), da fosfinotricina acetil transferase (PAT; Wohlleben e outros, (1988) Gene, 70: 25-37) e da região não traduzida a 3' do ORF 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3'UTR; Huang e outros, (1990) J. Bacteriol., 172:1814-1822). a construção pDAB101981 contém o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 (Figura 3). A construção pDAB101989 contém o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP13 (A Figura 4). Um plasmídeo de controle, 101908, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto a montante do gene yfp foi construído e incluído nos estudos (Figura 5). As construções foram confirmadas através da digestão com enzima de restrição e de sequenciamento. Finalmente, as construções foram transformadas em Agrobacterium tumefaciens e armazenadas na forma de estoques em glicerol.
[00132] Partindo de um estoque em glicerol de Agrobacterium, uma alça cheia de cultura congelada foi inoculada em 2 mL de YPD (100 μg/mL de espectinomicina) em um tubo esterilizado de 14 mL. O meio inoculado foi incubado a 28°C durante toda a noite com agitação a 200 rpm. No dia seguinte aproximadamente 100 μL da cultura foram utilizados para inocular 25 mL de YPD (100 μg/mL de espectinomicina) em um frasco com três chicanas esterilizado de 125 mL e incubados durante toda a noite a 28°C durante toda a noite com agitação a 200 rpm. No dia seguinte as culturas foram diluídas até uma DO600 de 0,5 em ddH2O esterilizada (pH 8,0). A cepa de Agrobacterium diluída foi misturada com uma segunda cepa de Agrobacterium contendo a proteína helper P19 em uma proporção de 1:1. A cultura foi utilizada para infiltração da folha do tabaco através do método de Voinnet O, Rivas S, Mestre P e Baulcombe D., (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus, The Plant Journal, 33:949-956. As plantas de tabaco infiltradas foram colocadas em um Conviron™ ajustado em 16 h de luz a 24°C durante pelo menos três dias até serem analisadas.
Resultados da Microscopia:
[00133] Folhas de tabaco infiltradas com Agrobacterium foram separadas da planta e colocadas dentro de uma placa de Petri com água para prevenir a desidratação. As folhas de tabaco infiltradas foram observadas sob excitação de luz azul com vidros de filtro com passagem longa mantidos no lugar utilizando uma Dark Reader Hand Lamp™ (Clare Chemical Research Co.; Dolores, CO) para identificar áreas não danificadas da folha que estavam expressando de forma bem sucedida as proteínas repórteres YFP. As áreas da folha identificadas especificamente foram dissecadas da folha e montadas em água para obtenção de imagem por microscopia confocal (Leica TCS-SP5 AOBS™; Buffalo Grove, IL). A proteína repórter YFP foi excitada por um limite de laser de 514 nm, utilizando um laser de íon argônio de vários limites. A largura das fendas de detecção foi ajustada utilizando uma amostra de folha de controle que não expressa (escuro) para excluir a autofluorescência da folha de fundo. A autofluorescência da clorofila foi coletada simultaneamente em um segundo canal para comparação direta com o sinal da proteína repórter fluorescente para a determinação da localização no cloroplasto.
[00134] Os resultados de obtenção de imagem por microscopia indicaram que a proteína fluorescente YFP que compreende um peptídeo de trânsito para o cloroplasto TraP12 ou TraP13 acumulada dentro dos cloroplastos se localizava no citoplasma das células de tabaco quando comparada com as proteínas fluorescentes YFP de controle que não se translocavam para dentro dos cloroplastos do citoplasma das células de tabaco (Figura 6 e A Figura 7). Estes resultados de obtenção de imagem por microscopia sugerem que a translocação da proteína YFP para dentro do cloroplasto era um resultado do peptídeo de trânsito para o cloroplasto TraP12 ou TraP13. Como mostrado na Figura 6 e na Figura 7 o sinal fluorescente de YFP fica localizado nos cloroplastos que também fluorescem em vermelho devido à autofluorescência sob as condições de obtenção de imagem por microscopia. Comparativamente, a Figura 8 fornece uma imagem de microscopia de tecido da folha do tabaco infiltrado com a construção de controle pDAB101908 que não contém um peptídeo de trânsito para o cloroplasto. Os cloroplastos nesta imagem fluorescem apenas em vermelho devido à autofluorescência sob as condições de obtenção de imagem por microscopia e são desprovidos de qualquer sinal de fluorescência de YFP que é exibido nas células de tabaco infiltradas com TraP. Ao invés disso, o sinal de fluorescência de YFP nas células de plantas de tabaco de controle é expresso difusamente ao longo de todo o citoplasma das células de plantas de tabaco.
Resultados de Western Blot:
[00135] Amostras das plantas de tabaco infiltradas foram analisadas através de Western blotting. Perfurações das folhas foram coletadas e submetidas à trituração com esferas. Aproximadamente 100-200 mg de material foliar foram misturado com 2 BBs (Daisy; Rogers, AR) e 500 mL de PBST durante 3 minutos em um moinho de esfera Kleco™. As amostras foram então centrifugadas em uma centrífuga a 14.000 x g a 4°C. O sobrenadante foi removido e analisado diretamente através de Western blot ou imunoprecipitado. As imunoprecipitações foram realizadas utilizando o Pierce Direct IP kit™ (Thermo Scientific; Rockford, IL) seguindo o protocolo de fabricante. Aproximadamente, 50 μg de anti-YFP foram ligados à resina. As amostras foram incubadas com a resina durante toda a noite a 4°C. A seguir, as amostras foram lavadas e eluídas na manhã seguinte e preparadas para análise através da combinação de volumes iguais de tampão de amostra de 2X Uréia a 8 M e então da fervura das amostras durante 5 minutos. As amostras fervidas foram corridas em um gel de SDS-Bis Tris a 4-12% em tampão MOPS durante 40 minutos. O gel foi então "transferido" utilizando o Invitrogen iBlot™ (Life Technologies; Carlsbad, CA) seguindo o protocolo de fabricante. A membrana "transferida" foi bloqueada durante 10 minutos utilizando 5% de leite em pó desnatado em solução de PBS-Tween. A membrana foi investigada com o anticorpo primário (anti-GFP monoclonal em coelho) utilizado a uma diluição de 1:1000 nos 5% de leite em pó desnatado em solução de PBS-Tween durante 1 hora. A seguir, a membrana foi lavada três vezes durante cinco minutos com PBS-Tween para remover todo o anticorpo primário não ligado. A membrana foi investigada com um anticoelho monoclonal secundário em anticorpo caprino (Life Technologies) utilizado a uma diluição de 1:1000, durante 60 minutos. A membrana foi lavada como descrito anteriormente e revelada através da adição do substrato Themo BCIP/NBT. Foi permitido que o substrato colorimétrico fosse revelado durante 5-10 minutos e então os blots foram lavados com água antes de serem secos.
[00136] Os resultados de Western blot indicaram que a proteína YFP era expressa nas células de tabaco infiltradas. Tanto os tecidos foliares de plantas de tabaco infiltrados com pDAB101981 quanto com pDAB101989 expressavam a proteína YFP como indicado pela presença de uma banda de proteína que reagiu com os anticorpos para YFP e era equivalente em tamanho à banda da proteína YFP obtida partindo do tecido foliar de planta de tabaco infiltrado com a construção de YFP de controle. Além disso, estes resultados indicaram que os peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP foram processados e clivados da proteína YFP. As construções de TraP12-YFP e TraP13-YFP expressam uma banda de proteína pré- processada que é maior em peso molecular que a proteína YFP de controle. A presença de bandas no Western blot que são equivalentes em tamanho à YFP de controle indica que as sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto TraP12 e TraP13 foram processadas, dessa maneira reduzindo o tamanho da YFP até um tamanho de peso molecular que é equivalente ao controle de YFP.
Ensaio Transitório no Protoplasto do Milho:
[00137] As sequências de polinucleotídeos que codificam o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 (SEQ ID NO: 5) e a sequência ligante (SEQ ID NO: 10) foram clonadas a montante do gene da proteína fluorescente amarela e incorporadas dentro da construção para teste através do ensaio transitório no protoplasto do milho in planta. A construção resultante continha a unidade de transcrição de planta a seguir (PTU). A primeira PTU era compreendida do promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (promotor ZmUbi1; Christensen, A., Sharrock R. e Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), do gene de fusão de TraP-proteína fluorescente amarela (TraP12-YFP; Pedido de Patente U.S. 2007/0298412) e da região não traduzida a 3' da Peroxidase 5 de Zea mays (ZmPer5 3'UTR; Patente U.S. N°. 6384207). A construção foi confirmada através da digestão com enzima de restrição e do sequenciamento.
[00138] Sementes de Zea mays var. B104 tiveram a superfície esterilizada através da agitação vigorosa em 50% de Clorox (3% de hipoclorito de sódio), contendo 2-3 gotas de Tween 20, durante aproximadamente 20 minutos. As sementes foram lavadas vigorosamente com água destilada esterilizada. As sementes estilizadas foram plaqueadas sobre ^ de meio MS em Phytatrays ou caixas de tipo similar e foi permitido que crescessem na escuridão (28°C) durante 12 até 20 dias. Um ensaio transitório no protoplasto do milho foi utilizado para obter e transfectar protoplastos do milho de folhas de milho B104. Este ensaio no protoplasto do milho é uma modificação do sistema descrito por Yoo, S.-D., Cho, Y.-H. e Sheen, J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2:1565-1572. As soluções foram preparadas como descrito por Yoo e outros (2007), com a exceção de que a concentração de manitol utilizada para os experimentos seguintes foi alterada para 0,6 M.
[00139] A transfecção de 100 até 500 μL de protoplastos (1-5x105) foi concluída através da adição dos protoplastos a um tubo de microcentrífuga de 2 mL contendo aproximadamente 40 μg de DNA plasmideal (pDAB106597), à temperatura ambiente. O volume de DNA foi mantido preferencialmente em aproximadamente 10% do volume de protoplasto. Os protoplastos e o DNA foram ocasionalmente misturados durante um período de incubação de 5 minutos. Um volume igual de solução de PEG foi lentamente adicionado aos protoplastos e ao DNA, 2 gotas por vez com mistura entre a adição das gotas de solução de PEG. Foi permitido que os tubos fossem incubados durante aproximadamente 10 minutos com agitação suave ocasional. A seguir, 1 mL de solução de W5+ foi adicionado e misturado através da inversão do tubo várias vezes. O(s) tubo(s) foi(ram) centrifugado(s) durante 5 minutos a 75 x g a uma temperatura de 4°C. Finalmente, o sobrenadante foi removido e a pelota foi ressuspensa em 1 mL de solução de WI e os protoplastos foram colocados dentro de uma placa de Petri pequena (35 x 10 mm) ou dentro de placas de multi-poços com 6 poços e incubados durante toda a noite na escuridão à temperatura ambiente. A fluorescência de YFP foi observada por microscopia após 12 horas de incubação. As condições de microscopia descritas anteriormente foram utilizadas para a obtenção de imagem.
[00140] Os resultados de obtenção de imagem por microscopia indicaram que a proteína fluorescente YFP que compreende um peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 se acumulava dentro dos cloroplastos localizados no citoplasma das células de tabaco quando comparadas com as proteínas fluorescentes YFP de controle que não se translocava para dentro dos cloroplastos do citoplasma das células de tabaco (Figura 9). Estes resultados de obtenção de imagem por microscopia sugerem que a translocação da proteína YFP para dentro do cloroplasto era um resultado do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12.
Exemplo 3: Sequências do Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto (TraP) Quimérico para a Expressão de Transgenes de Importância Agronômica em Arabidopsis
[00141] Uma única mutação de aminoácido (G96A) na enzima 5-enolpiruvilshikimato 3-fosfato sintase (EPSP sintase) de Escherichia coli pode resultar em insensibilidade ao glifosato (Padgette e outros, (1991); Eschenburg e outros, (2002); Priestman e outros, (2005); Haghani e outros, (2008)). Embora esta mutação confira tolerância ao glifosato, é sabido que também afeta de forma adversa a ligação da EPSP sintase com seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP). A alteração resultante na eficiência de ligação ao substrato pode tornar uma enzima mutada inadequada para o fornecimento de tolerância ao glifosato in planta.
[00142] O banco de dados NCBI Genbank foi verificado in silico em relação à proteína EPSP sintase e sequências de polinucleotídeos que contêm naturalmente uma alanina em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase como aquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima (Padgette e outros, (1991); Eschenburg e outros, (2002); Priestman e outros, (2005); Haghani e outros, (2008)).
[00143] Uma enzima que foi identificada como contendo uma alanina natural nesta posição era DGT-28 (GENBANK ACC NO: ZP_06917240.1) de Streptomyces sviceus ATCC29083. A mineração de dados in silico adicional revelou três outras enzimas únicas de Streptomyces com maior homologia a DGT-28; DGT-31 (GENBANK ACC NO: YP_004922608.1); DGT-32 (GENBANK ACC NO: ZP_04696613); e DGT-33 (GENBANK ACC NO: NC_010572). Cada uma destas enzimas contém uma alanina natural em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase como aquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima. Figura 1.
[00144] Devido ao fato de que as proteínas EPSP sintases de organismos diferentes são de comprimentos diferentes, a numeração da mutação para a versão de E. coli da enzima EPSP sintase não necessariamente corresponde à numeração da mutação para as enzimas EPSP sintases dos outros organismos. Estas enzimas EPSP sintases identificadas não foram previamente caracterizadas em relação à tolerância ao glifosato ou à afinidade ao substrato PEP. Além disso, estas enzimas EPSP sintases representam uma nova classe de enzimas EPSP sintases e não contêm quaisquer motivos de sequência que foram utilizados para caracterizar as enzimas EPSP sintases de Classe I (sequências derivadas de plantas adicionalmente descritas na Patente U.S. N°. RE39247), II (sequências derivadas de bactérias adicionalmente descritas na Patente U.S. N°. RE39247) e III (sequências derivadas de bactérias adicionalmente descritas no Pedido de Patente Internacional WO 2006/110586) previamente descritas.
[00145] As novas enzimas DGT-14, DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33 foram caracterizadas em relação à tolerância ao glifosato e à afinidade ao substrato PEP por comparação com enzimas EPSP sintases de Classe I. As enzimas de Classe I a seguir; DGT-1 de Glicina max, DGT-3 de Brassica napus (GENBANK ACC NO: P17688) e DGT-7 de Triticum aestivum (GENBANK ACC NO: EU977181) eram para comparação. As enzimas EPSP sintases de Classe I e variantes mutantes das mesmas foram sintetizados e avaliados. Uma mutação introduzida nas enzimas EPSP sintases de plantas consistia da mutação de Glicina para Alanina feita dentro da enzima EPSP sintase em uma localização similar que aquela da mutação G96A da versão de E. coli da enzima. Em adição, mutações de Treonina para Isoleucina e Prolina para Serina foram introduzidas dentro destas enzimas EPSP sintases de Classe I em posições análogas aquela do aminoácido 97 (T para I) e aminoácido 101 (P para S) na EPSP sintase de E. coli como descrito em Funke e outros, (2009).
DGT14:
[00146] Plantas de Arabidopsis T1 transgênicas contendo os peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 e TraP13 fundidos ao transgene dgt-14 foram produzidas como descrito no Pedido de Patente U.S. N°. 11/975.658. As plantas transgênicas foram borrifadas com taxas de glifosato diferentes. Uma distribuição de concentrações variáveis de taxas de glifosato, incluindo taxas elevadas, foi aplicada neste estudo para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). A taxa de glifosato de uso no campo 1X típica é 1.120 g ae/ha. As plantas de Arabidopsis T1 que foram utilizadas neste estudo variavam em relação ao número de cópias para o transgene dgt-14. As plantas de Arabidopsis T1 com dgt-14 com baixo número de cópias foram identificadas utilizando ensaios de confirmação molecular e foram autopolinizadas e utilizadas para produzir plantas T2. A Tabela 1 mostra as plantas transgênicas com resistência por dgt-14, quando comparadas com plantas de controle que compreendem um gene de resistência ao herbicida glifosato, dgt-1 (como descrito no N°. de Depósito da Patente U.S. 12558351).
[00147] Os transformantes de Arabidopsis T1 foram primeiramente selecionados do fundo de semente não transformada utilizando um esquema de selação com glufosinato. Três superfícies planas ou 30.000 sementes, foram analisadas para cada construção T1. As plantas T1 selecionadas foram caracterizadas molecularmente e as plantas foram subsequentemente transplantadas em vasos individuais e borrifadas com várias taxas de glifosato comercial como descrito anteriormente. A resposta à dose destas plantas é apresentada em termos de % de danos visuais 2 semanas após o tratamento (WAT). Os dados são apresentados nas tabelas a seguir que exibem plantas individuais mostrando pouco ou nenhum dano (<20%), dano moderado (20-40%) ou dano grave (>40%). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada construção utilizada para a transformação com Arabidopsis. A faixa na resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato.
[00148] O nível de resposta da planta variou nas plantas de Arabidopsis T1. Esta variância pode ser atribuída ao fato de que cada planta representa um evento de transformação independente e assim o número de cópias do gene de interesse varia de planta para planta. Uma média de danos na população geral pela taxa é apresentada na Tabela 1 para demonstrar a tolerância fornecida por cada uma das construções de dgt-14 ligadas com o peptídeo de trânsito para o cloroplasto TraP12 v2 ou TraP13 v2 versus os controles de dgt-1 e do tipo selvagem não transformados para taxas variáveis de glifosato. Os eventos continham dgt-14 ligado com TraP12 v2 (SEQ ID NO: 11) que fica contido na construção pDAB105528 (Figura 10) e TraP13 v2 (SEQ ID NO: 12) que fica contida na construção pDAB105529 (Figura 11). Os dados provenientes da seleção com glifosato de plantas T1 demonstraram que quando dgt-14 estava ligado com estes peptídeos de trânsito para o cloroplasto, era fornecida uma tolerância robusta a altos níveis de glifosato. Comparativamente, os controles não transformados (do tipo selvagem) não forneceram tolerância ao tratamento de altas concentrações de glifosato quando tratados com taxas similares de glifosato. Em adição, houve casos em que os eventos que foram mostrados como contendo três ou mais cópias de dgt-14 eram mais suscetíveis às taxas elevadas de glifosato. Estes casos são demonstrados dentro da porcentagem de faixa de danos visuais mostrada na Tabela 1. É provável que a presença de altos números de cópias dos transgenes dentro das plantas de Arabidopsis resulte no silenciamento do transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultaram na sensibilidade ao glifosato, apesar da presença do transgene dgt-14. Tabela 1. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparada a uma população segregante de dgt-1 (T2) e um controle não transformado. % de danos visuais duas semanas após a aplicação.
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[00149] As plantas de Arabidopsis T1 selecionadas que foram identificadas como contendo baixos números de cópias de inserções do transgene (1-3 cópias) foram autofertilizadas para produzir uma segunda geração para avaliação adicional de tolerância ao glifosato. As plantas de Arabidopsis de segunda geração (T2) que continham 1-3 cópias do transgene dgt-14 fundidas aos peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 e TraP13 foram adicionalmente caracterizadas em relação à tolerância ao glifosato e à tolerância ao glufosinato (resistência ao glufosinato indicava que o cassete de expressão de PAT estava intacto e não sofreu rearranjos durante o autocruzamento das plantas T1). Na geração T2 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para testar cada evento e, portanto, foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. As plantas hemizigotas contêm dois alelos diferentes em um lócus quando comparadas às plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um lócus. O número de cópias e os níveis de ploidia das plantas T2 foram confirmados utilizando protocolos de análise molecular. Similarmente, o glifosato foi aplicado utilizando os métodos e as taxas que foram descritos anteriormente. A resposta à dose das plantas é apresentada em termos de % de danos visuais duas semanas após o tratamento (WAT). Os dados são apresentados na forma de um histograma de indivíduos que exibem pouco ou nenhum dano (<20%), dano moderado (20-40%) ou dano grave (>40%). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada construção utilizada para a transformação com Arabidopsis. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (cv. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato. Em adição, plantas que compreendem um gene de resistência ao herbicida glifosato, dgt-1 (como descrito no N°. de Depósito da Patente U.S. 12558351) foram incluídas como um controle positivo.
[00150] Na geração T2 eventos de dgt-14 tanto de cópia única quanto de baixo número de cópias (duas ou três cópias) foram caracterizados em relação à tolerância ao glifosato. Uma média de danos na população geral por taxa é apresentada na Tabela 2 para demonstrar a tolerância fornecida por cada uma das construções de dgt-14 ligadas com um peptídeo de trânsito para o cloroplasto versus os controles de dgt-1 e do tipo selvagem não transformados para taxas variáveis de glifosato. Os eventos de geração T2 continham dgt-14 ligado com TraP12 v2 (pDAB105528) e TraP13 v2 (pDAB105529). Ambos estes eventos são altamente resistentes ao glifosato. Os resultados indicaram que a faixa de danos para as plantas de Arabidopsis T2 era menor que 20% para todas as concentrações de glifosato que foram testadas. Comparativamente, os controles não transformados (ou do tipo selvagem) não forneceram tolerância ao tratamento de altas concentrações de glifosato quando tratados com taxas similares de glifosato. De forma geral, os resultados mostraram que plantas contendo e expressando DGT-14 fundido às proteínas de peptídeo de trânsito quimérico TraP12 e TraP13 forneciam nível resistência comercial ao glifosato em níveis de até 3 vezes a taxa de campo (1120 g ae/ha). Tabela 2. Resposta de Arabidopsis T2 transformadas com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparadas a uma população segregante de dgt-1 (T2) e um controle não transformado. % de danos visuais duas semanas após a aplicação. Os dados representam uma linhagem com uma única cópia selecionada de cada construção que se segregou na forma de um único lócus na verificação de herdabilidade.
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[00151] Plantas de Arabidopsis T2 selecionadas aleatoriamente que foram identificadas como contendo baixos números de cópias de inserções do transgene (1-3 cópias) foram autofertilizadas para produzir uma terceira geração para avaliação adicional de tolerância ao glifosato. Sementes de Arabidopsis da terceira geração (T3) foram plantadas e avaliadas em relação à tolerância ao glifosato utilizando os mesmos protocolos que os descritos anteriormente. Os Eventos testados na geração T3 continham réplicas de cada linhagem que eram homozigotas (como determinado através da utilização de um controle de resistência ao glufosinato para identificar se qualquer uma das plantas desenvolvidas exibia segregação dos transgenes). Estes Eventos foram analisados através de LC-MS-MS para confirmar que as plantas expressavam a proteína DGT-14. Os resultados da geração T3 para a média de danos na população geral pela taxa de glifosato são apresentados na Tabela 3 que mostra a tolerância ao glifosato fornecida por cada uma das construções de dgt-14 para taxas variáveis de glifosato. Os exemplos de Eventos T3 resistentes compreendiam dgt-14 ligado com TraP12 v2 (pDAB105528) e TraP13 v2 (pDAB105529). Ambos estes eventos são altamente resistentes ao glifosato. Os resultados indicaram que a faixa de danos para as plantas Arabidopsis T3 era menor que 20% para todas as concentrações de glifosato que foram testadas. Comparativamente, os controles não transformados (ou do tipo selvagem) não forneceram tolerância ao tratamento de altas concentrações de glifosato quando tratados com taxas similares de glifosato. De forma geral, os resultados mostraram que plantas contendo e expressando DGT-14 forneciam nível de resistência ao glifosato comercial em níveis de até 3 vezes a taxa de campo (1120 g ae/ha).Tabela 3. Resposta de Arabidopsis T3 transformadas com dgt-14 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparadas a uma população segregante de dgt-1 (T2) e um controle não transformado. % de danos visuais duas semanas após a aplicação. Os dados representam uma população com uma única cópia selecionada de cada construção que se segregou na forma de um único lócus na verificação de herdabilidade de T2.
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DGT-28
[00152] A sequência de polinucleotídeos de dgt-28 v5 otimizada para plantas dicotiledôneas recém-planejadas está listada na SEQ ID NO: 18. A sequência de polinucleotídeos de dgt-28 v6 otimizada para plantas monocotiledôneas recém-planejadas está listada na SEQ ID NO: 19; esta sequência foi ligeiramente modificada através da inclusão de uma alanina na segunda posição de aminoácido para introduzir um sítio de enzima de restrição. As sequências de DNA resultantes possuem um grau mais alto de diversidade de códons, uma composição de bases desejável, contêm sítios de reconhecimento de enzimas de restrição colocados estrategicamente e não possuem sequências que poderiam interferir na transcrição do gene ou na tradução do produto de mRNA.
[00153] A síntese de fragmentos de DNA que compreendem a SEQ ID NO: 18 e a SEQ ID NO: 19 contendo sequências adicionais, tais como 6 términos de quadro (códons de término localizados em todos os seis quadros de leitura que são adicionados na extremidade a 3' da sequência codificadora) e um sítio de restrição a 5' para a clonagem foi realizada por fornecedores comerciais (DNA2.0, Menlo Park, CA). A molécula de ácido nucleico sintética foi então clonada dentro dos vetores de expressão e transformada em plantas ou bactérias como descrito nos Exemplos a seguir.
[00154] Estratégias de otimização de códons similares foram utilizadas para o planejamento de dgt-1, dgt-3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I; P178S), dgt-7 v4 (T168I; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3 e dgt-31 v3. A versão com códons otimizados destes genes está listada na forma das SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, respectivamente.
[00155] Construção de Vetores Binários de Planta. Métodos de clonagem padronizados foram utilizados na construção de vetores de entrada contendo uma sequência de polinucleotídeos do peptídeo de trânsito para o cloroplasto ligada a dgt-28 na forma de uma fusão em quadro. Os vetores de entrada contendo um peptídeo de trânsito (TraP) fundido a dgt-28 foram montados utilizando a IN-FUSION™ Advantage Technology (Clontech, Mountain View, CA). Como um resultado da fusão, o primeiro aminoácido, metionina, foi removido de dgt-28. Os peptídeos de trânsito TraP4 v2 (SEQ ID NO: 28), TraP5 v2 (SEQ ID NO: 29), TraP8 v2 (SEQ ID NO: 30), TraP9 v2 (SEQ ID NO: 31), TraP12 v2 (SEQ ID NO: 32) e TraP13 v2 (SEQ ID NO: 33) foram cada um sintetizados por DNA2.0 (Menlo Park, CA) e fundidos ao fragmento da extremidade a 5' de dgt-28, até e incluindo um único sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição AccI.
[00156] Os plasmídeos binários que continham os vários cassetes de expressão de TraP e dgt-28 eram controlados pelo promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10 v2; Callis, e outros, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493) e flanqueados pela região não traduzida a 3' do quadro aberto de leitura vinte e três de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; U.S. Pat. N°. 5,428,147).
[00157] Os cassetes de expressão de TraP e dgt-28 montados foram engenheirados utilizando a GATEWAY® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em plantas através da transformação de plantas mediada por Agrobacterium. As endonucleases de restrição foram obtidas na New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) e a T4 DNA Ligase (Invitrogen) foi utilizada para a ligação do DNA. As reações de Gateway foram realizadas utilizando a mistura de enzimas GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) para a montagem de um vetor de entrada no interior de um único vetor de destinação que continha o cassete de marcador selecionável com o promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca (CsVMV v2; Verdaguer e outros, (1996) Plant Mol. Biol., 31: 1129-1139) - DSM-2 (Pedido de Patente U.S. N°. 2007/086813) - região não traduzida a 3' do quadro aberto de leitura 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6; Huang e outros, (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822). As preparações de plasmídeo foram realizadas utilizando o NUCLEOSPIN® Plasmid Kit (Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, PA) ou o Plasmid Midi Kit (Qiagen) seguindo as instruções dos fabricantes. Os fragmentos de DNA foram isolados utilizando o QIAquick™ Gel Extraction Kit (Qiagen) após eletroforese em gel de agarose Tris-acetato.
[00158] Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente verificadas através da digestão por restrição de DNA de miniprep. O DNA plasmideal de clones selecionados foi sequenciado por um fornecedor de sequenciamento comercial (Eurofins™ MWG Operon, Huntsville, AL). Os dados de sequência foram montados e analisados utilizando o software SEQUENCHER™ (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
[00159] As construções binárias a seguir expressam as várias sequências gênicas de fusão de TraP:dgt-28: pDAB107527 contém TraP4 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 34); pDAB105530 contém TraP5 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 35); pDAB105531 contém TraP8 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 36); PDAB105532 contém TraP9 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 37); pDAB105533 contém TraP12 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 38); e pDAB105534 contém TraP13 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO: 39). A sequência de dgt-28 v5 de pDAB105534 foi modificada na qual o primeiro códon (GCA) foi trocado por (GCT).
[00160] Construção de Vetores Binários de Planta Adicionais. As estratégias de clonagem similares àquelas descritas anteriormente foram utilizadas para construir plasmídeos binários que contêm dgt-31, dgt-32, dgt-33, dgt-1, dgt-3 e dgt-7.
[00161] Os genes derivados de micro-organismos; dgt-31, dgt-32 e dgt-33, foram fundidos com peptídeos de trânsito para o cloroplasto diferentes que aqueles descritos anteriormente. Os peptídeos de trânsito para o cloroplasto a seguir foram utilizados; TraP14 v2 (SEQ ID NO: 40), TraP23 v2 (SEQ ID NO: 41), TraP24 v2 (SEQ ID NO: 42). pDAB107532 contém dgt-32 v3 fundido a TraP14 v2 (SEQ ID NO: 43), pDAB107534 contém dgt-33 v3 fundido a TraP24 v2 (SEQ ID NO: 44) e a última construção contém dgt-31 v3 fundido a TraP23 v2 (SEQ ID NO: 45). Os cassetes de expressão de dgt eram controlados pelo promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10 promotor v2) e flanqueados pela região não traduzida a 3' do quadro aberto de leitura vinte e três de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1). Um cassete com marcador selecionável DSM-2 contendo o promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca (CsVMV v2) - DSM-2 - região não traduzida a 3' do quadro aberto de leitura um de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3' UTR v6) também estava presente no vetor binário.
[00162] São construídos binários adicionais em que dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33 v3 são fundidos às sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto descritas anteriormente. Por exemplo, a sequência de TraP8 v2 é fundida a dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33 v3 e clonada dentro de vetores binários como descrito anteriormente.
[00163] Foram construídos vetores binários contendo os genes de Classe I (dgt-1, dgt-3 e dgt-7). Os vetores binários a seguir foram construídos e transformados em plantas: pDAB4104, que contém a sequência de dgt-1 v4 como descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2011/0124503, que é flanqueada pelas sequências de Osmotin de Nicotiana tabacum como descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. N°. 2009/0064376; pDAB102715; pDAB102716;pDAB102717; e pDAB102785. Os vários peptídeos de trânsito para o cloroplasto TraP que foram fundidos a dgt-28, dgt-31, dgt-32 e dgt-33 não foram adicionados aos genes de Classe I, uma vez que estas sequências derivadas de plantas possuem peptídeos de trânsito para o cloroplasto de plantas nativos. Estes vetores são descritos em maiores detalhes na Tabela 4.Tabela 4. Descrição dos vetores binários que contêm um gene da EPSP sintase de Classe I (isto é, dgt-1, dgt-3 ou dgt-7).
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[00164] Transformação de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis foi transformada utilizando o método de imersão floral de Clough e Bent (1998). Uma colônia de Agrobacterium selecionada contendo um dos plasmídeos binários descritos anteriormente foi utilizada para inocular uma ou mais pré-culturas de 100 mL de caldo YEP contendo espectinomicina (100 mg/L) e canamicina (50 mg/L). A cultura foi incubada durante toda a noite a 28°C com agitação constante a 225 rpm. As células foram peletizadas em aproximadamente 5000 xg durante 10 minutos à temperatura ambiente e o sobrenadante resultante foi descartado. A pelota de células foi suavemente ressuspensa em 400 mL de meio de imersão contendo: 5% (p/v) de sacarose, 10 μg/L de 6-benzilaminopurina e 0,04% de Silwet™ L-77. Plantas com aproximadamente 1 mês de idade foram imersas dentro do meio durante 5-10 minutos com agitação suave. As plantas foram deitadas sobre suas laterais e cobertas com sacos de plástico transparentes ou opacos durante 2-3 horas e então colocadas voltadas para cima. As plantas foram crescidas a 22°C, com um fotoperíodo de 16 horas de luz / 8 horas de escuridão. Aproximadamente 4 semanas após a imersão, as sementes foram colhidas.
[00165] Seleção de Plantas Transformadas. Foi permitido que uma semente T1 recém-coletada [contendo os cassetes de expressão de dgt e DSM-2] secasse durante 7 dias à temperatura ambiente. A semente T1 foi plantada em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm, cada uma recebendo uma alíquota de 200 mg de sementes T1 estratificadas (~10.000 sementes) que foram previamente suspensas em 40 mL de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C durante 2 dias para completar os requerimentos de dormência e garantir a germinação de sementes sincronizada.
[00166] Sunshine Mix LP5 foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então foi permitido que drenasse por gravidade. Cada alíquota de 40 mL de sementes estratificadas foi plantada igualmente sobre a vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de umidade durante 4-5 dias. As cúpulas foram removidas 1 dia antes da seleção de transformantes inicial utilizando spray de glufosinato pós-emergência (selecionado em relação ao gene DSM-2 co-transformado).
[00167] Sete dias após o plantio (DAP) e novamente 11 DAP, as plantas T1 (cotilédone e estágio de 2-4 folhas, respectivamente) foram borrifadas com uma solução a 0,2% de herbicida Liberty (200 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de spray de 10 mL/bandeja (703 L/ha) utilizando uma ponteira de spray de ar comprimido DeVilbiss para fornecer uma taxa eficiente de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicação. Os sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificados 4-7 dias após a pulverização final e transplantados individualmente para dentro de vasos de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de plantação (Metro Mix 360). As plantas transplantadas foram cobertas com cúpulas de umidade durante 3-4 dias e colocadas em uma câmara de crescimento a 22°C como antes ou transferidas diretamente para a estufa. As cúpulas foram subsequentemente removidas e as plantas cultivadas na estufa (22±5°C, 50±30% de UR, 14 h de luz:10 de escuridão, mínimo de 500 μE/m2s1 de luz natural + suplementar). A análise de confirmação molecular foi completada nas plantas T1 sobreviventes para confirmar que o gene de tolerância ao glifosato tinha se integrado de forma estável dentro do genoma das plantas.
[00168] Confirmação Molecular. A presença dos transgenes dgt-28 e DSM-2 dentro do genoma de plantas de Arabidopsis que foram transformadas com pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533 ou pDAB105534 foi confirmada. A presença destas sequências de polinucleotídeos foi confirmada através de ensaios com sonda de hidrólise, PCR do cassete de expressão gênica (também descrita como PCR de unidade de transcrição de planta -- PTU PCR), análise de Southern blot e análises de PCR por Transcrição Inversa Quantitativa.
[00169] As plantas de Arabidopsis T1 foram inicialmente verificadas através de um ensaio com sonda de hidrólise, análogo a TAQMAN™, para confirmar a presença dos transgenes DSM-2 e dgt-28. Os eventos foram verificados através da PCR do cassete de expressão gênica para determinar se o cassete de expressão de dgt tinha se integrado completamente dentro dos genomas das plantas sem rearranjo. Os dados gerados partindo destes estudos foram utilizados para determinar o número de cópias do transgene e identificar eventos de Arabidopsis selecionados para autofertilização e progresso para a geração T2. As plantas de Arabidopsis T2 desenvolvidas foram também verificadas através de ensaios com sonda de hidrólise para confirmar a presença e para estimar o número de cópias dos genes DSM-2 e dgt dentro do cromossomo da planta. Finalmente, um ensaio de Southern blot foi utilizado para confirmar o número de cópias estimado em um subconjunto das plantas de Arabidopsis T1.
[00170] Ensaios similares foram utilizados para confirmar a presença do transgene dgt-1 partindo de plantas transformadas com pDAB4101, a presença do transgene dgt-32 partindo de plantas transformadas com pDAB107532, a presença do transgene dgt-33 partindo de plantas transformadas com pDAB107534, a presença do transgene dgt-3 partindo de plantas transformadas com pDAB102715, a presença do transgene dgt-3 partindo de plantas transformadas com pDAB102716, a presença do transgene dgt-3 partindo de plantas transformadas com pDAB102717 e a presença do transgene dgt-7 partindo de plantas transformadas com pDAB102785.
[00171] Ensaio com Sonda de Hidrólise. O número de cópias foi determinado nas plantas de Arabidopsis T1 e T2 utilizando o ensaio com sonda de hidrólise descrito a seguir. Plantas com números variáveis de transgenes foram identificadas e avançadas para estudos de tolerância ao glifosato subsequentes.
[00172] Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 poços e liofilizadas durante 2 dias. A maceração do tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO™ e esferas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Após a maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento utilizando o kit Biosprint™ 96 Plant (Qiagen™, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi quantificado através do QUANT-IT™ PICO GREEN DNA ASSAY KIT (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA genômico quantificado foi ajustado em aproximadamente 2 ng/μL para o ensaio com sonda de hidrólise utilizando um manipulador de líquido automatizado BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown, MD). A determinação do número de cópias do transgene através do ensaio com sonda de hidrólise foi realizada através de PCR em tempo real utilizando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram planejados para DSM-2, dgt-28 e o gene de referência interna, TAFII15 (Genbank ID: NC 003075; Duarte e outros, (201) BMC Evol. Biol., 10:61).
[00173] Para a amplificação, a mistura de LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada em uma concentração final de 1X em uma reação multiplex de 10 μL de volume contendo 0,1 μM de cada iniciador para DSM-2 e dgt-28, 0,4 μM de cada iniciador para TAFII15 e 0,2 μM de cada sonda. Tabela 5. Uma reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C durante 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram corridas e os valores médios de limiar de Ciclos (Ct) foram utilizados para a análise de cada amostra. A análise dos dados da PCR em tempo real foi realizada utilizando a licença 1.5 do software LIGHTCYCLER™ utilizando o módulo quant relativo e é baseada no método de ΔΔCt. Para isto, uma amostra de DNA genômico proveniente de um calibrador de cópia única e verificação de duas cópias conhecidas foram incluídas em cada corrida. Os resultados do número de cópias da verificação com sonda de hidrólise foram determinados para as plantas de Arabidopsis transgênicas T1 e T2.Tabela 5. Informação de iniciadores e sonda para o ensaio com sonda de hidrólise de DSM-2, dgt-28 e gene de referência interna (TAFII15).
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[00174] Confirmação da Integração de dgt-28 Através da Análise de Southern Blot. A análise de Southern blot foi utilizada para estabelecer o padrão de integração do fragmento de DNA da fita T inserido e identificar eventos que continham dgt-28. Os dados foram gerados para demonstrar a integração e a integridade dos insertos do transgene dentro do genoma de Arabidopsis. Os dados de Southern blot foram utilizados para identificar a integração simples de uma cópia intacta do DNA da fita T. A análise de Southern blot detalhada foi realizada utilizando uma sonda amplificada pela PCR específica para o cassete de expressão gênica de dgt-28. A hibridização da sonda com o DNA genômico que foi digerido com enzimas de restrição específicas identificou fragmentos de DNA genômico de pesos moleculares específicos, cujos padrões foram utilizados para identificar eventos transgênicos T1 com inserção simples de comprimento completo para avançar para a geração seguinte.
[00175] Amostras de tecido foram coletadas em tubos cônicos de 2 mL (Eppendorf™) e foram liofilizadas durante 2 dias. A maceração do tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECKO™ e esferas de tungstênio. Após a maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado utilizando um procedimento de isolamento com CTAB. O DNA genômico foi adicionalmente purificado utilizando o kit Qiagen™ Genomic Tips. O DNA genômico foi quantificado através do kit QUANT-IT™ PICO GREEN DNA ASSAY (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA genômico quantificado foi ajustado em 4 μg para uma concentração coerente.
[00176] Para cada amostra, 4 μg de DNA genômico foram vigorosamente digeridos com a enzima de restrição SwaI (New England Biolabs, Beverley, MA) e incubados a 25°C durante toda a noite, então NsiI foi adicionada à reação e incubada a 37°C durante 6 horas. O DNA digerido foi concentrado por precipitação com Quick Precipitation Solution™ (Edge Biosystems, Gaithersburg, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi então resuspenso em 25 μL de água a 65°C durante uma hora. As amostras ressuspensas foram carregadas sobre um gel de agarose a 0,8% preparado em 1X TAE e submetido à eletroforese durante toda a noite a 1,1 V/cm em tampão 1X TAE. O gel foi sequencialmente submetido à desnaturação (0,2 M de NaOH / 0,6 M de NaCl) durante 30 minutos e à neutralização (0,5 M de Tris-HCl (pH 7,5) / 1,5 M de NaCl) durante 30 minutos.
[00177] A transferência de fragmentos de DNA para membranas de nylon foi realizada através da obtenção de uma estrutura em forma de pavio passando passivamente a solução de 20 X SSC durante toda a noite através do gel sobre a membrana de transferência IMMOBILON™ NY+ tratada (Millipore, Billerica, MA) através da utilização de um pavio de papel cromatográfico e toalhas de papel. Após a transferência, a membrana foi brevemente lavada com 2X SSC, ligada de forma cruzada com o STRATALINKER™ 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) e assada a vácuo a 80°C durante 3 horas.
[00178] Os blots foram incubados com solução de pré-hibridização (Perfect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) durante 1 hora a 65°C em garrafas giratórias de vidro utilizando uma incubadora de hibridização modelo 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). As sondas foram preparadas partindo de um fragmento de PCR contendo a sequência codificadora inteira. O amplicon da PCR foi purificado utilizando o kit de extração do gel QIAEX™ II e marcado com α32P-dCTP através do kit de marcação Random RT Prime IT™ (Stratagene, La Jolla, CA). Os blots foram hibridizados durante toda a noite a 65°C com a sonda desnaturada adicionada diretamente ao tampão de hibridização até aproximadamente 2 milhões de contagens por blot por mL. Após a hibridização, os blots foram sequencialmente lavados a 65°C com 0,1X SSC / 0,1% SDS durante 40 minutos. Finalmente, os blots foram expostos a telas de obtenção de imagem com fósforo de armazenamento e foram obtidas imagens utilizando um sistema de obtenção de imagens Molecular Dynamics Storm 860™.
[00179] As análises de Southern blot completadas neste estudo foram utilizadas para determinar o número de cópias e confirmar que eventos selecionados continham o transgene dgt-28 dentro do genoma de Arabidopsis.
[00180] Confirmação do Cassete de Expressão Gênica de dgt-28 Através da Análise de PCR. A presença do cassete de expressão gênica de dgt-28 contido nos eventos de plantas T1 foi detectada por uma reação de PCR de ponto final. Iniciadores (Tabela 6) específicos para as regiões de AtUbi10 promotor v2 e AtuORF23 3'UTR v1 do cassete de expressão gênica de dgt-28 foram utilizados para a detecção.Tabela 6. Iniciadores de oligonucleotídeo utilizados para a confirmação do cassete de expressão gênica de dgt-28.
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[00181] As reações de PCR requeriam um protocolo de ciclos de PCR em três etapas padronizado para amplificar o cassete de expressão gênica. Todas as reações de PCR foram completadas utilizando as condições de PCR a seguir: 94°C durante três minutos seguidos por 35 ciclos de 94°C durante trinta segundos, 60°C durante trinta segundos e 72°C durante três minutos. As reações foram completadas utilizando o kit EX-TAQ™ PCR (TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japão) através das instruções do fabricante. Após o ciclo final, a reação foi incubada a 72°C durante 10 minutos. A eletroforese em gel de agarose TAE foi utilizada para determinar o tamanho do amplicon da PCR. Os amplicons da PCR de um tamanho esperado indicaram a presença de um cassete de expressão gênica de comprimento completo que estava presente no genoma dos eventos de Arabidopsis transgênicos.
[00182] Confirmação da Transcrição Relativa de dgt-28 Através da Análise de PCR com Transcrição Inversa Quantitativa. Amostras de tecido de plantas transgênicas em relação a dgt-28 foram coletadas em placas de 96 poços e congeladas a 80°C. A maceração do tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO™ e esferas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Após a maceração do tecido, o RNA Total foi isolado em formato de alto rendimento utilizando o kit Qiagen™ Rneasy 96 (Qiagen™, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante que incluía o tratamento com DnaseI opcional sobre a coluna. Esta etapa foi subsequentemente seguida por um tratamento com DnaseI (Ambion™, Austin, TX) adicional do RNA total eluído. A síntese de cDNA foi realizada utilizando o RNA total como molde com o kit High Capacity cDNA Reverse Transcription™ (Applied Biosystems, Austin, TX) seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante com a adição do oligonucleotídeo, TVN. A quantificação da expressão foi completada através do ensaio com sonda de hidrólise e foi realizada através de PCR em tempo real utilizando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram planejados para dgt-28 e o gene de referência interna "proteína desconhecida" (Número de Acesso do Genbank: AT4G24610) utilizando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para a amplificação, uma mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada a uma concentração final de 1X em uma reação uniplex de 10 μL de volume contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda. Tabela 7. Tabela 7. Iniciadores da PCR utilizados para a análise de PCR com transcrição inversa quantitativa de dgt-28.
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[00183] Uma reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C durante 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram corridas em triplicatas e os valores médios de limiar de Ciclos (Ct) foram utilizados para a análise de cada amostra. Uma reação de transcrição inversa "minus" foi corrida para cada amostra para garantir que nenhuma contaminação de gDNA estivesse presente. A análise dos dados da PCR em tempo real foi realizada com base no método de ΔΔCt. Este ensaio foi utilizado para determinar a expressão relativa de dgt-28 em eventos de Arabidopsis transgênicos que foram determinados como sendo hemizogotos e homozigotos. Os níveis de transcrição relativos do mRNA de dgt-28 variavam de 2,5 vezes até 207,5 vezes mais altos que aqueles do controle interno. Estes dados indicam que as plantas transgênicas em relação a dgt-28 continham um cassete de expressão gênica de dgt-28 funcional e as plantas eram capazes de transcrever o transgene dgt-28.
[00184] Análise de Western Blotting. A DGT-28 foi detectada em amostras de folhas obtidas de plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas. Os extratos de planta provenientes de plantas transgênicas em relação a dgt-28 e padrões de proteína DGT-28 foram incubados com tampão de amostra NUPAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo DTT a 90°C durante 10 minutos e separados eletroforeticamente em um gel pré-moldado de acrilamida. As proteínas foram então eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose utilizando o protocolo do fabricante. Após o bloqueio com a WESTERNBREEZE® Blocking Mix (Invitrogen) a proteína DGT-28 foi detectada por um antissoro anti-DGT-28 seguido por antifosfatase de coelho de caprino. A proteína detectada foi visualizada pelo substrato quimioluminescente BCIP/NBT Western Analysis Reagent (KPL, Gaithersburg, MD). A produção de uma proteína DGT-28 intacta através de Western blot indicou que as plantas transgênicas em relação a dgt-28 que foram analisadas expressavam a proteína DGT-28.
[00185] Plantas de Arabidopsis T1 transgênicas contendo o transgene dgt-28 foram borrifadas com taxas diferentes de glifosato. Taxas elevadas foram aplicadas neste estudo para determinar os níveis de resistência relativa (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). Uma taxa de glifosato de uso no campo típica de 1X é 1120 g ae/ha. As plantas de Arabidopsis T1 que foram utilizadas neste estudo tinham número de cópias variável para o transgene dgt-28. As plantas de Arabidopsis T1 com dgt-28 com baixo número de cópias foram autopolinizadas e utilizadas para produzir plantas T2. A Tabela 8 mostra a comparação de plantas transgênicas em relação a dgt-28, representado a um gene de resistência ao herbicida glifosato, dgt-1 e controles do tipo selvagem. A Tabela 9 mostra a comparação de dgt-32 e dgt-33 representado a um gene de resistência ao herbicida glifosato, dgt-1 e controles do tipo selvagem. A Tabela 10 mostra a comparação das novas enzimas EPSP sintases bacterianas às enzimas EPSP sintases de Classe I e aos controles em uma taxa de glifosato de 1.680 g ae/ha.
[00186] Resultados da Seleção com Glifosato de Plantas de Arabidopsis Transformadas com dgt-28. Os transformantes Ti de Arabidopsis foram primeiramente selecionados partindo do fundo de sementes não transformadas utilizando um esquema de seleção com glufosinato. Três superfícies planas ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construção Ti. As plantas Ti selecionadas anteriormente foram caracterizadas molecularmente e as plantas com alto número de cópias foram subsequentemente transplantadas em vasos individuais e borrifadas com várias taxas de glifosato comercial como descrito anteriormente. A resposta destas plantas é apresentada em termos de % de danos visuais 2 semanas após o tratamento (WAT). Os dados são apresentados em uma tabela que mostra plantas individuais exibindo pouco ou nenhum dano (<20%), dano moderado (20-40%) ou dano grave (>40%). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada construção utilizado para transformação de Arabidopsis. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato.
[00187] O nível de resposta da planta variava. Esta variância pode ser atribuída ao fato de que cada planta representa um evento de transformação independente e assim o número de cópias do gene de interesse varia de planta para planta. Foi observado que algumas plantas que continham o transgene não eram tolerantes ao glifosato; uma análise completa para determinar se estas plantas expressavam o transgene não foi realizada. É provável que a presença de altos números de cópias do transgene dentro das plantas de Arabidopsis Ti resultasse no silenciamento do transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultaram na sensibilidade ao glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.
[00188] Uma média de danos na população geral por taxa é apresentada na Tabela 10 para taxas de glifosato a 1.680 g ae/ha para demonstrar a diferença significativa entre as plantas transformadas com dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32 e dgt-33 versus os controles de dgt-1 e do tipo selvagem.
[00189] A tolerância fornecida pelas novas EPSP sintases bacterianas variava dependendo da enzima específica. DGT-28, DGT-32 e DGT-33 forneceram inesperadamente tolerância ao glifosato significativa. Os genes dgt conferiram resistência a herbicida às plantas de Arabidopsis T1 individuais através de todos os peptídeos de trânsito testados. Como tal, o uso de peptídeos de trânsito para o cloroplasto adicionais (isto é, TraP8 - dgt-32 ou TraP8 - dgt-33) forneceria proteção ao glifosato com níveis de danos similares aos relatados dentro de certo tratamento.Tabela 8. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-28 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparada a uma população resistente homozigota para dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de danos visuais 14 dias após a aplicação.
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Tabela 9. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-32 e dgt-33 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparada a uma população resistente homozigota para dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de danos visuais 14 dias após a aplicação.
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Tabela 10. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-28, dgt-32, dgt-33, dgt-3 e dgt-7 ao glifosato aplicado pós-emergência a 1.680 g ae/ha, comparada a uma população resistente homozigota para dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de danos visuais 14 dias após a aplicação.
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[00190] dgt-28 como um Marcador Selecionável. O uso de dgt-28 como um marcador selecionável para agente de seleção com glifosato é testado com as plantas de Arabidopsis transformadas descritas anteriormente. Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis de geração T4 (homozigotas para dgt-28) são pregadas dentro de aproximadamente 5.000 sementes do tipo selvagem (sensíveis ao glifosato). As sementes são germinadas e as plantas jovens são borrifadas com uma dose de glifosato de seleção. Vários tratamentos de glifosato são comparados; cada bandeja de plantas recebe um ou dois momentos de aplicação de glifosato em um dos esquemas de tratamento a seguir: 7 DAP (dias após o plantio), 11 DAP ou 7 seguidos por 11 DAP. Uma vez que todas as plantas também contêm um gene de resistência ao glufosinato no mesmo vetor de transformação, as plantas contendo dgt-28 selecionadas com glifosato podem ser diretamente comparadas com as plantas contendo DSM-2 ou pat selecionadas com glufosinato.
[00191] Os tratamentos com glifosato são aplicados com uma ponteira de spray DeVilbiss™ como descrito anteriormente. As plantas transgênicas contendo dgt-28 são identificadas como "resistentes" ou "sensíveis" 17 DAP. Os tratamentos de 26,25-1680 g ae/ha de glifosato aplicados 7 e 11 dias após o plantio (DAP), mostram seleção eficiente para plantas de Arabidopsis transgênicas que contêm dgt-28. As plantas sensíveis e resistentes são contadas e é observado que o número de plantas tolerantes ao glifosato está correlacionado com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-28 que são plantadas. Estes resultados indicam que dgt-28 pode ser eficientemente utilizado como um marcador selecionável alternativo para uma população de Arabidopsis transformada.
[00192] Herdabilidade. Os eventos de Arabidopsis Ti transgênicos confirmados foram autopolinizados para produzir sementes T2. Estas sementes foram testadas em relação à progênie através da aplicação do herbicida contendo glufosinato Ignite™ (200 g ae/ha) a 100 irmãs T2 aleatórias. Cada planta T2 individual foi transplantada para vasos quadrados de 7,5 cm antes da aplicação do spray (pulverizador track à taxa de aplicação de 187 L/ha). As famílias T1 (plantas T2) se segregaram no modelo previsto de 3 Resistentes : 1 Sensível para um único lócus herdado de forma dominante com herança Mendeliana como determinado pela análise de Qui quadrado (P > 0,05). A porcentagem de famílias T1 que se segregaram com a herança Mendeliana esperada é ilustrada na Tabela 11 e demonstra que a característica dgt-28 é passada através de herança Mendeliana para a geração T2. As sementes foram coletadas de 5 até 15 indivíduos T2 (sementes T3). Vinte e cinco irmãs T3 de cada uma das 3-4 famílias T2 selecionadas aleatoriamente foram testadas em relação à progênie como descrito anteriormente. Os dados não mostravam segregação e assim demonstravam que dgt-28 e dgt-3 estão integrados de forma estável dentro do cromossomo e são herdados de uma maneira Mendeliana por pelo menos três gerações.Tabela 11. Porcentagem de famílias T1 (plantas T2) que se segregam na forma de herança Mendeliana simples para um teste de progênie de 100 plantas.
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[00193] Dados de Arabidopsis T2. As plantas de segunda geração (T2) de eventos de Arabidopsis T1 selecionados que continham baixos números de cópias do transgene dgt-28 foram adicionalmente caracterizadas em relação à tolerância ao glifosato. O glifosato foi aplicado como descrito anteriormente. A resposta das plantas é apresentada em termos de % de danos visuais 2 semanas após o tratamento (WAT). Os dados são apresentados na forma de um histograma de indivíduos que exibem pouco ou nenhum dano (<20%), dano moderado (20-40%) ou dano grave (>40%). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada construção utilizada para transformação de Arabidopsis. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (cv. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato. Na geração T2 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste em relação a cada evento e, portanto, foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas contêm dois alelos diferentes em um lócus quando comparadas com plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um lócus. É esperada uma variabilidade de resposta ao glifosato na geração T2 como um resultado da diferença na dosagem gênica para hemizigotas quando comparadas com plantas homozigotas. A variabilidade em resposta ao glifosato é refletida no desvio padrão e na faixa de resposta.
[00194] Na geração T2 eventos de dgt-28 tanto de cópia única quanto de várias cópias foram caracterizados em relação à tolerância ao glifosato. Dentro de um evento, plantas com uma única cópia mostravam níveis similares de tolerância ao glifosato. Os dados característicos para um evento T2 de cópia única são apresentados na Tabela 12. Os eventos contendo dgt-28 ligado com TraP5 v2 não forneceram tolerância robusta ao glifosato quando comparados com as construções de dgt-28 que continham outros peptídeos de trânsito TraP. Entretanto, as construções de dgt-28 TraP5 forneciam um baixo nível de tolerância ao glifosato quando comparadas com o controle Columbia não transformado. Houve casos em que foi mostrado que os eventos que continham duas ou mais cópias de dgt-28 eram mais suscetíveis às taxas elevadas de glifosato (dados não mostrados). Este aumento na sensibilidade ao glifosato é similar aos dados descritos anteriormente para as plantas T1 que também continham altos números de cópias do transgene dgt-28. É provável que a presença de altos números de cópias do transgene dentro das plantas de Arabidopsis resulte no silenciamento do transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultaram na sensibilidade ao glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.
[00195] Estes eventos continham dgt-28 ligado com TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) e TraP13 v2 (pDAB105534).
[00196] Em adição a dgt-28, os eventos de Arabidopsis T2 transformados com dgt-3 são apresentados na Tabela 13. Como descrito para os eventos de dgt-28 na Tabela 12, a tabela de dados contém um evento representativo que é característico da resposta ao glifosato para cada construção. Para a caracterização de dgt-3, construções contendo uma única PTU (unidade de transformação de planta) com o gene dgt-3 sendo controlado pelo promotor AtUbi10 (pDAB102716 e pDAB102715) foram comparadas às construções com o mesmo gene contendo 2 PTUs do gene (pDAB102719; pDAB102718). As construções que continham 2 PTU utilizavam o promotor AtUbi10 para controlar uma cópia do gene e o promotor de CsVMV para controlar a outra cópia. O uso da PTU dupla foi incorporado para comparar as plantas transgênicas em relação a dgt-3 com as plantas transgênicas em relação a dgt-28 que continham duas cópias do transgene. Os dados demonstraram que eventos de dgt-3 T2 de cópia única com apenas uma única PTU eram mais suscetíveis ao glifosato que os eventos de dgt-28 de cópia única testados, mas eram mais tolerantes que o controle não transformado. Famílias T1 contendo 2 PTUs do gene dgt-3 forneciam um nível mais alto de tolerância visual ao glifosato comparadas com as construções com 1 PTU. Em ambos os casos as Famílias T1 foram comparadas com o dgt-1 e controles do tipo selvagem. Os dados de T2 demonstram que dgt-28 fornece tolerância robusta na forma de eventos de cópia única.Tabela 12. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 individuais selecionados contendo dgt-28 ao glifosato aplicado pós-emergência a taxas variáveis, comparados a uma população resistente homozigota para dgt-1 (T4) e um controle não transformado. % de danos visuais 14 dias após a aplicação.
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Tabela 13. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 selecionados transformados com dgt-3 ao glifosato aplicado pós-emergência a taxas variáveis. % de danos visuais 14 dias após a aplicação.
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[00197] Dados de Arabidopsis T3. As plantas de terceira geração (T2) de eventos de Arabidopsis T1 selecionados que continham baixos números de cópias do transgene dgt-28 foram adicionalmente caracterizadas em relação à tolerância ao glifosato. O glifosato foi aplicado como descrito anteriormente. A resposta das plantas é apresentada em termos de % de danos visuais 2 semanas após o tratamento (WAT). Os dados são apresentados na forma de um histograma de indivíduos que exibem pouco ou nenhum dano (<20%), dano moderado (20-40%) ou dano grave (>40%). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada construção utilizada para transformação de Arabidopsis. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (cv. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato. Na geração T3 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste em relação a cada evento e, portanto, foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. As plantas hemizigotas contêm dois alelos diferentes em um lócus quando comparadas com as plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um lócus. A variabilidade de resposta ao glifosato é esperada na geração T3 como um resultado da diferença na dosagem gênica para as hemizigotas quando comparadas com plantas homozigotas. A variabilidade em resposta ao glifosato é refletida no desvio padrão e na faixa de resposta.Tabela 14. Resposta de eventos de Arabidopsis T3 individuais selecionados contendo dgt-28 ao glifosato aplicado pós-emergência a taxas variáveis, comparados a uma população com dgt-1 (T4) resistente homozigota e um controle não transformado. % de danos visuais 14 dias
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[00198] Seleção de plantas transformadas. Foi permitido que sementes T1 recém-coletadas [gene dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1] secassem à temperatura ambiente e foram transportadas para Indianapolis para testes. As sementes T1 foram plantadas em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), cada uma recebendo alíquotas de 200 mg de sementes T1 estratificadas (~10.000 sementes) que foram anteriormente suspensas em 40 mL de solução de agarose a 0,1% e armazenadas a 4°C durante 2 dias para completar os requerimentos de dormência e garantir a germinação de sementes sincronizada.
[00199] Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então foi permitido que drenasse por gravidade. Cada alíquota de 40 mL de sementes estratificadas foi plantada igualmente sobre a vermiculita com uma pipeta e coberta com cúpulas de umidade (KORD™ Products, Bramalea, Ontário, Canadá) durante 4-5 dias. As cúpulas foram removidas uma vez que as plantas germinaram antes da seleção de transformantes inicial utilizando spray de glufosinato pós- emergência (seleção em relação ao gene dsm-2 co-transformado).
[00200] Seis dias após o plantio (DAP) e novamente 10 DAP, plantas T1 (cotilédone e estágio de 2-4 folhas, respectivamente) foram borrifadas com uma solução a 0,1% de herbicida IGNITE™ (280 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de spray de 10 mL/bandeja (703 L/ha) utilizando uma ponteira de spray de ar comprimido DeVilbiss™ para fornecer uma taxa eficiente de 200 g ae/ha de glufosinato por aplicação. As sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4-7 dias após a pulverização final. As plantas sobreviventes foram transplantadas individualmente para dentro de vasos de 7,62 cm (3 polegadas) preparados com meio de plantação (Metro Mix 360™). As plantas foram cultivadas na estufa pelo menos 1 dia antes da obtenção de amostras de tecido para análises do número de cópias.
[00201] Foram obtidas amostras das plantas T1 e a análise do número de cópias para o gene dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 foi completada. As plantas T1 foram então submetidas a várias taxas de glifosato de forma que uma faixa de cópias ficasse entre cada taxa. Para Arabidopsis, 26,25 g ae/ha de glifosato é uma dose eficiente para distinguir plantas sensíveis daquelas com níveis de resistência significativos. Taxas elevadas foram aplicadas para determinar níveis de resistência relativa (105, 420, 1680 ou 3360 g ae/ha). A Tabela 16 mostra as comparações referentes ao dgt-1.
[00202] Todas as aplicações do herbicida glifosato foram feitas pelo pulverizador track em um volume de spray de 187 L/ha. O glifosato utilizado era da formulação de sal de dimetilamina Durango comercial (480 g ae/L, Dow AgroSciences, LLC). Plantas T1 com baixo número de cópias que exibiam tolerância ao glufosinato ou ao glifosato foram adicionalmente avaliadas na geração T2.
[00203] As primeiras transformações de Arabidopsis foram realizadas utilizando dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1. Os transformantes T1 foram primeiramente selecionados do fundo de sementes não transformadas utilizando um esquema de seleção com glufosinato. Três superfícies planas ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construção T1. A frequência de transformação foi calculada e os resultados das construções T1 com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 são listadas na Tabela 15.Tabela 15. Frequência de transformação de construções de Arabidopsis T1 com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 selecionadas com glufosinato para seleção do gene marcador selecionável DSM-2.
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[00204] P antas Ti selecionadas anteriormente foram subsequentemente transplantadas em vasos individuais e borrifadas com várias taxas de glifosato comercial. A Tabela 16 compara a resposta de dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 e genes de controle para conferir resistência ao glifosato aos transformantes de Arabidopsis T1. A resposta é apresentada em termos de % de danos visuais 2 WAT. Os dados são apresentados na forma de um histograma de indivíduos que exibem pouco ou nenhum dano (<20%), dano moderado (20-40%) ou dano grave (>40%). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada tratamento. A faixa na resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (cv. Columbia) serviu como um controle sensível ao glifosato. O gene DGT-31 (v1) com peptídeo de trânsito (TraP23) conferia ligeira tolerância a herbicida às plantas de Arabidopsis T1 individuais comparadas com o controle negativo. Tanto DGT-32 quanto DGT-33 demonstraram tolerância robusta ao glifosato nas taxas testadas com seu respectivo peptídeo de trânsito para o cloroplasto (TraP14 e TraP24, respectivamente). Dentro de certo tratamento, o nível de resposta da planta variava enormemente, o que pode ser atribuído ao fato de que cada planta representa um evento de transformação independente e assim o número de cópias do gene de interesse varia de planta para planta. É importante observar que, em cada taxa de glifosato testada, havia indivíduos que eram mais tolerantes que outros. Uma média de danos na população geral por taxa é apresentada na Tabela 16 para demonstrar a diferença significativa entre as plantas transformadas com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 versus os controles de dgt-1 v1 ou do tipo selvagem.Tabela 16. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 a uma faixa de taxas de glifosato aplicado pós- emergência, comparada a uma população resistente homozigota para dgt-1 (T4) ou um controle não transformado. % de danos visuais 2 semanas após o tratamento.
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[00205] Transformação de Milho. Métodos de clonagem padronizados, como descrito anteriormente, foram utilizados na construção de vetores binários para uso na transformação de milho mediada por Agrobacterium tumefaciens. A Tabela 17 lista os vetores que foram construídos para transformação de milho. Os elementos gênicos a seguir foram utilizados nos vetores que continham dgt-28; o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbil; Patente U.S. N°. 5.510.474) foi utilizado para controlar a sequência codificadora de dgt-28 que é flanqueada por uma região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR; Patente U.S. N°. 7179902), o cassete de marcador selecionável consiste do promotor Ubiquitina 1 de Zea mays que foi utilizado para controlar a sequência codificadora de aad-1 (Patente U.S. N°. 7.838.733) que é flanqueada por uma região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays. A sequência codificadora de aad-1 confere tolerância aos herbicidas de fenóxi auxina, tal como, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e a herbicidas de ariloxifenoxipropionato (AOPP).
[00206] As construções de dgt-28 foram construídas na forma de vetores binários padronizados e vetores de sistemas superbinários de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tóquio, JP). Os vetores binários padronizados incluem; pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665 e pDAB107665. Os vetores de sistemas superbinários de Agrobacterium incluem pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386 e pDAB108387.
[00207] Foram completadas construções adicionais que contêm um gene repórter de proteína fluorescente amarela (yfp; Pedido de Patente U.S. 2007/0298412). pDAB109812 contém um cassete de gene repórter yfp que é controlado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida a 3' per 5 de Zea mays (Zm per5 3'UTR; Patente U.S. N°. 7179902), o cassete de marcador selecionável consiste do promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar (SCBV; Patente U.S. N°. 5,994,123) que é utilizado para controlar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays. pDAB101556 contém um cassete de yfp que é controlado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida a 3' per 5 de Zea mays, o cassete de marcador selecionável consiste do promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays que é utilizado para controlar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays. pDAB107698 contém um cassete de dgt-28 que é controlado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e é flanqueado pela região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays, um cassete de yfp que é controlado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida a 3' per 5 de Zea mays, o cassete de marcador selecionável consiste do promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar que é utilizado para controlar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays. Todos os três destas construções são vetores binários padronizados.Tabela 17. Vetores de Transformação de Milho
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[00208] Esterilização de espiga e isolamento de embrião. Para a obtenção de embriões imaturos de milho, plantas da linhagem intracruzada B104 de Zea mays foram crescidas na estufa e foram auto ou polinizadas entre parentes para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 9-12 dias pós-polinização. No dia do experimento, as espigas tiveram sua superfície esterilizada por imersão em uma solução a 20% de hipoclorito de sódio (5%) e agitadas durante 20-30 minutos, seguidos por três lavagens em água esterilizada. Após a esterilização, os embriões zigóticos imaturos (1,5-2,4 mm) foram dissecados assepticamente de cada espiga e distribuídos aleatoriamente dentro de tubos de microcentrífuga contendo meio líquido de infecção (LS Basal Medium, 4,43 gm/L; N6 Vitamin Solution [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Sacarose, 68,5 gm/L; D(+) Glicose, 36,0 gm/L; 10 mg/mL de 2,4-D, 150 μL/L). Para certo conjunto de experimentos, os embriões agrupados de três espigas foram utilizados para cada transformação. Início de Cultura de Agrobacterium:
[00209] Estoques em glicerol de Agrobacterium contendo os vetores de transformação binários descritos anteriormente foram estriados sobre placas de meio mínimo AB contendo antibióticos apropriados e foram crescidos a 20°C durante 3-4 dias. Uma colônia isolada foi selecionada e estriada sobre placas de YEP contendo os mesmos antibióticos e foi incubada a 28°C durante 1-2 dias.
[00210] Cultura e Co-cultivo de Agrobacterium. Colônias de Agrobacterium foram tiradas da placa de YEP, suspensas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL e a densidade celular foi ajustada para DO600 nm de 0,2-0,4 utilizando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium foram colocadas em um agitador giratório a 125 rpm, temperatura ambiente, enquanto a dissecação do embrião era realizada. Embriões zigóticos imaturos entre 1,5-2,4 mm de tamanho foram isolados dos grãos de milho esterilizados e colocados em 1 mL do meio de infecção e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) foi adicionada em cada tubo e os tubos foram colocados sobre uma plataforma de agitação durante 10-15 minutos. Os embriões foram transferidos para meio de co-cultivo (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Myo-inositol, 100,0 mg/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; 30 mM de Dicamba-KOH, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™, 3,00 gm/L; Modified MS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/mL de AgNo3, 15,0 mg/L; DMSO, 100 μM), orientados com o escutelo voltado para cima e incubados a 25°C, sob 24 horas de luz na intensidade de luz de 50 μmoles m-2 s-1 durante 3 dias.
[00211] Seleção e Regeneração de Calos de Supostos Eventos. Após o período de co-cultivo, os embriões foram transferidos para meio de repouso (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; 1,2,3,5/4,6-Hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; 30 mM de Dicamba-KOH, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan 2,30 gm/L; Modified MS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/mL de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubados sob 24 horas de luz na intensidade de luz de 50 μmoles m-2 s-1 e a 25°C durante 3 dias.
[00212] Os experimentos de resposta à dosagem de inibição do crescimento sugeriram que concentrações de glifosato de 0,25 mM e superiores eram suficientes para inibir o crescimento celular na linhagem de milho B104 não transformada. Os embriões foram transferidos para o meio de Seleção 1 contendo 0,5 mM de glifosato (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Myo-inositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; 30mM de Dicamba-KOH, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™ 2,30 gm/L; Modified MS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/mL de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e incubados na escuridão e/ou sob 24 horas de luz na intensidade de luz de 50 μmoles m-2 s-1 durante 7-14 dias a 28°C.
[00213] Os calos embriogênicos proliferantes foram transferidos para o meio de Seleção 2 contendo 1,0 mM de glifosato (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6- Hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; 30 mM de Dicamba-KOH, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan™ 2,30 gm/L; Modified MS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/mL de AgNo3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L; ácido R-Haloxifop 0,1810 mg/L) e foram incubados na escuridão e/ou sob 24 horas de luz na intensidade de luz de 50 μmoles m-2 s-1 durante 14 dias a 28°C. Esta etapa de seleção permitiu que o calo transgênico se proliferasse e se diferenciasse adicionalmente. O período de seleção de calo durou três até quatro semanas.
[00214] Os calos embriogênicos proliferantes foram transferidos para o meio PreReg contendo 0,5 mM de glifosato (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6- Hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,250 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 50,0 mg/L; NAA-NaOH 0,500 mg/L; ABA-EtOH 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; Sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan™ 2,50 gm/L; Modified MS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/mL de AgNo3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e cultivados sob 24 horas de luz na intensidade de luz de 50 μmoles m-2 s-1 durante 7 dias a 28°C.
[00215] Os calos embrionários com botões similares a brotos foram transferidos para o meio de Regeneração contendo 0,5 mM de glifosato (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6- Hexahidroxiciclohexano,100,0 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434™ 3,00 gm/L; ModifiedMS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; Carbenicilina, 125,0 mg/L ) e cultivados sob 24 horas de luz na intensidade de luz de 50 μmoles m-2 s-1 durante 7 dias.
[00216] Os brotos pequenos com raízes primárias foram transferidos para o meio de produção de raiz (MS Salts, 4,33 gm/L; Modified MS-Vitamin [1000X], 1,00 mL/L; 1,2,3,5/4,6- Hexahidroxiciclohexano, 100 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434™ 3,00 gm/L;Carbenicilina, 250,0 mg/L) em Phytotrays e foram incubados sob 16/8 h de luz/escuridão na intensidade de luz de 140-190 μmoles m-2 s-1 durante 7 dias a 27°C. As supostas plantas jovens transgênicas foram analisadas em relação ao número de cópias do transgene utilizando os protocolos descritos anteriormente e transferidas para o solo.
[00217] Confirmação Molecular da Presença dos transgenes dgt-28 e aad-1 dentro de Plantas de Milho. A presença das sequências de polinucleotídeos de dgt-28 e aad-1 foram confirmadas através de ensaios com sonda de hidrólise. Plantas de milho T0 isoladas foram inicialmente verificadas através de um ensaio com sonda de hidrólise, análogo a TAQMAN™, para confirmar a presença dos transgenes aad-1 e dgt-28. Os dados gerados partindo destes estudos foram utilizados para determinar o número de cópias do transgene e utilizados para selecionar os eventos de milho transgênicos para retrocruzamento e prosseguimento para a geração T1.
[00218] Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 poços, a maceração do tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO™ e esferas de aço inoxidável (Hoover Precision Products, Cumming, GA), em tampão Qiagen™ RLT. Após a maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento utilizando o kit Biosprint 96™ Plant (Qiagen, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi quantificado através do kit QUANT-IT™ PICO GREEN DNA ASSAY (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA genômico quantificado foi ajustado em aproximadamente 2 ng/μL para o ensaio com sonda de hidrólise utilizando um manipulador de líquido automatizado BIOROBOT3000™ (Qiagen, Germantown, MD). A determinação do número de cópias do transgene através do ensaio com sonda de hidrólise, análogo a TAQMAN® ensaio, foi realizada através de PCR em tempo real utilizando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram planejados para aad-1, dgt-28 e um gene de referência interna Invertase (No de Acesso do Genbank: U16123.1) utilizando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para a amplificação, a mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada na concentração final 1X em uma reação multiplex com 10 μL de volume contendo 0,4 μM de cada iniciador para aad-1 e dgt- 28 e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 18).
[00219] Uma reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma extensão a 60°C durante 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram corridas e os valores médios de limiar de Ciclos (Ct) foram utilizados para a análise de cada amostra. A análise dos dados da PCR em tempo real foi realizada utilizando a licença 1.5 do software LIGHTCYCLER® utilizando o módulo quant relativo e é baseada no método de ΔΔCt. Os controles incluíam uma amostra de DNA genômico proveniente de calibrador de cópia única e verificação de 2 cópias conhecidas foram incluídas em cada corrida. A Tabela 19 lista os resultados dos ensaios com sonda de hidrólise.Tabela 18. Sequências de iniciadores e sondas utilizados para o ensaio com sonda de hidrólise de aad-1, dgt-28 e referência interna (Invertase).
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Tabela 19. Resultados para a quantidade de cópias de T0 para os eventos de dgt-28. Os eventos com baixo número de cópias consistiam em 1-2 cópias do transgene, os números de cópias únicas estão listados entre parênteses. Os eventos com altos números de cópias continham 3 ou mais cópias do transgene.
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[00220] Tolerância a Herbicida no Milho Transformado com dgt-28. Foi permitido que os eventos de transformação com dgt-28 de Zea mays (T0) se aclimatassem na estufa e foram crescidos até que as plantas sofressem transição das condições de crescimento em cultura de tecido para as de estufa (isto é, 2-4 folhas de aparência normal novas emergiram do vertículo). As plantas foram crescidas a 27°C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuridão na estufa. As plantas foram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA™ (contendo o herbicida glifosato) com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio. As aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador track em um volume de spray de 187 L/ha, altura do spray de 50 cm. As plantas T0 foram borrifadas com uma faixa de glifosato de 280 - 4480 g ae/ha de glifosato, que é capaz de danificar de forma significativa as linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de danos ao cruzamento B104.
[00221] Os resultados das plantas de milho com dgt-28 T0 demonstraram que a tolerância ao glifosato foi atingida em taxas de até 4480 g ae/ha. Um tipo de meio específico foi utilizado na geração T0. O impedimento do crescimento mínimo e o crescimento de plantas geral de plantas transformadas comparadas com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 fornece tolerância robusta ao glifosato quando ligado aos peptídeos de trânsito para o cloroplasto TraP5, TraP8 e TraP23.
[00222] Plantas T0 selecionadas são autocruzadas ou retrocruzadas para caracterização adicional na geração seguinte. 100 linhagens de dgt-28 escolhidas contendo as plantas T1 são borrifadas com 140-1120 g ae/ha de glufosinato ou 105-1680 g ae/ha de glifosato. Tanto o marcador selecionável quanto o gene de resistência ao glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Portanto, se um gene de tolerância a herbicida for selecionado através da pulverização com um herbicida, acredita-se que ambos os genes estejam presentes. Em 14 DAT, as plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que se segregaram na forma de uma característica Mendeliana dominante de lócus único (3R:1S) como determinado através da análise de Qui quadrado. Estes dados demonstram que dgt-28 pode ser herdado na forma de um gene de resistência ao glifosato robusta em uma espécie de monocotiledônea. Taxas mais altas de glifosato são aplicadas nos sobreviventes T1 ou F1 para caracterizar adicionalmente a tolerância e a proteção que são fornecidas pelo gene dgt-28.
[00223] Tolerância a herbicida pós-emergência no Milho To transformado com dgt-28. Eventos TO de dgt-28 ligado com TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23 foram gerados através da transformação com Agrobacterium e foi permitido que se aclimatassem sob condições de câmara de crescimento controladas até que 2-4 folhas de aparência normal novas emergissem do vertículo. Foram atribuídos números de identificação individual para as plantas e estas foram amostradas para análises do número de cópias tanto de dgt-28 quanto de aad-1. Com base nas análises do número de cópias, as plantas foram selecionadas para análises de expressão de proteína. As plantas foram transplantadas para vasos maiores com novo meio de crescimento e crescidas a 27°C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuridão na estufa. O restante das plantas que não foram amostradas para expressão de proteína foi então tratado com formulações comerciais de DURANGO DMA™ (glifosato) com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio. Os tratamentos foram distribuídos de forma que cada grupo de plantas continha eventos T0 de número variável de cópias. As aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador track em um volume de spray de 187 L/ha, altura do spray de 50 cm. As plantas To foram borrifadas com uma faixa de glifosato de 280 - 4480 g ae/ha de glifosato capaz de danificar de forma significativa as linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de danos ao cruzamento B104. B104 era o fundo genético dos transformantes.
[00224] Os resultados das plantas de milho com dgt-28 T0 demonstram que a tolerância ao glifosato foi atingida até 4480 g ae/ha. Tabela 20. O impedimento do crescimento mínimo e o crescimento de plantas geral de plantas transformadas comparadas com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 fornece proteção robusta ao glifosato quando ligado a TraP5, TraP8 e TraP23.Tabela 20. Resposta de eventos de dgt-28 T0 de números variáveis de cópias às taxas de glifosato variando de 280-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio 14 dias após o tratamento.
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[00225] As análises de expressão de proteína através de ELISA padronizado demonstraram uma faixa média de proteína DGT-28 de 12,6 - 22,5 ng/cm2 nas construções testadas.
[00226] Confirmação de tolerância ao glifosato na geração Fi sob condições de estufa. Plantas TO com cópia única que não foram borrifadas foram retrocruzadas com o fundo Bi04 não transformado para caracterização adicional na geração seguinte. Na geração Ti, a tolerância ao glifosato foi avaliada para confirmar a herança do gene dgt-28. Para as plantas Ti, o herbicida ASSURE II™ (35 g ae/ha de quizalofop-metil) foi aplicado no estágio de crescimento Vi para selecionar em relação à proteína AAD-i. Tanto o marcador selecionável quanto o gene de resistência ao glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Portanto, se um gene for selecionado, acredita-se que ambos os genes estejam presentes. Após 7 DAT, as plantas resistentes e sensíveis foram contadas e as plantas nulas foram removidas da população. Estes dados demonstram que dgt-28 (vi) pode ser herdado na forma de um gene de resistência ao glifosato robusta em uma espécie de monocotiledônea. Foram obtidas amostras das plantas para a caracterização da proteína DGT-28 através de ELISA padronizado e do nível de produto da transcrição do RNA. As plantas resistentes foram borrifadas com 560-4480 g ae/ha de glifosato como descrito anteriormente. Os dados demonstram tolerância robusta de dgt-28 ligado com os peptídeos de trânsito para o cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23 até 4480 g ae/ha de glifosato. Tabela 21. Tabela 21. Resposta de eventos de dgt-28 de cópia única F1 a taxas de glifosato variando de 560-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio 14 dias após o tratamento.
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[00227] Os dados de expressão de proteína demonstram uma faixa de proteína DGT-28 média de 42,2 - 88,2 ng/cm2 nos eventos Ti e construções testadas, estabelecendo expressão de proteína na geração T1.
[00228] Caracterização de milho com dgt-28 sob condições de campo. Os eventos TI de cópia única foram enviados para uma localização no campo para criar tanto sementes hemizigotas híbridas quanto homozigotas intracruzadas para caracterização adicional. As sementes híbridas foram criadas através do cruzamento de eventos T1 na linhagem de transformação de milho B104 com a linhagem intracruzada 4XP811 gerando populações híbridas que se segregam 1:1 (hemizigota:nula) em relação ao evento. As sementes resultantes foram enviadas para duas localizações separadas. Um total de cinco eventos de cópia única por construção foi plantado em cada localização em um planejamento de blocos completos aleatórios em triplicata. Os campos foram planejados para que as aplicações de glifosato ocorressem no estágio de crescimento V4 e um grupo separado de plantas receberia a aplicação no estágio de crescimento V8. O híbrido 4XP811/B104 convencional foi utilizado como um controle negativo.
[00229] As fileiras experimentais foram tratadas com 184 g ae/ha de ASSURE II™ (106 g ai/L de quizalofop-metil) para eliminar segregantes nulos. Todas as entradas experimentais se segregaram 1:1 (sensível:resistente) (p=0,05) em relação à aplicação de ASSURE II™. Foram obtidas amostras de plantas resistentes selecionadas de cada evento para a quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padronizado.
[00230] As plantas resistentes a quizalofop-metil foram tratadas com o herbicida comercial DURANGO DMA™ (480 g ae/L de glifosato) com a adição de 2,5% p/v de sulfato de amônio em qualquer um dos estágios de crescimento V4 ou V8. As aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador de lançamento calibrado para fornecer um volume de 187 L/ha, altura do spray de 50 cm. As plantas foram borrifadas com uma faixa de glifosato de 1120 - 4480 g ae/ha de glifosato, capaz de danificar significativamente as linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa > 95% de danos ao cruzamento 4XP811. Foram obtidas avaliações de danos visuais para a porcentagem de clorose visual, porcentagem de necrose, porcentagem de inibição do crescimento e danos visuais totais em 7, 14 e 21 DAT (dias após o tratamento). As avaliações foram comparadas com os controles não tratados para cada linhagem e para os controles negativos.
[00231] Os dados de danos visuais para todos os momentos de avaliação demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de DURANGO DMA™ tanto nas localizações quanto nos momentos de aplicação. Eventos representativos para a aplicação em V4 são apresentados partindo de uma localização e são coerentes com outros eventos, momentos de aplicação e localizações. Tabela 22. Um evento da construção contendo dgt-28 ligado com TraP23 (pDAB107665) era tolerante à seleção com ASSURE II™ para a proteína AAD-1, mas era sensível a todas as taxas de glifosato aplicadas.Tabela 22. Resposta de eventos com dgt-28 aplicados com uma faixa de glifosato de 1120-4480 g ae/ha + 2,5% p/v de sulfato de amônio no estágio de crescimento V4.
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[00232] Avaliações adicionais foram feitas durante o estágio de crescimento reprodutivo para a taxa de 4480 g ae/ha de glifosato. As avaliações visuais de corutos, momento de polinização e suprimento de espigas eram similares aos controles não tratados de cada linhagem para todas as construções, momentos de aplicação e localizações. Os resultados de quantificação para a proteína DGT-28 demonstraram uma faixa de expressão média de proteína de 186,4 - 303,0 ng/cm2. Os dados demonstram tolerância robusta de milho transformado com dgt-28 condições de campo ao longo dos estágios de crescimento reprodutivo até 4480 g ae/ha de glifosato. Os dados também demonstraram detecção de proteína DGT-28 e função baseada nos resultados de tolerância ao spray.
[00233] Confirmação de herdabilidade e da tolerância de milho com dgt-28 no estado homozigoto. Sementes do TIS2 foram plantadas sob condições de estufa como descrito anteriormente. As mesmas cinco linhagens de cópia única que foram caracterizadas sob condições de campo foram caracterizadas no estado homogêneo. As plantas foram crescidas até o estágio de crescimento V3 e separadas em três taxas de glifosato variando de 1120-4480 g ae/ha de glifosato (DURANGO DMA™) e quatro réplicas por tratamento. As aplicações foram feitas em um pulverizador track como descrito anteriormente e foram formuladas em 2,0% p/v de sulfato de amônio. Uma aplicação de sulfato de amônio serviu como um controle não tratado para cada linhagem. Foram obtidas avaliações visuais 7 e 14 dias após o tratamento como descrito anteriormente. Os dados demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato para todos os eventos testados. Tabela 23.Tabela 23. Resposta de eventos com dgt-28 homozigotos que receberam aplicação com uma faixa de glifosato de 1120-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio.
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[00234] A linhagem de pDAB107665 que não era tolerante sob condições de campo não demonstrou tolerância ao glifosato e, portanto, era coerente com as observações de campo (dados não mostrados). Com a exceção da linhagem mencionada anteriormente, todas as réplicas que foram tratadas com glifosato das linhagens não eram sensíveis ao glifosato. Portanto, os dados demonstram herdabilidade a uma população homogênea de milho com dgt-28 de uma maneira Mendeliana. A expressão da proteína DGT-28 através de ELISA padronizado demonstrou uma faixa de expressão média de proteína de 27,5 - 65,8 ng/cm2 nos eventos de cópia única que eram tolerantes ao glifosato. Os dados demonstram proteína funcional e estabilidade da proteína DGT-28 ao longo das gerações.
[00235] Uso de tolerância a herbicida pós-emergência de glifosato como um marcador selecionável. Como descrito anteriormente, plantas T0 transformadas foram transferidas da cultura de tecido e aclimatizadas na estufa. Os eventos testados continham dgt-28 ligado aos peptídeos de trânsito para o cloroplasto TraP5, TraP8 e TraP23. Foi demonstrado que estas plantas T0 forneciam tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato e as plantas não transformadas foram controladas com glifosato nas concentrações tão baixas quanto 280 g ae/ha. Estes dados demonstram que dgt-28 pode ser utilizado como um marcador selecionável utilizando uma concentração de glifosato variando de 280 - 4480 g ae/ha.
[00236] Um número de sementes de linhagens de milho fixadas que contêm o transgene dgt-28 é pregado dentro de um número de sementes de milho não transformadas. As sementes são plantadas e é permitido que cresçam até o estágio do desenvolvimento V1-V3, em cujo momento as plantas jovens são borrifadas com uma dose de glifosato de seleção na faixa de 280-4480 g ae/ha. Após 7-10 dias, as plantas sensíveis e resistentes são contadas e a quantidade de plantas tolerantes ao glifosato é correlacionada com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-28 que são plantadas.
[00237] "Acúmulo" de Milho com dgt-28. A proteína AAD-1 é utilizada como o marcador selecionável no milho transformado com dgt-28 para finalidades de pesquisa. O gene aad-1 pode também ser utilizado como uma característica de tolerância a herbicida no milho para fornecer tolerância robusta a 2,4-D até uma aplicação de V8 em uma planta de cultivo. Quatro eventos provenientes das construções pDAB107663 (TraP4::dgt-28), pDAB107664 (TraP8::dgt-28) epDAB107666 (TraP5::dgt-28) foram caracterizados em relação à tolerância de uma aplicação de mistura em tanque de glifosato e 2,4-D. O estudo de caracterização foi completado com sementes F1 sob condições de estufa. As aplicações foram feitas em um pulverizador track como descrito anteriormente nas taxas a seguir: 1120-2240 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120-2240 g ae/ha de 2,4-D (seletivo para o gene aad-1) ou uma mistura em tanque dos dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram classificadas nos 7 e 14 DAT. Os resultados da aspersão para aplicações dos herbicidas a 2240 g ae/ha são mostrados na Tabela 24.Tabela 24. Resposta de milho com aad-1 e dgt-28 F1 borrifado com 2240 g ae/ha de 2,4-D, glifosato e uma combinação de mistura em tanque dos dois herbicidas 14 dias após o tratamento.
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[00238] Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser "acumulado" de forma bem-sucedida com aad-1, aumentando assim o espectro dos herbicidas que podem ser aplicados na planta de cultivo de interesse (glifosato + ácidos fenoxiactético para dgt-28 e aad-1, respectivamente). Na produção de plantas de cultivo em que ervas daninhas de folha ampla difíceis de controlar ou biotipos de ervas daninhas resistentes existem o "acúmulo" pode ser utilizado como um meio de controle de ervas daninhas e de proteção da planta de cultivo de interesse. As características de entrada ou de saída adicionais também podem ser "acumuladas" com o gene dgt-28 no milho e outras plantas.
[00239] Transformação de Soja. Soja transgênica (Glicina max) contendo um transgene dgt-28 integrada de forma estável é gerada através da transformação mediada por Agrobacterium de explantes de nós de cotilédone da soja. Uma cepa de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é utilizada para iniciar a transformação.
[00240] A transformação mediada por Agrobacterium é realizada utilizando um procedimento de nó de meio cotilédone modificado de Zeng e outros (Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482). Sucintamente, sementes de soja (cv. Maverick) são germinadas sobre meio basal e os nós de cotilédone são isolados e infectados com Agrobacterium. Os meios de iniciação de brotos, de alongamento de brotos e de enraizamento são suplementados com cefotaxima, timentin e vancomicina para a remoção de Agrobacterium. A seleção através de um herbicida é empregada para inibir o crescimento de brotos não transformados. Os brotos selecionados são transferidos para o meio de enraizamento para o desenvolvimento de raízes e então transferidos para a mistura de solo para a aclimatização das plantas jovens.
[00241] Os folíolos terminais de plantas jovens selecionadas são tratados de forma tópica (técnica de pintura da folha) com um herbicida para selecionar supostos transformantes. As plantas jovens verificadas são transferidas para a estufa, é permitido que se aclimatem e então têm as folhas pintadas com um herbicida para reconfirmar a tolerância. São obtidas amostras destas supostas plantas T0 transformadas e análises moleculares são utilizadas para confirmar a presença do marcador selecionável de herbicida e do transgene dgt-28. É permitido que as plantas T0 se autofertilizem na estufa para produzir sementes T1.
[00242] Um segundo método de transformação de soja pode ser utilizado para produzir plantas de soja transgênicas adicionais. Uma cepa de Agrobacterium desarmada que carrega um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é utilizada para iniciar a transformação.
[00243] A transformação mediada por Agrobacterium é realizada utilizando um procedimento de meia semente modificado de Paz e outros, (Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T. e Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213). Sucintamente, sementes de soja maduras são esterilizadas durante toda a noite com gás cloro e embebidas com H2O esterilizada vinte horas antes da transformação de planta mediada por Agrobacterium. As sementes são cortadas no meio através de um corte longitudinal ao longo do hilo para separa a semente e remover o revestimento da semente. O eixo embrionário é cortado e quaisquer brotos/botões axiais são removidos do nó do cotilédone. Os explantes de meia semente resultantes são infectados com Agrobacterium. Os meios de iniciação do broto, de alongamento do broto e de enraizamento são suplementados cefotaxima, timentin e vancomicina para a remoção de Agrobacterium. A seleção com herbicida é empregada para inibir o crescimento de brotos não transformados. Os brotos selecionados são transferidos para o meio de enraizamento para o desenvolvimento de raízes e então transferidos para a mistura de solo para a aclimatização das plantas jovens.
[00244] Os folículos terminais de plantas jovens selecionadas são tratados de forma tópica (técnica de pintura da folha) com um herbicida para selecionar supostos transformantes. As plantas jovens verificadas são transferidas para a estufa, é permitido que se aclimatem e têm então as folhas pintadas com um herbicida para reconfirmar a tolerância. São obtidas amostras destas supostas plantas T0 transformadas e análises moleculares são utilizadas para confirmar a presença do marcador selecionável e do transgene dgt-28. Vários eventos são identificados como contendo os transgenes. Estas plantas T0 são desenvolvidas para análise adicional e é permitido que se autofertilizem na estufa para dar origem às sementes T1.
[00245] Confirmação de herdabilidade de dgt-28 para a geração T1. A herdabilidade da proteína DGT-28 para a geração TI foi avaliada em uma de duas maneiras. O primeiro método incluía o plantio de sementes T1 em meio Metro-mix e a aplicação de 411 g ae/ha de IGNITE™ 280 SL sobre as plantas germinadas no 1o estágio de crescimento trifoliado. O segundo método consistia da homogeneização das sementes para um total de 8 réplicas utilizando um rolamento de esferas e um genotriturador. Testes com tiras de ELISA para detectar a proteína PAT foram então utilizados para detectar os eventos herdáveis uma vez que o marcador selecionável estava no mesmo plasmídeo que o dgt-28. Para cada um dos métodos se uma única planta fosse tolerante ao glufosinato ou fosse detectada com o teste de tira de ELISA para PAT, o evento demonstrava herdabilidade para a geração T1.
[00246] Um total de cinco construções foram verificadas em relação à herdabilidade como descrito anteriormente. Os plasmídeos continham dgt-28 ligado com TraP4, TraP8 e TraP23. Os eventos nas construções demonstraram 68% de herdabilidade da proteína PAT::DGT-28 para a geração T1.
[00247] Tolerância a herbicida pós-emergência na soja TI transformada com dgt-28. As sementes provenientes dos eventos TI que foram determinados como sendo herdáveis através dos métodos de verificação descritos anteriormente foram plantadas em meio Metro-mix sob condições de estufa. As plantas foram crescidas até que o 1o trifoliado tivesse sido completamente expandido e foram tratadas com 411 g ae/ha de IGNITE™ 280 SL para a seleção do gene pat como descrito anteriormente. As plantas resistentes provenientes de cada evento receberam identificadores únicos e foram obtidas amostras para análises de zigosidade do gene dgt-28. Os dados de zigosidade foram utilizados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento quando existiam plantas suficientes. Estas plantas foram comparadas contra o tabaco Petite havana do tipo selvagem. Todas as plantas foram borrifadas com um pulverizador track ajustado em 187 L/ha. As plantas foram borrifadas em uma faixa de 560-4480 g ae/ha de sal de dimetilamina de DURANGO™ (DMA). Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias após o tratamento. Foi atribuída às plantas uma classificação de danos em relação ao impedimento do crescimento visual geral, à clorose e à necrose. A geração T1 é segregante, assim alguma resposta variável é esperada devido à diferença na zigosidade. Tabela 25. Resultados da pulverização demonstram em 14 DAT (dias após o tratamento) tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato de pelo menos um evento de dgt-28 por construção caracterizada. Todos os eventos representativos de cópia única das construções forneceram tolerância até 4480 g ae/ha comparados com o controle negative Maverick.
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[00248] Proteção de dgt-28 contra taxas elevadas de glifosato na geração T2. Um teste de progênie com 45 plantas foi realizado em duas até cinco linhagens T2 de dgt-28 por construção. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base nas análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementes foram plantadas como descrito anteriormente. As plantas foram então borrifadas com 411 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat como descrito anteriormente. Após 3 DAT, as plantas resistentes e sensíveis foram contadas.
[00249] Para construções contendo TraP4 ligado com dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107548), nove de dez linhagens testadas não se segregavam, confirmando assim linhagens homogêneas na geração T2. As linhagens contendo TraP8 ligado com dgt-28 (pDAB107545) demonstraram duas das quatro linhagens sem segregantes e demonstrando herança Mendeliana ao longo de pelo menos duas gerações de dgt-28 na soja. Amostras de tecido foram tiradas das plantas resistentes e a proteína DGT-28 foi quantificada através de métodos de ELISA padronizados. Os dados demonstraram uma faixa de proteína DGT-28 média de 32,8 - 107,5 ng/cm2 para linhagens T2 não segregantes testadas. Linhagens da construção pDAB107553 (TraP23::dgt-28) não foram anteriormente selecionadas com glufosinato e a resposta à dose de glifosato foi utilizada tanto para testar a homogeneidade quanto a tolerância a taxas elevadas de glifosato. Réplicas das linhagens da construção pDAB107553 eram tolerantes a taxas variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato e foram, portanto, confirmadas como sendo uma população homogênea e herdável para pelo menos duas gerações.
[00250] Taxas de DURANGO DMA variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato foram aplicadas em 2-3 sojas trifoliadas como descrito anteriormente. Os dados de danos visuais 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram demonstrados na geração T1.Tabela 26. Os dados demonstram tolerância robusta do tabaco com dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato ao longo de duas gerações, comparado com o controle não transformado.
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[00251] Transformação de Arroz com dgt-28. Em um exemplo de método de transformação, arroz transgênico (Oryza sativa) contendo um transgene dgt-28 integrado de forma estável é gerado através da transformação mediada por Agrobacterium de sementes de arroz esterilizadas. Uma cepa de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é utilizada para iniciar a transformação.
[00252] Os meios de cultura são ajustados em pH 5,8 com 1 M de KOH e solidificados com 2,5 g/L de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Os calos embrionários são cultivados em placas de Petri de 100 x 20 mm contendo 30 mL de meio semissólido. As plantas jovens de arroz são crescidas em 50 mL de meio em caixas MAGENTA. As suspensões de células são mantidas em frascos cônicos de 125 mL contendo 35 mL de meio líquido e giradas a 125 rpm. A indução e a manutenção das culturas embriogênicas ocorrem na escuridão a 25-26°C e a regeneração das plantas e a cultura de plantas inteiras ocorrem em recinto iluminado com um fotoperíodo de 16 h (Zhang e outros 1996).
[00253] A indução e a manutenção dos calos embrionários são realizadas em um meio basal NB modificado como descrito anteriormente (Li e outros 1993), em que o media é adaptado para conter 500 mg/L de glutamina. As culturas em suspensão são iniciadas e mantidas em meio líquido SZ (Zhang e outros 1998) com a inclusão de 30 g/L de sacarose no lugar da maltose. Meio osmótico (NBO) consistindo de meio NB com a adição de 0,256 M de cada um de manitol e sorbitol. O calo resistente a herbicida é selecionado em meio NB suplementado com o agente seletivo de herbicida apropriado durante 3-4 semanas. A pré-regeneração é realizada em meio (PRH50) que consiste de meio NB com ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg/L de ácido a-naftalenoacético (NAA), 5 mg/L de ácido abscísico (ABA) e herbicida seletivo durante 1 semana. A regeneração de plantas jovens sucede a cultura em meio de regeneração (RNH50) que compreende meio NB contendo 2,4-D, 0,5 mg/L de NAA e herbicida seletivo até que brotos supostamente transgênicos sejam regenerados. Os brotos são transferidos para o meio de enraizamento com sais basais de Murashige e Skoog de concentração média e vitaminas B5 de Gamborg, suplementado com 1% de sacarose e herbicida seletivo.
[00254] As sementes dessecadas maduras de Oryza sativa L. japonica cv. Taipei 309 são esterilizadas como descrito em Zhang e outros 1996. Os tecidos embriogênicos são induzidos através do cultivo de sementes de arroz maduras esterilizadas em meio NB na escuridão. O calo primário com aproximadamente 1 mm de diâmetro, é removido do escutelo e utilizado para iniciar a suspensão de células em meio líquido SZ. As suspensões são então mantidas como descrito em Zhang 1996. Os tecidos embriogênicos derivados das suspensões são removidos da cultura líquida 3-5 dias após o subcultivo anterior e colocados em meio osmótico NBO para formar um círculo de aproximadamente 2,5 cm ao longo da placa de Petri e cultivados durante 4 h antes do bombardeio. Dezesseis até vinte horas após o bombardeio, os tecidos são transferidos do meio NBO para o meio de seleção NBH50, garantindo que a superfície bombardeada fique voltada para cima e incubados na escuridão durante 14-17 dias. O calo recém- formado é então separado dos explantes bombardeados originais e colocado próximo no mesmo meio. Após 8-12 dias adicionais, um calo opaco relativamente compacto é identificado visualmente e transferido para o meio pré-regeneração PRH50 durante 7 dias na escuridão. O calo em crescimento, que se torna mais compacto e opaco é então subcultivado em meio de regeneração RNH50 ao longo de um período de 14-21 dias sob um fotoperíodo de 16 h. Os brotos em regeneração são transferidos para caixas MAGENTA contendo ^ de meio MSH50. Várias plantas regeneradas partindo de um único explante são consideradas irmãs e são tratadas como uma linhagem de planta independente. Uma planta é classificada como positiva em relação ao gene dgt-28 se esta produzir raízes brancas grossas e crescer vigorosamente em ^ de meio MSH50. Uma vez que as plantas jovens atingem a superfície das caixas MAGENTA, estas são transferidas para o solo em um vaso de 6 cm sob 100% de umidade durante uma semana e então são transferidas para uma câmara de crescimento com um período de luz de 14 h a 30°C e na escuridão a 21°C durante 2-3 semanas antes do transplante para vasos de 13 cm na estufa. As sementes são coletadas e secas a 37°C durante uma semana antes do armazenamento a 4°C.
[00255] Análise de To de arroz com dgt-28. Os transformantes de arroz transplantados produzidos através da transformação com Agrobacterium foram transplantados para o meio e aclimatizados às condições de estufa. Foram obtidas amostras de todas as plantas para detecção através da PCR de dgt-28 e os resultados demonstram vinte e dois eventos positivos para a PCR para pDAB110827 (TraP8::dgt-28) e um mínimo de dezesseis eventos positivos para PCR para pDAB110828 (TraP23::dgt-28). A análise de Southern para dgt-28 dos eventos positivos para PCR demonstrou eventos simples (1-2 cópias) para ambas as construções. A expressão de proteína de eventos T0 selecionados demonstrou faixas de expressão da proteína DGT-28 desde abaixo dos níveis de detecção até 130 ng/cm2. Os eventos T0 selecionados provenientes da construção pDAB110828 foram tratadas com 2240 g ae/ha de DURANGO DMA™ como descrito anteriormente e avaliadas 7 e 14 dias após o tratamento. Os dados demonstraram tolerância robusta à taxa de glifosato aplicada. Foi permitido que todas as plantas positivas para PCR produzissem sementes T1 para caracterização adicional.
[00256] Herdabilidade de dgt-28 no arroz. Um teste de progênie com 100 plantas foi realizado em quatro linhagens T1 de dgt-28 provenientes da construção pDAB110827 contendo o peptídeo de trânsito para o cloroplasto TraP8. As sementes foram plantadas dentro de vasos cheios de meio. Todas as plantas foram então borrifadas com 560 g ae/ha de DURANGO DMA™ para a seleção do gene dgt-28 como descrito anteriormente. Após 7 DAT, as plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Duas das quatro linhagens testadas para cada construção se segregaram na forma de uma característica Mendeliana dominante de lócus único (3R:1S) como determinado através da análise de Qui quadrado. Dgt-28 é um gene de resistência ao glifosato herdável em várias espécies.
[00257] Tolerância a herbicida pós-emergência no arroz TI transformado com dgt-28. Plantas TI resistentes provenientes de cada evento utilizadas no teste de progênie receberam identificadores únicos e foram obtidas amostras para as análises de zigosidade do gene dgt-28. Os dados de zigosidade foram utilizados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Estas plantas foram comparadas contra o arroz kitaake do tipo selvagem. Todas as plantas foram borrifadas com um pulverizador track ajustado em 187 L/ha. As plantas foram borrifadas partindo de uma faixa de 560-2240 g ae/ha de DURANGO DMA™. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias após o tratamento. Foi atribuída às plantas uma classificação de danos em relação ao impedimento do crescimento visual geral, à clorose e à necrose. A geração T1 é segregante, assim alguma resposta variável é esperada devido à diferença na zigosidade.
[00258] Resultados da pulverização demonstram em 7 DAT (dias após o tratamento) danos vegetativos mínimos às taxas elevadas de glifosato que foram detectadas (dados não mostrados).Tabela 27. Dados de danos visuais em 14 DAT demonstram menos de 15% de danos visuais médios até 2240 g ae/ha de glifosato.
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[00259] A detecção da proteína DGT-28 foi avaliada para réplicas de todas as quatro linhagens T1 testadas provenientes de pDAB110827. Os dados demonstraram faixas de proteína DGT-28 médias de 20-82 ng/cm2 e 21-209 ng/cm2 para réplicas hemizigotas e homozigotas respectivamente. Estes resultados demonstraram expressão estável de proteína para a geração T1 e tolerância de arroz com dgt-28 até 2240 g ae/ha de glifosato após uma aplicação de 560 g ae/ha de glifosato utilizada para a seleção.
[00260] Transformação de Tabaco com dgt-28. Pedados de folhas de tabaco (cv. Petit Havana) são transformados utilizando Agrobacterium tumefaciens contendo o transgene dgt-28. Colônias isoladas contendo o plasmídeo que contém o transgene dgt-28 são inoculadas dentro de 4 mL de meio YEP contendo espectinomicina (50 μg/mL) e estreptomicina (125 μg/mL) e incubadas durante toda a noite a 28°C em um agitador a 190 rpm. A cultura de sementes de 4 mL é subsequentemente utilizada para inocular uma cultura de 25 mL do mesmo meio em um frasco Erlenmeyer com chicanas de 125 mL. Esta cultura é incubada a 28°C com agitação a 190 rpm até esta atingir uma DO600 de ~1,2. Dez mL de suspensão de Agrobacterium são então colocados dentro de placas Petri™ de 60 x 20 mm esterilizadas.
[00261] Pedaços de folhas recém-cortadas (0,5 cm2) provenientes de plantas crescidas assepticamente em meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS,) com 30 g/L de sacarose em PhytaTrays™ (Sigma, St. Louis, MO) são imersos em 10 mL de cultura de Agrobacterium durante toda a noite por alguns minutos, secos como mata borrão sobre papel de filtro esterilizado e então colocados sobre o mesmo meio com a adição de 1 mg/L de ácido indoleacético e 1 mg/L de 6-benzilamino purina. Três dias depois, os pedaços de folhas co- cultivados com Agrobacterium carregando o transgene dgt-28 são transferidos para o mesmo meio com 5 mg/L de Basta™ e 250 mg/L de cefotaxima.
[00262] Após 3 semanas, as plantas jovens T0 individuais são transferidas para meio MS com 10 mg/L de Basta™ e 250 mg/L de cefotaxima durante 3 semanas adicionais antes do transplante para o solo e a transferência para a estufa. É permitido que as plantas T0 selecionadas (que são identificadas utilizando protocolos de análise molecular descritos anteriormente) se autopolinizem e a semente é coletada das cápsulas quando estas estão completamente secas. Mudas T1 são verificadas em relação à zigosidade e à expressão do gene repórter (como descrito a seguir) e as plantas selecionadas contendo o transgene dgt-28 são identificadas.
[00263] As plantas foram transferidas para dentro da estufa através da lavagem do ágar das raízes, do transplante para dentro do solo em vasos quadrados de 13,75 cm, da colocação do vaso dentro de um saco Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), da colocação de água da pia no fundo do saco e da colocação na luz indireta em uma estufa a 30°C durante uma semana. Após 3-7 dias, o saco foi aberto; as plantas foram fertilizadas e foi permitido que crescessem no saco aberto até que as plantas tivessem se aclimatado à estufa, em cujo momento o saco foi removido. As plantas foram crescidas sob condições aquecidas comuns de estufa (27°C de dia, 24°C à noite, 16 horas de dia, mínimo de luz natural + suplementar = 1200 μE/m2s1).
[00264] Antes da propagação, foram obtidas amostras das plantas T0 para análise de DNA para determinar o número de cópias do inserto dgt-28 através de PCR em tempo real. Tecido fresco foi colocado dentro de tubos e liofilizados a 4 °C durante 2 dias. Após o tecido ter sido totalmente seco, uma esfera de tungstênio (Valenite) foi colocada no tubo e as amostras foram submetidas a 1 minuto de trituração a seco utilizando um moinho de esferas Kelco. O procedimento de isolamento de DNA com DNeasy™ padronizado foi então realizado (Qiagen, DNeasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi então corada com Pico Green (Molecular Probes P7589) e lida em um fluorômetro (BioTek™) com padrões conhecidos para a obtenção da concentração em ng/μL. Um total de 100 ng de DNA total foi utilizado como molde. A reação da PCR foi realizada no termociclador 9700 Geneamp™ (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94°C durante 3 minutos e 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 64°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto e 45 segundos seguidos por 72°C durante 10 minutos. Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 1% corado com EtBr e confirmados por Southern blots.
[00265] Cinco até nove eventos positivos para PCR com 1-3 cópias do gene dgt-28 provenientes de 3 construções contendo uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto diferente (TraP4, TraP8 e TraP23) foram regenerados e transferidos para a estufa.
[00266] Foram obtidas amostras de todas as plantas positivas para PCR para a quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padronizado. A proteína DGT-28 foi detectada em todas as plantas positivas para PCR e uma tendência por um aumento na concentração da proteína foi observada com número crescente de cópias de dgt-28.
[00267] Herdabilidade de aad-12 (v1) no tabaco. Um teste de progênie com 100 plantas foi realizado em cinco linhagens T1 de dgt-28 por construção. As construções continham uma das sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto a seguir: TraP4, TraP8 ou TraP23. As sementes foram estratificadas, plantadas e transplantadas de forma muito parecida com aquela do procedimento de Arabidopsis exemplificado anteriormente, com a exceção de que as plantas nulas não foram removidas na seleção inicial antes do transplante. Todas as plantas foram então borrifadas com 280 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat como descrito anteriormente. Após 3 DAT, as plantas resistentes e sensíveis foram contadas.
[00268] Quatro das cinco linhagens testadas para cada construção se segregaram na forma de uma característica Mendeliana dominante de lócus único (3R:1S) como determinado através da análise de Qui quadrado. Dgt-28 é um gene de resistência ao glifosato herdável em várias espécies.
[00269] Tolerância a herbicida pós-emergência no tabaco Ti transformado com dgt-28. As plantas Ti resistentes provenientes de cada evento utilizado no teste de progênie receberam identificadores únicos e foram obtidas amostras para as análises de zigosidade do gene dgt-28. Os dados de zigosidade foram utilizados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas a cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Estas plantas foram comparadas contra o tabaco Petite havana do tipo selvagem. Todas as plantas foram borrifadas com um pulverizador track ajustado em i87 L/ha. As plantas foram borrifadas partindo de uma faixa de 560-4480 g ae/ha de DURANGO DMA™. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de 2% p/v de sulfato de amônio (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e i4 dias após o tratamento. As plantas receberam uma classificação de danos em relação ao impedimento do crescimento visual geral, à clorose e à necrose. A geração Ti é segregante, de forma que alguma resposta variável é esperada para a diferença na zigosidade.
[00270] Os resultados da pulverização demonstram em 7 DAT (dias após o tratamento) danos vegetativos mínimos para as taxas elevadas de glifosato que foram detectadas (dados não mostrados). Após i4 DAT, os dados de danos visuais demonstram maiores danos com eventos de cópia única da construção contendo TraP4 comparados com os eventos de cópia única provenientes das construçõeos TraP8 e TraP23. Tabela 28.Tabela 28. A uma taxa de 2240 g ae/ha de glifosato, um dano médio de 37,5% foi demonstrado com o evento contendo TraP4, em que os eventos contendo TraP8 e TraP23 demonstravam um dano médio de 9,3% e 9,5% respectivamente.
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[00271] Estes resultados demonstraram tolerância de dgt-28 até 4480 g ae/ha de glifosato, bem como diferenças na tolerância fornecida por sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto ligado ao gene dgt-28.
[00272] Proteção de dgt-28 contra taxas elevadas de glifosato na geração T2. Um teste de progênie com 25 plantas foi realizado em duas até três linhagens T2 de dgt-28 por construção. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base nas análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementes foram estratificadas, plantadas e transplantadas como descrito anteriormente. Todas as plantas foram então borrifadas com 280 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat como descrito anteriormente. Após 3 DAT, as plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Todas as linhagens testadas para cada construção não se segregavam confirmando dessa maneira linhagens homogêneas na geração T2 e demonstrando herança Mendeliana ao longo de pelo menos duas gerações de dgt-28 no tabaco.
[00273] Taxas de DURANGO DMA™ variando de 420-3360 g ae/ha de glifosato foram aplicadas no tabaco com 2-3 folhas como descrito anteriormente. Os dados de danos visuais 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram demonstrated na geração T1. Resultados foliares de linhagens com duas cópias provenientes da construção contendo TraP4 demonstraram tolerância similar àquela das linhagens de cópia única de TraP8 e TraP23 (dados não mostrados).Tabela 29. Linhagens de cópia única provenientes da construção contendo TraP4 com dgt-28 demonstraram maiores danos comparadas com linhagens provenientes de construções contendo TraP8 e TraP23 com dgt-28.
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[00274] Os dados demonstram tolerância robusta de tabaco com dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato ao longo de duas gerações comparado com o controle não transformado.
[00275] Foram obtidas amostras de plantas selecionadas provenientes de cada evento antes das aplicações de glifosato para análises da proteína DGT-28 através de ELISA para DGT-28 padronizado. Os dados demonstraram expressão média da proteína DGT-28 das linhagens simples (1-2 cópias) nas construções variando de 72,8-114,5 ng/cm2. Os dados demonstram que dgt-28 é uma proteína em expressão na geração T2 de tabaco transformado e os dados de tolerância confirmam a proteína DGT-28 funcional.
[00276] "Acúmulo" de dgt-28 para aumentar o espectro de herbicida. Plantas homozigotas para dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107545) e para aad-12 v1 (pDAB3278) (ver PCT/US2006/042133 para a última) foram todas reciprocamente cruzadas e sementes F1 foram coletadas. As sementes F1 provenientes dos dois cruzamentos recíprocos de cada gene foram estratificadas e 6 reps tratadas de cada cruzamento foram tratadas com 1120 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120 g ae/ha de 2,4-D (seletivo para o gene aad-12) ou uma mistura em tanque dos dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram classificadas em 14 DAT. Os resultados da pulverização são mostrados na Tabela 30. Tabela 30. Resposta de F1 aad-12 e dgt-28
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[00277] Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser "acumulado" de forma bem-sucedida com aad-12 (v1), aumentando assim o espectro dos herbicidas que podem ser aplicados à planta de cultivo de interesse (glifosato + ácidos fenoxiactéticos para dgt-28 e aad-12, respectivamente). Na produção de plantas de cultivo em que ervas daninhas difíceis de controlar ou biotipos de ervas daninhas resistentes existem o "acúmulo" pode ser utilizado como um meio de controle de ervas daninhas e de proteção da planta de cultivo de interesse. Características de entrada ou de saída adicionais também poderiam ser "acumuladas" com o gene dgt-28.
[00278] Resistência ao Glifosato no Trigo. Produção de vetores binários que codificam DGT-28. Os vetores binários contendo cassetes de expressão de DGT-28 e de seleção de PAT foram planejados e montados utilizando perícias e técnicas comumente conhecidas na arte. Cada cassete de expressão de DGT-28 continha o promotor, a região não traduzida a 5' e o íntron do gene da Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e outros, Plant Physiology 1992, 100 1503-07), seguidos por uma sequência codificadora consistindo de um dos quatro peptídeos de trânsito (TraP4, TraP8, TraP23 ou TraP5) fundido à extremidade a 5' de uma versão sintética do gene da 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (DGT-28), que teve os códons otimizados para a expressão em plantas. O cassete de expressão de DGT-28 terminava com uma região não traduzida a 3' (UTR) que compreende o terminador da transcrição e um sítio de poliadenilação de um gene da lipase (Vp1) de Z. mays (Paek e outros, Mol. Cells 1998 30;8(3) 336-42). O cassete de seleção de PAT compreendido do promotor, da região não traduzida a 5' e do íntron do gene da Actina (Act1) de Oryza sativa (McElroy e outros, The Plant Cell 1990 2( 2) 163-171), seguidos por uma versão sintética do gene da fosfinotricina acetil transferase (PAT) isolado de Streptomyces viridochromogenes, que teve os códons otimizados para a expressão em plantas. O gene PAT codifica uma proteína que confere resistência a inibidores de glutamina sintetase que compreendem fosfinotricina, glufosinato e bialaphos (Wohlleben e outros, Gene 1988, 70(1), 25-37). O cassete de seleção era terminado com a 3' UTR que compreende o terminador da transcrição e os sítios de poliadenilação do gene 35s do vírus mosaico da couve flor (CaMV) (Chenault e outros, Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396).
[00279] O cassete de seleção foi sintetizado por um fornecedor de síntese de genes comercial (GeneArt, Life Technologies) e clonado dentro de um vetor binário autorizado pela Gateway. Os cassetes de expressão de DGT-28 foram subclonados dentro de pDONR221. O clone ENTRY resultante foi utilizado em uma reação LR Clonase II (Invitrogen, Life Technologies) com o vetor binário autorizado pela Gateway que codifica o cassete de expressão da fosfinotricina acetil transferase (PAT). Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente verificadas através da digestão por restrição do DNA purificado utilizando endonucleases de restrição obtidas na New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) e na Promega (Promega Corporation, WI). As preparações de DNA plasmideal foram realizadas utilizando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) ou o Pure Yield Plasmid Maxiprep System (Promega Corporation, WI), seguindo as instruções dos fabricantes. O DNA plasmideal de clones selecionados foi sequenciado utilizando o protocolo do ABI Sanger Sequencing e do Big Dye Terminator v3.1 cycle (Applied Biosystems, Life Technologies). Os dados de sequência foram montados e analisados utilizando o software SEQUENCHER™ (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI).
[00280] Os quatro clones de expressão binários resultantes: pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) e pDAS000125 (TraP5-DGT28) foram cada um transformados na cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105.
[00281] Produção de eventos transgênicos de trigo com a construção de expressão de dgt-28. Plantas de trigo transgênicas expressando uma das quatro construções de expressão de DGT-28 foram geradas através da transformação mediada por Agrobacterium utilizando a linhagem de trigo doadora Bobwhite MPB26RH, seguindo um protocolo similar ao de Wu e outros, Transgenic Research 2008, 17:425-436. Os supostos eventos transgênicos T0 foram selecionados em relação à tolerância à fosfinotricina (PPT), o fenótipo conferido pelo marcador selecionável PAT e transferidos para o solo. As plantas T0 foram crescidas sob condições de restrição de estufa e sementes T1 foram produzidas. De forma geral, aproximadamente 45 eventos T0 independentes foram gerados para cada construção de expressão de DGT-28.
[00282] Resistência ao glifosato em eventos de trigo com dgt-28 de trigo To. Foi permitido que os eventos TO se aclimatem na estufa e foram crescidos até que 2-4 folhas de aparência normal novas tivessem emergido partindo do vertículo (isto é, as plantas tinham sofrido transição da cultura de tecido para as condições de crescimento em estufa). As plantas foram crescidas a 25°C sob 12 horas de iluminação suplementar na estufa até a maturidade. Uma verificação inicial de tolerância ao glifosato e análises de Taqman foram completadas nas plantas T1 crescidas sob as mesmas condições que são descritas anteriormente. Os dados permitiram que a determinação de eventos T1 herdáveis fosse adicionalmente caracterizada. Seis eventos T1 com baixo número de cópias (1-2 cópia) e dois com várias cópias foram replantados sob condições de estufa e crescidos até o estágio de 3 folhas. As plantas T1 foram borrifadas com uma formulação comercial de glifosato (Durango DMATM) partindo de uma faixa de 420 - 3360 g ae/ha, que é capaz de danificar significativamente as linhagens de trigo não transformadas. A adição de 2% p/v de sulfato de amônio foi incluída na aplicação. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >75% de danos ao controle não transformado Bob White MPB26RH. O herbicida foi aplicado.
[00283] Neste exemplo, as aplicações de glifosato foram utilizadas tanto para determinar a segregação do gene dgt-28 na geração T1 bem como para demonstrar tolerância a níveis crescentes de glifosato. A resposta das plantas é apresentada em termos de uma escala de danos visuais 21 dias após o tratamento (DAT). Os dados são apresentados na forma de um histograma de indivíduos que exibem menos de 25% de danos visuais (4), 25%-50% de danos visuais (3), 50%-75% de danos visuais (2) e mais de 75% de danos (1). Uma média aritmética e um desvio padrão são apresentados para cada construção utilizada para transformação do trigo. A classificação da faixa de resposta individual também é indicada na última coluna para cada taxa e transformação. O trigo não transformado do tipo selvagem (c.v. Bob White MPB26RH) serviu como um controle sensível ao glifosato. Na geração T1 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste em relação a cada evento e, portanto, foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas conterão metade da dose do gene que as plantas homozigotas, portanto, uma variabilidade de resposta ao glifosato pode ser esperada na geração T1.
[00284] Os resultados das plantas de trigo com dgt-28 T1 demonstraram que a tolerância ao glifosato foi atingida em taxas até 3360 g ae/ha com os peptídeos de trânsito para o cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23. Tabela 31. Os dados são de um evento T1 com baixo número de cópias, mas são representativos da população para cada construção.Tabela 31. Resposta de eventos de tricô com dgt-28 T1 com baixo número de cópias ao glifosato 21 dias após o tratamento.
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[00285] Em 21 DAT, as plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que se segregaram na forma de uma característica Mendeliana dominante de lócus único (3R:1S) como determinado através da análise de Qui quadrado. Tabela 32. Estes dados demonstram que dgt-28 pode ser herdado na forma de um gene de resistência ao glifosato robusta em uma espécie de monocotiledônea.Tabela 32. Porcentagem de eventos de dgt-28 T1 pela construção que demonstrava herdabilidade de uma maneira Mendeliana com base em seleção com glifosato em taxas variando de 420-3360 g ae/ha.
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Cry2Aa:
[00286] A eficácia dos peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 sobre a expressão da proteína Cry2Aa em Arabidopsis thaliana foi avaliada. Plantas transgênicas de Arabidopsis que continham peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 fundidos à proteína Cry2Aa foram analisadas em relação à tolerância a insetos à lagarta falsa medideira da soja (SBL) e à larva de traça do tabaco (TBW).
[00287] A sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12 foi clonada dentro de uma construção de expressão em planta pDAB107540 e testada em Arabidopsis. As sequências de polinucleotídeos que codificam as sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12 v3 (SEQ ID NO: 13) foram sintetizadas e incorporadas dentro de uma construção plasmideal. A construção resultante continha duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU era compreendida do promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10 promotor; Callis, e outros, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493), do gene de fusão TraP-cry2Aa (TraP-Cry2Aa) e da região não traduzida a 3' do ORF 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3'UTR; Patente U.S. N°. 5.428.147). A segunda PTU era compreendida do promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca (CsVMV promotor; Verdaguer e outros, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139), do gene dsm-2 (DSM2; Pedido de Patente U.S. N°. 2011/0107455) e da região não traduzida a 3' do ORF 1 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3'UTR; Huang e outros, (1990) J. Bacteriol., 172:1814-1822). A construção pDAB107540 contém o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12v3 (Figura 18). Um plasmídeo de controle, 107617, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto a montante do gene cry2Aa foi construído e incluído nos estudos (Figura 19). As construções foram confirmadas através da digestão com enzima de restrição e sequenciamento. Finalmente, as construções foram transformadas em Agrobacterium tumefaciens e armazenadas em estoques em glicerol.
[00288] A construção pDAB107540 foi transformada em Arabidopsis thaliana através da transformação de planta mediada por Agrobacterium tumefaciens. Sucintamente, 12 até 15 plantas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia, Col-0) foram crescidas em vasos de 10,16 cm (4 polegadas) em uma estufa com intensidade de luz de 250 μmoles/m2, 25°C, 18/6 horas de luz/escuridão. Os caules de flores primários foram aparados uma semana antes da transformação. Os inóculos de Agrobacterium foram preparados através da incubação de 10 μL de estoques de Agrobacterium recombinantes em glicerol em 100 mL de caldo LB (100 mg/L de espectinomicina, 50 mg/L de Canamicina) a 28°C com agitação a 225 rpm durante 72 horas. Uma quantidade de culturas de Agrobacterium foi medida com um espectrômetro e quando as células atingiram uma DO 600 de 0,8 as células foram coletadas por centrifugação. A seguir, as células foram resuspensas em 3-4 volumes de 5% de sacarose e 0,04% de Silwet-L77 e 10 μg/L de meio de infiltração de benzamino purina (BA). As partes das plantas acima do solo foram imersas dentro da solução de Agrobacterium durante 5-10 minutos, com agitação suave. As plantas foram então transferidas para a estufa para crescimento normal com rega regular e fertilização até a produção de sementes.
[00289] Aproximadamente 200 mg(s) de sementes T1 agrupadas foram plantados igualmente em bandejas de seleção (bandejas de germinação de 26,67 cm x 53,34 cm x 2,54 cm (10,5 polegadas x 21 polegadas x 1 polegada) T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN). As mudas foram borrifadas com uma solução a 0,20% (20 μL / 10 mL de dH2O) de herbicida glufosinato (Liberty) em um volume de spray de 10 mL/bandeja (703 L/ha) 5 dias após o plantio e novamente em 10 dias após o plantio utilizando uma ponteira de spray de ar comprimido DeVilbiss. Entre 4 até 7 dias após a segunda aplicação de glufosinato, as plantas resistentes a herbicida foram identificadas e transplantadas para a produção de sementes T2. As sementes T2 resultantes foram utilizadas nos estudos descritos a seguir.
[00290] Uma alíquota pequena de sementes T2 (aproximadamente 100-200 sementes) para cada evento foi suspensa em 40 mL de solução de agarose a 0,1% e estratificada a frio a 4 °C durante 24 h. As sementes estratificadas foram então plantadas por uma pipeta de 10 mL sobre a superfície de quatro superfícies planas em uma superfície plana de propagação. As superfícies planas foram preenchidas com meio de solo Sunshine #5 (Sun Gro; Bellevue, WA) e cobertas ligeiramente com vermiculita fina. As bandejas foram saturadas em fertilizante de Hoagland antes do plantio e quando necessário depois disso. Após o plantio, cúpulas de umidade foram utilizadas para cobrir as bandejas e estas foram então colocadas dentro de uma câmara de crescimento Conviron™ ajustada a 24°C com um fotoperíodo de 16 h. Luzes incandescentes e fluorescentes forneceram um nível de iluminação de 200 PAR. Após 5 dias as sementes germinaram e as cúpulas foram removidas. A primeira seleção com herbicida de transformantes foi no dia 6 e a segunda no dia 10. O herbicida Liberty (a.i., glufosinato-amônio) foi aplicado utilizando um pulverizador manual atomizador DeVilbiss a uma taxa de 200 g ae/ha para remover os nulos. Aproximadamente 25% eram nulos como esperado. Uma fileira de controles do tipo selvagem também foi incluída na seleção e tinha 100% de mortalidade após duas aplicações de herbicida. Em 14 dias as plantas estavam prontas para transplantar. Doze plantas foram selecionadas de cada evento para ensaio biológico e foram transplantadas para vasos de 7,62 cm (3 polegadas) preenchidos com solo Sunshine #5 que tinha uma leve cobertura de vermiculita fina. As superfícies planas foram pré-encharcadas com fertilizante de Hoagland antes do transplante e depois disso quando necessário. Os transplantes foram propagados em uma estufa não condicionada com ar ajustada a 25°C com 14 horas de luz suplementar. O desenvolvimento de síliquas foi inibidor através do corte com tesouras e foi assim criado mais tecido vegetal para teste. As plantas estavam prontas para a amostragem de DNA em 16-18 dias e prontas para ensaio biológico em aproximadamente 23 dias. As supostas plantas transgênicas foram verificadas utilizando ensaios de confirmação molecular e os eventos identificados foram desenvolvidos para análise de proteína e resultados de ensaio biológico.
[00291] As plantas transformadas geralmente exibiam um fenótipo saudável embora algumas plantas fossem menores em tamanho quando comparadas visualmente com o tipo selvagem. A análise do número de cópias do gene para cada construção de Arabidopsis exibia resultados de inserção comparáveis para todas as construções, com aproximadamente 50% das plantas possuindo > 3 cópias do gene de interesse cry2Aa e aproximadamente 50% possuindo 1-2 cópias do gene.
[00292] Os níveis de expressão da proteína Cry2Aa dos Eventos de Arabidopsis T1 variavam amplamente. A detecção de proteína foi concluída utilizando um ensaio de ELISA para quantificar a expressão da proteína Cry2Aa. Geralmente, os níveis de expressão de proteína se correlacionavam com o número de cópias de inserto da fita T para cada Evento. Eventos com alto número de cópias da fita T (por exemplo, >3 Eventos de inserção) geralmente produziam maiores níveis de expressão média de proteína que os Eventos com baixo número de cópias da fita T para ambos os conjuntos de eventos de transformação de Arabidopsis (por exemplo, Eventos de pDAB107617 expressando Cry2Aa sem um TraP e eventos de pDAB107540 expressando Cry2Aa com um peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP 12).
[00293] A geração T2 de plantas de Arabidopsis expressava valores de proteína Cry2Aa que eram reduzidos em comparação com os valores de expressão das plantas de Arabidopsis T1. Estes resultados indicaram que a expressão de proteína era variável entre cada conjunto de eventos. Níveis médios de expressão de proteína obtidos partindo de Eventos homozigotos eram maiores que os níveis médios de expressão de proteína obtidos partindo de Eventos hemizigotos para todos os Eventos de plantas testados (por exemplo, Eventos sem um TraP [pDAB107617] e com TraP12 [pDAB107540]). Os Eventos de Arabidopsis que continham mais de duas cópias de um inserto da fita T tinham níveis mais altos de expressão do que os Eventos de Arabidopsis que continham apenas uma cópia única. Apesar do decréscimo nos níveis de expressão de proteína da geração T1 para a T2, a incorporação do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 dentro das construções resultava em Eventos de Arabidopsis transgênicos que expressavam a proteína Cry2Aa.
[00294] Ambos os conjuntos de Eventos de Arabidopsis T1 foram testados em experimentos de ensaio biológico para insetos. Em geral, Eventos com alto número de cópias que expressavam maiores quantidades de proteína Cry2Aa resultavam em menores quantidades de danos nas folhas quando comparados com os Eventos com baixo número de cópias. Havia uma correlação entre a expressão de proteína e a proteção das folhas tanto contra SBL quanto TBW para os Eventos de Arabidopsis expressando Cry2Aa sem um TraP (r2=0,49 (SBL), 0,23(TBW)) e para Eventos de Arabidopsis expressando Cry2Aa com TraP 12 (r2=0,57 (SBL), 0,30 (TBW)). De forma resultante, um aumento na expressão de proteína causava proteção significativa contra danos nas folhas (Pr< 0,05).
[00295] Plantas de Arabidopsis foram protegidas de SBL em ambos os Eventos de Arabidopsis com TraP12 e sem TraP. A expressão de Cry2Aa com e sem um TraP12 resultava em menos que 30% de danos nas folhas com expressão mínima de proteína de aproximadamente 0,75 ng/cm2 para Eventos com TraP12: Cry2Aa e aproximadamente 1,5 ng/cm2 para Eventos de Cry2Aa sem um TraP. Avaliações do Evento de Arabidopsis de expressão de Cry2Aa com e sem TraP12 resultaram em menos que 20% de danos nas folhas, com expressão mínima de proteína de aproximadamente 1,1 ng/cm2 para Eventos de Arabidopsis com TraP12 e aproximadamente 2,0-2,5 ng/cm2 para Eventos de Arabidopsis sem TraP.
[00296] Plantas de Arabidopsis foram protegidas de TBW tanto pelos Eventos de Arabidopsis com TraP12 quanto sem TraP. A TBW era mais sensível à proteína Cry2Aa que SBL quando alimentada com material vegetal obtido dos Eventos de Arabidopsis. Concentrações de proteína tão baixas quanto aproximadamente 0,75 e 1,5 ng/cm2 de Cry2Aa resultaram em menos de 30% de danos nas folhas quando a proteína Cry2Aa era expressa em combinação com TraP12 e sem TraP, respectivamente. Nos 20% do ponto limite de danos nas folhas, a proteção das folhas proveniente de Eventos de Arabidopsis com TraP12 resultava de níveis de aproximadamente 1,1 ng/cm2 de proteína Cry2Aa enquanto que 2,0-2,5 ng/cm2 de proteína Cry2Aa expressa eram necessários partindo de Eventos de Arabidopsis que não possuíam um TraP.
[00297] Os peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 não reduziam a eficácia da expressão da proteína Cry2Aa em Arabidopsis thaliana. Plantas de Arabidopsis transgênicas que continham os peptídeos de trânsito para o cloroplasto quiméricos TraP12 fundidos à proteína Cry2Aa expressavam níveis mais altos da proteína Cry2Aa que forneciam tolerância a insetos à lagarta falsa medideira da soja (SBL) e à larva de traça do tabaco (TBW).
[00298] Exemplo 4: Sequências do Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto (TraP) Quimérico para a Expressão de Transgenes de Importância Agronômica no Milho
Cry2Aa:
[00299] A proteína Cry2Aa de Bacillus thuringiensis demonstrou atividade contra Helicoverpa zea (CEW) e Ostrinia nubilalis (ECB). Uma única versão do gene cry2Aa (SEQ ID NO: 14), com tendência de códons para o milho, foi testada no milho. Neste experimento, a Cry2Aa foi avaliada isoladamente e em associação com o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12v4 no milho para determinar a atividade de tolerância a insetos e para avaliar o efeito que teria a sequência do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12v4 sobre a expressão da proteína Cry2Aa no milho.
[00300] A sequência do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12v4 (SEQ ID NO: 15) e um ligante do códon GCA foram clonados a montante do gene cry2Aa e incorporados dentro da construção pDAB107686 (Figura 12) para testar a tolerância a insetos na planta de milho. A construção resultante continha duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU era compreendida do promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbi1 promotor; Christensen, A., Sharrock R. e Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expressio and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), do gene de fusão TraP12-cry2Aa (TraP12 Cry2Aa) e da região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR; US Patent No 7.179.902). A segunda PTU era compreendida do promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar (SCBV promotor; Patente U.S. N°. 6.489.462), do gene de tolerância a herbicida aad-1 contendo um Líder do MSV e o íntron 6 da álcool desidrogenase 1 (AAD-1; Patente U.S. N°. 7.838.733 e Sequência Líder do MSV; N°. de Acesso do Genbank FJ882146.1 e o íntron da álcool desidrogenase; N°. de Acesso do Genbank EF539368.1) e da região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR). Um plasmídeo de controle, pDAB107687, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto a montante do gene cry2Aa foi construído e incluído nos estudos (Figura 13). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens para transformação de planta.
[00301] Espigas de Zea mays cultivar B104 foram colhidas 10-12 dias após a polinização. As espigas colhidas foram descascadas e tiveram sua superfície esterilizada por imersão em uma solução de alvejante comercial a 20% (Ultra Clorox® Germicidal Bleach, 6,15% de hipoclorito de sódio) e duas gotas de Tween 20, durante 20 minutos, seguidos por três lavagens em água deionizada esterilizada dentro de um fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8-2,2 mm de comprimento) foram cortados de forma asséptica de cada espiga e distribuídos para dentro de um ou mais tubos de microcentrífuga contendo 2,0 mL de suspensão de Agrobacterium dentro dos quais 2 μL do tensoativo 10% Break-Thru® S233 foram adicionados.
[00302] Após o término da atividade de isolamento dos embriões o tubo dos embriões foi fechado e colocado em sobre uma plataforma giratória durante 5 minutos. O conteúdo do tubo foi então vertido sobre uma placa de meio de cocultivo e a suspensão líquida de Agrobacterium foi removida com uma pipeta de transferência descartável esterilizada. A placa de cocultivo contendo os embriões foi colocada na parte de trás do fluxo laminar com a tampa entreaberta durante 30 minutos; após cujo período de tempo os embriões foram orientados com o escutelo voltado para cima utilizando um microscópio. A placa de cocultivo com os embriões foi então novamente colocada na parte de trás do fluxo laminar com a tampa entreaberta durante mais 15 minutos. A placa foi então fechada, selada com fita 3M Micropore e colocada em uma incubadora a 25°C com 24 horas/dia de luz a aproximadamente 60 μmoles m-2 s-1 de intensidade de luz.
[00303] Após o período de cocultivo, os embriões foram transferidos para o meio de Repouso. Não mais de 36 embriões foram transferidos para cada placa. As placas foram embrulhadas com fita 3M micropore e incubadas a 27°C com 24 horas/dia de luz a aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 de intensidade de luz durante 7-10 dias. Os embriões que produziram calos foram então transferidos para o meio de Seleção I. Não mais de 18 embriões que produziram calos foram transferidos para cada placa de meio de Seleção I. As placas foram embrulhadas com fita 3M micropore e incubadas a 27°C com 24 horas/dia de luz a aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 de intensidade de luz durante 7 dias. Os embriões que produziram calos foram então transferidos para o meio de Seleção II. Não mais de 12 embriões que produziram calos foram transferidos para cada placa de Seleção II. As placas foram embrulhadas com fita 3M micropore e incubadas a 27°C com 24 horas/dia de luz a aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 de intensidade de luz durante 14 dias.
[00304] Neste estágio os calos resistentes foram transferidos para o meio de Pré-Regeneração. Não mais de nove calos foram transferidos para cada placa de Pré-Regeneração. As placas foram embrulhadas com fita 3M micropore e incubadas a 27°C com 24 horas/dia de luz a aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 de intensidade de luz durante 7 dias. Os calos em regeneração foram então transferidos para o meio de Regeneração em Phytatrays™ e incubados a 28°C com 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia a aproximadamente 150 μmoles m-2 s-1 de intensidade de luz durante 7-14 dias ou até os brotos se desenvolverem. Não mais de cinco calos foram colocados em cada Phytatray™. Brotos pequenos com raízes primárias foram então isolados e transferidos para o meio de Brotamento/Enraizamento. As plantas jovens enraizadas de aproximadamente 6 cm ou mais altas foram transplantadas para dentro do solo e transferidas para fora para uma câmara de crescimento para enrijecimento.
[00305] As plantas transgênicas receberam identificadores únicos completos e transferidas em uma base regular para a estufa. As plantas foram transplantadas das Phytatrays™ para vasos pequenos preenchidos com meio de crescimento (Premier Tech Horticulture, ProMix BX, 0581 P) e cobertas com cúpulas de umidade para ajudar a aclimatar as plantas. As plantas foram colocadas dentro de uma câmara de crescimento Conviron™ (28°C/24°C, foto período de 16 horas, 50-70% de UR, 200 μmoles de intensidade de luz) até atingirem o estágio V3-V4. Esta etapa ajuda na aclimatação das plantas ao solo e temperaturas mais ríspidas. As plantas foram então transferidas para a estufa (Light Exposition Type: Photo or Assimilation; High Light Limit: 1200 PAR; período de dia de 16 horas; 27°C de Dia/24°C à Noite) e transplantadas dos vasos pequenos para vasos de 13,97 cm (5,5 polegadas). Aproximadamente 1-2 semanas após o transplante para vasos maiores foram obtidas amostras das plantas para o ensaio biológico. Uma planta por evento foi analisada biologicamente.
[00306] Eventos de seleção foram identificados para avançar para a geração seguinte com base no número de cópias dos genes, detecção de proteína por Western blot e atividade contra os insetos do ensaio biológico. Os eventos que continham o gene de resistência à espectinomicina foram anotados, mas não necessariamente omitidos para avançar. Os eventos selecionados para avançar foram transplantados dentro de vasos de 5 galões. Foram obtidas observações periodicamente para rastrear quaisquer fenótipos anormais. Os sacos de brotos foram colocados sobre os brotos antes da emergência de silk para prevenir a contaminação cruzada pelo pólen stray desgarrado. Quaisquer brotos produzindo silks antes da cobertura foram anotados e o broto foi removido. O segundo broto foi então coberto e utilizado para as polinizações. As plantas que produziram brotos anormais ou nenhum foram registradas nos bacos de dados. Silks foram cortados no dia antes das polinizações para fornecer uma moita uniforme para aceitar pólen e as plantas foram autopolinizadas.
[00307] As plantas para a seleção de T1 foram borrifadas em 7 dias após o plantio. Estas foram crescidas em vasos de 10,16 cm (4 polegadas) de solo para plantio em vasos Metro 360 com 15 vasos por superfície plana. O estágio de crescimento de mudas era V1-V1.5. Os vasos com germinação insuficiente ou contendo plantas muito pequenas (vertículo ainda fechado) foram marcados de forma que não fossem incluídos na avaliação de seleção. Superfícies planas inteiras de plantas foram então colocadas em bandejas carreadoras secundárias para aplicação com o pulverizador track. As bandejas foram colocadas duas por vez no pulverizador track de Mandel, calibrado para fornecer um volume de 187 L/ha para a área alvo utilizando um bocal ventilado plano 8002E (Tee Jet). Uma solução de 35 g ae/ha de Assure II (quizalofop) + 1% de COC (concentrado de óleo de planta de cultivo) foi formulada para a aplicação. Um volume de 15 mL/spray foi utilizado para calcular a solução de spray total necessária. Cálculos; (35 g ae/ha) x (1 ha/187L) x (1 L/ 97,7 g ae de Assure II) = 0,192% de solução ou 28,74 μL/15 mL de H2O + 1% v/v). Após a aplicação, foi então permitido que as plantas secassem durante uma hora em um lab de spray antes de retornarem para a estufa. Aproximadamente 1-2 semanas após o transplante para vasos maiores foram obtidas amostras das plantas para o ensaio biológico. Uma planta por evento foi analisada biologicamente.
[00308] Todos os eventos T0 que passaram na verificação de análise molecular foram analisados em relação aos níveis de expressão da proteína Cry2Aa. Os Eventos provenientes da construção de controle, pDAB107687, que compreendia Cry2Aa sem um TraP tinham nível de expressão médio significativamente mais alto de Cry2Aa (15,0 ng/cm2) quando comparados com os Eventos provenientes de pDAB107686 (1,4 ng/cm2) que continha TraP12. Apesar dos níveis de expressão reduzidos dos Eventos com pDAB107686, estes eventos ainda expressavam a proteína Cry2Aa.
[00309] Os eventos T1 foram também analisados em relação aos níveis de expressão da proteína Cry2Aa. Os eventos provenientes da construção de controle, pDAB107687, que compreendia Cry2Aa sem um TraP tinham nível de expressão médio significativamente mais alto de Cry2Aa (55 e 60 ng/cm2) quando comparados com os Eventos provenientes de pDAB107686 (aproximadamente 2 até 3,7 ng/cm2) que continha TraP12. Apesar dos níveis de expressão reduzidos dos Eventos com pDAB107686, estes eventos ainda expressavam a proteína Cry2Aa.
[00310] Plantas transgênicas contendo cópias únicas da fita T compreendendo um gene cry2Aa foram testadas em relação à atividade inseticida em ensaios biológicos conduzidos com larvas de lepidóptera neonatas sobre as folhas das plantas transgênicas. As espécies de lepidóptera analisadas eram a Broca do Milho Europeia, Ostrinia nubilalis (Hübner) (ECB) e o Verme da Espiga de Milho, Helicoverpa zea (CEW).
[00311] Bandejas de 32 poços (C-D International, Pitman, NJ) foram parcialmente preenchidas com uma solução de ágar a 2% e foi permitido que o ágar solidificasse. Seções foliares aproximadamente uma em duas foram obtidas de cada planta e colocadas isoladamente dentro dos poços das bandejas de 32 poços. Um pedaço de folha foi colocado dentro de cada poço e dois pedaços de folha foram testados por planta e por inseto. Os insetos foram infestados em massa utilizando um pincel para pintura, colocando dez larvas neonatas dentro de cada poço. As bandejas foram seladas com tampas adesivas perfuradas que permitiam a ventilação durante o teste. As bandejas foram colocadas a 28°C, 40% de UR, 16 horas de luz: 8 horas de escuridão durante três dias. Após a duração do teste, um escore de porcentagem de danos simples foi obtido para cada pedaço de folha. Foi calculada a média dos escores de danos para cada teste e esta foi utilizada junto com a análise de expressão de proteína para conduzir análises de correlação.
[00312] Os resultados do ensaio biológico de T0 e T1 indicaram que a sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12 era funcional uma vez que os Eventos com pDAB107686 forneciam proteção contra os insetos testados no ensaio biológico. Nos Eventos T1, as plantas expressando a proteína Cry2Aa sem um TraP, (pDAB107687) tinham um dano médio das folhas que era significativamente maior que o das plantas expressando a proteína Cry2Aa com um TraP12 (pDAB107686) em todas as espécies de insetos testadas. Embora os Eventos com pDAB107686 com TraP12 tivessem mais danos nas folhas quando comparados com os Eventos sem um TraP, os Eventos com pDAB107686 forneciam proteção contra os insetos que foram analisados biologicamente.
VIP3Ab1:
[00313] A proteína Vip3Ab1 de Bacillus thuringiensis demonstrou atividade contra Helicoverpa zea (CEW) e Mariposa Migratória (FAW) e Mariposa Migratória resistente (rFAW). Os genes Vip3Ab1 v6 (SEQ ID NO: 16) e Vip3Ab1 v7 (SEQ ID NO: 17) foram expressos e testados em relação à tolerância a insetos no milho. Neste experimento, Vip3Ab1v6 e Vip3Ab1 v7 foram avaliados isoladamente e em associação com o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 no milho para determinar a atividade de tolerância a insetos e para avaliar o efeito que a sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 v2 teria sobre a expressão das proteínas Vip3Ab1v6 e Vip3Ab1 v7 no milho.
[00314] A construção pDAB112711 (Figura 14) contém a sequência de polinucleotídeos que codifica o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12 v2 (SEQ ID NO: 11) e um ligante do códon GCA clonados a montante do gene Vip3Ab1v6 para testar a tolerância a insetos na planta de milho. A construção resultante continha duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU era compreendida do promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbi1 promotor; Christensen, A., Sharrock R. e Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), do gene de fusão TraP12- Vip3Ab1v6 (TraP12 - Vip3Ab1v6) e da região não traduzida a 3' da Peroxidase 5 de Zea mays (ZmPer 5 3'UTR). A construção foi confirmada através da digestão com enzima de restrição e sequenciamento. A segunda PTU era compreendida do promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar (SCBV promotor; Patente U.S. N°.6,489,462), do gene de tolerância a tolerância aad-1 contendo um Líder do MSV e o íntron 6 da álcool desidrogenase 1 (AAD-1; Patente U.S. N°. 7.838.733 e Sequência Líder do MSV; N°. de Acesso do Genbank FJ882146.1 e o íntron da álcool desidrogenase; N°. de Acesso do Genbank EF539368,1) e da região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR). Um plasmídeo de controle, pDAB111479, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto a montante do gene Vip3Ab1v6 foi construído e incluído nos estudos (Figura 15). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens para transformação de planta.
[00315] A construção pDAB112712 (Figura 16) que contém a sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12 v2 (SEQ ID NO: 11) e um ligante do códon GCA foi clonado a montante do gene Vip3Ab1v7 e testado para o teste de tolerância a insetos na planta de milho. A construção resultante continha duas unidades de transcrição de planta (PTU). A primeira PTU era compreendida do promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbi1 promotor; Christensen, A., Sharrock R. e Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689), do gene de fusão TraP12- Vip3Ab1v7 (TraP12 - Vip3Ab1v7) e da região não traduzida a 3' da Peroxidase 5 de Zea mays (ZmPer 5 3'UTR). A construção foi confirmada através da digestão com enzima de restrição e sequenciamento. A segunda PTU era compreendida do promotor do vírus baciliforme da cana de açúcar (SCBV promotor; Patente U.S. N°. 6.489.462), do gene de tolerância a herbicida aad-1 contendo um Líder do MSV e o íntron 6 da álcool desidrogenase 1 (AAD-1; Patente U.S. N°. 7.838.733 e Sequência Líder do MSV; N°. de Acesso do Genbank FJ882146.1 e o íntron da álcool desidrogenase; N°. de Acesso do Genbank EF539368.1) e da região não traduzida a 3' da Lipase de Zea mays (ZmLip 3'UTR). Um plasmídeo de controle, pDAB112710, que não continha uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto a montante do gene Vip3Ab1v7 foi construído e incluído nos estudos (Figura 17). Os plasmídeos foram introduzidos em Agrobacterium tumefaciens para transformação de planta.
[00316] A transformação do milho, a expressão de proteína e os ensaios biológicos com insetos foram completados seguindo os protocolos descritos anteriormente e os resultados são mostrados na Tabela 33. Os resultados de ensaios biológicos com insetos indicaram que a sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico Trap12 era funcional e que os Eventos com pDAB112711 e pDAB112712 forneciam proteção contra as espécies de insetos testadas no ensaio biológico. Nos Eventos testados, os Eventos de planta expressando a proteína Vip3Ab1 v6 sem um TraP, (pDAB111479), tinham um nível mais alto de danos nas folhas que os Eventos de planta expressando a proteína Vip3Ab1 v6 com TraP12 (pDAB112711) para ambas as espécies de insetos CEW e FAW. Entretanto, as plantas expressando a proteína Vip3Ab1 v7 sem um TraP (pDAB112710) tinham uma média de danos nas folhas que não era significativamente diferente que aquela da planta expressando a proteína Vip3Ab1 v7 com TraP12 (pDAB112712). Tanto a proteína Vip3Ab1 v7 sem um TraP (pDAB112710) quanto a proteína Vip3Ab1 v7 com um TraP12 (pDAB112712) produziam Eventos de planta que forneciam controle a insetos contra as espécies CEW e FAW. Em conclusão, os Western blots e os ensaios biológicos indicaram todos os Eventos testados expressavam a proteína Vip3 Ab1.Tabela 33. Resultados do ensaio bioquímico e resultados do ensaio biológico para as sequências codificadoras de Vip3Ab1 v6 e Vip3Ab1 v7 que foram fundidas ao TraP12 quando comparadas com as sequências codificadoras de Vip3Ab1 v6 e Vip3Ab1 v7 que não possuíam uma sequência de peptídeo de trânsito para o cloroplasto.
Figure img0060
Expressão média Método de análise ELISA (ng/cm2) LC/MS/MS (fmol/cm2) Eventos positivos no Western Eventos testados Danos totais de CEW Média da % de Danos nas Folhas por CEW Danos totais de FAW Média da % de Danos nas Folhas por FAW
Exemplo 5: Clivagem In Planta de Sequências de Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto (TraP) Quimérico Resultados de MALDI:
[00317] O sítio de clivagem do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 e TraP13 foi determinado através de espectrometria MALDI e do sequenciamento por degradação de Edman N-terminal. O material vegetal foi obtido partindo de plantas transgênicas que continham os genes de fusão TraP12-dgt14, TraP12-dgt28, TraP13-dgt14 e TraP13-dgt28 e foi analisado para determinar a localização de clivagem do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico que ocorria durante a translocação dentro do cloroplasto.
[00318] As proteínas semipurificadas provenientes de uma amostra de planta foram separadas por SDS-PAGE. As bandas de proteína de um tamanho equivalente ao peso molecular de YFP foram cortadas do gel, descoradas e secas. A seguir, as bandas de proteína secas foram digeridas no gel com Tripsina (Promega; Madison, WI) em 25 mM de bicarbonato de amônio durante toda a noite a 37°C. Os peptídeos foram purificados por uma C18 ZipTip™ (Millipore, Bedford, MA) e eluídos com 50% de acetonitrila/0,1% de TFA. As amostras foram misturadas com a matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinâmico em uma proporção de 1:1 e a mistura foi transferida para uma placa de amostra de MALDI e seca com ar.
[00319] O espectro de massa do peptídeo foi gerado utilizando um Voyager DE-PRO MALDI-TOF Mass Spectrometer™ (Applied Biosystems; Framingham, MA). A calibração externa foi realizada através da utilização de uma Calibration Mixture 2™ (Applied Biosystems). A calibração interna foi realizada utilizando os picos de autólise da tripsina em m/z 842.508, 1045.564 e 2211.108. Todos os espectros de massa foram coletados no modelo de refletor de íons positivos. A análise de "fingerprint" da massa do peptídeo (PMF) foi realizada utilizando PAWS™ (Protein Analysis WorkSheet) freeware da Proteometrics LLC através da combinação do PMF da amostra com o PMF teórico da proteína alvo para verificar se a amostra é a proteína alvo. A identificação da proteína foi realizada através da busca no Banco de Dados utilizando MASCOT (MatrixScience, Londres, UK) contra o banco de dados de proteína do NCBI NR.
Sequenciamento N-Terminal Através da Degradação Química de Edman:
[00320] O sequenciamento N-terminal foi realizado em um Procise Protein Sequencer (modelo 494) da Applied Biosystems (Foster City, CA). As amostras de proteína foram separadas primeiramente por SDS-PAGE, então "transferido" sobre membrana de PVDF. As bandas de proteína foram cortadas da membrana e carregadas no Procise Sequencer. Oito ciclos de degradação química de Edman foram corridos para cada amostra para obter cinco resíduos de AA no N-terminal. Uma mistura padronizada de 20 PTH-aminoácidos (Applied Biosystems) foi corrida com cada amostra. Os resíduos de aminoácidos de cada degradação de Edman foram determinados com base em seus tempos de retenção partindo da coluna C-18 contra os padrões.
[00321] Os resultados do sequenciamento com MALDI indicaram que as proteínas DGT-28 e DGT14 eram expressas e que as sequências de peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP foram processados. A Tabela 34 lista as sequências processadas que foram obtidas através da utilização da degradação de Edman N-terminal e do sequenciamento com MALDI.Tabela 34. Sítios de clivagem de TraP12 e TraP13 fundidos com as sequências codificadoras de dgt-14 ou dgt-28. A caixa cinzenta indica o sítio de processamento.
Figure img0061
Exemplo 6: "Acúmulo" de Sequências de Polinucleotídeos que compreendem as Sequências de Peptídeo de Trânsito para o Cloroplasto Quimérico (TraP)
[00322] O peptídeo de trânsito quimérico TraP12 foi fundido à extremidade a 5' das sequências dos genes cry1Ac, cry1Ca e cry1F que foram "acumulados" em construções de plasmídeos com várias PTUs para determinar se o peptídeo de trânsito quimérico TraP12 aumentava ou reduzia a expressão das proteínas dentro de Arabidopsis.
[00323] As construções listadas na Tabela 35 foram montadas utilizando métodos reconhecidos na arte. As construções foram subsequentemente transformadas em Arabidopsis thaliana utilizando o protocolo de transformação mediada por Agrobacterium descrito anteriormente. As plantas de Arabidopsis transgênicas foram obtidas e a expressão de proteína foi determinada através de Western blotting e ensaios de ELISA. Tabela 35. As construções descritas a seguir foram transformadas em Arabidopsis para avaliar os efeitos do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 sobre a expressão de proteína.
Figure img0062
Os resultados da quantificação de proteína indicaram que TraP12 tinha efeitos variáveis sobre os níveis de expressão total da expressão de Cry1Ac, Cry1Ca e Cry1F. A adição do peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 resultou no decréscimo dos níveis de expressão de Cry1F e no aumento dos níveis de expressão de Cry1Ca e Cry1Ac. Independentemente da variabilidade nos níveis de expressão, todos os Eventos de planta testados expressavam proteína e o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 não inibia a expressão de proteína de um transgene. Finalmente, o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12 direcionava as proteínas expressas para dentro dos cloroplastos. A translocação das proteínas expressas para dentro do cloroplasto foi evidenciada por Western blots que exibiam tamanhos de pesos moleculares similares para as proteínas expressas com ou sem o peptídeo de trânsito para o cloroplasto quimérico TraP12.

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que consiste em: uma sequência nucleotídeo sintética derivada de Brassica que codifica um peptídeo, em que o peptídeo consiste em: uma região N-terminal de uma sequência de aminoácidos contígua de um primeiro peptídeo de trânsito de cloroplasto de Brassica; e uma região C-terminal de uma sequência de aminoácidos contígua de um segundo peptídeo de trânsito de cloroplasto, em que a sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em (i) SEQ ID NOs: 5, 11, 13 e 15, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e (ii) SEQ ID NOs: 7 e 12, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, em que preferencialmente a molécula de ácido nucleico isolada é operacionalmente ligada a sequências de nucleotídeos adicionais.
2. Molécula de ácido nucleico isolada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos sintética derivada de Brassica é operacionalmente ligada a uma sequência de nucleotídeos de interesse, em que preferencialmente a molécula de ácido nucleico isolada preenche pelo menos um dos seguintes: i) a molécula de ácido nucleico isolada é ligada ainda a pelo menos uma sequência de nucleotídeos adicionais, cada um codificando um peptídeo de trânsito de cloroplastos, em que a(s) sequência(s) de nucleotídeos adicionais estão operacionalmente ligadas à sequência de nucleotídeos de interesse, em que preferencialmente a pelo menos uma sequência de nucleotídeos adicionais(s) é de um organismo selecionado do grupo que consiste em procariontes, eucariotos fotossintéticos inferiores e clorófitas, ii) a sequência de nucleotídeos sintética derivada de Brassica e a sequência de nucleotídeos de interesse estão operacionalmente ligadas a uma ou mais sequências reguladoras; iii) a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico compreendendo um peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse e um peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos sintética derivada de Brassica.
3. Polipeptídeo quimérico, caracterizado pelo fato de que é codificado pela molécula de ácido nucleico da reivindicação 2 iii), em que preferencialmente o polipeptídeo quimérico preenche pelo menos um dos seguintes: i) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é direcionado para um plastídeo em uma célula contendo plastídeo, em que preferencialmente o polipeptídeo compreende um peptídeo de trânsito de cloroplastos que é removido quando o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é direcionado para o plastídeo, ii) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse cumpre pelo menos um dos seguintes: a) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é uma enzima, em que, preferencialmente, o referido peptídeo é selecionado do grupo que consiste em: acetolactase sintase (ALS), ALS mutado, precursores de ALS, 3-enolpiruvilshiquimato-5-fosfato sintetase (EPSPS), CP4 EPSPS e uma EPSPS de classe III, b) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é expresso em um plastídeo de uma célula em que o referido peptídeo é expresso nativamente, c) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse está envolvido em um processo selecionado do grupo que consiste em resistência a herbicidas, resistência a vírus, resistência a patógenos bacterianos, resistência a insetos, resistência a nematoides, resistência a fungos, vigor de plantas, rendimento de plantas, tolerância à temperatura, tolerância à condição do solo, tolerância a baixo nível de luz, tolerância a baixo nível de água, tolerância a alto nível de água, tolerância ao ambiente químico, cor da semente, modificação do amido, síntese de aminoácidos, fotossíntese, síntese de ácidos graxos, síntese de óleo, síntese de carotenóides, síntese de terpenóides e síntese de amido, em que preferencialmente o referido peptídeo está envolvido na resistência a herbicidas, d) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é selecionado do grupo que consiste em zeaxantina epoxidase, colina monooxigenase, ferrocelatase, ácido graxo ômega-3 dessaturase, glutamina sintetase, provitamina A, hormônios, proteínas toxinas Bt e marcadores úteis na identificação de plantas compreendendo uma característica de interesse, iii) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é um peptídeo fluorescente.
4. Vetor de expressão vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 2.
5. Método para produzir um material vegetal transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende: obter a molécula de ácido nucleico isolada como definida na reivindicação 2; e transformar um material vegetal com a molécula de ácido nucleico, em que preferencialmente o método inclui pelo menos um dos seguintes itens: i) o material vegetal é selecionado do grupo que consiste em uma célula vegetal, um tecido vegetal, uma cultura de tecido vegetal, uma cultura de calo, uma parte da planta e uma planta inteira, em que, preferencialmente, o material vegetal é uma célula vegetal que é incapaz de se regenerar para produzir uma planta; ii) o material vegetal não é uma planta inteira.
6. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que consiste em: um meio derivado de Brassica para direcionar um polipeptídeo a um cloroplasto, em que o meio derivado de Brassica consiste em um região N-terminal de um primeiro peptídeo de trânsito de cloroplasto de Brassica e uma região C-terminal de um segundo peptídeo de trânsito de cloroplasto, em que a sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em (i) SEQ ID NOs: 5, 11, 13 e 15, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e (ii) SEQ ID NOs: 7 e 12, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8; e uma sequência de nucleotídeos de interesse operacionalmente ligada ao meio derivado de Brassica para direcionar um polipeptídeo a um cloroplasto, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo quimérico compreendendo um peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas codificando as mesmas sequências de aminoácidos.
7. Polipeptídeo quimérico, caracterizado pelo fato de que é codificado pela molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 6, em que, preferencialmente, o polipeptídeo quimérico preenche pelo menos um dos seguintes: i) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é direcionado a um plastídeo em uma célula contendo plastídeo, em que preferencialmente, o polipeptídeo quimérico compreende um peptídeo de trânsito de cloroplasto que é removido quando o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é direcionado para o plastídeo, ii) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse cumpre pelo menos um dos seguintes: a) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse está envolvido em um processo selecionado do grupo que consiste em resistência a herbicida, resistência a vírus, resistência a patógenos bacterianos, resistência a insetos, resistência a nematoides, resistência a fungos, vigor de plantas, rendimento de plantas, produtividade de plantas, tolerância à temperatura, tolerância às condições do solo, tolerância a baixo nível de luz, tolerância a baixo nível de água, tolerância a alto nível de água, ambiente químico tolerância, cor da semente, modificação do amido, síntese de aminoácidos, fotossíntese, síntese de ácidos graxos, síntese de óleo, síntese de carotenoides, síntese de terpenoides e síntese de amido, b) o peptídeo codificado pela sequência de nucleotídeos de interesse é selecionado do grupo consistindo de zeaxantina epoxidase, colina monooxigenase, ferrocelatase, dessaturase de ácidos graxos ômega-3, glutamina sintetase, provitamina A, hormônios, proteínas da toxina Bt e marcadores úteis na identificação de plantas que compreendem uma característica de interesse, c) o peptídeo codificado pelo nucleotídeo a sequência de interesse é selecionado do grupo que consiste em: acetolactase sintase (ALS), ALS mutada, precursores de ALS, 3-enolpiruvil-shiquimato-5- fosfato sintetase (EPSPS), CP4 EPSPS e uma EPSPS de classe III.
8. Vetor de expressão vegetal, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 6.
9. Método para produzir um material vegetal transgênico, caracterizado pelo fato de que compreende: obter a molécula de ácido nucleico isolada, como definida na reivindicação 6; e transformar um material vegetal com a molécula de ácido nucleico, em que preferencialmente o método inclui pelo menos um dos seguintes itens: i) o material vegetal é selecionado do grupo que consiste em uma célula vegetal, um tecido vegetal, uma cultura de tecido vegetal, um calo cultura, uma parte da planta e uma planta inteira; ii) o material vegetal não é uma planta inteira.
BR112014019043A 2012-02-01 2013-02-01 Polipeptídeos quiméricos de trânsito de cloroplasto, moléculas de ácido nucleico isoladas, vetores de expressão vegetal, e métodos para a produção de material vegetal transgênico BR112014019043B8 (pt)

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