JP2015505480A - 合成葉緑体輸送ペプチド - Google Patents

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Abstract

本開示は、プラスチドを含有する細胞のプラスチドへ、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質をターゲッティングするための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ポリペプチドをプラスチドに向け得る葉緑体輸送ペプチドおよびそれをコードする核酸分子に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、葉緑体輸送ペプチドを含むトランスジェニック植物材料（例えば、トランスジェニック植物）を製造するための方法、ならびにこのような方法によって製造された植物材料およびそれから製造された植物商品生産物に関する。

Description

優先権の主張
本願は、２０１２年２月１日に出願された米国特許仮出願番号第６１／５９３，５５５号および２０１２年４月１７日に出願された米国特許仮出願番号第６１／６２５，２２２号の利益を主張する。
３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§ １．８２１（ｃ）または（ｅ）に従う声明−ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された配列表
３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§ １．８２１（ｃ）または（ｅ）に従って、配列表のＡＳＣＩＩテキストバージョンを含むファイルは、本出願と同時に提出され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、プラスチド含有細胞のプラスチドへターゲッティングされるポリペプチドを遺伝的にコードし、発現するための組成物および方法に関する。特定の実施形態では、本開示は、ポリペプチドを葉緑体（例えば、高等植物の）にターゲッティングするアミノ酸配列および／またはそれをコードする核酸分子に関する。特定の実施形態では、本開示は、キメラポリペプチドのプラスチドへの輸送を制御するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドおよび／またはそれをコードする核酸分子に関する。
植物細胞は、特徴的な膜系によって区切られており、細胞内で特殊な機能を果たす、一般に「プラスチド」と呼ばれる、個別の細胞内オルガネラを含有する。個々のプラスチドは、光合成、ならびに特定の化学化合物の合成および保存に関与している。すべてのプラスチドは、植物の成長点領域中に存在するプロプラスチドに由来する。プロプラスチドは、例えば、葉緑体、エチオプラスト、有色体、ゲロントプラスト（gerontoplasts）、白色体、アミロプラスト、エライオプラストおよびプロテイノプラストに発達し得る。プラスチドは、細胞内に半自律的に存在し、自身の遺伝子系およびタンパク質合成機構を含有するが、その発達および生合成活性において核細胞質系との密接な協力関係に依存している。
高等植物の光合成葉細胞では、最も顕著なプラスチドは葉緑体である。葉緑体の最も必須の機能は、光合成の光によって駆動される反応の実施である。しかし、葉緑体はまた、植物細胞にとって重要な多数のその他の生合成プロセスも実施する。例えば、細胞の脂肪酸のすべては、葉緑体ストロマに局在する酵素によって、そこで容易に入手可能なＡＴＰ、ＮＡＯＰＨおよび炭水化物を使用して製造される。さらに、光活性化された電子の還元力は、葉緑体における亜硝酸化合物（ＮＯ２ −）のアンモニア（ＮＨ３）への還元を駆動し、このアンモニアが、植物に、アミノ酸およびヌクレオチドの合成に必要な窒素を提供する。
葉緑体はまた、農業化学産業において特に重要なプロセスに参加する。例えば、多くの除草剤が、葉緑体内で実施される機能を遮断することによって作用するということがわかっている。最近の研究によって、いくつかの除草剤の特異的標的が同定された。例えば、トリアジン由来除草剤は、プラストキノン分子を、光化学系ＩＩの３２ｋＤポリペプチド中のその結合部位から移動させることによって光合成を阻害する。この３２ｋＤのポリペプチドは、葉緑体ゲノム中にコードされ、オルガネラ機構によって合成される。トリアジン除草剤に対して耐性である突然変異体植物が得られている。これらの植物は、トリアジン除草剤によってプラストキノンが、もはや移動され得ない突然変異体３２ｋＤポリペプチドを含有する。スルホニル尿素は、葉緑体においてアセト乳酸シンターゼを阻害する。アセト乳酸シンターゼは、イソロイシンおよびバリン合成に関与している。グリホサートは、芳香族アミノ酸の合成に関与する酵素である、５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）の機能を阻害する。すべてのこれらの酵素は、核ゲノムによってコードされるが、葉緑体中に転位置され、そこで実際のアミノ酸合成が起こる。
ほとんどの葉緑体タンパク質は、植物細胞の核中にコードされ、サイトゾルにおいて大きな前駆体タンパク質として合成され、翻訳後、葉緑体中に輸送される。ストロマへの外包膜および内包膜を越える輸送は、ストロマ、チラコイド膜およびチラコイドルーメンに向かう予定であるタンパク質が入るための主要な手段である。チラコイド膜およびチラコイドルーメンへの輸送される前駆体タンパク質の局在性は、細菌タンパク質輸送系と相同である２種を含めた４種の別個の機序によって達成される。したがって、葉緑体におけるタンパク質局在性のための機序は、幾分かは、原核生物の内部共生体に由来する。Cline and Henry (1996) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 12:1-26。
葉緑体発現に向かう予定である前駆体タンパク質は、葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）として知られるＮ末端伸長部分を含有する。輸送ペプチドは、葉緑体表面の特異的認識および葉緑体包膜を越える、ゆえに、葉緑体内の種々のサブコンパートメント（例えば、ストロマ、チラコイドおよびチラコイド膜）へのプレタンパク質の翻訳後転位置の媒介に役立つ。これらのＮ末端輸送ペプチド配列は、葉緑体タンパク質のプラスチド中への輸送に必要な情報のすべてを含有し、輸送ペプチド配列は、プラスチド輸送にとって必要であり、十分である。
そのＮ末端に天然にコードされる輸送ペプチド配列を有すると報告される植物遺伝子として、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）の葉緑体小サブユニット（de Castro Silva-Filho et al. (1996) Plant Mol. Biol. 30:769-80; Schnell et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:3335-42）；ＥＰＳＰＳ（例えば、Archer et al. (1990) J. Bioenerg. and Biomemb. 22:789-810および米国特許第６，８６７，２９３号、同７，０４５，６８４号およびＲｅ．３６，４４９を参照のこと）；トリプトファンシンターゼ（Zhao et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6081-7）；プラストシアニン（Lawrence et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:20357-63）；コリスミ酸シンターゼ（Schmidt et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:27447-57）；集光性葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質（ＬＨＢＰ）（Lamppa et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:14996-14999）；およびシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の葉緑体タンパク質（Lee et al. (2008) Plant Cell 20:1603-22）が挙げられる。米国特許出願公開ＵＳ２０１０／００７１０９０は、クラミドモナス（Chlamydomonas）種に由来する特定の葉緑体ターゲッティングペプチドを提供する。
しかし、葉緑体ターゲッティングペプチドによってコードされる情報の構造的必要要件は、その高レベルの配列多様性および共通またはコンセンサス配列モチーフの欠如のためにわかりにくいままであるが、独立した構造モチーフを有する葉緑体ターゲッティングペプチドの別個のサブグループがある可能性がある。Lee et al. (2008)、前掲。さらに、これらの配列の一部のものが、高等植物における葉緑体にターゲッティングされるタンパク質の異種発現において有用である。
植物におけるポリペプチドのプラスチドターゲッティングのための組成物および方法が、本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、組成物は、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成葉緑体輸送ペプチド（例えば、ＴｒａＰ２３ペプチド）をコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。特定の実施形態では、このような核酸分子は、単子葉植物または双子葉植物における、対象とするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現およびターゲッティングにとって有用であり得る。対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成葉緑体輸送ペプチドをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むベクターが、さらに記載される。
いくつかの実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られる参照ヌクレオチド配列由来のヌクレオチド配列またはその機能的変異体であり得る。いくつかの実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、種々の生物に由来するヌクレオチド配列をコードする部分ＣＴＰまたはその機能的変異体を含むヌクレオチド配列であり得る。特定の実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、参照ＥＰＳＰＳ ＣＴＰまたは前記のもののいずれかの機能的変異体の各々から得られた連続するヌクレオチド配列を含有し得る。これらおよびさらなる実施形態では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、２種以上のＣＴＰをコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列であり得る。
いくつかの例では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、ＥＰＳＰＳ酵素由来の部分ＣＴＰヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含むヌクレオチド配列であり得る。特定の例では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列は、ＥＰＳＰＳ酵素から得られた連続ヌクレオチド配列またはその機能的変異体を含有し得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするための少なくとも１種のＥＰＳＰＳ由来の手段を含む核酸分子を含む。対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするための少なくとも１種のＥＰＳＰＳ由来の手段を含む核酸分子を含む核酸分子がさらに記載される。特定の実施形態では、このような核酸分子は、単子葉植物または双子葉植物における、対象とするヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの発現およびターゲッティングにとって有用であり得る。本開示の目的上、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段とは、特定の合成ヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態では、ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段は、ＴｒａＰ２３と本明細書において呼ばれるヌクレオチド配列からなる群から選択される。
また、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む植物材料（例えば、限定するものではないが、植物、植物組織および植物細胞）も本明細書において記載される。いくつかの実施形態では、植物材料は、そのゲノム中に安定に組み込まれたこのような核酸分子を有し得る。いくつかの実施形態では、植物材料は、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子の産物を一時的に発現し得る。いくつかの実施形態では、植物材料は、植物体を製造するよう再生できない植物細胞である。
プラスチド含有細胞（例えば、植物）において、プラスチド含有細胞のプラスチド（例えば、葉緑体）においてヌクレオチド配列を発現するための方法も記載される。特定の実施形態では、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、対象とするヌクレオチド配列の発現生成物と融合している合成ＣＴＰを含む前駆体融合ポリペプチドが、植物細胞の細胞質において産生され、次いで、融合ポリペプチドが、植物細胞の葉緑体中にｉｎ ｖｉｖｏで輸送されるよう、植物細胞を形質転換するために使用され得る。このような方法のいくつかの実施形態では、植物細胞は、植物体を製造するよう再生できない。
対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むトランスジェニック植物の製造のための方法がさらに記載される。また、このようなトランスジェニック植物から製造される植物商品生産物（例えば、種子）も記載される。
以下およびその他の特徴は、添付の図面を参照して進行するいくつかの実施形態の以下の詳細な説明から、より明らかとなる。
対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列（例えば、ＴｒａＰ２３）の特定の例を代表するｍＲＮＡ分子を示す図である。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ分子（例えば、示されているもの）は、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、合成ＣＴＰをコードする配列を含むオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子から転写され得る。対象とするヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態において、対象とするペプチドをコードする配列であってもよく、例えば、限定されないが、プラスチドにターゲティングされるマーカー遺伝子産物またはペプチドであってもよい。 多重ＥＰＳＰＳ葉緑体輸送ペプチド配列のアラインメントを示す図である。影付きのアミノ酸残基は、ＴｒａＰ２３について選ばれたアミノ酸配列を示す。 ｐＤＡＢ１０７６４０のプラスミドマップを示す図である。 タバコ葉組織へのＴｒａＰ２３−ＧＦＰ浸潤の顕微鏡画像を示す図である。 ｐＤＡＢ１０６５９８のプラスミドマップを示す図である。 トウモロコシプロトプラストの葉緑体への移動を示す、トウモロコシプロトプラストに形質転換されたＴｒａＰ２３−ＧＦＰの顕微鏡画像を示す図である。 プラスミドマップｐＤＡＢ１０９８０８を示す図である。 プラスミドマップｐＤＡＢ１０７６８７を示す図である。
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ）（またはプラスチド輸送ペプチド）は、ＣＴＰを含むポリペプチドをプラスチド（例えば、葉緑体）に向かわせるよう、同時翻訳的または翻訳後に機能する。本発明のいくつかの実施形態では、内因性葉緑体タンパク質または異種タンパク質のいずれかが、ＣＴＰを含む大きな前駆体ポリペプチドとして、このようなタンパク質の発現によって葉緑体に向けられ得る。特定の実施形態では、ＣＴＰは、たとえば、限定されないが、異種生物から得られるオーソロガス遺伝子由来の少なくとも１つの連続配列を組み込むことによって、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られるヌクレオチド配列またはその機能的変異体から誘導され得る。
例示的な一実施形態では、各々、ＣＴＰをコードする核酸配列を、セイヨウアブラナ（Brassica napus）から得られたＥＰＳＰＳタンパク質配列のアラインメント（図２）から単離した。ＣＴＰをコードする配列は、ＥＰＳＰＳ遺伝子配列を、ＣｈｌｏｒｏＰ予測サーバーを用いて解析することによって単離した。Emanuelsson et al. (1999) Protein Science 8:978-84（cbs.dtu.dk/services/ChloroPで入手可能）。単離されたＣＴＰをコードする配列の予測されるタンパク質産物は、およそ６０〜７０個のアミノ酸長の輸送ペプチドである。この例では、ＥＰＳＰＳ ＣＴＰ配列のアラインメントを参照配列として用いて、アミノ酸を無作為に選択することによって典型的な合成ＣＴＰを設計し、新規合成ＣＴＰを製造した。この設計プロセスは、合成ＣＴＰの誘導の特徴を例示する。例示的合成ＣＴＰは、本開示内容を通じて、ＴｒａＰ２３と呼ばれる。例示的合成ＴｒａＰ２３を、プラスチドをターゲッティングする機能について試験し、個々に、少なくとも、天然ＣＴＰ配列について観察されたものと同程度に好都合であるプラスチドターゲッティングを示すとわかった。
さらなる例示的一実施形態では、各々、本発明の合成ＴｒａＰペプチドをコードする核酸配列を独立に合成し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列と作動可能に連結させて、各々、キメラＴｒａＰ：ＧＦＰ融合ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。各々、キメラＴｒａＰ：ＧＦＰポリペプチドをコードするこのような核酸分子を、各々、ＴｒａＰ：ＧＦＰをコードする核酸配列が、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターと作動可能に連結されるよう、各々、バイナリーベクターに導入した。
なおさらなる例示的一実施形態では、各々、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターと作動可能に連結されたＴｒａＰ：ＧＦＰをコードする核酸配列を含むバイナリーベクターを、独立に、アグロバクテリウム媒介性形質転換によってタバコ（Nicotiana benthamiana）に一時的に形質転換した。共焦点顕微鏡観察およびウエスタンブロット解析によって、各ＴｒａＰが、ＧＦＰをタバコ葉緑体に成功裏にターゲッティングしたことを確認した。
さらなる例示的一実施形態では、本発明の合成ＴｒａＰペプチドをコードする核酸配列を独立に合成し、農業的に重要な遺伝子配列をコードする核酸配列に作動可能に連結させた。ＴｒａＰ配列を、除草剤耐性形質（例えば、ｄｇｔ−２８）に融合して、キメラＴｒａＰ：ＤＧＴ−２８融合ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。キメラＴｒａＰ：ＤＧＴ−２８ポリペプチドをコードするこのような核酸分子を、各ＴｒａＰ：ｄｇｔ−２８をコードする核酸配列が、プロモーターおよびその他の遺伝子調節エレメントと作動可能に連結されるようにバイナリーベクター中に導入した。ＴｒａＰ：ｄｇｔ−２８をコードする核酸配列を含有するバイナリーを使用して、種々の植物種を形質転換した。トランスジェニック植物を、ＤＧＴ−２８酵素の葉緑体への発現および転位置の結果としての除草剤耐性についてアッセイした。
さらなる例示的一実施形態では、本発明の合成ＴｒａＰペプチドをコードする核酸配列を独立に合成し、農業的に重要な遺伝子配列をコードする核酸配列に作動可能に連結させた。ＴｒａＰ配列を、昆虫耐性形質（例えば、ｃｒｙ２Ａａ）と融合して、キメラＴｒａＰ：Ｃｒｙ２Ａａ融合ポリペプチドをコードする合成核酸分子を製造した。キメラＴｒａＰ：Ｃｒｙ２Ａａポリペプチドをコードするこのような核酸分子を、各ＴｒａＰ：ｃｒｙ２ａａをコードする核酸配列が、プロモーターおよびその他の遺伝子調節エレメントと作動可能に連結されるように、バイナリーベクターに導入した。ＴｒａＰ：ｃｒｙ２ａａをコードする核酸配列を含有するバイナリーを使用して、種々の植物種を形質転換した。トランスジェニック植物を、Ｃｒｙ２Ａａ酵素の葉緑体への発現および転位置の結果としての昆虫抵抗性についてバイオアッセイした。
上記の詳細な実施例を考慮して、本発明の合成ＣＴＰ配列およびそれをコードする核酸は、任意のポリペプチドを、様々なプラスチドを含有する細胞中のプラスチドに向かわせるために使用され得る。例えば、本開示によって当業者に利用可能になった方法によって、任意の第２のペプチド配列のＮ末端に融合された合成ＣＴＰ配列を含むキメラポリペプチドを、第２のペプチド配列のプラスチドターゲッティングのためにプラスチド含有宿主細胞中に導入してもよい（またはそこで発現させてもよい）。したがって、特定の実施形態では、本発明のＴｒａＰペプチドは、天然ＣＴＰと比較した場合に、プラスチド発現が望まれるペプチドの輸送およびプロセシングの増大された効率を提供し得る。
ＩＩ．略語
ＣＴＰ 葉緑体輸送ペプチド
ＥＰＳＰＳ ３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ
ＹＦＰ 黄色蛍光タンパク質
Ｔｉ 腫瘍誘導性（Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）に由来するプラスミド）
Ｔ−ＤＮＡ トランスファーＤＮＡ
ＩＩＩ．用語
本開示の種々の実施形態の再調査を容易にするために、特定の用語の以下の説明を提供する：
葉緑体輸送ペプチド：本明細書において、用語「葉緑体輸送ペプチド」（ＣＴＰ）（または「プラスチド輸送ペプチド」）とは、ポリペプチドのＮ末端に存在する場合に、ポリペプチドの輸送を、プラスチドを含有する細胞（例えば、全植物体または植物細胞培養物などの中の植物細胞）のプラスチド中に向かわせるアミノ酸配列を指し得る。ＣＴＰは、一般に、タンパク質の輸送を、宿主細胞のプラスチド（例えば、一次、二次または葉緑体などの三次プラスチド）中に向かわせるのに必要であり、十分である。推定葉緑体輸送ペプチドは、いくつかの利用可能なアルゴリズム（例えば、ＰＳＯＲＴおよびＣｈｌｏｒｏＰ（cbs.dtu.dk/services/ChloroPで入手可能））のうち１種によって同定され得る。ＣｈｌｏｒｏＰは、ＣＴＰの特に良好な予測を提供し得る。Emanuelsson et al. (1999) Protein Science 8:978-84。しかし、機能的ＣＴＰの予測は、いずれの既存のアルゴリズムによっても１００％の効率では達成されない。したがって、同定された推定ＣＴＰが、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ方法論において意図されるように実際に機能することを確認することは重要である。
葉緑体輸送ペプチドは、プラスチド中に輸送されるポリペプチドのＮ末端に位置し得る。ＣＴＰは、ＣＴＰを含むポリペプチドの、プラスチドへの同時翻訳輸送または翻訳後輸送を容易にし得る。葉緑体輸送ペプチドは、通常、約４０個から約１００個の間のアミノ酸を含み、このようなＣＴＰは、特定の共通する特徴を含有することが観察された。例えば、ＣＴＰは、あったとしても、極めて少ない負に帯電したアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンまたはグルタミンなど）しか含有しない；ＣＴＰのＮ末端領域は、帯電したアミノ酸、グリシンおよびプロリンを欠く；ＣＴＰの中央領域はまた、極めて高い割合の塩基性またはヒドロキシル化アミノ酸（セリンおよびトレオニンなど）を含有する可能性が高い；ＣＴＰのＣ末端領域は、アルギニンが豊富であり、両親媒性のベータシート構造を含む能力を有する可能性が高い。プラスチドプロテアーゼは、ポリペプチドのプラスチド中への輸送後に、ＣＴＰを、ＣＴＰを含むポリペプチドの残部から切断し得る。
接触：本明細書において、用語、細胞、組織または生物（例えば、植物細胞；植物組織；および植物体）「と接触する」または「によって取り込まれる」は、核酸分子に関して、核酸分子の、生物への内部移行、例えば、限定されるものではないが、生物を核酸分子を含む組成物と接触させること；および生物を核酸分子を含む溶液に浸漬することを含む。
内因性：本明細書において、用語「内因性」とは、特定の生物、組織または細胞内に起因する物質（例えば、核酸分子およびポリペプチド）を指す。例えば、植物細胞において発現された「内因性」ポリペプチドは、同一種の遺伝子操作されていない植物から得られた同一種の細胞において正常に発現されるポリペプチドを指し得る。いくつかの例では、内因性遺伝子（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子）が、参照ＣＴＰ配列を得るために使用され得る。
発現：本明細書において、コード配列（例えば、遺伝子または導入遺伝子）の「発現」とは、核酸転写単位（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む）のコードされた情報が、細胞の作動可能な、作動可能でない、または構造的部分に変換されるプロセスを指し、タンパク質の合成を含むことが多い。遺伝子発現は、外部シグナル；例えば、遺伝子発現を増大または減少させる薬剤に対する細胞、組織または生物の曝露によって影響を受け得る。遺伝子の発現はまた、ＤＮＡからＲＮＡへ、タンパク質への経路のどこでも調節され得る。遺伝子発現の調節は、例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送およびプロセシング、ｍＲＮＡなどの中間分子の分解に対して作用する制御によって、または特定のタンパク質分子の、製造された後の活性化、不活性化、コンパートメント化もしくは分解によって、またはそれらの組合せによって起こる。遺伝子発現は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、限定されるものではないが、ノーザンブロット；ＲＴ−ＰＣＲ；ウエスタンブロット；またはｉｎ ｖｉｔｒｏ；ｉｎ ｓｉｔｕ；およびｉｎ ｖｉｖｏタンパク質活性アッセイ（複数可）によって、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで測定され得る。
遺伝物質：本明細書において、用語「遺伝物質」は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのすべての遺伝子および核酸分子を含む。
異種：本明細書において、用語「異種」とは、特定の生物、組織または細胞内に起因しない物質（例えば、核酸分子およびポリペプチド）を指す。例えば、植物細胞において発現された「異種」ポリペプチドとは、同一種の遺伝子操作されていない植物から得られた同一種の細胞において正常には発現されないポリペプチド（例えば、同一生物の異なる細胞または異なる生物の細胞において発現されるポリペプチド）を指し得る。
単離された：本明細書において、用語「単離された」とは、分子が天然に存在する生物の細胞において、分子が正常には関連している同種のその他の分子（例えば、その他の核酸分子およびその他のポリペプチド）から実質的に分離または精製されている分子（例えば、核酸分子およびポリペプチド）を指す。例えば、単離された核酸分子は、核酸分子が天然に存在する生物の細胞において、染色体ＤＮＡまたは染色体外ＤＮＡから実質的に分離または精製され得る。したがって、この用語は、その他の核酸分子、ポリペプチドおよび細胞成分が除去されるように生化学的に精製された組換え核酸分子およびポリペプチドを含む。この用語はまた、組換え核酸分子、化学合成された核酸分子および組換えによって製造されたポリペプチドを含む。
本明細書において、用語「実質的に精製された」とは、その天然状態ではそれと正常に関連しているその他の分子から分離されている分子を指す。実質的に精製された分子が、組成物中に存在する主な種であり得る。実質的に精製された分子は、例えば、天然混合物中に存在する溶媒以外に、その他の分子を少なくとも６０％含まない、少なくとも７５％含まない、または少なくとも９０％含まないものであり得る。用語「実質的に精製された」は、その天然状態で存在する分子を指さない。
核酸分子：本明細書において、用語「核酸分子」とは、ヌクレオチドのポリマー形態を指し、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖の両方ならびに上記のものの合成形態および混合ポリマーを含み得る。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態を指す場合もある。本明細書において「核酸分子」とは、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義語である。核酸分子は、特に断りのない限り、普通、少なくとも１０塩基長である。この用語は、ＤＮＡの一本鎖および二本鎖形態を含む。核酸分子は、二量体の（いわゆる、タンデム）形態および核酸分子の転写産物を含む。核酸分子は、天然に存在する、および／または天然に存在しないヌクレオチド結合によって一緒に連結している、天然に存在するヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドのいずれかまたは両方を含み得る。
当業者には、容易に理解されるように、核酸分子は、化学的または生化学的に修飾され得るか、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。このような修飾として、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうち１個または複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、無電荷結合：例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど；電荷結合：例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど；懸垂部分：例えば、ペプチド；介入物：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレート剤；アルキル化剤；および修飾された結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。用語「核酸分子」はまた、一本鎖、二本鎖、部分二本鎖、三本鎖、ヘアピン、環状およびパドロック型（padlocked）コンホメーションを含めた任意のトポロジカルコンホメーションも含む。
本明細書において、ＤＮＡに関して、用語「コード配列」、「構造的ヌクレオチド配列」または「構造的核酸分子」とは、適当な調節配列の制御下に置かれた場合に、転写およびｍＲＮＡによってポリペプチドに最終的に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。ＲＮＡに関して、用語「コード配列」とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列として、それだけには限らないが、ゲノムＤＮＡ；ｃＤＮＡ；ＥＳＴ；および組換えヌクレオチド配列が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明は、例えば、例えば、イオン交換クロマトグラフィーなどの分離方法を使用して；分子の大きさに基づく排除によって、または親和性によって、種々の溶媒における溶解度に基づく分画技術ならびに増幅、クローニングおよびサブクローニングなどの遺伝子工学の方法によって、単離、精製または部分精製され得るヌクレオチド配列を含む。
配列同一性：本明細書において、２種の核酸またはポリペプチド配列に関連して、用語「配列同一性」または「同一性」とは、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致を求めてアラインされた場合に同一である２種の配列中の残基を指し得る。
本明細書において、用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、２種の最適にアラインされた配列（例えば、核酸配列およびアミノ酸配列）を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される値を指し得、ここで、比較ウィンドウ中の配列の部分は、２種の配列の最適アラインメントを求めて参照配列（付加または欠失を含まない）に対して比較されると付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両配列中に同一ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定し、対応する位置の数を得ること、対応する位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数によって除することおよび結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
比較のために配列をアラインするための方法は、当技術分野で周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50に記載されている。配列アラインメント方法および相同性算出の詳細な検討事項は、例えば、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10に見出すことができる。
米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（ＮＣＢＩ）Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（商標）;Altschul et al. (1990)）は、いくつかの配列解析プログラムに関連して使用するために、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）およびインターネットを含め、いくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを使用して配列同一性を決定する方法の説明は、ＢＬＡＳＴ（商標）の「ヘルプ」セクションの下でインターネットで入手可能である。核酸配列を比較するために、ＢＬＡＳＴ（商標）（Ｂｌａｓｔｎ）プログラムの「ＢＬＡＳＴ２配列」機能が、デフォルトパラメータに設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを使用して用いられ得る。参照配列に対してさらに大きな類似性を有する核酸配列は、この方法によって評価されると、増大する同一性パーセンテージを示す。
特異的にハイブリダイズ可能な／特異的に相補的な：本明細書において、用語「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」とは、核酸分子および標的核酸分子間で安定な、特異的な結合が生じるよう、十分な相補性度を示す用語である。２種の核酸分子間のハイブリダイゼーションは、２種の核酸分子の核酸配列間の逆行性アラインメントの形成を含む。次いで、２種の分子は、反対の鎖の対応する塩基と水素結合を形成して二本鎖分子を形成でき、これは十分に安定である場合には当技術分野で周知の方法を使用して検出可能である。核酸分子は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列に対して１００％相補的である必要はない。しかし、特異的であるハイブリダイゼーションのために存在しなくてはならない配列相補性の量は、使用されるハイブリダイゼーション条件の関数である。
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選択されるハイブリダイゼーション方法の性質および組成物およびハイブリダイズする核酸配列の長さに応じて変わる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーションバッファーのイオン強度（特に、Ｎａ＋および／またはＭｇ＋＋濃度）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを左右するが、洗浄時間も、ストリンジェンシーに影響を及ぼす。特定の程度のストリンジェンシーを得るのに必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算は、当業者には公知であり、例えば、Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nded., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11;およびHames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985に論じられている。核酸のハイブリダイゼーションに関するさらなる詳細な指示および案内は、例えば、Tijssen, 「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993;およびAusubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995に見出すことができる。
本明細書において、「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーションが、ハイブリダイゼーション分子および標的核酸分子内の相同配列間に２０％未満のミスマッチがある場合にのみ起こる条件を包含する。「ストリンジェントな条件」は、さらに特定のレベルのストリンジェンシーを含む。したがって、本明細書において、「中程度のストリンジェンシー」条件とは、２０％を超える配列ミスマッチを有する分子が、ハイブリダイズしないものであり；「高ストリンジェンシー」の条件とは、１０％を超えるミスマッチを有する配列が、ハイブリダイズしないものであり；「極めて高ストリンジェンシー」の条件とは、５％を超えるミスマッチを有する配列が、ハイブリダイズしないものである。
以下は、代表的な、限定するものではないハイブリダイゼーション条件である。
高ストリンジェンシー条件（少なくとも９０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：６５℃で１６時間の５×ＳＳＣバッファー中でのハイブリダイゼーション；室温で各１５分の２×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄；および６５℃で各２０分間の０．５×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄。
中程度のストリンジェンシー条件（少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を検出する）：６５〜７０℃で１６〜２０時間の５×〜６×ＳＳＣバッファー中でのハイブリダイゼーション；室温で各５〜２０分の２×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄；および５５〜７０℃で各３０分間の１×ＳＳＣバッファーでの２回の洗浄。
非ストリンジェント対照条件（少なくとも５０％の配列同一性を共有する配列がハイブリダイズする）：室温〜５５℃で１６〜２０時間の６×ＳＳＣバッファーでのハイブリダイゼーション；室温〜５５℃で各２０〜３０分の２×〜３×ＳＳＣバッファーでの少なくとも２回の洗浄。
本明細書において、用語「実質的に相同な」または「実質的相同性」とは、連続する核酸配列に関して、ストリンジェントな条件下で、参照核酸配列とハイブリダイズする連続するヌクレオチド配列を指す。例えば、参照核酸配列（例えば、配列番号１２）に対して実質的に相同である核酸配列とは、ストリンジェントな条件（例えば、上記で示される、中程度のストリンジェンシー条件）下で、参照核酸配列とハイブリダイズする核酸配列である。実質的に相同な配列は、少なくとも８０％配列同一性を有し得る。例えば、実質的に相同な配列は、約８０％〜１００％配列同一性、例えば、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９８．５％、約９９％、約９９．５％、および約１００％を有し得る。実質的相同性の特性は、特異的ハイブリダイゼーションと密接に関連している。例えば、核酸分子は、特異的結合が望まれる条件下で、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、核酸の、非標的配列との非特異的結合を避けるための十分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。
本明細書において、用語「オーソログ」（または「オーソロガス」）とは、共通の先祖ヌクレオチド配列から進化した２種以上の種における遺伝子を指し、２種以上の種において同一機能を保持し得る。
本明細書において、２種の核酸配列分子は、５’から３’方向に読まれる配列のどのヌクレオチドも、３’から５’方向に読まれる場合のもう一方の配列のどのヌクレオチドとも相補的である場合に、「完全相補性」を示すといわれる。参照ヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の逆相補配列に対して配列同一性を示す。これらの用語および説明は、当技術分野で十分に定義されており、当業者に容易に理解される。
アミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージを決定する場合には、アラインメントによって提供された所与の位置におけるアミノ酸の同一性は、アラインされた配列を含むポリペプチドの所望の特性に影響を及ぼすことなく異なり得るということは、当業者には周知である。これらの例では、配列同一性パーセントは、保存的に置換されたアミノ酸間の類似性を説明するよう調整され得る。これらの調整は、当業者には周知であり、よく使用される。例えば、Myers and Miller (1988) Computer Applications in Biosciences 4:11-7を参照のこと。
本発明の実施形態は、例示的プラスチド輸送ペプチドアミノ酸配列の機能的変異体およびそれをコードする核酸配列を含む。例示的輸送ペプチド配列の機能的変異体は、例えば、例示的輸送ペプチドアミノ酸配列の断片（Ｎ末端またはＣ末端断片など）、または全長の例示的輸送ペプチドアミノ酸配列もしくは例示的輸送ペプチドアミノ酸配列の断片の修飾された配列であり得る。例示的輸送ペプチドアミノ酸配列は、修飾され得、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を導入し得る。「保存的」アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が、同様の機能的側鎖、同様の大きさおよび／または同様の疎水性を有するアミノ酸残基によって置き換えられているものである。保存的置換を導入するために同一ファミリーの別のアミノ酸を置き換えるために使用され得るアミノ酸のファミリーは、当技術分野で公知である。例えば、これらのアミノ酸ファミリーとして、塩基性アミノ酸（例えば、リシン、アルギニンおよびヒスチジン）；酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）；無電荷（生理学的ｐＨで）極性アミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシンおよびシトシン）；非極性アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンおよびトリプトファン）；ベータ−分岐アミノ酸（例えば、トレオニン、バリンおよびイソロイシン）；および芳香族アミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびヒスチジン）が挙げられる。例えば、Sambrook et al. (Eds.), 前掲;およびInnis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press, NY, USAを参照のこと。
作動可能に連結された：第１のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列が、第２のヌクレオチド配列と機能的関係にある場合に、第２のヌクレオチド配列と「作動可能に連結している」。例えば、プロモーターは、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合に、コード配列と作動可能に連結している。組換えによって作製された場合には、作動可能に連結しているヌクレオチド配列は、一般に、連続しており、２つのタンパク質コード領域をつなげる必要がある場合には、同一リーディングフレーム中にある。しかし、ヌクレオチド配列は、作動可能に連結されるよう連続している必要はない。
用語「作動可能に連結された」とは、調節配列およびコード配列に関して使用される場合には、調節配列が、連結されたコード配列の発現に影響を及ぼすことを意味する。「調節配列」または「制御エレメント」とは、関連しているコード配列の転写のタイミングおよびレベル／量、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性または翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター；翻訳リーダー配列；イントロン；エンハンサー；ステム−ループ構造；リプレッサー結合性配列；終結配列；ポリアデニル化認識配列などを含み得る。特定の調節配列は、それに作動可能に連結しているコード配列の上流および／または下流に配置され得る。また、コード配列と作動可能に連結している特定の調節配列は、二本鎖核酸分子の関連する相補鎖上に配置され得る。
２種以上のアミノ酸配列に関連して使用される場合には、用語「作動可能に連結している」とは、第１のアミノ酸配列が、少なくとも１種のさらなるアミノ酸配列と機能的関係にあることを意味する。例えば、輸送ペプチド（例えば、ＣＴＰ）は、輸送ペプチドが、ポリペプチドまたは第２のアミノ酸配列の発現または輸送に影響を及ぼす場合に、両配列を含むポリペプチド内の第２のアミノ酸配列と作動可能に連結している。
プロモーター：本明細書において、用語「プロモーター」とは、転写の開始から上流であり得る、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写を開始するためのその他のタンパク質の認識および結合に関与し得るＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、細胞における発現のためにコード配列と作動可能に連結され得るか、またはプロモーターは、細胞における発現のためにコード配列と作動可能に連結され得るシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結され得る。「植物プロモーター」は、植物細胞において転写を開始できるプロモーターであり得る。発達制御下にあるプロモーターの例として、葉、根、種子、繊維、木部導管、仮導管または厚壁組織などの特定の組織における転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターは、「組織優先型」と呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞種特異的」プロモーターは、主に、１種または複数の器官中の特定の細胞種、例えば、根または葉中の維管束細胞において発現を駆動する。「誘導可能な」プロモーターとは、環境制御下にあるプロモーターであり得る。誘導プロモーターによる転写を開始し得る環境条件の例として、嫌気性条件および光の存在が挙げられる。組織特異的、組織優先的、細胞種特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターのクラスを構成する。「構成的」プロモーターとは、ほとんどの環境条件下で活性であり得るプロモーターである。
本発明のいくつかの実施形態では、任意の誘導プロモーターが使用され得る。Ward et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366参照のこと。誘導プロモーターを用いると、誘導物質に応じて転写の速度が増大する。例示的誘導プロモーターとして、それだけには限らないが、銅と反応するＡＣＥＩ系；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤と反応するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子；Ｔｎ１０由来のＴｅｔリプレッサーに由来するプロモーター；およびステロイドホルモン遺伝子由来の誘導プロモーターが挙げられ、糖質コルチコステロイドホルモンによってそれらの転写活性が誘導され得る（Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:0421）。
例示的構成プロモーターとして、それだけには限らないが、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーター；コメアクチン遺伝子由来のプロモーター；ユビキチンプロモーター；ｐＥＭＵ；ＭＡＳ；トウモロコシＨ３ヒストンプロモーター；およびＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子の５’のＸｂａ１／ＮｃｏＩ断片（または前記Ｘｂａ１／ＮｃｏＩ断片と同様のヌクレオチド配列）（国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／３０５３０）などの植物ウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
本発明のいくつかの実施形態では、さらに、任意の組織特異的または組織優先的プロモーターが利用され得る。組織特異的プロモーターと作動可能に連結しているコード配列を含む核酸分子で形質転換された植物は、もっぱら、または優先的に特定の組織においてコード配列の産物を製造し得る。例示的組織特異的または組織優先的プロモーターとして、それだけには限らないが、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根優先的プロモーター；ｃａｂまたはリブロース二リン酸カルボキシラーゼ由来のものなどの葉特異的および光誘導性プロモーター；ＬＡＴ５２由来のものなどの別の特異的プロモーター；Ｚｍ１３由来のものなどの花粉特異的プロモーター；およびａｐｇ由来のものなどの小胞子優先的プロモーターがある。
形質転換：本明細書において、用語「形質転換」または「形質導入」とは、１種または複数の核酸分子の細胞への転移を指す。細胞は、核酸分子の細胞ゲノムへの組み込みまたはエピソーム複製のいずれかによって、核酸分子が細胞によって安定に複製されるようになった場合に、細胞に軽質導入される核酸分子によって「形質転換される」。本明細書において、用語「形質転換」は、核酸分子が、このような細胞中に導入され得るすべての技術を包含する。例として、それだけには限らないが：ウイルスベクターを用いるトランスフェクション；プラスミドベクターを用いる形質転換；エレクトロポレーション（Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3）;リポフェクション（Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7）;マイクロインジェクション（Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85）;アグロバクテリウム媒介性転移（Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）;直接ＤＮＡ取り込み；および微粒子銃（Klein et al. (1987) Nature 327:70）が挙げられる。
導入遺伝子：外因性核酸配列。いくつかの例では、導入遺伝子は、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする配列であり得る。特定の例では、導入遺伝子は、少なくとも１種の合成ＣＴＰおよびプラスチド発現が望ましい、少なくとも１種のさらなるペプチド配列（例えば、除草剤抵抗性を付与するペプチド配列）を含むポリペプチドをコードし得る。これらおよびその他の例では、導入遺伝子は、導入遺伝子のコード配列と作動可能に連結している調節配列（例えば、プロモーター）を含有し得る。本開示の目的上、用語「トランスジェニック」は、生物（例えば、植物）を指すために使用される場合には、外因性核酸配列を含む生物を指す。いくつかの例では、外因性核酸配列を含む生物は、分子形質転換技術によって核酸配列が導入された生物であり得る。その他の例では、外因性核酸配列を含む生物は、例えば、遺伝子移入または植物における他家受粉によって核酸配列が導入された生物であり得る。
輸送：本明細書において、用語「輸送」、「ターゲッティング」、および「転移」とは、宿主細胞の核から宿主細胞のプラスチドへの、アミノ酸配列を含むポリペプチドの移動を促進する、本発明の特定のアミノ酸配列の特性を指す。特定の実施形態では、このようなアミノ酸配列（すなわち、合成ＣＴＰ配列）は、アミノ酸配列を含むポリペプチドの約１００％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、および／または少なくとも約５０％を、宿主細胞のプラスチド中に輸送できる可能性がある。
ベクター：例えば、形質転換された細胞を製造するために、細胞中に導入されるような核酸分子。ベクターは、複製起点などの、宿主細胞においてそれが複製するのを可能にする核酸配列を含み得る。ベクターの例として、それだけには限らないが、プラスミド；コスミド；バクテリオファージ；または外因性ＤＮＡを細胞中に運ぶウイルスが挙げられる。ベクターはまた、１種または複数の遺伝子、アンチセンス分子および／または選択マーカー遺伝子および当技術分野で公知のその他の遺伝子エレメントを含み得る。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染し、それによって、細胞に、ベクターによってコードされる核酸分子および／またはタンパク質を発現させ得る。ベクターは、任意選択で、核酸分子の細胞（例えば、リポソーム、タンパク質コーティングなど）への侵入の達成を補助する物質を含んでもよい。
具体的に示され、暗示されない限り、用語「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、本明細書において「少なくとも１つの」を示す。
具体的に説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、例えば、Lewin B.,Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9);Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);およびMeyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8）に見出すことができる。別に記載されない限り、すべてのパーセンテージは、重量によるものであり、すべての溶媒混合物割合は、容量によるものである。すべての温度は、摂氏度である。
ＩＶ．合成ＣＴＰをコードする配列を含む核酸分子
いくつかの実施形態では、本開示は、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。特定の実施形態では、対象とするヌクレオチド配列は、対象とするポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり得る。特定の例では、ＴｒａＰ２３配列が対象とするポリペプチドのＮ末端と融合しているポリペプチドをコードする単一の核酸分子が、提供される。
いくつかの実施形態では、合成葉緑体輸送ペプチドは、キメラＣＴＰであり得る。合成ＣＴＰは、ＥＰＳＰＳ酵素のアラインメントからアミノ酸を無作為に選択することから誘導され得る。図２は、ＣＴＰ配列のアラインメントが植物ＥＰＳＰＳ酵素から単離されたことを示す。したがって、合成ＣＴＰをコードするアミノ酸配列は、天然の葉緑体輸送ペプチド配列のアラインメントからのアミノ酸配列を無作為に選択することから誘導され得る。これらおよび他の例では、アラインメントを製造するために使用された参照ＣＴＰ配列の連続アミノ酸配列は合成ＣＴＰを含み得る。
当業者ならば、合成ＣＴＰ配列内の第１の連続するアミノ酸配列の選択後に、前述の誘導プロセスに従う、相同なＣＴＰ配列の残部からの連続するアミノ酸配列の同定および選択は、明白なものであり、自動的であるということは理解されよう。いくつかの例では、第１の連続するアミノ酸配列は、約２５から約４１個の間のアミノ酸長（例えば、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２個のアミノ酸長）であり得る。
前記のプロセスに従う、合成ＣＴＰタンパク質配列の例は、配列番号１１によって表される。当業者によれば、遺伝暗号の縮重を考慮して、これらのペプチドをコードするヌクレオチド配列の種類は、すぐに思い浮かぶ。これらの特定の例は、異なる植物種由来のいくつかのＥＳＰＳＰオーソログの１種から得た相同ＣＴＰのアラインメントに由来する連続する配列を組み込むことによって、合成ＣＴＰの構造的特徴を例示する。
いくつかの実施形態は、合成葉緑体輸送ペプチドおよび／またはそれをコードする核酸の機能的変異体を含む。このような機能的変異体として、例えば、限定するものではないが、配列番号１１として示される合成ＣＴＰをコードする配列および／またはそれによってコードされるＣＴＰ；配列番号１１内の連続するアミノ酸配列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴＰ；配列番号１２の連続する核酸配列を含む末端切断型合成ＣＴＰをコードする配列；配列番号１２に対して実質的に相同である、連続する核酸配列を含む末端切断型合成ＣＴＰをコードする配列；配列番号１１の連続するアミノ酸配列を含む末端切断型合成ＣＴＰ；配列番号１１の連続するアミノ酸配列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴＰ；１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する、配列番号１１の連続するアミノ酸配列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴＰ；ならびに、作動可能に連結しているペプチドをプラスチドを含有する細胞中のプラスチドに向けると実証されている、１つまたは複数の非保存的アミノ酸置換を有する、配列番号１１内の連続するアミノ酸配列を含む合成ＣＴＰをコードする核酸および／またはそれによってコードされるＣＴＰが挙げられる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む。このような核酸分子は、例えば、分子生物学の技術における本発明のＣＴＰをコードする配列の製造を容易にすることにおいて有用であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＣＴＰをコードする配列は、発現ベクターに配列をサブクローニングするために適したベクター中に導入され得るか、または本発明のＣＴＰをコードする配列は、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結しているＣＴＰをコードする配列を含むさらなる核酸分子の製造を容易にする核酸分子中に導入され得る。これらのおよびさらなる実施形態では、合成ＣＴＰの配列中の１つまたは複数のアミノ酸位置が欠失している場合がある。例えば、合成ＣＴＰの配列は、配列中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０位のアミノ酸（複数可）が欠失されるよう修飾され得る。相同ＣＴＰ配列のアラインメントを使用して、どのアミノ酸が、合成ＣＴＰの機能に影響を及ぼすことなく欠失され得るかについてのガイダンスが提供され得る。
特定の例では、合成葉緑体輸送ペプチドは、８０個未満のアミノ酸長である。例えば、合成ＣＴＰは、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０個またはそれより少ないアミノ酸長であり得る。特定の例では、合成ＣＴＰは、約６５、約６８、約７２または約７４個のアミノ酸長であり得る。これらおよびさらなる例では、合成ＣＴＰは、配列番号１１として示されるアミノ酸配列または前記のものの機能的変異体を含み得る。したがって、合成ＣＴＰは、合成ＣＴＰの長さが、８０個未満のアミノ酸長である、配列番号１１のアミノ酸配列またはその機能的変異体を含み得る。特定の例では、合成ＣＴＰは、例えば、配列番号１１のうち１種に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を含み得る。
特定の合成ＣＴＰタンパク質、例えば、配列番号１１のＴｒａＰ２３ペプチド、または任意の特定の欠失および／もしくは保存的アミノ酸置換を含む前記のもののいずれかの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列のすべてが、本開示を考慮して当業者には認識されよう。遺伝暗号の縮重は、特定のアミノ酸配列について有限数のコード配列を提供する。合成ＣＴＰをコードするよう特定の配列を選択することは、実施者の判断の自由の範囲内にある。異なる適用では、異なるコード配列が望ましいものであり得る。例えば、特定の宿主における合成ＣＴＰの発現を増大するために、宿主のコドン使用バイアスに影響を及ぼすコード配列が、選択され得る。例として、合成ＣＴＰは、配列番号１２として示されるヌクレオチド配列によってコードされ得る。
本発明のいくつかの実施形態において提供される核酸分子では、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列の最後のコドンおよび対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンは、例えば、イントロンまたは「停止」をコードしない任意の数のヌクレオチドトリプレットによって離れている場合もある。いくつかの例では、天然前駆体ポリペプチドにおいて葉緑体輸送ペプチドと普通関連している成熟タンパク質の第１のアミノ酸をコードする配列が、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列の最後のコドンと、対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンの間に存在し得る。合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列と、対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンを分離する配列は、例えば、コードされるアミノ酸配列が、キメラポリペプチドの翻訳およびプラスチドへのその転位置を大幅に変更する可能性が低いような任意の配列からなり得る。これらおよびさらなる実施形態では、合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列の最後のコドンは、位相レジスタにおいて、対象とするヌクレオチド配列の第１のコドンとそれと直接連続して、または合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用されることばあるヌクレオチドリンカー）によってコードされるような短いペプチド配列だけそれから離れて融合され得る。
いくつかの実施形態では、例えば、特定の宿主におけるコード配列の発現を増強するために、対象とするヌクレオチド配列および／または単一コード配列にそれと融合している合成ＣＴＰをコードする配列のヌクレオチドを修飾することが望ましい場合がある。遺伝暗号は、６４種の可能性あるコドンと重複しているが、ほとんどの生物は、これらのコドンのサブセットを優先的に使用する。種において最も多く利用されるコドンは、最適コドンと呼ばれ、あまり多くは利用されないものは、稀に使用されるコドンまたは低使用コドンとして分類される。Zhang et al. (1991) Gene 105:61-72.コドンは、「コドン最適化」と呼ばれることもあるプロセスにおいて、特定の宿主の好ましいコドン使用を反映するよう置換され得る。例えば、翻訳の速度を高めるよう、または望ましい特性（例えば、最適化されていない配列から製造された転写物と比較して、より長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を製造するよう、個々の原核生物または真核生物宿主によって好まれるコドンを含有する最適化されたコード配列が調製され得る。
合成ＣＴＰ配列を組み込むことによって、任意のポリペプチドが、プラスチドを含有する細胞のプラスチドにターゲッティングされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、連結しているポリペプチド−ＣＴＰ分子が発現される細胞において、ポリペプチドをプラスチドに向かわせるために、ポリペプチドが合成ＣＴＰ配列に連結され得る。特定の実施形態では、合成ＣＴＰ配列の組み込みによってプラスチドにターゲッティングされるポリペプチドは、例えば、ポリペプチドが天然に発現される細胞のプラスチドにおいて普通発現されるポリペプチドであり得る。例えば、限定するものではないが、合成ＣＴＰ配列の組み込みによってプラスチドにターゲッティングされるポリペプチドは、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性または真菌抵抗性に関与しているポリペプチドであり得る。例えば、米国特許第５，５６９，８２３号；同５，３０４，７３０号；同５，４９５，０７１号；同６，３２９，５０４号；および同６，３３７，４３１号を参照のこと。合成ＣＴＰ配列の組み込みによってプラスチドにターゲッティングされるポリペプチドは、別法として、例えば、限定するものではないが、草勢または収量に関与するポリペプチド（極端な温度、土壌条件、光量レベル、水分レベルおよび化学的環境に対する耐性に関与しているポリペプチドを含む）または対象とする形質（例えば、選択マーカー遺伝子産物、種子色に関与しているポリペプチドなど）を含む植物を同定するためのマーカーとして使用され得るポリペプチドであり得る。
本発明のいくつかの実施形態において、合成ＣＴＰ配列と連結され得る、除草剤抵抗性に関与しているポリペプチドの限定されない例として、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、突然変異ＡＬＳおよびＡＬＳの前駆体（例えば、米国特許第５，０１３，６５９号を参照のこと）；ＣＰ４ ＥＰＳＰＳまたはクラスIII ＥＰＳＰＳなどのＥＰＳＰＳ（例えば、米国特許第４，９７１，９０８号および同６，２２５，１１４号を参照のこと）；光合成および脂肪酸、アミノ酸、油、アロテノイド（arotenoid）、テルペノイド、デンプンの合成などを含めたプラスチドにおいて生じる生理学的プロセスを修飾する酵素が挙げられる。特定の実施形態において、合成葉緑体輸送ペプチドと連結され得るポリペプチドのその他の限定されない例として、ゼアキサンチンエポキシダーゼ、コリンモノオキシゲナーゼ、フェロケラターゼ、オメガ３脂肪酸不飽和化酵素、グルタミンシンセターゼ、デンプン変性酵素、必須アミノ酸の合成に関与しているポリペプチド、プロビタミンＡ、ホルモン、Ｂｔ毒素タンパク質などが挙げられる。前記のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知であり、このようなヌクレオチド配列は、合成ＣＴＰと連結している対象とするポリペプチドを含むポリペプチドに発現されるよう、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結され得る。さらに、前記のポリペプチドのいずれかをコードするさらなるヌクレオチド配列は、当業者によって同定され得る（例えば、特定のポリペプチドをコードするその他の遺伝子に対して高い相同性を有する遺伝子のクローニングによって）。このようなヌクレオチド配列が同定されると、同定されたヌクレオチド配列と作動可能に連結された合成ＣＴＰをコードする配列を含むヌクレオチド配列または同等のポリペプチドをコードする配列を設計することが簡単なプロセスである。
Ｖ．合成葉緑体輸送ペプチドを含むポリペプチドの発現
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドまたはその機能的同等物をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１種の核酸分子が、そこでのポリペプチドの発現のために細胞、組織または生物中に導入され得る。特定の実施形態では、核酸分子は、合成ＣＴＰをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸分子は、少なくとも１種の合成ＣＴＰと、対象とするヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１種のさらなるペプチド配列を含むポリペプチドをコードするコード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子が、プラスチドを含有する宿主細胞、組織または生物（例えば、植物細胞、植物組織および植物体）中に導入され得、その結果、ポリペプチドが、プラスチドを含有する宿主細胞、組織または生物中の核酸分子から発現され得、発現されたポリペプチドが、少なくとも１種の合成ＣＴＰおよび対象とするヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも１種のさらなるペプチド配列を含む。特定の例では、このような発現されたポリペプチドの合成ＣＴＰは、少なくともさらなるペプチド配列を含むポリペプチドの一部を、宿主細胞、組織または生物のプラスチドへのターゲッティングを容易にし得る。
いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、当業者に公知の方法論のいずれかのうち１種によってプラスチドを含有する細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、宿主細胞、組織または生物は、細胞、組織または生物中に核酸分子を導入するために本発明の核酸分子と接触され得る。特定の実施形態では、細胞は、核酸分子が細胞中に導入され、核酸分子が、細胞のゲノム中に安定に組み込まれるように、本発明の核酸分子を用いて形質転換され得る。いくつかの実施形態では、対象とするヌクレオチド配列と作動可能に連結している合成ＣＴＰをコードする少なくとも１種のヌクレオチド配列を含む核酸分子が、細胞、例えば、プラスチドを含有する細胞（例えば、植物細胞）の形質転換のために使用され得る。発現を開始または増強するために、核酸分子は、１種または複数の調節配列を含んでもよく、この調節配列は、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結され得る。
核酸分子は、例えば、例えば、直鎖または閉じた環状プラスミドを含めたベクター系であり得る。特定の実施形態では、ベクターは、発現ベクターであり得る。本発明の核酸配列は、例えば、核酸配列が、１種または複数の調節配列と作動可能に連結されるようベクター中に挿入され得る。多数のベクターが、この目的のために利用可能であり、特定のベクターの選択は、例えば、ベクター中に挿入される核酸の大きさおよびベクターを用いて形質転換される個々の宿主細胞に応じて変わり得る。ベクターは、通常、種々の成分を含有し、その同一性は、ベクターの機能（例えば、ＤＮＡの増幅およびＤＮＡの発現）およびベクターが適合する個々の宿主細胞（複数可）に応じて変わる。
いくつかの実施形態は、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列と作動可能に連結している上記の調節配列のうち少なくとも１種を含むヌクレオチド配列を含む植物形質転換ベクターを含み得る。１種または複数のヌクレオチド配列は、ポリペプチドの少なくとも一部を、植物細胞、組織または生物のプラスチドにターゲッティングする合成ＣＴＰを含むポリペプチドを製造するよう、植物細胞、組織または生物において調節配列（複数可）の制御下で発現され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結している調節配列は、核酸分子が増幅される細菌細胞または核酸分子が発現される植物細胞などの宿主細胞において機能するプロモーター配列であり得る。本発明の核酸分子における使用に適したプロモーターとして、誘導可能、ウイルス性、合成または構成性であるものが挙げられ、そのすべてが、当技術分野で周知である。本発明の実施形態において有用であり得るプロモーターの限定されない例は、米国特許第６，４３７，２１７号（トウモロコシＲＳ８１プロモーター）；同５，６４１，８７６号（コメアクチンプロモーター）；同６，４２６，４４６号（トウモロコシＲＳ３２４プロモーター）；同６，４２９，３６２号（トウモロコシＰＲ−１プロモーター）；同６，２３２，５２６号（トウモロコシＡ３プロモーター）；同６，１７７，６１１号（構成的トウモロコシプロモーター）；同５，３２２，９３８号、同５，３５２，６０５号、同５，３５９，１４２号および同５，５３０，１９６号（３５Ｓプロモーター）；同６，４３３，２５２号（トウモロコシＬ３オレオシンプロモーター）；同６，４２９，３５７号（コメアクチン２プロモーターおよびコメアクチン２イントロン）；同６，２９４，７１４号（光誘導性プロモーター）；同６，１４０，０７８号（塩誘導性プロモーター）；同６，２５２，１３８号（病原体誘導性プロモーター）；同６，１７５，０６０号（亜リン酸欠乏誘導性プロモーター）；同６，３８８，１７０号（双方向性プロモーター）；同６，６３５，８０６号（γ−コイキシン（coixin）プロモーター）；および米国特許出願番号第０９／７５７，０８９号（トウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーター）によって提供される。
さらなる例示的プロモーターとして、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）プロモーター（Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9）;オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーター（アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の腫瘍誘導性プラスミドで実施される）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９Ｓプロモーターなどのカリモウイルスプロモーター（Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24）;ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Odell et al. (1985) Nature 313:810-2;ゴマノハグサ（figwort）モザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8）;スクロースシンターゼプロモーター（Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8）;Ｒ遺伝子複合体プロモーター（Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83）;クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモーター；ＣａＭＶ３５Ｓ（米国特許第５，３２２，９３８号、同５，３５２，６０５号、同５，３５９，１４２号および同５，５３０，１９６号）；ＦＭＶ３５Ｓ（米国特許第６，０５１，７５３号および同５，３７８，６１９号）；ＰＣ１ＳＶプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号）；ＳＣＰ１プロモーター（米国特許第６，６７７，５０３号）；およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓプロモーター（GenBank受託番号V00087;Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73;Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7）が挙げられる。
特定の実施形態では、本発明の核酸分子は、組織特異的プロモーターを含み得る。組織特異的プロモーターは、生物のその他の組織と比較して、プロモーターが特異的である組織において、作動可能に連結しているヌクレオチド配列のより高レベルの転写を指示するヌクレオチド配列である。組織特異的プロモーターの例として、限定するものではないが、タペータム特異的プロモーター；別の特異的プロモーター；花粉特異的プロモーター（例えば、米国特許第７，１４１，４２４号および国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９９／０４２５８７を参照のこと）；胚珠特異的プロモーター；（例えば、米国特許出願第２００１／０４７５２５号 Ａ１を参照のこと）；果実特異的プロモーター（例えば、米国特許第４，９４３，６７４号および同５，７５３，４７５号参照のこと）；および種子特異的プロモーター（例えば、米国特許第５，４２０，０３４号および同５，６０８，１５２号参照のこと）が挙げられる。いくつかの実施形態では、発達段階特異的プロモーター（例えば、発達の後期段階で活性なプロモーター）が、本発明の組成物または方法において使用され得る。
いくつかの実施形態において、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列として、翻訳リーダー配列として機能するプロモーター配列とコード配列の間に位置する５’ＵＴＲが挙げられる。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に存在し、一次転写物のプロセシングおよび／またはＲＮＡ安定性に影響を及ぼし得る。翻訳リーダー配列の例として、トウモロコシおよびペチュニア熱ショックタンパク質リーダー（米国特許第５，３６２，８６５号）、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物リブロース二リン酸カルボキシラーゼリーダーおよびその他のものが挙げられる。例えば、Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36を参照のこと。５’ＵＴＲの限定されない例は、ＧｍＨｓｐ（米国特許第５，６５９，１２２号）；ＰｈＤｎａＫ（米国特許第５，３６２，８６５号）；ＡｔＡｎｔ１；ＴＥＶ（Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7）;およびＡＧＲ腫瘍（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０００８７；およびBevan et al. (1983) Nature 304:184-7）によって提供されている。
いくつかの実施形態において、核酸分子と作動可能に連結され得るさらなる調節配列はまた、３’非翻訳配列、３’転写終結領域またはポリアデニル化領域も含む。これらは、ヌクレオチド配列の下流に位置する遺伝子エレメントであり、ポリアデニル化シグナルおよび／または転写もしくはｍＲＮＡプロセシングに影響を及ぼすことができるその他の調節シグナルを提供するポリヌクレオチドを含む。ポリアデニル化シグナルは、植物において、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル化（polyadenylate）ヌクレオチドの付加を引き起こすよう機能する。ポリアデニル化配列は、様々な植物遺伝子から、またはＴ−ＤＮＡ遺伝子から導かれ得る。３’転写終結領域の限定されない例として、ノパリンシンターゼ３’領域（ｎｏｓ３’；Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7）がある。異なる３’非翻訳領域の使用の例が、Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80に提供されている。ポリアデニル化シグナルの限定されない例として、エンドウ（Pisum sativum）ＲｂｃＳ２遺伝子に由来するもの（Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9）およびＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｅ０１３１２）が挙げられる。
本発明の組換え核酸分子またはベクターは、植物細胞などの形質転換された細胞に選択可能な表現型を付与する選択マーカーを含み得る。選択マーカーはまた、本発明の組換え核酸分子を含む植物または植物細胞を選択するために使用され得る。マーカーは、殺生物剤抵抗性、抗生物質抵抗性（例えば、カナマイシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど）または除草剤抵抗性（例えば、グリホサートなど）をコードし得る。選択マーカーの例として、それだけには限らないが、カナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、Ｇ４１８などを使用して選択され得るｎｅｏ遺伝子；ビアラホス抵抗性をコードするｂａｒ遺伝子；グリホサート抵抗性をコードする変異株ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子；イミダゾリノン（imidazolinone）またはスルホニル尿素抵抗性を付与する変異株アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）；メトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子が挙げられる。アンピシリン、ブレオマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、リンコマイシン、メトトレキサート、ホスフィノトリシン、ピューロマイシン、スペクチノマイシン、リファンピシン、ストレプトマイシンおよびテトラサイクリンなどに対する抵抗性を付与する複数の選択マーカーが利用可能である。このような選択マーカーの例は、例えば、米国特許第５，５５０，３１８号；同５，６３３，４３５号；同５，７８０，７０８号および同６，１１８，０４７号に例示されている。
本発明の組換え核酸分子またはベクターはまた、またはあるいは、スクリーニング可能なマーカーを含み得る。スクリーニング可能なマーカーは、発現をモニタリングするために使用され得る。例示的なスクリーニング可能なマーカーとして、β−グルクロニダーゼまたは種々の発色基質が公知である酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）（Jefferson et al. (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405）；植物組織におけるアントシアニン色素（赤色）の産生を調節する産物をコードするＲ遺伝子座遺伝子（Dellaporta et al. (1988)「Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac.」In 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson and R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82)；β−ラクタマーゼ遺伝子（Sutcliffe et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-41)；種々の発色基質が公知である酵素をコードする遺伝子（例えば、ＰＡＤＡＣ、発色性セファロスポリン）；ルシフェラーゼ遺伝子（Ow et al. (1986) Science 234:856-9)；発色性カテコールを変換できるカテコールジオキシゲナーゼをコードするｘｙｌＥ遺伝子（Zukowski et al. (1983) Gene 46(2-3):247-55)；アミラーゼ遺伝子（Ikatu et al. (1990) Bio/Technol. 8:241-2)；チロシンをＤＯＰＡおよびドーパキノンに酸化でき、それが、順に、メラニンに縮合する酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子（Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14）;およびα−ガラクトシダーゼが挙げられる。
宿主細胞の形質転換に適した方法として、例えば、限定するものではないが、プロトプラストの形質転換によって（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号を参照のこと）；乾燥／阻害媒介性ＤＮＡ取り込みによって（例えば、Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8を参照のこと）；エレクトロポレーションによって（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号を参照のこと）；シリコンカーバイドファイバーを用いる撹拌によって（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号および同５，４６４，７６５号を参照のこと）；アグロバクテリウム媒介性形質転換によって（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号、同５，５９１，６１６号、同５，６９３，５１２号、同５，８２４，８７７号、同５，９８１，８４０号および同６，３８４，３０１号を参照のこと）；およびＤＮＡがコーティングされた粒子の加速によって（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号、同５，５５０，３１８号、同５，５３８，８８０号、同６，１６０，２０８号、同６，３９９，８６１号および同６，４０３，８６５号を参照のこと）など、ＤＮＡが細胞中に導入され得る任意の方法が挙げられる。これらなどの技術の適用によって、実質的にいかなる種の細胞も、安定に形質転換され得る。いくつかの実施形態では、形質転換ＤＮＡは、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる。多細胞性種の場合には、トランスジェニック細胞は、トランスジェニック生物に再生され得る。例えば、トランスジェニック植物のゲノム中に本発明の１種または複数の核酸配列を含むトランスジェニック植物を生成するために、これらの技術のいずれも使用され得る。
発現ベクターを植物中に導入するために最も広く利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換システムに基づいている。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびA.リゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）およびA.リゾゲネス（A. rhizogenes）のＴｉおよびＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を保持する。Ｔｉ（腫瘍誘導性）プラスミドは、形質転換された植物に転移されるＴ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含有する。Ｔｉプラスミドの別のセグメント、ｖｉｒ領域が、Ｔ−ＤＮＡ転移に関与している。Ｔ−ＤＮＡ領域は、末端反復に隣接している。一部の修飾されたバイナリーベクターでは、腫瘍誘導性遺伝子が欠失されており、Ｔ−ＤＮＡ境界配列に隣接している外来ＤＮＡを転移させるために、ｖｉｒ領域の機能が利用される。Ｔ−領域はまた、例えば、トランスジェニック植物および細胞の効率的な回収のための選択マーカーならびに合成ＣＴＰをコードする核酸などの転移のための配列を挿入するための多重クローニング部位を含有し得る。
したがって、いくつかの実施形態では、植物形質転換ベクターは、Ａ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）のＴｉプラスミド（例えば、米国特許第４，５３６，４７５号、同４，６９３，９７７号、同４，８８６，９３７号および同５，５０１，９６７号；および欧州特許ＥＰ０１２２７９１を参照のこと）またはＡ．リゾゲネス（A. rhizogenes）のＲｉプラスミドから導くことができる。さらなる植物形質転換ベクターとして、例えば、限定するものではないが、Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-13;Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7;Klee et al. (1985) Bio/Technol. 3:637-42;によって、および欧州特許ＥＰ０１２０５１６において記載されたものおよび前記のいずれかから誘導されたものが挙げられる。植物と天然に相互作用する、シノリゾビウム（Sinorhizobium）、根粒菌（Rhizobium）およびメソリゾビウム（Mesorhizobium）などのその他の細菌が、いくつかの多様な植物への遺伝子導入を媒介するよう修飾され得る。これらの植物と関連する共生細菌は、武装解除されたＴｉプラスミドおよび適したバイナリーベクターの両方を獲得することによって遺伝子導入に適任にされ得る。
外因性ＤＮＡをレシピエント細胞に提供した後、一般に、さらなる培養および植物再生のために形質転換された細胞が同定される。形質転換された細胞を同定する能力を改善するために、形質転換体を生成するために使用されるベクターとともに、先に示されたような選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用することが望ましい場合がある。選択マーカーが使用される場合には、形質転換された細胞は、細胞を、選択物質（単数または複数）に曝露することによって、形質転換された可能性のある細胞集団内で同定される。スクリーニング可能なマーカーが使用される場合には、細胞は、所望のマーカー遺伝子形質についてスクリーニングされ得る。
選択物質に対する曝露を生き延びる細胞またはスクリーニングアッセイにおいて陽性とスコアされた細胞が、植物の再生を支持する培地で培養され得る。いくつかの実施形態では、任意の適した植物組織培養培地（例えば、ＭＳおよびＮ６培地）は、成長調節物質などのさらなる物質を含むことによって修飾され得る。組織は、植物再生の試みを開始するのに、または手作業での選択の反復ラウンド後に十分な組織が利用可能になるまで、組織の形態が再生に適するまで（例えば、少なくとも２週間）、成長調節物質を含む基本培地で維持され、次いで、シュート形成につながる培地に移され得る。培養物は、十分なシュート形成が起こるまで周期的に移される。シュートが形成されると、それらは、根形成につながる培地に移される。十分な根が形成されると、植物は、さらなる成長および成熟度のために土壌に移され得る。
再生植物における対象とする核酸分子（例えば、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）の存在を確認するために、様々なアッセイが実施され得る。このようなアッセイとして、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＰＣＲおよび核酸配列決定などの分子生物学的アッセイ；例えば、免疫学的手段によって（ＥＬＩＳＡおよび／またはウエスタンブロット）、または酵素機能によってタンパク質産物の存在を検出することなどの生化学的アッセイ；葉または根のアッセイなどの植物部分アッセイ；および再生した植物体全体の表現型の解析が挙げられる。
例として、組み込み事象は、例えば、対象とするヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅によって解析され得る。ＰＣＲ遺伝子型判定は、ゲノムに組み込まれた、対象とする核酸分子を含有すると予測される単離された宿主植物組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅と、それに続くＰＣＲ増幅産物の標準的なクローニングおよび配列解析を含むが、それに限定されないと理解される。ＰＣＲ遺伝子型判定の方法は、十分に記載されており（例えば、Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53を参照のこと）、任意の植物種（例えば、トウモロコシ（Z. mays）またはダイズ（G. max））または細胞培養物を含めた組織種に由来するゲノムＤＮＡに適用され得る。
アグロバクテリウム依存性形質転換法を使用して形成されたトランスジェニック植物は、通常、１つの染色体に挿入された単一の組換えＤＮＡ配列を含有する。単一組換えＤＮＡ配列は、「トランスジェニック事象」または「組み込み事象」と呼ばれる。このようなトランスジェニック植物は、挿入されたＤＮＡ配列についてヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子に関してホモ接合性のトランスジェニック植物体は、単一の外因性遺伝子配列を含有する独立した分離個体のトランスジェニック植物を、自身と性的に交配すること（自家受粉）によって得られ得る、例えば、Ｆ１種子を製造するためのＦ０植物。製造されたＦ１種子の４分の１が、導入遺伝子に関してホモ接合体となる。Ｆ１種子を発芽させることが、通常、ＳＮＰアッセイまたはヘテロ接合性とホモ接合性間の区別を可能にする熱増幅アッセイ（すなわち、接合状態アッセイ）を使用してヘテロ接合性について試験され得る植物をもたらす。
特定の実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含む少なくとも１種のポリペプチドのコピーが、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含む少なくとも１種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも１種の核酸分子が導入されているプラスチドを含有する細胞において製造される。少なくとも１種の合成ＣＴＰを含む各ポリペプチドは、異なる形質転換事象において導入された複数の核酸配列から、または単一の形質転換事象において導入された単一の核酸配列から発現され得る。いくつかの実施形態では、複数のこのようなポリペプチドが、単一プロモーターの制御下で発現される。その他の実施形態では、複数のこのようなポリペプチドが、複数のプロモーターの制御下で発現される。複数のペプチド配列を含み、ペプチド配列の各々が、プラスチドにターゲッティングされるべき、単一のポリペプチドが、発現され得る。
組換え核酸分子を用いる植物の直接形質転換に加えて、少なくとも１つのトランスジェニック事象を有する第１の植物を、このような事象を欠く第２の植物と交雑させることによってトランスジェニック植物が調製され得る。例えば、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子を、形質転換を受け入れる第１の植物株に導入して、トランスジェニック植物を製造してもよく、このトランスジェニック植物を、第２の植物と交雑させて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を第２の植物株中に遺伝子移入してもよい。
ＶＩ．合成葉緑体輸送ペプチドによって指示されるポリペプチドを含む植物材料
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む植物が、提供される。特定の実施形態では、このような植物は、植物組織または植物細胞の形質転換および全植物体の再生によって製造され得る。さらなる実施形態では、このような植物は、市販の供給源から、または少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の生殖質への遺伝子移入によって得られ得る。少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞を含む植物材料も提供される。このような植物材料は、植物細胞を含む植物から得られ得る。
少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物または植物材料は、いくつかの実施形態では、以下の特徴：植物の細胞におけるポリペプチドの発現；植物の細胞のプラスチドにおけるポリペプチドの一部の発現；植物の細胞のサイトゾルから細胞のプラスチドへのポリペプチドの輸送；植物の細胞におけるポリペプチドのプラスチド特異的発現；および／または植物の細胞におけるポリペプチドの局在性のうち１種または複数を示し得る。このような植物は、コードされるポリペプチドの発現以外の１種または複数の望ましい形質をさらに有し得る。このような形質は、例えば：昆虫、その他の有害生物および疾患を引き起こす物質に対する抵抗性；除草剤に対する耐性；増強された安定性、収率または有効期間；環境耐性；薬剤製造；工業製品製造；および栄養強化を含み得る。
本発明のトランスジェニック植物は、本発明の核酸分子を用いて形質転換され得る任意の植物であり得る。したがって、植物は、双子葉植物または単子葉植物であり得る。本方法において使用可能な双子葉類植物の限定されない例として、アラビドプシス属（Arabidopsis）、アルファルファ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、ワタ、キュウリ、ナス、レタス、メロン、エンドウマメ、コショウ、ピーナッツ、ジャガイモ、カボチャ（pumpkin）、ラディッシュ、ナタネ、ホウレンソウ、ダイズ、カボチャ（squash）、サトウダイコン、ヒマワリ、タバコ、トマトおよびスイカが挙げられる。本方法において使用可能な単子葉類植物の限定されない例として、トウモロコシ、アブラナ属、タマネギ、コメ、ソルガム、コムギ、ライムギ、アワ、サトウキビ、カラスムギ、ライコムギ、スイッチグラスおよびシバクサが挙げられる。本発明のトランスジェニック植物は、任意の方法で使用または栽培され得る。
いくつかの実施形態はまた、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物、例えば、１種または複数のこのようなヌクレオチド配列を含有する組換え植物または種子から製造される商品生産物を提供する。少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列を含有する商品生産物として、例えば、限定するものではないが、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列を含む、食品、食事、油または破砕された穀類もしくは全粒または植物の種子が挙げられる。１種または複数の商品または商品生産物における少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列の検出は、商品または商品生産物が、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする１種または複数のヌクレオチド配列を含む植物から、少なくとも幾分かは製造されたという事実上の証拠である。特定の実施形態では、本発明の商品生産物は、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードする核酸配列の検出可能な量を含む。いくつかの実施形態では、このような商品生産物は、例えば、トランスジェニック植物を得ることおよびそれから食物または餌を調製することによって製造され得る。
いくつかの実施形態では、少なくとも１種の合成ＣＴＰを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むトランスジェニック植物または種子はまた、限定するものではないが、ｉＲＮＡ分子；殺虫性タンパク質（例えば、バチルス・チューリンゲンシス（Bacilus thuringiensis）殺虫性タンパク質）をコードする遺伝子；除草剤耐性遺伝子（例えば、グリホサートに対する耐性を提供する遺伝子）；およびトランスジェニック植物において望ましい表現型（例えば、増大した収量、変更された脂肪酸代謝または細胞質雄性不稔の回復）に貢献する遺伝子が転写されるトランスジェニック事象を含めた、少なくとも１種のその他のトランスジェニック事象を、そのゲノム中に含み得る。
ＶＩＩ．プラスチドへの、遺伝子産物の合成葉緑体輸送ペプチド媒介性局在
本発明のいくつかの実施形態は、プラスチド（例えば、葉緑体）への遺伝子産物の発現および／または局在のための方法を提供する。特定の実施形態では、遺伝子産物は、マーカー遺伝子産物、例えば、蛍光分子であり得る。合成ＣＴＰを含むポリペプチドの一部としての遺伝子産物の発現は、特定の合成ＣＴＰ配列のプラスチド局在能を評価するためのシステムを提供し得る。いくつかの実施形態では、合成ＣＴＰを含有するポリペプチドの一部としてのマーカー遺伝子産物の発現は、マーカー遺伝子産物の発現を、ポリペプチドが発現される細胞のプラスチドにターゲッティングするために使用される。特定の実施形態では、このようなマーカー遺伝子産物は、宿主細胞のプラスチド（複数可）に局在している。例えば、マーカー遺伝子産物は、プラスチド（複数可）において、宿主細胞のサイトゾルまたはその他のオルガネラよりも高レベルで発現され得るか；マーカー遺伝子産物は、本質的にプラスチド（複数可）のみにおいて発現され得るか；またはマーカー遺伝子産物は、サイトゾルまたは非プラスチドオルガネラにおける発現が検出され得ないよう、プラスチド（複数可）において完全に発現され得る。
いくつかの実施形態では、マーカー遺伝子産物と作動可能に連結している、合成ＣＴＰの機能的変異体を含むポリペプチドは、機能的変異体ペプチドの特徴を評価するために使用される。例えば、合成ＣＴＰの配列は、例えば、少なくとも１つの保存的突然変異（複数可）を合成ＣＴＰ中に導入することによって変更され得、得られた変異体ペプチドは、マーカー遺伝子産物に連結され得る。適した宿主細胞（例えば、発現構築物中の１つまたは複数の調節エレメントが作動可能である細胞）における発現後、マーカー遺伝子産物の発現が決定され得る。参照合成ＣＴＰ−マーカー構築物と変異体ペプチド−マーカー構築物間のマーカー遺伝子産物の細胞内局在性を比較することによって、変異体ペプチドが、例えば、より大きなプラスチド局在性を提供するか、または実質的に同一のプラスチド局在性を提供するかどうかが決定され得る。このような変異体は、機能的変異体と考えられ得る。より大きなプラスチド（plastic）局在性を提供する合成ＣＴＰの機能的変異体を同定することによって、このような変異体における突然変異が、合成ＣＴＰのさらなる変異体に組み込まれ得る。この評価プロセスの複数ラウンドを実施すること、続いて、同定された好都合な突然変異を合成ＣＴＰ配列に組み込むことは、合成ＣＴＰ配列の最適化のための反復プロセスをもたらし得る。このような最適化された合成ＣＴＰ配列およびそれをコードするヌクレオチド配列は、このような最適化された合成ＣＴＰ配列が、さらなる突然変異によってさらに最適化され得るか否かにかかわらず、本発明の一部と考えられる。
本明細書で引用された刊行物、特許および特許出願を含む全ての参考文献は、本開示の明示的な詳細と矛盾しない程度に参照により本明細書に組み込まれ、このようにして、それぞれの文献が、参照により組み込まれているものと個別にかつ具体的に指示されているかのように、および全体として本明細書に記載されているかのように同程度に組み込まれている。本明細書で議論される参考文献は、単に、本願の出願日に先立つその開示のために提供される。本明細書において、先行発明のために、本発明者らがこのような開示に先行する権利がないという承認と解釈されるべきものはない。
以下の実施例は、特定の個々の特徴および／または態様を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される個々の特徴または態様に制限すると解釈されてはならない。
（実施例）
合成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列の設計および生成
プラスチドは、高等植物種に見出される細胞小器官であり、すべての植物組織中に存在する。葉緑体は、本質的な生理機能に関与している緑色の光合成組織に見られる特定のタイプのプラスチドである。例えば、このような１つの主要な生理機能は、植物に必要とされる芳香族アミノ酸の合成である。核コードされた酵素は、この生合成経路に必要とされ、細胞質から葉緑体の内部に輸送される。これらの核コードされた酵素は、通常、葉緑体のストロマへのペプチド輸送を促進するために、葉緑体の膜と相互作用するＮ末端輸送ペプチドを有する。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10: 440-447。取り込み時に、間質ペプチダーゼは輸送ペプチドを切断し、葉緑体に取り込まれた成熟機能性タンパク質を残す。Richter S, Lamppa GK. (1999) Stromal processing peptidase binds transit peptides and initiates their ATP-dependent turnover in chloroplasts. Journ. Cell Bio. 147: 33-43。葉緑体輸送ペプチドは、長さ、組成および機構において高度に分岐している可変配列である。Bruce B. (2000) Chloroplast transit peptides: structure, function, and evolution. Trends Cell Bio. 10: 440-447。葉緑体輸送ペプチドの配列類似性は、異なる植物種由来の相同タンパク質間で有意に分岐する。異なる植物種から得られた相同タンパク質は、プロセシングされた成熟機能性タンパク質を比較する場合、典型的に、比較的高レベルの配列類似性を共有することを考慮すると、葉緑体輸送ペプチド間の分岐量は予期されない。
新規な合成葉緑体輸送ペプチド配列を設計し、生成し、ｉｎ ｐｌａｎｔａにおいて試験した。新規な合成葉緑体輸送ペプチドは、葉緑体内への農学的に重要なタンパク質の取り込みのための効果的な移行およびプロセシング特性を有することが示された。最初に、異なる植物種由来の天然の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）タンパク質配列は、http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/にて利用可能なＣｈｌｏｒｏＰ（商標）コンピュータプログラムを介して分析され、推定上の葉緑体輸送ペプチド配列を同定した（Emanuelsson O, Nielsen H, von Heijne G, (1999) ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites, Protein Science 8; 978-984）。葉緑体輸送ペプチド配列アラインメントを利用して、新規な合成葉緑体輸送ペプチドは、新規合成の推定葉緑体輸送ペプチド配列を製造するためにアミノ酸を無作為に選択することによって設計された。新たに設計された合成葉緑体輸送ペプチドの典型的な配列はＴｒａＰ２３（配列番号１１）である。新規な合成葉緑体輸送ペプチドは、農学的に重要な導入遺伝子配列に融合させた遺伝子発現エレメントを含む安定な形質転換事象として、一過性のｉｎ ｐｌａｎｔａ発現系を含んだ複数のアッセイを介して、および遺伝子導入で試験された。
合成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列の一過性ｉｎ ｐｌａｎｔａ試験
タバコ一過性アッセイ：
最初に、一過性ｉｎ ｐｌａｎｔａアッセイを介して、ＴｒａＰ２３の合成葉緑体輸送ペプチド配列を試験した。ＴｒａＰ ｖ２（配列番号１２）の合成葉緑体輸送ペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を合成した。得られた構築物は２つの植物転写単位（ＰＴＵ）を含有した。第１のＰＴＵは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーター；Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）、ＴｒａＰ−緑色蛍光タンパク質融合遺伝子（ＴｒａＰ−ＧＦＰ；米国特許第７，６７８，８９３号）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ２３ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ；米国特許第５，４２８，１４７号）で構成された。第２のＰＴＵは、キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶプロモーター；Verdaguer et al, (1996) Plant Molecular Biology, 31 : 1129-1139）、ｄｓｍ−２（ＤＳＭ２；米国特許出願第２０１１／０１０７４５５号）、およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＯＲＦ１ ３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ；Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172: 1814-1822）で構成された。構築物ｐＤＡＢ１０７６４０は、ＴｒａＰ２３ ｖ２の合成葉緑体輸送ペプチドを含有する（図３）。構築物を制限酵素消化および配列決定を介して確認した。最後に、構築物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に形質転換し、グリセロールストックとして保存した。
アグロバクテリウムグリセロールストックから、凍結培養物で満ちたループを１４ｍｌの滅菌チューブ中のＹＰＤ（１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）の２ｍｌに接種した。接種した培地を２００ｒｐｍで振とうしながら、２８℃にて一晩インキュベートした。翌日、約１００μｌの培養物を用いて、１２５ｍｌの滅菌したトリバッフル付きフラスコ中に２５ｍｌのＹＰＤ（１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシン）を接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら一晩２８℃にて一晩インキュベートした。翌日、滅菌ｄｄＨ２Ｏ（ｐＨ８．０）中でＯＤ６００が０．５になるまで培養物を希釈した。希釈されたアグロバクテリウム株は、１：１の比率でＰ１９ヘルパータンパク質を含有する第２のアグロバクテリウム株と混合した。培養物は、Voinnet O, Rivas S, Mestre P, and Baulcombe D., (2003) An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus, The Plant Journal, 33: 949-956の方法を介して、タバコ葉浸潤に使用された。浸潤されたタバコ植物は、アッセイするまで、少なくとも３日間、２４℃にて１６時間の光に設定されたＣｏｎｖｉｒｏｎ（商標）に置かれた。
顕微鏡の結果：
アグロバクテリウム浸潤したタバコの葉を植物から切断し、脱水を防ぐために水とともにペトリ皿に入れた。浸潤したタバコの葉は、ＧＦＰレポータータンパク質を首尾よく発現している葉の損傷がない領域を同定するために、Ｄａｒｋ Ｒｅａｄｅｒ Ｈａｎｄ Ｌａｍｐ（商標）（Ｃｌａｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏ．；Ｄｏｌｏｒｅｓ、ＣＯ）を用いて、適所に保持されたロングパスフィルターガラスを用いた青色光励起下で観察された。具体的に同定された葉の領域は葉から切断され、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ−ＳＰ５ ＡＯＢＳ（商標）；Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）による画像化のために水中でマウントされた。ＧＦＰレポータータンパク質は、マルチラインアルゴンイオンレーザーを用いて、５１４ｎｍのレーザー線で励起した。検出スリットの幅は、バックグラウンドの葉の自己蛍光を排除するために、非発現（暗）対照の葉試料を用いて調整された。クロロフィルの自己蛍光は、葉緑体の局在を決定するための蛍光レポータータンパク質シグナルとの直接比較のために第２のチャネルに同時に回収された。
顕微鏡撮像の結果は、ＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドを含むＧＦＰ蛍光タンパク質が、タバコ細胞の細胞質に位置する葉緑体に検出可能な量のＧＦＰタンパク質を蓄積しないことを示した（図４）。
ウエスタンブロットの結果：
浸潤したタバコ植物の試料をウエスタンブロッティングを介してアッセイした。リーフパンチを収集し、ビーズミルに供した。約１００〜２００ｍｇの葉材料は、Ｋｌｅｃｏ（商標）ビーズミル中で３分間、２ＢＢ（鋼球；Ｄａｉｓｙ；Ｒｏｇｅｒｓ、ＡＲ）および５００ｍｌのＰＢＳＴと混合された。次に、試料を１４，０００×ｇ、４℃にて遠心機でスピンダウンした。上清を除去し、ウエスタンブロットまたは免疫沈降のいずれかを介して直接分析した。製造業者のプロトコールに従って、Ｐｉｅｒｃｅ Ｄｉｒｅｃｔ ＩＰキット（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて免疫沈降を行った。およそ５０μｇの抗ＧＦＰを樹脂に結合させた。試料を樹脂とともに一晩、４℃にてインキュベートした。次に、試料を洗浄し、翌朝溶出した。等量の２×８Ｍ尿素試料緩衝液を合わせ、その後、試料を５分間煮沸することによって分析用に準備した。ＭＯＰＳ緩衝液中の４〜１２％ＳＤＳ−Ｂｉｓ Ｔｒｉｓゲル上で煮沸試料を４０分間泳動した。次に、製造業者のプロトコールに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｉＢｌｏｔ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いてゲルをブロットした。ブロットしたメンブレンをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液中の５％脱脂粉乳を用いて１０分間ブロックした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液中の５％脱脂粉乳で１：１０００希釈で使用した一次抗体（ウサギのモノクローナル抗ＧＦＰ）を用いてメンブレンを１時間探査した。次に、すべての未結合の一次抗体を除くために、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて５分間３回、メンブレンを濯いだ。１：１０００希釈で使用したヤギの二次モノクローナル抗ウサギ抗体（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてメンブレンを６０分間探査した。メンブレンを上記に記載の通りに洗浄し、Ｔｈｅｍｏ ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を添加することによって発色させた。比色基質は、５〜１０分間発色させ、続いて、乾燥させる前にブロットを水で濯いだ。
ウエスタンブロットの結果は、ＧＦＰタンパク質が浸潤したタバコ細胞で発現したことを示した。ｐＤＡＢ１０７６４０で浸潤されたタバコ植物葉組織は、ＧＦＰ抗体に反応したタンパク質バンドの存在によって指示されるようにＧＦＰタンパク質を発現し、葉緑体輸送ペプチドを含まないＧＦＰ対照から得られたＧＦＰタンパク質バンドと大きさが同等であった。さらに、これらの結果は、ＴｒａＰ合成葉緑体輸送ペプチドがプロセシングされ、ＧＦＰタンパク質から切断されることを示した。ＴｒａＰ２３−ＧＦＰ構築物は、対照ＧＦＰタンパク質よりも分子量が大きい事前にプロセシングされたタンパク質バンドを発現する。対照ＧＦＰとサイズにおいて同等であるウエスタンブロット上のバンドの存在は、ＴｒａＰ２３の葉緑体輸送ペプチド配列がプロセシングされ、それによって、ＧＦＰ対照と同等である分子量の大きさにＧＦＰの大きさを小さくしたことを示す。
トウモロコシプロトプラスト一過性アッセイ：
ＴｒａＰ２３ ｖ２合成葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１２）は、緑色蛍光タンパク質遺伝子の上流にクローニングされ、トウモロコシプロトプラストの一過性ｉｎ ｐｌａｎｔａアッセイを介した試験のためにｐＤＡＢ１０６５９８構築物（図５）に組み込まれた。得られた構築物は、以下の植物転写単位（ＰＴＵ）を含有した。第１のＰＴＵは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモーター；Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18: 675-689）、ＴｒａＰ−緑色蛍光タンパク質融合遺伝子（ＴｒａＰ２３−ＧＦＰ；米国特許第７，６７８，８９３号）、およびトウモロコシ（Zea mays）ペルオキシダーゼ５ ３’非翻訳領域（ＺｍＰｅｒ５ ３’ＵＴＲ；米国特許第６３８４２０７号）で構成された。制限酵素消化および配列決定を介して構築物を確認した。
トウモロコシ（Zea mays）変種Ｂ１０４の種子は、２〜３滴のＴｗｅｅｎ２０を含む５０％Ｃｌｏｒｏｘ（３％次亜塩素酸ナトリウム）中で、約２０分間激しく振とうすることによって表面を滅菌した。種子を滅菌蒸留水で十分に濯いだ。無菌種子は、Ｐｈｙｔａｔｒａｙまたは類似タイプのボックス中で１／２ＭＳ培地に播種され、暗所（２８℃）にて１２〜２０日間成長させた。トウモロコシプロトプラスト一過性アッセイを用いて、Ｂ１０４−トウモロコシの葉からのトウモロコシプロトプラストを得てトランスフェクトした。このトウモロコシプロトプラストアッセイは、Yoo, S.-D., Cho, Y.-H., and Sheen, J., (2007), Arabidopsis Mesophyll Protoplasts: A Versitile Cell System for Transient Gene Expression Analysis, Nature Protocols, 2: 1565-1572によって記載されているシステムの変法である。溶液をYooら（2007）によって記載されるように調製したが、以下の実験に使用したマンニトール濃度を０．６Ｍに変更したことを除く。
１００〜５００μｌのプロトプラスト（１−５×１０５）のトランスフェクションは、室温にて、約４０μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＡＢ１０６５９８）を含む２ｍｌの微量遠心管にプロトプラストを添加することによって完了した。ＤＮＡの体積は、好ましくは、プロトプラストの体積の約１０％に維持された。プロトプラストおよびＤＮＡは、時々、５分間のインキュベーション期間中に混合された。等体積のＰＥＧ溶液を１回につき２滴、プロトプラストとＤＮＡにゆっくりと添加し、ＰＥＧ溶液の液滴の添加間に混合した。チューブは、時々穏やかに混合しながら約１０分間インキュベートした。次に、１ｍｌのＷ５＋溶液を添加し、チューブを数回反転させることによって混合した。チューブ（複数可）を４℃の温度にて７５×ｇで５分間遠心分離した。最後に、上清を除去し、ペレットを１ｍｌのＷＩ溶液に再懸濁し、プロトプラストを小さなペトリ皿（３５×１０ｍｍ）または６ウェルのマルチウェルプレート中に置き、一晩、暗所にて室温でインキュベートした。ＧＦＰの蛍光を、１２時間のインキュベーション後に顕微鏡で観察した。前述した顕微鏡の条件を撮像のために使用した。
顕微鏡撮像の結果は、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチドを含むＧＦＰ蛍光タンパク質が、トウモロコシ細胞の細胞質の葉緑体内に移行しない対照ＧＦＰ蛍光タンパク質と比較して、トウモロコシ細胞の細胞質に位置する葉緑体に蓄積されたことを示した（図６）。これらの顕微鏡撮像の結果は、葉緑体へのＧＦＰタンパク質の移行が、ＴｒａＰ２３の合成葉緑体輸送ペプチドの結果であったことを示唆している。
アラビドプシス属（Arabidopsis）における農学的に重要な導入遺伝子の発現のための合成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列
大腸菌（Esherichia coli）の５−エノールピルビルシキミ酸３−リン酸シンターゼ酵素（ＥＰＳＰシンターゼ）における１アミノ酸突然変異（Ｇ９６Ａ）は、グリホサート非感受性をもたらすことができる（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al., (2002); Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。この突然変異はグリホサートに対する耐性を付与するが、その天然基質であるホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）によるＥＰＳＰシンターゼの結合に悪影響を及ぼすことも知られている。基質結合効率において生じた変化は、グリホサートに対するｉｎ ｐｌａｎｔａにおける耐性を提供するために、突然変異した酵素を不適当なものにし得る。
ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入したＧ９６Ａ突然変異と類似した位置でアラニンを天然に含有するＥＰＳＰシンターゼタンパク質配列とポリヌクレオチド配列についてインシリコにおいてＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋデータベースをスクリーニングした（Padgette et al, (1991); Eschenburg et al, (2002); Priestman et al, (2005); Haghani et al, (2008)）。
この位置で天然のアラニンを含むことが同定された１つの酵素は、ストレプトマイセス・スビセウス（Streptomyces sviceus）ＡＴＣＣ２９０８３由来のＤＧＴ−２８（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０６９１７２４０．１）であった。さらに、インシリコのデータマイニングは、ＤＧＴ−２８；ＤＧＴ−３１（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＹＰ＿００４９２２６０８．１）；ＤＧＴ−３２（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＺＰ＿０４６９６６１３）；およびＤＧＴ−３３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＮＣ＿０１０５７２）により高い相同性を有する３つの他の固有のストレプトマイセス酵素を示した。これらの酵素のそれぞれは、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内の、該酵素の大腸菌（E.coli）バージョンに導入されたＧ９６Ａ突然変異と類似した位置で天然のアラニンを含有する。
異なる生物由来のＥＰＳＰシンターゼタンパク質は長さが異なるため、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の大腸菌（E.coli）バージョンの突然変異の番号付けは、他の生物由来のＥＰＳＰシンターゼ酵素の突然変異の番号付けと必ずしも対応しない。これらの同定されたＥＰＳＰシンターゼ酵素は、グリホサート耐性またはＰＥＰ基質親和性に関して従前特徴付けられていなかった。さらに、これらのＥＰＳＰシンターゼ酵素は、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の新しいクラスを表し、前述のクラスＩ（米国再発行特許第３９２４７号にさらに記載されている植物由来の配列）、ＩＩ（米国再発行特許第３９２４７号にさらに記載されている細菌由来の配列）、およびＩＩＩ（国際特許出願ＷＯ２００６／１１０５８６にさらに記載されている細菌由来の配列）のＥＰＳＰシンターゼ酵素を特徴付けるために使用されているいずれもの配列モチーフを含まない。
新規なＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３酵素は、クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素と比較することによって、グリホサート耐性およびＰＥＰ基質親和性について特徴付けられた。以下のクラスＩの酵素；ダイズ（Glycine max）由来のＤＧＴ−１、セイヨウアブラナ（Brassica napus）由来のＤＧＴ−３（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：Ｐ１７６８８）、およびコムギ（Triticum aestivum）由来のＤＧＴ−７（ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号：ＥＵ９７７１８１）は比較のためのものであった。クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素およびその変異改変体を合成し、評価した。植物ＥＰＳＰシンターゼ酵素に導入された突然変異は、酵素の大腸菌（E.coli）バージョン由来のＧ９６Ａ突然変異と同様の位置で、ＥＰＳＰシンターゼ酵素内でなされたグリシンからアラニンへの突然変異からなっていた。さらに、トレオニンからイソロイシンおよびプロリンからセリンの突然変異は、Funke et al., (2009)において記載されているように、大腸菌（E.coli）のＥＰＳＰシンターゼにおけるアミノ酸９７（ＴからＩ）とアミノ酸１０１（ＰからＳ）の突然変異と類似した位置で、これらのクラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素内に導入された。
ＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３１、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３：
新たに設計された、双子葉植物の最適化されたｄｇｔ−２８ ｖ５ポリヌクレオチド配列は配列番号１４に列挙されている。新たに設計された、単子葉植物の最適化されたｄｇｔ−２８ ｖ６ポリヌクレオチド配列は配列番号１５に列挙されている：この配列は、制限酵素部位を導入するために、第２のアミノ酸位置でアラニンを含むことによって僅かに改変された。得られたＤＮＡ配列は、高度なコドン多様性、所望の塩基組成を有し、戦略的に配置された制限酵素認識部位を含み、遺伝子の転写または生成物ｍＲＮＡの翻訳を干渉し得る配列を欠損している。
６個のフレーム終止（コード配列の３’端に追加された全６個のリーディングフレームに位置した終止コドン）およびクローニングのための５’制限部位などの追加配列を含有する配列番号１４と配列番号１５を含むＤＮＡ断片の合成は、商業的供給業者（ＤＡＮ２．０、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって行われた。次に、合成核酸分子は、発現ベクターにクローニングされ、以下の実施例に記載されるように、植物または細菌に形質転換された。
同様のコドン最適化戦略を用いて、ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３ ｖ２（Ｇ１７３Ａ）、ｄｇｔ−３ ｖ３（Ｇ１７３Ａ；Ｐ１７８Ｓ）、ｄｇｔ−３ ｖ４（Ｔ１７４Ｉ；Ｐ１７８Ｓ）、ｄｇｔ−７ ｖ４（Ｔ１６８Ｉ；Ｐ１７２Ｓ）、ｄｇｔ−３２ ｖ３、ｄｇｔ−３３ ｖ３、およびｄｇｔ−３１ ｖ３を設計した。これらの遺伝子のコドン最適化バージョンは、それぞれ、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３として列挙されている。
植物バイナリーベクター構築。標準的なクローニング法は、インフレーム融合としてｄｇｔ−２８に連結した葉緑体輸送ペプチドポリヌクレオチド配列を含有するエントリーベクターの構築に使用された。ｄｇｔ−２８に融合した輸送ペプチド（ＴｒａＰ）を含むエントリーベクターは、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（商標）Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて組み立てられた。融合の結果として、第１のアミノ酸であるメチオニンをｄｇｔ−２８から除いた。輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列ＴｒａＰ４ ｖ２（配列番号２４）、ＴｒａＰ５ ｖ２（配列番号２５）、ＴｒａＰ８ ｖ２（配列番号２６）、ＴｒａＰ９ ｖ２（配列番号２７）、ＴｒａＰ１２ ｖ２（配列番号２８）、およびＴｒａＰ１３ ｖ２（配列番号２９）は、それぞれ、それぞれ、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成され、最大で固有のＡｃｃＩ制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含むｄｇｔ−２８の５’端の断片に融合させた。
様々なＴｒａＰおよびｄｇｔ−２８発現カセットを含んだバイナリープラスミドをシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０ ｖ２；Callis, et al, (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493）によって駆動させ、隣接してアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの２３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１；米国特許第５，４２８，１４７号）を並べた。
組み立てられたＴｒａＰおよびｄｇｔ−２８発現カセットは、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）技術（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて遺伝子操作され、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換を介して植物に形質転換させた。制限エンドヌクレアーゼをＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から得て、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＮＡライゲーションのために使用した。選択マーカーカセットキャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ ｖ２；Verdaguer et al, (1996) Plant Mol. Biol, 31: 1129-1139）−ＤＳＭ−２（米国特許出願第２００７／０８６８１３号）−アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの１つの３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦｌ ３’ＵＴＲ ｖ６；Huang et al, (1990) J. Bacteriol. 172: 1814-1822）を含む単一のデスティネーションベクターに１つのエントリーベクターを組み込むことによって、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ ＣＬＯＮＡＳＥ（登録商標）酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＧａｔｅｗａｙ反応を行った。プラスミド調製は、供給業者の指示に従って、ＮＵＣＬＥＯＳＰＩＮ（登録商標）プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）またはプラスミドＭｉｄｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行われた。ＤＮＡ断片は、アガロース、Ｔｒｉｓ−アセテートゲル電気泳動後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離された。
すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、ミニプレップＤＮＡの制限消化によってスクリーニングされた。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡを、市販のシークエンシングベンダー（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ（商標）ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）によって配列決定された。配列データを組み立て、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて分析した。
以下のバイナリー構築物は、様々なＴｒａＰ：ｄｇｔ−２８融合遺伝子配列を発現する：ｐＤＡＢ１０７５２７はＴｒａＰ４ ｖ２：ｄｇｔ−２８ ｖ５（配列番号３０）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３０はＴｒａＰ５ ｖ２：ｄｇｔ−２８ ｖ５（配列番号３１）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３１はＴｒａＰ８ ｖ２：ｄｇｔ−２８ ｖ５（配列番号３２）を含む；ＰＤＡＢ１０５５３２はＴｒａＰ９ ｖ２：ｄｇｔ−２８ ｖ５（配列番号３３）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３３はＴｒａＰ１２ ｖ２：ｄｇｔ−２８ ｖ５（配列番号３４）を含む；ｐＤＡＢ１０５５３４はＴｒａＰ１３ ｖ２：ｄｇｔ−２８ ｖ５（配列番号３５）を含む。ｐＤＡＢ１０５５３４のｄｇｔ−２８ ｖ５配列は修飾され、第１のコドン（ＧＣＡ）を（ＧＣＴ）に変更した。
追加の植物バイナリーベクター構築。上述したものと類似したクローニング戦略を用いて、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、ｄｇｔ−３３、ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７を含むバイナリープラスミドを構築した。
微生物由来の遺伝子；ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３は、先に記載したものとは異なる葉緑体輸送ペプチドと融合させた。以下の葉緑体輸送ペプチドを使用した；ＴｒａＰ１４ ｖ２（配列番号３６）、ＴｒａＰ２３ ｖ２（配列番号３７）、ＴｒａＰ２４ ｖ２（配列番号３８）。ｐＤＡＢ１０７５３２は、ＴｒａＰ１４ ｖ２に融合させたｄｇｔ−３２ ｖ３（配列番号３９）を含み、ｐＤＡＢ１０７５３４は、ＴｒａＰ２４ ｖ２と融合させたｄｇｔ−３３ ｖ３（配列番号４０）を含み、ｐＤＡＢ１０７５３３は、ＴｒａＰ２３ ｖ２に融合させたｄｇｔ−３１ ｖ３（配列番号４１）を含む。ｄｇｔ発現カセットは、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ユビキチン１０プロモーター（ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２）によって駆動され、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの２３個の３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１）を並べた。キャッサバ葉脈モザイクウイルスプロモーター（ＣｓＶＭＶ ｖ２）−ＤＳＭ−２−アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオープンリーディングフレームの１つの３’非翻訳領域（ＡｔｕＯＲＦ１ ３’ＵＴＲ ｖ６）を含むＤＳＭ−２選択マーカーカセットもバイナリーベクターに存在した。
ｄｇｔ−３１ ｖ３、ｄｇｔ−３２ ｖ３、およびｄｇｔ−３３ ｖ３が先に記載された葉緑体輸送ペプチド配列に融合している追加のバイナリーを構築する。例えば、ＴｒａＰ８ ｖ２配列は、ｄｇｔ−３１ ｖ３、ｄｇｔ−３２ ｖ３、およびｄｇｔ−３３ ｖ３に融合され、上記したバイナリーベクターにクローニングされる。
クラスＩ遺伝子（ｄｇｔ−１、ｄｇｔ−３、およびｄｇｔ−７）を含むバイナリーベクターを構築した。以下のバイナリーベクターを構築し、植物に形質転換した：米国特許出願公開第２０１１／０１２４５０３号に記載されているｄｇｔ−１ ｖ４配列を含むｐＤＡＢ４１０４を米国特許出願公開第２００９／００６４３７６号に記載されているニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）オスモチン配列；ｐＤＡＢ１０２７１５；ｐＤＡＢ１０２７１６；ｐＤＡＢ１０２７１７；およびｐＤＡＢ１０２７８５と並べる。ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３に融合させた様々なＴｒａＰ葉緑体輸送ペプチドは、これらの植物由来の配列は天然の植物葉緑体輸送ペプチドを有するため、クラスＩ遺伝子に追加されなかった。これらのベクターは、表１においてさらに詳細に記載されている。
Figure 2015505480
シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の形質転換。アラビドプシス属（Arabidopsis）は、CloughおよびBent（1998）のフローラルディップ法を用いて形質転換された。上記のバイナリープラスミドの１つを含む選択されたアグロバクテリウムコロニーを使用して、スペクチノマイシン（１００ｍｇ／Ｌ）およびカナマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）を含むＹＥＰブロスの１つまたは複数の１００ｍＬの前培養物を植菌した。培養物を２２５ｒｐｍで一定に撹拌しながら一晩２８℃にてインキュベートした。細胞を１０分間、室温にて約５０００×ｇでペレットにし、得られた上清を捨てた。５％（ｗ／ｖ）スクロース、１０μｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリン、および０．０４％Ｓｉｌｗｅｔ（商標）Ｌ−７７を含有する４００ｍＬの液体培地において穏やかに再懸濁させた。約１カ月齢の植物は、穏やかに撹拌しながら５〜１０分間、培地中に浸漬させた。植物は、それらの側面を下に置き、２〜３時間、透明または不透明なプラスチックバッグで覆い、その後、直立に配置された。植物は、２２℃にて１６時間の明／８時間の暗の光周期で成長させた。浸漬から約４週間後、種子を回収した。
形質転換植物の選択。新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔとＤＳＭ−２発現カセットを含む］を７日間室温にて乾燥させた。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイに播種され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存された、層状にしたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４０ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５日間、湿気ドームで覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換されたＤＳＭ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体選択の１日前に外された。
植え付け後（ＤＡＰ）７日とさらに１１ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−ｌｆ段階）は、適用あたり２８０ｇ ａｉ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、Ｌｉｂｅｒｔｙ除草剤（２００ｇ ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．２％溶液で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜７日後に特定され、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ ３６０）を用いて調製された３インチ（７．６ｃｍ）のポットに個別に移植された。移植された植物を温室（２２±５℃、５０±３０％ＲＨ、１４時間の明：１０時間の暗、最小５００μΕ／ｍ２ｓ１自然＋補助照明）で育てた。分子確認分析は、生存Ｔ１植物について完了し、グリホサート耐性遺伝子が植物のゲノムに安定に組み込まれたことを確認した。
分子確認。ｐＤＡＢ１０７５２７、ｐＤＡＢ１０５５３０、ｐＤＡＢ１０５５３１、ｐＤＡＢ１０５５３２、ｐＤＡＢ１０５５３３、またはｐＤＡＢ１０５５３４で形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）植物のゲノム内でｄｇｔ−２８およびＤＳＭ−２導入遺伝子の存在が確認された。これらのポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセイ、遺伝子発現カセットＰＣＲ（植物転写単位ＰＣＲ−−ＰＴＵ ＰＣＲとも記載される）、サザンブロット分析、および定量的逆転写ＰＣＲ分析によって確認された。
Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、最初に、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされ、ＤＳＭ−２およびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認した。事象は、遺伝子発現カセットＰＣＲによりスクリーニングされ、ｄｇｔ発現カセットが、再配列することなく、植物ゲノムに完全に組み込まれたかどうかを決定した。これらの研究から得られたデータを用いて、自家受精およびＴ２世代への進行に関して、導入遺伝子のコピー数を決定し、選択アラビドプシス属（Arabidopsis）事象を同定した。また、進行したＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物を加水分解プローブアッセイによりスクリーニングし、植物染色体内にＤＳＭ−２遺伝子とｄｇｔ遺伝子の存在を確認し、そのコピー数を推定した。最後に、サザンブロットアッセイを用いて、Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のサブセット上の推定コピー数を確認した。
同様のアッセイを用いて、ｐＤＡＢ４１０４で形質転換された植物由来のｄｇｔ−１導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３２で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３２導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３４で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０７５３３で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０２７１５で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０２７１６で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、ｐＤＡＢ１０２７１７で形質転換された植物由来のｄｇｔ−３導入遺伝子の存在、およびｐＤＡＢ１０２７８５で形質転換された植物由来のｄｇｔ−７導入遺伝子の存在を確認した。
加水分解プローブアッセイ。後述する加水分解プローブアッセイを用いて、Ｔ１とＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）植物におけるコピー数を決定した。様々な数の導入遺伝子を有する植物を同定し、その後のグリホサート耐性研究に進めた。
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された（Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｅｔａｌ ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）。組織浸軟後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ（商標）９６植物キット（Ｑｉａｇｅｎ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式でゲノムＤＮＡを単離した。ゲノムＤＮＡをＱＵＡＮＴ−ＩＴ（商標）ＰＩＣＯ ＧＲＥＥＮ ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整された。加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＤＳＭ−２、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子、ＴＡＦＩＩ１５（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：ＮＣ００３０７５；Duarte et al., (201) BMC Evol. Biol., 10:61）について設計された。
増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ＤＳＭ−２とｄｇｔ−２８用のそれぞれ０．１μＭのプライマー、ＴＡＦＩＩ１５についてそれぞれ０．４μＭのプライマーおよび０．２μＭのそれぞれのプローブを含有する１０μＬ体積の多重反応物において１×最終濃度で調製された。表２。二段階増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行い、蛍光を得た。すべての試料を実施し、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行い、ΔΔＣｔ法に基づいている。このために、１コピーの較正物質由来のゲノムＤＮＡの試料と既知の２コピーチェックをそれぞれの実行に含めた。加水分解プローブスクリーニングのコピー数の結果は、Ｔ１およびＴ２トランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について決定された。
Figure 2015505480
サザンブロット分析を介したｄｓｔ−２８組み込み確認。サザンブロット分析を用いて、挿入されたＴ−鎖ＤＮＡ断片の組み込みパターンを確立し、ｄｇｔ−２８を含有する事象を同定した。データを作成し、アラビドプシス属（Arabidopsis）ゲノム内の導入遺伝子挿入物の組み込みと完全性を実証した。サザンブロットデータは、Ｔ−鎖ＤＮＡの無傷のコピーの単純な組み込みを同定するために使用された。詳細なサザンブロット分析は、ｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットに特異的なＰＣＲ増幅されたプローブを用いて行われた。特定の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、特定の分子量のゲノムＤＮＡ断片を同定した。そのパターンを用いて、次世代への進行のための完全長の単一挿入物Ｔ１トランスジェニック事象を同定した。
組織試料を２ｍＬのコニカルチューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標））に回収し、２日間凍結乾燥した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＫＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズを用いて実施された。組織浸軟後、ＣＴＡＢ単離手法を用いてゲノムＤＮＡを単離した。Ｑｉａｇｅｎ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｔｉｐｓキットを用いて、ゲノムＤＮＡをさらに精製した。ゲノムＤＮＡをＱｕａｎｔ−ＩＴ（商標）Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、一定濃度にするために４μｇに調整された。
それぞれの試料について、制限酵素ＳｗａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）を用いて、４μｇのゲノムＤＮＡを完全に消化し、２５℃で一晩インキュベートし、次に、反応にＮｓｉＩを添加し、３７℃にて６時間インキュベートした。消化されたＤＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、Ｑｕｉｃｋ Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて沈殿させて濃縮された。その後、６５℃にて１時間、２５μＬの水にゲノムＤＮＡを再懸濁した。再懸濁した試料は、１×ＴＡＥ中で調製された０．８％アガロースゲルに装填され、１×ＴＡＥ緩衝液中で１．１Ｖ／ｃｍで一晩電気泳動された。連続的に、ゲルは、３０分間の変性（０．２ＭのＮａＯＨ／０．６ＭのＮａＣｌ）、および３０分間の中和（０．５ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１．５ＭのＮａＣｌ）に供された。
ナイロンメンブレンへのＤＮＡ断片の転写は、クロマトグラフィーペーパーの芯や紙タオルを使用することによって、処理されたＩＭＭＯＢＩＬＯＮ（商標）ＮＹ＋転写メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）上にゲルを介して一晩２０×ＳＳＣ溶液を受動的に吸い上げることによって行われた。転写後、メンブレンは、簡単に、２×ＳＳＣで洗浄し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）１８００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて架橋し、８０℃にて３時間、真空乾燥させた。
モデル４００ハイブリダイゼーションインキュベータ（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｙｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、ガラスローラーボトル中で１時間６５℃にてプレハイブリダイゼーション溶液（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ ｐｌｕｓ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）とともにブロットをインキュベートした。プローブは、全コード配列を含むＰＣＲ断片から調製された。ＰＣＲアンプリコンは、ＱＩＡＥＸ（商標）ＩＩゲル抽出キットを用いて精製され、Ｒａｎｄｏｍ ＲＴ Ｐｒｉｍｅ ＩＴ（商標）標識キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を介して、α３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識された。ブロットは、ブロットあたり約２００万カウント／ｍＬまでハイブリダイゼーション緩衝液に直接添加された変性プローブを用いて、一晩６５℃にてハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション後、ブロットは、連続して、６５℃にて０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４０分間洗浄された。最後に、ブロットをストレージリン光イメージングスクリーンに曝露し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８６０（商標）イメージングシステムを用いて撮像した。
この研究において完成されたサザンブロット分析を用いて、コピー数を決定し、その選択された事象がアラビドプシス属（Arabidopsis）のゲノム内のｄｇｔ−２８導入遺伝子を含有していることを確認した。
ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットの確認。Ｔ１の植物事象に含まれるｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットの存在は、エンドポイントＰＣＲ反応によって検出された。ＡｔＵｂｉ１０プロモーターｖ２とｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットのＡｔｕＯＲＦ２３ ３’ＵＴＲ ｖ１領域に特異的なプライマー（表３）を検出のために使用した。
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ＰＣＲ反応は、遺伝子発現カセットを増幅するために、標準的な三段階のＰＣＲサイクリングプロトコールを必要とした。すべてのＰＣＲ反応は、以下のＰＣＲ条件を使用して完了された：９４℃にて３分間、続いて、９４℃にて３０秒間、６０℃にて３０秒間、および７２℃にて３分間の３５サイクル。製造者の指示に従って、ＥＸ−ＴＡＱ（商標）ＰＣＲキット（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、Ｏｔｓｕ、Ｓｈｉｇａ、Ｊａｐａｎ）を用いて、反応を完了させた。最終サイクル後、反応を７２℃にて１０分間インキュベートした。ＴＡＥアガロースゲル電気泳動を用いて、ＰＣＲアンプリコンのサイズを決定した。予想されるサイズのＰＣＲアンプリコンは、全長遺伝子発現カセットの存在がトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象のゲノム中に存在することを示した。
定量的逆転写ＰＣＲ分析を介したｄｇｔ−２８相対転写の確認。ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物の組織試料を９６ウェルプレートに回収し、８０℃にて凍結した。組織浸軟は、ＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機とタングステンビーズ（Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｅｔａｌ ＩＮＣ．、Ｓｗｅｅｔ Ｈｏｍｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて行った。組織浸軟の後、全ＲＮＡは、製造業者が示唆したプロトコールに従って、カラム上のオプションのＤｎａｓｅＩ処置を含めたＱｉａｇｅｎ（商標）Ｒｎｅａｓｙ ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いたハイスループット形式で単離された。その後、このステップは、溶出された全ＲＮＡの追加のＤｎａｓｅＩ（Ａｍｂｉｏｎ（商標）、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）処理に続いた。ｃＤＮＡ合成は、製造業者が示唆した手法に従って、オリゴヌクレオチド、ＴＶＮを加えて、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（商標）キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、鋳型として全ＲＮＡを使用して行われた。発現の定量は、加水分解プローブアッセイによって完了し、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲにより行われた。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）プローブデザインソフトウェア２．０を用いて、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子「未知タンパク質」（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＴ４Ｇ２４６１０）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、０．４μＭのそれぞれのプライマー、および０．２μＭのそれぞれのプローブを含む１０μＬ体積の一重反応中で１×最終濃度で調製された。表４。
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二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべての試料は３重にして行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。マイナス逆転写反応をそれぞれの試料について行い、ｇＤＮＡ汚染がないことを確認した。リアルタイムＰＣＲデータの分析はΔΔＣｔ法に基づいて行った。このアッセイを用いて、ヘミ接合性およびホモ接合性であることが決定されたトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）事象におけるｄｇｔ−２８の相対的発現を決定した。ｄｇｔ−２８ ｍＲＮＡの相対的転写レベルは、内部対照より２．５倍から２０７．５倍高い範囲であった。これらのデータは、ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物が、機能的ｄｇｔ−２８遺伝子発現カセットを含有し、植物がｄｇｔ−２８導入遺伝子を転写することができたことを示している。
ウエスタンブロッティング分析。ＤＧＴ−２８は、トランスジェニックシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）植物から得られる葉の試料において検出された。ｄｇｔ−２８トランスジェニック植物由来の植物抽出物とＤＧＴ−２８タンパク質標準は、ＤＴＴを含有するＮＵＰＡＧＥ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とともに、９０℃にて１０分間インキュベートされ、アクリルアミドプレキャストゲルにおいて電気泳動的に分離された。次に、タンパク質は、製造者のプロトコールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上に電気的に転写された。ＷＥＳＴＥＲＮＢＲＥＥＺＥ（登録商標）ブロッキングミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてブロッキング後、ＤＧＴ−２８タンパク質を抗ＤＧＴ−２８抗血清、次にヤギ抗ウサギホスファターゼによって検出した。検出されたタンパク質は、化学発光基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴウエスタン分析試薬（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）によって可視化された。ウエスタンブロットを介した無傷のＤＧＴ−２８タンパク質の生産は、アッセイされたｄｇｔ−２８トランスジェニック植物がＤＧＴ−２８タンパク質を発現したことを示した。
ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、異なる比率のグリホサートで噴霧された。高い比率がこの研究において適用され、抵抗性の相対的なレベル（１０５、４２０、１，６８０または３，３６０ｇ ａｅ／ｈａ）を決定した。非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）を防除する典型的な１×使用率は、４２０ｇ ａｅ／ｈａである。硫酸アンモニウムの添加を伴うグリホサート製剤は、１８７Ｌ／ｈａで較正されたトラック噴霧器を用いてＴ１植物に適用された。この研究で使用されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物は、様々なコピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子であった。低コピーのｄｇｔ−２８ Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物を自家受粉し、これを用いてＴ２植物を生成させた。表５は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子、ｄｇｔ−１、および野生型対照を引用したｄｇｔ−２８トランスジェニック植物の比較を示す。表６は、グリホサート除草剤抵抗性遺伝子、ｄｇｔ−１、および野生型対照を引用したｄｇｔ−３２とｄｇｔ−３３の比較を示す。表７は、新規な微生物ＥＰＳＰシンターゼ酵素と、クラスＩのＥＰＳＰシンターゼ酵素およびグリホサート比率が１，６８０ｇ ａｅ／ｈａの対照の比較を示す。
形質転換されたｄｇｔ−２８アラビドプシス属（Arabidopsis）植物のグリホサート選択の結果。アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを使用して、非形質転換の種子のバックグラウンドから選択された。３フラットまたは３０，０００個の種子は、各Ｔ１構築物について分析された。上記で選択されたＴ１植物は、分子的に特徴付けられ、その後、様々なコピー数を有する代表的な植物は、個別のポットに移植され、前述のように様々な比率の市販のグリホサートで噴霧された。これらの植物の応答は、処理から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは表に示され、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個々の植物を示す。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。
植物応答のレベルは変化した。この差異は、それぞれの植物が独立した形質転換事象を表すという事実に起因することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は、植物ごとに変動する。導入遺伝子を含んでいたいくつかの植物はグリホサートに耐性ではなく；これらの植物が導入遺伝子を発現したかどうかを判断する徹底的な分析が完了しなかったことに気付いた。Ｔ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内での高いコピー数の導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングをもたらしたかまたはグリホサートに対する感受性をもたらした他のエピジェネティックな効果をもたらした可能性がある。
比率による全体的な集団の損傷平均は、１，６８０ｇ ａｅ／ｈａでのグリホサートの比率について表７に示され、ｄｇｔ−３、ｄｇｔ−７、ｄｇｔ−２８、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３対ｄｇｔ−１および野生型対照で形質転換された植物の間に有意な差を実証する。
新規な細菌ＥＰＳＰシンターゼによって提供される耐性は、特異的酵素に依存して変化した。ＤＧＴ−２８、ＤＧＴ−３２、およびＤＧＴ−３３は、予想外にグリホサートに有意な耐性を示した。ｄｇｔ遺伝子は、試験したすべての輸送ペプチド全体で個々のＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物に除草剤抵抗性を付与した。このように、追加的な葉緑体輸送ペプチド（すなわち、ＴｒａＰ８−ｄｇｔ−３２またはＴｒａＰ８−ｄｇｔ−３３）の使用は、所定の処置内で報告されているのと同様の損傷レベルでグリホサートに対する保護を提供する。
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選択マーカーとしてのｄｇｔ−２８。グリホサート選択剤のための選択マーカーとしてのｄｇｔ−２８の使用は、上記のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換植物を用いて試験される。約５０個のＴ４世代アラビドプシス属（Arabidopsis）種子（ｄｇｔ−２８についてホモ接合）は、約５，０００個の野生型（グリホサートに感受性である）の種子に混ぜられる。種子は発芽され、苗木はグリホサートの選択用量で噴霧される。グリホサートのいくつかの処理を比較する：植物のそれぞれのトレイは、以下の処置スキーム：７ＤＡＰ（植え付け後の日数）、１１ＤＡＰ、または７ＤＡＰの後１１ＤＡＰの１つにおいて、グリホサートの１回または２回の適用時期のいずれかを受ける。すべての植物はまた、同じ形質転換ベクターにグルホシネート抵抗性遺伝子を含んでいるため、グリホサートを用いて選択されたｄｇｔ−２８を含む植物は、グルホシネートを用いて選択されたＤＳＭ−２またはｐａｔを含む植物と直接比較することができる。
前述のように、グリホサート処置は、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）噴霧チップを用いて適用される。ｄｇｔ−２８を含有するトランスジェニック植物は、「抵抗性」または「感受性」１７ＤＡＰとして同定される。植え付け後（ＤＡＰ）７日および１１日に適用された２６．２５〜１６８０ｇ ａｅ／ｈａグリホサートの処理は、ｄｇｔ−２８を含むトランスジェニックアラビドプシス属（Arabidopsis）植物について有効な選択を示す。感受性および抵抗性の植物をカウントし、グリホサート耐性植物の数は、植え付けられるｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関することが見出される。これらの結果は、ｄｇｔ−２８が、形質転換されたアラビドプシス属（Arabidopsis）の集団に対して代替的な選択マーカーとして効果的に使用できることを示す。
遺伝可能性。確認されたトランスジェニックＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象は、Ｔ２種子を生産するために自家受粉された。これらの種子は、１００個の無作為なＴ２同胞に、グルホシネート（２００ｇ ａｅ／ｈａ）を含有するＩｇｎｉｔｅ（商標）除草剤を適用することによって後代検定を行われた。それぞれの個々のＴ２植物は、噴霧適用（１８７Ｌ／ｈａ適用率でのトラック噴霧器）前に７．５ｃｍの正方形ポットに移植された。Ｔ１ファミリー（Ｔ２植物）は、カイ二乗分析（Ｐ＞０．０５）によって決定したメンデル遺伝を用いた優性遺伝単一遺伝子座について、予期される３抵抗性：１感受性モデルに分離した。期待されたメンデル遺伝を用いて分離されたＴ１ファミリーの割合は表８に示され、ｄｇｔ−２８形質はＴ２世代にメンデル遺伝を介して渡されることを実証する。種子は、５〜１５個のＴ２個体（Ｔ３種子）から回収された。３〜４個の無作為に選択されたＴ２ファミリーのそれぞれからの２５個のＴ３同胞について前述のように後代検定を行った。データは分離を示さず、したがって、ｄｇｔ−２８およびｄｇｔ−３は、染色体内に安定に組み込まれ、少なくとも３世代にメンデル様式で遺伝されることを実証した。
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Ｔ２アラビドプシス属（Arabidopsis）データ。低コピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子を含んだ選択されたＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）事象の第２世代植物（Ｔ２）は、グリホサート耐性についてさらに特徴付けられた。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。Ｔ２世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたそれぞれの比率のグリホサートに含まれた。遺伝子座で同じ２つの対立遺伝子を含むホモ接合植物と比較して、ヘミ接合植物は、遺伝子座で２つの異なる対立遺伝子を含む。グリホサートに対する応答の変動性は、ホモ接合植物と比較して、ヘミ接合性についての遺伝子量の差の結果として、Ｔ２世代で期待される。グリホサートへの応答の変動性は、標準偏差と応答の範囲に反映される。
Ｔ２世代において、１コピーとマルチコピーのｄｇｔ−２８事象の両方はグリホサート耐性について特徴付けられた。事象内では、１コピーの植物はグリホサートに対して同レベルの耐性を示した。１コピーＴ２事象について特徴的データを表９に示す。ＴｒａＰ５ ｖ２と連結されたｄｇｔ−２８を含む事象は、他のＴｒａＰ輸送ペプチドを含有したｄｇｔ−２８構築物と比較して、グリホサートに対する強固な耐性を提供しなかった。しかしながら、ｄｇｔ−２８ ＴｒａＰ５構築物は、非形質転換コロンビア対照と比較して、低レベルのグリホサート耐性を提供した。２以上のコピーのｄｇｔ−２８を含有することが示された事象が高比率のグリホサートにより感受性であるという例があった（データ示さず）。グリホサートに対する感受性のこの増加は、高いコピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子も含有したＴ１植物について先に記載されたデータに類似する。アラビドプシス属（Arabidopsis）植物内の高いコピー数の導入遺伝子の存在は、ｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在にもかかわらず、導入遺伝子サイレンシングまたはグリホサートに対する感受性をもたらす他のエピジェネティックな効果をもたらす可能性がある。
これらの事象は、ＴｒａＰ５ ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３０）、ＴｒａＰ１２ ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３３）およびＴｒａＰ１３ ｖ２（ｐＤＡＢ１０５５３４）と連結したｄｇｔ−２８を含んでいた。
ｄｇｔ−２８に加えて、ｄｇｔ−３で形質転換されたＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）事象を表１０に示す。表９においてｄｇｔ−２８事象について記載したように、データ表は、それぞれの構築物についてのグリホサートに対する応答に特徴的である代表的な事象を含む。ｄｇｔ−３の特徴付けのために、ＡｔＵｂｉ１０プロモーターによって駆動されるｄｇｔ−３遺伝子を有する単一ＰＴＵ（植物形質転換単位）を含む構築物（ｐＤＡＢ１０２７１６とｐＤＡＢ１０２７１５）は、遺伝子の２ＰＴＵ（ｐＤＡＢ１０２７１９；ｐＤＡＢ１０２７１８）を含む同遺伝子を有する構築物と比較された。２ＰＴＵを含んだ構築物は、該遺伝子の１コピーを駆動するためにＡｔＵｂｉ１０プロモーターを使用し、他のコピーを駆動するためにＣｓＶＭＶプロモーターを使用した。二重ＰＴＵの使用は、ｄｇｔ−３トランスジェニック植物と、２コピーの導入遺伝子を含有したｄｇｔ−２８トランスジェニック植物を比較するために組み込まれた。データは、単一のＰＴＵのみを有する１コピーのＴ２ ｄｇｔ−３事象が、試験された１コピーのｄｇｔ−２８事象よりもグリホサートに対して感受性であるが、非形質転換対照より高い耐性であることを実証した。ｄｇｔ−３遺伝子の２ＰＴＵを含むＴ１ファミリーは、１ＰＴＵ構築物と比較して、グリホサートに対して高いレベルの視覚的耐性を提供した。いずれの場合も、Ｔ１ファミリーは、ｄｇｔ−１および野生型対照と比較された。Ｔ２データは、ｄｇｔ−２８が１コピー事象として強固な耐性を提供することを実証している。
Figure 2015505480
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Ｔ３アラビドプシス属（Arabidopsis）データ。低コピー数のｄｇｔ−２８導入遺伝子を含んだ選択されたＴ２アラビドプシス属（Arabidopsis）事象の第３世代植物（Ｔ３）は、グリホサート耐性についてさらに特徴付けられた。株あたり２５個の植物は、上述のようにグリホシネートを用いて選択され、試験したすべての構築物からの株は選択マーカー遺伝子について分離しなかった。グリホサートを前述のように適用した。植物の応答は、処置から２週間後（ＷＡＴ）、視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、アラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換のために使用されるそれぞれの構築物について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。
Figure 2015505480
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形質転換植物の選択。新たに回収したＴ１種子［ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３ ｖ１遺伝子］を室温にて乾燥させ、試験のためにインディアナポリスに搬送した。Ｔ１種子は、２６．５×５１ｃｍの発芽トレイ（Ｔ．Ｏ．Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、ＭＮ）に播種され、それぞれは、予め４０ｍＬの０．１％アガロース溶液に懸濁され、４℃にて２日間保存された、層状にしたＴ１種子の２００ｍｇアリコート（約１０，０００個の種子）を受け、休眠要件を完了し、同期種子発芽を確保した。
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ Ｍｉｘ ＬＰ５（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｎｃ．、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、ＷＡ）は微細なバーミキュライトで覆われ、湿るまでホーグランド液で地下灌漑され、次に、重力排出を可能にした。層状にした種子のそれぞれ４０ｍＬのアリコートは、ピペットを用いてバーミキュライト上に均一に播種され、４〜５日間、湿度ドーム（ＫＯＲＤ（商標）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｒａｍａｌｅａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）で覆われた。ドームは、グルホシネート出芽後噴霧（同時形質転換されたｄｓｍ−２遺伝子を選択する）を使用した最初の形質転換体の選択前に植物が発芽した時点で外された。
植え付け後（ＤＡＰ）６日とさらに１０ＤＡＰに、Ｔ１植物（それぞれ子葉と２−４−ｌｆ段階）は、適用あたり２００ｇ ａｅ／ｈａグルホシネートの有効比率を達成するために、ＤｅＶｉｌｂｉｓｓ（商標）圧縮空気噴霧チップを用いて、１０ｍＬ／トレイ（７０３Ｌ／ｈａ）の噴霧体積で、ＩＧＮＩＴＥ（商標）除草剤（２８０ｇ ａｉ／Ｌグルホシネート、Ｂａｙｅｒ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ、ＭＯ）の０．１％溶液で噴霧された。生存者（活発に成長している植物）は、最終噴霧から４〜７日後に特定された。生存植物は、ポッティングメディア（Ｍｅｔｒｏ Ｍｉｘ ３６０（商標））を用いて調製された３インチ（７．６ｃｍ）のポットに個別に移植された。植物は、コピー数分析のための組織サンプリングの少なくとも１日前に温室において生育された。
Ｔ１植物をサンプリングし、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３ ｖ１遺伝子についてのコピー数分析を完了した。次に、コピーの範囲が、それぞれの比率にあるように、Ｔ１植物を様々な比率のグリホサートに割り当てた。アラビドプシス属（Arabidopsis）について、２６．２５ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートは、感受性の植物と意味のあるレベルの抵抗性を有する植物を区別するのに有効な用量である。高い比率は、相対的レベルの抵抗性（１０５、４２０、１６８０、または３３６０ｇ ａｅ／ｈａ）を決定するために適用された。表１３は、ｄｇｔ−１を引用した比較を示す。
すべてのグリホサート除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧体積でトラック噴霧器によってなされた。使用されたグリホサートは、市販のＤｕｒａｎｇｏジメチルアミン塩製剤（４８０ｇ ａｅ／Ｌ、Ｄｏｗ ＡｇｒｏＡｃｉｅｎｃｅｓ、ＬＬＣ）であった。グルホシネートまたはグリホサートのいずれかに耐性を示した低コピーのＴ１植物は、Ｔ２世代においてさらに評価された。
最初のアラビドプシス属（Arabidopsis）形質転換は、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３ ｖ１を用いて行われた。Ｔ１形質転換体は、最初に、グルホシネート選択スキームを用いて、非形質転換種子のバックグラウンドから選択された。３フラットまたは３０，０００個の種子は、各Ｔ１構築物について分析された。形質転換頻度を計算し、Ｔ１のｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３構築物の結果は表１２に列挙する。
Figure 2015505480
その後、上記で選択されたＴ１植物は、個別のポットに移植され、様々な比率の市販のグリホサートで噴霧された。表１３は、アラビドプシス属（Arabidopsis）Ｔ１形質転換体にグリホサート抵抗性を付与するｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２およびｄｇｔ−３３ ｖ１ならびに対照遺伝子の応答を比較する。応答は、２ＷＡＴで視覚的損傷％の観点から提示される。データは、損傷がほとんどないもしくは全くない（＜２０％）、中程度の損傷（２０〜４０％）、または重度の損傷（＞４０％）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、それぞれの処理について提示される。個別の応答における範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示されている。野生型、非形質転換アラビドプシス属（Arabidopsis）（栽培品種コロンビア）は、グリホサート感受性対照として用いた。輸送ペプチドＴｒａＰ２３を含むＤＧＴ−３１（ｖ１）遺伝子は、陰性対照と比較して、個々のＴ１アラビドプシス属（Arabidopsis）植物に対してわずかに除草剤耐性を付与したが、該遺伝子は、輸送ペプチドＴｒａＰ８により改善された耐性を示した。ＤＧＴ−３２とＤＧＴ−３３はともに、ＴｒａＰ８およびそれぞれの異なる葉緑体輸送ペプチド（それぞれＴｒａＰ１４およびＴｒａＰ２４）を用いて試験された比率でグリホサートに対して強固な耐性を実証した。所与の処理中で、植物応答のレベルは非常に変化した。これは、それぞれの植物が独立した形質転換事象を表すという事実に帰することができ、したがって、対象とする遺伝子のコピー数は植物ごとに変動する。重要にも注目すべきことに、試験したそれぞれのグリホサート比率で、他よりも耐性である個体があった。比率による全集団の損傷平均は表１３に示され、ｄｇｔ−３１、ｄｇｔ−３２、およびｄｇｔ−３３ ｖ１対ｄｇｔ−１ ｖ１または野生型対照で形質転換された植物間で有意な相違を実証する。
Figure 2015505480
Figure 2015505480
トウモロコシ形質転換。標準的なクローニング方法は、上述した通りであり、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を媒介したトウモロコシの形質転換において使用するためのバイナリーベクターの構築に用いた。表１４は、トウモロコシ形質転換のために構築されたベクターを列挙する。以下の遺伝子エレメントはｄｇｔ−２８を含んだベクターにおいて使用された；トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１；米国特許第５，５１０，４７４号）を用いて、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）に並べられたｄｇｔ−２８コード配列を駆動し、選択マーカーカセットは、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたａａｄ−１コード配列（米国特許第７，８３８，７３３号）を駆動するために使用されたトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターからなる。ａａｄ−１コード配列は、例えば、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）およびアリールオキシフェノキシプロピオネート（ＡＯＰＰ）除草剤などのフェノキシオーキシン除草剤に対する耐性を付与する。
ｄｇｔ−２８構築物は、標準的なバイナリーベクターおよびアグロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクター（Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ、Ｔｏｋｙｏ、ＪＰ）として構築された。標準的なバイナリーベクターとしては、ｐＤＡＢ１０７６６３、ｐＤＡＢ１０７６６４、ｐＤＡＢ１０７６６５、およびｐＤＡＢ１０７６６５が挙げられる。アグロバクテリウムスーパーバイナリーシステムベクターには、ｐＤＡＢ１０８３８４、ｐＤＡＢ１０８３８５、ｐＤＡＢ１０８３８６、およびｐＤＡＢ１０８３８７が含まれる。
黄色蛍光タンパク質（ｙｆｐ；米国特許出願公開第２００７／０２９８４１２号）レポーター遺伝子を含有しているさらなる構築物を完成した。ｐＤＡＢ１０９８１２は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５ ３’非翻訳領域（Ｚｍ ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ；米国特許第７１７９９０２号）に並べられたｙｆｐレポーター遺伝子カセットを含み、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター（ＳＣＢＶ；米国特許第５，９９４，１２３号）からなる。ｐＤＡＢ１０１５５６は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５ ３’非翻訳領域に並べられたｙｆｐカセットを含み、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたトウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターからなる。ｐＤＡＢ１０７６９８は、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたｄｇｔ−２８カセットを含み、ｙｆｐカセットは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーターによって駆動され、トウモロコシ（Zea mays）ｐｅｒ５ ３’非翻訳領域に並べられ、選択マーカーカセットは、ａａｄ−１発現を駆動するために使用され、トウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域に並べられたサトウキビ桿菌状ウイルスプロモーターからなる。これらの構築物の３つすべてが標準的なバイナリーベクターである。
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穂の滅菌および胚の単離。トウモロコシ未熟胚を得るために、トウモロコシ（Zea mays）の同系交配株Ｂ１０４の植物を温室で生育させ、自家受粉または同胞受粉し、穂を生成した。受粉後の約９〜１２日目に穂を回収した。実験日に、穂は、次亜塩素酸ナトリウム（５％）の２０％溶液に浸漬することによって表面を滅菌し、２０〜３０分間振とうし、次に、滅菌水で３回濯いだ。滅菌後、未熟接合胚（１．５〜２．４ｍｍ）は、それぞれの穂から無菌的に切除し、液体感染培地（ＬＳ基礎培地、４．４３ｇ／Ｌ；Ｎ６ビタミン溶液［１０００×］、１．００ｍＬ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６８．５ｇ／Ｌ；Ｄ（＋）グルコース、３６．０ｇ／Ｌ；１０ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、１５０μＬ／Ｌ）を含む微量遠心管に無作為に分配した。所与の実験セットについて、３つの穂からプールされた胚をそれぞれの形質転換に使用した。
アグロバクテリウム培養開始：
上記のバイナリー形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムのグリセロールストックは、適切な抗生物質を含むＡＢ最小培地プレート上に筋状にし、２０℃にて３〜４日間で増殖させた。単一のコロニーを採取し、同じ抗生物質を含むＹＥＰプレート上に筋状にし、２８℃にて１〜２日間インキュベートした。
アグロバクテリウム培養および共培養。アグロバクテリウムコロニーをＹＥＰプレートから採取し、５０ｍＬ使い捨てチューブ中の１０ｍＬ感染培地に懸濁した。細胞密度は、分光光度計を用いてＯＤ６００ｎｍが０．２〜０．４になるように調整した。アグロバクテリウム培養物を１２５ｒｐｍ、室温にてロータリーシェーカー上に置き、胚切除を行った。サイズが１．５〜２．４ｍｍ間の未熟接合胚は、滅菌トウモロコシ穀粒から単離し、１ｍＬの感染培地に入れ、同じ培地で１回洗浄した。アグロバクテリウム懸濁液（２ｍＬ）をそれぞれのチューブに加え、チューブを１０〜１５分間振とうプラットホーム上に置いた。胚を共培養培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオ−イノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）、３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌのＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；ＤＭＳＯ、１００μΜ）に移し、胚盤を上に向けて配向し、５０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２５℃にて３日間インキュベートした。
カルス選択および推定事象の再生。共培養期間後、胚を残りの培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ ２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）（選択剤を含まない）に移し、５０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２５℃にて３日間インキュベートした。
増殖阻害用量応答実験により、０．２５ｍＭ以上のグリホサート濃度が非形質転換Ｂ１０４トウモロコシ株において細胞増殖を阻害するのに十分であることが示唆された。胚は、０．５ｍＭグリホサートを含む選択１培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ミオイノシトール、１００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移され、暗所および／または５０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７〜１４日間インキュベートされた。
増殖中の胚発生カルスは、１．０ｍＭグリホサートを含有する選択２培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、７００．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．５００ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 １００．０ｍｇ／Ｌ；３０ｍＭ ジカンバ−ＫＯＨ、３．３ｍｇ／Ｌ；スクロース、３０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．３０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍＬ ＡｇＮｏ３、１５．０ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ；Ｒ−ハロキシホップ酸０．１８１０ｍｇ／Ｌ）に移し、暗所および／または５０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて１４日間インキュベートされた。この選択工程は、トランスジェニックカルスをさらに増殖および分化させた。カルス選択期間を３〜４週間継続した。
増殖中の胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有ＰｒｅＲｅｇ培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；Ｌ−プロリン、３５０．０ｍｇ／Ｌ；ＭＥＳ［（２−（ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸）、遊離酸］０．２５０ｇ／Ｌ；カゼイン酵素加水分解物 ５０．０ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ−ＮａＯＨ ０．５００ｍｇ／Ｌ；ＡＢＡ−ＥｔＯＨ ２．５０ｍｇ／Ｌ；ＢＡ １．００ｍｇ／Ｌ；スクロース、４５．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｚａｎ（商標）２．５０ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；８．５ｍｇ／ｍｌ ＡｇＮｏ３、１．００ｍｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で２８℃にて７日間培養された。
シュート様芽を有する胚発生カルスは、０．５ｍＭグリホサート含有再生培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００．０ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；カルベニシリン、１２５．０ｍｇ／Ｌ）に移し、５０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の２４時間光の下で７日間培養された。
一次根を有する小さなシュートは、Ｐｈｙｔｏｔｒａｙ中の発根培地（ＭＳ塩、４．３３ｇ／Ｌ；改変されたＭＳ−ビタミン［１０００×］、１．００ｍｌ／Ｌ；１，２，３，５／４，６−ヘキサヒドロキシシクロヘキサン、１００ｍｇ／Ｌ；スクロース、６０．０ｇ／Ｌ；Ｇｅｌｌａｎ Ｇｕｍ Ｇ４３４（商標）３．００ｇ／Ｌ；カルベニシリン、２５０．０ｍｇ／Ｌ）に移し、１４０〜１９０μｍｏｌｅ ｍ−２ｓｅｃ−１光強度の１６／８時間の明／暗で２７℃にて７日間インキュベートされた。推定されるトランスジェニック苗木は、上述のプロトコールを用いて、導入遺伝子のコピー数について分析され、土壌に移された。
トウモロコシ植物内のｄｇｔ−２８およびａａｄ−１導入遺伝子の存在の分子確認。ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１のポリヌクレオチド配列の存在は、加水分解プローブアッセイによって確認された。単離されたＴ０トウモロコシ植物は、最初に、ａａｄ−１とｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認するために、ＴＡＱＭＡＮ（商標）に類似した加水分解プローブアッセイを介してスクリーニングされた。これらの研究から生じたデータは、導入遺伝子のコピー数を決定するために使用され、Ｔ１世代へ戻し交配および進行のためのトランスジェニックトウモロコシ事象を選択するために使用された。
組織試料を９６ウェルプレートに回収し、組織浸軟は、Ｑｉａｇｅｎ（商標）ＲＬＴ緩衝液中でＫＬＥＣＯ（商標）組織粉砕機およびステンレス製ビーズ（Ｈｏｏｖｅｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃｕｍｍｉｎｇ、ＧＡ）を用いて行った。組織浸軟後、製造業者が示唆するプロトコールに従って、ゲノムＤＮＡは、Ｂｉｏｓｐｒｉｎｔ ９６（商標）Ｐｌａｎｔキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、ハイスループット形式で単離された。ゲノムＤＮＡは、Ｑｕａｎｔ−ＩＴ（商標）Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ ＤＮＡアッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）によって定量した。定量されたゲノムＤＮＡは、ＢＩＯＲＯＢＯＴ３０００（商標）自動化液体ハンドラー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いて、加水分解プローブアッセイのために約２ｎｇ／μＬに調整された。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイに類似した加水分解プローブアッセイによる導入遺伝子のコピー数の決定は、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０システム（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いたリアルタイムＰＣＲによって行われた。アッセイは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０を用いて、ａａｄ−１、ｄｇｔ−２８および内部参照遺伝子インベルターゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ１６１２３．１）について設計された。増幅のために、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、ａａｄ−１とｄｇｔ−２８についての０．４μＭの各プライマーおよび０．２μＭの各プローブを含有する１０μＬ体積の多重反応において１×最終濃度にて調製された（表１５）。
二段階の増幅反応は、６０℃にて４０秒間の伸長を用いて行われ、蛍光を得た。すべての試料を行い、平均サイクル閾値（Ｃｔ）をそれぞれの試料の分析に使用した。リアルタイムＰＣＲデータの分析は、相対的な定量モジュールを用いたＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）ソフトウェアリリース１．５を使用して行われ、ΔΔＣｔ法に基づいている。対照は、それぞれの実行に含まれた単一コピー較正因子と既知の２つのコピーチェックからのゲノムＤＮＡの試料を含んだ。表１６は、加水分解プローブアッセイの結果を列挙する。
Figure 2015505480
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ｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシにおける除草剤耐性。トウモロコシ（Zea mays）ｄｇｔ−２８形質転換事象（Ｔ０）は、温室で順化させ、植物が、組織培養から温室生育条件（すなわち、２〜４の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現していた）に移行するまで成長させた。植物を温室で、２７℃にて１６時間の明所：８時間の暗所の条件で生育した。次に、植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともに、ＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）（除草剤グリホサートを含む）の市販製剤で処理した。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。Ｔ０植物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系Ｂ１０４に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。
Ｔ０ ｄｇｔ−２８トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａまでの比率で達成されたことを実証した。特定の媒体タイプをＴ０世代に使用した。非形質転換対照と比較した、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植物成長は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドに連結されたとき、ｄｇｔ−２８がグリホサートに対する強固な耐性を提供することを実証した。
選択されたＴ０植物は、次世代におけるさらなる特徴付けのために自家受粉され、または戻し交配される。Ｔ１植物を含む１００個の選ばれたｄｇｔ−２８株は、１４０〜１１２０ｇ ａｅ／ｈａのグルホシネートまたは１０５〜１６８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートで噴霧される。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、１つの除草剤耐性遺伝子が除草剤で噴霧することによって選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。１４ＤＡＴで、抵抗性および感受性植物は、カイ二乗分析によって決定された単一遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された株の割合を決定するためにカウントされる。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝され得ることを実証する。グリホサート比率の増加は、ｄｇｔ−２８遺伝子によって提供される耐性および保護をさらに特徴付けるために、Ｔ１またはＦ１生存者に適用される。
ｄｇｔ−２８で形質転換されたＴ０トウモロコシにおける発芽後の除草剤耐性。ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３と連結されたｄｇｔ−２８のＴ０事象は、アグロバクテリウム形質転換によって生成され、２〜４枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで、制御された成長チャンバー条件下で順化させた。植物は、個々の識別番号が割り当てられ、ｄｇｔ−２８とａａｄ−１の両方のコピー数分析のためにサンプリングされた。コピー数分析に基づいて、タンパク質発現分析のための植物を選択した。植物を新しい成長培地とともに大きなポットに移植し、温室で２７℃にて１６時間明所：８時間暗所の条件で生育した。次に、タンパク質発現のためにサンプリングされなかった残りの植物を２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加とともにＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）（グリホサート）の市販製剤で処理した。植物のそれぞれのグループがコピー数を変化させるＴ０事象を含むように処置を分配させた。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの噴霧量、５０ｃｍの噴霧高でトラック噴霧器を用いて行われた。Ｔ０植物は、非形質転換トウモロコシ株に重大な損傷を与えることができる２８０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、近交系Ｂ１０４に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。Ｂ１０４は、形質転換体の遺伝的バックグラウンドであった。
Ｔ０ ｄｇｔ−２８トウモロコシ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａまで達成されたことを実証する。表１７。非形質転換対照と比較した、形質転換植物の最小発育阻害および全体の植物成長は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３に連結されたとき、ｄｇｔ−２８がグリホサートに対する強固な保護を与えることを実証した。
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標準的なＥＬＩＳＡによるタンパク質発現分析は、試験された構築物全体で１２．６〜２２．５ｎｇ／ｃｍ２のＤＧＴ−２８タンパク質の平均範囲を実証した。
温室条件下でのＦ１世代におけるグリホサート耐性の確認。噴霧されなかった１コピーのＴ０植物は、次世代においてさらなる特徴付けのために、非形質転換のバックグラウンドＢ１０４に戻し交配された。Ｔ１世代において、グリホサート耐性は、ｄｇｔ−２８遺伝子の遺伝を確認するために評価された。Ｔ１植物について、除草剤ＡＳＳＵＲＥ ＩＩ（商標）（３５ｇ ａｅ／ｈａのキザロホップ−メチル）は、ＡＡＤ−１タンパク質を選択するためのＶ１成長段階で適用された。選択マーカーとグリホサート抵抗性遺伝子の両方は、同じプラスミド上に構築される。したがって、１つの遺伝子が選択される場合、両方の遺伝子が存在すると考えられる。７ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントし、ヌル植物を集団から除去した。これらのデータは、ｄｇｔ−２８（ｖ１）は、単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝することができることを実証する。標準的なＥＬＩＳＡおよびＲＮＡ転写レベルによるＤＧＴ−２８タンパク質の特徴付けのために植物をサンプリングした。抵抗性植物は、前述のように、５６０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートで噴霧された。データは、４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートまで、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３と連結されたｄｇｔ−２８の強固な耐性を実証する。表１８。
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タンパク質発現データは、Ｔ１世代のタンパク質発現を確立する、Ｔ１事象および試験された構築物全体で、４２．２〜８８．２ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均ＤＧＴ−２８タンパク質を実証する。
野外条件下のｄｇｔ−２８トウモロコシの特徴付け。１コピーのＴ１事象は、さらなる特徴付けのために、ハイブリッドヘミ接合種子と近交系ホモ接合種子の両方を作製するために野外場所に搬送された。ハイブリッド種子は、トウモロコシ形質転換株Ｂ１０４におけるＴ１事象を、事象について１：１（ヘミ接合：ヌル）を分離するハイブリッド集団を生成する近交株４ＸＰ８１１に交配させることによって作製された。得られた種子は、２つの別々の場所に搬送された。構築物あたり５つの１コピー事象の合計は、３重の無作為化された完全ブロック設計のそれぞれの場所で植え付けられた。野外は、Ｖ４成長段階で生じさせるためのグリホサート適用、およびＶ８成長段階で適用される植物の別のグループについて設計された。４ＸＰ８１１／Ｂ１０４の従来のハイブリッドを陰性対照として使用した。
実験行は、ヌル分離体を排除するために、１８４ｇ ａｅ／ｈａのＡＳＳＵＲＥ ＩＩ（商標）（１０６ｇ ａｉ／Ｌのキザロホップ−メチル）で処理された。すべての実験エントリーは、ＡＳＳＵＲＥ ＩＩ（商標）適用に関して１：１（感受性：抵抗性）（ｐ＝０．０５）を分離した。選択された抵抗性植物は、標準的なＥＬＩＳＡによってＤＧＴ−２８タンパク質の定量化のためにそれぞれの事象からサンプリングされた。
キザロホップメチル抵抗性植物は、Ｖ４またはＶ８成長段階のいずれかで２．５％ｗ／ｖ硫酸アンモニウムの添加とともに、市販の除草剤ＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）（４８０ｇ ａｅ／Ｌのグリホサート）で処理された。除草剤適用は、１８７Ｌ／ｈａの体積、５０ｃｍの噴霧高を送達するように較正されたブーム噴霧器を用いて行われた。植物は、非形質転換トウモロコシ株に対して重大な損傷を与えることができる１１２０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートのある範囲のグリホサートで噴霧された。致死量は、４ＸＰ８１１近交系に対して＞９５％損傷を引き起こす比率として定義される。視覚的損傷評価は、７、１４および２１ＤＡＴ（処置後の日数）での視覚的な白化の割合、壊死の割合、成長阻害の割合および全視覚的損傷について行われた。評価は、それぞれの株および陰性対照について、未処理チェックと比較された。
すべての評価時期の視覚的損傷データは、場所と適用時期の両方で、最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａまでのＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）に対する強固な耐性を実証した。Ｖ４適用に関する代表的な事象は１つの場所から示され、他の事象、適用時期および場所と一致している。表１９。ＴｒａＰ２３（ｐＤＡＢ１０７６６５）と連結されたｄｇｔ−２８を含む構築物からの１つの事象は、ＡＡＤ−１タンパク質についてＡＳＳＵＲＥ ＩＩ（商標）選択に対して耐性であったが、適用されたすべての比率のグリホサートに感受性であった。
Figure 2015505480
追加の評価は、４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート比率について、再生成長段階中に行われた。房、受粉時期および穂の膨らみの視覚的評価は、すべての構築物、適用時期および場所について、それぞれの株の未処理チェックと同様であった。ＤＧＴ−２８タンパク質の定量結果は、１８６．４〜３０３．０ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均タンパク質発現を実証した。データは、最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートまで再生成長段階を通じて、野外条件下でｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシの強固な耐性を実証する。また、データは、噴霧耐性結果に基づいて、ＤＧＴ−２８タンパク質の検出および機能を実証した。
ホモ接合状態におけるｄｇｔ−２８トウモロコシの遺伝可能性および耐性の確認。Ｔ１Ｓ２から種子は、前述のように、温室条件下で植え付けられた。野外条件下で特徴付けた同じ５つの１コピー株は均一な状態で特徴付けた。植物は、Ｖ３成長段階まで成長させ、１１２０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート（ＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標））の範囲の３つの比率のグリホサートおよび処理あたり４つの複製に分離された。適用は、前述のようにトラック噴霧器で行われ、２．０％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムにおいて製剤化された。硫酸アンモニウムの適用は、それぞれの株に対して未処理のチェックとして用いた。前述のように、視覚的評価は処置から７日後および１４日後に行われた。データは、試験されたすべての事象について、最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートまで強固な耐性を実証した。表２０。
Figure 2015505480
野外条件下で耐性でないｐＤＡＢ１０７６６５からの株はグリホサートに対して耐性を示さず、したがって、野外観察と一致する（データ示さず）。前述の１つの株を除いて、株からグリホサートで処理したすべての複製物は、グリホサートに対して感受性でなかった。したがって、データは、メンデル様式でｄｇｔ−２８トウモロコシの均質な集団に対する遺伝可能性を実証する。標準的なＥＬＩＳＡによるＤＧＴ−２８タンパク質の発現は、グリホサートに耐性であった１コピー事象全体で２７．５〜６５．８ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均タンパク質発現を実証した。データは、機能的タンパク質、および世代全体でＤＧＴ−２８タンパク質の安定性を実証する。
選択マーカーとしてのグリホサートの発芽後の除草剤耐性使用。前述したように、Ｔ０形質転換植物を組織培養から移動させ、温室内で順化させた。試験された事象は、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８、およびＴｒａＰ２３葉緑体輸送ペプチドに連結されたｄｇｔ−２８を含有した。これらのＴ０植物は最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａまでのグリホサートに強固な耐性を提供し、非形質転換植物は、２８０ｇ ａｅ／ｈａ程度に低い濃度のグリホサートで制御されたことが実証された。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が、２８０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの濃度を用いる選択マーカーとして利用され得ることを実証する。
ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトウモロコシの固定された株からの多数の種子が、多数の非形質転換トウモロコシ種子に混ぜられた。種子を植え付け、Ｖ１〜Ｖ３発育段階まで生育させ、その時点で、苗木は、２８０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａの範囲でグリホサートの選択用量を用いて噴霧される。７〜１０日後に、感受性および抵抗性植物をカウントし、グリホサート耐性植物の量は、植え付けられるｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニック種子の元の数と相関する。
ｄｇｔ−２８トウモロコシのスタッキング。ＡＡＤ−１タンパク質は、研究目的のためにｄｇｔ−２８形質転換されたトウモロコシにおいて選択マーカーとして使用される。また、ａａｄ−１遺伝子は、作物における最大Ｖ８適用までに強固な２，４−Ｄ耐性を提供するために、トウモロコシにおける除草剤耐性の形質として利用することができる。構築物ｐＤＡＢ１０７６６３（ＴｒａＰ４：：ｄｇｔ−２８）、ｐＤＡＢ１０７６６４（ＴｒａＰ８：：ｄｇｔ−２８）およびｐＤＡＢ１０７６６６（ＴｒａＰ５：：ｄｇｔ−２８）からの４つの事象は、グリホサートおよび２，４−Ｄのタンク混合適用の耐性について特徴付けられた。特徴付け研究は、温室条件下でＦ１種子を用いて完了された。適用は、前述されるように、以下の比率：１１２０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート（ｄｇｔ−２８遺伝子について選択的である）、１１２０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ａａｄ−１遺伝子について選択的である）、または記載される比率での２つの除草剤のタンク混合物でトラック噴霧器において行われた。植物は７および１４ＤＡＴで等級付けされた。２２４０ｇ ａｅ／ｈａの除草剤の適用についての噴霧結果を表２１に示す。
Figure 2015505480
結果は、ｄｇｔ−２８がａａｄ−１と首尾よく積層できることを確認し、したがって、対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤（ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１についてそれぞれグリホサート＋フェノキシ酢酸）を増やす。防除が難しい広葉雑草または抵抗性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象とする作物の保護の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性はまた、トウモロコシおよび他の植物におけるｄｇｔ−２８遺伝子を用いて積層することができる。
ダイズ形質転換。安定に組み込まれたｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックダイズ（Glycine max）は、アグロバクテリウムを媒介したダイズ子葉節外植片の形質転換を介して生成された。機能的ｄｇｔ−２８を含有するバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株を、形質転換を開始するために使用した。
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Zengら（Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482）の修正された半子葉節手法を用いて行われた。簡単に説明すると、ダイズ種子（品種マーベリック）を基本培地で発芽させ、子葉節を単離し、アグロバクテリウムで感染させた。シュート開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足される。除草剤を介した選択を、非形質転換シュートの生育を阻害するために使用した。選択されたシュートは、根の発育のために発根培地に移され、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移される。
選択された苗木の末端の小葉を、推定の形質転換体をスクリーニングするために、除草剤（葉塗装技術）で局所的に処理した。スクリーニングされた苗木を、温室に移し、順化させ、次に、除草剤で葉を塗装し、耐性を再確認した。これらの推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、除草剤選択マーカーおよびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認した。Ｔ０植物を温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を作製した。
第２のダイズ形質転換法を用いて、追加のトランスジェニックダイズ植物を作製することができる。機能的ｄｇｔ−２８を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株を使用して、形質転換を開始する。
アグロバクテリウムを媒介した形質転換は、Paz et al.（Paz M., Martinez J., Kalvig A., Fonger T., and Wang K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213）の修正された半種子手法を用いて実施された。簡単に説明すると、成熟ダイズ種子を、塩素ガスで一晩滅菌し、アグロバクテリウムを媒介した植物形質転換の２０時間前に滅菌Ｈ２Ｏを吸収させた。種子は、種子を分離し、種皮を除去するために、へそに沿って長手方向の切り込みによって半分に切断した。胚軸を切除し、いずれもの軸方向のシュート／芽を子葉節から除去した。得られた半種子の外植片をアグロバクテリウムで感染させた。シュート開始、シュート伸長、および発根培地には、アグロバクテリウムを除去するためのセフォタキシム、チメンチンおよびバンコマイシンが補足された。除草剤選択を、非形質転換シュートの生育を阻害するために使用した。選択されたシュートを、根の発育のために発根培地に移し、次に、苗木の順化のための土壌ミックスに移した。
推定の形質転換されたＴ０植物をサンプリングし、分子分析を用いて、選択マーカーおよびｄｇｔ−２８導入遺伝子の存在を確認した。いくつかの事象は、導入遺伝子を含むものとして同定される。これらのＴ０植物を、さらなる分析に進め、温室で自家受粉させ、Ｔ１種子を生じさせた。
ｄｇｔ−２８形質転換Ｔ１ダイズにおける発芽後の除草剤耐性。前述のスクリーニング法によって、遺伝可能性であることが決定されたＴ１事象由来の種子は、温室条件下でメトロミックス培地に植え付けられた。第１の三つ葉が完全に展開されるまで植物を生育させ、前述のように、ｐａｔ遺伝子の選択のために４１１ｇ ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ（商標）２８０ＳＬで処理した。それぞれの事象由来の抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、十分な植物が存在する場合に処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、野生型のプチハバナタバコと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ（商標）ジメチルアミン塩（ＤＭＡ）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
Figure 2015505480
Ｔ２世代における高いグリホサート率に対するｄｇｔ−２８保護。４５個の植物の後代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の２〜５個のＴ２株に対して行われた。ホモ接合体株は、前の世代に完成した接合性分析に基づいて選択された。前述のように種子を植え付けた。次に、植物は、前述のようなｐａｔ選択マーカーの選択のために、４１１ｇ ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントした。
ｄｇｔ−２８と連結されたＴｒａＰ４を含む構築物（ｐＤＡＢ１０７５４３およびｐＤＡＢ１０７５４８）について、試験された１２個の株のうち９個は分離せず、それによって、Ｔ２世代において均一な株を確認した。ｄｇｔ−２８と連結されたＴｒａＰ８を含む株（ｐＤＡＢ１０７５４５）は、４つの株のうち２つは分離がないことを実証し、ダイズにおけるｄｇｔ−２８の少なくとも２つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。組織試料は、抵抗性植物から採取され、ＤＧＴ−２８タンパク質は、標準的なＥＬＩＳＡ法によって定量された。データは、試験された非分離のＴ２株について、３２．８〜１０７．５ｎｇ／ｃｍ２のある範囲の平均ＤＧＴ−２８タンパク質を実証した。構築物ｐＤＡＢ１０７５５３（ＴｒａＰ２３：：ｄｇｔ−２８）由来の株は、グルホシネートで以前に選択されなかった。グリホサートの用量反応は、均質性と高い比率のグリホサートに対する耐性を試験するために利用された。構築物ｐＤＡＢ１０７５５３由来の株からの複製物は、５６０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲の比率に耐性であり、したがって、少なくとも２つの世代で均質な集団であり、遺伝可能性であることが確認された。
５６０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡの比率は、前述のように２〜３個の三つ葉のダイズに適用された。１４ＤＡＴの視覚的損傷データは、Ｔ１世代において実証された耐性結果を確認した。
Figure 2015505480
ｄｇｔ−２８を用いたイネの形質転換。典型的な形質転換法において、安定に組み込まれたｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むトランスジェニックイネ（コメ（Oryza sativa））は、滅菌したイネ種子のアグロバクテリウムを媒介した形質転換を介して生成される。機能的ｄｇｔ−２８を含むバイナリーベクターを担持する安全化されたアグロバクテリウム株は、形質転換を開始するために使用される。
培養培地は、１ＭのＫＯＨでｐＨ５．８に調整され、２．５ｇ／ｌのＰｈｙｔａｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で固化される。胚発生カルスは、３０ｍｌの半固形培地を含む１００×２０ｍｍのペトリ皿中で培養される。イネ苗木は、ＭＡＧＥＮＴＡボックス中の５０ｍｌの培地上で生育される。細胞懸濁液は、３５ｍＬの液体培地を含む１２５ｍｌのコニカルフラスコ中で維持され、１２５ｒｐｍで回転させる。胚発生培養の誘導および維持は、２５〜２６℃にて暗所で発生させ、植物再生および全植物体培養は、１６時間の光周期（Ｚｈａｎｇら、１９９６）を用いて照明の部屋で発生させる。
胚発生カルスの誘導および維持は、前述されるような改変されたＮＢ基礎培地（Ｌｉら、１９９３）上で行われ、ここで、培地は、５００ｍｇ／Ｌのグルタミンを含むように適合される。懸濁培養物は、マルトースの代わりに３０ｇ／Ｌのスクロースを含む、ＳＺ液体培地（Ｚｈａｎｇら、１９９８）中で開始され、維持される。浸透培地（ＮＢＯ）は、それぞれ０．２５６Ｍのマンニトールとソルビトールの添加を伴うＮＢ培地からなる。除草剤抵抗性カルスは、３〜４週間、適切な除草剤選択剤が補足されたＮＢ培地上で選択される。プレ再生は、１週間、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、１ｍｇ／ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、５ｍｇ／ｌのアブシジン酸（ＡＢＡ）と選択的除草剤を含むＮＢ培地からなる培地（ＰＲＨ５０）上で行われる。苗木の再生は、推定上、トランスジェニックシュートが再生されるまで、２，４−Ｄ、０．５ｍｇ／ｌのＮＡＡおよび選択的除草剤を含有するＮＢ培地を含む再生培地（ＲＮＨ５０）上での培養に続く。シュートは、１％スクロースと選択的除草剤が補足された、半強度のＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ基本塩とＧａｍｂｏｒｇのＢ５ビタミンを含む発根培地に移される。
コメ（Oryza sativa）Ｌ．ジャポニカ品種Ｔａｉｐｅｉ３０９の成熟乾燥種子は、Ｚｈａｎｇら、１９９６に記載されるように滅菌される。胚発生組織は、暗所においてＮＢ培地上で滅菌成熟イネ種子を培養することによって誘導される。約１ｍｍ径の一次カルスは、胚盤から取り出され、ＳＺ液体培地中で細胞懸濁を開始するために使用される。次に、懸濁液は、Zhang、1996に記載されるように維持される。懸濁誘導された胚発生組織は、先の継代培養から３〜５日後、液体培地から取り出され、ＮＢＯ浸透培地上に配置され、ペトリ皿全体において約２．５ｃｍの円を形成し、照射前４時間、培養される。照射の１６〜２０時間後、組織をＮＢＯ培地からＮＢＨ５０選択培地に移し、照射表面が上を向いていることを確認し、暗所にて１４〜１７日間インキュベートされる。次に、新たに形成されたカルスは、元の照射された外植片から分離され、同じ培地上で、近くに配置される。さらに８〜１２日後、比較的にコンパクトであり、不透明なカルスは、視覚的に識別され、暗所での７日間、ＰＲＨ５０プレ再生培地に移される。次に、よりコンパクトで不透明になる成長中のカルスは、１６時間の光周期の下で１４〜２１日間、ＲＮＨ５０再生培地上で継代培養される。再生中のシュートは、１／２のＭＳＨ５０培地を含むＭＡＧＥＮＴＡボックスに移される。単一の外植片から再生された複数の植物は、同胞種であると考えられ、１つの独立した植物株として処理される。植物は、厚く、白い根を生成し、１／２のＭＳＨ５０培地上で積極的に成長している場合、ｄｇｔ−２８遺伝子について陽性として採点される。苗木がＭＡＧＥＮＴＡボックスの最上部に達すると、１００％湿度で１週間、６ｃｍポット中の土壌に移され、次に、３０℃にて１４時間の光周期の成長チャンバーに移動させ、温室において１３ｃｍポットに移植される前に、２１℃にて２〜３週間、暗所に配置される。種子を回収し、４℃で保存する前に１週間、３７℃で乾燥させる。
ｄｇｔ−２８イネのＴ０分析。アグロバクテリウム形質転換を介して得られた植え付けられたイネ形質転換体を培地に移植し、温室条件に順化させた。すべての植物は、ｄｇｔ−２８のＰＣＲ検出のためにサンプリングされ、結果は、ｐＤＡＢ１１０８２７（ＴｒａＰ８：：ｄｇｔ−２８）について２２個のＰＣＲ陽性事象と、ｐＤＡＢ１１０８２８（ＴｒａＰ２３：：ｄｇｔ−２８）について１６個のＰＣＲ陽性事象の最小を実証する。ＰＣＲ陽性事象のｄｇｔ−２８についてのサザン分析は、両方の構築物について単一（１〜２コピー）事象を実証した。選択されたＴ０事象のタンパク質発現は、ＤＧＴ−２８タンパク質の発現が、検出レベル未満から１３０ｎｇ／ｃｍ２の範囲であることを実証した。構築物ｐＤＡＢ１１０８２８からの選択されたＴ０事象は、前述されるように２２４０ｇ ａｅ／ｈａのＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）で処理され、処置の７および１４日後に評価された。データは、適用されたグリホサートの比率に強固な耐性を実証した。すべてのＰＣＲ陽性植物は、さらなる特徴付けのためにＴ１種子を生成させた。
イネにおけるｄｇｔ−２８遺伝可能性。１００個の植物後代検定は、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ８を含む構築物ｐＤＡＢ１１０８２７からのｄｇｔ−２８の４つのＴ１株において行われた。種子は、培地で満たされたポットに植えられた。次に、すべての植物は、前述されるように、ｄｇｔ−２８遺伝子の選択について、５６０ｇ ａｅ／ｈａのＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）で噴霧された。７ＤＡＴ後、抵抗性および感受性の植物をカウントした。それぞれの構築物について試験された４つの株のうちの２つは、カイ二乗分析によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ｄｇｔ−２８は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である。
ｄｇｔ−２８形質転換されたＴ１イネにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定において使用されるそれぞれの事象からのＴ１抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、野生型のキタアケイネと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜２２４０ｇ ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
噴霧結果は、７ＤＡＴ（処置後の日数）で、高い比率のグリホサートに対する最小植物損傷が検出されたことを実証する（データ示さず）。
Figure 2015505480
ＤＧＴ−２８のタンパク質検出は、ｐＤＡＢ１１０８２７から試験された４つすべてのＴ１株からの複製物について評価された。データは、ＤＧＴ−２８平均タンパク質が、ヘミ接合複製物とホモ接合複製物について、それぞれ２０〜８２ｎｇ／ｃｍ２と２１〜２０９ｎｇ／ｃｍ２の範囲であることを実証した。これらの結果は、Ｔ１世代に対する安定なタンパク質発現と、選択のために使用された５６０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート適用後の最大２２４０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートまでのｄｇｔ−２８イネの耐性を実証した。
ｄｇｔ−２８を用いたタバコの形質転換。タバコ（cv. Petit Havana）の葉片を、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を用いて形質転換した。ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含むプラスミドを含有する単一コロニーを、スペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）とストレプトマイシン（１２５μｇ／ｍＬ）を含有する４ｍＬのＹＥＰ培地に植菌し、１９０ｒｐｍの振とう機上で一晩２８℃にてインキュベートした。その後、４ｍＬの種子培養物を用いて、１２５ｍＬのバッフルされた三角フラスコ中で同じ培地の２５ｍＬの培養物を植菌した。この培養物を、ＯＤ６００が約１．２に達するまで１９０ｒｐｍで振とうしながら２８℃にてインキュベートした。次に、１０ｍＬのアグロバクテリウム懸濁液を、滅菌した６０×２０ｍｍのペトリ（商標）皿に配置した。
ＰｈｙｔａＴｒａｙｓ（商標）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）における３０ｇ／Ｌのスクロースを含むＭＳ培地（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ、Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ、ＫＳ）上で無菌で成長させた植物の新鮮なカットされた葉片（０．５ｃｍ２）を、アグロバクテリウムの１０ｍＬの一晩培養物に数分間浸漬させ、滅菌ろ紙上にブロット乾燥させ、次に、１ｍｇ／Ｌインドール酢酸および１ｍｇ／Ｌの６−ベンジルアミノプリンの添加を伴う同じ培地上に配置した。３日後、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を保有するアグロバクテリウムと共培養された葉片を、５ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含む同じ培地に移した。
３週間後、個々のＴ０苗木を、１０ｍｇ／ＬのＢａｓｔａ（商標）および２５０ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＭＳ培地に移し、さらに３週間後、土壌に移植し、温室に移す。選択されたＴ０植物（上述の分子分析プロトコールを用いて同定される）に、自家受粉させ、完全に乾燥したとき、種子をカプセルから回収した。Ｔ１実生は、接合性およびレポーター遺伝子発現（後述）についてスクリーニングされ、ｄｇｔ−２８導入遺伝子を含む選択された植物を同定した。
植物は、根から寒天を洗浄し、１３．７５ｃｍの正方形ポット中の土壌に移植し、ポットをＺｉｐｌｏｃ（登録商標）バッグ（ＳＣ Ｊｏｈｏｎｓｏｎ ＆ Ｓｏｎ，Ｉｎ．）に置き、バッグの底に水道水を入れ、間接光中の３０℃の温室に１週間置くことによって温室に移動された。３〜７日後、バッグを開封した；植物を受精し、植物が温室で順化されるまで開封したバッグで成長させた。その時点でバッグを除去した。植物は、通常の暖かい温室条件（日中２７℃、夜間２４℃、日中１６時間、最小の自然光＋補足光＝１２００μΕ／ｍ２ｓ１）下で成長させた。
繁殖前に、Ｔ０植物をＤＮＡ分析のためにサンプリングし、リアルタイムＰＣＲによってインサートｄｇｔ−２８のコピー数を決定した。新鮮な組織をチューブに入れ、４℃にて２日間凍結乾燥した。組織が完全に乾燥した後、タングステンビーズ（Ｖａｌｅｎｉｔｅ）をチューブ中に配置し、試料をＫｅｌｃｏビーズミルを用いた１分間の乾式粉砕に供した。次に、標準のＤＮｅａｓｙ（商標）ＤＮＡ単離手法を続けた（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＮｅａｓｙ ６９０１９）。抽出したＤＮＡのアリコートをピコグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐ７５８９）で染色し、既知の標準とともに蛍光光度計（ＢｉｏＴｅｋ（商標））において読み出し、濃度（ｎｇ／μｌ）を得た。総ＤＮＡの全１００ｎｇを鋳型として使用した。ＰＣＲ反応は、９７００Ｇｅｎｅａｍｐ（商標）サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において実施され、試料を９４℃で３分間と、９４℃で３０秒間、６４℃にて３０秒間および７２℃で１分４５秒の３５サイクル、ならびに７２℃で１０分間に供した。ＰＣＲ産物をＥｔＢｒで染色した１％アガロースゲル上の電気泳動によって分析し、サザンブロットによって確認した。
異なる葉緑体輸送ペプチド配列を含む３つの構築物（ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３）からのｄｇｔ−２８遺伝子の１〜３コピーを有する５〜９個のＰＣＲ陽性事象を再生し、温室に移した。
すべてのＰＣＲ陽性植物は、標準的なＥＬＩＳＡによってＤＧＴ−２８タンパク質の定量のためにサンプリングされた。ＤＧＴ−２８タンパク質は、すべてのＰＣＲ陽性植物において検出され、タンパク質濃度が増加する傾向は、ｄｇｔ−２８のコピー数の増加とともに注目された。
タバコにおけるａａｄ−１２（ｖ１）遺伝可能性。１００個の植物の後代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の５つのＴ１株について行われた。構築物は、以下の葉緑体輸送ペプチド配列：ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８またはＴｒａＰ２３の１つを含んだ。種子は、大部分、上記で例示されたアラビドプシス属（Arabidopsis）手法のように、層状にし、播種され、植え付けられたが、ヌル植物は、植え付け前に初期の選択によって除かれなかったことを除く。次に、すべての植物は、前述されるように、ｐａｔ選択マーカーの選択のために、２８０ｇ ａｅ／ｈａのＩＧＮＩＴＥ ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性および感受性植物をカウントした。
それぞれの構築物について試験された５つの株のうちの４つは、カイ二乗分析によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された。ｄｇｔ−２８は、複数種における遺伝可能なグリホサート抵抗性遺伝子である。
ｄｇｔ−２８形質転換されたＴ１タバコにおける発芽後の除草剤耐性。後代検定において使用されるそれぞれの事象からのＴ１抵抗性植物は、固有の識別子が与えられ、ｄｇｔ−２８遺伝子の接合性分析のためにサンプリングされた。接合性データは、処理あたり全４つの複製物について可能にする、適用されたそれぞれの比率のグリホサートに、２つのヘミ接合複製物と２つのホモ接合複製物を割り当てるために使用された。これらの植物は、野生型のプチハバナ（Petite havana）タバコと比較された。すべての植物は、１８７Ｌ／ｈａで設定されたトラック噴霧器で噴霧された。植物は、５６０〜４４８０ｇ ａｅ／ｈａの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）から噴霧された。すべての適用は、２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウム（ＡＭＳ）の添加とともに水中で製剤化された。植物は、処理の７日および１４日後に評価された。植物は、全体的な視覚的な発育阻害、白化、および壊死に関して損傷評価が割り当てられた。Ｔ１世代は分離されているので、いくつかの変数応答は接合性の違いにより期待される。
噴霧結果は、７ＤＡＴ（処置後の日数）で、高い比率のグリホサートに対する最小植物損傷が検出されたことを実証する（データ示さず）。１４ＤＡＴ後、視覚的損傷データは、構築物ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３からの単一コピーの事象と比較して、ＴｒａＰ４を含む構築物の単一コピー事象を用いて損傷の増加を実証する。表２５。
Figure 2015505480
これらの結果は、最大４４８０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートまでのｄｇｔ−２８の耐性、ならびにｄｇｔ−２８遺伝子に連結された葉緑体輸送ペプチド配列によって与えられる耐性における相違を実証した。
Ｔ２世代における高いグリホサート比率に対するｄｇｔ−２８保護。２５個の植物の後代検定は、構築物あたりｄｇｔ−２８の２〜３個のＴ２株について行われた。ホモ接合体株は、前の世代において完成された接合性分析に基づいて選択された。前述のように、種子を層状にし、播種し、および移植した。次に、すべての植物は、前述のように、ｐａｔ選択マーカーの選択のために、２８０ｇ ａｅ／ｈａのＩｇｎｉｔｅ ２８０ＳＬで噴霧された。３ＤＡＴ後、抵抗性と感受性の植物をカウントした。それぞれの構築物について試験されたすべての株は分離せず、それによって、Ｔ２世代において均一な株を確認し、タバコにおけるｄｇｔ−２８の少なくとも２つの世代を介したメンデル遺伝を実証した。
４２０〜３３６０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートの範囲のＤＵＲＡＮＧＯ ＤＭＡ（商標）の比率は、前述したように、２〜３枚の葉タバコに適用された。視覚的損傷データ１４ＤＡＴは、Ｔ１世代において実証された耐性の結果を確認した。ＴｒａＰ４を含む構築物由来の２コピー株からの葉面結果が単一コピーのＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３株と同様の耐性を示した（データは示さず）。
Figure 2015505480
データは、非形質転換対照と比較して、２つの世代を通じて最大３３６０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサートまでｄｇｔ−２８タバコの強固な耐性を実証する。
それぞれの事象から選択された植物は、標準的なＤＧＴ−２８ ＥＬＩＳＡによって、ＤＧＴ−２８タンパク質の分析のために、グリホサート適用前にサンプリングされた。データは、７２．８〜１１４．５ｎｇ／ｃｍ２の範囲の構築物全体で単一（１〜２コピー）株のＤＧＴ−２８平均タンパク質発現を実証した。データは、形質転換されたタバコのＴ２世代において、ｄｇｔ−２８がタンパク質を発現していることを実証し、耐性データは、機能的なＤＧＴ−２８タンパク質を確認する。
タバコ（cv. Petit Havana）における除草スペクトルを増加させるためのｄｇｔ−２８のスタッキング。ホモ接合ｄｇｔ−２８（ｐＤＡＢ１０７５４３とｐＤＡＢ１０７５４５）およびａａｄ−１２ ｖ１（ｐＤＡＢ３２７８）植物（後者について、参照により全体として本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４２１３３参照）はともに相互交雑され、Ｆ１種子を回収した。それぞれの遺伝子の２つの相互交雑からのＦ１種子は層状にされ、それぞれの交雑の処理された６個の代表は、１１２０ｇ ａｅ／ｈａのグリホサート（ｄｇｔ−２８遺伝子について選択的である）、１１２０ｇ ａｅ／ｈａの２，４−Ｄ（ａａｄ−１２遺伝子について選択的である）、または記載される比率での２つの除草剤のタンク混合物で処理された。植物は、１４ＤＡＴで等級付けされた。噴霧結果を表２７に示す。
Figure 2015505480
結果は、ｄｇｔ−２８がａａｄ−１２（ｖ１）と首尾よく積層され得ることを確認し、したがって、対象とする作物に適用され得るスペクトル除草剤（ｄｇｔ−２８およびａａｄ−１２についてそれぞれグリホサート＋フェノキシ酢酸）を増やす。防除が難しい広葉雑草または抵抗性雑草生物型が存在する作物生産において、積層は雑草防除および対象とする作物の保護の手段として使用され得る。追加のインプットまたはアウトプット特性はまた、ｄｇｔ−２８遺伝子を用いて積層することができる。
コムギにおけるグリホサートに対する抵抗性。ＤＧＴ−２８をコードするバイナリーベクターの製造。ＤＧＴ−２８発現およびＰＡＴ選択カセットを含むバイナリーベクターを設計し、当該技術分野において一般的に知られている技法および技術を用いて組み立てた。それぞれのＤＧＴ−２８発現カセットは、プロモーター、トウモロコシ（Zea mays）由来のユビキチン（Ｕｂｉ）遺伝子からの５’非翻訳領域とイントロン（Toki et al., Plant Physiology 1992, 100 1503-07）、続く５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ遺伝子（ＤＧＴ−２８）の合成バージョンの５’端に融合された４つの輸送ペプチドのうちの１つ（ＴｒａＰ４、ＴｒａＰ８、ＴｒａＰ２３またはＴｒａＰ５）からなるコード配列を含み、植物における発現にコドン最適化されている。ＤＧＴ−２８発現カセットは、トウモロコシ（Z. mays）由来のリパーゼ遺伝子（Ｖｐ１）の転写ターミネーターとポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域（ＵＴＲ）（Paek et al., Mol. Cells 1998 30;8(3) 336-42）を用いて終了させた。ＰＡＴ選択カセットは、プロモーター、コメ（Oryza sativa）由来のアクチン（Ａｃｔ１）遺伝子からの５’非翻訳領域とイントロン（McElroy et al., The Plant Cell 1990 2( 2) 163-171）、続くストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から単離されたホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子の合成バージョンから構成され、植物における発現にコドン最適化されている。ＰＡＴ遺伝子は、ホフィノトリシン、グルホシネート、およびビアラホスを含むグルタミン合成酵素の阻害剤に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする（Wohlleben et al., Gene 1988, 70(1), 25-37）。選択カセットは、転写ターミネーターとカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ｓ遺伝子（Chenault et al., Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396）からのポリアデニル化部位を含む３’ＵＴＲで終了された。
選択カセットは、市販の遺伝子合成販売会社（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成され、およびゲートウェイ対応のバイナリーベクターにクローニングされた。ＤＧＴ−２８発現カセットをｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした。得られたエントリークローンは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）発現カセットをコードするゲートウェイ対応のバイナリーベクターを用いて、ＬＲクロナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）反応に使用された。すべての組み立てられたプラスミドのコロニーは、最初に、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（ＮＥＢ；Ｉｐｓｗｉｓｈ、ＭＡ）とＰｒｏｍｅｇａ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）から得られた制限エンドヌクレアーゼを用いて、精製されたＤＮＡの制限消化によってスクリーニングされた。プラスミドＤＮＡ調製物は、供給業者の指示に従って、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）またはＰｕｒｅ Ｙｉｅｌｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉｐｒｅｐシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＷＩ）を用いて実施された。選択されたクローンのプラスミドＤＮＡは、ＡＢＩ Ｓａｎｇｅｒ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１サイクル配列決定プロトコール（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて配列決定された。配列データを集め、ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を用いて分析した。
得られた４つのバイナリー発現クローン：ｐＤＡＳ０００１２２（ＴｒａＰ４−ＤＧＴ２８）、ｐＤＡＳ０００１２３（ＴｒａＰ８−ＤＧＴ２８）、ｐＤＡＳ０００１２４（ＴｒａＰ２３−ＤＧＴ２８）およびｐＤＡＳ０００１２５（ＴｒａＰ５−ＤＧＴ２８）はそれぞれ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）株ＥＨＡ１０５に形質転換された。
ｄｇｔ−２８発現構築物を用いたトランスジェニックコムギ事象の生成。４つのＤＧＴ−２８発現構築物のうちの１つを発現するトランスジェニックコムギ植物は、Wuら、Transgenic Research 2008、17:425-436に類似したプロトコールに従って、ドナーコムギ株Ｂｏｂｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨを使用して、アグロバクテリウムを媒介した形質転換によって生成された。推定されるＴ０トランスジェニック事象は、ホスフィノトリシン（ＰＰＴ）耐性について選択され、表現型はＰＡＴ選択マーカーによって付与され、土壌に移された。Ｔ０植物を温室の閉じ込められた条件下で成長させ、Ｔ１種子を作製した。全体として、約４５個の独立したＴ０事象が、それぞれのＤＧＴ−２８発現構築物について生成された。
Ｔ０コムギｄｇｔ−２８コムギ事象におけるグリホサート抵抗性。Ｔ０事象を温室で順化させ、２〜４枚の新しく、通常に見える葉が渦巻きから出現するまで成長させた（すなわち、植物は、組織培養から温室生育条件に移行された）。植物は、成熟するまで温室で１２時間の補足照明下で、２５℃にて成長させた。グリホサート耐性とＴａｑｍａｎ分析の初期スクリーニングは、前述したように、同じ条件下で成長させたＴ１植物について完了された。データは、さらに特徴付けられる遺伝可能なＴ１事象の決定を可能にした。６つの低コピー（１〜２コピー）と２つのマルチコピーＴ１事象は、温室条件下で植え替えられ、３葉期まで成長させた。Ｔ１植物は、非形質転換のコムギ株に重大な損傷を与えることができる４２０〜３３６０ｇ ａｅ／ｈａの範囲のグリホサートの市販製剤（Ｄｕｒａｎｇｏ ＤＭＡ（商標））で噴霧された。２％ｗ／ｖの硫酸アンモニウムの添加は適用に含まれた。致死量は、Ｂｏｂ Ｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ非形質転換対照に対して＞７５％損傷を引き起こす比率として定義される。除草剤を適用した。
この実施例では、グリホサート適用は、Ｔ１世代におけるｄｇｔ−２８遺伝子の分離を決定すること、ならびにグリホサートの増加レベルに対する耐性を実証することについて利用された。植物の応答は、処理から２１日後（ＤＡＴ）の視覚的損傷の規模に関して提示される。データは、２５％未満の視覚損傷（４）、２５％〜５０％の視覚損傷（３）、５０％〜７５％の視覚損傷（２）、および７５％を超える損傷（１）を提示する個体のヒストグラムとして示される。算術平均および標準偏差は、コムギ形質転換のために使用される各構築物について提示されている。個別の応答におけるスコア範囲もまた、それぞれの比率および形質転換に関して、最後の列に示される。野生型、非形質転換コムギ（栽培品種Ｂｏｂ Ｗｈｉｔｅ ＭＰＢ２６ＲＨ）は、グリホサート感受性対照として用いた。Ｔ１世代において、ヘミ接合およびホモ接合植物は、それぞれの事象についての試験に利用可能であり、したがって、試験されたグリホサートのそれぞれの比率について含まれた。ヘミ接合植物は、ホモ接合植物としての遺伝子の用量の半分を含み、したがって、グリホサートに対する応答の変動性は、Ｔ１世代で予想され得る。
Ｔ１のｄｇｔ−２８コムギ植物の結果は、グリホサートに対する耐性が、葉緑体輸送ペプチドＴｒａＰ４、ＴｒａＰ５、ＴｒａＰ８およびＴｒａＰ２３を用いて、最大３３６０ｇ ａｅ／ｈａの比率で達成されることを実証した。表２８。データは、低コピーのＴ１事象のものであるが、それぞれの構築物について、集団の代表的なものである。
Figure 2015505480
２１ＤＡＴで、抵抗性および感受性植物をカウントし、カイ二乗分析によって決定されるように、単一の遺伝子座の優性メンデル形質（３Ｒ：１Ｓ）として分離された株の割合を決定する。表２９。これらのデータは、ｄｇｔ−２８が単子葉植物種において強固なグリホサート抵抗性遺伝子として遺伝可能であることを実証する。
Figure 2015505480
トウモロコシにおける農学的に重要な導入遺伝子を発現させるための合成葉緑体輸送ペプチド（ＴｒａＰ）配列
Ｃｒｙ２Ａａ：
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）由来のＣｒｙ２Ａａタンパク質は、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＣＥＷ）およびヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（ＥＣＢ）に対して活性を実証した。ｃｒｙ２Ａａ遺伝子（配列番号１３）の単一バージョンは、トウモロコシのための偏ったコドンであり、トウモロコシにおいて試験された。この実験では、Ｃｒｙ２Ａａは、単独で、およびトウモロコシにおけるＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチドと組み合わせて評価され、昆虫耐性活性を決定し、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチド配列がトウモロコシにおけるＣｒｙ２Ａａタンパク質の発現に及ぼす効果を評価した。
ＴｒａＰ１２ ｖ２合成葉緑体輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１２）およびＧＣＡコドンリンカーは、ｃｒｙ２Ａａ遺伝子の上流にクローニングされ、トウモロコシ植物における昆虫耐性試験のために構築物ｐＤＡＢ１０９８０８に組み込まれた（図７）。得られた構築物は２つの植物転写単位（ＰＴＵ）を含有した。第１のＰＴＵは、トウモロコシ（Zea mays）ユビキチン１プロモーター（ＺｍＵｂｉ１プロモーター；Christensen, A., Sharrock R., and Quail P., (1992) Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Molecular Biology, 18:675-689）、ＴｒａＰ２３−ｃｒｙ２Ａａ融合遺伝子（ＴｒａＰ２３ Ｃｒｙ２Ａａ）、およびトウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲ；米国特許第７，１７９，９０２号）で構成された。第２のＰＴＵは、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター（ＳＣＢＶプロモーター；米国特許第６，４８９，４６２号）、ＭＳＶリーダーとアルコールデヒドロゲナーゼ１イントロン６を含有するａａｄ−１除草剤耐性遺伝子（ＡＡＤ−１；米国特許第７，８３８，７３３号、およびＭＳＶリーダー配列；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＦＪ８８２１４６．１、およびアルコールデヒドロゲナーゼイントロン；Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＥＦ５３９３６８．１）、およびトウモロコシ（Zea mays）リパーゼ３’非翻訳領域（ＺｍＬｉｐ ３’ＵＴＲ）で構成された。ｃｒｙ２Ａａ遺伝子の上流に葉緑体輸送ペプチド配列を含まない対照プラスミドであるｐＤＡＢ１０７６８７を構築し、研究に含めた（図８）。プラスミドは、植物形質転換用のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入された。
トウモロコシ（Zea mays）の栽培品種Ｂ１０４由来の穂を受粉から１０〜１２日後に回収した。回収された穂は脱穀され、市販の漂白剤（Ｕｌｔｒａ Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）殺菌漂白剤、６．１５％次亜塩素酸）とＴｗｅｅｎ２０の２滴の２０％溶液中で２０分間浸漬させることによって表面殺菌し、層流フード内で滅菌した脱イオン水中で３回濯いた。未熟接合胚（１．８〜２．２ｍｍの長さ）は、それぞれの穂から無菌的に切り出され、２μｌの１０％Ｂｒｅａｋ−Ｔｈｒｕ（登録商標）Ｓ２３３界面活性剤を添加した２．０ｍｌのアグロバクテリウム懸濁液を含む１つまたは複数の微量遠心管に分配された。
胚単離活動が完了すると、胚のチューブを閉じ、５分間ロッカープラットフォーム上に置いた。チューブの内容物は、共培養培地のプレートに注ぎ出し、液体アグロバクテリウム懸濁液は、無菌の使い捨てトランスファーピペットを用いて取り出された。胚を含む共培養プレートは、３０分間、蓋を少し開けた層流フードの背面に配置させた；その時間後、胚は、顕微鏡を用いて、胚盤が上を向くように配向させた。次に、胚との共培養プレートは、さらに１５分間、蓋を少し開けた層流フードの背面に戻された。その後、プレートを閉じ、３Ｍマイクロポアテープで密封し、約６０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２５℃にてインキュベーターに置かれた。
共培養期間後、胚を休息培地に移した。３６個以下の胚をそれぞれのプレートに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、７〜１０日間、約５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートした。次に、カルス胚を選択Ｉ培地に移した。１８個以下のカルス胚を選択Ｉ培地のそれぞれのプレートに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、７日間、約５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートした。次に、カルス胚を選択ＩＩ培地に移した。１２個以下のカルス胚を選択ＩＩのそれぞれのプレートに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、１４日間、約５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートした。
この段階で、抵抗性カルスをプレ再生培地に移した。９個以下のカルスをプレ再生のそれぞれのプレートに移した。プレートを３Ｍマイクロポアテープでラップし、７日間、約５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で２４時間／日の光を用いて、２７℃にてインキュベートした。次に、再生中のカルスをＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）中の再生培地に移し、７〜１４日間またはシュートが発生するまで、約１５０μｍｏｌのｍ−２ｓ−１の光強度で、１日あたり１６時間明所／８時間暗所で２８℃にてインキュベートした。５個以下のカルスをそれぞれのＰｈｙｔａｔｒａｙ（商標）に置いた。次に、一次根を有する小さなシュートを単離し、シュート／根培地に移した。約６ｃｍ以上の高さの根ざした苗木を土壌に移植し、ハードニングのために成長チャンバーに移動させた。
トランスジェニック植物は、全体で固有の識別子が割り当てられ、温室に定期的に移された。植物は、成長培地（Ｐｒｅｍｉｅｒ Ｔｅｃｈ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ、ＰｒｏＭｉｘ ＢＸ、０５８１Ｐ）で充填された小さなポットに、Ｐｈｙｔａｔｒａｙ（商標）から移植され、加湿ドームで覆われ、植物を順化させた。植物は、Ｖ３〜Ｖ４段階に達するまで、Ｃｏｎｖｉｒｏｎ（商標）成長チャンバー（２８℃／２４℃、１６時間の光周期、５０〜７０％ＲＨ、２００μｍｏｌの光強度）内に配置された。この段階は、土壌および厳しい温度に植物を順化させることに役立つ。次に、植物を温室（光曝露タイプ：光または同化；光の上限：１２００ＰＡＲ；１６時間の日の長さ；日中２７℃／夜間２４℃）に移動させ、小さなポットから５．５インチ（１４ｃｍ）ポットに移植した。大きなポットに移植してから約１〜２週間後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。事象あたり１つの植物をバイオアッセイした。
選択事象は、遺伝子のコピー数に基づく次世代への進行、ウエスタンブロットによるタンパク質検出、およびバイオアッセイ昆虫に対する活性について同定された。スペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含む事象が注目されたが、必ずしも進行から省略されなかった。進行のために選択された事象は、５ガロン（１９Ｌ）のポットに移植された。観察は、いずれかの異常な表現型を追跡するために定期的に行われた。浮遊花粉による交雑汚染を防止するために、シュート袋を毛（ｓｉｌｋ）の出現前にシュート上に置いた。覆いの前に毛を生成しているいずれものシュートを注目し、シュートを除去した。次に、第２のシュートを覆い、受粉のために使用した。異常シュートを生成した植物またはシュートが全くない植物をデータベースに記録した。受粉の前日に毛を刈り込み、花粉を受け入れるように均一なブラシを与え、植物を自家受粉させた。
Ｔ１選択のための植物は、播種の７日後に噴霧された。それらは、フラットあたり１５ポットで、Ｍｅｔｒｏ ３６０の鉢植え用土の４インチ（１０．２ｃｍ）ポットにおいて成長させた。実生の成長段階は、Ｖ１〜Ｖ１．５であった。発芽が乏しいまたは非常に小さな植物（渦巻きがまだ閉じている）を含むポットに印を付け、それらを選択評価に含めなかった。次に、植物の全フラットは、トラック噴霧器適用用の二次キャリアトレイに入れられた。トレイは、Ｍａｎｄｅｌトラック噴霧器において一度に２つ配置され、８００２Ｅフラットファンノズル（Ｔｅｅ Ｊｅｔ）を使用して標的領域に体積１８７Ｌ／ｈａを送達するように較正された。３５ｇ ａｅ／ｈａのＡｓｓｕｒｅ ＩＩ（キザロホップ）＋１％ＣＯＣ（穀物油濃縮物）の溶液は適用のために製剤化された。１５ｍｌ／噴霧の体積を用いて、必要とされる総噴霧溶液を算出した。計算；（３５ｇ ａｅ／ｈａ）×（１ｈａ／１８７Ｌ）×（１Ｌ／９７．７ｇ ａｅ Ａｓｓｕｒｅ ＩＩ）＝０．１９２％溶液または２８．７４μｌ／１５ｍｌ Ｈ２Ｏ＋１％ｖ／ｖ）。次に、適用後、植物を温室に戻す前に、噴霧室で１時間乾燥させた。大きなポットに移植してから約１〜２週間後、植物をバイオアッセイのためにサンプリングした。事象あたり１つの植物はバイオアッセイした。
分子解析スクリーニングを通過したＴ０事象のすべては、Ｃｒｙ２Ａａタンパク質発現レベルについて分析された。ＴｒａＰを含まないＣｒｙ２Ａａを含む対照構築物であるｐＤＡＢ１０７６８７からの事象は、ＴｒａＰ２３を含むｐＤＡＢ１０９８０８（０．２ｎｇ／ｃｍ２）からの事象と比較して、Ｃｒｙ２Ａａの有意に高い平均発現レベル（１５．０ｎｇ／ｃｍ２）を有していた。ｐＤＡＢ１０９８０８事象の発現レベルの低下にもかかわらず、これらの事象はなおもＣｒｙ２Ａａタンパク質を発現した。
ｃｒｙ２Ａａ遺伝子を含むＴ鎖の単一コピーを含むトランスジェニック植物は、該トランスジェニック植物からの葉の上に新生児鱗翅類の幼虫を用いて行われたバイオアッセイにおける殺虫活性について試験された。アッセイされた鱗翅目種は、ヨーロピアンコーンボーラー、ヨーロッパアワノメイガ（Ostrinia nubilalis）（Ｈｕｂｎｅｒ）（ＥＣＢ）、およびトウモロコシイヤーワーム、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）（ＣＥＷ）であった。
３２ウェルトレイ（Ｃ−Ｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｐｉｔｍａｎ、ＮＪ）は、２％寒天溶液で部分的に満たされ、寒天を固化させた。葉のセクションの約２つのうち１つは、それぞれの植物から採取され、３２ウェルトレイのウェルに単独で入れられた。１枚の葉片をそれぞれのウェルに入れ、２つの葉片を植物あたりおよび昆虫あたり試験した。昆虫は、ペイントブラシを用いて大量に群棲させ、それぞれのウェルに１０匹の新生児幼虫を入れた。トレイは、試験中に換気を可能にする有孔粘着性の蓋で密封された。トレイは、２８℃にて、４０％ＲＨ、１６時間明所：８時間暗所で３日間置かれた。試験期間後、単純な損傷割合スコアをそれぞれの葉片について得た。それぞれの試験についての損傷スコアを平均し、相関分析を行うために、タンパク質発現解析と一緒に使用した。
バイオアッセイの結果は、ＴｒａＰ２３合成葉緑体輸送ペプチド配列が、バイオアッセイにおいて試験された昆虫に対して保護を与えたｐＤＡＢ１０９８０８事象として機能的であることが示された。トランスジェニック事象では、ＴｒａＰを含まないＣｒｙ２Ａａタンパク質（ｐＤＡＢ１０７６８７）を発現する植物は、試験されたすべての昆虫種全体でＴｒａＰ２３を有するＣｒｙ２Ａａタンパク質（ｐＤＡＢ１０９８０８）を発現する植物よりも有意に大きい平均の葉損傷を有した。ＴｒａＰ２３を有するｐＤＡＢ１０９８０８事象はＴｒａＰを含まない事象と比較して多くの葉損傷を有したが、ｐＤＡＢ１０９８０８事象は、バイオアッセイされた昆虫に対する保護を与えた。

Claims (40)

  1. ５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られた参照ヌクレオチド配列から誘導される合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
  2. 合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  3. 参照ヌクレオチド配列が、アブラナ属種（Brassica sp.）、ダイズ属種（Glycine sp.）、アラビドプシス属種（Arabidopsis sp.）、およびデュネイラ属種（Duneila sp.）からなる群から選択される種から単離された５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素のアラインメントから得られる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  4. 参照ヌクレオチド配列が、配列番号１〜１０からなる群から選択されるポリペプチドのアラインメントから得られる、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  5. 合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも８０％同一である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  6. 合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも８５％同一である、請求項５に記載の単離された核酸分子。
  7. 合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９０％同一である、請求項６に記載の単離された核酸分子。
  8. 合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９５％同一である、請求項７に記載の単離された核酸分子。
  9. 合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１の葉緑体輸送ペプチドと少なくとも９８％同一である、請求項８に記載の単離された核酸分子。
  10. 合成葉緑体輸送ペプチドが、配列番号１１を含む、請求項９に記載の単離された核酸分子。
  11. 合成葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２の核酸に特異的にハイブリダイズ可能である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
  12. 各々、葉緑体輸送ペプチドをコードする、少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列をさらに含み、さらなるヌクレオチド配列が、対象とするヌクレオチド配列に作動可能に連結している、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  13. 少なくとも１種のさらなるヌクレオチド配列が、原核生物、下等光合成真核生物および緑藻植物からなる群から選択される生物に由来する、請求項１２に記載の単離された核酸分子。
  14. 対象とする合成葉緑体輸送ペプチドをコードする配列およびヌクレオチド配列が、１つまたは複数の調節配列に作動可能に連結している、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  15. 対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドおよび合成葉緑体輸送ペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、請求項２に記載の単離された核酸分子。
  16. 請求項１５に記載の核酸分子によってコードされるキメラポリペプチド。
  17. 対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチド含有細胞中のプラスチドにターゲッティングされる、請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
  18. 対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、プラスチドにターゲッティングされると除去される合成葉緑体輸送ペプチドを含む、請求項１７に記載のキメラポリペプチド。
  19. 対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、生物学的に活性なペプチドである、請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
  20. 対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドが、蛍光ペプチドである、請求項１６に記載のキメラポリペプチド。
  21. 生物学的に活性なペプチドが、アセトラクターゼシンターゼ（ＡＬＳ）、突然変異ＡＬＳ、ＡＬＳの前駆体、３−エノールピルビルシキミ酸−５−リン酸シンセターゼ（ＥＰＳＰＳ）、ＣＰ４ ＥＰＳＰＳおよびクラスＩＩＩ ＥＰＳＰＳからなる群から選択される、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  22. 生物学的に活性なペプチドが、ＤＧＴ−２８またはＣｒｙ２Ａａである、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  23. 生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性、ウイルス抵抗性、細菌病原体抵抗性、昆虫抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、草勢、植物の収量、温度耐性、土壌条件耐性、低光量レベル耐性、低水分レベル耐性、高水分レベル耐性、化学的環境耐性、種子色、デンプン変性、アミノ酸合成、光合成、脂肪酸の合成、油の合成、アロテノイド（arotenoid）の合成、テルペノイドの合成、デンプンの合成および除草剤抵抗性からなる群から選択されるプロセスに関与している、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  24. 生物学的に活性なペプチドが、除草剤抵抗性に関与している、請求項１９に記載のキメラポリペプチド。
  25. 請求項２に記載の核酸分子を含む植物材料。
  26. 植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、請求項２５に記載の植物材料。
  27. 核酸分子が、植物材料から得た細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項２５に記載の植物材料。
  28. トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
    請求項２に記載の単離された核酸分子を得ることと、
    植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
    を含む、方法。
  29. 請求項２８に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
  30. ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段を含む単離された核酸分子。
  31. ポリペプチドを葉緑体にターゲッティングするためのＥＰＳＰＳ由来の手段に作動可能に連結している対象とするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３０に記載の単離された核酸分子。
  32. 対象とするヌクレオチド配列によってコードされるペプチドを含むキメラポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の単離された核酸分子。
  33. 請求項３１に記載の核酸分子を含む植物発現ベクター。
  34. 請求項３３に記載の核酸分子を含む植物材料。
  35. トランスジェニック植物材料を製造する方法であって、
    請求項３１に記載の単離された核酸分子を得ることと、
    植物材料を、核酸分子を用いて形質転換することと
    を含む、方法。
  36. 植物材料が、植物細胞、植物組織、植物組織培養物、カルス培養物、植物の一部および全植物体からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
  37. 請求項３５に記載の方法によって製造されるトランスジェニック植物材料。
  38. 請求項３７に記載のトランスジェニック植物材料から再生されたトランスジェニック植物。
  39. 植物体に再生され得ない植物細胞である、請求項２６に記載の植物材料。
  40. 植物材料が、植物体を生成するよう再生できない植物細胞である、請求項２８に記載の方法。
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