BR112014018916B1 - Molécula de ácido nucleico isolada, vetor compreendendo a mesma, métodos para gerar uma planta transgênica, parte, órgão, semente ou célula vegetal resistente a herbicida, para controle de ervas daninhas e para conferência de resistência a um herbicida a uma planta - Google Patents

Molécula de ácido nucleico isolada, vetor compreendendo a mesma, métodos para gerar uma planta transgênica, parte, órgão, semente ou célula vegetal resistente a herbicida, para controle de ervas daninhas e para conferência de resistência a um herbicida a uma planta Download PDF

Info

Publication number
BR112014018916B1
BR112014018916B1 BR112014018916-1A BR112014018916A BR112014018916B1 BR 112014018916 B1 BR112014018916 B1 BR 112014018916B1 BR 112014018916 A BR112014018916 A BR 112014018916A BR 112014018916 B1 BR112014018916 B1 BR 112014018916B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
plant
dgt
nucleic acid
glyphosate
plants
Prior art date
Application number
BR112014018916-1A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112014018916A2 (pt
BR112014018916B8 (pt
Inventor
Justin M. Lira
Robert M. Cicchillo
Satish K. Nair
Original Assignee
Dow Agrosciences Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Agrosciences Llc filed Critical Dow Agrosciences Llc
Publication of BR112014018916A2 publication Critical patent/BR112014018916A2/pt
Publication of BR112014018916B1 publication Critical patent/BR112014018916B1/pt
Publication of BR112014018916B8 publication Critical patent/BR112014018916B8/pt

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N57/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds
    • A01N57/18—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds
    • A01N57/20—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic phosphorus compounds having phosphorus-to-carbon bonds containing acyclic or cycloaliphatic radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y113/00—Oxidoreductases acting on single donors with incorporation of molecular oxygen (oxygenases) (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/11—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with 2-oxoglutarate as one donor, and incorporation of one atom each of oxygen into both donors (1.14.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y205/00—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5)
    • C12Y205/01—Transferases transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5) transferring alkyl or aryl groups, other than methyl groups (2.5.1)
    • C12Y205/01019—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/08—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a chloroplast localisation signal
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR COMPREENDENDO A MESMA, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA GERAR UMA PLANTA, PARTE, ÓRGÃO, SEMENTE OU CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA RESISTENTE A HERBICIDA, PARA CONTROLE DE ERVAS DANINHAS, PARA CONFERÊNCIA DE RESISTÊNCIA A UM HERBICIDA A UMA PLANTA, BEM COMO USO DA PLANTA, PARTE, ÓRGÃO, SEMENTE OU CÉLULA DE PLANTA TRANSGÊNICA. A presente invenção refere-se a uma classe de enzimas EPSPS e ácidos nucleicos úteis na codificação das mesmas, bem como a novos polipeptídeos envolvidos em metabolismo de N-(fosfonometil)glicina, ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos e métodos para identificação dos mesmos. As modalidades particulares se referem a plantas, partes de planta e células de planta que compreendem polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 61/593.555 depositado em 1 de fevereiro de 2002 e também para o Pedido de Patente Provisório U.S. No. de Série 61/625.222 depositado em 17 de abril de 2012. DECLARAÇÃO DE ACORDO COM 37 C.F.R. § 1.821 (c) ou (e) - LISTAGEM DE SEQUÊNCIA APRESENTADA COMO ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[0002] Nos termos para 37 C.F.R. § 1.821 (c) ou (e), um arquivo contendo uma versão de texto ASCII da Listagem de Sequência foi apresentado concomitante com o presente pedido.
CAMPO DA TÉCNICA
[0003] A presente invenção refere-se à biotecnologia de planta. Algumas modalidades se referem a novos polipeptídeos envolvidos em metabolismo de N-(fosfonometil)glicina, ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos e métodos para identificação dos mesmos. As modalidades particulares se referem a plantas, partes de planta e células de planta que compreendem polipeptídeos e/ou ácidos nucleicos mencionados acima.
ANTECEDENTES
[0004] Espécies de erva daninha têm sido há muito tempo um problema em campos cultivados. Embora o controle de erva daninha possa ser uma operação de trabalho intenso, ele foi facilitado pela disponibilidade de herbicidas químicos de morte de erva daninha eficientes. O uso disseminado de herbicidas, junto com variedades de cultura e fertilizantes aperfeiçoados, realizou uma grande contribuição para a “revolução verde” na agricultura. Herbicidas particularmente úteis são aqueles que têm um espectro amplo de atividade herbicida. Infelizmente, herbicidas de amplo espectro tipicamente têm um efeito prejudicial sobre plantas de cultura expostas ao herbicida. Uma maneira de superar este problema é produzir plantas de cultura que sejam tolerantes ao herbicida de amplo espectro.
[0005] Um exemplo de um herbicida de amplo espectro é N- fosfonometil-glicina, também conhecido como glifosato. O glifosato tem sido usado extensivamente por fazendeiros em todo o mundo para controle de ervas daninhas antes do plantio da cultura, por exemplo, em plantio direto. Ainda, o glifosato é um meio eficaz para controlar ervas daninhas e plantas voluntárias entre ciclos de produção e rotações de cultura. O glifosato não se transfere para solos após o uso, e ele é considerado ser um dos herbicidas químicos mais ambientalmente seguros e amplamente eficazes disponíveis para uso na agricultura.
[0006] O glifosato mata plantas através da inibição da via do ácido chiquímico. Esta via leva à biossíntese de compostos aromáticos, incluindo aminoácidos, vitaminas e hormônios de planta. O glifosato bloqueia a condensação de ácido fosfoenolpirúvico ((PEP) (Phosphoenolpyruvic) e ácido 3-fosfonochiquímico para ácido 5- enolpiruvil-3-fosfochiquímico através da ligação a e inibição da atividade da enzima 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase, geralmente referida como “EPSP sintase” e “EPSPS”.
[0007] Infelizmente, não são conhecidas quaisquer plantas de cultura que sejam naturalmente tolerantes a glifosato e, desta maneira, a utilidade deste herbicida para controle de ervas daninhas em culturas cultivadas foi limitada. Um método para produzir plantas de cultura tolerantes a glifosato é introduzir um gene codificando uma forma tolerante a glifosato heteróloga de um gene de EPSPS na planta de cultura usando a técnica de engenharia genética. Usando mutagênese química, formas tolerantes a glifosato de EPSPS foram produzidas em bactérias, e os genes heterólogos foram introduzidos em plantas para produzir plantas tolerantes a glifosato. Vide, por exemplo, Comai e outros (1983) Science 221:370-71. Os genes de EPSPS heterólogos podem ser superexpressos nas plantas de cultura para obter um nível de tolerância desejado.
[0008] EPSPS se dobra em dois domínios similares, cada um compreendendo três cópias de uma unidade de dobra βαβαββ (Stallings e outros (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:5046-50). Lys-22, Arg- 124, Asp-313, Arg-344, Arg-386 e Lys-411 são resíduos conservados de EPSPS de E. coli (Schonbrunn e outros (2001) Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A. 98:1376-80). Resíduos conservados importantes para atividade de EPSPS também incluem Arg-100, Asp-242 e Asp-384 (Selvapandiyan e outros (1995) FEBS Letters 374:253-6). Arg-27 se liga a S3P (Shuttleworth e outros (1999) Biochemistry 38:296-302).
[0009] Variantes de EPSPS do tipo selvagem foram isoladas, as quais são tolerantes a glifosato como um resultado de alterações na sequência de codificação de aminoácido de EPSPS (Kishore e Shah (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:627-63; Wang e outros (2003) J. Plant Res. 116:455-60; Eschenburg e outros (2002) Planta 216:129-35). He e outros (2001) Biochim et Biophysica Acta 1568:1-6) desenvolveram enzimas EPSPS com tolerância a glifosato aumentada através de mutagênese e recombinação entre os genes de EPSPS de E. coli e Salmonella typhimurium e sugeriram que mutações na posição 42 (T42M) e na posição 230 (Q230K) são provavelmente responsáveis pela resistência observada. Trabalho subsequente (He e outros (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67:1405-9) mostra que a mutação T42M (treonina para metionina) é suficiente para aperfeiçoar a tolerância de ambas as enzimas de E. coli e S. typhimurium.
[00010] Atualmente, há três classes principais de EPSPS que são conhecidas na técnica: Classe I (sensível a glifosato); Classe II (Publicação de Patente Internacional PCT No. WO2006/012080 A2; Liang e outros (2009) J. Biotechnol. 144(4):330-6); e Classe III (Publicação de Patente Internacional PCT No. WO2007/0082269 A2; Publicação de Patente U.S. No. US 2010/0144530 A1).
[00011] Os exemplos acima da técnica relacionada e limitações relacionadas à mesma pretendem ser ilustrativos e não exclusivos. Outras limitações da técnica relacionada se tornarão aparentes àqueles versados na técnica quando de uma leitura do relatório.
DESCRIÇÃO
[00012] É descrita aqui uma nova classe de enzimas EPSPS, enzimas que são identificáveis ambos por motivos de sequência de aminoácido conservados (estrutura primária) e elementos estruturais secundários e terciários. Essas novas enzimas EPSPS são referidas aqui como enzimas EPSPS “Classe IV”. De acordo com algumas modalidades, a estrutura dessas enzimas pode ser alterada conforme aqui exemplificado, de maneira a influenciar o metabolismo de glifosato em uma célula ou organismo expressando heterologamente a(s) enzima(s), por exemplo, para prover tolerância a glifosato na célula ou organismo. Em modalidades particulares, os elementos estruturais conservados de enzimas EPSPS Classe IV são utilizados para identificar enzimas EPSPS adicionais que podem conferir tolerância a glifosato a um organismo transgênico (por exemplo, uma planta).
[00013] Algumas modalidades incluem então um polipeptídeo isolado tendo pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 69, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168; e/ou polipeptídeo isolado compreendendo SEQ ID NOs:170-173.
[00014] Algumas modalidades incluem um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada o grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e/ou 168; e/ou um ácido nucleico codificando uma enzima EPSPS compreendendo SEQ ID NOs:170-173. Em alguns exemplos, um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e/ou um ácido nucleico codificando uma enzima EPSPS compreendendo SEQ ID NOs:170-173, compreende uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade (por exemplo, pelo menos 79%, pelo menos 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, pelo menos cerca de 99%, pelo menos cerca de 99,5% e pelo menos cerca de 99,9% de identidade) com pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167 e 169.
[00015] Algumas modalidades incluem uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168. Algumas modalidades incluem uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NOs:170-173.
[00016] Em modalidades adicionais, a invenção refere-se a métodos de geração de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta resistente a glifosato compreendendo: transformação de uma planta, parte de uma planta, órgão de planta, semente de planta e/ou célula de planta com um ácido nucleico codificando uma EPSPS Classe IV; e expressando o ácido nucleico de maneira a produzir a EPSPS Classe IV. Modalidades particulares incluem plantes tolerantes a glifosato e células de planta expressando uma EPSPS Classe IV heteróloga.
[00017] Algumas modalidades incluem vetores compreendendo um ácido nucleico codificando uma EPSPS Classe IV. Exemplos particulares incluem vetores compreendendo um ácido nucleico codificando uma enzima EPSPS compreendendo SEQ ID NOs:170-173.
[00018] Modalidades adicionais incluem métodos para controle de ervas daninhas em um campo ou área sob cultivo contendo plantas resistentes a glifosato, onde tal método pode compreender: plantio de uma planta ou uma semente de planta compreendendo um ácido nucleico codificando uma EPSPS Classe IV heteróloga no campo ou área sob cultivo; e aplicação ao campo ou área sob cultivo uma quantidade suficiente de glifosato para controlar ervas daninhas no campo sem afetar significantemente a planta.
[00019] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a células regeneráveis para uso em cultura de tecido de plantas resistentes a glifosato. Tal cultura de tecido pode ser capaz de regenerar plantas tendo as características fisiológicas e morfológicas das plantas resistentes a glifosato acima e também de regenerar plantas tendo substancialmente o mesmo genótipo que as plantas resistentes a glifosato. Células regeneráveis em tais culturas de tecido podem ser, por exemplo, embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólens, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, flores, sementes, vagens e caules. Modalidades particulares se referem a plantas regeneradas a partir de uma cultura de tecido de acordo com o acima.
[00020] Em algumas modalidades, a invenção refere-se a células que não são regeneráveis para produzir plantas, por exemplo, para uso na produção de linhagens de célula de planta resistentes a glifosato. Em outras modalidades, a invenção refere-se a plantas compreendendo em parte tais células.
[00021] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se à aplicação de herbicidas múltiplos a culturas plantadas em uma área sob cultivo. Uma aplicação “over the top” de glifosato em adição a herbicidas múltiplos leva a vantagem das propriedades herbicidas diferentes, de maneira que o controle de erva daninha é provido com uma combinação aperfeiçoada de flexibilidade e economia. Por exemplo, herbicidas individuais podem ter longevidades diferentes na área sob cultivo, isto é, alguns herbicidas podem persistir e se eficazes por um tempo relativamente longo após eles serem aplicados à área, enquanto outros herbicidas podem ser rapidamente quebrados em outros compostos e/ou não ativos. Um sistema de aplicação de herbicida aperfeiçoado de acordo com modalidades particulares permite o uso de glifosato e herbicidas múltiplos de maneira que um agricultor pode personalizar a seleção de herbicidas particulares para uso em uma situação particular.
[00022] Em algumas modalidades, a presente invenção refere-se a métodos e composições para fabricação e uso de uma planta que é tolerante a mais de um herbicida ou classe ou subclasse de herbicidas, conforme descrito abaixo. Em modalidades particulares, é provida uma planta que é tolerante a ambos o glifosato e pelo menos um outro herbicida (ou classe ou subclasse de herbicida) ou agente químico (ou classe ou subclasse de agente químico) (por exemplo, fungicidas, inseticidas, reguladores de crescimento de planta e similar). Tais plantas podem encontrar uso, por exemplo, em métodos compreendendo tratamento de plantas de cultura com herbicidas múltiplos. Desta maneira, a invenção provê plantas resistentes a herbicida que toleram tratamento com um herbicida ou combinação de herbicidas (incluindo uma combinação de herbicidas que agem cada um através de um modo diferente de atividade herbicida) ou que toleram tratamento com uma combinação de pelo menos um herbicida e pelo menos um outro agente químico. Desta maneira, a invenção descreve métodos aperfeiçoados de cultivo de plantas de cultura onde as ervas daninhas são seletivamente controladas.
[00023] Uma planta resistente a herbicida de acordo com algumas modalidades pode compreender uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo que confere tolerância a glifosato e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere tolerância a ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). De acordo com os parágrafos acima, são providas plantas que compreendem pelo menos uma terceira molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que fornece à planta uma característica selecionada do grupo consistindo em uma característica de tolerância a herbicida; uma característica de resistência a inseto; uma característica agronômica; uma característica de resistência à doença; uma característica de ácido graxo modificado; e uma característica de fitato reduzido.
[00024] Em alguns exemplos, uma planta resistente a herbicida compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga codificando um polipeptídeo que confere tolerância a glifosato e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere tolerância a glufosinato. Alguns exemplos incluem uma planta resistente a herbicida compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que fornece à planta uma característica selecionada do grupo consistindo em uma característica de tolerância a herbicida; uma característica de resistência a inseto; uma característica agronômica; uma característica de resistência à doença; uma característica de ácido graxo modificado; e uma característica de fitato reduzido.
[00025] Em exemplos particulares, uma planta resistente a herbicida compreende uma molécula de ácido nucleico heteróloga codificando um polipeptídeo que confere tolerância a glifosato e uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que confere tolerância a um herbicida que inibe acetolactato sintase (ALS) (Lee e outros (1988) EMBO J. 7:1241), também conhecida como enzima acetoidroxiácido (AHAS) (Miki e outros (1990) Theor. Appl. Genet. 80:449). Alguns exemplos incluem uma planta resistente a herbicida compreendendo uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo que fornece à planta uma característica selecionada do grupo consistindo em uma característica de resistência a herbicida; uma característica de resistência a inseto; uma característica agronômica; uma característica de resistência à doença; uma característica de ácido graxo modificado; e uma característica de fitato reduzida.
[00026] Em algumas modalidades, um ácido nucleico pode ser combinado (ou “empilhado”) em uma planta com qualquer outra molécula de ácido nucleico, por exemplo e sem limitação, para prover resistência ou tolerância adicional a glifosato ou outro herbicida, para prover resistência a insetos ou doenças selecionados, para prover aumentos nutricionais, para prover características agronômicas aperfeiçoadas e prover uma proteína ou outro produto útil em ração, alimento, usos industriais, usos farmacêuticos e/ou outros usos. Exemplos incluem o empilhamento de dois ou mais ácidos nucleicos de interesse dentro de um genoma de planta. Tal “pilha de gene” pode ser obtida via cruzamento de planta convencional usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, retransformação de uma planta transgênica ou adição de novas características através de integração alvo através de recombinação homóloga. Exemplos particulares de tal pilha incluem qualquer combinação do que segue: um ácido nucleico dgt-28; um ácido nucleico dgt-31; um ácido nucleico dgt-32; um ácido nucleico dgt-33; um ácido nucleico Cry34Ab1; um ácido nucleico Cry35Ab1; um ácido nucleico Cry1F; um ácido nucleico Cry1Ac; um ácido nucleico aad-12; e ácido nucleico aad-1; um ácido nucleico pat; e um ácido nucleico DSM-2.
[00027] Em adição aos aspectos e modalidades exemplares descritos acima, aspectos e modalidades adicionais se tornarão aparentes através do estudo das descrições que seguem.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[00028] Na listagem de sequência, sequências de aminoácidos são providas para 17 proteínas EPSPS Classe IV exemplares.
[00029] A SEQ ID NO:1 mostra a sequência de aminoácido de DGT- 28.
[00030] A SEQ ID NO:67 mostra a sequência de aminoácido de DGT- 33.
[00031] A SEQ ID NO:68 mostra a sequência de aminoáciod de DGT- 32
[00032] A SEQ ID NO:145 mostra a sequência de aminoácido de DGT-31.
[00033] As SEQ ID NOs:146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168 mostram a sequência de aminoácido de proteínas EPSPS Classe IV exemplares.
[00034] As SEQ ID NOs:147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167 e 169 incluem ácidos nucleicos exemplares que codificam uma EPSPS Classe IV.
[00035] A SEQ ID NO:170 mostra uma sequência de aminoácido conservada que é característica de proteínas EPSPS Classe IV: TARXLF, enquanto X é A ou G.
[00036] A SEQ ID NO:171 mostra uma sequência de aminoácido conservada que é característica de proteínas EPSPS Classe IV: EGFXEG, onde X é T ou A.
[00037] A SEQ ID NO:172 mostra uma sequência de aminoácido conservada que é característica de proteínas EPSPS Classe IV: GATTARFLPX1LX2AA, onde X1 é T ou A e X2 é A ou V.
[00038] A SEQ ID NO:173 mostra uma sequência de aminoácido conservada que é característica de proteínas EPSPS Classe IV: FDAS. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00039] A FIGURA 1 (a-g) inclui um alinhamento de sequência múltiplo comparando as três classes anteriormente descritas de enzimas EPSPS (por exemplo, aroA sensível a glifosato) a enzimas EPSPS Classe IV exemplares (por exemplo, DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33) (SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168). Os motivos conservados são mostrados em vermelho abaixo do alinhamento.
[00040] A FIGURA 2 inclui um alinhamento de enzimas DGT exemplares (isto é, DGT-1, DGT-3 e DGT-7). A localização de um resíduo de aminoácido mutado que mudou de uma glicina para uma alanina é indicada pelo primeiro asterisco. A localização do segundo resíduo de aminoácido mutado que foi mudado de uma treonina para uma isoleucina é indicada pelo segundo asterisco. A localização de um terceiro resíduo de aminoácido mutado que foi mudado de uma prolina para uma serina é indicada pelo terceiro asterisco.
[00041] As FIGURAS 3-30 incluem mapas de vários plasmídeos exemplares: pDAB107527 (FIG. 3); pDAB105530 (FIG. 4); pDAB105531 (FIG. 5); pDAB105532 (FIG. 6); pDAB105533 (FIG. 7); pDAB105534 (FIG. 8); pDAB4104 (FIG. 9); pDAB102715 (FIG. 10); pDAB107532 (FIG. 11); pDAB107534 (FIG. 12); pDAB102785 (FIG. 13); pDAB100445 (FIG. 14); pDAB102946 (FIG. 15); pDAB100469 (FIG. 16); pDAB102028 (FIG. 17); pDAB102029 (FIG. 18); pDAB102032 (FIG. 19); pDAB102034 (FIG. 20); pDAB100429 (FIG. 21); pDAB100442 (FIG. 22); pDAB100430 (FIG. 23); pDAB102036 (FIG. 24); pDAB102038 (FIG. 25); pDAB102040 (FIG. 26); pDAB102042 (FIG. 27); pDAB107712 (FIG. 28); pDAB107713 (FIG. 29); e pDAB107714 (FIG. 30).
[00042] A FIGURA 31 inclui valores IC50 obtidos após introdução de várias mutações em DGT-1 (A) e DGT-7 (B) usando PEP 1 mM. Para ambas as curvas IC50 da FIGURA 31(A) e da FIGURA 31(B), triângulos fechados representam tipo selvagem, círculos fechados representam mutantes GA, quadrados abertos representam mutantes GAPS e quadrados fechados representam mutantes TIPS.
[00043] As FIGURAS 32-54 incluem mapas de vários plasmídeos exemplares: pDAB102719 (FIG. 32); pDAB102718 (FIG. 33); pDAB107663 (FIG. 34); pDAB107664 (FIG. 35); pDAB107665 (FIG. 36); pDAB107666 (FIG. 37); pDAB109812 (FIG. 38); pDAB101556 (FIG. 39); pDAB107698 (FIG. 40); pDAB108384 (FIG. 41); pDAB108385 (FIG. 42); pDAB108386 (FIG. 43); pDAB108387 (FIG. 44); pDAB102716 (FIG. 45); e pDAB102717 (FIG. 46).
[00044] A FIGURA 55 inclui uma representação em fita da estrutura geral do modelo de alta resolução de SsvESPS sintase. Os dois ligantes (S3P e glifosato) são mostrados como esferas van der Waals. A hélice interna que carrega Ala-84 é mostrada em azul.
[00045] A FIGURA 56 inclui vistas aproximadas dos sítios ativos de ESPS sintases de E. coli e S. sviceus destacando as diferenças que definem as enzimas tolerantes à Classe IV. Note que na SsvESPS sintase, a hélice interna que carrega Ala-84 (a determinante de resistência primária para o herbicida) é empurrada mais para a bolsa de ligação de glifosato, precludindo ligação de seu ligante. MODOS PARA REALIZAR A INVENÇÃO
I. Visão geral
[00046] São revelados aqui novos polipeptídeos envolvidos em metabolismo de N-(fosfonometil)glicina e ácidos nucleicos codificando tais polipeptídeos. Em alguns exemplos, tal polipeptídeo confere (ou aumenta) a tolerância a glifosato em uma célula de planta onde o polipeptídeo é heterologamente expresso, por exemplo, sem afetar de modo adverso a ligação de EPSP sintase com seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP).
II. Termos
[00047] A fim de esclarecer mais o escopo da presente invenção, as definições específicas, termos e abreviações que seguem são providos.
[00048] A menos que especificamente definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme geralmente compreendido por um versado comum na técnica. A menos que de outro modo claro a partir do contexto onde ele aparece, um termo no singular deve incluir pluralidades, e termos no plural são compreendidos incluir o singular. Desta maneira, os artigos indefinidos “um” e “uma”, conforme usado precedendo um elemento ou componente, são não restritivos com relação ao número de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Onde faixas de valores numéricos forem providas aqui (por exemplo, “menos do que cerca de X”, “menos do que X” e “por exemplo, X1... e X2”), as faixas são compreendidas incluir todos os valores e faixas de valores incluídos na faixa provida, como se esses valores e faixas incluídos tivessem sido expressamente mencionados.
[00049] Conforme aqui usado, os termos “compreendendo”, “incluindo”, “tendo” e “contendo” e suas variações são abertos (isto é, não exclusivos). Por exemplo, uma composição ou método que compreende uma lista de elementos não é necessariamente limitado a apenas esses elementos. Tal composição ou método pode (ou não) incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes à composição ou método. Ainda, a menos que expressamente declarado o contrário, “ou” é usado no sentido inclusivo (e não no exclusivo). Por exemplo, uma condição “A ou B” é satisfeita por qualquer um do que segue: A é verdadeiro (ou presente) e B é falso (ou não presente); A é falso (ou não presente) e B é verdadeiro (ou presente); e ambos A e B são verdadeiros (ou presentes).
[00050] Planta: Conforme aqui usado, o termo “planta” inclui uma planta inteira e qualquer descendente, célula, tecido ou parte de uma planta. O termo “partes de planta” inclui qualquer parte(s) de uma planta incluindo, por exemplo, e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente imatura); um corte de planta; uma célula de planta; uma cultura de célula de planta; um órgão de planta (por exemplo, pólen, embriões, flores, frutas, brotos, folhas, raízes, troncos e explantes). Um tecido ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplastos, calo ou qualquer outro grupo de células de planta que seja organizado em uma unidade estrutural ou funcional. Uma cultura de célula ou tecido de planta pode ser capaz de regeneração de uma planta tendo as características fisiológicas e morfológicas da planta da qual a célula ou tecido foi obtido e de regeneração de uma planta tendo substancialmente o mesmo genótipo que a planta. Em contraste, algumas células de planta não são capazes de ser regeneradas para produzir plantas. Células regeneráveis em uma cultura de célula ou tecido de planta podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calos, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flores, miolos, sabugos, espigas, cascas ou pedúnculos.
[00051] Partes de planta incluem partes que podem ser colhidas ou partes úteis para propagação de plantas progênies. Partes de planta úteis para propagação incluem, por exemplo e sem limitação: semente; fruta; um corte; uma muda; um tubérculo; e um porta-enxerto. Uma parte que pode ser colhida de uma planta pode ser qualquer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; pedúnculo; fruta; semente e raiz.
[00052] Uma célula de planta é a unidade estrutural e fisiológica da planta, compreendendo um protoplastos e uma parede celular. Uma célula de planta pode estar na forma de uma célula única isolada, ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula culturada), e pode ser parte de uma unidade organizada superior (por exemplo, um tecido de planta, órgão de planta e planta). Desta maneira, uma célula de planta pode ser um protoplasto, uma célula produtora de gameta ou uma célula ou coleção de células que podem regenerar em uma planta inteira. Desta maneira, uma semente, que compreende células de planta múltiplas e é capaz de se regenerar em uma planta inteira, é considerada uma “célula de planta” em modalidades aqui.
[00053] Resistência/tolerância a herbicida: Quando se referindo a plantas que são resistentes ou tolerantes a glifosato, quer dizer que uma aplicação de uma quantidade de glifosato na planta não afeta significantemente ou mata a planta, onde uma planta do tipo selvagem da mesma espécie seria significantemente afetada e/ou morta pela aplicação da quantidade de glifosato. Uma planta pode ser naturalmente tolerante a um herbicida particular ou uma planta pode ser tornada tolerante a herbicida como um resultado de engenharia genética tal como, por exemplo, cruzamento seletivo; transformação genética; e/ou a introdução de um transgene no genoma da planta. Uma “planta resistente a glifosato” se refere a uma planta contendo uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico que confere tolerância a herbicida quando provida a uma planta heteróloga ou outro organismo expressando-a (isto é, que torna uma planta ou outro organismo tolerante a herbicida).
[00054] Uma planta que é resistente ou tolerante a glifosato pode mostrar um impacto mínimo da aplicação de glifosato à planta. Por exemplo, pode haver uma alteração em crescimento e desenvolvimento normais da planta, onde a planta pode exibir sinais ou sintomas que estão associados a estresse ou doença. Tal impacto mínimo resultante da aplicação de glifosato a plantas que são resistentes ou tolerantes a glifosato está em contraste com o impacto adverso que resulta da aplicação de glifosato a plantas que são suscetíveis a glifosato. Um versado na técnica pode distinguir entre plantas que são resistentes a glifosato e plantas que são suscetíveis a glifosato. Aplicação de glifosato a plantas compreendendo um ácido nucleico que confere tolerância a glifosato resulta em significantemente menos impacto do que aplicação da mesma quantidade de glifosato a uma planta da mesma espécie que não compreende uma molécula de ácido nucleico que confere tolerância a glifosato.
[00055] Uma planta que é tolerante a um herbicida ou outro agente químico mostra tolerância aperfeiçoada em comparação com uma planta controle apropriada. Dano resultante do tratamento com herbicida ou outro agente químico pode ser avaliado através da avaliação de qualquer parâmetro de crescimento ou bem-estar da planta. Tais parâmetros são conhecidos daqueles versados na técnica e sua seleção está dentro do discernimento do versado na técnica. Dano a plantas pode ser avaliado através de inspeção visual e/ou através de análise estatística de um ou mais parâmetros adequados de crescimento ou bem-estar de planta em plantas individuais ou um grupo(s) de planta. Desta maneira, dano pode ser avaliado através da avaliação de parâmetros incluindo, por exemplo e sem limitação: altura da planta; peso da planta; cor da folha; comprimento da folha; floração; fertilidade; espigamento; rendimento; e produção de semente. Dano pode ser também avaliado através da avaliação do tempo decorrido para um estágio de desenvolvimento particular (por exemplo, espigamento, floração e derramamento de pólen) ou o tempo decorrido até que uma planta tenha se recuperado do tratamento com um agente químico e/ou herbicida particular.
[00056] Ao realizar avaliações de dano, valores podem ser atribuídos a graus particulares de danos de maneira que análise estatística ou comparações quantitativas podem ser feitas. O uso de faixas de valores para descrever graus de dano particulares é conhecido na técnica e qualquer faixa ou escala adequada pode ser usada. Por exemplo, classificações de lesão por herbicida (também chamadas classificações de tolerância) podem ser atribuídas. Desta maneira, tolerância a herbicida pode também ser indicada por outras classificações nesta escala, onde uma planta controle apropriada (ou grupo de plantas controle) exibe uma classificação estatisticamente menor na escala em resposta a um tratamento com herbicida do que um grupo de plantas objeto.
[00057] Dano causado por um herbicida ou outro agente químico pode ser avaliado em vários momentos após uma planta ter sido tratada com um herbicida. Frequentemente, dano é avaliado mais ou menos no momento que a planta controle exibe dano máximo. Algumas vezes, dano é avaliado após um período de tempo durante o qual uma planta controle que não foi tratada com herbicida ou outro agente químico cresceu e/ou se desenvolveu mensuravelmente em comparação com o tamanho ou estágio no qual o tratamento foi administrado. Dano pode ser avaliado em qualquer um de muitos momentos adequados, por exemplo, em 12 horas; em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 e/ou 14 dias; em 3 e/ou 4 semanas; ou mais, após uma planta objeto ter sido tratada com herbicida. Qualquer momento de avaliação é adequado contanto que ele permita detecção de uma diferença em resposta a um tratamento de plantas de teste e controle.
[00058] Um herbicida não “afeta significantemente” uma planta quando ele ou não tem nenhum efeito sobre a planta, quando ele tem algum efeito sobre a planta do qual a planta se recupera mais tarde ou quando ele tem um efeito sobre a planta que é prejudicial, mas que é compensado, por exemplo, pelo impacto do herbicida particular sobre ervas daninhas. Desta maneira, por exemplo, uma planta de cultura pode não ser “significantemente afetada” por um herbicida ou outro tratamento se a planta exibir menos do que cerca de 25%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9%, menos do que cerca de 8%, menos do que cerca de 7%, menos do que cerca de 6%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% de diminuição em pelo menos um parâmetro adequado que é indicativo de saúde e/ou produtividade da planta, em comparação com uma planta controle apropriada (por exemplo, uma planta não tratada da mesma espécie). Em modalidades particulares, uma planta é tolerante a um herbicida ou outro agente químico se ela mostrar dano em comparação com uma planta controle apropriada que é menos do que o dano exibido pela planta controle em pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% ou 1000% ou mais. Uma planta de cultura que não é significantemente afetada por um herbicida ou outro tratamento pode exibir uma diminuição em pelo menos um parâmetro, mas a diminuição é de natureza temporária, e a planta se recupera totalmente dentro de, por exemplo, cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 4 semanas ou cerca de 6 semanas. Em modalidades particulares, uma planta que é tolerante a um herbicida ou outro agente químico pode ser caracterizada pelo fato que a planta não é significantemente afetada pela aplicação do herbicida ou outro agente químico.
[00059] Parâmetros adequados que são indicativos de saúde e/ou produtividade de planta incluem, por exemplo e sem limitação: altura da planta; peso da planta; comprimento da folha; tempo decorrido para um estágio de desenvolvimento particular; floração; rendimento; e produção de semente. A avaliação de um parâmetro pode ser realizada através de inspeção visual e/ou através de análise estatística do parâmetro. Uma vez avaliado em uma planta objeto e uma planta controle, uma comparação pode ser feita de maneira a determinar se a planta objeto é significantemente afetada pelo herbicida ou outro tratamento.
[00060] Plantas controle apropriadas que podem ser usadas para determinar resistência a um herbicida (ou outro agente químico) incluem plantas da mesma espécie que não compreendem um ácido nucleico e/ou polipeptídeo de tolerância a herbicida heterólogo putativo e plantas que compreendem o ácido nucleico e/ou polipeptídeo de tolerância a herbicida heterólogo putativo, mas que não foram tratadas com o herbicida.
[00061] Herbicida: Um “herbicida” é um agente químico que causa lesão temporária ou permanente a uma planta. Exemplos não limitantes de herbicidas são listados e discutidos em detalhes adicionais em outro ponto aqui. Um herbicida pode ser incorporado a uma planta ou suas células ou pode agir sobre a planta ou células sem ser incorporado. Um “ingrediente ativo” é um agente químico em uma formulação herbicida que é responsável pela fitotoxidez da formulação. Ingredientes ativos em formulações herbicidas comerciais são tipicamente identificados como um ingrediente ativo no rótulo do produto. Informação do rótulo do produto está disponível na U.S. Environmental Protection Agency e é atualizada online em oaspub.epa.gov/pestlabl/ppls.own. Informação no rótulo do produto está também disponível online em www.cdms.net.
[00062] Quando usado com relação a um herbicida, o termo “equivalente ácido” se refere à taxa ou quantidade como o ácido parental ativo herbicida.
[00063] Isolado: Um componente biológico “isolado” (tal como um ácido nucleico ou polipeptídeo) foi substancialmente separado, produzido separado de ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo onde o componente ocorre naturalmente (isto é, outro DNA e RNA cromossomal e extracromossomal e proteínas), enquanto realizando uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo através de quebra de ligações químicas conectando o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram “isoladas” incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas através de métodos de purificação padrão. O termo também compreende ácidos nucleicos e proteínas preparados através de expressão recombinante em uma célula hospedeiro, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.
[00064] Ácido nucleico: Os termos “polinucleotídeo”, “ácido nucleico” e “molécula de ácido nucleico” são usados aqui intercomutavelmente e compreendem um ácido nucleico único; ácidos nucleicos plurais; um fragmento de ácido nucleico, variante ou derivado do mesmo; e construto de ácido nucleico (por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) e DNA de plasmídeo (pDNA)). Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode conter a sequência de nucleotídeo de uma sequência de cDNA de comprimento integral, ou um fragmento da mesma, incluindo sequências 5’ e/ou 3’ não traduzidas e sequência(s) de codificação. Um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode incluir ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos não modificados ou ribonucleotídeos ou desoxirrobonucleotídeos modificados. Por exemplo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico pode ser compreendido de DNA de fita simples ou dupla; DNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla; RNA de fita simples e dupla; e RNA que é uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA podem ser de fita simples, fita dupla ou uma mistura de regiões de fita simples e dupla. Os termos acima também incluem formas quimicamente, enzimaticamente e metabolicamente modificadas de um polinucleotídeo ou ácido nucleico.
[00065] É compreendido que um DNA específico se refere também ao seu complemento, cuja sequência é determinada de acordo com as regras de emparelhamento de base de desoxirribonucleotídeo.
[00066] Conforme aqui usado, o termo “gene” se refere a um ácido nucleico que codifica um produto funcional (RNA ou polipeptídeo/proteína). Um gene pode incluir sequências reguladoras precedendo (sequências não codificando 5’) e/ou seguindo (sequências não codificando 3’) a sequência codificando o produto funcional.
[00067] Conforme aqui usado, o termo “sequência de codificação” se refere a uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido específica. Uma “sequência reguladora” se refere a uma sequência de nucleotídeo localizada a montante (por exemplo, sequências de não codificação de 5’), dentro ou a jusante (por exemplo, sequências de não codificação de 3’) de uma sequência de codificação, que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras incluem, por exemplo, e sem limitação: promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; sequências de reconhecimento de poliadenilação; sítios de processamento de RNA; sítios de ligação de efetor; e estruturas tronco-alça.
[00068] Conforme aqui usado, o termo “degeneração de códon” se refere à redundância no código genético que permite variação de uma sequência de nucleotídeo particular sem afetar a sequência de aminoácido do polipeptídeo codificado. Uma vez que cada códon consiste em três nucleotídeos, e os nucleotídeos compreendendo DNA são restritos a quatro bases específicas, há 64 possíveis combinações de nucleotídeos, 61 das quais codificam aminoácidos (os três códons restantes codificam sinais de término de tradução). Como resultado, muitos aminoácidos são projetados por mais de um códon. Por exemplo, os aminoácidos alanina e prolina são codificados por quatro tripletos, serina e arginina por seis, enquanto triptofano e metionina são codificados por apenas um tripleto. O “código genético” que mostra quais códons codificam quais aminoácidos é geralmente conhecido na técnica. A degeneração nele então permite que as bases de um DNA variem em uma faixa ampla sem alterar a sequência de aminoácido das proteínas codificadas pelo DNA.
[00069] Em algumas modalidades da presente invenção, quando projetando uma sequência de codificação para expressão aperfeiçoada em uma célula hospedeiro, o gene é projetado de maneira que a frequência de uso de códon no mesmo se aproxime da frequência do uso de códon preferido da célula hospedeiro. Desta maneira, o termo “otimizado no códon” se refere a genes ou sequências de codificação de ácidos nucleicos para transformação de vários hospedeiros onde códons no gene ou sequência de codificação foram alterados para refletir o uso de códon típico do organismo hospedeiro sem alterar o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. Em exemplos, tal otimização inclui substituição de pelo menos um, mais de um, um número significante e/ou todos os códons no gene ou sequência de codificação com um ou mais códons que são mais frequentemente usados nos genes deste organismo.
[00070] Muitos organismos exibem uma tendência ao uso de códons particulares para codificar inserção de um aminoácido particular em uma cadeia de peptídeo em formação. Preferência de códon, ou tendência de códon, diferenças em uso de códon entre os organismos, é fornecida pela degeneração do código genético, e é bem documentada dentre muitos organismos. Tendência de códon frequentemente se relaciona com a eficiência de tradução de RNA mensageiro (mRNA), que é por sua vez acreditada ser dependente das, inter alia, propriedades dos códons sendo traduzidos e a disponibilidade de moléculas de RNA de transferência (tRNA) particulares. A predominância de tRNAs selecionados em uma célula é geralmente um reflexo dos códons usados mais frequentemente em síntese de peptídeo. Desta maneira, os genes podem ser feitos especialmente ou projetados para expressão de gene ótima em um dado organismo com base em otimização de códon.
[00071] Dado o grande número de sequências de gene disponíveis para uma ampla variedade de espécie de animal, planta e microbiana, é possível calcular as frequências relativas de uso de códon. Tabelas de uso de códon estão prontamente disponíveis, por exemplo, no “Codon Usage Database” disponível na internet em kazusa.or.jp/codon/, e essas tabelas podem ser adaptadas de várias maneiras. Vide Nakamura e outros (2000) Nucl. Acids Res. 28:292. Ao utilizar uma tabela de uso de códon, um versado na técnica pode aplicar as frequências correspondendo a uma dada espécie a qualquer dada sequência de polipeptídeo, para projetar e produzir um fragmento de ácido nucleico sintético de uma região de codificação otimizada no códon que codifica o polipeptídeo, mas que usa códons ótimos para a espécie.
[00072] Tendência de códon é refletida na composição de base média de regiões de codificação de proteína. Por exemplo, organismos tendo genomas com teores G+C relativamente baixos utilizam mais códons tendo A ou T na terceira posição de códons sinônimos, enquanto aqueles tendo teores G+C maiores utilizam mais códons tendo G ou C na terceira posição. Ainda, é pensado que a presença de códons “em quantidades menores” dentro de um mRNA pode reduzir a taxa de tradução absoluta deste mRNA, especialmente quando a abundância relativa do tRNA carregado correspondendo ao códon em quantidade menor é baixa. Uma extensão deste raciocínio é que a diminuição de taxa de tradução por códons em quantidades menores individuais seria pelo menos aditiva para códons em quantidades menores múltiplos. Desta maneira, mRNAs tendo teores relativamente altos de códons em quantidades menores teriam correspondentemente taxas de tradução baixas. Esta taxa poderia ser refletida pelos níveis correspondentemente baixos da proteína codificada.
[00073] A tendência de códon pode ser calculada com a frequência na qual um códon único é usado com relação aos códons para todos os aminoácidos. Alternativamente, o códon pode ser calculado como a frequência na qual um códon único é usado para codificar um aminoácido particular, com relação a todos os outros códons para este aminoácido (códons sinônimos).
[00074] O termo “identidade percentual” (ou “identidade %”) se refere a uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeo (ou sequências de polinucleotídeo), conforme determinado comparando as sequências. A identidade percentual pode expressar o grau de relação de sequência entre sequências de polipeptídeo (ou polinucleotídeo), conforme pode ser determinado pela compatibilidade entre as fitas de tais sequências. Em geral, identidade se refere a uma correspondência nucleotídeo-para-nucleotídeo ou aminoácido-para-aminoácido exata de dois polinucleotídeos ou sequências de polipeptídeo, respectivamente. A identidade percentual de duas sequências, sejam sequências de ácido nucleico ou aminoácido, é o número de compatibilidades exatas entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100. Vide Russel e Barton (1994) J. Mol. Biol. 244:332-50.
[00075] Técnicas para alinhamento de sequências de ácido nucleico e aminoácido e determinação de identidade são conhecidas no campo e incluem, por exemplo e sem limitação, aquelas providas em: Computational Molecular Biology (1988) (Lesk, A.M., Ed.) Oxford University, NY; Biocomputing: Informatics and Genome Projects (1993) (Smith, D. W., Ed.) Academic, NY; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (1994) (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania, NJ; Sequence Analysis in Molecular Biology (1987) (von Heinje, G., Ed.) Academic, NY; and Sequence Analysis Iniciador (1991) (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton, NY. Uma técnica para determinação da identidade percentual entre duas sequências pode incluir provisão da sequência de nucleotídeo de um mRNA ou gene e/ou provisão ou inferência da sequência de aminoácido então codificada e comparação da(s) sequência(s) com uma segunda sequência de nucleotídeo e/ou aminoácido. Sequências genômicas podem também ser determinadas e comparadas desta maneira.
[00076] Ainda, métodos para alinhamento sequências de ácido nucleico e aminoácido e determinação da identidade são incorporados em vários programas de software de computador publicamente disponíveis. Cálculos de alinhamento de sequência e identidade percentual podem ser realizados, por exemplo, usando o programa AlignX® da Vector NTI® suite (Invitrogen, Carlsbad, CA) ou programa MegAlign® da LASERGENE® bioinformatics computing suite (DNASTAR® Inc., Madison, WI). Alinhamentos de sequências múltiplos podem ser realizados usando o método Clustal®, que compreende várias variedades de um algoritmo de alinhamento, incluindo Clustal® V e Clustal® W (Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Higgins e outros (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-91). Para alinhamentos múltiplos em Clustal® V, valores default que podem ser usados incluem GAP PENALTY=10 e GAP LENGTH PENALTY=10. Parâmetros default para alinhamento múltiplo em Clustal® W incluem (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0,2, Seqs Divergen de Retardo=30, Peso de Transição de DNA=0,5, Matriz de Peso da Proteína=Gonnet Series, Matriz de Peso do DNA=IUB). Parâmetros default para alinhamentos em par e cálculo de identidade percentual entre sequências de proteína que podem ser usados em um método Clustal® são KTUPLE=1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros default podem ser KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WINDOW=4 e DIAGONALS SAVED = 4. Após alinhamento de sequências usando um programa Clustal®, é possível obter uma “identidade percentual” observando a tabela de “distâncias de sequência” no mesmo programa.
[00077] Em algumas modalidades, um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência (quando comparado com um polipeptídeo de referência, por exemplo, uma EPSPS Classe I) de, por exemplo e sem limitação: pelo menos cerca de 55%; pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 65%; pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 75%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90%; e pelo menos cerca de 95%, tem a mesma função ou similar que o polipeptídeo de referência. Desta maneira, qualquer porcentagem de identidade inteira de, por exemplo, 55% a 100%, pode ser útil na descrição de ácidos nucleicos particulares aqui, por exemplo e sem limitação: 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99%. Certos fragmentos de ácido nucleico não têm apenas a identidade de sequência estranha, mas podem codificar um polipeptídeo tendo, por exemplo e sem limitação: pelo menos 50 aminoácidos; pelo menos 100 aminoácidos; pelo menos 150 aminoácidos; pelo menos 200 aminoácidos; e pelo menos 250 aminoácidos. Modalidades particulares incluem um ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 80% de identidade com a SEQ ID NO:2 ou 3 (por exemplo, pelo menos 79% de identidade; pelo menos cerca de 80% de identidade; pelo menos cerca de 81% de identidade; pelo menos cerca de 82% de identidade; pelo menos cerca de 83% de identidade; pelo menos cerca de 84% de identidade; pelo menos cerca de 85% de identidade; pelo menos cerca de 86% de identidade; pelo menos cerca de 87% de identidade; pelo menos cerca de 88% de identidade; pelo menos cerca de 89% de identidade; pelo menos cerca de 90% de identidade; pelo menos cerca de 91% de identidade; pelo menos cerca de 92% de identidade; pelo menos cerca de 93% de identidade; pelo menos cerca de 94% de identidade; pelo menos cerca de 95% de identidade; pelo menos cerca de 96% de identidade; pelo menos cerca de 97% de identidade; pelo menos cerca de 98% de identidade; pelo menos cerca de 99% de identidade; e pelo menos cerca de 99,5% de identidade).
[00078] O termo “software de análise de sequência” se refere a um algoritmo de computador ou programa de software que é útil para a análise de sequências de nucleotídeo ou aminoácido. “Software de análise de sequência” pode estar comercialmente disponível ou ser independentemente desenvolvido. Exemplos não limitantes de software de análise de sequência incluem: o suite GCG de programas (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI); BLASTP®, BLASTN® e BLASTX® (Altschul e outros, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10); DNASTAR® (DNASTAR®, Inc. Madison, WI); Sequencher® (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI); e o programa FASTA® incorporando o algoritmo Smith-Waterman (Pearson (1994) Comput. Methods Genome Res. [Proc. Int. Symp.], Meeting Date 1992 (Suhai e Sandor, Eds.), Plenum: New York, NY, pp. 111-20). Onde software de análise de sequência tiver sido usado para analisar uma sequência de nucleotídeo ou aminoácido aqui, os resultados da análise mostrados foram gerados usando valores default do programa referido, a menos que de outro modo especificado. Conforme aqui usado, o termo “valores default” se refere a um conjunto de valores ou parâmetros que originalmente carrega com o software de análise de sequência quando é primeiro inicializado.
[00079] Hibridização: Um ácido nucleico compreendendo toda ou parte de uma sequência de nucleotídeo pode ser usado como uma sonda que “hibridiza” seletivamente para sequências de nucleotídeo presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonados ou fragmentos de cDNA (por exemplo, bibliotecas genômicas ou de cDNA de um organismo escolhido) que têm uma quantidade significante de identidade de sequência com a sequência da sonda. Uma sonda de hibridização pode ser um fragmento de DNA genômico; um fragmento de DNA de plasmídeo; um fragmento de cDNA; um fragmento de RNA; um fragmento de DNA amplificado por PCR; um oligonucleotídeo; ou outro polinucleotídeo, e uma sonda pode ser marcada com um grupo detectável (por exemplo, 32P) ou qualquer outro marcador detectável. Desta maneira, por exemplo e sem limitação, uma sonda para hibridização pode ser feita através da marcação de um oligonucleotídeo sintético que hibridiza especificamente para um ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, um ácido nucleico tendo pelo menos cerca de 90% de identidade com a SEQ ID NO:1). Métodos para preparação de sondas para hibridização, e para construção de cDNA e bibliotecas genômicas, são conhecidos na técnica. Sambrook e outros (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Uma orientação extensiva para a hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrada em Sambrook e outros (1989), supra; e Ausubel e outros (1997) Short Protocols in Molecular Biology, Terceira Edição, Wiley, NY, New York, pp. 2-40.
[00080] Em algumas modalidades, hibridização de ácido nucleico (por exemplo, para DNA amplificado) pode ser usada para identificar a presença de um evento transgênico em uma amostra. Moléculas de ácido nucleico ou fragmentos das mesmas são capazes de “hibridizar especificamente” para outra molécula de ácido nucleico sob certas circunstâncias. Em alguns exemplos, um ácido nucleico hibridiza especificamente sob condições adstringentes para um ácido nucleico alvo. Conforme aqui usado, duas moléculas de ácido nucleico são ditas ser capazes de hibridizar especificamente uma para a outra se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucleico de fita dupla, antiparalela, sob condições adstringentes (por exemplo, alta adstringência).
[00081] Um ácido nucleico é dito ser o “complemento” de outra molécula de ácido nucleico se as duas moléculas de ácido nucleico exibirem complementaridade de sequência completa. Conforme aqui usado, os ácidos nucleicos são ditos exibir “complementaridade completa” quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Moléculas que exibem complementaridade completa hibridizarão geralmente uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma para a outra sob condições de “alta adstringência” convencionais. Condições de alta adstringência convencionais são descritas por Sambrook e outros (1989), supra.
[00082] Duas moléculas são ditas exibir “complementaridade mínima” se elas puderem hibridizar uma para a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas uma para a outra sob pelo menos condições de “baixa adstringência” convencionais. Condições de baixa adstringência convencionais são também descritas por Sambrook e outros (1989) supra. A fim de que uma molécula de ácido nucleico sirva como um iniciador ou sonda, ela precisa apenas exibir a complementaridade mínima de sequência para ser capaz de formar uma estrutura de fita dupla estável sob as concentrações de solvente e sal particulares empregadas.
[00083] Fatores que afetam a adstringência de hibridização são bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica e incluem, por exemplo: temperatura, pH, resistência iônica e concentração de solventes orgânicos (por exemplo, formamida e dimetilsulfóxido). Como é conhecido daqueles de habilidade na técnica, adstringência de hibridização é aumentada por temperaturas maiores, resistência iônica menor e concentrações de solvente menores. Condições adstringentes podem ser também obtidas com a adição de agentes desestabilizantes tal como formamida.
[00084] O termo “condição adstringente” ou “condições de adstringência” é definido com relação à hibridização de um ácido nucleico para outro ácido nucleico alvo (isto é, para uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo de interesse particular) através de um procedimento de hibridização específico discutido em Sambrook e outros (1989), supra (em 9.529.55). Vide também Sambrook e outros (1989) em 9.47-9.52 e 9.569.58.
[00085] Especificidade em muitas aplicações está relacionada com as condições de lavagens pós-hibridização, onde fatores incluem a resistência iônica e a temperatura da solução de lavagem. Para híbridos de DNA-DNA, o ponto de fusão térmico (Tm) pode ser aproximado da equação: Tm = 81,5oC+16,6 (logM)+0,41(%GC)-0,61(%form)-500/L, (1) onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, %form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização e L é o comprimento do híbrido em pares de base. Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-84.
[00086] A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH particulares) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridizam para uma sonda perfeitamente compatível. A Tm é reduzida em cerca de 1° C para cada 1% de incompatibilidade. Desta maneira, Tm, hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para sequências da identidade desejadas hibridizar. Por exemplo, se hibridização de sequências com 90% de identidade for pretendida, a Tm pode ser diminuída 10° C (sob resistência iônica e pH particulares). Condições adstringentes podem, por exemplo, ser selecionadas para serem cerca de 5° C menores do que o ponto de fusão térmico (Tm) para uma sequência específica e seu complemento em resistência iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente adstringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem em 1, 2, 3 ou 4° C menor do que a Tm; condições moderadamente adstringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10° C menor do que a Tm; condições de baixa adstringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11 até 20° C menor do que a Tm.
[00087] Em alguns exemplos, condições adstringentes são aquelas onde a concentração de sal é menos do que cerca de 1,5 M Na+ (por exemplo, Na+ cerca de 0,01 a 1,0 M) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30° C para ácidos nucleicos curtos (por exemplo, 11 a 50 nucleotídeos de comprimento) e pelo menos cerca de 60° C para sondas longas (por exemplo, de mais de 50 nucleotídeos de comprimento). Condições de baixa adstringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1,0 M, dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,1% a 37° C e uma lavagem em SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/citrato trissódico ,03M) a 50 a 55° C. Condições de adstringência moderada exemplares incluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl 1,0 M, SDS 0,1% a 37° C e uma lavagem em SSC 0,5X a 1X a 55 a 60° C. Condições de adstringência alta exemplares incluem hibridização em cerca de 50% de formamida, sal de Na cerca de 1,0 M, SDS cerca de 0,1% em cerca de 37° C e uma lavagem em cerca de SSC 0,1X em cerca de 60 a 65° C.
[00088] Conforme aqui usado, o termo “polipeptídeo” inclui um polipeptídeo singular, polipeptídeos plurais e fragmentos dos mesmos. Este termo se refere a uma molécula compreendida de monômeros (aminoácidos) linearmente ligados por ligações de amida (também conhecidas como ligações de peptídeo). O termo “polipeptídeo” se refere a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento ou tamanho específico do produto. Desta maneira, peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopeptídeo, proteína, cadeia de aminoácido, e qualquer outro termo usado para se referir a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, estão incluídos na definição de “polipeptídeo”, e os termos acima são usados intercomutavelmente com “polipeptídeo” aqui. Um polipeptídeo pode ser isolado de uma fonte biológica natural ou produzido através de tecnologia recombinante, mas um polipeptídeo específico não é necessariamente traduzido de um ácido nucleico específico. Um polipeptídeo pode ser gerado de qualquer maneira apropriada, incluindo, por exemplo e sem limitação, através de síntese química.
[00089] Endógeno e Heterólogo: Conforme aqui usado, o termo “nativo” se refere à forma de um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo que é encontrada na natureza com suas próprias sequências reguladoras, se presente. O termo “endógeno” se refere à forma nativa do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo em sua localização natural no organismo ou no genoma do organismo.
[00090] Em contraste, o termo “heterólogo” se refere a um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo que não é normalmente encontrado em sua localização no organismo de referência (hospedeiro). Por exemplo, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que é normalmente encontrado no organismo de referência em uma localização genômica diferente. A título de exemplo adicional, um ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que não é normalmente encontrado no organismo de referência. Um organismo hospedeiro compreendendo um polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser produzido através da introdução do polinucleotídeo, gene ou polipeptídeo heterólogo no organismo hospedeiro. Em exemplos particulares, um polinucleotídeo heterólogo compreende uma sequência de codificação nativa, ou porção da mesma, que é reintroduzida em um organismo fonte em uma forma que é diferente do polinucleotídeo nativo correspondente. Em exemplos particulares, um gene heterólogo compreende uma sequência de codificação nativa, ou porção da mesma, que é reintroduzida em um organismo fonte em uma forma que é diferente do gene nativo correspondente. Por exemplo, um gene heterólogo pode incluir uma sequência de codificação nativa que é uma porção do gene quimérico incluindo regiões reguladoras não nativas que é reintroduzida no hospedeiro nativo. Em exemplos particulares, um polipeptídeo heterólogo é um polipeptídeo nativo que é reintroduzido em um organismo fonte em uma forma que é diferente do polipeptídeo nativo correspondente.
[00091] Um gene ou polipeptídeo heterólogo pode ser um gene ou polipeptídeo que compreende uma sequência de polipeptídeo ou ácido nucleico funcional codificando um polipeptídeo funcional que é fundido a outros genes ou polipeptídeo para produzir um polipeptídeo quimérico ou de fusão, ou um gene codificando o mesmo. Genes e proteínas de modalidades particulares incluem sequências de comprimento integral especificamente exemplificadas e porções, segmentos, fragmentos (incluindo fragmentos contíguos e deleções internas e/ou terminais comparado com as moléculas de comprimento integral), variantes, mutantes, quiméricos e fusões dessas sequências.
[00092] Modificação: Conforme aqui usado, o termo “modificação” pode se referir a uma mudança em um polinucleotídeo de referência particular que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência. Uma modificação pode também se referir a uma mudança em um polipeptídeo de referência que resulta em atividade reduzida, substancialmente eliminada ou eliminada do polipeptídeo de referência. Alternativamente, o termo “modificação” pode ser referir a uma mudança em um polinucleotídeo de referência que resulta em uma atividade aumentada ou realçada de um polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência, bem como uma mudança em um polipeptídeo de referência que resulta em atividade aumentada ou realçada do polipeptídeo de referência. Mudanças tal como a acima podem ser feitas através de qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica incluindo, por exemplo e sem limitação: deleção de uma porção da molécula de referência; mutação da molécula de referência (por exemplo, via mutagênese espontânea, via mutagênese aleatória, via mutagênese causada por genes mutantes e via mutagênese de transposon); substituição de uma porção da molécula de referência; inserção de um elemento na molécula de referência; sub-regulagem da expressão da molécula de referência; alteração da localização celular da molécula de referência; alteração do estado da molécula de referência (por exemplo, via metilação de um polinucleotídeo de referência e via fosforilação e ubiquitinação de um polipeptídeo de referência); remoção de um co-fator da molécula de referência; introdução de um RNA/DNA antissentido se direcionando à molécula de referência; introdução de um RNA/DNA de interferência se direcionando à molécula de referência; modificação química da molécula de referência; modificação covalente da molécula de referência; irradiação da molécula de referência com radiação UV ou raios-X; recombinação homóloga que altera a molécula de referência; recombinação mitótica que altera a molécula de referência; substituição do promotor da molécula de referência; e/ou combinações de qualquer um dos acima.
[00093] Orientação na determinação de quais nucleotídeos ou resíduos de aminoácido podem ser modificados em um exemplo específico pode ser encontrada comparando a sequência do polinucleotídeo ou polipeptídeo de referência com aquela de polinucleotídeos ou polipeptídeos homólogos (por exemplo, de levedura ou bacterianos homólogos), e maximização do número de modificações feitas em regiões de sequências de alta homologia (regiões conservadas) ou de consenso.
[00094] Derivado e Variante: O termo “derivado“, conforme aqui usado, se refere a uma modificação de uma sequência exemplar da presente invenção. Tais modificações incluem a substituição, inserção e/ou deleção de uma ou mais bases de uma sequência de codificação da presente invenção que preserva, altera ligeiramente ou aumenta a função da sequência de codificação em uma espécie de cultura. Tais derivados podem ser prontamente determinados por um versado na técnica, por exemplo e sem limitação, usando técnicas de modelagem por computador para previsão e otimização da estrutura da sequência. O termo “derivado” então também inclui ácidos nucleicos heterólogos compreendendo uma sequência tendo identidade de sequência substancial com uma sequência exemplar da presente invenção, de maneira que elas podem ter a mesma funcionalidade, ligeiramente alterada ou aumentada para uso em expressão de uma EPSPS Classe IV em uma planta de cultura.
[00095] Conforme aqui usado, o termo “variante” se refere a um polipeptídeo que difere de um polipeptídeo exemplar da presente invenção por inserções, deleções, mutações e/ou substituições de aminoácido, uma vez que elas podem ser introduzidas usando, por exemplo e sem limitação, técnicas de DNA recombinante. Orientação na determinação de quais resíduos de aminoácido podem ser substituídos, adicionados ou deletados dentro de uma sequência de aminoácido de referência pode ser encontrada comparando a sequência do polipeptídeo de referência particular com aquela de polipeptídeos homólogos e minimizando o número de mudanças de sequência de aminoácido feitas em regiões de homologia alta (regiões conservadas) ou substituindo aminoácidos com uma sequência de consenso. Um polipeptídeo variante pode ter aminoácidos substituídos e ainda reter a atividade funcional do polipeptídeo de referência. Genes “variantes” compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica o mesmo polipeptídeo que um gene de referência ou um polipeptídeo equivalente que tem uma atividade equivalente ou similar ao polipeptídeo de referência.
[00096] Em algumas modalidades, genes variantes podem ser usados para produzir proteínas variantes e hospedeiros recombinantes podem ser usados para produzir as proteínas variantes. Por exemplo, genes e proteínas variantes podem ser construídos, os quais compreendem resíduos contíguos (aminoácido ou nucleotídeo) de qualquer sequência exemplificada aqui. Um gene ou proteína variante pode ter, por exemplo e sem limitação: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292 e 293 resíduos contíguos (aminoácido ou nucleotídeo) que correspondem a um segmento (do mesmo tamanho) na sequência exemplificada. Segmentos similarmente dimensionados, especialmente aqueles para regiões conservadas, podem ser também usados como sondas e/ou iniciadores.
[00097] É compreendido por aqueles versados na técnica que muitos níveis de identidade de sequência são úteis na identificação de polipeptídeos (por exemplo, de outras espécies) que têm função ou atividade igual ou similar a um polipeptídeo de referência. Em algumas modalidades, um polipeptídeo variante tendo uma identidade de sequência (quando comparado com um polipeptídeo de referência, por exemplo, uma EPSPS Classe IV) de, por exemplo e sem limitação: pelo menos cerca de 55%; pelo menos cerca de 60%; pelo menos cerca de 65%; pelo menos cerca de 70%; pelo menos cerca de 75%; pelo menos cerca de 80%; pelo menos cerca de 85%; pelo menos cerca de 90%; e pelo menos cerca de 95%, tem a mesma função ou similar que o polipeptídeo de referência.
[00098] Estratégias para projeto e construção de genes e proteínas variantes que compreendem resíduos contíguos de uma molécula particular podem ser determinadas através da obtenção e exame da estrutura de uma proteína de interesse (por exemplo, coordenadas 3-D (tridimensional) atômicas de uma estrutura de cristal e/ou modelo molecular). Em alguns exemplos, uma estratégia pode ser direcionada a certos segmentos de uma proteína que são ideais para modificação, tais como segmentos expostos à superfície e não segmentos internos que estão envolvidos com dobra de proteína e integridade estrutural 3D essencial. A Patente U.S. No. 5.605.793, por exemplo, se refere a métodos para geração de diversidade molecular adicional usando remontagem de DNA após fragmentação aleatória ou focada. Isso pode ser referido como “embaralhamento” (shuffling) de gene, que envolve tipicamente mistura de fragmentos (de um tamanho desejado) de duas ou mais moléculas de DNA diferentes, seguido por rodadas repetidas de renaturação. Este processo pode aperfeiçoar a atividade de uma proteína codificada por um gene objeto. O resultado pode ser uma proteína quimérica tendo atividade aperfeiçoada, especificidade de substrato alterada, estabilidade de enzima aumentada, estereoespecificidade alterada ou outras características.
[00099] Uma “substituição” de aminoácido pode ser o resultado de substituição de um aminoácido em uma sequência de referência com outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas similares (isto é, substituição de aminoácido conservativa), ou pode ser o resultado de substituição de um aminoácido em uma sequência de referência com um aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas diferentes (isto é, substituição de aminoácido não conservativa). Aminoácidos podem ser substituídos nas classes estruturais e/ou químicas que seguem: não polar; polar não carregada; básica; e ácida. Desta maneira, substituições de aminoácido “conservativas” podem ser feitas com base em similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade ou na natureza anfifática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidos polares não carregados (neutros) incluem serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluem arginina, lisina e histidina; e aminoácidos negativamente carregados (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Alternativamente, substituições de aminoácido “não conservativas” podem ser feitas selecionando as diferenças na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade ou natureza anfifática de qualquer um desses aminoácidos. “Inserções” ou “deleções” podem estar dentro da faixa de variação conforme estruturalmente ou funcionalmente tolerado pelas proteínas recombinantes.
[000100] Em algumas modalidades, uma proteína variante é “truncada” com relação a uma proteína de comprimento integral, de referência. Em alguns exemplos, uma proteína truncada retém a atividade funcional da proteína de referência. Por proteína “truncada” quer dizer que uma porção de uma proteína pode ser clivada, por exemplo, enquanto a proteína truncada restante retém e exibe a atividade desejada após clivagem. Clivagem pode ser obtida através de qualquer uma de várias proteases. Ainda, proteínas eficazmente clivadas podem ser produzidas usando técnicas de biologia molecular, onde as bases de DNA codificando uma porção da proteína são removidas da sequência de codificação, ou através de digestão com endonucleases de restrição ou outras técnicas disponíveis ao versado na técnica. Uma proteína truncada pode ser expressa em um sistema heterólogo, por exemplo, E. coli, baculovírus, sistemas virais baseados em planta e levedura. Proteínas truncadas conferindo tolerância a herbicida podem ser confirmadas usando o sistema heterólogo expressando a proteína em um bioensaio de tolerância a herbicida, tal como descrito aqui. É bem conhecido na técnica que proteínas truncadas podem ser produzidas com sucesso de maneira que elas retêm a atividade funcional da proteína de referência de comprimento integral. Por exemplo, proteínas Bt podem ser usadas em uma forma truncada (proteína de núcleo). Hofte and Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53(2):242-55; e Adang e outros (1985) Gene 36:289-300.
[000101] Em alguns casos, especialmente para expressão em plantas, pode ser vantajoso usar genes truncados que expressam proteínas truncadas. Genes truncados podem codificar um polipeptídeo compreendido de, por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% da proteína de comprimento integral.
[000102] Os genes e proteínas variantes que retêm a função da sequência de referência da qual eles foram projetados podem ser determinados por um versado na técnica, por exemplo, através de ensaio de variantes recombinantes quanto à atividade. Se tal ensaio de atividade for conhecido e caracterizado, então a determinação de variantes funcionais requer apenas experimentação de rotina.
[000103] Mudanças específicas no “sítio ativo” de uma enzima podem ser feitas para afetar sua funcionalidade inerente com relação à atividade ou estereoespecificidade. Vide Muller e outros (2006) Protein Sci. 15(6):1356-68. Por exemplo, a estrutura tauD conhecida foi usada como uma dioxigenase modelo para determinar resíduos de sítio ativo enquanto ligados ao seu substrato inerente, taurina. Vide Elkins e outros (2002) Biochemistry 41(16):5185-92. Informação adicional com relação à otimização de sequência e capacidade de projeto de sítios ativos de enzima pode ser encontrada em Chakrabarti e outros (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(34):12035-40.
[000104] Várias propriedades estruturais e características tridimensionais de uma proteína podem ser mudadas sem afetar de modo adverso a atividade/funcionalidade da proteína. Substituições de aminoácido conservativas podem ser feitas, as quais não afetam de modo adverso a atividade e/ou configuração tridimensional da molécula (substituições “toleradas”). Proteínas variantes podem ser também projetadas, as quais diferem no nível de sequência da proteína de referência, mas que retêm a estrutura tridimensional essencial geral, distribuição de carga de superfície iguais ou parecidas e similar. Vide, por exemplo, Patente U.S. 7.058.515; Larson e outros (2002) Protein Sci. 11:2804-13; Crameri e outros (1997) Nat. Biotechnol. 15:436-8; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51; Stemmer (1994) Nature 370:389-91; Stemmer (1995) Bio/Technology 13:549-53; Crameri e outros (1996) Nat. Med. 2:100-3; e Crameri e outros (1996) Nat. Biotechnol. 14: 315-9.
[000105] Projeto computacional de UTRs 5’ ou 3’ (por exemplo, grampos de cabelo sintéticos) que são adequadas para uso em um construto de expressão (por exemplo, um construto de expressão de EPSPS Classe IV) pode ser também realizado e pode ser usado para projetar elementos dentro de ácidos nucleicos de algumas modalidades da presente invenção. Modelagem por computador e UTRs e técnicas de modelagem por computador para uso em previsão/avaliação de derivados de UTR 5’ e 3’ incluem, por exemplo e sem limitação: versão MFoLd® 3.1 (disponível da Genetics Corporation Group, Madison, WI; vide, Zucker e outros . “Algorithms and Thermodynamics for RNA Secondary Structure Prediction: A Practical Guide,” in RNA Biochemistry and Biotechnology, 11-43, J. Barciszewski & B.F.C. Clark, eds., NATO ASI Series, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999; Zucker e outros (1999) J. Mol. Biol. 288:911-40; Zucker e outros “RNA Secondary Structure Prediction,” em Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, S. Beaucage, D.E. Bergstrom, G.D. Glick e R.A. Jones eds., John Wiley & Sons, New York, 11.2.1-11.2.10, 2000); e COVE® (análise de estrutura de RNA usando modelos de covariância (métodos de gramática livre de contexto estocástica)) v.2.4.2 (Eddy and Durbin (1994) Nucl. Acids Res. 22:2079-88), que é livremente distribuído como um código fonte e que pode ser baixado acessando o website genetics.wustl.edu/eddy/software/; e FOLDALIGN® (vide Gorodkin e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25(18):3724-32 e Gorodkin e outros (1997) Proceedings International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology ISMB International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5:120-123), também livremente distribuído e disponível para baixar no website, foldalign.ku.dk/software/ index.html.
[000106] Promotor: O termo “promotor” se refere a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação de ácido nucleico ou RNA funcional. Em exemplos, a sequência de codificação controlada está localizada 3’ para uma sequência promotora. Um promotor pode ser derivado em sua totalidade de um gene nativo, um promotor pode ser compreendido de elementos diferentes derivados de promotores diferentes encontrados na natureza ou um promotor pode compreender até mesmo segmentos de DNA sintético. É compreendido por aqueles versados na técnica que promotores diferentes podem direcionar a expressão de um gene em tecidos ou tipos de célula diferentes ou em estágios de desenvolvimento diferentes ou em resposta a condições ambientais ou fisiológicas diferentes. Exemplos de todos os promotores acima são conhecidos e usados na técnica para controlar a expressão de ácidos nucleicos heterólogos. Promotores que direcionam a expressão de um gene na maioria dos tipos de célula na maioria das vezes são geralmente referidos como “promotores constitutivos”. Ainda, embora aqueles na técnica tenham tentado (em muitos casos sem sucesso) delinear os limites exatos de sequências reguladoras, deve ser compreendido que fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade promotora idêntica. A atividade promotora de um ácido nucleico particular pode ser ensaiada usando técnicas familiares àqueles no campo.
[000107] Operavelmente ligado: O termo “operavelmente ligado” se refere a uma associação de sequências de ácido nucleico em um ácido nucleico único, onde a função de uma das sequências de ácido nucleico é afetada por outra. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado com uma sequência de codificação quando o promotor é capaz de afetar a expressão desta sequência de codificação (por exemplo, a sequência de codificação está sob o controle transcripcional do promotor). Uma sequência de codificação pode ser operavelmente ligada a uma sequência reguladora em uma orientação de sentido ou antissentido.
[000108] Expressão: O termo “expressão”, conforme aqui usado, pode se referir à transcrição e acúmulo estável de RNA de sentido (mRNA) e antissentido derivado de um DNA. Expressão pode também ser referir à tradução de mRNA em um polipeptídeo. Conforme aqui usado, o termo “superexpressão” se refere à expressão que é maior do que a expressão endógena do mesmo gene ou gene relacionado. Desta maneira, um gene heterólogo é “superexpresso” se sua expressão for maior do que aquela de um gene endógeno comparável.
[000109] Transformação: Conforme aqui usado, o termo “transformação” se refere à transferência e à integração de um ácido nucleico ou fragmento do mesmo em um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Organismos hospedeiros contendo um ácido nucleico transformante são referidos como organismos “transgênicos”, “recombinantes” ou “transformados”. Métodos de transformação conhecidos incluem, por exemplo: transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes; transformação com fosfato de cálcio; transformação com polibreno; fusão de protoplastos; eletroporação; métodos ultrassônicos (por exemplo, sonoporação); transformação de lipossomo; microinjeção; transformação com DNA nu; transformação com vetores de plasmídeo; transformação com vetores virais; transformação biolística (bombardeamento de micropartícula); transformação mediada por WHISKERS de carboneto de silício; feixe de aerossol; e transformação mediada por PEG.
[000110] Introduzido: Conforme aqui usado, o termo “introduzido” (no contexto de introdução de um ácido nucleico em uma célula) inclui transformação de uma célula, bem como cruzamento de uma planta compreendendo o ácido nucleico com uma segunda planta, de maneira que a segunda planta contenha o ácido nucleico, uma vez que pode ser realizado utilizando técnicas de cruzamento de planta convencionais. Tais técnicas de cruzamento são conhecidas no campo. Para uma discussão de técnicas de cruzamento de planta, vide Poehlman (1995) Breeding Field Crops, 4a Edição, AVI Publication Co., Westport CT.
[000111] Métodos de retrocruzamento podem ser usados para introduzir um ácido nucleico em uma planta. Esta técnica tem sido usada por décadas para introduzir características em plantas. Um exemplo de uma descrição de retrocruzamento (e outras metodologias de cruzamento de planta) pode ser encontrado em, por exemplo, Poehlman (1995), supra; e Jensen (1988) Plant Breeding Methodology, Wiley, New York, NY. Em um protocolo de retrocruzamento exemplar, uma planta de interesse original (a “origem recorrente”) é cruzada com uma segunda planta (a “origem não recorrente”) que carrega um ácido nucleico a ser introduzido. A progênie resultante deste cruzamento é então cruzada novamente com a origem recorrente, e o processo é repetido até que uma planta convertida seja obtida, onde essencialmente todas as características morfológicas e fisiológicas desejadas da origem recorrente são recuperadas na planta convertida, em adição ao ácido nucleico da origem não recorrente.
[000112] Plasmídeo/vetor: Os termos “plasmídeo” e “vetor”, conforme aqui usado, se referem a um elemento extracromossomal que pode carregar um ou mais genes que não são parte do metabolismo central da célula. Plasmídeos e vetores são tipicamente moléculas de DNA de fita dupla circulares. No entanto, plasmídeos e vetores podem ser ácidos nucleicos lineares ou circulares, de um DNA ou RNA de fita simples ou dupla, e podem ser derivados de qualquer fonte, onde várias sequências de nucleotídeo foram unidas ou recombinadas em uma construção única que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e uma sequência de DNA de codificação junto com qualquer sequência não traduzida 3’ apropriada em uma célula. Em exemplos, plasmídeos e vetores podem compreender sequências replicando autonomamente, sequências de integração em genoma e/ou sequências de fago ou nucleotídeo.
III. Sequências de codificação de EPSPS Classe IV
[000113] Algumas modalidades da presente invenção proveem um polipeptídeo isolado tendo pelo menos cerca de 90% de identidade (por exemplo, 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade) com uma proteína EPSPS Classe IV (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168). Algumas modalidades da presente invenção proveem um polipeptídeo isolado compreendendo SEQ ID NOs:170-173, que são elementos estruturais conservados característicos em proteínas EPSPS Classe IV que as distinguem de outras enzimas.
[000114] Algumas modalidades da presente invenção proveem um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90% de identidade com uma proteína EPSPS Classe IV. Algumas modalidades incluem então um ácido nucleico codificando um polipeptídeo isolado compreendendo SEQ ID NOs:170-173. Tais ácidos nucleicos podem ser úteis em qualquer uma de uma ampla variedade de aplicações (por exemplo, introdução de resistência a glifosato) onde metabolismo de glifosato modificado é desejado em uma célula de planta. Desta maneira, algumas modalidades proveem um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência (por exemplo, 79%, pelo menos 80%, pelo menos 81%, pelo menos 82%, pelo menos 83%, pelo menos 84%, pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade) com uma sequência de ácido nucleico nativa que codifica uma proteína EPSPS Classe IV. Exemplos particulares de ácidos nucleicos de EPSPS Classe IV providos para propósitos ilustrativos aqui são SEQ ID NOs:2 e 3 (dgt-28). Exemplos particulares de ácidos nucleicos dgt-28 incluem ácidos nucleicos que hibridizam especificamente para um ácido nucleico tendo SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3 sob condições adstringentes (por exemplo, altamente adstringentes).
[000115] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos codificando EPSPS Classe IV otimizados no códon são providos. Por exemplo, para obter expressão alta de um gene heterólogo em uma planta pode ser desejável projetar e reengenheirar o gene de maneira que ele seja mais eficientemente expresso em uma célula da planta. Esta estratégia pode ser particularmente desejável em circunstâncias onde um gene bacteriano é desejado ser expresso em uma célula de planta.
[000116] Desta maneira, alguns dos presentes exemplos proveem um gene otimizado na planta codificando uma proteína EPSPS Classe IV, e métodos para seu projeto, para gerar uma sequência de DNA que pode ser expressa otimamente em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas, e onde as modificações de sequência não impedem tradução ou transcrição. Projeto de um gene de codificação de EPSPS Classe IV otimizado para expressão da mesma proteína EPSPS Classe IV em ambas as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas é exemplificado aqui com uma reengenharia da região de codificação da proteína de dgt-28 para expressão ótima. Ácidos nucleicos dgt-28 otimizados da planta exemplares aqui incluem SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:3.
[000117] Na engenharia um gene codificando uma proteína EPSPS Classe IV para expressão em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas (por exemplo, algodão, canola, tabaco, milho, soja, trigo e arroz), a tendência de códon da planta(s) hospedeiro prospectiva pode ser determinada, por exemplo, através do uso de bancos de dados de sequência de DNA publicamente disponíveis para encontrar informação sobre a distribuição de códon de genomas de planta ou das regiões de codificação de proteína de vários genes de planta.
[000118] No projeto de regiões de codificação em um ácido nucleico para expressão em planta, os códons primários (“primeira escolha”) preferidos pela planta devem ser determinados, bem como as segunda, terceira, quarta, etc, escolhas de códons preferidos quando escolhas múltiplas existem. Uma nova sequência de DNA pode ser então projetada, a qual codifica a sequência de aminoácido do mesmo peptídeo (por exemplo, uma proteína EPSPS Classe IV), mas a nova sequência de DNA difere da sequência de DNA original pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido, etc) para especificar o aminoácido em cada posição dentro da sequência de aminoácido.
[000119] A nova sequência pode então ser analisada quanto a sítios de enzima de restrição que poderiam ter sido criados pelas modificações. Os sítios identificados podem ser adicionalmente modificados pela substituição dos códons com primeiros, segundos, terceiros ou quartos códons preferidos de escolha. Outros sítios na sequência que poderiam afetar transcrição ou tradução do gene de interesse são estruturas tronco-alça, junções exon:íntron (5’ ou 3’), sinais de adição de poli A e sinais de término de polimerase de RNA; esses sítios podem ser removidos pela substituição de códons de planta. A sequência pode ser analisada adicionalmente e modificada para reduzir a frequência de dupletos TA ou CG. Em adição aos dupletos, blocos de sequência G ou C que têm mais do que cerca de seis resíduos que são iguais podem afetar a transcrição ou tradução da sequência. Desta maneira, esses blocos podem ser modificados substituindo os códons de primeira ou segunda escolha, etc, com o próximo códon de escolha preferido.
[000120] A SEQ ID NO:2 (dgt-28 (v5)) foi otimizada para expressão em plantas dicotiledôneas. A SEQ ID NO:3 (dgt-28 (v6)) foi otimizada para expressão em plantas monocotiledôneas. O uso de códon nessas sequências sintéticas foi selecionado com base no uso de códon preferido, isto é, os produtos de expressão de cada um são codificados por códons tendo uma tendência com relação a uso de planta ou monocotiledônea ou dicotiledônea, e sequências prejudiciais e sítios de restrição supérfluos foram removidos para aumentar a eficiência de transcrição/tradução do polipeptídeo DGT-28 e facilitar etapas de manipulação de DNA.
[000121] Da mesma maneira, a molécula de ácido nucleico de SEQ ID NO:4 (dgt-28 (v1)) foi otimizada para aperfeiçoar a expressão em Escherichia coli. Uso de códon em SEQ ID NO:4 foi selecionado com base em uso de códon de E. coli preferido; a proteína expressa é codificada por códons tendo uma tendência com relação a uso de E. coli. Durante o novo projeto, sequências prejudiciais e sítios de restrição supérfluos foram removidos para aumentar a eficiência de transcrição/tradução da sequência de codificação de DGT-28 e facilitar as etapas de manipulação de DNA. Desta maneira, expressão de DGT- 28 de um ácido nucleico compreendendo SEQ ID NO:4 em E. coli pode resultar em expressão de proteína robusta, por exemplo, para caracterização enzimática de DGT-28.
[000122] Uma vez uma sequência de DNA otimizada (por exemplo, otimizada em planta) tendo sido projetada no papel, ou in silico, moléculas de DNA reais podem ser sintetizadas no laboratório para corresponder em sequência precisamente à sequência projetada. Tais moléculas de molécula de ácido nucleico sintética podem ser clonadas e de outra maneira manipuladas exatamente como se elas fossem derivadas de fontes naturais ou nativas.
[000123] Um ácido nucleico da presente invenção pode ser clonado em um vetor para transformação em células procarióticas ou eucarióticas para replicação e/ou expressão. Os vetores podem ser vetores procarióticos, por exemplo, plasmídeos, ou vetores embaralhados, vetores de inseto ou vetores eucarióticos. Um ácido nucleico da presente invenção pode ser também clonado em um vetor de expressão, por exemplo, para administração a uma célula de planta. Em certas aplicações, pode ser preferível ter vetores que são funcionais em E. coli (por exemplo, produção de proteína para aumento de anticorpos, análise de sequência de DNA, construção de insertos, obtenção de quantidades de ácidos nucleicos).
[000124] Para expressar uma proteína EPSPS Classe IV em uma célula, um ácido nucleico codificando a proteína é tipicamente subclonado em um vetor de expressão que contém um promotor para transcrição direta. Promotores bacterianos e eucarióticos adequados são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2a ed., 1989, 3a ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel e outros, supra). Sistemas de expressão bacteriana para expressão de um ácido nucleico da presente invenção estão disponíveis em, por exemplo, E. coli, Bacillus e Salmonella (Palva e outros, Gene 22:229-235) (1983)). Estojos para tais sistemas de expressão estão comercialmente disponíveis. Sistemas de expressão eucarióticos para células de mamífero, levedura e células de inseto são bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica e estão também comercialmente disponíveis.
[000125] O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética para a célula é selecionado com relação ao uso pretendido da proteína EPSPS Classe IV (por exemplo, expressão em plantas, animais, bactérias, fungos e protozoários). Vetores de expressão bacteriana e animal padrão são conhecidos na técnica e são descritos em detalhes, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. 20050064474A1 e Publicações de Patente Internacionais WO 05/084190, WO05/014791 e WO03/080809. Métodos de transfecção padrão podem ser usados para produzir linhagens de célula bacteriana que expressam grandes quantidades de proteína, que podem então ser purificadas usando técnicas padrão.
[000126] A seleção de um promotor usado para direcionar a expressão de um ácido nucleico da presente invenção depende da aplicação particular. Vários promotores que direcionam a expressão de um gene em uma planta podem ser empregados nas presentes modalidades. Tais promotores podem ser selecionados de constitutivos, quimicamente regulados, induzíveis, específicos de tecido e promotores preferidos de semente. Por exemplo, um promotor constitutivo forte adequado para a célula hospedeiro pode ser usado para expressão e purificação de proteínas DGT-28. Exemplos não limitantes de promotores de planta incluem sequências de promotor derivadas de ubiquitina-10 de A. thaliana (ubi-10) (Callis e outros, 1990, J. Biol. Chem., 265:12486-12493); manopina sintase de A. tumefaciens (Δmas) (Petolino e outros, Patente U.S. No. 6.730.824); e/ou Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV) (Cassava Vein Mosaic Virus) (Verdaguer e outros, 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139).
[000127] Promotores constitutivos incluem, por exemplo, o promotor do Vírus do Mosaico da Couve-flor 35 (Odell e outros (1985) Nature 313:810-812); promotor da Actina do Arroz (McElroy e outros (1990) Plant Cell 2:163-171); promotor da Ubiquitina do Milho (Número de Patente U.S. 5.510.474; Christensen e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen e outros (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); promotor pEMU (Last e outros (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); promotor ALS (Número de Patente U.S. 5.659.026); promotor da Histona do Milho (Chabouté e outros, Plant Molecular Biology, 8:179191 (1987)); e similar.
[000128] A faixa de promotores compatíveis com planta disponíveis inclui promotores específicos de tecido e induzíveis. Um elemento regulador induzível é um que é capaz de diretamente ou indiretamente ativar transcrição de uma ou mais sequências de DNA ou genes em resposta a um indutor. Na ausência de um indutor as sequências de DNA ou gene não serão transcritas. Tipicamente o fator proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar transcrição está presente em uma forma inativa, que é então diretamente ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. O indutor pode ser um agente químico tal como uma proteína, metabolito, regulador de crescimento, herbicida ou composto fenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente por calor, frio, sal ou elementos tóxicos ou indiretamente pela ação de um patógeno ou agente de doença tal como um vírus. Tipicamente, o fator proteína que se liga especificamente a um elemento regulador induzível para ativar transcrição está presente em uma forma inativa que é então diretamente ou indiretamente convertida na forma ativa pelo indutor. Uma célula de planta contendo um elemento regulador induzível pode ser exposta a um indutor aplicando externamente o indutor à célula ou planta tal como através de pulverização, rega, aquecimento ou métodos similares.
[000129] Qualquer promotor induzível pode ser usado nas presentes modalidades. Vide Ward e outros, Plant Mol. Biol. 22: 361-366 (1993). Promotores induzíveis incluem, por exemplo e sem limitação: promotores do receptor ecdisona (Número de Patente U.S. 6.504.082); promotores do sistema ACE1 que respondem a cobre (Mett e outros. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); genes In2-1 e In2-2 do milho que respondem a protetores de herbicida benzenossulfonamida (Número de Patente U.S. 5.364.780; Hershey e outros, Mol. Gen. Genetics 227: 229237 (1991) e Gatz e outros, Mol. Gen. Genetics 243: 32-38 (1994)); repressor Tet de Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 227: 229-237 (1991); promotores de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcripcional é induzida por um hormônio glucocorticosteroide, Schena e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 10421 (1991) e McNellis e outros (1998) Plant J. 14(2):247-257; o promotor GST do milho, que é ativado pelos compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes (vide Patente U.S. No. 5.965.387 e Pedido de Patente Internacional, Publicação No. WO 93/001294); e o promotor PR-1A do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico (vide Ono, S., Kusama, M., Ogura, R., Hiratsuka, K., “Evaluation of the Use of the Tobacco PR-1a Promoter to Monitor Defense Gene Expression by the Luciferase Bioluminescence Reporter System”, Biosci. Biotechnol. Biochem. 2011 23 de setembro;75(9):1796- 800). Outros promotores químico-regulados de interesse incluem promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (vide, por exemplo, Gatz e outros (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237 e Patentes U.S. Números 5.814.618 e 5.789.156).
[000130] Outros promotores reguláveis de interesse incluem um elemento regulador responsivo a frio ou um elemento regulador de choque térmico, cuja transcrição pode ser realizada em resposta à exposição a frio ou calor, respectivamente (Takahashi e outros, Plant Physiol. 99:383-390, 1992); o promotor do gene da álcool desidrogenase (Gerlach e outros, PNAS USA 79:2981-2985 (1982); Walker e outros, PNAS 84(19):6624-6628 (1987)), induzível por condições anaeróbicas; o promotor induzível por luz derivado do gene rbcS da ervilha ou gene psaDb da ervilha (Yamamoto e outros (1997) Plant J. 12(2):255-265); um elemento regulador induzível por luz (Feinbaum e outros, Mol. Gen. Genet. 226:449, 1991; Lam e Chua, Science 248:471, 1990; Matsuoka e outros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; Orozco e outros (1993) Plant Mol. Bio. 23(6):1129-1138); um elemento regulador induzível por hormônio de planta (Yamaguchi-Shinozaki e outros, Plant Mol. Biol. 15:905, 1990; Kares e outros, Plant Mol. Biol. 15:225, 1990) e similar. Um elemento regulador induzível pode ser também o promotor do gene In2-1 ou In2- 2 do milho, que responde a protetores de herbicida benzenossulfonamida (Hershey e outros, Mol. Gen. Gene. 227:229-237, 1991; Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 243:32-38, 1994), e o repressor Tet de transposon Tn10 (Gatz e outros, Mol. Gen. Genet. 227:229-237, 1991).
[000131] Promotores induzíveis por estresse incluem promotores induzíveis por estresse de sal/água tal como P5CS (Zang e outros (1997) Plant Sciences 129:81-89); promotores induzíveis pelo frio, tal como cor15a (Hajela e outros (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252), cor15b (Wilhelm e outros (1993) Plant. Mol. Biol. 23:1073-1077), wsc120 (Ouellet e outros (1998) FEBS Lett. 423-324-328), ci7 (Kirch e outros (1997) Plant Mol. Biol. 33:897-909) e ci21A (Schneider e outros (1997) Plant Physiol. 113:335-45); promotores induzíveis pela seca, tal como Trg-31 (Chaudhary e outros (1996) Plant Mol. Biol. 30:1247-57) e rd29 (Kasuga e outros (1999) Nature Biotechnology 18:287-291); promotores induzíveis osmóticos, tal como Rab17 (Vilardell e outros (1991) Plant Mol. Biol. 17:985-93) e osmotina (Raghothama e outros (1993) Plant Mol. Biol. 23:1117-28); promotores induzíveis por calor, tais como proteínas de choque térmico (Barros e outros (1992) Plant Mol. 19:66575; Marrs e outros (1993) Dev. Genet. 14:27-41), smHSP (Waters e outros (1996) J. Experimental Botany 47:325-338); e o elemento induzível por choque térmico do promotor da ubiquitina da salsa (WO 03/102198). Outros promotores induzíveis por estresse incluem rip2 (Patente U.S. Número 5.332.808 e Publicação U.S. No. 2003/0217393) e rd29a (Yamaguchi-Shinozaki e outros (1993) Mol. Gen. Genetics 236:331-340). Certos promotores são induzíveis por lesão, incluindo o promotor pMAS de Agrobacterium (Guevara-Garcia e outros (1993) Plant J. 4(3):495-505) e o promotor ORF13 de Agrobacterium (Hansen e outros, (1997) Mol. Gen. Genet. 254(3):337-343).
[000132] Promotores preferidos de tecido podem ser utilizados para se direcionar à transcrição e/ou expressão aumentada dentro de um tecido de planta particular. Exemplos desses tipos de promotores incluem expressão preferida de semente, tal como aquela provida pelo promotor da faseolina (Bustos e outros, 1989. The Plant Cell Vol. 1, 839853) e o gene da globulina-1 do milho, Belanger e outros, 1991 Genetics 129:863-972. Para dicotiledôneas, promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a, β-faseolina do feijão, napina, β- conglicinina, lectina da soja, cruciferina e similar. Para monocotiledôneas, promotores preferidos de semente incluem, mas não estão limitados a, zeína de 15 kDa do milho, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, Y-zeína, ceroso, reticulado 1, reticulado 2, globulina 1, etc. Promotores preferidos de semente também incluem aqueles promotores que direcionam expressão de gene predominantemente para tecidos específicos dentro da semente tal como, por exemplo, o promotor preferido do endosperma de Y-zeína, o promotor críptico do tabaco (Fobert e outros, 1994. “T-DNA tagging of a seed coat-specific cryptic promoter in tobacco”. Plant J. 4: 567-577), o promotor P-gene do milho (Chopra e outros, 1996. “Alleles of the maize P gene with distinct tissue specificities encode Myb-homologous proteins with C-terminal replacements.” Plant Cell 7:1149-1158, Erratum in Plant cell 1997, 1:109), o promotor da globulina-1 do milho (Belenger e Kriz, 1991. Molecular basis for Allelic Polymorphism of the maize Globulin-1 gene.” Genetics 129: 863-972) e promotores que direcionam a expressão para revestimento da semente ou casca do grão do milho, por exemplo, o promotor da glutamina sintetase específica do pericarpo (Muhitch e outros, 2002, “Isolation of a Promotor Sequence From Glutamine Synthetase1-2 Gene Capable of Conferring Tissue-Specific Gene Expression in Transgenic Maize”. Plant Science 163:865-872).
[000133] Em adição ao promotor, um vetor de expressão tipicamente contém uma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais requeridos para expressão do ácido nucleico em células hospedeiro, ou procarióticas ou eucarióticas. Um cassete de expressão típico então contém um promotor operavelmente ligado, por exemplo, a uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína, e sinais requeridos, por exemplo, para poliadenilação eficiente do transcrito, terminação transcripcional, sítios de ligação de ribossomo ou terminação de tradução. Elementos adicionais do cassete podem incluir, por exemplo, sinais de união aumentadores e heterólogos.
[000134] Outros componentes do vetor podem ser incluídos, também dependendo do uso pretendido do gene. Exemplos incluem marcadores selecionáveis, sequências alvo ou reguladoras, sequências de peptídeo de trânsito tal como a sequência de peptídeo de trânsito otimizada (vide Patente U.S. Número 5.510.471), sequências de estabilização tal como RB7 MAR (vide Thompson e Myatt (1997) Plant Mol. Biol. 34: 687-692 e WO9727207) ou sequências líderes, íntrons, etc. Descrições e exemplos gerais de vetores de expressão de planta e genes repórteres podem ser encontrados em Gruber e outros “Vectors for Plant Transformation” em “Vectors for Plant Transformation” in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick et al eds; CRC Press pp. 89-119 (1993).
[000135] A seleção de um vetor de expressão apropriado dependerá do hospedeiro e do método de introdução do vetor de expressão no hospedeiro. O cassete de expressão pode incluir, no terminal 3’ de uma sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse, uma região de terminação transcripcional e traducional funcional em plantas. A região de terminação pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes estão disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação octopina sintase e nopalina sintase (nos) (Depicker e outros, Mol. and Appl. Genet. 1:561-573 (1982) e Shaw e outros (1984) Nucleic Acids Research vol. 12, No. 20 pp7831- 7846(nos)); vide também Guerineau e outros Mol. Gen. Genet. 262:141144 (1991); Proudfoot, Cell 64:671-674 (1991); Sanfacon e outros Genes Dev. 5:141-149 (1991); Mogen e outros Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroe e outros Gene 91:151-158 (1990); Ballas e outros Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 (1989); Joshi e outros Nucleic Acid Res. 15:9627-9639 (1987).
[000136] Um cassete de expressão pode conter uma sequência líder 5’. Tais sequências líderes podem agir para aumentar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem, a título de exemplo, líderes picornavírus, líder EMCV (região de não codificação 5’ da encefalomiocardite), Elroy-Stein e outros, Elroy-Stein e outros Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:6126-6130 (1989); líderes de potyvírus, por exemplo, líder TEV (Tobacco Etch Virus) Carrington e Freed, Journal of Virology, 64:1590-1597 (1990), líder MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus), Allison e outros, Virology 154:9-20 (1986); proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP), Macejak e outros, Nature 353:90-94 (1991); líder não traduzido do mRNA da proteína de revestimento do vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4), Jobling e outros Nature 325:622-625 (1987); líder do Vírus do mosaico do tabaco (TMV), Gallie e outros (1989) Molecular Biology of RNA, páginas 237256; e líder do vírus mosqueado clorótico do milho (MCMV) Lommel e outros. Virology 81:382-385 (1991). Vide também Della-Cioppa e outros Plant Physiology 84:965-968 (1987).
[000137] O construto pode também conter sequências que aumentam a estabilidade da tradução e/ou mRNA tais como íntrons. Um exemplo de tal íntron é o primeiro íntron do gene II da variante H3.III da histona de Arabidopsis thaliana. Caubet e outros, Journal of Molecular Biology, 225:569-574 (1992).
[000138] Nos casos onde for desejável ter o produto expresso da sequência de nucleotídeo heteróloga direcionado a uma organela particular, particularmente o plastídeo, amiloplasto ou ao retículo endoplásmico, ou secretado na superfície da célula ou extracelularmente, o cassete de expressão pode compreender ainda uma sequência de codificação para um peptídeo de trânsito. Tais peptídeos de trânsito são bem conhecidos na técnica e incluem o, mas não estão limitados ao, peptídeo de trânsito para a proteína carreadora acila, a subunidade pequena de RUBISCO, EPSPS sintase de planta e Helianthus annuus (Vide Lebrun e outros, Patente U.S. 5.510.417), peptídeo de trânsito de cloroplasto Brittle-1 de Zea mays (Nelson e outros, Plant Physiol. 117(4):1235-1252 (1998); Sullivan e outros. Plant Cell 3(12):1337-48; Sullivan e outros. Planta (1995) 196(3):477-84; Sullivan e outros, J. Biol. Chem. (1992) 267(26):18999-9004) e similar. Ainda, peptídeos de trânsito de cloroplasto quiméricos são conhecidos na técnica, tal como o Peptídeo de Trânsito Otimizado (vide Patente U.S. Número 5.510.471). Peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais foram descritos anteriormente nas Patentes U.S. Nos. 5.717.084; 5.728.925. Um versado na técnica vai compreender prontamente as muitas opções disponíveis em expressão de um produto para uma organela particular. Por exemplo, a sequência de alfa amilase de cevada é frequentemente usada para direcionar expressão para o retículo endoplásmico. Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985).
[000139] Será compreendido por um versado na técnica que uso de tecnologias de DNA recombinante podem aperfeiçoar controle de expressão de moléculas de ácido nucleico transfectadas através da manipulação, por exemplo, do número de cópias das moléculas de ácido nucleico dentro da célula hospedeiro, a eficiência com a qual essas moléculas de ácido nucleico são transcritas, a eficiência com a qual os transcritos resultantes são traduzidos e a eficiência de modificações pós-traducionais. Ainda, a sequência promotora seria geneticamente engenheirada para aperfeiçoar o nível de expressão comparado com o promotor nativo. Técnicas recombinantes úteis para controle da expressão de moléculas de ácido nucleico incluem, mas não estão limitadas a, integração estável das moléculas de ácido nucleico em um ou mais cromossomos de célula hospedeiro, adição de sequências de estabilidade de vetor a plasmídeos, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, promotores, operadores, aumentadores), substituições ou modificações de sinais de controle de tradução (por exemplo, sítios de ligação de ribossomo, sequências Shine-Dalgarno ou Kozak), modificação de moléculas de ácido nucleico para corresponder ao uso de códon da célula hospedeiro e deleção de sequências que desestabilizam transcritos.
[000140] Genes repórteres ou marcadores para seleção de células ou tecidos ou partes de planta ou plantas transformados podem ser incluídos nos vetores de transformação. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a antimetabolitos tais como herbicidas ou antibióticos, por exemplo, deidrofolato redutase, que confere resistência a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13:143-149, 1994; vide também Herrera Estrella e outros, Nature 303:209-213, 1983; Meijer e outros, Plant Mol. Biol. 16:807-820, 1991); neomicina fosfotransferase, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2:987-995, 1983 e Fraley e outros Proc. Natl. Acad. Sci USA 80:4803 (1983)); higromicina fosfotransferase, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32:481-485, 1984; vide também Waldron e outros, Plant Mol. Biol. 5:103-108, 1985; Zhijian e outros, Plant Science 108:219-227, 1995); trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:8047, 1988); manose-6-fosfato isomerase que permite que as células utilizem manose (WO 94/20627); ornitina descarboxilase, que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2- (difluormetil)-DL-ornitina (DFMO; McConlogue, 1987; Em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.); e desaminase de Aspergillus terreus, que confere resistência à Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:2336-2338, 1995).
[000141] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, por exemplo, uma acetolactato sintase mutante, que confere resistência à imidazolinona ou sulfonilureia (Lee e outros, EMBO J. 7:1241-1248, 1988), um psbA mutante, que confere resistência à atrazina (Smeda e outros, Plant Physiol. 103:911-917, 1993) ou uma protoporfirinogeno oxidase (vide Patente U.S. No. 5.767.373) ou outros marcadores conferindo resistência a um herbicida tal como glufosinato. Exemplos de genes marcadores selecionáveis adequados incluem, mas não estão limitados a, genes codificando resistência a cloranfenicol (Herrera Estrella e outros, EMBO J. 2:987-992, 1983); estreptomicina (Jones e outros, Mol. Gen. Genet. 210:86-91, 1987); espectinomicina (Bretagne- Sagnard e outros, Transgenic Res. 5:131-137, 1996); bleomicina (Hille e outros, Plant Mol. Biol. 7:171-176, 1990); sulfonamida (Guerineau e outros, Plant Mol. Biol. 15:127-136, 1990); bromoxinila (Stalker e outros, Science 242:419-423, 1988); glifosato (Shaw e outros, Science 233:478-481, 1986); fosfinotricina (DeBlock e outros, EMBO J. 6:25132518, 1987) e similar.
[000142] Uma opção para uso de um gene seletivo é um DNA codificando resistência a glufosinato e em uma modalidade pode ser a fosfinotricino acetil transferase (pat), gene pat ou gene bar otimizado do milho sob o controle do promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca. Esses gentes conferem resistência a bialafos. Vide (vide Wohlleben e outros, (1988) Gene 70: 25-37); Gordon-Kamm e outros, Plant Cell 2:603; 1990; Uchimiya e outros, BioTechnology 11:835, 1993; White e outros, Nucl. Acids Res. 18:1062, 1990; Spencer e outros, Theor. Appl. Genet. 79:625-631, 1990; e Anzai e outros, Mol. Gen. Gen. 219:492, 1989). Uma versão do gene pat é o gene pat otimizado do milho, descrito na Patente U.S. No. 6.096.947.
[000143] Ainda, marcadores que facilitam identificação de uma célula de planta contendo os polinucleotídeos codificando o marcador podem ser empregados. Marcadores que podem ser classificados ou avaliados são úteis, onde presença da sequência produz um produto mensurável e pode produzir o produto sem destruição da célula da planta. Exemplos incluem uma β-glucuronidase, ou um gene uidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, Patentes U.S. 5.268.463 e 5.599.670); cloranfenicol acetil transferase (Jefferson e outros. The EMBO Journal vol. 6, No. 13 pp. 3901-3907); e fosfatase alcalina. Em uma modalidade preferida, o marcador usado é beta-caroteno ou provitamina A (Ye e outros, Science 287:303-305 (2000)). O gene tem sido usado para aumentar a nutrição de arroz, mas neste caso ele é empregado ao invés de um marcador que pode ser avaliado, e a presença do gene ligado a um gene de interesse é detectada por uma cor dourada provida. Diferente da situação onde o gene é usado para esta contribuição nutricional para a planta, uma quantidade menor da proteína é suficiente para propósitos de marcação. Outros marcadores que podem ser avaliados incluem genes de antocianina/flavonoide em geral (vide discussão em Taylor e Briggs, The Plant Cell (1990) 2:115-127) incluindo, por exemplo, um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros, em Chromosome Structure and Function, Kluwer Academic Publishers, Appels e Gustafson eds., pp. 263-282 (1988)); os genes que controlam a biossíntese de pigmentos de flavonoide, tal como gene C1 do milho (Kao e outros, Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler e outros Mol. Gen. Genet. (1994) 242:40-48) e C2 do milho (Wienand e outros, Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B (Chandler e outros, Plant Cell (1989) 1:11751183), o gene p1 (Grotewold e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991) 88:4587-4591; Grotewold e outros, Cell (1994) 76:543-553; Sidorenko e outros, Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); genes de locus bronze (Ralston e outros, Genetics (1988) 119:185-197; Nash e outros, Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), dentre outros.
[000144] Exemplos adicionais de marcadores adequados incluem o gene da proteína fluorescente ciano (CYP) (Cyan Fluorescent Protein) (Bolte e outros (2004) J. Cell Science 117: 943-54 e Kato e outros (2002) Plant Physiol. 129: 913-42), o gene da proteína amarelo fluorescente (PHIYFP® da Evrogen; vide Bolte e outros (2004) J. Cell Science 117: 943-54); um gene lux, que codifica uma luciferase, cuja presença pode ser detectada usando, por exemplo, película de raio-X, contagem por cintilação, espectrofotometria fluorescente, câmeras de vídeo de pouca luz, câmeras de contagem de fóton ou luminometria multipoço (Teeri e outros (1989) EMBO J. 8:343); um gene da proteína verde fluorescente (GFP) (green fluorescent protein) (Sheen e outros, Plant J. (1995) 8(5):777-84); e DsRed2 onde células de planta transformadas como o gene marcador são de cor vermelha, e então visualmente selecionáveis (Dietrich e outros (2002) Biotechniques 2(2):286-293). Exemplos adicionais incluem um gene da β-lactamase (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de xylE (Zukowsky e outros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80:1101), que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; uma gene da α-amilase (Ikuta e outros, Biotech. (1990) 8:241); e um gene da tirosinase (Katz e outros, J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona, que então condensa para formar o composto facilmente detectável melanina. Claramente, muitos tais marcadores estão disponíveis e são conhecidos daqueles versados na técnica.
IV. Células e organismos compreendendo uma EPSPS Classe IV
[000145] Em algumas modalidades, é provida uma célula e/ou organismo (por exemplo, uma célula de planta ou planta) que compreende um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168. Em modalidades particulares, uma célula e/ou organismo é provido, o qual compreende um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 162, 164, 166 e 168. Algumas modalidades incluem uma célula e/ou organismo compreendendo um ácido nucleico heterólogo codificando um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NOs:170-173. Algumas modalidades incluem uma célula e/ou organismo compreendendo um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NOs:170-173.
[000146] Uma célula de planta, parte de planta e/ou planta pode ser geneticamente modificada para compreender um polipeptídeo heterólogo (por exemplo, uma EPSPS Classe IV) e/ou ácido nucleico heterólogo (por exemplo, um ácido nucleico codificando EPSPS Classe IV) através de qualquer um de vários métodos de introdução de uma molécula heteróloga conhecida na técnica. Nas presentes modalidades particulares, uma molécula heteróloga é introduzida em uma célula de planta, parte de planta e/ou planta através de um método selecionado de, por exemplo e sem limitação: transformação e cruzamento seletivo (por exemplo, cruzamento retrógrado).
[000147] Qualquer espécie de planta ou célula de planta pode ser geneticamente modificada para compreender um polipeptídeo heterólogo e/ou ácido nucleico da presente invenção. Em algumas modalidades, a célula de planta que é então geneticamente modificada não é capaz de se regenerar para produzir uma planta. Em algumas modalidades, plantas que são geneticamente modificadas de acordo com a presente invenção (por exemplo, células hospedeiro de planta) incluem, mas não estão limitadas a, uma planta superior, uma planta dicotiledônea, uma planta monocotiledônea, uma planta consumível, uma planta de cultura e uma planta utilizada por seus óleos (por exemplo, uma planta de semente oleaginosa). Tais plantas incluem, por exemplo e sem limitação: alfafa, soja, algodão, semente de colza (canola), semente de linhaça, milho, arroz, braquiária, trigo; açafrão, sorgo, beterraba açucareira, girassol, tabaco e gramíneas (por exemplo, turf grass). Em exemplos particulares, uma célula de planta ou planta geneticamente modificada da presente invenção inclui, por exemplo e sem limitação: Brassica napus, mostarda indiana (Brassica juncea); mostarda Etiopaiana (Brassica carinata); nabo (Brassica rapa); repolho (Brassica oleracea); Glycine max; Linum usitatissimum; Zea mays; Carthamus tinctorius; Helianthus annuus; Nicotiana tabacum; Arabidopsis thaliana, castanha do Brasil (Betholettia excelsa); mamona (Ricinus communis); coco (Cocus nucifera); coentro (Coriandrum sativum); Gossypium spp.; amendoim (Arachis hypogaea); jojoba (Simmondsia chinensis); palma de óleo (Elaeis guineeis); oliva (Olea eurpaea); Oryza sativa; abóbra (Cucurbita maxima); cevada (Hordeum vulgare); cana-de-açúcar (Saccharum officinarum); Triticum spp. (incluindo Triticum durume Triticum aestivum); e lentilha d'água (Lemnaceae sp.). Em algumas modalidades, a planta pode ter uma base genética particular, como para cultivares de elite, cultivares do tipo selvagem e variedades comercialmente distinguíveis.
[000148] Ácidos nucleicos introduzidos em uma célula de planta podem ser usados para conferir características desejadas a essencialmente qualquer planta. Uma ampla variedade de plantas ou sistemas de célula de planta pode ser engenheirada para as características fisiológicas e agronômicas desejadas descritas aqui usando um ácido nucleico codificando uma EPSPS Classe IV e vários métodos de transformação. As presentes modalidades podem usar qualquer um de muitos métodos para a transformação de plantas (e produção de plantas geneticamente modificadas) que são conhecidas na técnica. Vários métodos para transformação de planta foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformações biológica e física para plantas dicotiledôneas, bem como plantas monocotiledôneas (vide, por exemplo, Goto-Fumiyuki e outros (1999) Nat. Biotechnol. 17:282-6; Miki e outros (1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology (Glick, B. R. e Thompson, J. E., Eds.), CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 67-88). Ainda, vetores e métodos de cultura in vitro para transformação de célula e tecido de planta e regeneração de plantas são descritos, por exemplo, em Gruber e outros (1993), supra, nas páginas 89-119.
[000149] Técnicas de transformação de planta disponíveis para introdução de um ácido nucleico em uma célula hospedeiro de planta incluem, por exemplo e sem limitação: transformação com T-DNA desarmado usando Agrobacterium tumefaciens ou A. rhizogenes como o agente de transformação; transfecção com fosfato de cálcio; transformação com polibreno; fusão de protoplastos; eletroporação (D’Halluin e outros (1992) Plant cell 4:1495-505); métodos ultrassônicos (por exemplo, sonoporação); transformação de lipossomo; microinjeção; contato com DNA nu; contato com vetores de plasmídeo; contato com vetores virais; biolística (por exemplo, bombardeamento com partícula de DNA (vide, por exemplo, Klein e outros (1987) Nature 327:70-3) e bombardeamento com micropartícula (Sanford e outros (1987) Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford (1988) Trends Biotech. 6:299, Sanford (1990) Physiol. Plant 79:206; e Klein e outros (1992) Biotechnology 10:268); transformação mediada por carboneto de silício WHISKERS (Kaeppler e outros (1990) Plant Cell Rep. 9:415-8); transformação de nanopartícula (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. US2009/0104700A1); feixe de aerossol; e absorção mediada por polietileno glicol (PEG). Em exemplos específicos, um ácido nucleico heterólogo pode ser introduzido diretamente no DNA genômico de uma célula de planta.
[000150] Um método amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão em uma planta é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. Horsch e outros (1985) Science 227:1229. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para a planta conhecidas ser úteis para transformar geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Kado (1991) Crit. Rev. Plant. Sci. 10:1. Detalhes com relação a sistemas de vetor de Agrobacterium e métodos para transferência de gene mediada por Agrobacterium estão também disponíveis em, por exemplo, Gruber e outros, supra, Miki e outros, supra, Moloney e outros (1989) Plant Cell Reports 8:238 e Patentes U.S. Nos. 4.940.838 e 5.464.763.
[000151] Se Agrobacterium for usada para a transformação, o DNA a ser inserido é tipicamente clonado em plasmídeos especiais; ou em um vetor intermediário ou um vetor binário. Vetores intermediários não podem replicar sozinhos em Agrobacterium. O vetor intermediário pode ser transferido para A. tumefaciens por meio de um plasmídeo auxiliar (conjugação). O sistema Japan Tobacco Superbinary é um exemplo de tal sistema (revisto por Komari e outros (2006) Methods in Molecular Biology (K. Wang, ed.) No. 343; Agrobacterium Protocols, 2a Edição, Vol. 1, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp.15-41; e Komori e outros (2007) Plant Physiol. 145:1155-60). Vetores binários podem replicar sozinhos ambos em E. coli e em Agrobacterium. Vetores binários compreendem um gene marcador de seleção e um ligante ou poliligante que são estruturados pelas regiões de borda de T-DNA direita e esquerda. Eles podem ser transforados diretamente em Agrobacterium (Holsters, 1978). A Agrobacterium compreende um plasmídeo carregando uma região vir. O plasmídeo Ti ou Ri também compreendem a região vir necessária para a transferência do T-DNA. A região vir é necessária para a transferência do T-DNA para a célula de planta. T-DNA adicional pode estar contido.
[000152] As funções de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciens vão direcionar a inserção de uma fita T contendo o construto e marcador adjacente no DNA da célula de planta quando a célula é infectada com as bactérias usando um vetor de DNA T binário (Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-21) ou o procedimento de co- cultivo (Horsch e outros (1985) Science 227:1229-31). Em geral, o sistema de transformação de Agrobacterium é usado para engenheirar plantas dicotiledôneas. Bevan e outros (1982) Ann. Rev. Genet. 16:357-84; Rogers e outros (1986) Methods Enzymol. 118:627-41. O sistema de transformação de Agrobacterium pode também ser usado para transformar, bem como transferir, ácidos nucleicos para plantas monocotiledôneas e células de planta. Vide Patente U.S. No. 5.591.616; Hernalsteen e outros (1984) EMBO J. 3:3039-41; Hooykass-Van Slogteren e outros (1984) Nature 311:763-4; Grimsley e outros (1987) Nature 325:1677-9; Boulton e outros (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; e Gould e outros (1991) Plant Physiol. 95:426-34.
[000153] As manipulações genéticas de um hospedeiro recombinante da presente invenção podem ser realizadas usando técnicas e avaliação genéticas padrão e podem ser realizadas em qualquer célula hospedeiro que seja adequada para manipulação genética. Em algumas modalidades, uma célula hospedeiro recombinante pode ser qualquer organismo ou micro-organismo adequado para modificação genética e/ou expressão de gene recombinante. Em algumas modalidades, um hospedeiro recombinante pode ser uma planta. Técnicas de DNA recombinante e clonagem molecular padrão usadas aqui são bem conhecidas no campo e são descritas em, por exemplo e sem limitação: Sambrook e outros (1989), supra; Silhavy e outros (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; e Ausubel e outros (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley-Interscience, New York, NY.
[000154] Seguindo a introdução de um ácido nucleico em uma célula de planta, a célula de planta pode ser cultivada e quando da emergência de tecido de diferenciação tais como brotos e raízes, plantas maduras podem ser geradas. Em algumas modalidades, uma pluralidade de plantas pode ser gerada. Metodologias para regeneração de plantas são conhecidas daqueles de habilidade comum na técnica e podem ser encontradas, por exemplo, em: Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil e Thorpe Eds. Kluwer Academic Publishers e em : Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111, 1999 Hall Eds Humana Press). Plantas geneticamente modificadas descritas aqui podem ser culturadas em um meio de fermentação ou cultivadas em um meio adequado tal como solo. Em algumas modalidades, um meio de crescimento adequado para plantas superiores pode ser qualquer meio de crescimento para plantas incluindo, mas não limitado a, solo, areia e qualquer outro meio em partícula que apoie crescimento de raiz (por exemplo, vermiculita, perlita, etc) ou cultura hidropônica, bem como luz, água e suplementos nutricionais adequados que facilitem o crescimento da planta superior.
[000155] Células de planta transformadas que são produzidas através de qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser culturadas para regenerar uma planta inteira que possui o genótipo transformado, e então o fenótipo desejado. Tais técnicas de regeneração se baseiam em manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecido, tipicamente se baseando em um marcador biocida e/ou herbicida que foi introduzido junto com as sequências de nucleotídeo desejadas. Regeneração de planta a partir de protoplastos culturados é descrita em Evans e outros, "Protoplasts Isolation and Culture" em Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985. Regeneração pode ser também obtida a partir de calos de planta, explantes, órgãos, pólens, embriões ou partes da mesma. Tais técnicas de regeneração são descritas geralmente em Klee e outros (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486.
[000156] Em outras modalidades, as células de planta que são transformadas não são capazes de regeneração para produzir uma planta. Tais células podem ser empregadas, por exemplo, no desenvolvimento de uma linhagem de célula de planta tendo o fenótipo relevante, por exemplo, resistência a herbicida.
[000157] Uma célula de planta, calo, tecido ou planta modificado pode ser identificado e isolado através da seleção ou avaliação do material de planta engenheirado quanto a características codificadas pelos genes marcadores presentes no DNA de transformação. Por exemplo, seleção pode ser realizada cultivando o material de planta engenheirada em meio contendo uma quantidade inibidora do antibiótico ou herbicida ao qual o construto de gene transformado confere resistência. Ainda, plantas e células de planta transformadas podem ser também identificadas através da avaliação das atividades de quaisquer genes marcadores visíveis (por exemplo, genes de β-glucuronidase, luciferase ou gfp) que possam estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinante. Tais metodologias de seleção e avaliação são bem conhecidas daqueles versados na técnica.
[000158] Uma planta transgênica contendo uma molécula heteróloga da presente invenção pode ser produzida através de cruzamento seletivo, por exemplo, cruzando sexuadamente uma primeira planta parental compreendendo a molécula e uma segunda planta parental, desta maneira produzindo uma pluralidade de primeiras plantas progênies. Uma primeira planta progênie pode então ser selecionada, a qual é resistente a um marcador selecionável (por exemplo, glifosato, resistência ao qual pode ser conferida à planta progênie pela molécula heteróloga da presente invenção). A primeira planta progênie pode então ser autofecundada, desta maneira produzindo uma pluralidade de segundas plantas progênies. Então, a segunda planta progênie pode ser selecionada, a qual é resistente ao marcador selecionável. Essas etapas podem incluir ainda o cruzamento retrógrado da primeira planta progênie ou da segunda planta progênie com a segunda planta parental ou uma terceira planta parental.
[000159] Deve ser também compreendido que duas plantas transgênicas diferentes podem ser também emparceiradas para produzir prole que contém dois genes exógenos, adicionados, segregando independentemente. Autofecundação de progênie apropriada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos os genes exógenos, adicionados. Cruzamento retrógrado com uma planta parental e out-crossing com uma planta não transgênica são também compreendidos, bem como propagação vegetativa. Outros métodos de cruzamento geralmente usados para características e culturas diferentes são conhecidos na técnica. Cruzamento retrógrado tem sido usado para transferir genes para uma característica altamente herdável, simplesmente herdada, para uma cultivar homozigota ou linhagem de cruzamento entre a mesma espécie, que é a origem recorrente. A planta resultante é esperada ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida da origem doadora. Após o cruzamento inicial, indivíduos possuindo o fenótipo da origem doadora são selecionados e repetidamente cruzados (retrocruzados) com a origem recorrente. A origem resultante é esperada ter os atributos da origem recorrente (por exemplo, cultivar) e a característica desejável transferida da origem doadora.
[000160] Um ácido nucleico pode ser também introduzido em uma área predeterminada do genoma da planta através de recombinação homogênea. Métodos para integrar estavelmente uma sequência de polinucleotídeo dentro de um sítio cromossomal específico de uma célula de planta através de recombinação homóloga foram descritos na técnica. Por exemplo, integração específica de sítio conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2009/011118 A1 envolve o uso de recombinases ou integrases para mediar a introdução de uma sequência de polinucleotídeo doadora em um alvo cromossomal. Ainda, o Pedido de Patente Internacional No. WO 2008/021207 descreve recombinação homóloga mediada por dedo de zinco para estavelmente integrar uma ou mais sequências de polinucleotídeo doadoras dentro de locais específicos do genoma. O uso de recombinases tal como FLP/FRT conforme descrito na Patente U.S. No. 6.720.475 ou CRE/LOX conforme descrito na Patente U.S. No. 5.658.772 pode ser feito para integrar estavelmente uma sequência de polinucleotídeo em um sítio cromossomal específico. Finalmente, o uso de meganucleases para direcionamento de polinucleotídeos doadores para uma localização cromossomal específica foi descrito em Puchta e outros, PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060).
[000161] Outros vários métodos para integração específica de sítio dentro de células de planta são geralmente conhecidos e aplicáveis (Kumar e outros, Trends in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159). Ainda, sistemas de recombinação específicos de sítio que foram identificados em vários organismos procariontes e eucariontes inferiores podem ser aplicados para uso em plantas. Exemplos de tais sistemas incluem, mas não estão limitados a: o sistema de recombinante R/RS do plasmídeo pSR1 da levedura Zygosaccharomyces rouxii (Araki e outros (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203) e o sistema Gin/gix de fago Mu (Maeser e Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176).
[000162] Em algumas modalidades, uma EPSPS Classe IV pode ser opcionalmente combinada com outro ácido nucleico na célula e/ou organismo hospedeiro. Por exemplo, em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codificando uma EPSPS Classe IV pode ser combinado ou “empilhado” com outro que provê resistência ou tolerância adicional a glifosato ou outro herbicida e/ou outro que proveja resistência a insetos ou doenças selecionados e/ou aumentos nutricionais e/ou características agronômicas aperfeiçoadas e/ou outro que proveja proteínas ou outros produtos úteis em usos em ração, alimento, industrial, farmacêuticos ou outros. O “empilhamento” de duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro de um genoma de planta pode ser realizado, por exemplo, através de cruzamento de planta convencional usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto(s) que contém os ácidos nucleicos, retransformação de uma planta transgênica ou adição de novas características através de integração direcionada através de recombinação homóloga.
[000163] Ácidos nucleicos que podem ser “empilhados” com um ácido nucleico heterólogo codificando uma EPSPS Classe IV incluem, por exemplo e sem limitação: Genes ou Sequência de Codificação (por exemplo, iRNA) que Conferem Resistência a Pestes ou Doença
[000164] (A) Genes de Resistência à Doença de Planta. As defesas de planta são frequentemente ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência à doença (R) na planta e o produto de um gene de avirulência correspondente (Avr) no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para engenheirar plantas que são resistentes a linhagens de patógeno específicas. Exemplos de tais genes incluem o gene Cf-9 do tomate para resistência a Cladosporium fulvum (Jones e outros, 1994 Science 266:789), gene Pto do tomate, que codifica uma proteína cinase, para resistência à Pseudomonas syringae pv. tomato (Martin e outros, 1993 Science 262:1432) e gene RSSP2 de Arabidopsis para resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos e outros, 1994 Cell 78:1089).
[000165] (B) Uma proteína de Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado na mesma tal como uma sequência de nucleotídeo de um gene de δ-endotoxina Bt (Geiser e outros, 1986 Gene 48:109), e um gene inseticida vegetativo (VIP) (Vegetative Inseticidal) (vide, por exemplo, Estruch e outros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Além disso, moléculas de DNA codificando genes de δ-endotoxina podem ser compradas da American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob números de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.
[000166] (C) Uma lectina, tais como sequências de nucleotídeo de vários genes de lectina de ligação à manose de Clivia miniata (Van Damme e outros, 1994. Plant Molec. Biol. 24:825).
[000167] (D) Uma proteína de ligação de vitamina, tal como avidina e homólogos de avidina que são úteis como larvicidas contra pestes de inseto. Vide Patente U.S. No. 5.659.026.
[000168] (E) Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor de protease ou um inibidor de amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor de cisteína proteinase do arroz (Abe e outros, 1987. J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor I da proteinase do tabaco (Huub e outros, 1993 Plant Molec. Biol. 21:985) e um inibidor de α-amilase (Sumitani e outros, 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).
[000169] (F) Um hormônio específico de inseto ou feromônio tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil uma variante do mesmo, um mimético baseado no mesmo, ou um antagonista ou agonista do mesmo, tal como expressão de baculovírus de esterase de hormônio juvenil clonado, um inativador de hormônio juvenil (Hammock e outros, 1990 Nature 344:458).
[000170] (G) Um peptídeo ou neuropeptídeo específico de inseto que, quando da expressão, rompe a fisiologia da peste afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), uma alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989) e neurotoxinas paralíticas, específicas de inseto (Patente U.S. No. 5.266.361).
[000171] (H) Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc, tal como um peptídeo insectotóxico de escorpião (Pang, 1992, Gent 116:165).
[000172] (I) Uma enzima responsável por um hiperacúmulo de monoterpeno, um sesquiterpeno, um esteroide, ácido hidroxâmico, um derivado de fenilpropanoide ou outro molécula não proteína com atividade inseticida.
[000173] (J) Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-traducional, de uma molécula biologicamente ativa, por exemplo, enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma cinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma quitinase e uma glucanase, seja natural ou sintética. Exemplos de tais genes incluem um gene callas (Pedido de Patente Publicado PCT WO93/02197), sequências de codificação de quitinase (que podem ser obtidas, por exemplo, da ATCC sob números de acesso 3999637 e 67152), quitinase de hookworm do tabaco (Kramer e outros, 1993 Insect Molec. Biol. 23:691) e gene da poliubiquitina ubi4-2 da salsa (Kawalleck e outros, 1993 Plant Molec. Biol. 21:673).
[000174] (K) Uma molécula que estimula transdução de sinal. Exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeo para clones de cDNA de calmodulina de feijão mung (Botella e outros, 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de um clone de cDNA de calmodulina do milho (Griess e outros, 1994 Plant Physiol. 104:1467).
[000175] (L) Um peptídeo de momento hidrofóbico. Vide Patentes U.S. Nos. 5.659.026 e 5.607.914; a última ensina peptídeos antimicrobianos sintéticos que conferem resistência à doença.
[000176] (M) Uma permease de membrana, um formador de canal ou um bloqueador de canal, tal como um análogo de peptídeo lítico cecropina-β (Jaynes e outros, 1993. Plant Sci. 89:43) que torna plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.
[000177] (N) Uma proteína viral-invasiva ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, o acúmulo de proteínas de revestimento virais em células de planta transformadas fornece resistência a desenvolvimento de infecção e/ou doença viral realizado pelo vírus do qual o gene de proteína de revestimento é derivado, bem como por vírus relacionados. Resistência mediada por proteína de revestimento foi conferida a plantas transformadas contra vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da risca do tabaco (tobacco streak virus), vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus etch do tabaco, vírus chocalho do tabaco (tobacco rattle virus) e vírus do mosaico do tabaco (tobacco mosaic vírus). Vide, por exemplo, Beachy e outros (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.
[000178] (O) Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Desta maneira, um anticorpo direcionado a uma função metabólica crítica no intestino do inseto inativaria uma enzima afetada, matando o inseto. Por exemplo, Taylor e outros (1994) Abstract #497, Seventh Int’l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions mostram inativação enzimática em tabaco transgênico através da produção de fragmentos de anticorpo de cadeia simples.
[000179] (P) Um anticorpo específico de vírus. Vide, por exemplo, Tavladoraki e outros (1993) Nature 266:469, que mostram que plantas transgênicas expressando genes de anticorpo recombinantes são protegidas de ataque por vírus.
[000180] (Q) Uma proteína de parada de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Desta maneira, endo α- 1,4-D poligalacturonases facilitam colonização fúngica e liberação de nutriente da planta através de solubilização da homo-α-1,4-D- galacturonase da parede celular da planta (Lamb e outros, 1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e a caracterização de um gene que codifica uma proteína de inibição de endopoligalacturonase de feijão são descritas por Toubart e outros (1992, Plant J. 2:367).
[000181] (R) Uma proteína de parada de desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene de inativação do ribossomo da cevada que provê uma resistência aumentada à doença fúngica (Longemann e outros, 1992). Bio/Technology 10:3305.
[000182] (S) Interferência de RNA, onde uma molécula de RNA é usada para inibir expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA em um exemplo é parcialmente ou totalmente de fita dupla, que dispara uma resposta de silenciamento, resultando em clivagem de dsRNA em RNAs de interferência pequenos, que são então incorporados a um complexo de direcionamento que destrói mRNAs homólogos. Vide, por exemplo, Fire e outros, Patente U.S. 6.506.559; Graham e outros, 6.573.099. Genes que Conferem Resistência a um Herbicida
[000183] (A) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida imidazolinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Genes exemplares nesta categoria codificam uma enzima ALS mutante (Lee e outros, 1988. EMBO J. 7:1241), que é também conhecida como enzima AHAS (Miki e outros, 1990. Theor. Appl. Genet. 80:449).
[000184] Um ou mais genes adicionais codificando resistência ou tolerância a glifosato fornecida por genes da EPSP sintase e aroA mutantes, ou através de inativação metabólica por genes tal como GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) ou outros compostos fosfono tal como glufosinato (genes pat e bar; DSM-2) e ácidos ariloxipropiônico e cicloexanodionas (genes de codificação de inibidor de ACCase). Vide, por exemplo, Patente U.S. No. 4.940.835, que revela a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência a glifosato. Uma molécula de DNA codificando um gene aroA mutante pode ser obtida sob Número de Acesso 39256 e a sequência de nucleotídeo do gene mutante é revelada na Patente U.S. No. 4.769.061. O Pedido de Patente Europeu No. 0 333 033 e a Patente U.S. No. 4.975.374 revelam sequências de nucleotídeo de genes de glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tal como L- fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene da fosfinotricinacetil-transferase é provida no Pedido de Patente Europeu No. 0 242 246. De Greef e outros (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos codificando atividade de fosfinotricino acetil transferase. Exemplos de genes conferindo resistência a ácidos ariloxifenoxipropiônicos e cicloexanodionas, tais como setoxidim e haloxifope, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-3 descritos por Marshall e outros (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.
[000185] (C) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que inibe fotossíntese, tal como uma triazina (genes psbA e gs+) e uma benzonitrila (genes da nitrilase). Przibilla e outros (1991) Plant Cell 3:169 descrevem o uso de plasmídeos codificando genes psbA mutantes para transformar Chlamydomonas. Sequências de nucleotídeo para genes da nitrilase são reveladas na Patente U.S. No. 4.810.648 e moléculas de DNA contendo esses genes estão disponíveis sob números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. Clonagem e expressão de DNA codificando uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes e outros (1992) Biochem. J. 285:173.
[000186] (D) Genes codificando resistência ou tolerância a um herbicida que se ligam a hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), enzimas que catalisam a reação onde para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisato. Isso inclui herbicidas tais como isoxazóis (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Pat. U.S. No. 5,424,276), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, dicetonitrilas (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)propano-1,3- diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2fenil)propano-1,3- diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Pat. U.S. No. 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz uma abundância em excesso de HPPD em plantas pode prover tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.268.549 e 6.245.968 e Pedido de Patente U.S., Publicação No. 20030066102.
[000187] (E) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicidas fenóxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP). Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-1), descrito na Patente U.S. No. 7.838.733.
[000188] (F) Genes codificando resistência ou tolerância a herbicidas fenóxi auxina, tal como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), e que podem também conferir resistência ou tolerância a herbicidas piridilóxi auxina, tal como fluroxipir ou triclopir. Exemplos de tais genes incluem o gene da enzima dioxigenase dependente de α-cetoglutarato (aad-12), descrito no WO 2007/053482 A2.
[000189] (G) Genes codificando resistência ou tolerância a dicamba (vide, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030135879).
[000190] (H) Genes provendo resistência ou tolerância a herbicidas que inibem protoporfirinogeno oxidase (PPO) (vide Patente U.S. No. 5.767.373).
[000191] (I) Genes provendo resistência ou tolerância a herbicidas triazina (tal como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tal como diuron) que se ligam a proteínas de núcleo de centros de reação de fotossistema II (PS II) (vide Brussian e outros (1989) EMBO J. 1989, 8(4):1237-1245). Genes que Conferem ou Contribuem para uma Característica de Valor Agregado
[000192] (A) Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, através da transformação de milho ou Brassica com um gene de antissentido ou estearoil-ACP dessaturases para aumentar o teor de ácido esteárico da planta (Knultzon e outros, 1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2624. (B) Teor de fitato diminuído (1) Introdução de um gene de codificação de fitase, tal como gene de fitase de Aspergillus niger (Van Hartingsveldt e outros, 1993. Gene 127:87), aumenta a quebra de fitato, adicionando mais fosfato livre à planta transformada. (2) Um gene poderia ser introduzido, o qual reduz o teor de fitato. Em milho isso poderia ser realizado, por exemplo, através de clonagem e então reintrodução de DNA associado com o alelo único que é responsável por mutantes de milho caracterizados por níveis baixos de ácido fítico (Raboy e outros, 1990. Maydica 35:383).
[000193] (C) Composição de carboidrato modificada realizada, por exemplo, através da transformação de plantas com um gene codificando uma enzima que altera o padrão de ramificação de milho. Exemplos de tais enzimas incluem gene de fructosiltransferase de Streptococcus mucus (Shiroza e outros, 1988) J. Bacteriol. 170:810, gene de levansucrase de Bacillus subtilis (Steinmetz e outros, 1985. Mol. Gen. Genet. 200:220), α-amilase de Bacillus licheniformis (Pen e outros, 1992. Bio/Technology 10:292), genes da invertase do tomate (Elliot e outros, 1993), gene da amilase da cevada (Sogaard e outros, 1993. J. Biol. Chem. 268:22480) e enzima II de ramificação do amido de endosperma do milho (Fisher e outros, 1993. Plant Physiol. 102:10450).
[000194] Vários ensaios podem ser empregados com relação à molécula de ácido nucleico de certas modalidades da invenção. As técnicas que seguem são úteis em uma variedade de situações, e em uma modalidade, são úteis na detecção da presença da molécula de ácido nucleico e/ou do polipeptídeo codificado em uma célula de planta. Por exemplo, a presença da molécula pode ser determinada de várias maneiras, incluindo uso de um iniciador ou sonda da sequência, ensaio ELISA para detectar a proteína codificada, um Western blot para detectar a proteína ou um Northern ou Southern blot para detectar RNA ou DNA. Ensaios enzimáticos para detecção da enzima DGT-28 podem ser empregados. Ainda, um anticorpo que pode detectar a presença da proteína DGT-28 pode ser gerado usando procedimentos reconhecidos na técnica. Técnicas adicionais, tais como hibridização in situ, tingimento de enzima e imunotingimento, podem ser também usadas para detectar a presença ou expressão do construto recombinante em órgãos e tecidos de planta específicos. Um transgene pode ser seletivamente expresso em alguns tecidos da planta ou em alguns estágios desenvolvimentais, ou o transgene pode ser expresso em substancialmente todos os tecidos de planta, substancialmente durante todo o seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de expressão combinatorial é também aplicável.
[000195] Análise Southern é um método de detecção geralmente usado, onde DNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o DNA através de peso molecular e então transferência para membranas de náilon. Ele é então hibridizado com o fragmento de sonda que foi radioativamente marcado com 32P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma solução de SDS.
[000196] Da mesma maneira, análise Northern implanta um protocolo similar, onde RNA é cortado com endonucleases de restrição e fracionado em um gel de agarose para separar o RNA através de peso molecular e então transferindo para membranas de náilon. Ele é então hibridizado com o fragmento de sonda que foi radioativamente marcado com 32P (ou outros marcadores de sonda) e lavado em uma solução de SDS. Análise do RNA (por exemplo, mRNA) isolado do tecido de interesse pode indicar níveis de expressão relativos. Tipicamente, se o mRNA estiver presente ou a quantidade do mRNA tiver aumentado, pode ser suposto que o transgene correspondente está sendo expresso. Análise Northern, ou outros protocolos analíticos de mRNA, pode ser usada para determinar níveis de expressão de um transgene introduzido ou gene nativo.
[000197] Na análise Western, ao invés de isolar DNA/RNA, a proteína de interesse é extraída e posta em um gel de acrilamida. A proteína é então blotted em uma membrana e contatada com uma substância de marcação. Vide, por exemplo, Hood e outros, “Commercial Production of Avidin from Transgenic Maize; Characterization of Transformants, Production, Processing, Extraction and Purification” Molecular Breeding 3:291-306 (1997); Towbin e outros, (1979) “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(9): 4350-4354; Renart e outros “Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl- paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(7): 3116-3120.
[000198] Os ácidos nucleicos da presente invenção, ou segmentos dos mesmos, podem ser usados para projetar iniciadores para amplificação por PCR. Na realização da amplificação por PCR, um certo grau de incompatibilidade pode ser tolerado entre iniciador e molde. Mutações, inserções e deleções podem ser produzidas em um dado iniciador através de métodos conhecidos de um versado comum na técnica.
[000199] Outro exemplo de método de detecção é a técnica de pirossequência conforme descrito por Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000). Neste método, um oligonucleotídeo é projetado, o qual se sobrepõe à junção de DNA genômico adjacente e DNA de inserção. O oligonucleotídeo é hibridizado para produto de PCR de fita simples da região de interesse (um iniciador na sequência inserida e um na sequência genômica de flanqueamento) e incubado na presença de uma polimerase de DNA, ATP, sulfurilase, luciferase, apirase, adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina. DNTPs são adicionadas individualmente e a incorporação resulta em um sinal luminoso que é medido. Um sinal luminoso indica a presença da sequência de inserção/flanqueamento de transgene devido à amplificação, hibridização e extensão de base simples ou múltipla bem sucedida.
[000200] Sinais moleculares foram descritos para uso em detecção de sequência. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada, a qual se sobrepõe à junção de DNA genômico de flanqueamento e de inserção. A estrutura única da sonda FRET resulta em ela conter uma estrutura secundária que mantém as porções fluorescentes e de extinção em proximidade grande. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência de genoma de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPs. Seguindo amplificação por PCR bem sucedida, hibridização da sonda(s) FRET para a sequência alvo resulta na remoção da estrutura secundária da sonda e separação espacial das porções fluorescentes e de extinção. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência genômica de flanqueamento/inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedidas.
[000201] Ensaio de sonda de hidrólise, conhecido também como TAQMAN® (Life Technologies, Foster City, Calif.), é um método de detecção e quantificação da presença de uma sequência de DNA. Em suma, uma sonda de oligonucleotídeo FRET é projetada com um oligo dentro do transgene e um na sequência genômica de flanqueamento para detecção específica de evento. A sonda FRET e os iniciadores de PCR (um iniciador na sequência de DNA de inserção e um na sequência genoma de flanqueamento) são ciclizados na presença de uma polimerase termoestável e dNTPS. Hibridização da sonda FRET resulta em clivagem e liberação da porção fluorescente para longe da porção de extinção na sonda FRET. Um sinal fluorescente indica a presença da sequência de flanqueamento/inserção de transgene devido à amplificação e hibridização bem sucedidas.
[000202] O ELISA ou imunoensaio ligado à enzima é conhecido desde 1971. Em geral, antígenos solubilizados em um tampão são revestidos sobre uma superfície plástica. Quando soro é adicionado, anticorpos podem se ligar ao antígeno na fase sólida. A presença ou ausência desses anticorpos pode ser demonstrada quando conjugados a uma enzima. Adição do substrato apropriado vai detectar a quantidade de conjugado ligado que pode ser quantificada. Um ensaio ELISA comum é um que usa anticorpos policlonais anti-(proteína) biotinilados e um conjugado de fosfatase alcalina. Por exemplo, um ELISA usado para determinação quantitativa de níveis de lacase pode ser um ensaio sanduíche de anticorpo, que utiliza anticorpos de coelho policlonais obtidos comercialmente. O anticorpo é conjugado à fosfatase alcalina para detecção. Em outro exemplo, um ensaio ELISA para detectar tripsina ou tripsinogeno usa anticorpos policlonais anti-tripsina e anti- tripsinogeno biotinilado e um conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina.
[000203] Certas modalidades se referem a processos de realização de cruzamentos usando uma planta de uma modalidade da presente invenção como pelo menos uma origem. Por exemplo, modalidades particulares se referem a uma planta híbrida F1 tendo como uma ou ambas as origens qualquer uma das plantas exemplificadas aqui. Outras modalidades se referem à semente produzida por tais híbridos de F1. Outras modalidades se referem ainda a um método para produção de uma semente híbrida F1 através de cruzamento de uma planta exemplificada com uma planta diferente (por exemplo, origem de cruzamento entre a mesma espécie) e colheita da semente híbrida resultante. Outras modalidades se referem a uma planta exemplificada que é ou uma origem feminina ou uma origem masculina. Características das plantas resultantes podem ser aperfeiçoadas através de consideração cuidadosa das plantas de origem.
V. Tolerância a Glifosato Mediada por Enzimas EPSPS Classe IV
[000204] Polipeptídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173, podem ter atividade enzimática de EPSPS. Desta maneira, polipeptídeos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistido em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173, e ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173 (por exemplo, SEQ ID NOs:2-4) podem ser usados em algumas modalidades para conferir tolerância a glifosato a uma célula ou organismo (por exemplo, uma célula de planta ou planta). Provisão de uma planta ou célula de planta que é resistente a formulações de herbicida glifosato pode ser útil em uma variedade de aplicações, onde essas células de planta tendo tal resistência podem tolerar exposição a uma quantidade suficiente de glifosato que é usado para controlar pelo menos algumas ervas daninhas em uma área sob cultivo.
[000205] Glifosato, uma composição compreendendo N- (fosfonometil)glicina, é um componente amplamente usado em herbicidas. O glifosato é tipicamente formulado como um sal em um concentrado líquido aquoso, um concentrado sólido, uma emulsão ou uma microemulsão. O glifosato pode ser aplicado over-the-top de plantas da emergência durante os vários estágios de desenvolvimento da planta.
[000206] As variedades de planta tolerantes a glifosato usadas em combinação com formulações herbicidas de glifosato se tornaram o programa padrão para tratamento de erva daninha em produção de cultura nos Estados Unidos e em todo o mundo. A principal vantagem para os cultivadores no uso de uma característica de tolerância a glifosato é que ele permite aplicação simples e conveniente de glifosato; um herbicida de pós-emergência, de amplo espectro, para controlar plantas e gramíneas indesejadas (isto é, “ervas daninhas”) com excelente segurança para a cultura e menos dependência de aplicações de herbicida pré-planta. Outros benefícios incluem um melhor ajuste em plantio direto e sistemas de plantio direto reduzidos. As culturas tolerantes a glifosato expandiram as opções para tratamento de erva daninha e tornaram a prática de controle de erva daninha muito mais fácil, mais barata e mais flexível. Os cultivadores relataram fazer menos viagens pelos campos para aplicar herbicidas bem como fazer menos viagens de cultivo, o que economiza combustível e reduz a erosão do solo. Culturas tolerantes a glifosato, desta maneira, diminuem os riscos ambientais impostos pelos herbicidas, enquanto ao mesmo tempo aumentando a eficácia de controle de erva daninha químico necessário.
[000207] Desta maneira, algumas modalidades da presente invenção proveem controle seletivo de ervas daninhas em uma área sob cultivo contendo uma planta compreendendo um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173; e/ou um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173, onde a planta tem tolerância a glifosato aumentada quando comparado com uma planta da mesma espécie que não compreende o polipeptídeo e/ou ácido nucleico(s). Em alguns exemplos, um método provido aqui compreende aplicação de uma quantidade suficiente de um herbicida glifosato à folhagem da cultura e ervas daninhas para controlar o crescimento das ervas daninhas.
[000208] As modalidades particulares da presente invenção proveem um método para matar ou controlar ervas daninhas ou vegetação indesejada em uma área sob cultivo contendo uma cultura (por exemplo, uma planta compreendendo um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173; e/ou um ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com pelo menos uma EPSPS Classe IV selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166 e 168, e polipeptídeos compreendendo SEQ ID NOs: 170-173). Em alguns exemplos, o método compreende aplicação de glifosato à cultura e/ou à área sob cultivo; por exemplo, aplicação de uma quantidade do glifosato à folhagem da planta de cultura, e simultaneamente a ervas daninhas crescendo em proximidade grande com tais plantas, onde a quantidade é suficiente para resultar em controle das ervas daninhas ou vegetação indesejada, enquanto deixando a planta de cultura substancialmente sem dano.
[000209] Uma composição de glifosato pode ser aplicada a plantas em uma taxa de aplicação suficiente para dar os resultados biológicos desejados, por exemplo, controle de crescimento de erva daninha sem afetar significantemente as plantas de cultura tolerantes a glifosato. Essas taxas de aplicação são geralmente expressas como quantidade de glifosato por área unitária tratada, por exemplo, gramas por hectare (g/ha). O que constitui um “efeito significante” varia de acordo com os padrões e prática daqueles que investigam, desenvolvem, comercializam e usam composições, e a seleção de taxas de aplicação que são significantemente eficazes para uma composição está dentro da habilidade daqueles versados na técnica.
[000210] Em certos exemplos, a quantidade da composição de glifosato aplicada por área unitária para fornecer controle de 85% de uma espécie de erva daninha conforme medido através da redução de crescimento ou mortalidade é usada para definir uma taxa de aplicação. A seleção de várias taxas de aplicação de herbicida glifosato suficientes para controlar ervas daninhas em uma área sob cultivo está dentro da habilidade do cientista em agricultura comum. Aqueles versados na técnica provavelmente reconhecerão que condições de planta individuais, condições de clima e crescimento, bem como os ingredientes ativos específicos e sua razão em peso na composição, podem influenciar o grau de eficácia herbicida em uma aplicação particular.
[000211] Em algumas modalidades, uma composição de glifosato aquosa pode ser aplicada a tecidos foliares de plantas para matar ou controlar o crescimento de uma ampla variedade de plantas indesejadas, incluindo gramíneas anuais e perenes e espécies de erva daninha de folha larga, através da aplicação a tecidos de folha das plantas de composições de glifosato aquosas. A quantidade relativa de glifosato presente em uma composição herbicida compreendida (por exemplo, um concentrado sólido em partícula, concentrado líquido, composição pronta-para-uso e composição de mistura em tanque) pode variar dependendo de muitos fatores incluindo, por exemplo, a espécie da erva daninha a ser controlada e o método de aplicação. Falando de um modo geral, no entanto, a concentração de glifosato e, opcionalmente, um tensoativo e/ou algum outro adjuvante ou aditivo (conforme descrito em outro ponto aqui) usado na composição herbicida, é suficiente para controlar ervas daninhas dentro de uma área sob cultivo.
[000212] Uma composição de pulverização herbicida pode ser aplicada como uma solução ou dispersão aquosa, seja a composição fabricada pronta para aplicação ou resultante da diluição adicional de um concentrado de glifosato líquido ou da adição de água a um concentrado de glifosato sólido em partícula. No entanto, o termo “aquoso”, conforme aqui usado, inclui composições compreendendo uma quantidade pequena de solvente não aquoso, contanto que o solvente predominante seja água. Uma composição de pulverização herbicida pode ser aplicada à folhagem das plantas a serem tratadas através de qualquer um dos métodos apropriados que são bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica, incluindo técnicas de aplicação aérea e aplicação ao solo (por exemplo, um pulverizador terrestre de barra (ground boom), um pulverizador manual e um aplicador de mecha (rope-wick)).
[000213] Em alguns exemplos, uma composição concentrada líquida é formulada para incluir glifosato em uma concentração de pelo menos cerca de 50 gramas, pelo menos cerca de 75 gramas ou pelo menos cerca de 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690 ou 700 gramas (equivalentes ácidos ou a.e. (acid equivalente)) por litro ou mais. A faixa de concentração de glifosato pode ser, por exemplo, de a partir de cerca de 50 a cerca de 680 gramas (a.e.) por litro (gpl), de a partir de cerca de 100 a cerca de 600 gpl, de a partir de cerca de 250 a cerca de 600 gpl e de a partir de cerca de 360 a cerca de 540 gpl.
[000214] Quando expresso como uma porcentagem em peso com base no peso total do concentrado de glifosato, um concentrado líquido pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 10% em peso de glifosato (a.e.), pelo menos cerca de 15% em peso e pelo menos cerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67 ou 68% em peso ou mais. A faixa de concentração de glifosato pode ser, por exemplo, de a partir de cerca de 10% em peso a cerca de 70% em peso a.e., de a partir de cerca de 20% em peso a cerca de 68% em peso ou de a partir de cerca de 25% em peso a cerca de 45% em peso.
[000215] Se o glifosato for aplicado como uma composição pronta para uso, a concentração de glifosato pode ser, por exemplo, de a partir de cerca de 1% em peso a cerca de 3% em peso a.e. e de a partir de cerca de 1% em peso a cerca de 2% em peso.
[000216] As composições de pulverização podem ser formuladas para aplicação de, por exemplo, pelo menos cerca de 3,78 litros (1 galão) de composição de pulverização por acre, pelo menos cerca de 7,57 litros (2), 11,34 (3), 15,12 (4), 18,92 (5), 22,68 (6), 26,46 (7), 30,24 (8), 34,02 (9), 37,8 (10), 41,58 (11), 45,36 (12), 49,14 (13), 52,92 (14), 56,7 (15), 60,48 (16), 64,26 (17), 68,04 (18), 71,82 (19) ou 20 (75,7 litros) por acre e mais. O volume de pulverização da composição de pulverização pode variar, por exemplo, de a partir de cerca de 3,78 litros (1 galão) a cerca de 378,5 litros (100 galões) por acre, de a partir de cerca de 7,57 litros (2 galões) a cerca de 151,41 litros (40 galões) por acre e de a partir de cerca de 7,57 litros (2 galões) a cerca de 18,92 litros (5 galões) por acre para uma aplicação aérea, e de a partir de cerca de 18,92 litros (5 galões) a cerca de 75,7 litros (20 galões) por acre para uma aplicação ao solo.
[000217] Em alguns exemplos, uma formulação concentrada líquida tendo uma fase aquosa onde glifosato está presente predominantemente na forma de um sal e uma fase não aquosa contendo opcionalmente um segundo ingrediente ativo herbicida que é relativamente insolúvel em água pode ser empregada. Tais formulações podem incluir, por exemplo, emulsões (incluindo macroemulsões e microemulsões, tipos água-em-óleo, óleo-em-água e água-em-óleo-em- água), suspensões e suspoemulsões. A fase não aquosa pode compreender em certos casos um componente microencapsulado (por exemplo, um herbicida microencapsulado). Em formulações tendo uma fase não aquosa, a concentração de glifosato a.e. na composição como um todo pode não obstante estar dentro das faixas exemplares particulares mencionadas aqui para formulações concentradas aquosas.
[000218] Formas de sal adequadas de glifosato que podem ser usadas de acordo com qualquer uma das formulações incluem, por exemplo, sais de metal alcalino, por exemplo, sais de sódio e potássio, sais de amônio, sais de diamônio tais como dimetilamino, sais de alquilamina, por exemplo, sais de dimetilamina e isopropilamina, sais de alcanolamina, por exemplo, sais de etanolamina, sais de alquilsulfônio, por exemplo, sais de trimetilsulfônio, sais de sulfoxônio e misturas ou combinações dos mesmos. Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição: GLYPHOMAX®, GLYPHOMAZ® XRT, GLYPHOMAX® PLUS, DURANGO®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® ULTRAMAK, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIOACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK®, ACCORD® SP, ACCORD® XRT e ACCORD® CONCENTRATE, todos contêm glifosato como seu sal de isopropilamônio (IPA); ROUNDUP® DRY e RIVAL®, que contêm glifosato como seu sal de amônio; ROUNDUP® GEOFORCE, uma formulação de glifosato de sódio; TOUCHDOWN™, uma formulação de sal de glifosato trimésio, TOUCHDOWN® IQ, uma formulação de sal de glifosato diamônio, TOUCHDOWN® TOTAL IQ, uma formulação de glifosato potássico e ROUNDUP® WEATHERMAX, uma formulação de glifosato potássico. Formulações de glifosato podem incluir agentes de proteção, tensoativos e/ou adjuvantes.
[000219] Se desejado, o usuário pode misturar um ou mais adjuvantes com uma composição de glifosato e a água de diluição quando preparando uma formulação para aplicação. Tais adjuvantes podem incluir tensoativo e/ou um sal inorgânico adicional (por exemplo, sulfato de amônio) com o objetivo de aumentar mais a eficácia herbicida.
[000220] Se desejado, o usuário pode também empregar protetores apropriados em uma formulação de glifosato para proteger mais as plantas e/ou adicionar resistência cruzada a mais herbicidas. Protetores são agentes químicos que reduzem a fitotoxidez de herbicidas para plantas de cultura através de um mecanismo fisiológico ou molecular, sem comprometer a eficácia de controle de erva daninha. Os protetores tipicamente agem para aumentar o sistema imune de uma planta através da ativação/expressão de cP450. Protetores exemplares incluem, por exemplo e sem limitação: benoxacor, cloquintocete, ciometrinil, diclormida, diciclonon, dietolato, fenclorazol, fenclorim, flurazol, fluxofenim, furilazol, isoxadifeno, mefenpir, mefenato, anidrido naftálico e oxabetrinil.
[000221] Protetores podem ser usados para a proteção de culturas de gramíneas de semente grande, por exemplo e sem limitação, milho, sorgo em grão e arroz semeado a úmido, contra herbicidas incorporados pré-planta ou aplicados pré-emergência das famílias tiocarbamato e cloroacetanilida. Protetores também foram desenvolvidos para proteger culturas de cereal de inverno tal como trigo contra aplicações pós- emergência de herbicidas ariloxifenoxipropionato e sulfonilureia. O uso de protetores para a proteção de milho e arroz contra herbicidas sulfonilureia, imidazolinona, cicloexanodiona, isoxazol e tricetona é também bem estabelecido.
[000222] Ativadores de planta (uma nova classe de compostos que protege plantas através da ativação de seus mecanismos de defesa) podem ser também usados nas modalidades da presente invenção. Ativadores de planta exemplares incluem azibenzolar e probenazol.
[000223] As modalidades da presente invenção são definidas ainda nos Exemplos que seguem. Deve ser compreendido que esses Exemplos são dados a título de ilustração apenas. A partir da discussão acima e desses Exemplos, um versado na técnica pode determinar as características essenciais da presente invenção, e sem se afastar do espírito e escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações das modalidades da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Desta maneira, várias modificações das modalidades da invenção, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, serão aparentes àqueles versados na técnica a partir da descrição acima. Tais modificações também pretendem estar dentro do escopo das reivindicações apensas. O que segue é provido a título de ilustração e não pretende limitar o escopo da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1: Materiais e Métodos
[000224] As modalidades da presente invenção são descritas adicionalmente nos exemplos que seguem, que são oferecidos a título de ilustração e não pretendem limitar a invenção de modo algum.
[000225] Uma mutação de aminoácido única (G96A) na enzima 5- enolpiruvilshiquimato 3-fosfato sintase de Escherichia coli (EPSPS sintase) pode resultar em insensibilidade a glifosato (Padgette e outros (1991); Eschenburg e outros (2002); Priestman e outros (2005); Haghani e outros (2008)). Embora esta mutação confira tolerância a glifosato, ela é também conhecida afetar de modo adverso ligação de EPSPS sintase com seu substrato natural, fosfoenolpiruvato (PEP). A mudança resultante em eficiência de ligação de substrato pode tornar uma enzima mutada inadequada para provisão de tolerância in planta a glifosato.
[000226] O banco de dados NCBI Genbank foi avaliado in silico quanto à proteína EPSP sintase e sequências de polinucleotídeo que contêm naturalmente uma alanina em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase àquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima (Padgette e outros (1991); Eschenburg e outros (2002); Priestman e outros (2005); Haghani e outros (2008)).
[000227] Uma enzima que foi identificada conter uma alanina natural nesta posição foi DGT-28 (GENBANK ACC NO: ZP_06917240.1) de Streptomyces sviceus ATCC29083. Exploração de dados in silico adicionais revelou três outras enzimas de Streptomyces únicas com homologia maior com DGT-28; DGT-31 (GENBANK ACC NO:YP_004922608.1); DGT-32 (GENBANK ACC NO: ZP_04696613); e DGT-33 (GENBANK ACC NO: NC_010572). Cada uma dessas enzimas contém uma alanina natural em uma posição análoga dentro da enzima EPSP sintase àquela da mutação G96A que foi introduzida na versão de E. coli da enzima. FIG. 1.
[000228] Devido ao fato das proteínas EPSP sintase de organismos diferentes serem de comprimentos diferentes, a numeração da mutação para a versão de E. coli da enzima EPSP sintase não necessariamente corresponde à numeração da mutação para as enzimas EPSP sintase de outros organismos. Essas enzimas EPSP sintase identificadas não foram anteriormente caracterizadas com relação à tolerância a glifosato ou afinidade com o substrato de PEP. Ainda, essas enzimas EPSP sintase representam uma nova classe de enzimas EPSP sintase e não contêm quaisquer motivos de sequência que tenham sido usados para caracterizar previamente enzimas EPSP sintase Classe I (sequências derivadas de planta descritas adicionalmente na Patente U.S. No. RE39247), II (sequências bacterialmente derivadas descritas adicionalmente na Patente U.S. No. RE39247) e III (sequências bacterialmente derivadas descritas adicionalmente no Pedido de Patente Internacional WO 2006/110586).
[000229] As enzimas DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33 novas foram caracterizadas por tolerância a glifosato e afinidade com substrato de PEP através de comparação com enzimas EPSP sintase Classe I. As enzimas Classe I que seguem: DGT-1 de Glycine max, DGT-3 de Brassica napus (GENBANK ACC NO: P17688) e DGT-7 de Triticum aestivum (GENBANK ACC NO: EU977181) foram para comparação. As enzimas EPSP sintase Classe I e suas variantes mutantes foram sintetizadas e avaliadas. Uma mutação introduzida nas enzimas EPSP sintase de planta consistia na mutação Glicina para Alanina feita dentro da enzima EPSP sintase em um local similar àquele da mutação G96A da versão de E. coli da enzima. Ainda, mutações Treonina para Isoleucina e Prolina para Serina foram introduzidas nessas enzimas EPSP sintase Classe I em posições análogas àquela do aminoácido 97 (T a I) e aminoácido 101 (P a S) na EPSP sintase de E. coli conforme descrito em Funke e outros (2009).
[000230] A FIG. 1 mostra um alinhamento de sequência parcial de DGT-28, DGT-31, DGT-32 e DGT-33 com outras enzimas EPSP sintase. Todas as quatro enzimas DGT compartilham uma alanina conservada na posição 96 de aminoácido da enzima EPSP sintase aroA. A localização deste aminoácido é indicada por um asterisco e o resíduo de aminoácido é sublinhado.
[000231] A FIG. 2 mostra um alinhamento das enzimas DGT-1, DGT-3 e DGT-7. A localização do resíduo de aminoácido que foi mutado de glicina para alanina é indicada pelo primeiro asterisco. A localização do resíduo de aminoácido que foi mutado de treonina para isoleucina é indicada pelo segundo asterisco. A localização do terceiro resíduo de aminoácido que foi mutado de prolina para serina é indicada pelo terceiro asterisco. Essas mutações foram introduzidas em versões diferentes de DGT-1, DGT-3 e DGT-7. As versões diferentes (v1, v2, v3...vN) dos genes que contêm as mutações são descritas em mais detalhes abaixo. Exemplo 2: Otimização de Sequência para Expressão em Plantas e Bactérias
[000232] Otimização de Planta: Tendência de códon para dicotiledôneas e monocotiledôneas (milho) foi calculada como a frequência na qual um códon único é usado com relação aos códons para todos os aminoácidos. Tabela 1. Alternativamente, a tendência de códon pode ser calculada como a frequência na qual um códon único é usado para codificar um aminoácido particular, com relação a todos os outros códons para este aminoácido (códons sinônimos). No projeto de regiões de codificação para expressão de planta, os códons primários (“primeira escolha”) preferidos pela planta foram determinados, bem como as segunda, terceira, quarta, etc, escolhas de códons preferidos quando escolhas múltiplas existem.
[000233] Análise da sequência de codificação de DGT-28 de S. sviceus revelou a presença de vários motivos de sequência que eram acreditados ser prejudiciais para expressão de planta ótima, bem como uma composição de códon não ótima para expressão em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.
[000234] Tabela 1. Representação de códon sinônimo de regiões de codificação de genes de planta monocotiledônea (% de milho) e dicotiledônea (% dicot) é mostradas nas Colunas D, E, I e J. Valores para um conjunto de representação de códon com tendência a equilíbrio para um projeto de gene sintético otimizado em planta estão nas Colunas C e H.
Figure img0001
*DNU = NÃO USAR
[000235] Para engenheirar os genes otimizados em planta codificando uma proteína DGT-28, sequências de DNA foram projetadas para codificar as sequências de aminoácido, utilizando um códon genético redundante estabelecido a partir da tabela de tendência de códon compilada a partir das sequências de codificação de proteína para as plantas hospedeiro particulares. Na Tabela 1, as Colunas D e I apresentam as distribuições (em % do uso para todos os códons para este aminoácido) de códons sinônimos para cada aminoácido, conforme encontrado nas regiões de codificação de plantas monocotiledôneas (milho). As colunas E e J apresentam a distribuição (em % de uso para todos os códons para este aminoácido) de códons sinônimos para cada aminoácido, conforme encontrado nas regiões de codificação de plantas dicotiledôneas. Alguns códons sinônimos para alguns aminoácidos são encontrados apenas raramente em genes de planta (por exemplo, CGG). Geralmente, um códon foi considerado ser raramente usado se ele for representado em cerca de 10% ou menos do tempo para codificar o aminoácido relevante em genes de qualquer tipo de planta (indicado por DNU nas Colunas C e H da Tabela 1). Para equilibrar a distribuição das escolhas de códon restantes para um aminoácido, uma representação de Média Ponderada para cada códon foi calculada usando a fórmula: % Média Ponderada de C1 = 1/(%C1 + %C2 + %C3 + etc.) x %C1 x 100, (1) onde C1 é o códon em questão e C2%, C3%, etc, representam a média dos valores % para dicotiledôneas de códons sinônimos restantes (valores % médios para os códons relevantes são obtidos das Colunas C e H) da Tabela 1.
[000236] O valor % Média Ponderal para cada códon é dado nas Colunas C e H da Tabela 1.
[000237] Usando o procedimento acima, uma nova sequência de DNA que codifica essencialmente a sequência de aminoácido da proteína DGT-28 foi projetada para expressão ótima em plantas dicotiledôneas, usando uma distribuição de códon equilibrada de códons frequentemente usados encontrados em genes de planta dicotiledôneas. Uma segunda sequência de DNA que codifica essencialmente a sequência de aminoácido da proteína DGT-28 foi projetada para expressão ótima em plantas monocotiledôneas, usando uma distribuição de códon equilibrada de códons frequentemente usados encontrados em genes de planta monocotiledônea. As duas novas sequências de DNA diferiam das sequências de DNA originais codificando dgt-28 pela substituição de códons de planta (primeiro preferido, segundo preferido, terceiro preferido ou quarto preferido) para especificar o aminoácido apropriado em cada posição dentro da sequência de aminoácido da proteína.
[000238] Projeto das sequências de DNA otimizadas na planta foi iniciado através da tradução reversa das sequências de proteína da sequência de proteína DGT-28 (No. Acesso Genbank: ZP_06917240.1). A SEQ ID NO:1 sofreu tradução reversa usando uma tabela de tendência de códon dicotiledôneo construída a partir da Tabela 1; Colunas E e J. Uma segunda tradução reversa de SEQ ID NO:1 foi completada usando uma tabela de tendência de códon monocotiledôneo construída a partir da Tabela 1; Colunas D e I.
[000239] As sequências de tradução reversa iniciais foram então modificadas através da compensação de mudanças de códon (enquanto retendo a representação de códon ponderal média geral) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzima de restrição, remover estruturas secundárias intrafita altamente estáveis e remover outras sequências que pudessem ser prejudiciais para clonagem de manipulações ou expressão do gene engenheirado em plantas. A sequência de DNA foi então novamente analisada quanto a sítios de reconhecimento de enzima de restrição que poderiam ser criados pelas modificações. Os sítios identificados foram modificados adicionalmente através da substituição dos códons relevantes com primeiros, segundos, terceiros ou quartos códons preferidos de escolha. Outros sítios nas sequências que poderiam afetar a transcrição ou tradução do gene de interesse incluem as junções exon:íntron (5’ ou 3’), sítios de adição de poli A e sinais de terminação de polimerase de RNA. As sequências modificadas foram analisadas adicionalmente e modificadas adicionalmente para reduzir a frequência de dupletos TA ou CG e aumentar a frequência de dupletos TG ou CT. Em adição a esses dupletos, blocos de sequência que têm mais do que seis resíduos consecutivos de [G+C] ou [A+T] podem afetar a transcrição ou tradução da sequência. Desta maneira, esses blocos de sequência foram também modificados através da substituição dos códons de primeira ou segunda escolha, etc, com outros códons de escolha preferidos. Códons raramente usados não foram incluídos a um ponto substancial no projeto de gene, sendo usados apenas quando necessário para acomodar um critério de projeto diferente da composição de códon, per se (por exemplo, adição ou deleção de sítios de reconhecimento de enzima de restrição).
[000240] A sequência de polinucleotídeo dgt-28 v5 otimizada em planta dicotiledônea, recém-projetada, é listada na SEQ ID NO:2. A sequência de polinucleotídeo dgt-28 v6 otimizada em planta monocotiledônea, recém-projetada, é listada na SEQ ID NO:3; esta sequência foi ligeiramente modificada incluindo uma alanina na segunda posição de aminoácido para introduzir um sítio de enzima de restrição. As sequências de DNA resultantes têm um grau maior de diversidade de códon, uma composição de base desejável, contém sítios de reconhecimento de enzima de restrição estrategicamente dispostos e não têm sequências que pudessem interferir com transcrição do gene ou tradução do mRNA de produto.
[000241] Síntese de fragmentos de DNA compreendendo SEQ IDNO:2 e SEQ ID NO:3 contendo sequências adicionais, tais como 6- frame stops (códons de paradas localizados em todas as seis estruturas de leitura que são adicionadas à extremidade 3’ da sequência de codificação) e um sítio de restrição 5’ para clonagem foi realizada por fornecedores comerciais (DNA2.0, Menlo Park, CA). A molécula de ácido nucleico sintética foi então clonada em vetores de expressão e transformada em plantas ou bactérias conforme descrito nos Exemplos abaixo.
[000242] Estratégias de otimização de códon similares foram usadas para projetar dgt-1, dgt-3 v2 (G173A), dgt-3 v3 (G173A; P178S), dgt-3 v4 (T174I; P178S), dgt-7 v4 (T168I; P172S), dgt-32 v3, dgt-33 v3 e dgt-33 v3. As versões otimizadas no códon desses genes são listadas como SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, e SEQ ID NO:144, respectivamente.
[000243] Otimização Bacteriana. Uma nova sequência de DNA que codifica a proteína DGT-28 de SEQ ID NO:1 que é otimizada para expressão em células de Escherichia coli foi projetada. Projeto da sequência de DNA otimizada em E. coli foi iniciado através de tradução reversa da sequência de proteína de SEQ ID NO:1 usando um protocolo de otimização de códon da proprietária da GeneArt (Regensburg, Alemanha). A sequência inicial foi modificada através da compensação de mudanças de códon (enquanto retendo a representação média ponderada geral) para remover ou adicionar sítios de reconhecimento de enzima de restrição e remover estruturas secundárias intrafita altamente estáveis e outras sequências que pudessem ser prejudiciais para manipulações de clonagem ou expressão do gene engenheirado. Um exemplo de tal sequência prejudicial para evitar dentro de uma região de codificação é uma sequência de ligação de RNA ribossomal 16S (“sequência Shine-Dalgarno”) tal como AGGAGG, que codificaria, por exemplo, dois aminoácidos arginina consecutivos, mas que também serviria como um sinal de início de tradução intragênico (e então indesejável). A sequência de DNA de dgt-28 com tendência a E. coli (v1 dgt-28) que codifica a proteína de SEQ ID NO:1 é dada como SEQ ID NO:4.
[000244] Para facilitar clonagem e assegurar início de tradução eficiente, uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição NdeI terminal 5’ foi posta a montante do códon de início de tradução ATG. Também para facilitar clonagem, e assegurar terminação de tradução apropriada, bases codificando dois códons de parada de tradução de TAA e um sítio de reconhecimento de enzima de restrição XhoI foram incluídas na extremidade 3’ da região de codificação. Síntese de um fragmento de DNA compreendendo SEQ ID NO:4 foi realizada pelo fornecedor comercial, GeneArt®.
[000245] Estratégias de otimização de códon de E. coli similares foram usadas para projetar dgt-1 v5, dgt-1 v6 (G112A), dgt-1 v7 (G112A; P117S), dgt-1 v8 (T113I; P117S), dgt-3 v6 (G105A), dgt-3 v7 (G105A; P112S), dgt-3 v8 (T106I; P112S), dgt-7 v5, dgt-7 v6 (G113A), dgt-7 v7 (G113A; P117S), dgt-7 v8 (T114I; P117S), dgt-32 v5 e dgt-33 v5. As versões das sequências dgt-1, dgt-3 e dgt-7 foram modificadas pela remoção da sequência de direcionamento a cloroplasto. As versões otimizadas no códon de E. coli desses genes são listadas como SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24, respectivamente. Exemplo 3: Vetores para Expressão Bacteriana de Genes de Tolerância a Glifosato
[000246] Construção de Vetor de Expressão pET, dgt-28 para Expresão em E. coli. Para teste in vitro, a sequência de gene otimizada em E. coli dgt-28 v1 (SEQ ID NO:4) foi sintetizada e clonada por GeneArt® para síntese e clonagem. A sequência de gene dgt-28 v1 sintetizada foi clonada no vetor de expressão pET28 através dos sítios de restrição Nde I e Xho I. A construção resultante introduziu um marcador His 6X N-terminal e foi marcada como pDAB100445. FIG. 14.
[000247] Mutagênese Direcionada a Sítio de dgt-28 v1. Mutagênese direcionada a sítio foi realizada em dgt-28 v1 para avaliar o papel da alanina na posição 84 na provisão de tolerância a glifosato. Esta alanina natural foi mutada para glicina para determinar se a mudança diminuiria a tolerância da enzima a glifosato ou afinidade com PEP. Este resíduo de aminoácido foi selecionado, uma vez que ele corresponde à mutação G96A que foi introduzida na EPSP sintase de E. coli conforme anteriormente descrito.
[000248] O Quick Change II® kit da Stratagene® (Santa Clara, CA) foi usado para realizar a mutagênese. Reações de PCR foram ajustadas de acordo com o protocolo QuickChange® usando pDAB100445 (v1 dgt- 28) como DNA modelo. O construto contendo a sequência de gene dgt- 28 v2 mutada foi chamado pDAB102946 (FIG. 15) e confirmado através de sequenciamento de DNA. Os iniciadores que seguem foram projetados para fazer a mudança de aminoácido: DGT28 MutF (SEQ ID NO:25; 5 gATgTTTATTgCCgTgATggTggAACCACCgCACgTT TTC) DGT28 MutR (SEQ ID NO:26; 5 gAAAACgTgCggTggTTCCACCATCACggCAATAAA CATC)
[000249] Uma segunda rodada de mutagênese foi realizada em dgt- 28 v2 em uma tentativa de diminuir mais sua tolerância a glifosato. Uma segunda mutação, T172A, foi introduzida no dgt-28 v2 já mutagenizado. A mutação alanina para treonina recíproca de EPSPS sintase nesta posição foi anteriormente descrita em Haghani e outros (2008), onde ela resultou em insensibilidade a glifosato. O resultado final foi a produção de um mutante A84G, T172A duplo que foi nomeado dgt-28 v3. Reações de PCR foram ajustadas de acordo com o protocolo QuickChange® usando pDAB102946 (v2 dgt-28) como DNA modelo. O construto contendo a sequência de gene dgt-28 v3 mutada foi nomeado pDAB100469 (FIG. 16). Os iniciadores que seguem foram usados para produzir a mutação T172A: DGT28 Mut2F (SEQ ID NO:27; 5 gggTCCgCTggCACgTCAgggTCTgCgTATTCg) DGT28 Mut2R (SEQ ID NO:28; 5 CgAATACgCAgACCCTgACgTgCCAgCggACCCAg CAgC)
[000250] Construções Adicionais, Vetor de Expressão pEt para Expressão de E. coli. Para teste in vitro, as sequências de gene dgt-1 v5, dgt-1 v6, dgt-1 v7, dgt-1 v8, dgt-3 v6, dgt-3 v7, dgt-3 v8, dgt-7 v5, dgt- 7 v6, dgt-7 v7, dgt-7 v8, dgt-32 v5 e dgt-33 v5 foram sintetizadas e clonadas (GeneArt®). Os genes sintetizados foram clonados no vetor de expressão pET28. As construções resultantes foram identificadas como pDAB102028 (FIG. 17) contendo dgt-1 v5, pDAB102029 (FIG. 18) contendo dgt-1 v6, pDAB102032 (FIG. 19) contendo dgt-1 v7, pDAB102034 (FIG. 20) contendo dgt-1 v8, pDAB100429 (FIG. 21) contendo dgt-3 v6, pDAB100442 (FIG. 22) contendo dgt-3 v7, pDAB100430 (FIG. 23) contendo dgt-3 v8, pDAB102036 (FIG. 24) contendo dgt-7 v5, pDAB102038 (FIG. 25) contendo dgt-7 v6, pDAB102040 (FIG. 26) contendo dgt-7 v7 e pDAB102042 (FIG. 27) contendo dgt-7 v8.
[000251] Clonagem de DGT-32 e DGT-33. Para teste in vitro, os genes otimizados em planta que seguem, dgt-32 v3 e dgt-33 v3, foram amplificados dos vetores binários pDAB107532 (FIG. 11) e pDAB107534 (FIG. 12), respectivamente. Os conjuntos de iniciador que seguem foram usados: pMALDGT32F (SEQ ID NO:29; CATATGACCGTTATTGAAATTCCGGG) e pMALDGT32R (SEQ ID NO:30; GATATCCTATTATTAACGACCTTCCAG) para dgt-3 2, e pMALDGT33F (SEQ ID NO:31; CATATGGGTGCAGTTACCGTTATTGA), pMALDGT33R(SEQ ID NO:32; GATATCCTATTATTATGCCTGCGGAC) para dgt-3 3.
[000252] As sequências amplificadas foram então subclonadas em pMAL-c5X de maneira que cada gene era uma fusão em estrutura com a sequência de codificação malE. Os construtos de expressão finais eram pDAB107713 (FIG. 29) contendo dgt-32 v3 e pDAB107714 (FIG. 30) contendo dgt-33 v3.
Exemplo 4: Ensaio Cinético Enzimático Bioquímico In Vitro
[000253] Superexpressão e Purificação de Enzimas DGT Recombinantes. Proteínas DGT recombinantes foram superexpressas em células Rosetta2® (DE3) (Novagen®, Madison, WI) a partir dos construtos descritos acima. Uma colônia única foi usada para inocular 50 mL de culturas de partida de LB contendo cloranfenicol (25 μg/mL) e canamicina (50 μg/mL) que foram cultivadas de um dia para o outro a 37° C. As culturas de um dia para o outro foram usadas para inocular 1L de LB contendo cloranfenicol (25 μg/mL) e canamicina (50 μg/mL). As culturas foram cultivadas a 37° C para um O.D.600 = 0,6, então postas em um banho de água gelada por 10 minutos. Expressão das proteínas alvo foi obtida através da adição de IPTG para uma concentração final de 500 μM.
[000254] A indução foi deixada prosseguir de um dia para o outro a 20° C seguido por coleta via centrifugação a 8.000 rpm por 20 minutos. Os péletes celulares foram armazenados a -80° C até necessários para purificação. Todas as etapas de purificação foram realizadas a 4° C. Péletes de célula de culturas de 1L foram ressuspensos em 20-30 mL de Tampão A (HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, imidazol 20 mM e glicerol 5%). Coquetel inibidor de protease COMPLETE® (1 comprimido/50 mL, Roche, Indianápolis, IN) e lisozima (1 mg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram então adicionados e a suspensão foi agitada por 20 minutos. Lise celular foi realizada usando um Branson® Sonifier® 250 (explosões de 3 x 60 segundos) seguido por remoção dos restos celulares por centrifugação a 16.000 rpm por 45 minutos.
[000255] Enzimas DGT foram purificadas até a homogeneidade em uma etapa através de cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) (Immobilized Metal Affinity Chromatography) usando uma coluna bruta FF HisTrap de 5 mL. A coluna foi equilibrada em Tampão A e a amostra foi carregada no mesmo tampão. A coluna foi então lavada com 10 volumes de coluna de Tampão A seguido por eluição em um gradiente linear de Tampão B 0-100% (HEPES 50 mM pH 7,5, KCl 200 mM, DTT 2 mM, EDTA 1 mM, imidazol 500 mM e glicerol 5%) em 25 volumes de coluna. Frações contendo proteína alvo, conforme julgado por análise SDS-PAGE, foram concentradas para 2,5 mL usando um dispositivo de ultracentrifugação Millipore equipado com um peso molecular de corte (MWCO) (Molecular Weight Cut-off) de 10 kDa. As enzimas DGT purificadas tiveram tampão trocado usando colunas PD-10 (GE Healthcare) em HEPES 50 mM pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 2 mM e glicerol 5% e subsequentemente concentradas ~1 mL. As amostras foram tipicamente diluídas 1:50 e o espectro visível UV foi registrado de 240-700 nm em um espectrofotômetro visível em UV Cary50® Bio. Um coeficiente de extensão teórico foi então usado para calcular a concentração de proteína com base na absorbância a 280 nm (ExPASy, Geneva, Suíça).
[000256] Expressão e Purificação de Fusões de DGT-32 e DGT-33 Recombinantes. As enzimas DGT-32 e DGT-33 foram construídas para conter um marcador de fusão de maltose localizado no terminal amino da enzima. Células de Escherichia coli transformadas com pDAB107712 (Fig. 28), pDAB107713 e pDAB107714 foram isoladas e confirmadas. Uma colônia única de cada linhagem bacteriana foi usada para inocular 50 mL de meio LB contendo 100 μg/μL de carbenicilina e 25 μg/μL de cloranfenicol. A cultura de partida foi cultivada de um dia para o outro a 37° C e subsequentemente usada para inocular 600 mL de meio LB suplementado com glicose 0,2%, 100 μg/μL de carbenicilina e 25 μg/μL de cloranfenicol. As culturas foram cultivadas a 37° C para um OD600 = 0,4 ponto no qual IPTG foi adicionado para uma concentração final de 50 μM de IPTG. As culturas foram induzidas por 15 horas a 18° C. No dia seguinte as culturas foram coletadas através de centrifugação a 8.000 rpm por 20 minutos para peletizar as células. A pasta de célula foi armazenada a -80° C até ser requerida para purificação.
[000257] Péletes congelados foram ressuspensos em 20-30 mL de tampão A (HEPES 50 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, EDTA 1 mM, glicerol 5% e DTT 1 mM) e 1 comprimido de inibidor de protease (Roche Complete). Uma vez o pélete completamente ressolubilizado 1 mg/mL de lisozima foi adicionado e a amostra foi misturada a 4° C por 15-20 minutos. Seguindo a incubação com a lisozima a amostra foi transferida para um tubo de centrifuga de 50 mL e posta em gelo. A amostra foi então sonificada por intervalos de 1 minutos seguido por 4 minutos de esfriamento. Esta etapa foi repetida mais duas vezes para um total de três ciclos de sonificação. Restos celulares foram removidos através de centrifugação a 16.500 rpm por 45 minutos e o sobrenadante foi carregado em um septo de injeção de 50 mL. O lisato bruto foi aplicado a uma coluna de amilose, lavado para 7 volumes de coluna com tampão A e eluído em tampão B 100% (Tampão A e maltose 10 mM). A proteína alvo foi agrupada e concentrada para 2,5 mL usando um centricon MWCO 30 kDa. A proteína purificada teve tampão trocado para HEPES 50 mM pH 7,5, KCl 100 mM e glicerol 5% usando uma coluna de filtragem em gel PD-10. As concentrações de proteína foram determinadas via ensaio Bradford usando BSA como um padrão. A proteína pura foi congelada em nitrogênio líquido e armazenada a -80° C.
[000258] Caracterização Cinética In Vitro de Enzimas DGT de Planta e Bacterianas. As atividades de enzima de DGTs do tipo selvagem (WT) e mutantes foram medidas através de produção de fosfato inorgânico (Pi) em um procedimento modificado descrito por Lanzetta e outros (1979) Anal. Biochem. 100:95-7. Os ensaios foram realizados em um formato de placa de 96 poços em um total de 50 μL em uma leitora de placa Spectra-Max 190 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Ensaios típicos continham HEPES 50 mM pH 7,5, KCl 150 mM, DTT 2 mM e S3P 1 mM. As concentrações de PEP e glifosato foram variadas conforme indicado. Glifosato foi obtido da Sigma como o ácido livre e foi ressuspenso em ddH2O. Glifosato foi solubilizado através da adição de KOH até que a mistura estivesse em um pH neutro. Os ensaios foram iniciados através da adição da enzima DGT em concentrações que variaram entre 0,01-1 μM. As reações foram terminadas através da adição de 235 μL e uma mistura 3:1 de solução de verde malaquita:molibdato de amônio. Após desenvolvimento de cor completo (~1 minuto), a mudança de absorbância a 660 nm foi registrada e a quantidade de Pi formado foi calculada a partir de uma curva padrão. Reações controle sem enzima foram usadas para corrigir a absorbância de base. Concentrações altas de PEP (>2 mM) e glifosato (>30 mM) contribuem com uma quantidade significante de absorbância de base usando este método de detecção. Os dados foram ajustados à equação Michaelis-Menten que permitiu a determinação de Km e Vmax (Equação 3) enquanto IC50 foi determinada a partir da Equação 4, onde y é a atividade relativa e s é o coeficiente Hill. Os dados foram analisados usando software GraFit® versão 5 (Erithacus Software Limited, Horley, R.U.).
Figure img0002
[000259] O valor de IC50 para um inibidor competitivo mudará dependendo da concentração de substrato, desta maneira os valores de IC50 na Tabela 2 foram obtidos em PEP 1 mM e em PEP 60 μM (uma estimativa das concentrações de PEP intracelulares em plantas). Apenas os valores IC50 medidos na mesma concentração de PEP devem ser comparados (determinações de Km para DGT-32 e DGT-33 foram determinadas em PEP 100 μM). Ainda, valores IC50 de enzimas altamente tolerantes não puderam ser determinados com precisão através do método de Lanzetta e foram então estimados com base em atividade relativa.
[000260] Cinéticas de DGTs de Planta. Duas enzimas com sequências nativas não mutadas, DGT-1 v5 e DGT-7 v5, foram testadas primeiro para estabelecer parâmetros de linha de base para sensibilidade a glifosato. Ambas as proteínas exibiram valores Km baixos para PEP (~70 μM) e eram sensíveis a glifosato com valores IC50 de ~20 μM (Tabela 2) em PEP 1 mM. Conforme observado para DGT-1 v6, GDT-3 v6 e DGT-7 v6, uma mutação por ponto única de G para A melhorou significantemente a tolerância a glifosato (valores IC50 de 8-21 mM), mas também aumentou a Km para PEP em ~8 vezes. A mutação dupla (GAPS), para todas as DGTs derivadas de planta (DGT-1 v7, DGT-3 v7 e DGT-7 v7), também aumentou a tolerância a glifosato, mas novamente resultou em uma elevação considerável em Km PEP. Os mutantes TIPS (DGT-1 v8, DGT-3 v8 e DGT-7 v8) eram tolerantes a concentrações modestas de glifosato (3-6 mM), mas em contraste para os mutantes GA e GAPS, os níveis de Km permaneceram próximos das proteínas do tipo selvagem entre 60-200 μM. A FIG. 31 demonstra as mudanças em tolerância a glifosato para DGT-1 (A) e DGT-7 (B) quando da introdução das mutações específicas. A concentração de PEP foi mantida a 1 mM para os experimentos resultando nos dados mostrados na FIG. 31, o que provavelmente levou à IC50 elevada (>80 mM) para DGT-7 v8. Procedimentos adicionais foram realizados para determinar se níveis menores de PEP alteraram a tolerância relativa a glifosato. Níveis fisiologicamente relevantes de PEP variam de 5-60 μM. Com 60 μM de PEP, o valor de IC50 diminuiu significantemente (3,6 mM), sugerindo que a determinação inicial foi influenciada por PEP em excesso, conforme esperado da cinética Michaelis-Menten e mencionado na Tabela 2.
[000261] A FIG. 31 mostra valores de IC50 obtidos após introdução de várias mutações em DGT-1 (A) e DGT-7 (B) usando PEP 1 mM. Para ambas as curvas de IC50 A e B triângulos fechados representam tipo selvagem, círculos fechados representam mutantes GA, quadrados abertos representam mutantes GAPS e quadrados fechados representam mutantes TIPS.
[000262] Tabela 2. Parâmetros cinéticos de estado uniforme para enzimas DGT. Valores IC50 maiores do que 50 são estimados devido a limitações do método usado. *IC50 para glifosato foi determinada em PEP 100 μM.
Figure img0003
[000263] Cinética de DGTs Bacterianas. Das enzimas bacterianas, DGT-28 v1 possui os parâmetros cinéticos gerais mais favoráveis (valores de IC50 e kcat/Km elevados). A enzima era tolerante a glifosato nas concentrações >80 mM e exibiu uma eficiência catalítica de 1,32 x 105 M-1 s-1. A mutação A^G em DGT-28 v2 diminuiu a IC50 para 2,17 mM (em PEP 60 μM) e causou uma ligeira elevação na Km para PEP (161 μM). Esta enzima mutante retém a eficiência catalítica alta vista em DGT-28 v1. Mesmo com uma IC50 menor, esta enzima mutada é adequada para provisão de tolerância a glifosato in planta em certas aplicações. Os dados sugerem que nesta nova classe de EPSP sintase, a alanina não é o único determinante para tolerância a glifosato. Para explorar outros possíveis determinantes uma variante adicional, DGT- 28 v3 (mutante duplo A84G T172A) foi construída. Esta enzima exibiu tolerância menor a glifosato com um valor IC50 de 5,15 mM (em 60 μM de PEP). A diminuição em IC50 para DGT-28 v3 foi acompanhada por uma diminuição de 200 vezes em eficiência catalítica, sugerindo que a segunda mutação levou a efeitos não intencionais (Tabela 2). Os homólogos de DGT-28 v1 de identidade maior (identidade de aminoácido ~75%), DGT-32 e DGT-33, tinham Km’s baixas para PEP (~114-139 μM), no entanto, as eficiências catalíticas eram 100 vezes menores do que DGT-28 v1. Esta queda em eficiência catalítica é provavelmente derivada da fusão da proteína de ligação à maltose (MBP) (Maltose Binding Protein). As enzimas são também insensíveis a glifosato exibindo valores IC50 maiores do que 50 mM. Como um resultado desses ensaios in vitro, que indicaram que as várias enzimas DGT proveram tolerância a glifosato, as enzimas DGT foram testadas in planta.
Exemplo 5: Clonagem de Vetores de Transformação de Planta
[000264] Construção de Vetor Binário de Planta. Métodos de clonagem padrão foram usados na construção de vetores de entrada contendo uma sequência de polinucleotídeo de peptídeo de trânsito de cloroplasto unida a dgt-28 como uma fusão em estrutura. Os vetores de entrada contendo um peptídeo de trânsito (TraP) fundido a dgt-28 foram montados usando a IN-FUSION® Advantage Technology (Clontech, Mountain View, CA). Como um resultado da fusão, o primeiro aminoácido, metionina, foi removido de dgt-28. Peptídeos de trânsitoTraP4 v2 (SEQ ID NO:33), TraP5 v2 (SEQ ID NO:34), TraP8 v2 (SEQ ID NO:35), TraP9 v2 (SEQ ID NO:36), TraP12 v2 (SEQ ID NO:37) e TraP13 v2 (SEQ ID NO:38) foram cada um sintetizados através de DNA2.0 (Menlo Park, CA) e fundidos ao fragmento de extremidade 5’ de dgt-28, até e incluindo um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição AccI único.
[000265] Plasmídeos binários que continham os vários cassetes de expressão de TraP e dgt-28 foram direcionados pelo promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (AtUbi10 v2; Callis, e outros (1990) J. Biol. Chem., 265: 12486-12493) e flanqueados pela região não traduzida 3’ vinte e três da estrutura de leitura aberta (AtuORF23 3‘ UTR v1; Pat. U.S. No. 5.428.147).
[000266] Os cassetes de expressão de TraP e dgt-28 montados foram engenheirados usando GATEWAY® Technology (Invitrogen, Carlsbad, CA) e transformados em plantas através de transformação de planta mediada por Agrobacterium. Endonucleases de restrição foram obtidas da New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) e Ligase de DNA T4 (Invitrogen) foi usada para ligação de DNA. Reações Gateway foram realizadas usando mistura de enzima GATEWAY® LR CLONASE® (Invitrogen) para montagem de um vetor de entrada em um vetor de destino único que continha o cassete marcador selecionável promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV v2; Verdaguer e outros (1996) Plant Mol. Biol., 31: 11291139) - DSM-2 (Pedido de Patente U.S. No. 2007/086813) - região não traduzida 3’ um da estrutura de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3’ UTR v6; Huang e outros (1990) J. Bacteriol. 172:1814-1822). Preparações de plasmídeo foram realizadas usando NUCLEOSPIN® Plasmid Kit (Macherey-Nagel Inc., Bethlehem, PA) ou o Plasmid Midi Kit (Qiagen) seguindo as instruções dos fornecedores. Fragmentos de DNA foram isolados usando QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen) após eletroforese em gel de agarose Tris-acetato.
[000267] Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente avaliadas através de digestão com restrição de DNA miniprep. DNA de plasmídeo de clones selecionados foi sequenciado por um vendedor de sequenciamento comercial (Eurofins® MWG Operon, Huntsville, AL). Dados de sequência foram montados e analisados usando o software SEQUENCHER® (Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI).
[000268] Os construtos binários que seguem expressam as várias sequências de gene de fusão TraP:dgt-28: pDAB107527 (FIG. 3) contém TraP4 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:79); pDAB105530 (FIG. 4) contém TraP5 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:80); pDAB105531 (FIG. 5) contém TraP8 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:81); PDAB105532 (FIG. 6) contém TraP9 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:82); pDAB105533 (FIG. 7) contém TraP12 v2: dgt-28 v5 (SEQ ID NO:83); e pDAB105534 (FIG. 8) contém TraP13 v2:dgt-28 v5 (SEQ ID NO:84). A sequência de dgt- 28 v5 de pDAB105534 foi modificada onde o primeiro códon (GCA) foi mudado para (GCT).
[000269] Construção de Vetor Binário de Planta Adicional. Estratégias de clonagem similares àquelas descritas acima foram usadas para construir plasmídeos binários que contêm dgt-31, dgt- 32, dgt-33, dgt-1, dgt-3 e dgt-7.
[000270] Os genes microbialmente derivados, dgt-31, dgt-32 e dgt- 33, foram fundidos com peptídeos de trânsito de cloroplasto diferentes dos descritos anteriormente. Os peptídeos de trânsito de cloroplasto que seguem foram usados: TraP14 v2 (SEQ ID NO:39), TraP23 v2 (SEQ ID NO:40), TraP24 v2 (SEQ ID NO:41). pDAB107532 (FIG. 11) contém dgt-32 v3 fundido a TraP14 v2 (SEQ ID NO:42), pDAB107534 (FIG. 12) contém dgt-33 v3 fundido a TraP24 v2 (SEQ ID NO:43) e pDAB 1017533 (FIG. 54) contém dgt-31 v3 fundido a TraP23 v2 (SEQ ID NO:143). Os cassetes de expressão de dgt foram direcionados pelo promotor da Ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (promotor AtUbi10 v2) e flanqueados pela região não traduzida 3’ vinte e três de estrutura de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3’ UTR v1). Um cassete marcador selecionável DSM-2 contendo promotor do Vírus do Mosaico da Nervura da Mandioca (CsVMV v2) - DMS2 - região não traduzida 3’ de estrutura de leitura aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF1 3’ UTR v6) estava também presente no vetor binário.
[000271] Binários adicionais são construídos, onde dgt-31 v3, dgt- 32 v3 e dgt-33 v3 são fundidos às sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto anteriormente descritos. Por exemplo, a sequência TraP8 v2 é fundida a dgt-31 v3, dgt-32 v3 e dgt-33-v2 e clonada em vetores binários conforme descrito acima.
[000272] Vetores binários contendo os genes Classe I (dgt-1, dgt-3 e dgt-7) foram construídos. Os vetores binários que seguem foram construídos e transformados em plantas: pDAB4104 (FIG. 9), que contém a sequência dgt-1 v4 conforme descrito na Publicação do Pedido de Patente U.S. No. 2011/0124503, que é flanqueada pelas sequências Osmotim de Nicotiana tabacum conforme descrito na Publicação do pedido de Patente U.S. No. 2009/0064376; pDAB102715 (FIG. 10); pDAB102716 (FIG. 45); pDAB102717 (FIG. 46); e pDAB102785 (FIG. 13). Os vários peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP que foram fundidos a dgt-28, dgt-31, dgt-32 e dgt-33 não foram adicionados aos genes Classe I, uma vez que essas sequências derivadas de planta possuem peptídeos de trânsito de cloroplasto de planta nativos. Esses vetores são descritos em mais detalhes da Tabela 3.
[000273] Tabela 3. Descrição dos vetores binários que contêm uma gene da EPSP sintase Classe I (isto é, dgt-1, dgt-3 ou dgt-7)
Figure img0004
Exemplo 6: Transformação em Arabidopsis e Seleção
[000274] Transformação de Arabidopsis thaliana. Arabidopsis foi transformada usando o método de mergulho floral de Clough e Bent (1998). Uma colônia de Agrobacterium selecionada contendo um dos plasmídeos binários descritos acima foi usada para inocular uma ou mais pré-culturas de 100 mL de caldo YEP contendo espectinomicina (100 mg/L) e canamina (50 mg/L). A cultura foi incubada de um dia para o outro a 28° C com agitação constante a 225 rpm. As células foram peletizadas em aproximadamente 5000 xg por 10 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante resultante descartado. O pélete celular foi suavemente suspenso em 40 mL de meio de embebimento contendo: 5% (p/v) sacarose, 10 μg/L 6-benzilaminopurina e Silwet® L- 77 0,04%. As plantas de aproximadamente 1 mês de vida foram mergulhadas no meio por 5-10 minutos com agitação suave. As plantas foram deitadas de lado e cobertas com bolsas plásticas transparentes ou opacas por 2-3 horas, e então postas na vertical. As plantas foram cultivadas a 22° C, com um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuro. Aproximadamente 4 semanas após o mergulho, as sementes foram coletadas.
[000275] Seleção de Plantas Transformadas: Semente Ti recém- colhida [contendo os cassetes de expressão dgt e DSM-2] foi deixada secar por 7 dias em temperatura ambiente. Semente T1 foi semeada em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm, cada uma recebendo uma alíquota de 200 mg de semente T1 estratificada (~10.000 sementes) que tinha sido anteriormente suspensa em 40 mL de solução de agarose 0,1% e armazenada a 4° C por 2 dias para completar as necessidades de dormência e assegurar germinação de semente sícrona.
[000276] Sunshine Mix LP5 foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então deixada secar com a gravidade. Cada alíquota de 40 mL de semente estratificada foi semeada uniformemente na vermiculita com uma pepita e coberta com domos de umidade por 4-5 dias. Os domos foram removidos 1 dia antes da seleção de transformante inicial usando pulverização de pós-emergência de glufosinato (seleção do gene DSM- 2 co-transformado).
[000277] Sete dias após o plantio (DAP) (Days After Planting) e novamente 11 DAP, plantas T1 (cotilédones e estágio de folha 2-4, respectivamente) foram pulverizadas com uma solução 0,2% de herbicida Liberty (200 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de pulverização de 10 mL/bandeja (703 L/ha) usando uma ponteira de pulverização de ar comprimido DeVilbiss para aplicar uma taxa eficaz de 280 g ai/ha de glufosinato por aplicação. Sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4-7 dias após a pulverização final e transplantadas individualmente em potes de 7,62 centímetros (3 polegadas) preparados com meio de envasamento (Metro Mix 360). As plantas transplantadas foram cobertas com domos de umidade por 3-4 dias e postas em uma câmara de crescimento a 22° C como antes ou removidas diretamente para a estufa. Os domos foram subsequentemente removidos e as plantas cultivadas na estufa (22±5° C, 50±30% RH, 14 h luz:10 escuro, mínimo 500 μE/m2s1 natural + luz suplementada). Análise de confirmação molecular foi completada nas plantas T1 sobreviventes para confirmar que o gene de tolerância a glifosato tinha integrado estavelmente no genoma das plantas.
[000278] Confirmação Molecular. A presença dos transgenes dgt-28 e DSM-2 dentro do genoma de plantas de Arabidopsis que foram transformadas com pDAB107527, pDAB105530, pDAB105531, pDAB105532, pDAB105533 ou pDAB105534 foi confirmada. A presença dessas sequências de polinucleotídeo foi confirmada através de ensaios de sonda de hidrólise, PCR de cassete de expressão de gene (também descrita como PCR de unidade de transcrição de planta --- PTU PCR), análise Southern blot e análises de PCR de Transcrição Reversa Quantitativa.
[000279] As plantas de Arabidopsis T1 foram inicialmente avaliadas através um ensaio de sonda de hidrólise, análogo a TAQMAN®, para confirmar a presença dos transgenes DMS-2 e dgt-28. Os eventos foram avaliados através PCR de cassete de expressão de gene para determinar que o cassete de expressão de dgt integrou completamente nos genomas da planta sem rearranjo. Os dados gerados a partir desses estudos foram usados para determinar o número de cópia de transgene e identificar selecionar eventos de Arabidopsis para autofertilização e avanço para a geração T2. As plantas de Arabidopsis T2 avançadas foram também avaliadas através de ensaios de sonda de hidrólise para confirmar a presença e estimar o número de cópia de genes DSM-2 e dgt dentro do cromossomo da planta. Finalmente, um ensaio Southern blot foi usado para confirmar o número de cópia estimado em um subconjunto das plantas de Arabidopsis T1.
[000280] Ensaios similares foram usados para confirmar a presença do transgene dgt-1 de plantas transformadas com pDAB4101, a presença do transgene dgt-32 de plantas transformadas com pDAB107532, a presença do transgene dgt-33 de plantas transformadas com pDAB107534, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102715, a presença do transgene dgt- 3 de plantas transformadas com pDAB102716, a presença do transgene dgt-3 de plantas transformadas com pDAB102717 e a presença do transgene dgt-7 de plantas transformadas com pDAB102785.
[000281] Ensaio de Sonda de Hidrólise. O número de cópia foi determinado em plantas de Arabidopsis T1 e T2 usando o ensaio de sonda de hidrólise descrito abaixo. Plantas com números variáveis de transgenes foram identificadas e avançadas para estudos de tolerância a glifosato subsequentes.
[000282] Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 poços e liofilizadas por 2 dias. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Seguindo maceração de tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o Biosprint® 96 Plant kit (Qiagen®, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico foi quantificado através do QUANT-IT® PICO GREEN DNA ASSAY KIT (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para em torno de 2 ng/μL para o ensaio de sonda de hidrólise usando o manuseador de líquido automático BIOROBOT3000® (Qiagen, Germantown, MD). Determinação de número de cópia de transgene através do ensaio de sonda de hidrólise foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram projetados para DMS-2, dgt-28 e o gene de referência interna, TAFII15 (ID Genbank: NC 003075; Duarte e outros (201) BMC. Evol. Biol., 10:61).
[000283] Para amplificação, LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em uma reação multiplex de volume de 10 μL contendo 0,1 μM de cada iniciador para DSM-2 e dgt-28, 0,4 μM de cada iniciador para TAFII15 e 0,2 μM de cada sonda. Tabela 4. Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60° C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram processadas e os valores de Limiar de ciclo (Ct) (Cycle Treshold) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR em tempo real foi realizada usando LightCycler® software release 1.5 usando o módulo quant relativo e é baseada no método ΔΔCt. Para isso, uma amostra de DNA genômico de um calibrador de cópia único e checagem de 2 cópias conhecida foram incluídas em cada rodada. Os resultados de número de cópia da avaliação de sonda de hidrólise foram determinados para as plantas de Arabidopsis transgênicas T1 e T2. Tabela 4. Informação de iniciador e sonda para ensaio de sonda de hidrólise de DSM-2, dgt-28 e gene de referência interno (TAFII15)
Figure img0005
[000284] Confirmação de integração de dgt-28 através de Análise Southern Blot. Análise Southern blot foi usada para estabelecer o padrão de integração do fragmento de DNA de fita T inserido e identificar eventos que continha dgt-28. Os dados foram gerados para demonstrar a integração e a integridade dos insertos de transgene dentro do genoma de Arabidopsis. Dados Southern blot foram usados para identificar integração simples de uma cópia intacta do DNA de fita T. Análise Southern blot detalhada foi conduzida usando uma sonda amplificada por PCR específica para o cassete de expressão de gene dgt-28. A hibridização da sonda com DNA genômico que tinha sido digerido com enzimas de restrição específicas identificou fragmentos de DNA genômico de pesos moleculares específicos, cujos padrões são usados para identificar eventos transgênicos T1 de inserção simples, de comprimento integral, para avanço para a próxima geração.
[000285] Amostras de tecido foram coletadas em tubos cônicos de 2 mL (Eppendorf®) e liofilizadas por 2 dias. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECKO® e contas de tungstênio. Seguindo maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado usando um procedimento de isolamento CTAB. O DNA genômico foi purificado adicionalmente usando o Qiagen® Genomic Tips kit. DNA genômico foi quantificado através de Quant-IT® Pico Green DNA assay kit (Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para 4 μg para uma concentração consistente.
[000286] Para cada amostra, 4 μg de DNA genômico foram totalmente digeridos com a enzima de restrição SwaI (New England Biolabs, Beverly, MA) e incubados a 25° C de um dia para o outro, então Nsil foi adicionado à reação e incubado a 37° C por 6 horas. O DNA digerido foi concentrado através de precipitação com Quick Precipitation Solution® (Edge Biosystems, Gaithesburg, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. O DNA genômico foi então ressuspenso em 25 μL de água a 65° C por 1 hora. Amostras ressuspensas foram carregadas em um gel de agarose 0,8% preparado em TAE 1X e eletroforadas de um dia para o outro 1.1 V/cm em tampão TAE 1X. O gel foi sequencialmente submetido à desnaturação (NaOH 0,2M/NaCl 0,6 M) por 30 minutos e neutralização (Tris-HCl 0,5M (pH 7,5)/NaCl 1,5 M) por 30 minutos.
[000287] Transferência de fragmentos de DNA para membranas de náilon foi realizada passivamente absorvendo solução 20X SSC de um dia para o outro através do gel em membrana de transferência IMMOBILON® NY+ tratada (Millipore, Billerica, MA) usando um pavio de papel de cromatografia e toalhas de papel. Seguindo a transferência, a membrana foi lavada rapidamente com 2X SSC, reticulada com o STRATALINKER® 1800 (Stratagene, LaJolla, CA) e cozida a vácuo a 80° C por 3 horas.
[000288] Os blots foram incubados com solução de pré-hibridização (Perfect Hyb plus, Sigma, St. Louis, MO) por 1 hora a 65° C em frascos rolantes de vidro usando uma incubadora de hibridização modelo 400 (Robbins Scientific, Sunnyvale, CA). As sondas foram preparadas a partir de um fragmento de PCR contendo a sequência de codificação inteira. O amplicon de PCR foi purificado usando o estojo de extração em gel QIAEX® II e marcado com α32P-dCTP via o estomo de marcação Random RT Prime IT® (Stratagene, La Jolla, CA). Os blots foram hibridizados de um dia para o outro a 65° C com sonda desnaturada adicionada diretamente a tampão de hibridização para contagens de aproximadamente 2 milhões por blot por mL. Seguindo hibridização, os blots foram sequencialmente lavados a 65° C com 0,1X SSC/SDS 0,1% por 40 minutos. Finalmente, os blots foram expostos a avaliações de imagem de armazenamento de fósforo e imagens realizadas usando um sistema de imagem Molecular Dynamics Storm 860®.
[000289] As análises Southern blot completadas neste estudo foram usadas para determinar o número de cópia e confirmar quais eventos selecionados continham o transgene dgt-28 dentro do genoma de Arabidopsis.
[000290] Confirmação de Cassete de Expressão de Gene dgt-28 via análise de PCR. A presença do cassete de expressão de gene dgt-28 contido nos eventos de planta T1 foi detectada por uma reação de PCR de ponto final. Iniciadores (Tabela 5) específicos para o promotor AtUbi10 v2 e regiões AtuORF23 3’UTR v1 do cassete de expressão de gene dgt-28 foram usados para detecção.
[000291] Tabela 5. Iniciadores de oligonucleotídeo usados para confirmação do cassete de expressão de gene dgt-28
Figure img0006
[000292] As reações de PCR necessitaram um protocolo de ciclização de PCR de três etapas padrão para amplificar o cassete de expressão de gene. Todas as reações de PCR foram completadas usando as condições de PCR que seguem: 94° C por três minutos seguido por 35 ciclos de 94° C por três segundos, 60° C por trinta segundos e 72° C por três minutos. As reações foram completadas usando o estojo EX-TAQ® PCR (TaKaRa Biotechnology Inc. Otsu, Shiga, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Seguindo o ciclo final, a reação foi incubada a 72° C por 10 minutos. Eletroforese em gel de agarose TAE foi usada para determinar o tamanho do amplicon de PCR. Amplicons de PCR de um tamanho esperado indicaram a presença de um cassete de expressão de gene de comprimento integral no genoma dos eventos de Arabidopsis transgênicos.
[000293] Confirmação de Transcrição Relativa de dgt-28 através da Análise de PCR de Transcrição Reversa. Amostras de tecido de plantas transgênicas de dgt-28 foram coletadas em placas de 96 poços e congeladas a 80° C. Maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de tungstênio (Environ Metal INC., Sweet Home, Oregon). Seguindo maceração do tecido, o RNA total foi isolado em formato de alto rendimento usando o Qiagen® Rneasy 96 kit (Qiagen®, Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante que incluía o tratamento com DnaseI opcional na coluna. Esta etapa foi subsequentemente seguida por um tratamento com DnaseI adicional (Ambion®, Austin, TX) do RNA total eluído. Síntese de cDNA foi realizada usando o RNA total como molde com o High Capacity cDNA Reverse Transcription® kit (Applied Biosystems, Austin, TX) seguindo o procedimento sugerido pelo fabricante com a adição do oligonucleotídeo, TVN. Quantificação de expressão foi completada através do ensaio de sonda de hidrólise e foi realizada através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER®480 (Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN). Os ensaios foram projetados para dgt-28 e o gene de referência interno “proteína desconhecida” (Número de Acesso Genbank: AT4G24610) usando o LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, mistura LIGHTCYCLER®480 Probes Master (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada em concentração final 1X em uma reação singleplex de 10 μL de volume contendo 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda. Tabela 6.
[000294] Tabela 6. Iniciadores de PCR usados para análise de PCR de transcrição reversa quantitativa de dgt-28
Figure img0007
[000295] Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60° C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram processadas em triplicata e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Uma reação de transcrição reversa mínima (minus) foi realizada para cada amostra para assegurar que nenhuma contaminação de gDNA estivesse presente. Análise de dados de PCR em tempo real foi realizada com base no método ΔΔCt. Este ensaio foi usado para determinar a expressão relativa de dgt-28 em eventos de Arabidopsis transgênicos que foram determinados ser hemizigotos ou homozigotos. Os níveis de transcrição relativos do mRNA de dgt-28 variaram de 2,5 vezes a 207,5 vezes mais do que o controle interno. Esses dados indicam que plantas transgênicas dgt-28 continham um cassete de expressão de gene dgt-28 e as plantas eram capazes de transcrever o transgene dgt-28.
[000296] Análise Western Blotting. DGT-28 foi detectado em amostras de folha obtidas de plantas de Arabidopsis thaliana transgênicas. Extratos de planta de plantas transgênicas com dgt-28 e padrões de proteína DGT-28 foram incubados com tampão de amostra NUPAGE® LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo DTT a 90° C por 10 minutos e eletroforeticamente separados em um gel de pré-moldagem de acrilamida. As proteínas foram então eletrotransferidas para membrana de nitrocelulose usando o protocolo do fabricante. Após bloqueio com a Mistura de Bloqueio WESTERNBREEZE® (Invitrogen), a proteína DGT- 28 foi detectada através de antissoro anti-DGT-28 seguido por fosfatase anticoelho de cabra. A proteína detectada foi visualizada através de substrato de quimioluminescência BCIP/NBT Western Analysis Reagent (KPL, Gaithersburg, MD). Produção de uma proteína DGT-28 intacta através de Western blot indicou que as plantas transgênicas com dgt- 28 que foram ensaiadas expressavam a proteína DGT-28.
Exemplo 7: Tolerância a Glifosato
[000297] Plantas de Arabidopsis T1 transgênicas contendo o transgene dgt-28 foram pulverizadas com taxas diferentes de glifosato. Taxas elevadas foram aplicadas neste estudo para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1.680 ou 3.360 g ae/ha). Uma taxa de uso de campo 1X de glifosato é 1120 g ae/ha. As plantas de Arabidopsis T1 que foram usadas neste estudo eram de número de cópia variável para o transgene dgt-28. As plantas de Arabidopsis T1 dgt-28 de número de cópia baixo foram autopolinadas e usadas para produzir plantas T2. A Tabela 7 mostra a comparação de plantas transgênicas dgt-28, esboçada para um gene de resistência a herbicida glifosato, dgt-1, e controles do tipo selvagem. A Tabela 8 mostra a comparação de dgt-32 e dgt-33 esboçada para um gene de resistência a herbicida glifosato, dgt-1, e controles do tipo selvagem. A Tabela 9 mostra a comparação das novas enzimas EPSP sintase bacterianas com as enzimas EPSP sintase Classe I e os controles em uma taxa de glifosato de 1.680 g ae/ha.
[000298] Resultados de Seleção de Glifosato de Plantas de Arabidopsis com dgt-28 Transformadas. Os transformantes TI de Arabidopsis foram primeiro selecionados da base de semente não transformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas de semente ou 30.000 sementes foram analisados para cada construto de T1. As plantas T1 selecionadas acima foram molecularmente caracterizadas e as plantas de número de cópia alto foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com várias taxas de glifosato comercial conforme anteriormente descrito. A resposta dessas plantas é apresentada em termos de lesão visual % 2 semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados em uma tabela que mostra plantas individuais exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão grave (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa na resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem (c.v. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato.
[000299] O nível de resposta de planta variou. Esta variação pode ser atribuída ao fato que cada planta representa um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. Foi notado que algumas plantas que continham o transgene não eram tolerantes a glifosato; uma análise completa para determinar se essas plantas expressavam o transgene não foi terminada. É provável que a presença de números de cópia altos do transgene dentro das plantas de Arabidopsis T1 tenha resultado em silenciamento de transgene ou outros efeitos epigenéticos que resultou em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.
[000300] Uma média por taxa de lesão de população geral é apresentada na Tabela 9 para taxas de glifosato a 1.680 g ae/ha para demonstrar a diferença significante entre as plantas transformadas com dgt-3, dgt-7, dgt-28, dgt-32 e dgt-33 versus os controles dgt-1 e tipo selvagem.
[000301] A tolerância provida pelas novas EPSP sintases bacterianas variou dependendo da enzima específica. DGT-28, DGT-32 e DGT-33 inesperadamente proveram tolerância significante a glifosato. Os genes dgt forneceram resistência a herbicida a plantas de Arabidopsis T1 individuais em todos os peptídeos de trânsito testados. Desta maneira, o uso de peptídeos de trânsito de cloroplasto adicionais (isto é, TraP8 - dgt-32 ou TraP8 - dgt-33) proveria proteção para glifosato com níveis de lesão similares conforme relatado dentro de um dado tratamento.
[000302] Tabela 7. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt- 28 para uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4), e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação.
Figure img0008
Figure img0009
Figure img0010
[000303] Tabela 8. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-32 e dgt-33 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós- emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4), e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação.
Figure img0011
[000304] Tabela 9. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt- 28, dgt-32, dgt-33, dgt-3 e dgt-7 a glifosato aplicado pós-emergência a 1.680 g ae/ha, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4), e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação.
Figure img0012
[000305] dgt-28 como um Marcador Selecionável. O uso de dgt-28 como um marcador selecionável para agente de seleção glifosato é testado com as plantas transformadas com Arabidopsis descritas acima. Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis de geração T4 (homozigotas para dgt-28) são salpicadas em aproximadamente 5.000 sementes do tipo selvagem (sensível a glifosato). As sementes são germinadas e as mudas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato. Vários tratamentos de glifosato são comparados; cada bandeja de plantas recebe ou um ou dois momentos de aplicação de glifosato em um dos esquemas de tratamento que seguem: 7 DAP (dias após plantio), 11 DAP ou 7 seguido por 11 DAP. Uma vez que todas as plantas também contêm um gene de resistência a glufosinato no mesmo vetor de transformação, plantas contendo dgt-28 selecionadas com glifosato podem ser comparadas diretamente com plantas contendo DSM-2 ou pat selecionadas com glufosinato.
[000306] Tratamentos com glufosinato são aplicados com uma ponteira de pulverização DeVilbiss® conforme anteriormente descrito. Plantas transgênicas contendo dgt-28 são identificadas como “resistentes” ou “sensíveis” 17 DAP. Tratamentos de 26,25-1680 g ae/ha de glifosato aplicado 7 e 11 dias após plantio (DAP) mostram seleção eficaz para plantas de Arabidopsis transgênicas que contêm dgt-28. Plantas sensíveis e resistentes são contadas e o número de plantas tolerantes a glifosato é verificado se relacionar com o número original de semente transgênica contendo o transgene dgt-28 que é plantado. Esses resultados indicam que dgt-28 pode ser usado com eficácia como um marcador selecionável alternativo para uma população de Arabidopsis transformada.
[000307] Capacidade de herança. Eventos de Arabidopsis Ti transgênicos confirmados foram autopolinados para produzir semente T2. Essas sementes tiveram progênie testada através da aplicação de glufosinato contendo herbicida Ignite® (200 g ae/ha) a i00 irmãs T2 aleatórias. Cada planta T2 individual foi transplantada para potes de 7,5 cm quadrado antes aplicação de pulverização (pulverizador em faixa em taxa de aplicação de i87 L/ha). Famílias Ti (plantas T2) segregaram no modelo Resistente 3: Sensível i antecipadopara um locus único dominantemente herdado com herança Mendeliana conforme determinado através de análise do Qui quadrado (P>0,05). A porcentagem de famílias T1 que segregaram com a herança Mendeliana esperada é ilustrada na Tabela 10 e demonstra que a característica dgt- 28 é passada via herança Mendeliana para a geração T2. As sementes foram coletadas de 5 a 15 indivíduos T2 (semente T3). Vinte e cinco irmãs T3 de cada uma das 3-4 famílias T2 aleatoriamente selecionadas tiveram progênie testada conforme anteriormente descrito. Os dados não mostraram nenhuma segregação e então demonstraram que dgt- 28 e dgt-3 são estavelmente integrados dentro do cromossomo e herdados de uma maneira Mendeliana por pelo menos três gerações.
[000308] Tabela 10. Porcentagem de famílias T1 (plantas T2) segregando como herança Mendeliana única para um teste de progênie de 100 plantas.
Figure img0013
[000309] Dados de Arabidopsis T2. As plantas de segunda geração (T2) de eventos de Arabidopsis T1 que continham números de cópia baixos do transgene dgt-28 foram caracterizadas adicionalmente quanto à tolerância a glifosato. Glifosato foi aplicado conforme anteriormente descrito. A resposta das plantas é apresentada em termos de lesão visual % 2 semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem (cv. Columbia), serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração T2 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas contêm dois alelos diferentes em um locus comparado com plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um locus. Variabilidade da resposta a glifosato é esperada na geração T2 como um resultado da diferença em dosagem de gene para hemizigotas comparado com plantas homozigotas. A variabilidade em reposta a glifosato é refletida no desvio padrão e faixa de resposta.
[000310] Na geração T2 ambos os eventos dgt-28 de cópia única e multicópia foram caracterizados por tolerância a glifosato. Dentro de um evento, plantas de cópia única mostraram níveis de tolerância similares a glifosato. Dados característicos para um evento T2de cópia única são apresentados na Tabela 11. Eventos contendo dgt-28 ligado a TraP5 não proveram tolerância robusta a glifosato comparado com os construtos de dgt-28 que continham outros peptídeos de trânsito TraP. No entanto, os construtos de TraP5 dgt-28 não proveram um nível baixo de tolerância a glifosato comparado com o controle Columbia não transformado. Houve casos quando eventos que foram mostrados conter duas ou mais cópias de dgt-28 eram mais suscetíveis a taxas elevadas de glifosato (dados não mostrados). Este aumento em sensibilidade a glifosato é similar aos dados previamente descritos para as plantas T1 que também continham números de cópia altos do transgene dgt-28. É provável que a presença de números de cópia altos do transgene dentro das plantas de Arabidopsis resulte em silenciamento transgênico ou outros efeitos epigenéticos que resultaram em sensibilidade a glifosato, apesar da presença do transgene dgt-28.
[000311] Esses eventos continham dgt-28 ligado com TraP5 v2 (pDAB105530), TraP12 v2 (pDAB105533) e TraP13 v2 (pDAB105534).
[000312] Em edição a dgt-28, eventos de Arabidopsis T2 transformados com dgt-3 são apresentados na Tabela 12. Conforme descrito para os eventos de dgt-28 na Tabela 11, a tabela de dados contém um evento representativo que é característico da resposta a glifosato para cada construto. Para a caracterização de dgt-3, construtos contendo uma PTU (unidade de transformação de planta (Plant Transformation Unit) com o gene dgt-3 sendo direcionado pelo promotor AtUbi10 (pDAB102716, FIG. 45 e pDAB102715, FIG. 10) foram comparados com construtos tendo o mesmo gene contendo 2 PTUs do gene (pDAB102719, FIG. 32; pDAB102718, FIG. 33). Os construtos que continham 2 PTU usaram o promotor AtUbi10 para direcionar uma cópia do gene e o promotor CsVMV para direcionar a outra cópia. O uso da PTU dupla foi incorporado para comparar as plantas transgênicas dgt-3 com plantas transgênicas dgt-28 que continham duas cópias do transgene. Dados demonstraram que eventos dgt-3 T2 de cópia única com apenas uma PTU única eram mais suscetíveis a glifosato do que eventos dgt-28 de cópia única testados, mas eram mais tolerantes do que o controle não transformado. Famílias T1 contendo 2 PTUs do gene dgt-3 proveram um nível maior de tolerância visual a glifosato comparado com os construtos com 1 PTU. Em ambos os casos as famílias T1 foram comparadas com os controles dgt-1 e tipo selvagem. Dados de T2 demonstram que dgt-28 provê tolerância robusta como eventos de cópia única.
[000313] Tabela 11. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 individuais selecionados contendo dgt-28 a glifosato aplicado pós-emergência em taxas variáveis, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4), e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação.
Figure img0014
Figure img0015
[000314] Tabela 12. Resposta de eventos de Arabidopsis T2 selecionados transformados com dgt-3 a glifosato aplicado pós- emergência em taxas variáveis. Lesão % visual 14 dias após aplicação.
Figure img0016
[000315] Dados de Arabidopsis T3. As plantas da terceira geração (T2) de eventos de Arabidopsis T1 selecionados que continham números de cópia baixos do transgene dgt-28 foram caracterizadas adicionalmente quanto à tolerância a glifosato. Glifosato foi aplicado conforme anteriormente descrito. A resposta das plantas é apresentada em termos de lesão visual % 2 semanas após tratamento (WAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de Arabidopsis. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada, do tipo selvagem (cv. Columbia), serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração T3 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas contêm dois alelos diferentes em um locus comparado com plantas homozigotas que contêm os mesmos dois alelos em um locus. A variabilidade de resposta a glifosato é esperada na geração T3 como um resultado da diferença em dosagem de gene para hemizigota comparado com plantas homozigotas. A variabilidade em resposta a glifosato é refletida no desvio padrão e faixa de resposta.
[000316] Tabela 13. Resposta de eventos de Arabidopsis T3 individuais selecionados contendo dgt-28 a glifosato aplicado pós- emergência em taxas variáveis, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4), e um controle não transformado. Lesão % visual 14 dias após aplicação
Figure img0017
Figure img0018
Figure img0019
[000317] Seleção de plantas transformadas. Sementes Ti recém- colhidas [gene dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1] foram deixadas secar em temperatura ambiente e enviadas para Indianápolis para teste. Semente T1 foi semeada em bandejas de germinação de 26,5 x 51 cm (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN), cada uma recebendo alíquotas de 200 mg de semente T1 estratificada (~10.000 sementes) que tinha sido anteriormente suspensa em 40 mL de solução de agarose 0,1% e armazenada a 40° C por 2 dias para completar as necessidades de dormência e assegurar germinação de semente síncrona.
[000318] Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) foi coberta com vermiculita fina e subirrigada com solução de Hoagland até ficar úmida, então deixada drenar pela gravidade. Cada alíquota de 40 mL de semente estratificada foi semeada uniformemente na vermiculita com uma pipeta e coberta com domos de umidade (KORD® Products, Bramalea, Ontario, Canada) por 4-5 dias. Os domos foram removidos uma vez as plantas tendo germinado antes da seleção de transformante inicial usando pulverização pós-emergência de glufosinato (seleção do gene dsm-2 co-transformado).
[000319] Seis dias após o plantio (DAP) (Days After Planting) e novamente 10 DAP, plantas T1 (cotilédone e estágio de folha 2-4, respectivamente) foram pulverizadas com uma solução 0,1% de herbicida IGNITE® (280 g ai/L de glufosinato, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) em um volume de pulverização de 10 mL/bandeja (703 L/ha) usando uma ponteira de pulverização de ar comprimido DeVilbiss® para administrar uma taxa eficaz de 200 g ae/ha de glufosinato por aplicação. Sobreviventes (plantas crescendo ativamente) foram identificadas 4-7 dias após a pulverização inicial. As plantas sobreviventes foram transplantadas individualmente para potes de 7,62 centímetros (3 polegadas) preparados com meios de envasamento (Metro Mix 360®). As plantas cresceram na estufa pelo menos 1 dias antes da amostragem de tecido para análises de número de cópia.
[000320] As plantas T1 foram amostradas e análises de número de cópia para genes dgt-31, dgt-32 e dgt-22 v1 foram terminadas. Plantas T1 foram então designadas a várias taxas de glifosato de maneira que uma faixa de cópias estava dentre cada taxa. Para Arabidopsis, 26,25 g ae/ha de glifosato é uma dose eficaz para distinguir plantas sensíveis daqueles com níveis significantes de resistência. Taxas elevadas foram aplicadas para determinar os níveis relativos de resistência (105, 420, 1680 ou 3360 g ae/ha). A Tabela 15 mostra as comparações esboçadas para dgt-1.
[000321] Todas as aplicações de herbicida glifosato foram feitas através de pulverizador em faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha. Glifosato usado era da formulação de sal de dimetilamina Durango comercial (480 g ae/L, Dow AgroScience, LLC). Plantas T1 de número baixo de cópia que exibiram tolerância a ou glufosinato ou glifosato foram avaliadas adicionalmente na geração T2.
[000322] As primeiras transformações de Arabidopsis foram conduzidas usando dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1. Transformantes T1 foram primeiro selecionados da base de semente não transformada usando um esquema de seleção de glufosinato. Três bandejas de semente ou 30.000 sementes foram analisadas para cada construto de T1. A frequência de transformação foi calculada e os resultados de construtos de dgt-31, dgt-32 e dgt-33 de T1 são listados na Tabela 14.
[000323] Tabela 14. Frequência de transformação de construtos de Arabidopsis dgt-31, dgt-32 e dgt-33 selecionados com glufosinato para seleção do gene marcador selecionável DSM-2.
Figure img0020
[000324] Plantas T1 selecionadas acima foram subsequentemente transplantadas para potes individuais e pulverizadas com várias taxas de glifosato comercial. A Tabela 15 compara a resposta de dgt-31, dgt- 32 e dgt-33 v1 e genes controle para fornecer resistência a glifosato com transformantes T1 de Arabidopsis. A resposta é apresentada em termos de lesão visual % 2 WAT. Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo pouca ou nenhuma lesão (<20%), lesão moderada (20-40%) ou lesão severa (>40%). Uma média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada tratamento. A faixa em resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Arabidopsis não transformada do tipo selvagem (cv. Columbia) serviu como um controle sensível a glifosato. O gene DGT-31 (v1) com peptídeo de trânsito (TraP23) forneceu leve tolerância a herbicida às plantas de Arabidopsis T1 individuais comparado com o controle negativo. Ambos o DGT-32 e o DGT-33 demonstraram tolerância robusta a glifosato e as taxas testadas com seu respectivo peptídeo de trânsito de cloroplasto (TraP14 e TraP24, respectivamente). Dentro de um dado tratamento, o nível de resposta de planta variou muito, o que pode ser atribuído ao fato que cada planta representa um evento de transformação independente e então o número de cópia do gene de interesse varia de planta para planta. De nota importante, em cada taxa de glifosato testada, havia indivíduos que eram mais tolerantes do que outros. Uma média de lesão de população geral por taxa é apresentada na Tabela 15 para demonstrar a diferença significante entre as plantas transformadas com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 versus os controles dgt-1 v1 ou Tipo selvagem.
[000325] Tabela 15. Resposta de Arabidopsis T1 transformada com dgt-31, dgt-32 e dgt-33 v1 a uma faixa de taxas de glifosato aplicadas pós-emergência, comparado com uma população resistente homozigota dgt-1 (T4) ou um controle não transformado. Lesão % visual 2 semanas após tratamento.
Figure img0021
Figure img0022
Exemplo 8: dgt-32 e dgt-33 como Marcadores Selecionáveis
[000326] Dgt-32 e dgt-33 v1 são usados como marcadores selecionáveis com glifosato como o agente de seleção. O desempenho desses marcadores é analisado com Arabidopsis transformada. Aproximadamente 50 sementes de Arabidopsis de geração T4 (homozigotas para dgt-32 e dgt-33 v1) são salpicadas em aproximadamente 5.000 sementes do tipo selvagem (sensíveis). Vários tratamentos são comparados, cada bandeja de plantas recebendo ou um ou dois momentos de aplicação de glifosato em um dos esquemas de tratamento que seguem: 7 DAP, 11 DAP ou 7 seguido por 11 DAP. Uma vez que todos os indivíduos também contêm o gene dsm-2 no mesmo vetor de transformação, dgt-32 e dgt-33 selecionados com glifosato são capazes de ser diretamente comparados com dsm-2 selecionado com glufosinato.
[000327] Os tratamentos são aplicados com uma ponteira de pulverização DeVilbiss®. As plantas são identificadas como Resistentes ou Sensíveis 17 DAP. Os tratamentos de 26,25-280 g ae/ha de 2,4-D aplicados 7 e 11 dias após plantio (DAP) são igualmente eficazes em frequência de seleção. Esses resultados indicam que dgt-32 e dgt-33 v1 podem ser usados eficazmente como um marcador selecionável.
[000328] Capacidade de herança. Uma variedade de eventos Ti foi autopolinada para produzir semente T2. Essas sementes têm a progênie testada através da aplicação de IGNITE® (200 g ae/ha) a i00 irmãs T2 aleatórias. Cada planta T2 individual é transplantada para potes quadrados de 7,5 cm antes da aplicação da pulverização (pulverizador em faixa em taxa de aplicação de i87 L/ha). Famílias Ti (plantas T2) que segregam no modelo 3 Resistente:i Sensível antecipado para um locus único dominantemente herdado com herança Mendeliana conforme determinado através de análise do Qui quadrado (P>0,05) são determinadas.
[000329] Semente é coletada de 5 a i5 indivíduos T2 (semente T3). Vinte e cinco irmãs T3 de cada uma das 3 famílias T2 aleatoriamente selecionadas têm a progênie testada. Dados não mostrando nenhuma segregação demonstram que dgt-32 e dgt-33 v1 são cada um estavelmente integrados e herdados de uma maneira Mendeliana para pelo menos três gerações.
[000330] Caracterização de Tolerância a Herbicida Adicional de Linhagens DGT T3. Semente de Arabidopsis de geração T3 é estratificada e semeada em bandejas de seleção. Uma linhagem controle transformada contendo dgt-1 e o controle não transformado são plantados de uma maneira similar. As mudas são transferidas para pontes individuais de 7,62 centímetros (3 polegadas) na estufa. Todas as plantas são pulverizadas com o uso de um pulverização de faixa a 187 L/ha. As plantas são pulverizadas com uma faixa de glifosato de 420-3360 g ae/ha (DURANGO® DMA, Dow AgroSciences). Todas as aplicações são formuladas em água. Cada tratamento é replicado 4 vezes e as plantas são avaliadas em 7 e 14 dias após tratamento.
Exemplo 9: Transformação de Espécies de Cultura Adicionais
[000331] Soja é transformada com dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para prover níveis altos de resistência ao herbicida glifosato, utilizando substancialmente as mesmas técnica anteriormente descritas no Exemplo 11 ou Exemplo 13 da Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.
[000332] Algodão é transformado com dgt-28- dgt-32 e/ou dgt-33 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para prover níveis altos de resistência ao herbicida glifosato através da utilização de substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo 14 da Patente U.S. 7.838.733 ou Exemplo 12 da Publicação do Pedido de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.
[000333] Canola é transformada com dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para prover níveis altos de resistência ao herbicida glifosato através da utilização de substancialmente as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo 26 da Patente U.S. 7.838.733 ou Exemplo 22 da Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482.
Exemplo 10: Transformação de Milho
[000334] Construtos de DNA para Transformação de Milho. Métodos de clonagem padrão, conforme descrito acima, foram usados na construção de vetores binários para uso em transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens de milho. A Tabela 16 lista os vetores que foram construídos para transformação de milho. Os elementos de gene que seguem foram usados nos vetores que continham dgt-28; o promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays (ZmUbi1; Patente U.S. No. 5.510.474) foi usado para direcionar a sequência de codificação de dgt- 28 que é flanqueada por uma região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays (ZmLip 3’UTR; Patente U.S. No. 7179902), o cassete marcador selecionável consiste no promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays que foi usado para direcionar a sequência de codificação de aad-1 (Patente U.S. No. 7.838.733) que é flanqueada por uma região não traduzida 3’ de lipase de Zea mays. A sequência de codificação de aad-1 confere tolerância aos herbicidas fenóxi auxina, tal como ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) e aos herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP).
[000335] Os construtos de dg-28 foram construídos como vetores binários padrão e vetores de sistema superbinário de Agrobacterium (Japan Tobacco, Tóquio, Japão). Os vetores binários padrão incluem: pDAB107663, pDAB107664, pDAB107665 e pDAB107665. Os vetores do sistema superbinário de Agrobacterium incluem pDAB108384, pDAB108385, pDAB108386 e pDAB108387.
[000336] Construtos adicionais foram completados, os quais contêm um gene repórter da proteína amarela fluorescente (yfp; Pedido de Patente U.S. 2007/0298412). pDAB109812 contém um cassete de gene repórter yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida per 5 3’ de Zea mays (Zm per5 3’UTR; Patente U.S. No. 7179902), o cassete marcador selecionável consiste no promotor do vírus baciliforme da cana-de- açúcar (SCBV; Patente U.S. No. 5.994.123) que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays. pDAB101556 contém um cassete yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida per 5 3’ de Zea mays, o cassete marcador selecionável consiste no promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays que é usado para direcionar a expressão de add-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays. pDAB107698 contém um cassete de dgt-28 que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays, um cassete de yfp que é direcionado pelo promotor da Ubiquitina 1 de Zea mays e flanqueado pela região não traduzida per 5 3’ de Zea mays, o cassete marcador selecionável consiste no promotor do vírus baciliforme de cana-de-açúcar que é usado para direcionar a expressão de aad-1 e é flanqueado pela região não traduzida 3’ de Lipase de Zea mays. Todos os três desses construtos são vetores binários padrão.
[000337] Tabela 16. Vetores de Transformação de Milho.
Figure img0023
Figure img0024
[000338] Esterilização de espiga e isolamento do embrião. Para obter embriões imaturos de milho, plantas da linhagem de cruzamento entre a mesma espécie B104 de Zea mays foram cultivadas na estufa e foram autopolinadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 9-12 dias pós-polinação. No dia experimental, as espigas foram esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de hipoclorito de sódio (5%) e agitadas por 20-30 minutos, seguido por três enxágues em água estéril. Após esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5-2,4 mm) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo meios de infecção de líquido (LS Basal Medium, 4,43 gm/L; N6 Vitamin Solution [1000X], 1,00 mL/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Sacarose, 68,5 gm/L; D(+) Glicose, 36,0 gm/L; 10 mg/L de 2,4-D, 150 μL/L). Para um dado conjunto de experimentos, embriões agrupados de três espigas foram usados para cada transformação. Início da Cultura de Agrobacterium:
[000339] Estoques de glicerol de Agrobacterium contendo os vetores de transformação binários descritos acima foram dispostos em tiras em placas de meio mínimo AB contendo antibióticos apropriados e foram cultivados a 20° C por 3-4 dias. Uma colônia única foi selecionada e disposta em tiras em placas YEP contendo o mesmo antibiótico e foi incubada a 28° C por 1-2 dias.
[000340] Cultura e Co-cultivo de Agrobacterium. Colônias de Agrobacterium foram obtidas da placa de YEP, suspensas em 10 mL de meio de infecção em um tubo descartável de 50 mL e a densidade celular foi ajustada para OD600 nm de 0,2-0,4 usando um espectrofotômetro. As culturas de Agobacterium foram postas em um agitador giratório a 125 rpm, temperatura ambiente, enquanto dissecção do embrião era realizada. Embriões zigóticos imaturos entre 1,5-2,4 mm de tamanho foram isolados dos grãos de milho esterilizados e postos em 1 mL do meio de infecção) e lavados uma vez no mesmo meio. A suspensão de Agrobacterium (2 mL) foi adicionada a cada tubo e os tubos foram postos em uma plataforma de agitação por 10-15 minutos. Os embriões foram transferidos para meios de co-cultura (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; Mio-inositol, 100,0 mg/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan®, 3,00 gm/L; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/ml de AgNOs, 15,0 mg/L; DMSO, 100 μM), orientados com o escutelo faceando para cima e incubados a 25° C, sob luz por 24 horas a 50 μmole m-2 seg-1 de intensidade de luz por 3 dias.
[000341] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos. Seguindo o período de co-cultivo, os embriões foram transferidos para meios de descanso (MS Salts, 4,33 gm/L; L-prolina, 700,0 mg/L; 1,2,3,5,/4,6-Hexaidrocicloexano, 100 mg/L; MES ácido [(2-(n-morfolino)- etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan®, 2,30 gm/L; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/ml de AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) sem agente seletivo e incubados sob luz por 24 horas a 50 μmole m-2 seg-1 de intensidade de luz e a 25° C por 3 dias.
[000342] Experimentos de resposta à dosagem de inibição de crescimento sugeriram que concentrações de glifosato de 0,25 mM e mais eram suficientes para inibir crescimento celular na linhagem de milho B104 não transformada. Os embriões foram transferidos para Meio de seleção 1 contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; L- prolina, 700,0 mg/L; Mioinositol, 100,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n- morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan®, 2,30 gm/L; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/ml de AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e incubados ou no escuro e/ou sob luz por 24 horas a 50 μmole m-2 seg-1 de intensidade de luz por 7-14 dias a 28° C.
[000343] Calos embriogênicos em proliferação foram transferidos para Meio de seleção 2 contendo 1,0 mM de glifosato (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrocicloexano, 100 mg/L; L-prolina, 700,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,500 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 100,0 mg/L; Dicamba-KOH 30 mM, 3,3 mg/L; Sacarose, 30,0 gm/L; Gelzan®, 2,30 gm/L; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/ml de AgNO3, 15,0 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L); Ácido R-Haloxifope 0,1810 mg/L) e foram incubados ou no escuro e/ou sob luz por 24 horas a 50 μmole m-2 seg-1 de intensidade de luz por 14 dias a 28° C. Esta etapa de seleção permitiu que calos transgênicos proliferassem mais e diferenciassem. O período de seleção de calo durou três a quatro semanas.
[000344] Calos embriogênicos, em proliferação, foram transferidos para meios PreReg contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrocicloexano, 100 mg/L; L-prolina, 350,0 mg/L; MES [(ácido 2-(n-morfolino)-etanossulfônico), ácido livre] 0,250 gm/L; Hidrolisado enzimático de caseína 50,0 mg/L; NAA-NaOH 0,500 mg/L; ABA-EtOH 2,50 mg/L; BA 1,00 mg/L; Sacarose, 45,0 gm/L; Gelzan®, 2,50 gm/L; MS-Vitamina Modificada [1000X], 1,00 mL/L; 8,5 mg/ml de AgNO3, 1,00 mg/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) e culturados sob luz por 24 horas a 50 μmole m-2 seg-1 de intensidade de luz por 7dias a 28° C.
[000345] Calos embriogênicos com embriões tipo broto foram transferidos para Meios de regeneração contendo glifosato 0,5 mM (MS Salts, 4,33 gm/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrocicloexano, 100,0 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gelan Gum G434® 3,00 gm/L; MS-Vitamin Modificada [1000X], 1,00 ml/L; Carbenicilina, 125,0 mg/L) culturados sob luz por 24 horas a 50 μmol m-2 seg-1 de intensidade de luz por 7 dias.
[000346] Brotos pequenos com raízes primárias foram transferidos para meio de enraizamento (MS Salts, 4,33 gm/L. MS-Vitamin Modificada [1000X], 1,00 ml/L; 1,2,3,5/4,6-Hexaidrocicloexano, 100 mg/L; Sacarose, 60,0 gm/L; Gellan Gum G434® 3,00 gm/L; Carbenicilina, 250,0 mg/L) em fitobandejas e foram incubados sob 16/8 h de luz/escuro a 140-190 μmol m-2 seg-1 de intensidade de luz por 7 dias a 27° C. Mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto ao número de cópia de transgene usando os protocolos descritos acima e transferidas para o solo.
[000347] Confirmação Molecular da Presença dos transgenes dgt-28 e aad-1 dentro de Plantas de Milho. A presença das sequências de polinucleotídeo dgt-28 e aad-1 foi confirmada através de ensaios de sonda de hidrólise. Plantas de milho T0 isoladas foram inicialmente avaliadas através de um ensaio de sonda de hidrólise, análogo a TAQMAN®, para confirmar a presença de transgenes aad-1 e dgt-28. Os dados gerados a partir desses estudos foram usados para determinar o número de cópia de transgene e usados para selecionar eventos de milho transgênicos para retrocruzamento e avanço para a geração T1.
[000348] Amostras de tecido foram coletadas em placas de 96 poços, maceração de tecido foi realizada com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de aço inoxidável (Hoover Precision Products, Cumming, GA), em tampão Qiagen® RLT. Seguindo maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando o Biosprint 96® Plant kit (Qiagen Germantown, MD) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. DNA genômico foi quantificado através do Quant-IT® Pico Green DNA assay kit (Molecular Proves, Invitrogen, Carlsdab, CA). DNA genômico quantificado foi ajustado para mais ou menos 2 ng/μL para o ensaio de sonda de hidrólise usando um manuseador de líquido automático BIOROBOT3000® (Qiagen, Germantown, MD). Determinação de número de cópia de transgene através do ensaio de sonda de hidrólise, análogo ao ensaio TAQMAN®, foi realizada através de PCR em tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Os ensaios foram designados para aad-1, dgt-28 e um gene de referência interno Invertase (No. de Acesso Genbank: U16123.1) usando LIGHTCYCLER® Probe Design Software 2.0. Para amplificação, LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foi preparada em uma concentração final 1X em uma reação multiplex de volume de 10 μL contendo 0,4 μM de cada iniciador para aad-1 e dgt-28 e 0,2 μM de cada sonda (Tabela 17).
[000349] Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada com uma extensão a 60° C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as amostras foram administradas e os valores de Limiar de ciclo (Ct) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR em tempo real foi realizada usando LightCycler® software release 1.5 usando o módulo quant relativo e é baseada no método ΔΔCt. Controles incluíam uma amostra de DNA genômico de um calibrador de cópia única e checagem de duas cópias conhecida que foram incluídas em cada rodada. A Tabela 18 lista os resultados dos ensaio de sonda de hidrólise.
[000350] Tabela 17. Sequências de iniciador e sonda usadas para ensaio de sonda de hidrólise de aad-1, dgt-28 e referência interna (Invertase).
Figure img0025
[000351] Tabela 18. Resultado da quantidade de cópia T0 para eventos dgt-28. Eventos de número de cópia baixo consistiam em 1-2 cópias de transgene, números de cópia única são listados em parênteses. Eventos de número de cópia alto continham 3 ou mais cópias de transgene.
Figure img0026
Exemplo 11: Tolerância a Herbicida em Milho Transformado com dgt-28
[000352] Eventos de transformação de dgt-28 de Zea mays (T0) foram deixados aclimatar na estufa e foram cultivados até que as plantas tivessem realizado transição de cultura de tecido para condições de crescimento em estufa (isto é, 2-4 folhas novas, parecendo normais tinham emergido do verticilo). As plantas foram cultivadas a 27° C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuro na estufa. As plantas foram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA® (contendo o herbicida glifosato) com a adição de sulfato de amônio p/v 2%. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador de faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização de 50 cm. Plantas T0 foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de 280-4480 g ae/ha de glifosato, que é capaz de lesionar significantemente linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à linhagem de cruzamento entre a mesma espécie B104.
[000353] Os resultados das plantas de milho dgt-28 T0 demonstraram que tolerância a glifosato foi obtida em taxas de até 4480 g ae/ha. Um tipo de meio específico foi usado na geração T0. Tolhimento mínimo e crescimento de planta geral de plantas transformadas comparado com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 provê tolerância robusta a glifosato quando ligado aos peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP5, TraP8 e TraP23.
[000354] Plantas T0 selecionadas são autopolinadas ou retrocruzadas para caracterização adicional na geração seguinte. 100 linhagens de dgt-28 escolhidas contendo as plantas T1 são pulverizadas com 140-1120 g ae/ha de glufosinato ou 105-1680 g ae/ha de glifosato. Ambos o marcador selecionável e o gene resistente a glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Desta maneira, se um gene tolerante a herbicida for selecionado através de pulverização com um herbicida, ambos os genes são acreditados estar presentes. Em 14 DAT, plantas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que segregam como uma característica Mendeliana dominante (3R:1S), de locus único, conforme determinado através de análise do quadrado Qui. Esses dados demonstram que dgt-28 é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiledônea. Taxas altas de glifosato são aplicadas aos sobreviventes T1 ou F1 para caracterizar adicionalmente a tolerância e a proteção que são providas pelo gene dgt-28.
[000355] Tolerância a herbicida pós-emergência em Milho To transformado com dgt-28. Eventos TO de dgt-28 ligado com TraP4, TraP5, TraP8 e Trap23 foram gerados através de transformação de Agrobacterium e foram deixados aclimatar sob condições de câmara de crescimento não controladas até que 2-4 folhas de aparência normal, novas, tivessem emergido do verticilo. As plantas receberam números de identificação individuais e foram amostradas para análise de número de cópia de ambos o dgt-28 e o aad-1. Com base nas análises do número de cópia, as plantas foram selecionadas para análise de expressão de proteínas. As plantas foram transplantadas em potes maiores com meio de crescimento novo e cultivadas a 27° C sob condições de 16 horas de luz:8 horas de escuro na estufa. As plantas restantes que não foram amostradas para expressão de proteína foram então tratadas com formulações comerciais de DURANGO DMA® (glifosato) com a adição de sulfato de amônio 2% p/v. Os tratamentos foram distribuídos de maneira que cada agrupamento de plantas continha eventos T0 de número de cópia variável. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverização de faixa em um volume de pulverização de 187 L/ha, altura de pulverização de 50 cm. Plantas T0 foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de 280-4480 g ae/ha de glifosato capaz de lesionar significantemente linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à linhagem de cruzamento entre a mesma espécie B104. B104 era o retrocruzamento genético dos transformantes.
[000356] Os resultados de plantas de milho com dgt-28 T0 demonstram que tolerância a glifosato foi obtida até 4480 g ae/ha. Tabela 19. Embotamento mínimo e crescimento de planta geral de plantas transformadas comparado com os controles não transformados demonstraram que dgt-28 provê proteção robusta para glifosato quando ligado a TraP5, TraP8 e TraP23.
[000357] Tabela 19. Resposta de eventos de dgt-28 T0 de números de cópia variáveis a taxas de glifosato variando de 280-4480 g ae/ha + sulfato de amônio 2,0% p/v 14 dias após tratamento.
Figure img0027
[000358] Análise de expressão de proteína através de ELISA padrão demonstrou uma faixa média de proteína DGT-28 de 12,6-22,5 ng/cm2 em todos os construtos testados.
[000359] Confirmação de tolerância a glifosato na geração Fi sob condições de estufa. Plantas T0 de cópia única que não foram pulverizadas foram retrocruzadas com a base não transformada Bi04 para caracterização adicional na geração seguinte. Na geração Ti, tolerância a glifosato foi avaliada para confirmar a herança do gene dgt- 28. Para plantas Ti, o herbicida ASSURE II® (35 g ae/ha quizalofope- metila) foi aplicado no estágio de crescimento Vi para selecionar a proteína AAD-i. Ambos o marcador selecionável e gene resistente a glifosato são construídos no mesmo plasmídeo. Desta maneira se um gene for selecionado, ambos os genes são acreditados estar presentes. Depois de 7 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas e plantas nulas foram removidas da população. Esses dados demonstram que dgt-28 (vi) é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiledônea. As plantas foram amostradas para caracterização de proteína DGT-28 através de ELISA padrão e nível de transcrição de RNA. Plantas resistentes foram pulverizadas com 560-4480 g ae/ha de glifosato conforme anteriormente descrito. Os dados demonstram tolerância robusta de dgt-28 ligado com os peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e Trap23 até 4480 g ae/g de glifosato. Tabela 20.
[000360] Tabela 20. Resposta de eventos de dgt-28 de cópia única Fi a taxas de glifosato variando de 560-4480 g ae/ha + 2,0% p/v de sulfato de amônio i4 dias após tratamento.
Figure img0028
Figure img0029
[000361] Dados de expressão de proteína d emonsl tram uma faixa de proteína DGT-28 média de 42,2-88,2 ng/cm2 em eventos T1 e construtos testados, estabelecendo expressão de proteína na geração T1.
[000362] Caracterização de milho dgt-28 sob condições de campo. Eventos T1 de cópia única foram enviados para uma localização de campo para criar ambas sementes hemizigota híbrida e homozigota de cruzamento entre a mesma espécie para caracterização adicional. Sementes híbridas foram criadas cruzando eventos T1 na linhagem de transformação de milho B104 com a linhagem de cruzamento entre a mesma espécie 4XP811 gerando populações híbridas segregando 1:1 (hemizigota:nula) para o evento. As sementes resultantes foram enviadas para 2 locais separados. Um total de cinco eventos de cópia única por construto foi plantado em cada localização em um esboço de bloco completo aleatorizado em triplicata. Os campos foram designados para aplicação de glifosato ocorrer no estágio de crescimento V4 e um agrupamento separado de plantas a ser aplicado no estágio de crescimento V8. O híbrido convencional 4XP811/B104 foi usado como um controle negativo.
[000363] As fileiras experimentais foram tratadas com 184 g/ha de ASSURE II® (106 g ai/L quizalofope-metila) para eliminar segregantes nulos. Todos registros experimentais segregaram 1:1 (sensível:resistente) (p=0,05) com relação à aplicação de ASSURE II®. Plantas resistentes selecionadas foram amostradas de cada evento para quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padrão.
[000364] Plantas resistentes a quizalofope-metila foram tratadas com o herbicida comercial DURANGO DMA® (480 g ae/L de glifosato) com a adição de 2,5% p/v de sulfato de amônio no estágio de crescimento V4 ou V8. Aplicações de herbicida foram feitas com um pulverizador em barra calibrado para administrar um volume de 187 L/ha, altura de pulverização de 50 cm. As plantas foram pulverizadas com uma faixa de glifosato de a partir de 1120-4480 g ae/ha de glifosato, capaz de lesionar significantemente linhagens de milho não transformadas. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >95% de lesão à linhagem de cruzamento entre a mesma espécie 4XP811. Avaliações de lesão visuais foram feitas para a porcentagem de clorose visual, porcentagem de necrose, porcentagem de inibição de crescimento e lesão visual total em 7, 14 e 21 DAT (dias após tratamento). As avaliações foram comparadas às checagens não tratadas para cada linhagem e controles negativos.
[000365] Dados de lesão visual para todos os momentos de avaliação demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de DURANGO DMA® em ambos os locais e momentos de aplicação. Eventos representativos para a aplicação de V4 são apresentados de uma localização e estão de acordo com os outros eventos, momentos de aplicação e localizações. Tabela 21. Um evento do construto contendo dgt-28 ligado com TraP23 (pDAB107665) foi tolerante à seleção de ASSURE II® para a proteína ADD-1, mas foi sensível a todas as taxas de glifosato aplicadas.
[000366] Tabela 21. Resposta de eventos de dgt-28 aplicados com uma faixa de glifosato de 1120-4480 g ae/ha + 2,5% p/v de sulfato de amônio no estágio de crescimento V4.
Figure img0030
Figure img0031
[000367] Avaliações adicionais foram feitas durante o estágio de crescimento reprodutivo para a taxa de glifosato de 4480 g ae/ha. Avaliações visuais de pendões, momento de polinação e preenchimento de espiga foram similares às checagens não tratadas de cada linhagem para todos os construtos, momentos de aplicação e localizações. Resultados de quantificação para a proteína DGT-28 demonstraram uma faixa de expressão de proteína média de 186,4-303,0 ng/cm2. Os dados demonstram tolerância robusta de milho transformado com dgt- 28 sob condições de campo através dos estágios de crescimento reprodutivo até 4480 g ae/ha de glifosato. Os dados também demonstram detecção e funcionamento de proteína DGT-28 com base em resultados de tolerância à pulverização.
[000368] Confirmação de capacidade de herança e tolerância de milho dgt-28 no estado homozigoto. Sementes de TIS2 foram plantadas sob condições de estufa conforme anteriormente descrito. As mesmas cinco linhagens de cópia única que foram caracterizadas sob condições de campo foram caracterizadas no estado homogêneo. As plantas foram cultivadas até o estágio de crescimento V3 e separadas em três taxas de glifosato variando de 1120-4480 g ae/ha de glifosato (DURANGO DMA®) e quatro réplicas por tratamento. As aplicações foram feitas em um pulverizador de faixa conforme anteriormente descrito e foram formuladas em sulfato de amônio 2,0% p/v. Uma aplicação de sulfato de amônio serviu como uma checagem não tratada para cada linhagem. Avaliações visuais foram feitas 7 e 14 dias após tratamento conforme anteriormente descrito. Os dados demonstraram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato para todo os eventos testados. Tabela 22.
[000369] Tabela 22. Resposta de eventos dgt-28 homozigotos aplicados com uma taxa de glifosato de a partir de 1120-4480 g ae/ha + sulfato de amônio 2,0% p/v.
Figure img0032
Figure img0033
[000370] A linhagem de pDAB107665 que não era tolerante sob condições de campo não demonstrou nenhuma tolerância a glifosato e desta maneira de acordo com as observações de campo (dados não mostrados). Com a exceção de uma linhagem anteriormente mencionada, todas as réplicas que foram tratadas com glifosato das linhagens não eram sensíveis a glifosato. Desta maneira os dados demonstram capacidade de herança para uma população homogênea de milho dgt-28 de uma maneira Mendeliana. Expressão da proteína DGT-28 através de ELISA padrão demonstrou uma faixa de expressão de proteína média de 27,5-65,8 ng/cm2 em todos os eventos de cópia única que eram tolerantes a glifosato. Os dados demonstram proteína funcional e estabilidade da proteína DGT-28 através das gerações.
Exemplo 12: Uso de tolerância a herbicida pós-emergência de glifosato como um marcador selecionável
[000371] Conforme anteriormente descrito, plantas transformadas T0 foram levadas da cultura de tecido e aclimatadas na estufa. Os eventos testados continham dgt-28 ligado a peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP5, TraP8 e TraP23. Foi demonstrado que essas plantas T0 proveram tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato, e plantas não transformadas foram controladas com glifosato em concentrações tão baixas quanto 280 g ae/ha. Esses dados demonstram que dgt-28 pode ser utilizado como um marcador selecionável usando uma concentração de glifosato variando de 280-4480 g ae/ha.
[000372] Várias sementes de linhagens fixas de milho que continham o transgene dgt-28 são salpicadas em várias sementes de milho não transformadas. As sementes são plantadas e deixadas crescer para o estágio desenvolvimental V1-V3, momento quando as mudas são pulverizadas com uma dose de seleção de glifosato na faixa de 2804480 g ae/ha. Seguindo 7-10 dias, plantas sensíveis e resistentes são contadas e a quantidade de plantas tolerantes a glifosato se relaciona com o número original de sementes transgênicas contendo o transgene dgt-28 que são plantadas.
Exemplo 13: Empilhamento de Milho dgt-28
[000373] A proteína AAD-1 é usada como o marcador selecionável em milho transformado com dgt-28 para propósitos de pesquisa. O gene aad-1 pode ser também utilizado como uma característica tolerante a herbicida em milho para prover tolerância a 2,4-D robusta até uma aplicação V8 em uma cultura. Quatro eventos dos construtos pDAB107663 (TraP4::dgt-28), pDAB107664 (TraP8::dgt-28) e pDAB107666 (TraP5::dgt-28) foram caracterizados para a tolerância de uma aplicação de mistura de tanque de glifosato e 2,4-D. O estudo de caracterização foi completado com semente F1 sob condições de estufa. As aplicações foram feitas em um pulverizador de faixa conforme anteriormente descrito nas taxas que seguem: 1120-2240 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120-2240 g ae/ha de 2,4-D (seletivo para o gene aad-1) ou uma mistura de tanque de dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram classificadas em 7 e 14 dias. Os resultados de pulverização para aplicações dos herbicidas em 2240 g ae/ha são mostrados na Tabela 23.
[000374] Tabela 23. Resposta de milho aad-1 e dgt-28 F1 pulverizado com 2240 g ae/ha de 2,4-D, glifosato e uma combinação de mistura de tanque dos dois herbicidas 14 dias após tratamento. Evento Fi 2240 g ae/ha 2,4-D 2240 g glifosato ae/ha 2240 g ae/ha 2,4-D +
Figure img0034
[000375] Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser empilhado com sucesso com aad-1, então aumentando os herbicidas de espectro que podem ser aplicados à cultura de interesse (glifosato + ácidos fenoxiacéticos para dgt-28 e aad-1, respectivamente). Em produção de cultura onde ervas daninhas de folha larga difíceis de controlar ou biotipos de erva daninha resistentes existem a pilha pode ser usada como um meio de controle de erva daninha e proteção da cultura de interesse. Características de entrada ou saída adicionais podem ser também empilhadas com o gene dgt-28 em milho e outras plantas.
Exemplo 14: Transformação de Outras Culturas
[000376] Culturas adicionais são transformadas usando técnicas conhecidas. Para transformação mediada por Agrobacterium de centeio vide, por exemplo, Popelka, J.C., Xu, J,, Altpeter, F., “Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale cereale L.) plants instantly marker-free transgenic rye,” Transgenic Res. Out. 2003;12(5):587-96.). Para transformação mediada por Agrobacterium de sorgo vide, por exemplo, Zhao e outros, “Agrobacterium-mediated sorghum transformation,” Plant Mol Biol. Dez 2000;44(6):789-98. Para transformação mediada por Agrobacterium de cevada vide, por exemplo, Tingay e outros, “Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation,” The Plant Journal, (1997) 11: 1369-1376. Para transformação mediada por Agrobacterium de trigo vide, por exemplo, Cheng e outros, “Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens,” Plant Physiol. Nov 1997;115(3):971-980. Para transformação mediada por Agrobacterium de arroz vide, por exemplo, Hiei e outros, “Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens,” Plant Mol. Biol. Set 1997;35(1-2):205-18.
[000377] Outras técnicas de transformação (não Agrobacterium) são usadas para transformar dgt-28, dgt-32 ou dgt-33, por exemplo, Milho (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. and Zizania spp.), Cevada (Hordeum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Beterrabas açucareiras e de mesa (Beta spp.), Cana-de-açúcar (Arenga pinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum e outra spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outra spp., e Cyphomandra betacea), Batata (Solanum tuberosum), Batata Doce (Ipomoea batatas), Centeio (Secale spp.), Pimentas (Capsicum annuum, chinense e frutescens), Alface (Lactuca sativa, perennis e pulchella), Repolho (Brassica spp.), Aipo (Apium grMédiaolens), Berinjela (Solanum melongena), Amendoim (Arachis hypogea), Sorgo (Sorghum spp.), Alfafa (Medicago sativa), Cenoura (Daucus carota), Feijões (Phaseolus spp. e outros gêneros), Aveias (Médiana sativa e strigosa), Ervilhas (Pisum, Vigna, and Tetragonolobus spp.), Girassol (Helianthus annuus), Abóbora (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa). Tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Grama (Lolium, Agrostis, Poa, Cynodon e outros gêneros), Trevo (Trifolium), Ervilhaca (Vicia).
[000378] Resistência a glifosato conferida por dgt-28, dgt-32 e dgt-33 aumenta a aplicabilidade de herbicidas glifosato para uso em temporada em muitos sistemas de corte de madeira de decíduas e sempre-verdes. Espécies de corte resistentes a herbicida glifosato aumentam a flexibilidade de uso além dos limites desses herbicidas sem preocupações com lesão. Desta maneira, dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33 são transformados em espécies de madeira: amieiro (Alnus spp.), freixo (Fraxinus spp.), álamo alpino e espécies de álamo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Betula spp.), cereja (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), nogueira (Carya spp.), carvalho (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.) e pinheiro (Pinus spp.).
[000379] Resistência ao herbicida glifosato aumenta a aplicabilidade de herbicidas glifosato para o controle de erva daninha seletivo em espécies ornamentais e produtoras de frutas. Desta maneira, dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33 são transformados nas espécies ornamentais e produtoras de fruta: rosa (Rosa spp.), sarça ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp.), maçã de caranguejo ou maçã (Malus spp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp) e calêndula (Tagetes spp.).
Exemplo 15: Empilhamento com Outras Características
[000380] Culturas transgênicas contendo características de resistência a inseto (IR) (Insect Resistance) são prevalentes em plantas de milho, soja e algodão em toda a América do Norte, e uso dessas características está se expandido por todo o mundo. Culturas transgênicas comerciais combinando características de resistência a inseto e tolerante a herbicida (HT) (Herbicide Tolerant) foram desenvolvidas por várias companhias de semente. Essas incluem características de Bacillus thuringiensis (por exemplo, toxinas Bt listadas no website lifesci.sussex.ac.uk, 2006), características de resistência a inseto não-Bt, e qualquer uma ou todas as características HT mencionadas acima. A habilidade em controlar problemas de peste múltiplos através de características IR é um conceito de produto comercial valioso. No entanto, a conveniência deste conceito de produto será restrita se controle de erva daninha e controle de inseto forem independentes um do outro.
[000381] Dgt-28, dgt-32 ou dgt-33, sozinho ou empilhado com uma ou mais características HT adicionais, são empilhados com uma ou mais características de entrada adicionais (por exemplo, resistência a inseto, resistência fúngica ou tolerância a estresse e outros) (vide www.isb.vt.edu), ou através de cruzamento convencional ou em conjunto como um evento de transformação novo. Característica(s) IR é/são empilhadas com dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33. Quando da obtenção de uma sequência de codificação de uma característica IR, elementos de expressão (por exemplo, promotor, íntron, 3’UTR, etc) são adicionados e a característica IR é molecularmente empilhada com dgt- 28, dgt-32 ou dgt-33 através de metodologias de DNA recombinante.
[000382] As características IR incluem: Cry1F (Pat. U.S. Nos. 5.126.133; 5.188.960; 5.691.308; 6.096.708; 6.573.240; e 6.737.273). Cry1A(c) (Pat. U.S. Nos. 6.114.138; 5.710.020; 6.251.656; e 6.229.004). Cry1F e Cry1A(c) como uma pilha tripla com ou dgt-28, dgt-32 ou dgt- 33. Cry34Ab(1) (Pat. U.S. Nos. 7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246; 6.340.593). Cry35 Ab(1) (Pat. U.S. No. 6.340.593; 7.323.556; 7.897.342; 7.888.495; 7.875.430; 7.932.033; 7.956.246). e/ou Cry35Ab(1) e Cry 34Ab(1) como uma pilha tripla com dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33.
[000383] Os benefícios incluem o controle aperfeiçoado de erva daninha oferecido por dgt-28, dgt-32 ou dgt-33, e descrito em exemplos anteriores, ligado com a habilidade em tratar pestes de inseto e/ou outros estresses agronômicos. Plantas compreendendo tais características empilhadas com dgt-28, dgt-32 e/ou dgt-33 proveem um pacote agronômico completo de qualidade de cultura aperfeiçoada com a habilidade de controlar flexivelmente e com custo eficaz qualquer número de questões agronômicas. Características IR e HT combinadas têm aplicação na maioria das culturas horticulturais/ornamentais e silvicultura.
[000384] A combinação de dgt-28, dgt-32 ou dgt-33 e a tolerância a herbicida e resistência a inseto comensuráveis fornecidas por qualquer número de genes IR Bt ou não Bt pode ser aplicada às espécies de cultura listadas aqui. Uso de qualquer um de vários herbicidas comerciais listados aqui em tais culturas é possibilitado por transformação com dgt-28, dgt-32 ou dgt-33 e empilhamento com a característica HT ou característica IR correspondente, ou através de cruzamento convencional ou engenharia genética. Taxas de aplicação específicas de herbicidas representativas dessas químicas são determinadas pelos rótulos de herbicida compilados no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados online (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer orientações de proteção de cultura comerciais ou acadêmicas tal como o Crop Protection Guide for Agriliance (2005).
Exemplo 16: Característica de DGT Empilhada com uma Característica de AAD em qualquer Cultura
[000385] Ao empilhar uma característica de dgt com uma característica de aad (por exemplo, aad-1 descrito na Patente U.S. 7.838.733; ou aad-12 descrito na Publicação de Patente Internacional PCT No. WO 2007/053482 A2), ou através de cruzamento convencional ou em conjunto como um novo evento de transformação, eficácia de controle de erva daninha, flexibilidade e a habilidade em tratar mudanças de erva daninha e desenvolvimento de resistência a herbicida são aperfeiçoados.
[000386] Transformação de culturas com aad-1 permite que um agricultor aplique seletivamente herbicidas de ariloxialcanoato em culturas monocotiledôneas. Tais culturas monocotiledôneas terão uma margem maior de segurança para fenóxi auxina. Ainda, fenóxi auxinas podem ser seletivamente aplicadas em culturas dicotiledôneas transformadas com aad-1. Transformação de culturas com aad-12 permite que um agricultor aplique seletivamente herbicidas piridilóxi auxina e ariloxialcanoato em culturas dicotiledôneas para controlar espécies daninhas. Ao empilhar dgt-28, dgt-32 ou dgt-33 com as características aad-1 ou aad-12, os agricultores são providos com um espectro mais amplo de herbicidas para o tratamento de ervas daninhas. Além disso, o uso de combinações de herbicida resulta em maior flexibilidade para tratamento de resistência a herbicida em espécies daninhas.
[000387] As opções de controle de erva daninha que seguem são providas para uma planta onde uma característica dgt e uma característica aad são empilhadas em qualquer espécie de cultura monocotiledônea ou dicotiledônea:
[000388] A. Glifosato é aplicado em uma taxa de aplicação de pós- emergência padrão (420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha) para o controle da maioria das espécies de erva daninha de grama e folha larga. As características de dgt podem prover tolerância nessas taxas de aplicação de glifosato. Para o controle de ervas daninhas de folha larga resistentes a glifosato tal como Conyza canadenses ou ervas daninhas inerentemente difíceis de controlar com glifosato (por exemplo, Commelina spp.), 280-2240 g ae/ha (por exemplo, 560-1120 g ae/ha) de 2,4-D são aplicados sequencialmente, misturados em tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para prover controle adicional. Ambos o aad-1 e o aad-12 proveem tolerância a 2,4-D. Ainda, aad-12 provê tolerância a herbicidas piridiloxi auxina tais como triclopir e fluroxipir. Os herbicidas piridioloxi auxina são aplicados para controlar ervas daninhas de folha larga resistentes a glifosato tais como Conyza canadenses e Commelina spp. Para triclopir, as taxas de aplicação tipicamente variam de 70-112 g ae/ha, por exemplo, 140-420 g ae/ha. Para fluroxipir, as taxas de aplicação tipicamente variam de 35560 g ae/ha, por exemplo, 70-280 ae/ha.
[000389] B. Glifosato é aplicado em uma taxa de aplicação pós- emergência padrão (420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha) para o controle da maior parte das espécies de erva daninha de gramínea e folha larga. Para o controle de espécies de gramínea resistentes a glifosato tal como Lolium rigidum ou Eleusine indica, 10200 g ae/ha (por exemplo, 20-100 g ae/ha) de quilazofope são aplicados sequencialmente, misturados em tanque ou como uma pré-mistura com glifosato para prover controle eficaz. aad-1 provê tolerância a quilazofope. Empilhamento de aad-1 em combinação com dgt-28, dgt- 32 ou dgt-33 em espécies de cultura resulta em culturas que são tolerantes aos herbicidas descritos acima.
[000390] C. Glifosato é eficaz no controle de espécies de gramínea que não espécies de erva daninha de folha larga. As características empilhadas de aad-2 e dgt-28, dgt-32 ou dgt-33 permitem a aplicação de taxas eficazes em gramínea de glifosato (105-840 g ae/ha, por exemplo, 210-420 g ae/ha). 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, por exemplo, 560-1120 g ae/ha) é então aplicado sequencialmente, misturado em tanque, ou como uma pré-mistura, com taxas eficazes para gramínea de glifosato para prover controle de erva daninha de folha larga necessário. Um herbicida AOPP tal como quilazofope a 10-200 g ae/ha (por exemplo, 20-100 g ae/ha e 20-35 g ae/ha) é usado para controle de erva daninha de gramínea mais robusto e/ou para retardar o desenvolvimento de gramíneas resistentes a glifosato. A taxa baixa de glifosato também provê algum benefício para o controle de erva daninha de folha larga; no entanto, controle principal é da 2,4-D.
[000391] D. Da mesma maneira, as características empilhadas de aad-12 e dgt-28, dgt-32 ou dgt-33 permitem a aplicação de taxas de glifosato eficazes para gramínea (105-840 g ae/ha, por exemplo, 210420 g ae/ha). 2,4-D (a 280-2240 g ae/ha, por exemplo, 560-1120 g ae/ha) é então aplicada sequencialmente, misturada em tanque, ou como uma pré-mistura com taxas eficazes em gramínea de glifosato para prover controle de erva daninha de folha larga necessário. Triclopir e fluroxipir usados nas taxas mencionadas acima também são componentes aceitáveis no regime de tratamento. A taxa baixa de glifosato também provê algum benefício para o controle de erva daninha de folha larga; no entanto, controle principal é de 2,4-D, triclopir ou fluroxipir.
[000392] Uso de um ou mais herbicidas arilóxi auxina comerciais sozinho ou em combinação (sequencialmente ou independentemente) é facilitado por transformação de aad-12 em culturas. Da mesma maneira, o uso de um ou mais herbicidas de fenóxi auxina comerciais sozinho ou em combinação (sequencialmente ou independentemente) com um ou mais herbicidas AOPP comerciais é facilitado por aad-1. Empilhamento de qualquer uma dessas características com dgt-28, dgt- 32 ou dgt-33 permite tratamento mais robusto de espécies daninhas. As taxas específicas de outros herbicidas representativos dessas químicas são determinadas pelos rótulos do herbicida compilados no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados online (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer outras orientações de proteção de cultura comerciais ou acadêmicas tal como o Crop Protection Guide for Agriliance (2005).
Exemplo 17: dgt-28 Empilhado com Característica de AHAS em qualquer Cultura
[000393] Características codificando tolerância ao herbicida imidazolinona (AHAS) estão atualmente presentes em várias culturas plantadas na América do Norte incluindo, mas não limitado a, milho, arroz, girassol e trigo. Culturas tolerantes a imidazolinona adicionais (por exemplo, algodão e beterraba açucareira) estão sob desenvolvimento. Muitos herbicidas de imidazolinona (por exemplo, imazamox, imazetapir, imazaquina e imazapique) são atualmente usados seletivamente em várias culturas convencionais. O uso de imazetapir, imazamox e do imazapir não seletivo foi facilitado através de características de tolerância à imidazolinona tal como AHAS. HTCs tolerantes à imidazolinona até agora têm a vantagem de ser não transgênicos. Esta classe química também tem atividade residual no solo significante, desta maneira sendo capaz de prover controle de erva daninha que se estende além do momento da aplicação, diferente dos sistemas baseados em glifosato ou glufosinato. No entanto, o espectro de ervas daninhas controladas por herbicidas imidazolinona não é tão amplo quanto glifosato (Agriliance, 2003). Ainda, herbicidas de imidazolinona têm um modo de ação (inibição de acetolactato sintase, ALS) ao qual muitas ervas daninhas desenvolveram resistência (Heap I (2004). The international survey of herbicide resistant weeds, available at www.weedscience.com).
[000394] dgt-28 é empilhado com uma característica de tolerância à imidazolinona, ou através de cruzamento convencional ou em conjunto como um novo evento de transformação, e eficácia em controlar erva daninha, flexibilidade e habilidade em tratar mudanças de erva daninha e desenvolvimento de resistência a herbicida são aperfeiçoados.
[000395] As opções de controle de erva daninha que seguem são providas para uma planta onde uma característica de dgt e uma característica de tolerância a imidazolinona são empilhadas em espécies de cultura monocotiledônea ou dicotiledônea:
[000396] A. Imazetapir é aplicado em uma taxa de aplicação de pós- emergência padrão (35 a 280 g ae/ha, por exemplo, 70-140 g ae/ha) para o controle de muitas espécies de erva daninha de gramínea e folha larga. i) ervas daninhas de folha larga resistentes a inibidor de ALS tais como Amaranthus rudis, Ambrosia trifida, Chenopodium album (dentre outras, Heap, 2004) são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 a 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha. ii) espécies de folha larga inerentemente mais tolerantes a herbicidas imidadzolina tal como Ipomoea spp. são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 até 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha. iii) ervas daninhas de gramínea resistentes a inibidor de ALS tal como Sorghum halepense e Lolium spp. são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 até 2160 g ae/ha, por exemplo, 50 a 1120 g ae/ha. iv) espécies de erva daninha inerentemente tolerantes (por exemplo, Agropyron repens) são controladas por glifosato de mistura em tanque a 420 até 2160 g ae/ha, por exemplo, 560 a 1120 g ae/ha.
[000397] Uso de qualquer um de vários herbicidas imidazolinona ou herbicida glifosato comerciais, sozinhos ou em combinações múltiplas, é facilitado por transformação com dgt-28 e empilhamento com qualquer característica de tolerância à imidazolinona, ou através de cruzamento convencional ou engenharia genética. Taxas específicas de outros herbicidas representativos dessas químicas são determinadas pelos rótulos de herbicida compilados no livro CPR (Crop Protection Reference) ou compilação similar, rótulos compilados online (por exemplo, cdms.net/manuf/manuf.asp) ou quaisquer orientações de proteção de cultura comerciais ou acadêmicas tal como o Crop Protection Guide for Agriliance (2005).
Exemplo 18: Transformação de Soja
[000398] Soja transgênica (Glycine max) contendo um transgene dgt- 28 estavelmente integrado é gerada através de transformação mediada por Agrobacterium de explantes de nó cotiledonário de soja. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 convencional é usada para iniciar a transformação.
[000399] Transformação mediada por Agrobacterium é realizada usando um procedimento de metade de nó cotiledonário modificado de Zeng e outros (Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C., (2004), Plant Cell Rep., 22(7): 478-482). Em suma, sementes de soja (cv. Maverick) são germinadas em meio basal e nós cotiledonários são isolados e infectados com Agrobacterium. Início do broto, alongamento do broto e meios de enraizamento são suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção através de um herbicida é empregada para inibir o crescimento de brotos não transformados. Os brotos selecionados são transferidos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatação das mudas.
[000400] Folhinhas terminais de mudas selecionadas são tratadas topicamente (técnica de pintura da folha) com um herbicida para avaliar os transformantes putativos. As mudas avaliadas são transferidas para a estufa, deixadas aclimatar e então têm as folhas pintadas com um herbicida para reconfirmar tolerância. Essas plantas T0 putativas transformadas são amostradas e análise molecular é usada para confirmar a presença do marcador selecionável herbicida e o transgene dgt-28. As plantas T0 são deixadas autofertilizar na estufa para produzir semente T1.
[000401] Um segundo método de transformação de soja pode ser usado para produzir plantas de soja transgênicas adicionais. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é usada para iniciar a transformação.
[000402] Transformação mediada por Agrobacterium é realizada usando um procedimento de metade de semente modificado de Paz e outros(Paz, M., Martinez, J., Kalvig, A., Fonger, T. e Wang, K., (2005) Plant Cell Rep., 25: 206-213). Em suma, sementes de soja maduras são esterilizadas de um dia para o outro com gás de cloro e embebidas em H2O estéril vinte horas antes da transformação de planta mediada por Agrobacterium. As sementes são cortadas na metade com um corte longitudinal ao longo do hilo para separar a semente e remover o revestimento da semente. O eixo embriônico é excisado e quaisquer brotos/rebentos axiais são removidos do nó cotiledonário. Os explantes de metade de semente resultantes são infectados com Agrobacterium. Início de broto, alongamento de broto e meio de enraizamento são suplementados com cefotaxima, timentina e vancomicina para remoção de Agrobacterium. Seleção de herbicida é empregada para inibir o crescimento de brotos não transformados. Os brotos selecionados são transferidos para meio de enraizamento para desenvolvimento de raiz e então transferidos para mistura de solo para aclimatação das mudas.
[000403] Folhinhas terminais de mudas selecionadas são tratadas topicamente (técnica de pintura de folha) com um herbicida para avaliar transformantes putativos. As mudas avaliadas são transferidas para a estufa, deixadas aclimatar e então têm as folhas pintadas com um herbicida para reconfirmar a tolerância. Essas plantas T0 putativas transformadas são amostradas e análise molecular é usada para confirmar a presença do marcador selecionável e do transgene dgt-28. Vários eventos são identificados como contendo os transgenes. Essas plantas T0 são avançadas para análise adicional e deixadas autofertilizar na estufa para dar origem à semente T1.
[000404] Confirmação de capacidade de herança de dgt-28 para a geração Ti. A capacidade de herança da proteína DGT-28 para a geração T1 foi avaliada em uma de duas maneiras. O primeiro método incluía plantio de semente Ti em meio de mistura Metro e aplicação de 4ii g ae/ha de IGNITE® 280 SL às plantas germinadas no primeiro estágio de crescimento de três folhas. O segundo método consistia em homogeneização da semente para um total de 8 réplicas usando um rolamento ou e um genogrinder. Testes de tira de ELISA para detectar a proteína PAT foram então usados para detectar eventos de herança uma vez que o marcador selecionável estava no mesmo plastídeo que dgt-28. Para qualquer método se uma única planta fosse tolerante a glufosinato ou fosse detectada com o teste de tira de ELISA PAT, o evento demonstrou capacidade de herança para a geração Ti.
[000405] Um total de cinco construtos foi avaliado quanto à capacidade de herança conforme anteriormente descrito. Os plasmídeos continham dgt-28 ligado a TraP4, TraP8 e TraP23. Os eventos nos construtos demonstraram 68% de capacidade de herança da proteína PAT:DGT-28 para a geração Ti.
[000406] Tolerância a herbicida pós-emergência na soja Ti transformada com dgt-28. Sementes de eventos Ti que foram determinados ser herdáveis através dos métodos de avaliação anteriormente descritos foram plantadas em meio de mistura Metro sob condições de estufa. As plantas foram cultivadas até o 1° trifoliato ter expandido totalmente e tratadas com 4ii g ae/ha de IGNITE® 280 SL para seleção do gene pat conforme anteriormente descrito. Plantas resistentes de cada evento receberam identificadores únicos e foram amostradas para análise de zigosidade do gene dgt-28. Os dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas para cada taxa de glifosato aplicada permitindo um total de 4 réplicas por tratamento quando plantas suficientes existiam. Essas plantas foram comparadas com tabaco havana Petite do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa ajustado em 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de uma taxa de 560-4480 g ae/ha de sal de dimetilamina DURANGO® (DMA). Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2% p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias após tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação ao embotamento, clorose e necrose visuais gerais. A geração T1 é segregante, deste modo resposta um pouco variável é esperada devido à diferença em zigosidade.
[000407] Tabela 24. Os resultados da pulverização demonstram em 14 DAT (dias após tratamento) tolerância robusta até 4480 g ae/ha de glifosato de pelo menos um dgt-28 por construto caracterizado. Eventos de cópia única representativos dos construtos proveram todos tolerância até 4480 g ae/ha comparado com o controle negativo Maverick.
Figure img0035
Figure img0036
[000408] Proteção de dgt-28 contra taxas de glifosato elevadas na geração T2. Um teste de 45 progênies de planta foi conduzido em duas até cinco linhagens T2de dgt-28 por construto. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base em análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementes foram plantadas conforme anteriormente descrito. As plantas foram então pulverizadas com 411 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas.
[000409] Para construtos contendo TraP ligado com dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107548), nove de doze linhagens testadas não segregaram, desta maneira confirmando linhagens homogêneas na geração T2. As linhagens contendo TraP8 ligado com dgt-28 (pDAB107545) demonstraram duas das quatro linhagens sem quaisquer segregantes e demonstrando herança Mendeliana em pelo menos duas gerações de dgt-28 em soja. Amostras de tecido foram obtidas de plantas resistentes e a proteína DGT-28 foi quantificada através de métodos ELISA padrão. Os dados demonstraram uma faixa de proteína DGT-28 média de 32,8-107,5 ng/cm2 para linhagens T2 não segregantes testadas. As linhagens do construto pDAB107553 (TraP23::dgt-28) não foram previamente selecionada com glufosinato, e a resposta de dose de glifosinato foi utilizada como ambos para testar a homogeneidade e a tolerância a taxas elevadas de glifosato. Réplicas das linhagens do construto pDAB107553 eram tolerantes a taxas variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato e foram então confirmadas ser uma população homogênea e herdável para pelo menos duas gerações.
[000410] Taxas de DURANGO DMA variando de 560-4480 g ae/ha de glifosato foram aplicadas a 2-3 sojas trifoliadas conforme anteriormente descrito. Os dados de lesão visual 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram demonstrados na geração T1.
[000411] Tabela 25. Os dados demonstram tolerância robusta do tabaco dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato em duas gerações, comparado com o controle não transformado.
Figure img0037
Exemplo 19: Transformação de Arroz com dgt-28
[000412] Em um método de transformação exemplar, arroz transgênicos (Oryza sativa) contendo um transgene dgt-28 estavelmente integrado é gerado através de transformação mediada com Agrobacterium de semente de arroz esterilizada. Uma linhagem de Agrobacterium desarmada carregando um vetor binário contendo um dgt-28 funcional é usada para iniciar a transformação.
[000413] Meios de cultura são ajustados para pH 5,8 com KOH 1M e solidificados com 2,5 g/l de Phytagel (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Calos embriogênicos são culturados em placas de Petri de 100 x 20 mm contendo 30 ml de meio semissólido. As mudas de arroz são cultivadas em 50 ml de meio em caixas MAGENTA. As suspensões celulares são mantidas em frascos cônicos de 125 ml contendo 35 mL de meio líquido e giradas a 125 rpm. Indução e manutenção de culturas embriogênicas ocorrem no escuro a 25-26° C e regeneração de planta e cultura de planta inteira ocorrem em sala iluminada com um fotoperíodo de 16 h (Zhang e outros, 1996).
[000414] Indução e manutenção de calo embriogênico são realizadas em um meio basal NB modificado conforme anteriormente descrito (Li e outros, 1993), onde o meio é adaptado para conter 500 mg/L de glutamina. Culturas em suspensão são iniciadas e mantidas em meio líquido SZ (Zhang e outros, 1998) com a inclusão de 30 g/L de sacarose no lugar da maltose. Meio osmótico (NBO) consistindo em meio NB com a adição de 0,256 M de cada um de manitol e sorbitol. Calo resistente a herbicida é selecionado em meio NB suplementado com o agente seletivo de herbicida apropriado por 3-4 semanas. Pré-regeneração é realizada em meio (PRH50) consistindo em meio NB com ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D), 1 mg/ml de ácido a-naftalenoacético (NAA), 5 mg/l de ácido abscísico (ABA) e herbicida seletivo por 1 semana. Regeneração de mudas segue a cultura em meio de regeneração (RNH50) compreendendo meio NB contendo 2,4-D, 0,5 mg/ml de NAA e herbicida seletivo até que brotos putativamente transgênicos sejam regenerados. Os brotos são transferidos para meio de enraizamento com sais basais Murashige e Skoog de média-resistência e vitaminas B5 da Gamborg, suplementado com sacarose 1% e herbicida seletivo.
[000415] Sementes dissecadas maduras de Oryza sativa L. japonica vc. Taipei 309 são esterilizadas conforme descrito em Zhang e outros, 1996. Tecidos embriogênicos são induzidos através de cultura de sementes de arroz maduras estéreis em meio NB no escuro. O calo primário de aproximadamente 1 mm de diâmetro é removido do escutelo e usado para iniciar suspensão celular em meio líquido SZ. As suspensões são então mantidas conforme descrito em Zhang, 1996. Tecidos embriogênicos derivados de suspensão são removidos de cultura líquida 3-5 dias após a subcultura prévia e postos em meio osmótico NBO para formar um círculo de cerca de 2,5 cm de um lado ao outro em uma placa de Petri e culturados por 4 horas antes do bombardeamento. Dezesseis a vinte horas após bombardeamento, os tecidos são transferidos do meio NBO para meio de seleção NBH50, assegurando que a superfície de bombardeamento esteja faceando para cima, e incubados no escuro por 14-17 dias. Calo recém-formado é então separado dos explantes de bombardeamento originais e posto nos arredores no mesmo meio. Seguindo mais 8-12 dias, calo relativamente compacto, opaco, é visualmente identificado e transferido para meio de pré-regeneração PRH50 por 7 dias no escuro. Calo em crescimento, que se torna mais compacto e opaco, é então subculturado em meio de regeneração RNH50 por um período de 14-21 dias sob um fotoperíodo de 16 h. Brotos em regeneração são transferidos para caixas MAGENTA contendo meio MSH50 1. Plantas múltiplas regeneradas a partir de um explante único são consideradas irmãs e são tratadas como uma linhagem de planta independente. Uma planta é classificada como positiva para o gene dgt-28 se ela produzir raízes brancas, espessas, e crescer vigorosamente em meio MSH50 1. Assim que as mudas atingem o topo das caixas MAGENTA, elas são transferidas para o solo em um pote de 6 cm sob 100% de umidade por uma semana e então são levadas para uma câmara de crescimento com um período de luz de 14 h a 30° C e no escuro a 21° C por 2-3 semanas antes do transplante para potes de 13 cm na estufa. As sementes são coletadas e secas a 37° C por uma semana antes do armazenamento a 4° C.
[000416] Análise To de arroz dgt-28. Transformantes de arroz transplantados produzidos através de transformação com Agrobacterium foram transplantados para o meio e aclimatados a condições de estufa. Todas as plantas foram amostradas para detecção por PCR de dgt-28 e os resultados demonstram vinte e dois eventos positivos para PCR para pDAB110827 (TraP8::dgt-28) e um mínimo de dezesseis eventos positivos para PCR para pDAB110828 (TraP23::dgt- 28). Análise Southern para dgt-28 dos eventos positivos para PCR demonstrou eventos únicos (1-2 cópias) para ambos os construtos. Expressão de proteína de eventos T0 selecionados demonstrou faixas de expressão de proteína DGT-28 de abaixo dos níveis de detecção até 130 ng/cm2. Eventos T0 selecionados do construto pDAB110828 foram tratados com 2240 g ae/ha de DURANGO DMA® conforme anteriormente descrito e avaliado 7 e 14 dias após tratamento. Os dados demonstraram tolerância robusta à taxa de glifosato aplicada. Todas as plantas positivas para PCR foram deixadas produzir semente T1 para caracterização adicional.
[000417] Capacidade de herança de dgt-28 em arroz. Um teste de progênie de 100 plantas foi conduzido em quatro linhagens T1 de dgt-28 do construto pDAB110827 contendo o peptídeo de trânsito de cloroplasto TraP8. As sementes foram plantadas em potes cheios com meio. Todas as plantas foram então pulverizadas com 560 g ae/ha de DURANGO DMA® para a seleção do gene dgt-28 conforme anteriormente descrito. Após 7 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Duas das quatro linhagens testadas para cada construto segregaram como um característica Mendeliana dominante (3R:1S), de locus único, conforme determinado através de análise do Qui quadrado. dgt-28 é um gene de resistência a glifosato herdável em espécies múltiplas.
[000418] Tolerância a herbicida pós-emergência em arroz Ti transformado com dgt-28. Plantas resistentes Ti de cada evento usadas o teste de progênie receberam identificadores únicos e amostradas para análise de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas para cada taxa de glifosato aplicado permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Essas plantas foram comparadas com arroz kitaake do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa ajustado a i87 L/ha. As plantas foram pulverizadas a partir de uma faixa de 560-2240 g ae/ha de DURANGO DMA®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2% p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e i4 dias após tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação a embotamento, clorose e necrose visuais gerais. A geração Ti é segregante, então alguma resposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.
[000419] Os resultados da pulverização demonstram em 7 DAT (dias após tratamento) lesão vegetativa mínima para taxas elevadas de glifosato que foram detectadas (dados não mostrados).
[000420] Tabela 26. Dados de lesão visual em i4 DAT demonstram menos do que i5% de lesão visual média até 2240 g ae/ha de glifosato.
Figure img0038
[000421] Detecção de proteína de DGT-28 foi avaliada para réplicas de todas as quatro linhagens T1 testadas de pDAB110827. Os dados demonstraram faixas de proteína médias de DGT-28 de a partir de 2082 ng/cm2 e 21-109 ng/cm2 para réplicas hemizigotas e homozigotas, respectivamente. Esses resultados demonstraram expressão de proteína estável para a geração T1 e tolerância de arroz dgt-28 até 2240 g ae/ha de glifosato seguindo uma aplicação de 560 g ae/ha de glifosato usado para seleção.
Exemplo 20: Transformação de Grama TurfGrass com dgt-28
[000422] Transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens do transgene de dgt-28 em agróstea rastejante (creeping bentgrass) é obtida através de calo embriogênicos iniciado a partir de sementes (cv. Penn-A-4). Vide “Efficiency of Agrobacterium tumefaciens-mediated turfgrass (Agrostis stolonifera L) transformation” (Luo e outros, 2004).
[000423] Célula de calo são infectadas com uma linhagem de A. tumefaciens carregando um vetor superbinário que contém um transgene resistente a herbicida direcionado (por exemplo, dgt-28) por um promotor específico de monocotiledônea. A eficiência de transformação estável geral varia de 18% a 45%. Southern blot e análise genética confirmam integração de transgene dentro do genoma da agróstea rastejante e transmissão normal e expressão estável do transgene na geração T1. Todos os eventos de transformação independentes carregam uma a três cópias do transgene, e a maioria (60-65%) contém apenas uma cópia única do transgene sem quaisquer rearranjos aparentes.
[000424] As semente maduras são descascadas com lixa e esterilizadas na superfície em 10% (v/v) de alvejante Clorox® (hipoclorito de sódio 6%) mais Tween 20 0,2% (v/v) (Polissorbato 20) com agitação vigorosa por 90 minutos. Seguindo enxágue cinco vezes em água destilada estéril, as sementes são postas em meio de indução de calo (sais basais MS e vitaminas, 30 g/l de sacarose, 500 mg/l de hidrolisado de caseína, 6,6 mg/l de ácido 3,6-dicloro-o-anísico (dicamba), 0,5 mg/l de 6-benzilaminopurina (BAP) e 2 g/l Phytagel. O pH do meio é ajustado para 5,7 antes da autoclavagem a 120° C por 20 minutos).
[000425] As placas de cultura contendo explantes de semente preparados são mantidas no escuro em temperatura ambiente por 6 semanas. Calos embriogênicos são visualmente selecionados e subculturados em meio de indução de calo fresco no escuro em temperatura ambiente por 1 semana antes do co-cultivo.
[000426] Um dia antes da infecção mediada por Agrobacterium, o calo embriogênico é divido em pedaços de 1 a 2 mm e posto em meio de indução de calo contendo 100 μM de acetosiringona. Uma alíquota de 10 μl de suspensão de Agrobacterium (OD=1,0 a 660 nm) que carrega o transgene dgt-27 é então aplicada a cada pedaço do calo, seguido por 3 dias de co-cultivo no escuro a 25° C. O calo é então transferido e culturado por 2 semanas em meio de indução de calo mais 125 mg/ml de cefotaxima e 250 mg/ml de carbenicilina para suprimir crescimento bacteriano.
[000427] Seleção de plantas transgênicas ocorre quando o calo é levado para meio de indução de calo contendo 250 mg/ml de cefotaxima e um herbicida. O material de calo é mantido neste meio por 8 semanas com um intervalo de subcultura de seleção de 3 semanas. O processo de seleção é realizado em temperatura ambiente no escuro.
[000428] Para regeneração de planta, os eventos de calo de proliferação resistentes a herbicida são primeiro levados para meio de regeneração (meio basal MS, 30 g/l de sacarose, 100 mg/l de mio- inositol, 1 mg/l de BAP e 2 g/l de Phytagel) suplementado com cefotaxima e um herbicida para seleção. Esses calos são mantidos no escuro em temperatura ambiente por 1 semana e então levados para a luz por 2-3 semanas para desenvolver brotos.
[000429] Os brotos desenvolvidos são separados e transferidos para meio de regeneração livre de hormônio contendo um herbicida e cefotaxima para promover crescimento de raiz enquanto mantendo pressão de seleção e supressão de quaisquer células de Agrobacterium restantes. As mudas com raízes bem desenvolvidas (3-5 semanas) são então transferidas para o solo e cultivadas ou na estufa ou no campo.
[000430] As plantas transgênicas são mantidas no exterior em um berçário de contenção (3-6 meses) até o solstício de inverno em dezembro. As plantas vernalizadas são então transferidas para a estufa e mantidas a 25° C sob um fotoperíodo de 16/8 h e circundadas por plantas controle não transgênicas que isolam fisicamente as plantas transgênicas de outras fontes de pólen. As plantas transgênicas começam a florescer 3-4 semanas após serem levadas de volta para a estufa. Essas plantas são cruzadas com o pólen de plantas controle circundantes. As sementes coletadas de cada planta transgênica individual são germinadas em solo a 25° C e plantas Ti são cultivadas na estufa para análise adicional.
[000431] Outras gramas são transformadas com dgt-28 de acordo com o protocolo descrito, incluindo grama do prado anual (Annual meadowgrass (Poa annua)), grama da Bahia (Bahiagrass), agrostis (Bentgrass), grama bermuda (Bermudagrass), grama azul (Bluegrass), tronco azul (Bluestems), braquiária (Brachiaria), grama brome (Bromegrass), panasco (Browntop bent (Agrostis capillaries)), grama búfafo (Buffalograss), grama de canário (Canary Grass), grama tapete (Carpetgrass), grama centípede (Centipedegrass), festuca vermelha mastigável (Chewings fescue (Festuca rubra commutate)), capim- colchão (Crabgrass), erva-fina (Creeping bent (Agrostis stolonifera)), Crested hairgrass (Koeleria macrantha), capim-melador (Dallisgrass), festuca (Fescue), Festolium, festuca-ovelha (Hard/sheeps fescue (Festuca ovina)), grama Gramagrass, grama Indiangrass, grama Johnsongrass, Lovegrass, misturas (Equina, Pasto, etc.), Gramas Nativas, grama Orchardgrass, azevém perene (Perennial ryegrass (Lolium perene)), grama Redtop, grama Rescuegrass, azevém anual e perene (annual and perennial Ryegrass), festuca rubra delgada (Slender creeping red fescue (Festuca rubra trichophylla)), grama dos prados (Smooth-stalked meadowgrass (Poa pratensis)), grama St. Agostinho, festuca rubra grossa (Strong creeping red fescue (Festuca rubra rubra)), grama Sudangrass, grama Switchgrass, festuca alta (Tall fescue (Festuca arundinacea)), grama Tufted hairgrass (Deschampsia caespitosa), grama Turfgrasses, erva-de-trigo (Wheatgrass) e grama esmeralda (Zoysiagrass).
Exemplo 21: Transformação de Brassica spp. com dgt-28
[000432] O gene dgt-28 conferindo resistência a glifosato é usado para transforma Brassica napus var. Nexera® 710 com transformação mediada por Agrobacterium.
[000433] Sementes de Brassica napus são esterilizadas na superfície com alvejante comercial 10% por 10 minutos e enxaguadas 3 vezes com água destilada estéril. As sementes são então postas em metade da concentração de meio basal MS (Murashige e Skoog, 1962) e mantidas sob regime de crescimento ajustado a 25° C e um fotoperíodo de 16 h de luz/8 horas escuro.
[000434] Segmentos hipocotiledôneos (3-5 mm) são excisados de mudas de 5-7 dias de vida e postos em meio de indução de calo K1D1 (meio MS com 1 mg/l de quinetina e 1 mg/l de 2,4-D) por 3 dias como pré-tratamento. Os segmentos são então transferidos para uma placa de Petri e tratados com uma linhagem de Agrobacterium tumefaciens contendo um construto compreendendo dgt-28. A Agrobacterium tumefaciens é cultivada de um dia para o outro a 28° C no escuro em um agitador a 150 rpm e subsequentemente ressuspensa no meio de cultura.
[000435] Depois de um tratamento de 30 minutos dos segmentos hipocotiledôneos com Agrobacterium, esses segmentos são postos de volta no meio de indução de calo por 3 dias. Seguindo co-cultivo, os segmentos são postos em K1D1TC (meio de indução de calo contendo 250 mg/l de Carbenicilina e 300 mg/l de Timentina) por uma semana de recuperação. Alternativamente, os segmentos são postos diretamente em meio de seleção K1D1H1 (meio acima com um herbicida). Carbenicilina e Timentina são os antibióticos usados para matar a Agrobacterium. O agente de seleção permite o crescimento das células transformadas.
[000436] Amostras de calo de eventos independentes isolados são testadas através de PCR. As amostras que testam positivas para a presença de dgt-28 são confirmadas e avançadas para meio para regeneração. Os segmentos hipocotiledôneos com calo são então postos em B3Z1H1 (meio MS, 3 mg/ml de benzilamino purina, 1 mg/l de Zeatina, 0,5 gm/l de meio de regeneração de broto MES [ ácido 2-(N- morfolino)etano sulfônico], 5 mg/l de nitrato de prata, herbicida seletivo, Carbenicilina e Timentina). Depois de 3 semanas os brotos começam a regeneração. Segmentos hipocotiledôneos junto com os brotos são transferidos para meio B3Z1H3 (Meio MS, 3 mg/l de benzilamino purina, 1 mg/ml de Zeatina, 0,5 g/l de MES [ácido 2-(N-morfolino)etano sulfônico], 5 mg/l de nitrato de prata, herbicida seletivo, Carbenicilina e Timentina) por mais 3 semanas.
[000437] Os brotos são excisados dos segmentos hipocotiledôneos e transferidos para meio de alongamento de broto MESH10 (MS, 0,5 g/l de MES, herbicida seletivo, Carbenicilina, Timentina) por 2-4 semanas. Os brotos alongados são culturados para indução de raiz em MSI.1 (MS com 0,1 mg/l de ácido Indolbutírico). Uma vez as plantas tendo estabelecido um sistema de raiz, as plantas são transportadas para o solo. As plantas são aclimatadas sob condições ambientais controladas em um Conviron® por 1-2 semanas antes da transferência para a estufa.
[000438] As plantas T0 transformadas são autopolinadas na estufa para obter semente T1. As plantas T0 e a progênie T1 são pulverizadas com uma faixa de concentrações de herbicida glifosato para estabelecer o nível de proteção pelo gene dgt-28.
Exemplo 22: Transformação de Tabaco com dgt-28
[000439] Pedaços de folha de tabaco (cv. Petit Havana) são transformados usando Agrobacterium tumefaciens contendo o transgene dgt-28. Colônias únicas contendo o plasmídeo que contém o transgene dgt-28 são inoculadas em 4 mL de meio YEP contendo espectinomicina (50 μg/mL) e estreptomicina (125 μg/mL) e incubadas de um dia para o outro a 28° C em um agitador a 190 rpm. Os 4 mL de cultura de semente são subsequentemente usados para inocular uma cultura de 25 mL do mesmo meio em um frasco Erlenmeyer com reentrância no fundo de 125 mL. Esta cultura é incubada a 28° C agitando a 190 rpm até que ela atinja um OD600 de ~1,2. Dez mL de suspensão de Agrobacterium são então postos em placas de Petri® de 60 x 20 mm estéreis.
[000440] Pedaços de folha recém-cortados (0,5 cm2) de plantas assepticamente cultivadas em meio MS (Phytotechnology Labs, Shawnee Mission, KS) com 30 g/L de sacarose em PhytaTrays® (Sigma, St. Louis, MO) são embebidos em 10 mL de cultura de Agrobacterium de um dia para o outro por alguns minutos, secos com papel absorvente em papel filtro estéril e então postos no mesmo meio com a adição de 1 mg/L de ácido indolacético e 1 mg/L de 6-benzilamino purina. Três dias depois, pedaços de folha co-cultivados com Agrobacterium carregando o transgene dgt-28 são transferidos para o mesmo meio com 5 mg/L de Basta® e 250 mg/L de cefotaxima.
[000441] Depois de 3 semanas, mudas T0 individuais são transferidas para meio MS com 10 mg/L de Basta® e 250 mg/L de cefotaxima mais 3 semanas antes do transplante para o solo e transferência para estufa. Plantas T0 selecionadas (conforme identificado usando protocolos de análise molecular descritos acima) são deixadas autopolinar e semente é coletada de cápsulas quando elas são completamente secas. Mudas T1 são avaliadas quanto à zigosidade e expressão de gene repórter (conforme descrito abaixo) e plantas selecionadas contendo o transgene dgt-28 são identificadas.
[000442] As plantas são levadas para a estufa através de lavagem do ágar das raízes, transplante para o solo em potes de 13,75 cm2, pondo o pote em uma bolsa Ziploc® (SC Johnson & Son, Inc.), pondo água da torneira no fundo da bolsa e pondo em luz indireta em uma estufa a 30° C por uma semana. Depois de 3-7 dias, a bolsa foi aberta; as plantas foram fertilizadas e deixadas crescer na bolsa aberta até que as plantas foram aclimatadas na estufa, momento quando a bolsa foi removida. As plantas foram cultivadas sob condições de estufa aquecida comuns (27° C dia, 24° C noite, 16 horas dia, luz natural mínima + suplementar = 1200 μE/m2s1).
[000443] Antes da propagação, plantas T0 foram amostradas para análise de DNA para determinar o número de cópia de dgt-28 de inserção através de PCR em tempo real. Tecido fresco foi posto em tubos e liofilizado a 4° C por 2 dias. Após o tecido ter sido totalmente seco, uma conta de tungstênio (Valenite) foi posta no tubo e as amostras foram submetidas a 1 minuto de moagem a seco usando um moedor de conta Kelco. O procedimento de isolamento de DNA DNeasy® padrão foi então seguido (Qiagen, DNeasy 69109). Uma alíquota do DNA extraído foi então tingida com Pico Green (Molecular Probes P7589) e leitura no fluorômetro (BioTek®) com padrões obtidos para obter a concentração em ng/ml. Um total de 100 ng de DNA total foi usado como molde. A reação de PCR foi realizada no termociclizador 9700 Geneamp® (Applied Biosystems), submetendo as amostras a 94° C por 3 minutos e 35 ciclos de 94° C por 30 segundos, 64° C por 30 segundos e 72° C por 1 minuto e 45 segundos seguido por 72° C por 10 minutos. Produtos de PCR foram analisados através de eletroforese em um gel de agarose 1% com EtBr e confirmados através de Southern blots.
[000444] Cinco a nove eventos positivos de PCR com 1-3 cópias de gene dgt-28 de 3 construtos contendo uma sequência de peptídeo de trânsito de cloroplasto diferente (TraP4, TraP8 e TraP23) foram regenerados e levados para a estufa.
[000445] Todas as plantas positivas para PCR foram amostradas quanto à quantificação da proteína DGT-28 através de ELISA padrão. A proteína DGT-28 foi detectada em todas as plantas positivas para PCR e uma tendência para um aumento em concentração de proteína foi notada com número de cópia alto de dgt-28.
[000446] Capacidade de herança de aad-12 (v1) em tabaco. Um teste de progênie de 100 plantas foi conduzido em cinco linhagens T1 de dgt- 28 por construto. Os construtos continham uma das sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto que seguem: TraP4, TraP8 ou TraP23. As sementes foram estratificadas, semeadas e transplantadas com relação muito similar àquela do procedimento de Arabidopsis exemplificado acima, com a exceção que plantas nulas não foram removidas por uma seleção inicial antes do transplante. Todas as plantas foram então pulverizadas com 280 g ae/ha de IGNITE 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Depois de 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas.
[000447] Quatro das cinco linhagens testadas para cada construto segregaram como uma característica Mendeliana dominante (3R:1S), de locus único, conforme determinado através de análise do Qui quadrado. Dgt-28 é um gene de resistência a glifosato herdável em espécies múltiplas.
[000448] Tolerância a herbicida pós-emergência em tabaco TI transformado com dgt-28. Plantas resistentes TI de cada evento usadas no teste de progênie receberam identificadores únicos e foram amostradas para análises de zigosidade do gene dgt-28. Dados de zigosidade foram usados para designar 2 réplicas hemizigotas e 2 homozigotas para cada taxa de glifosato aplicado permitindo um total de 4 réplicas por tratamento. Essas plantas foram comparadas com tabaco havana Petite do tipo selvagem. Todas as plantas foram pulverizadas com um pulverizador de faixa ajustado a 187 L/ha. As plantas foram pulverizadas em uma faixa de a partir de 560-4480 g ae/ha de DURANGO DMA®. Todas as aplicações foram formuladas em água com a adição de sulfato de amônio 2% p/v (AMS). As plantas foram avaliadas em 7 e 14 dias após tratamento. As plantas receberam uma classificação de lesão com relação a embotamento, clorose e necrose visuais gerais. A geração T1 é segregante, desta maneira um pouco de resposta variável é esperada devido à diferença em zigosidade.
[000449] Os resultados de pulverização demonstram em 7 DAT (dias após tratamento) lesão vegetativa mínima a taxas elevadas de glifosato que foram detectadas (dados não mostrados). Seguindo 14 DAT, dados de lesão visual demonstram lesão aumentada com eventos de cópia única do construto contendo TraP4 comparado com eventos de cópia única dos construtos TraP8 e TraP23. Tabela 27.
[000450] Tabela 27. Em uma taxa de 2240 g ae/ha de glifosato, uma lesão média de 37,5% foi demonstrada com o evento contendo TraP4, onde eventos contendo TraP8 e TraP23 demonstraram uma lesão média de 9,3% e 9,5%, respectivamente.
Figure img0039
Figure img0040
[000451] Esses resultados c emonstraram tolerância de dgt-28 até 4480 g ae/ha de glifosato, bem como diferenças em tolerância provida pelas sequências de peptídeo de trânsito de cloroplasto ligadas ao gene dgt-28.
[000452] Proteção de dgt-28 contra taxas de glifosato elevadas na geração T2. Um teste de progênie de 25 plantas foi conduzido em duas a três linhagens T2 de dgt-28 por construto. Linhagens homozigotas foram escolhidas com base nas análises de zigosidade completadas na geração anterior. As sementes foram estratificadas, semeadas e transplantadas conforme anteriormente descrito. Todas as plantas foram então pulverizadas com 280 g ae/ha de Ignite 280 SL para a seleção do marcador selecionável pat conforme anteriormente descrito. Após 3 DAT, plantas resistentes e sensíveis foram contadas. Todas as linhagens testadas para cada construto não segregaram, desta maneira confirmando linhagens homogêneas na geração T2 e demonstrando herança Mendeliana em pelo menos duas gerações de dgt-28 em tabaco.
[000453] Taxas de DURANGO DMA® variando de 420-3360 g ae/ha de glifosato foram aplicadas a 2-3 folhas de tabaco conforme anteriormente descrito. Dados de lesão visual 14 DAT confirmaram os resultados de tolerância que foram demonstrados na geração T1. Resultados foliares de linhagens de duas cópias do construto contendo TraP4 demonstraram tolerância similar àquela de linhagens TraP8 e TraP23 de cópia única (dados não mostrados).
[000454] Tabela 28. Linhagens de cópia única do construto contendo Trap4 com dgt-8 demonstraram lesão aumentada comparado com as linhagens dos construtos contendo TraP8 e TraP23 com dgt-28.
Figure img0041
Figure img0042
[000455] Os dados demonstram tolerância robusta de tabaco dgt-28 até 3360 g ae/ha de glifosato em duas gerações comparado com o controle não transformado.
[000456] Plantas selecionadas de cada evento foram amostradas antes das aplicações de glifosato para análises da proteína DGT-28 através de ELISA DGT-28 padrão. Os dados demonstraram expressão de proteína média DGT-28 das linhagens simples (1-2 cópias) em construtos variando de 72,8-114,5 ng/cm2. Os dados demonstram que dgt-28 está expressando proteína na geração T2 de tabaco transformado e dados de tolerância confirmam proteína DGT-28 funcional.
[000457] Empilhamento de dgt-28 para aumentar o espectro herbicida. Plantas dgt-28 (pDAB107543 e pDAB107545) e aad-12 v1 (pDAB3278) (vide PCT/US2006/042133 para o último, onde semente ambas reciprocamente cruzada e F1 foi coletada). A semente F1 dos dois cruzamentos recíprocos de cada gene foi estratificada e 6 réplicas tratadas de cada cruzamento foram tratadas com 1120 g ae/ha de glifosato (seletivo para o gene dgt-28), 1120 g ae/ha 2,4-D (seletivo para gene aad-12) ou uma mistura de tanque de dois herbicidas nas taxas descritas. As plantas foram classificadas em 14 DAT. Os resultados de pulverização são mostrados na Tabela 29.
[000458] Tabela 29. Resposta de aad-12 e dgt-28 F1.
Figure img0043
[000459] Os resultados confirmam que dgt-28 pode ser empilhado com sucesso com aad-12 (v1), desta maneira aumentando os herbicidas de espectro que podem ser aplicados à cultura de interesse (glifosato + ácidos fenoxiacéticos para dgt-28 e aad-12, respectivamente). Em produção de cultura onde ervas daninhas de folha larga difíceis de controlar ou biotipos de erva daninha resistente existem a pilha pode ser usada como um meio de controle de erva daninha e proteção da cultura de interesse. Características de entrada ou saída adicionais poderiam ser também empilhadas com o gene dgt-28.
Exemplo 23: Resistência a Glifosato em Trigo
[000460] Produção de vetores binários codificando DGT-28. Vetores binários contendo cassetes de expressão de DGT-28 e seleção de PAT foram projetados e montados usando habilidades e técnicas geralmente conhecidas no campo. Cada cassete de expressão de DGT-28 continha o promotor, região não traduzida 5’ e íntron do gene da Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Toki e outros, Plant Physiology 1992, 100, 1503-07), seguido por uma sequência de codificação consistindo em um de quatro peptídeos de trânsito (TraP4, TraP8, TraP23 ou TraP5) fundida à extremidade 5’ de uma versão sintética do gene da 5- enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (DGT-28), que teve o códon otimizado para expressão em plantas. O cassete de expressão de DGT- 28 terminado com uma região não traduzida 3’ (UTR) compreendendo o terminador transcripcional e sítio de poliadenilação de um gene da lipase (Vp1) de Z. mays (Paek e outros, Mol. Cells 1998 30;8(3) 33642). O cassete de seleção PAT compreendido do promotor, região não traduzida 5’ e íntron do gene da Actina (Act1) de Oryza sativa (McElroy e outros, The Planta Cell 1990 2(2) 163-171), seguido por uma versão sintética do gene da fosfinotricino acetil transferase (PAT) isolado de Streptomyces viridochromogenes, que tinha tido o códon otimizado para expressão em plantas. O gene PAT codifica uma proteína que confere resistência a inibidores de glutamina sintetase compreendendo fosfinotricina, glufosinato e bialafos (Wohlleben e outros, Gene 1988, 70(1), 25-37). O cassete de seleção foi terminado com a UTR 3’ compreendendo o terminal transcripcional e sítios de poliadenilação do gene 35s do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Chenault e outros, Plant Physiology 1993 101 (4), 1395-1396).
[000461] O cassete de seleção foi sintetizado por um vendedor de síntese de gene comercial (GeneArt, Life Technologies) e clonado em um vetor binário autorizado pela Gateway. Os cassetes de expressão de DGT-28 foram subclonados em pDONR221. O clone ENTRY resultante foi usado em uma reação LR Clonase II (Invitrogen, Life Technologies) com o vetor binário autorizado pela Gateway codificando o cassete de expressão de fosfinotricino acetil transferase (PAT). Colônias de todos os plasmídeos montados foram inicialmente avaliadas através de digestão por restrição de DNA purificado usando endonucleases de restrição obtidas da New England BioLabs (NEB; Ipswich, MA) e Promega (Promega Corporation, WI). Preparações de DNA de plasmídeo foram realizadas usando o QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) ou o Pure Yield Plasmid Maxiprep System (Promega Corporation, WI), seguindo as instruções dos fornecedores. DNA de plasmídeo de clones selecionados foi sequenciado usando ABI Sanger Sequencing e Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing protocol (Applied Biosystems, Life Technologies). Os dados de sequência foram montados e analisados usando o software SEQUENCHER® (GenCodes Corporation, Ann Arbor, MI).
[000462] Os quatro clones de expressão binários resultantes: pDAS000122 (TraP4-DGT28), pDAS000123 (TraP8-DGT28), pDAS000124 (TraP23-DGT28) e pDAS000125 (TraP5-DGT28) foram cada um transformados em linhagem EGA105 de Agrobacterium.
[000463] Produção de eventos de trigo transgênico com construto de expressão de dgt-28. Plantas de trigo transgênicas expressando um dos quatro construtos de expressão de DGT-28 foram geradas através de transformação mediada por Agrobacterium usando a linhagem de trigo doadora Bobwhite MPB26RH, seguindo um protocolo similar a Wu e outros, Transgenic Research 2008, 17:425-436. Eventos transgênicos T0 putativos foram selecionados quanto à tolerância a fosfinotricina (PPT), o fenótipo conferido pelo marcador selecionável PAT, e transferidos para o solo. As plantas T0 foram cultivadas sob condições de contenção em estufa e semente T1 foi produzida. No geral, cerca de 45 eventos T0 independentes foram gerados para cada construto de expressão de DGT-28.
[000464] Resistência a glifosato em eventos de trigo dgt-28 de trigo TO. Eventos T0 foram deixados aclimatar na estufa e foram cultivados até que 2-4 folhas de aparência normal, novas, emergissem do verticilo (isto é, plantas que tinham passado pela transição de cultura de tecido para condições de crescimento em estufa). As plantas foram cultivadas a 25° C sob 12 horas de luz suplementar na estufa até a maturidade. Uma avaliação inicial de tolerância a glifosato e análises Taqman foi completada em plantas T1 cultivadas sob as mesmas condições anteriormente descritas. Os dados permitiram que determinação de eventos T1 herdáveis fosse adicionalmente caracterizada. Seis eventos T1 de número de cópia baixo (1-2 cópias) e multicópia foram replantados sob condições de estufa e cultivados até o estágio de 3 folhas. Plantas T1 foram pulverizadas com uma formulação comercial de glifosato (Durango DMA®) de uma faixa de 420-3360 g ae/ha, que são capazes de lesionar significantemente linhagens de trigo não transformadas. A adição de sulfato de amônio 2% p/v foi incluída na aplicação. Uma dose letal é definida como a taxa que causa >75% de lesão ao controle não transformado Bob White MPB26RH. Herbicida foi aplicado.
[000465] Neste exemplo, as aplicações de glifosato foram utilizadas para ambos determinação da segregação do gene dgt-28 na geração T1 bem como demonstração da tolerância a níveis altos de glifosato. A resposta das plantas é apresentada em termos de uma escala de lesão visual 21 dias após tratamento (DAT). Os dados são apresentados como um histograma de indivíduos exibindo menos do que 25% de lesão visual (4), 25-50% de lesão visual (3), 50%-75% de lesão visual (2) e mais do que 75% de lesão visual (1). Média aritmética e desvio padrão são apresentados para cada construto usado para transformação de trigo. A faixa de classificação de resposta individual é também indicada na última coluna para cada taxa e transformação. Trigo não transformado, do tipo selvagem (c.v. Bob White MPB26RH) serviu como um controle sensível a glifosato. Na geração T1 plantas hemizigotas e homozigotas estavam disponíveis para teste para cada evento e então foram incluídas para cada taxa de glifosato testada. Plantas hemizigotas conterão metade da dose do gene que plantas homozigotas, desta maneira variabilidade de resposta a glifosato pode ser esperada na geração T1.
[000466] Os resultados das plantas de trigo dgt-28 T1 demonstraram que tolerância a glifosato foi obtida em taxas de até 3360 de ae/ha com os peptídeos de trânsito de cloroplasto TraP4, TraP5, TraP8 e TraP23. Tabela 30. Os dados são de um evento T1 de número de cópia baixo, mas são representativos da população para cada construto.
[000467] Tabela 30. Resposta de eventos de trigo dgt-28 T1 de número de cópia baixo para glifosato 21 dias após tratamento.
Figure img0044
Figure img0045
[000468] Em 21 DAT, p antas resistentes e sensíveis são contadas para determinar a porcentagem de linhagens que segregaram como uma característica Mendeliana dominante (3R:1S), de locus único, conforme determinado através de análise do Qui quadrado. Tabela 31. Esses dados demonstram que dgt-28 é herdável como um gene de resistência a glifosato robusto em uma espécie monocotiledônea.
[000469] Tabela 31. Porcentagem de eventos dgt-28 T1 pelo construto que demonstrou capacidade de herança de uma maneira Mendeliana com base em uma seleção de glifosato em taxas variando de 420-3360 g ae/ha.
Figure img0046
[000470] Confirmação molecular de plantas transgênicas To para integração de T-DNAs codificando DGT-28. DNA genômico foi extraído de material de folha seco por congelamento de todas as plantas de trigo T0 putativas. Tecido de folha recém-coletado foi rapidamente congelado em nitrogênio líquido e seco por congelamento por 24 h em um Labconco Freezone 4.5® (Labconco, Kansas City, MO) a -40° C e pressão de 133 x 10-3 mBar. O material liofilizado foi submetido à extração de DNA usando o Dneasy® Plant DNA Extraction Mini kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante.
[000471] DNA de cada planta T0 foi testado quanto à presença- ausência de linhagem de Agrobacterium tumefaciens transportada e quanto ao número de cópias integradas do T-DNA codificando DGT-28. A presença-ausência de linhagem de A. tumefaciens foi realizada usando um ensaio Taqman® qPCR dúplex para amplificar o gene da ubiquitina endógeno (iniciadores reverso e avançado e sonda): 5 GCGAAGATCCAGGACAAGGA 3‘ (SEQ ID NO:85; Iniciador avançado) 5 CTGCTTACCGGCAAAGATGAG 3‘ (SEQ ID NO:86; Iniciador reverso) 5 TTCCCCCGGACCAGCAGCGT 3‘ (SEQ ID NO:87; Sonda) do genoma de trigo e virC de pTiBo542: 5 CCGACGAGAAAGACCAGCAA 3‘ (SEQ ID NO:88; Iniciador avançado) 5 CTTAAGTTGTCGATCGGGACTGT 3‘ (SEQ ID NO:89; Iniciador reverso) 5‘ TGAGCCTCTCGTCGCCGATCACAT 3‘ (SEQ ID NO:90; Sonda).
[000472] O número de cópias de T-DNA integrado foi estimado usando um ensaio Taqman® qPCR dúplex seguindo o procedimento de Livak e Schmittgen (Methods 2001 25:402-8). O ensaio amplificou o gene puroindol-b (Pinb) de cópia única endógeno no genoma D de trigo hexaploide (Gautier e outros, Plant Science, 2000, 153, 81-91): 5‘ ATTTTCCATTCACTTGGCCC 3‘ (SEQ ID NO:91; Iniciador avançado) 5‘ TGCTATCTGGCTCAGCTGC 3‘ (SEQ ID NO:92; Iniciador reverso) 5 ATGGTGGAAGGGCGGTTGTGA 3‘ (SEQ ID NO:93; Sonda) e uma região do promotor da Actina (Act1) presente no T-DNA: 5 CTCCCGCGCACCGATCTG 3‘ (SEQ ID NO:94; Iniciador avançado) 5 CCCGCCCCTCTCCTCTTTC 3‘ (SEQ ID NO:95; Iniciador reverso) 5 AAGCCGCCTCTCGCCCACCCA 3‘ (SEQ ID NO:96; Sonda).
[000473] As plantas que não amplificaram um produto de virC e da qual produtos corretos foram amplificados com iniciadores para o promotor da ubiquitina e da actina do arroz endógeno foram classificadas como transgênicas. O número de T-DNA integrado foi estimado a partir de 2ΔΔc(T), de acordo com Livak e Schmittgen (Methods, 2001 25:402-8). No geral, cerca de 95% de todas as plantas T0 tinham pelo menos uma cópia integrada do T-DNA. Tabela 32.
[000474] Tabela 32. Número de plantas T0 independentes geradas e número estimado de T-DNA integrado codificando DGT-28.
Figure img0047
[000475] Desenvolvimento de ensaios de zigosidade de PCR para rastreamento de herança de transgene. As sequências flanqueando os sítios de integração de T-DNA foram identificadas através de digestão de DNA genômico purificado com oito endonucleases de restrição, seguido por ligação de adaptadores de fita dupla específicos para as saliências criadas pelas endonucleases de restrição. Seguindo ligação do adaptador, PCR foi realizada com um iniciador biotinilado ou para a extremidade 3’ ou 5’ do T-DNA codificando DGT-28 e um iniciador para cada adaptador. Os produtos de PCR foram capturados e purificados em contas Ampure Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI) (Agencourt Bioscience Corporation, Beckman Coulter Company). Uma PCT aninhada foi então realizada e os produtos de amplificação foram sequenciados Sanger usando química BigDye® v3.1 (Applied Biosystems) em uma plataforma de eletroforese capilar automática. Análise de sequência realizada usando software Sequencher (GeneCodes, Ann Arbor, MI) foi usada para gerar (onde possível) uma sequência de consenso. A sequência de consenso resultante e singletons foram usados como investigações BlastN contra contigs de sequência de pesquisa de genoma montados para braços de cromossomo classificados pelo fluxo de variedades de trigo Chinese Spring (www.wheatgenome.org) para determinar os cromossomos onde integração de T-DNA tinha ocorrido e permitir o projeto de iniciadores específicos de subgenoma para o desenvolvimento de ensaios de zigosidade de PCR.
[000476] Dois ensaios de PCR foram desenvolvidos para cada evento transgênico para permitir que herança de transgene fosse rastreada em gerações subsequentes. O primeiro ensaio (daqui em diante referido como PCR out-out) foi projetado para amplificar através do sítio de integração de T-DNA. Amplificação específica subgenoma neste ensaio foi obtida usando PCR on-off com iniciadores projetados para posicionar a penúltima base (que continha uma ligação fosforotioato) sobre a variação de sequência de nucleotídeo que distinguia o locus alvo de cópias duplicadas (ambas homólogas e parálogas) do locus em outro local no genoma do trigo. O segundo ensaio (daqui em diante referido como PCR in-out) foi projetado para amplificar a partir do T-DNA para a sequência endógena. Este ensaio utilizou um dos iniciadores do ensaio de PCR out-out e um iniciador projetado para a extremidade 3’ ou 5’ dos T-DNAs codificando DGT-28. Os iniciadores de PCR foram projetados para estar entre 18 e 27 nucleotídeos de comprimento e ter uma temperatura de fusão de 60 a 65° C, ótima 63° C. Ambos os ensaios de PCR out-out e in-out foram realizados em um volume de reação de 25 μM com dNTP 0,2 mM, tampão de PCR Phusion 1x (New England BioLabs), MgCl2 1,5 mM, polimerase de DNA Hotstart Phusion 0,5U (New England BioLabs), DNA genômico purificado 25 ng e 0,4 μM de cada iniciador. Condições de ciclização de PCR foram 98° C por 30 s, então (98° C para 10 s, 65° C para 20 s, 72° C para 60 s) para 40 ciclos. A zigosidade de plantas transgênicas foi designada conforme mostrado na Tabela 33.
[000477] Tabela 33. Eventos transgênicos para os quais ensaios de zigosidade de PCR foram desenvolvidos e sequências de iniciador usadas para PCR out-out e in-out.
Figure img0048
Figure img0049
*indica ligação fosforotioato
[000478] Avaliação fenotípica de plantas transgênicas Ti quanto à tolerância a glifosato. Para determinar se eventos transgênicos com construtos de expressão de DGT-28 exibem tolerância a glifosato, plantas Ti derivadas de eventos individuais foram fenotipicamente avaliadas sob condições de contenção em estufa. Duas avaliações fenotípicas foram realizadas. Na primeira avaliação (preliminar), eventos transgênicos (com semente Ti suficiente para ambas as avaliações fenotípicas) foram avaliados quanto à tolerância a glufosinato e glifosato para confirmar expressão de DGT-28 e estabelecer a ordem de classificação para tolerância a herbicida dentre os eventos. Na segunda avaliação (detalhada), eventos transgênicos selecionados foram avaliados quanto à tolerância a glifosato em taxas de dose de pulverização diferentes para estabelecer o nível de tolerância a herbicida conferido dentro de eventos e entre construtos de expressão de DGT-28.
[000479] Doze sementes Ti por evento selecionado e três réplicas (i2 sementes cada) da linhagem de trigo doadora não transformada Bobwhite MPB26RH foram semeadas em potes de 85 mm e cultivadas para o estágio de 2 folhas sob condições de boa rega a 25° C com luz suplementar provendo um fotoperíodo de i2 horas. Os potes foram postos de uma maneira aleatorizada para permitir que efeitos ambientais fossem removidos durante análise de dados. Os eventos transgênicos avaliados são listados na Tabela 34. No estágio de 2 folhas, todas as plantas Ti e a primeira réplica de i2 plantas de trigo doadoras não transformadas foram pulverizadas com glufosinato em uma taxa de dose de 420 g ai/ha. As plantas foram visualmente inspecionadas após quatro dias e plantas representativas capturando a faixa de respostas fenotípicas foram usadas para desenvolver uma escala de classificação de 0 a 6. Tabela 32.
[000480] Tabela 34. Eventos transgênicos testados em avaliação preliminar.
Figure img0050
Figure img0051
Figure img0052
Figure img0053
Figure img0054
*Baseado no ensaio Taqman® qPCR dúplex. Número de cópia baixo e cópia múltipla indica <3 e >4 T-DNA integrado, respectivamente.
[000481] Tabela 35. Escala de classificação usada para registrar resposta fenotípica a glufosinato 4 dias após pulverização.
Figure img0055
[000482] Cada planta no teste foi então classificada com relação à escala de classificação, com o classificador “cego” com relação ao genótipo da planta para eliminar tendência à classificação. Cinco dias após classificação de glufosinato, todas as plantas T1 e as primeira e segunda réplicas de plantas de trigo doadoras não transformadas foram pulverizadas com glifosato em uma taxa de dose de 420 g ai/ha. A terceira réplica restante de linhagem de trigo doadora não transformada (total 12 plantas) não foi pulverizada. As plantas foram visualmente inspecionadas em 7, 14 e 21 dias após pulverização. Uma escala de classificação capturando a faixa de respostas fenotípicas foi desenvolvida para cada ponto de tempo e usada para classificar todo o teste. Em cada ponto de tempo, o classificador “cego” com relação ao genótipo da planta. A escala de classificação em 7 dias após pulverização variou de 0 a 7 (Tabela 36) e de 1 a 4 em 14 e 21 dias após pulverização (Tabela 37). Comprimento da planta, número de rebento e anormalidades morfológicas foram também registrados para cada planta em 14 dias após pulverização com glifosato. As plantas com germinação retardada ou estabelecimento pobre foram excluídas das análises subsequentes.
[000483] Tabela 36. Escala de classificação usada para registrar resposta fenotípica a glifosato em 7 dias após pulverização.
Figure img0056
[000484] Tabela 37. Escala de classificação usada para registrar resposta fenotípica a glifosato em 14 e 21 dias após pulverização.
Figure img0057
Classificação Descrição 1 Planta morta 2 50-75% folhas necróticas; clorose e murchamento severos; planta morta 3 <25% folhas necróticas; 25% folhas cloróticas; menos murchamento; sinais de crescimento 4 Planta saudável
[000485] Análise de resposta a glufosinato falhou em revelar uma diferença fenotípica clara entre plantas de trigo doadoras não transformadas que foram pulverizadas e plantas doadoras não transformadas que não foram pulverizadas (dados não mostrados). Como uma consequência, a tolerância dos eventos transgênicos a glufosinato não poderia ser avaliada confiavelmente. Em contraste, análise de resposta a glifosato em 21 dias após pulverização revelou uma diferença fenotípica clara entre as plantas doadoras não transformadas pulverizadas e não pulverizadas. Tabela 38. Desta maneira, análise quanto à tolerância a glifosato dentre os eventos transgênicos foi baseada em classificações de resposta coletadas em 21 dias após pulverização. Um evento transgênico foi considerado exibir tolerância a glifosato quando 4 ou mais das 12 plantas T1 para aquele evento tiveram uma classificação de resposta maior do que ou igual a 3. Este critério era baseado na expectativa que cada evento segregaria 1:2:1 (homozigoto presente : hemizigoto : homozigoto ausente) para o transgene na geração T1 e permitir que eventos com expressão de DGT- 28 fraca fossem identificados. Os eventos transgênicos foram classificados ordenados quanto à tolerância a glifosato observada usando uma classificação de agregado arbitrária calculada a partir de plantas tolerantes individuais. A classificação de agregado foi calculada a partir das classificações de resposta em 14 e 21 dias e comprimento da planta, número de rebento e anormalidades morfológicas registradas em 14 dias após pulverização.
[000486] Tabela 38. Resposta fenotípica de plantas de trigo doadoras não transformadas a tratamento com herbicida em 21 dias após pulverização.
Figure img0058
[000487] No geral, 67 de 92 eventos transgênicos avaliados mostraram evidência quanto à tolerância a glifosato. Tabela 39. Seis eventos transgênicos estimados ter <3 cópias integradas do transgene e dois eventos transgênicos estimados ter 4 ou mais transgenes integrados foram selecionados para cada vetor de expressão de DGT- 28 para inclusão a segunda avaliação fenotípica (detalhada).
[000488] Tabela 39. Reposta fenotípica ordenada por classificação de eventos transgênicos a tratamento com glifosato.
Figure img0059
Figure img0060
Figure img0061
Figure img0062
Figure img0063
Figure img0064
Figure img0065
Figure img0066
*Uma classificação positiva indica tolerância a glifosato maior. A classificação de agregado padronizada para as plantas de trigo doadoras não transformadas não tratadas foi 12,2.
[000489] Avaliação fenotípica detalhada. Quatro réplicas de 12 sementes T1 por evento selecionado e oito réplicas (12 sementas cada uma) da linhagem de trigo doadora não transformada Bobwhite MBP26RH foram semeadas em potes de 85 mm e cultivadas para o estágio de 2 folhas sob condições de boa rega a 25° C com luz suplementar provendo um fotoperíodo de 12 horas. Os potes foram postos em um esquema aleatorizado para permitir que efeitos ambientais fossem removidos durante análise de dados. Os eventos transgênicos avaliados são listados na Tabela 40. No estágio de 2 folhas, o comprimento da planta e o número de folhas foram registrados para cada planta antes da pulverização com glifosato. As primeira, segunda, terceira e quarta réplicas de plantas T1 para cada evento selecionado e a linhagem de trigo doadora não transformada foram pulverizadas em uma taxa de dose de 420, 840, 1680 e 3360 g ai/ha, respectivamente. As quinta, sexta, sétima e oitava réplicas da linhagem de trigo doadora não transformada (total de 48 plantas) não foram pulverizadas. Em 7, 14 e 21 dias após pulverização, as plantas foram classificadas quanto ao comprimento da planta, número de folhas e resposta fenotípica a glifosato usando a escala de classificação na Tabela 37. Quaisquer anormalidades morfológicas foram também registradas. Para classificação, o classificar era “cego” com relação ao genótipo da planta e taxa de dose de pulverização para prevenir tendência à classificação. Plantas com germinação retardada e estabelecimento pobre (critérios: comprimento da planta <6 cm) na classificação de pré-pulverização foram excluídas de análises subsequentes.
[000490] Tabela 40. Eventos transgênicos testados em avaliação fenotípica detalhada.
Figure img0067
Figure img0068
*Com base em ensaio T Paqman® qPCR dúplex. Número de cópia baixo e multicópia indicam <3 e >4 T-DNA integrado, respectivamente.
[000491] Análise de resposta a glifosato em 7, 14 e 21 dias após pulverização revelou uma diferença fenotípica clara entre as plantas de trigo doadoras não transformadas pulverizadas e não pulverizadas. Esta diferenciação foi máxima em 21 dias e foi observada em todas as taxas de dose de glifosato. Tabela 41. Para avaliar a tolerância dos eventos transgênicos a glifosato em cada taxa de dose de pulverização, plantas T1 nulas (isto é, plantas não carregando o transgene) foram excluídas de análises subsequentes. Plantas T1 com uma classificação de resposta de menos do que três em 21 dias após pulverização foram consideradas ter o genótipo nulo. Análise de variância (ANOVA) com base em fenótipos tolerantes revelou um efeito significante para construto de expressão de DGT-28, evento transgênico e dose de pulverização de glifosato. Tabela 42. No entanto, testes de comparação múltiplos falharam em revelar interpretação biológica significante para a origem dessas diferenças devido à faixa limitada de classificação de resposta (isto é, 1 a 4; Tabela 37) usada para registrar o fenótipo de plantas individuais. Em geral, os oito eventos transgênicos independentes testados para cada construto de expressão de DGT-28 mostraram tolerância similar a glifosato em cada taxa de dose de pulverização, indicando que todos os quatro transgenes DGT-28 conferiram um fenótipo dominante e que uma cópia única foi suficiente para conferir tolerância a glifosato. Cada um dos construtos de expressão de DGT-28 revelou tolerância eficaz a pelo menos 3360 g ai/ha de glifosato.
[000492] Tabela 41. Resposta fenotípica de plantas de trigo doadoras não transformadas a tratamentos com glifosato diferentes em 21 dias após pulverização.
Figure img0069
[000493] Tabela 42. Análise de variância (ANOVA) com base em plantas tolerantes a glifosato.
Figure img0070
1Graus de liberdade; 2Estatisticamente significante em 0,001 (***) e 0,01 (**), respectivamente.
[000494] Confirmação molecular da presença de T-DNA em plantas Ti tolerantes a glifosato. Os ensaios de zigosidade de PCR desenvolvidos no Exemplo 2 foram usados para confirmar a presença de DGT-28 de codificação de T-DNA nas plantas Ti tolerantes a glifosato guardadas para produção de semente T2 (vide Exemplo 6). No geral, testes de zigosidade de PCR foram realizados para i04 plantas Ti, das quais 89% confirmaram conter pelo menos uma cópia do transgene. Tabela 43. Esses resultados confirmaram que a tolerância a glifosato observada foi conferida pela presença de T-DNA codificando DGT-28.
[000495] Tabela 43. Segregação de transgene observada dentre plantas Ti.
Figure img0071
[000496] Geração de semente " 22 para eventos transgênicos tolerantes a glifosato. Cerca de oito plantas Ti tolerantes a glifosato foram guardadas das avaliações fenotípicas para os 32 eventos transgênicos que foram selecionados para inclusão na avaliação fenotípica detalhada (Tabela 43). As plantas foram transferidas para potes de 200 mm e cultivadas sob condições de boa rega a 25° C com luz suplementar provendo um fotoperíodo de i2 horas. Os espigões em cada planta foram individualmente embalados antes da antese para prevenir cruzamento.
[000497] Exemplo 24: Cristalização e Modelagem de 5- Enolpiruvilchiquimato 3-fosfato Sintase de Streptomyces sviceus (SsvESPS sintase)
[000498] Purificação e cristalização de proteína. Clonagem, expressão e purificação de SsvESPS sintase recombinante podem ser realizadas como segue. Em suma, plasmídeos de superexpressão para SsvESPS sintase são transformados em linhagem Rosetta2 de E. coli competente e expressão de proteína recombinante é induzida pela adição de 0,2 mM de IPTG por 16 horas a 18° C. As células são coletadas através de centrifugação e ressuspensas em tampão de lise Tris 20 mM (pH 8,0) NaCl 500 mM glicerol 10% e 0,1% de detergente zwitteriônico (ou DDM (dodecil maltosídeo) ou DM (decil maltosídeo): pureza do anômero β > 98% e menos do que 1% de contaminação do anômero α). Passagens múltiplas através de um homogeneizador de célula Avestin C5 são usadas para lisar as células, e o lisado é purificado através de ultracentrifugação. O lisado é carregado em uma coluna de Ni-NTA de 5 mL equilibrada em tampão de lise. A coluna é extensivamente lavada com tampão de lise suplementado com imidazol 30 mM e eluída por um gradiente linear para imidazol 200 mM. Frações de proteína puras, conforme julgado através de SDS-PAGE, são agrupadas e dialisadas em Tris 20 mM (pH 8,0) NaCl 300 mM e DM/DDM 0,1% por 12 horas. O marcador hexaistidina é removido através de digestão com trombina (1 unidade/mg de proteína) seguido por cromatografia de troca de íon e cromatografia de exclusão de tamanho (Superdex 75 16/60, GE Healthcare) em HEPES 20 mM (pH 7,5) KCl 300 mM β-mercaptoetanol 1 mM e DM/DDM 0,05%. A proteína é concentrada usando filtros centrífugos Amicon.
[000499] Condições de cristalização iniciais são estabelecidas usando o método de matriz esparsa utilizando difusão de vapor em gota sentada e matrizes de cristalização comercialmente disponíveis e feitas na casa. Em suma, uma gota de 50 nanolitros de amostra de proteína em concentração de 8 mg/mL (em um tampão de HEPES 20 mM (pH 7,5) KCl 300 mM β-mercaptoetanol 1 mM e DM/DDM 0,05% suplementado com chiquimato 3-fosfato 2 mM e glifosato 2 mM) é misturada com um volume igual do licor mãe do reservatório. Cristais iniciais são cultivados usando polietileno glicol como um precipitante e cultivados para o seu tamanho máximo dentro de 10 dias. Antes da coleta dos dados, os cristais são rapidamente imersos em uma solução crioprotetora composta do licor mãe de cristalização suplementado com glicerol 25%, antes da vitrificação através de imersão direta em nitrogênio líquido.
[000500] Determinação de fase e estrutura. Dados cristalográficos são coletados em uma fonte synchrotron de dispositivo de inserção_(LS- CAT, Sector 21 ID-D, Advanced Photon Source, Argonne, IL) usando um detector de dispositivo de carga acoplada MAR. Os dados são indexados e escalas usando ou pacote HKL2000 (vide Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z. e Chruszcz, M. (2006) HKL-3000: Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z. e Chruszcz, M. (2006) HKL- 3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 62, 859-866) ou usando XDS (vide Kabsch, W. (2010) Xds, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-132). Fases cristalográficas iniciais são determinadas usando o método de substituição molecular usando um modelo de homologia de SsvESPS sintase que foi gerado (vide abaixo) como uma sonda de pesquisa com o software PHASER (vide McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C. e Read, R. J. (2007) “Phaser crystallographic software”, J Appl Crystallogr 40, 658-674) conforme implementado no suite CCP4 de programas (vide Winn, M. D., Ballard, C. C., Cowtan, K. D., Dodson, E. J., Emsley, P., Evans, P. R., Keegan, R. M., Krissinel, E. B., Leslie, A. G., McCoy, A., McNicholas, S. J., Murshudov, G. N., Pannu, N. S., Potterton, E. A., Powell, H. R., Read, R. J., Vagin, A. e Wilson, K. S. (2011) “Overview of the CCP4 suite and current developments”, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 235-242). Reconstrução dos átomos de cadeia principal e cadeia lateral é realizada usando ambos os procedimentos automáticos (ARP/wARP) (vide Langer, G., Cohen, S. X., Lamzin, V. S. e Perrakis, A. (2008) “Automated macromolecular model building for X-ray crystallography using ARP/wARP version 7”, Nature protocols 3, 1171-1179) e intervenção manual usando ou XtalView (vide McRee, D. E. (1999) “XtalView/Xfit--A versatile program for manipulating atomic coordinates and electron density”, Journal of structural biology 125, 156-165) ou COOT (vide Emsley, P. e Cowtan, K. (2004) “Coot: model-building tools for molecular graphics”, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132). Refinamento cristalográfico usará REFMAC (vide Murshudov, G. N., Vagin, A. A. e Dodson, E. J. (1997) “Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method”, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 53, 240-255), interespaçado com rodadas de construção de modelo manual. Validação cruzada é rotineiramente usada durante o curso de construção e refinamento de modelo usando 5% dos dados no cálculo do fator R livre (vide Kleywegt, G. J. e Brunger, A. T. (1996) “Checking your imagination: applications of the free R value”, Structure 4, 897-904). A estereoquímica do modelo é monitorada durante o curso de refinamento usando PROCHECK (vide Laskowski, R. A., Rullmannn, J. A., MacArthur, M. W., Kaptein, R. e Thornton, J. M. (1996) “AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR”, Journal of biomolecular NMR 8, 477-486) e as coordenadas cristalográficas finais são validadas usando MOLPROBITY (vide Davis, I. W., Murray, L. W., Richardson, J. S. e Richardson, D. C. (2004) “MOLPROBITY: structure validation and allatom contact analysis for nucleic acids and their complexes”, Nucleic Acids Res 32, W615-619).
[000501] Modelagem de homologia de SsvESPS sintase. A sequência primária de SsvESPS sintase foi usada para investigação no Protein Data Bank usando BLAST e PSI-BLAST. As estruturas de cristal de enzimas homólogas das espécies que seguem foram recuperadas: V. cholera (Código PDB: 3NVS; 39% de identidade de sequência em 160 resíduos alinhados), E. coli (1G6S; 38% de identidade de sequência em 158 resíduos alinhados), M. tuberculosis (2BJB; 36% de identidade de sequência em 150 resíduos alinhados), C. burnetii (3ROI; 28% de identidade de sequência em 117 resíduos alinhados) e Agrobacerium sp. (2GGA: 27% de identidade de sequência em 116 resíduos alinhados). As coordenadas atômicas de todas essas estruturas foram manualmente superpostas (usando COOT) e o sítio ativo foi visualmente inspecionado para determinar o melhor molde para modelagem de homologia. Duas abordagens paralelas foram utilizadas para modelagem: abordagem baseada em modelo único com SWISS- MODEL usando o “melhor” modelo (conforme determinado através de alinhamento manual dos resíduos de sítio ativo) e modelagem multimodelo usando PHYRE2 (vide Bennett-Lovsey, R.M., Hebert, A.D., Sternberg, M.J. e Kelley, L.A. (2008) “Exploring the extremes of sequence/structure space with ensemble fold recognition in the program Phyre”, Proteins 70, 611-625). Para o procedimento de modelo múltiplo, um total de 338 modelos completos ou parciais diferentes, com um valorE de cutoff de 10-50, foi selecionado para um alinhamento de sequência pseudo-múltiplo em PSI-BLAST para previsões de estrutura secundária.
[000502] Os 11 melhores modelos consistem em homólogos de EPSP sintase e com a superfamília IF3 de proteínas constituindo os próximos modelos de classificação. Sítios de ligação para ligantes foram confirmados usando o servidor 3DLigandSite (vide Wass, M.N., Kelley, L.A. e Sternberg, M.J. (2010) “3DLigandSite: predicting ligand-binding sites using similar structures”, Nucleic Acids Res 38, W469-473) para identificar as prováveis posições para ambos o chiquimato 3-fosfato e o glifosato. Onde necessário, estruturas de modelo individuais foram submetidas a rodadas de protocolos de minimização de energia para reduzir desvios de comprimentos de ligação ideais, ângulos e manter planaridade de resíduos aromáticos. A confiança dos modelos foi avaliada através de gráficos de erros locais previstos e usando classificações QMEAN4 Z- normalizadas esperadas para um modelo de proteína aproximadamente do mesmo tamanho (vide Benkert, P., Kunzli, M. e Schwede, T. (2009) “QMEAN server for protein model quality estimation”, Nucleic Acids Res 37, W510-514). Para o modelo resultante, mais de 90% dos átomos da cadeia principal poderiam ser modelados com 100% de precisão.
[000503] Modelo de homologia de SsvESPS Sintase. O melhor modelo de homologia foi derivado usando a abordagem de molde múltiplo conforme implementado em PHYRE2. Para este modelo, mais de 90% dos átomos da cadeia principal e da cadeia lateral poderiam ser modelados com precisão. Um mapa Ramachandran do modelo de homologia mostra 89% de resíduos dentro das regiões mais favorecidas, com uma adicional de 9,7% em regiões permitidas adicionais. Dois resíduos (Ala-255 e Ala-314) estão em regiões desaprovadas, mas esses resíduos estão localizados em alças que são distais ao sítio ativo. A validez do modelo de homologia é afirmada pelo fato que resíduos localizados em regiões com lacuna de alinhamentos de sequência são modelados com ângulos de torsão que se encaixam dentro dos limites Ramachandram, incluindo resíduos que estão localizados em regiões de alça que não são formadas por elementos estruturais.
[000504] Base molecular para tolerância a glifosato aumentada. Caracterização bioquímica e biofísica da 5-enolpiruvilchiquimato 3- fosfato sintase tolerante a glifosato (classe II) de Agrobacterium sp. (o determinante de resistência engenheirado em plantas Roundup Ready) estabeleceu que mudanças pequenas no sítio ativo podem ser responsáveis por resistência a herbicida nesta enzima. Especificamente, um resíduo Ala-100 é substituído na ESPS sintase de Agrobacterium sp., no lugar do Gly que é encontrado na posição equivalente (Gly-96) na enzima de E. coli sensível a glifosato (classe I). Na estrutura de co-cristal com ESPS sintase de E. coli sensível, glifosato é envenenado de uma maneira estendida, enquanto na ESPS sintase de Agrobacerium, conflitos estéricos com a cadeia lateral de Ala-100 resultam em uma compressão do herbicida, que resulta em tolerância. Estudos de estrutura/função com a enzima de E. coli mostraram que mutação de Gly-96 para Ala resulta em resistência a glifosato.
[000505] Nas estruturas de ESPS sintase, o resíduo Ala-100 (Gly-96) está localizado na extremidade de partida de uma hélice α interna longa adjacente ao sítio de ligação de glifosato. Em EPSP sintases classe I, sensíveis, em adição à mutação de Gly96Ala mencionada acima, tolerância a glifosato pode ser induzida pela mutação de resíduos dentro desta hélice, incluindo Thr97Ile, Pro101Leu/Thr/Ala/Ser. Mesmo que alguns desses resíduos estejam de mais de 10Â distante do sítio de ligação de glifosato, alterações nesses resíduos causam uma mudança na orientação da hélice que carrega Gly-96, sendo responsável pela tolerância a glifosato aumentada.
[000506] No modelo de homologia de alta resolução de SsvESPS, este resíduo Gly é alterado para Ala-84. Ainda, a hélice interna (Fig. 55) que carrega Ala-84 é empurrada ainda mais para o sítio ativo. Esta mudança é um resultado das mudanças que seguem: Ala-98 em ESPS sintase de E. coli é substituído por Thr-86; Met-99 em ESPS sintase de E. coli é substituído por Ala-87; Pro-101 em ESPS sintase de E. coli é substituído por Phe-89; Ala-103 em ESPS sintase de E. coli é substituído por Pro-91; Ala-105 em ESPS sintase de E. coli é substituído por Leu-93 e Leu-106 em ESPS sintase de E. coli é substituído por Ala- 94. Esses aminoácidos representam Motivo III na FIG.; 1b.
[000507] Há mudanças compensatórias adicionais em resíduos que apoiam esta hélice, incluindo Met-53 (ESPS sintase de E. coli) para Phe- 44 (Motivo II, FIG. 1a) e Leu-115 (ESPS sintase de E. coli) para Phe- 103 (Motivo IV, FIG. 1b). Por fim, substituição de Asp-26 e His-52 em ESPS sintase de E. coli com um Ala-17 (Motivo I, FIG. 1a) e Gly-43 menor (Motivo II, FIG. 1a) cria uma cavidade que permite a mudança desta hélice interna ainda mais para o sítio de ligação de glifosato. No lado oposto desta hélice, resíduos de ESPS sintase de E. coli Leu-30 e Met-178 são substituídos por Phe-21 (Motivo I, FIG. 1a) e Leu-167, empurrando ainda mais esta hélice para o sítio de ligação. Essas mudanças resultam em uma mudança significante na orientação desta hélice interna, que, por sua vez, oclui significantemente glifosato. Consequentemente, a mutação Ala84Gly em SsvESPS sintase não deve resultar em um fenótipo sensível, como a hélice interna que carrega este resíduo seria ainda mudada muito longe para o sítio ativo para permitir ligação de glifosato. A previsão estrutural é substanciada por estudos de cinética de estado uniforme e IC50 onde DGT-28v2 (Ala84Gly) retém níveis altos de tolerância a glifosato.
[000508] Embora aspectos da presente invenção tenham sido descritos em certas modalidades, eles podem ser ainda modificados dentro do espírito e escopo da presente invenção. O presente pedido pretende então compreender quaisquer variações, usos ou adaptações das modalidades da invenção usando seus princípios gerais. Ainda, o presente pedido pretende compreender tais distanciamentos da presente invenção que estiverem dentro de prática conhecida ou comum na técnica à qual essas modalidades pertencem e que se encaixem nos limites das reivindicações apensas.

Claims (15)

1. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que é um cassete de expressão, em que os seguintes elementos estão presentes: um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, operacionalmente ligado a uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo EPSPS Classe IV, em que a referida sequência de nucleotídeos é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 3, 79 a 84, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167 e 169, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1, 67, 68, 145, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 171, 172 e 173.
2. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo EPSPS Classe IV é operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo.
3. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido promotor heterólogo é o promotor AtUbi10.
4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1.
5. Vetor, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo heterólogo.
6. Método para gerar uma planta transgênica, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula vegetal resistente a glifosato, caracterizado pelo fato de que compreende: transformação da planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula vegetal com a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1; e expressão de um polipeptídeo EPSPS Classe IV em que, preferencialmente, a planta transformada, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula vegetal é resistente a glifosato.
7. Método para controle de ervas daninhas em uma área sob cultivo contendo plantas resistentes a herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende: plantar uma planta ou uma semente de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico, como definida na reivindicação 1, como um ácido nucleico heterólogo na área sob cultivo; e aplicar à área sob cultivo uma quantidade suficiente de herbicida para controlar ervas daninhas na área sob cultivo sem afetar significantemente a planta ou semente de planta.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o herbicida é glifosato.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a planta ou semente de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico heteróloga como definida na reivindicação 1 compreende um segundo ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo, em que preferencialmente o segundo ácido nucleico compreende aad-1 ou aad-12.
10. Método para conferência de resistência a um herbicida a uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende: transformação da planta com o ácido nucleico, como definido na reivindicação 1; regeneração de uma planta transformada; e expressão da molécula de ácido nucleico de maneira a produzir um polipeptídeo EPSPS Classe IV.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o herbicida é glifosato.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta ou semente de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico heteróloga como definida na reivindicação 1 compreende um segundo ácido nucleico que codifica um polipeptídeo heterólogo, em que preferencialmente o segundo ácido nucleico compreende aad-1 ou aad-12.
13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula vegetal não é regenerável para produzir uma planta transformada.
14. Uso de uma planta, parte de planta, órgão de planta, semente de planta ou célula de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para o plantio ou cultivo de uma cultura resistente a herbicida.
15. Método para gerar uma planta transgênica resistente a herbicida, caracterizado pelo fato de que compreende cruzar uma planta compreendendo a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.
BR112014018916A 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico isolada, vetor compreendendo a mesma, métodos para gerar uma planta transgênica, parte, órgão, semente ou célula vegetal resistente a herbicida, para controle de ervas daninhas e para conferência de resistência a um herbicida a uma planta BR112014018916B8 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261593555P 2012-02-01 2012-02-01
US61/593,555 2012-02-01
US201261625222P 2012-04-17 2012-04-17
US61/625,222 2012-04-17
PCT/US2013/024511 WO2013116782A1 (en) 2012-02-01 2013-02-01 Novel class of glyphosate resistance genes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BR112014018916A2 BR112014018916A2 (pt) 2017-07-04
BR112014018916B1 true BR112014018916B1 (pt) 2022-08-09
BR112014018916B8 BR112014018916B8 (pt) 2023-05-16

Family

ID=48904120

Family Applications (8)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112014018903-0A BR112014018903A2 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 plantas resistentes ao glifosato e métodos associados
BR102013002598-4A BR102013002598B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico, proteína quimérica, método para a produção de um material de planta transgênica e uso do mesmo
BR112014018916A BR112014018916B8 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico isolada, vetor compreendendo a mesma, métodos para gerar uma planta transgênica, parte, órgão, semente ou célula vegetal resistente a herbicida, para controle de ervas daninhas e para conferência de resistência a um herbicida a uma planta
BR102013002599-2A BR102013002599B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico isolada ou recombinante, método para gerar uma célula vegetal tolerante a glifosato e usos da mesma
BR102013002592-5A BR102013002592B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico isolada, polipeptídeo quimérico, método para produção de um material de planta transgênica e uso do mesmo
BR112014018832A BR112014018832A2 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 peptídeo de trânsito do cloroplasto
BR122022004161-2A BR122022004161B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico, polipeptídeo quimérico, vetor de expressão de plantas, método para a produção de um material de planta transgênica e uso do mesmo
BR112014019043A BR112014019043B8 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Polipeptídeos quiméricos de trânsito de cloroplasto, moléculas de ácido nucleico isoladas, vetores de expressão vegetal, e métodos para a produção de material vegetal transgênico

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112014018903-0A BR112014018903A2 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 plantas resistentes ao glifosato e métodos associados
BR102013002598-4A BR102013002598B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico, proteína quimérica, método para a produção de um material de planta transgênica e uso do mesmo

Family Applications After (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR102013002599-2A BR102013002599B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico isolada ou recombinante, método para gerar uma célula vegetal tolerante a glifosato e usos da mesma
BR102013002592-5A BR102013002592B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico isolada, polipeptídeo quimérico, método para produção de um material de planta transgênica e uso do mesmo
BR112014018832A BR112014018832A2 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 peptídeo de trânsito do cloroplasto
BR122022004161-2A BR122022004161B1 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Molécula de ácido nucleico, polipeptídeo quimérico, vetor de expressão de plantas, método para a produção de um material de planta transgênica e uso do mesmo
BR112014019043A BR112014019043B8 (pt) 2012-02-01 2013-02-01 Polipeptídeos quiméricos de trânsito de cloroplasto, moléculas de ácido nucleico isoladas, vetores de expressão vegetal, e métodos para a produção de material vegetal transgênico

Country Status (24)

Country Link
US (13) US9873883B2 (pt)
EP (9) EP2809148B1 (pt)
JP (8) JP6349261B2 (pt)
KR (6) KR102047336B1 (pt)
CN (11) CN108285901A (pt)
AP (4) AP2014007895A0 (pt)
AR (7) AR089872A1 (pt)
AU (11) AU2013205441B2 (pt)
BR (8) BR112014018903A2 (pt)
CA (6) CA2863402A1 (pt)
CL (6) CL2014002017A1 (pt)
CO (6) CO7051012A2 (pt)
ES (1) ES2716481T3 (pt)
HU (1) HUE042672T2 (pt)
IL (5) IL233861B (pt)
MX (8) MX344968B (pt)
NZ (5) NZ628989A (pt)
PH (4) PH12014501728A1 (pt)
RU (8) RU2627169C2 (pt)
TW (3) TW201335365A (pt)
UA (5) UA115545C2 (pt)
UY (3) UY34608A (pt)
WO (6) WO2013116782A1 (pt)
ZA (6) ZA201405891B (pt)

Families Citing this family (133)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX344968B (es) * 2012-02-01 2017-01-12 Dow Agrosciences Llc Peptido de transito al cloroplasto.
AU2013205557B2 (en) * 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
JP6775953B2 (ja) 2012-09-07 2020-10-28 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ｆａｄ３性能座および標的化切断を誘導可能である対応する標的部位特異的結合タンパク質
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
KR102192599B1 (ko) 2013-04-05 2020-12-18 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 식물의 게놈 내의 외인성 서열의 통합을 위한 방법 및 조성물
MX359027B (es) 2013-09-13 2018-09-12 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
AP2016009164A0 (en) 2013-10-04 2016-04-30 Dow Agrosciences Llc Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof
BR102014025499A2 (pt) 2013-10-15 2015-09-29 Dow Agrosciences Llc elementos regulatórios de zea mays e uso dos mesmos
CA2929150A1 (en) 2013-10-29 2015-05-07 Hypo-Stream Limited Anti-inflammatory solution comprising sodium hypochlorite
MX2016008255A (es) 2013-12-20 2016-10-14 Dow Agrosciences Llc Control sinergico herbicida de malezas y tolerancia mejorada del cultivo de combinaciones de 2,4-d-colina, glifosato y glufosinato en soya, maiz, algodon y otras areas de cultivo tolerantes a 2,4-d-, glifosato y glufosinato.
AR100785A1 (es) 2014-06-09 2016-11-02 Dow Agrosciences Llc Control herbicida de maleza a partir de combinaciones de fluroxipir e inhibidores de als
NZ726117A (en) 2014-06-20 2017-10-27 Dow Agrosciences Llc Vegetative insecticidal proteins useful for control of insect pests
KR101788673B1 (ko) 2014-06-24 2017-11-15 싸이퍼롬, 인코퍼레이티드 핵산염기서열 보안 방법, 장치 및 이를 저장한 기록매체
AU2015286205A1 (en) * 2014-07-08 2016-12-15 MINISTER FOR AGRICULTURE, FOOD AND FISHERIES acting through THE SOUTH AUSTRALIAN RESEARCH AND DEVELOPMENT INSTITUTE (ABN 53 763 159 658) A BODY CORPORATE PURSUANT TO THE ADMINISTRATIVE ARRANGEMENTS ACT 1994 (SOUTH AUSTRALIA) Herbicide tolerant plants
DK3837970T3 (da) 2014-10-15 2023-09-18 Monsanto Technology Llc Herbicidtolerancegener og fremgangsmåder til anvendelse deraf
JP2018501798A (ja) * 2014-12-30 2018-01-25 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 害虫の防除に有用な改変Ｃｒｙ１Ｃａ毒素
EP3267796B1 (en) 2015-03-11 2023-08-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of pip-72 and methods of use
AU2016250064A1 (en) 2015-04-15 2017-10-19 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
CN107614690A (zh) 2015-04-15 2018-01-19 美国陶氏益农公司 用于转基因表达的植物启动子
KR20180038048A (ko) * 2015-08-20 2018-04-13 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 엽록체 전이 펩티드
BR112018003400A2 (pt) * 2015-08-25 2018-09-25 Dow Agrosciences Llc toxinas cry inseticidas irdig17912
CN105132546A (zh) * 2015-08-31 2015-12-09 四川省农业科学院作物研究所 一种养分高效利用转基因玉米材料快速鉴定的方法
WO2017044372A1 (en) * 2015-09-11 2017-03-16 AgBiome, Inc. Chloroplast transit peptides and methods of their use
TW201718861A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 道禮責任有限公司 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
TW201718862A (zh) 2015-09-22 2017-06-01 Dow Agrosciences Llc 用於轉殖基因表現之植物啟動子及３’ｕｔｒ
WO2017059045A1 (en) * 2015-09-30 2017-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plant epsp synthases and methods of use
AU2016340893B2 (en) 2015-10-22 2019-06-27 Corteva Agriscience Llc Plant promoter for transgene expression
US20170121726A1 (en) 2015-11-04 2017-05-04 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
RU2018139841A (ru) * 2016-04-19 2020-05-19 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Комбинация из четырех белковых токсинов vip и cry для контроля насекомых-вредителей у растений
EP3960863A1 (en) 2016-05-04 2022-03-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CA3024770A1 (en) * 2016-05-20 2017-11-23 BASF Agro B.V. Dual transit peptides for targeting polypeptides
CN116515950A (zh) * 2016-07-18 2023-08-01 赛尔伊迪克斯公司 抗原偶联的杂交试剂
US20190177735A1 (en) * 2016-09-02 2019-06-13 North Carolina State University Methods and compositions for modification of plastid genomes
EP3518657B1 (en) 2016-10-03 2022-07-13 Corteva Agriscience LLC Plant promoter for transgene expression
CA3038508A1 (en) 2016-10-03 2018-04-12 Dow Agrosciences Llc Plant promoter for transgene expression
EP3535285B1 (en) 2016-11-01 2022-04-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
CN106498063B (zh) * 2016-11-08 2019-12-10 云南省烟草农业科学研究院 一种分子标记辅助选择定向改良烟草黑胫病抗性的育种方法
CN106967746A (zh) * 2017-02-04 2017-07-21 深圳万智联合科技有限公司 一种快速获得抗除草剂的转基因高粱纯合植株的方法
BR112019020311A2 (pt) * 2017-03-30 2020-04-28 Pioneer Hi Bred Int epsp sintases de planta melhoradas e métodos de uso
CN107502621B (zh) * 2017-09-22 2021-04-13 福建农林大学 一种快速检测体内dna末端连接的方法
BR112020013929A2 (pt) 2018-01-17 2020-12-01 Basf Se plantas ou partes da planta, semente, células vegetais, produto vegetal, progênie ou planta descendente, métodos para controlar ervas daninhas, para produzir uma planta e para produzir uma planta descendente, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, polipeptídeo, método para produzir um produto vegetal e produto vegetal
CN110386966A (zh) * 2018-04-23 2019-10-29 中国科学院大连化学物理研究所 一种含有叶绿体转运肽的基因序列的应用
JP2020146299A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146314A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146308A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146316A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146312A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146318A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146304A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146301A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146311A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146310A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146305A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146315A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146303A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146298A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146307A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146313A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146297A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146302A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146306A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146317A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
JP2020146300A (ja) * 2019-03-14 2020-09-17 株式会社三洋物産 遊技機
CN117050817A (zh) 2019-04-12 2023-11-14 埃科莱布美国股份有限公司 抗微生物多用途清洁剂及其制备和使用方法
CN110095613A (zh) * 2019-05-27 2019-08-06 武汉上成生物科技有限公司 一种快速检测转基因植物中cp4-epsps的方法
KR102088178B1 (ko) * 2019-11-01 2020-03-12 경희대학교 산학협력단 엽록체 내 스트로마를 표적하는 트랜지트 펩티드 및 이의 용도
US11926834B2 (en) 2019-11-05 2024-03-12 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for RNA-encoded DNA-replacement of alleles
WO2021113788A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Pairwise Plants Services, Inc. Recruitment methods and compounds, compositions and systems for recruitment
CN111139228B (zh) * 2019-12-31 2021-04-06 华中农业大学 一种抗草甘膦植物epsps酶双突变体及其克隆、表达与应用
CA3169462A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
MX2022009333A (es) 2020-01-31 2022-10-07 Pairwise Plants Services Inc Supresion de la respuesta de evasion de la sombra en las plantas.
WO2021158798A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Pairwise Plants Services, Inc. Thornless / prickleless rubus plants
CA3172333A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pairwise Plants Services, Inc. Improved resistance to soybean cyst nematode through gene editing
US20210292754A1 (en) 2020-03-16 2021-09-23 Pairwise Plants Services, Inc. Natural guide architectures and methods of making and using the same
US11999946B2 (en) 2020-03-26 2024-06-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
US11882808B2 (en) 2020-03-27 2024-01-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving resistance to soybean rust
US20230175006A1 (en) 2020-04-06 2023-06-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for increasing resistance to ear rot and stem rot disease in maize
EP4135512A1 (en) 2020-04-16 2023-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
CN116096230A (zh) 2020-06-02 2023-05-09 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
CA3186972A1 (en) 2020-06-17 2021-12-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for controlling meristem size for crop improvement
CA3187135A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions, systems, and methods for base diversification
CN116367714A (zh) * 2020-07-31 2023-06-30 伊纳瑞农业技术有限公司 具有经修饰的转基因基因座的转基因作物植物的基因组编辑
CA3188282A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Expedited breeding of transgenic crop plants by genome editing
WO2022026390A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
BR112023001774A2 (pt) * 2020-07-31 2023-03-07 Inari Agriculture Tech Inc Genoma de planta transgênica editado, célula de planta transgênica, planta transgênica, parte de planta transgênica, método para obter uma população avolumada de sementes endogâmicas para produção de sementes comerciais, método de obtenção de semente de cultura híbrida, molécula de dna, produto de planta transgênica processado, amostra biológica, marcador de ácido nucleico adaptado para detecção de dna genômico ou seus fragmentos, método de detecção do genoma de planta transgênica editado, método de obtenção de um genoma de planta transgênica editado compreendendo um lócus transgênico modificado, método de excisão de um lócus transgênico modificado ou sua porção a partir de um genoma de planta transgênica editado, método de obtenção de uma linha de reprodução de plantas, método para obter germoplasma de planta transgênica endogâmico contendo diferentes traços transgênicos
CN111996205A (zh) * 2020-08-10 2020-11-27 深圳润康生态环境股份有限公司 几丁质酶基因、几丁质酶及其制备方法和应用
AU2021331344A1 (en) 2020-08-28 2023-03-16 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas proteins and methods of use thereof
CN112266419B (zh) * 2020-10-29 2023-02-03 中国科学院微生物研究所 一种人工合成的抗除草剂蛋白
CA3200521A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Pairwise Plants Services, Inc. Compositions and methods for rna-encoded dna-replacement of alleles
BR112023015909A2 (pt) 2021-02-11 2023-11-21 Monsanto Technology Llc Métodos e composições para modificar níveis de citocinina oxidase em plantas
US20220380792A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 Pairwise Plants Services, Inc Methods and compositions for modifying root architecture in plants
US20220403475A1 (en) 2021-06-14 2022-12-22 Pairwise Plants Services, Inc. Reporter constructs, compositions comprising the same, and methods of use thereof
CN117897050A (zh) 2021-06-17 2024-04-16 成对植物服务股份有限公司 大豆中生长调节因子家族转录因子的修饰
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
CA3224982A1 (en) 2021-07-01 2023-01-05 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
US20230078990A1 (en) 2021-08-12 2023-03-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023023496A1 (en) 2021-08-17 2023-02-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
WO2023034731A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
US20230087522A1 (en) 2021-09-21 2023-03-23 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
US20230266293A1 (en) 2021-09-21 2023-08-24 Pairwise Plants Services, Inc. Color-based and/or visual methods for identifying the presence of a transgene and compositions and constructs relating to the same
EP4413127A1 (en) 2021-10-04 2024-08-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
CN118302434A (zh) 2021-10-07 2024-07-05 成对植物服务股份有限公司 用于改善小花育性和种子产量的方法
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
WO2023114750A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Pairwise Plants Services, Inc. Model editing systems and methods relating to the same
CN114196660B (zh) * 2021-12-15 2022-11-08 中国农业科学院油料作物研究所 油菜fc2亚铁螯合酶基因在提高油菜产量中的应用
WO2023133440A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for trichome removal
CN114085277B (zh) * 2022-01-19 2022-04-19 北京市农林科学院 一种将目的蛋白定位于叶绿体的方法及其应用
CN114085278B (zh) * 2022-01-20 2022-04-26 北京市农林科学院 Lsa25711转运肽在叶绿体遗传转化中的应用
AR128372A1 (es) 2022-01-31 2024-04-24 Pairwise Plants Services Inc Supresión de la respuesta de evitación de la sombra en las plantas
WO2023164722A1 (en) 2022-02-28 2023-08-31 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered crispr-cas effector proteins and methods of use thereof
US20240327858A1 (en) 2022-03-02 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
US20230357789A1 (en) 2022-04-07 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023205714A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20230348922A1 (en) 2022-05-02 2023-11-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
AR129709A1 (es) 2022-06-27 2024-09-18 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para modificar el escape a la sombra en plantas
WO2024006791A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
AR129748A1 (es) 2022-06-29 2024-09-25 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para controlar el tamaño del meristemo para el mejoramiento de cultivos
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
US20240060081A1 (en) 2022-08-11 2024-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024054880A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
CN115623986B (zh) * 2022-10-27 2023-12-15 天津农学院 一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法
US20240200102A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Pairwise Plants Services, Inc. Fusion proteins comprising an intein polypeptide and methods of use thereof
WO2024137911A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered proteins and methods of use thereof
WO2024173622A1 (en) 2023-02-16 2024-08-22 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240327811A1 (en) 2023-03-01 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Engineered proteins and methods of use thereof
WO2024182658A1 (en) 2023-03-02 2024-09-06 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
WO2024186950A1 (en) 2023-03-09 2024-09-12 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid signaling pathway genes for improving yield traits in plants
US20240324536A1 (en) 2023-03-30 2024-10-03 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing thorns or prickles in plants
CN116789780B (zh) * 2023-05-26 2023-12-01 中国农业科学院生物技术研究所 用于抗草甘膦除草剂基因的叶绿体转运肽及其应用
CN118547001A (zh) * 2024-07-24 2024-08-27 西北农林科技大学深圳研究院 除草剂抗性基因及其应用

Family Cites Families (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4693977A (en) 1982-08-23 1987-09-15 Queen's University At Kingston Enzyme immobilization for producing cephalosporin antibiotics
US4536475A (en) 1982-10-05 1985-08-20 Phytogen Plant vector
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NZ207765A (en) 1983-04-15 1987-03-06 Lubrizol Genetics Inc Plant expression of transferred dna(t-dna)from plasmids associated with agrobacterium sp
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US6114138A (en) 1984-06-04 2000-09-05 Mycogen Plant Science, Inc. Insecticidal protein fragments
DE3587548T2 (de) 1984-12-28 1993-12-23 Bayer Ag Rekombinante DNA, die in pflanzliche Zellen eingebracht werden kann.
US5753475A (en) 1985-01-17 1998-05-19 Calgene, Inc. Methods and compositions for regulated transcription and expression of heterologous genes
US5420034A (en) 1986-07-31 1995-05-30 Calgene, Inc. Seed-specific transcriptional regulation
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US4886937A (en) 1985-05-20 1989-12-12 North Carolina State University Method for transforming pine
CA1313830C (en) * 1985-08-07 1993-02-23 Dilip Maganlal Shah Glyphosate-resistant plants
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US4810648A (en) 1986-01-08 1989-03-07 Rhone Poulenc Agrochimie Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
US4975374A (en) 1986-03-18 1990-12-04 The General Hospital Corporation Expression of wild type and mutant glutamine synthetase in foreign hosts
US5013659A (en) 1987-07-27 1991-05-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
US5268463A (en) 1986-11-11 1993-12-07 Jefferson Richard A Plant promoter α-glucuronidase gene construct
EP0270496B1 (de) 1986-12-05 1993-03-17 Ciba-Geigy Ag Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
TR27832A (tr) 1987-04-29 1995-08-31 Monsanto Co Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler.
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
EP0333033A1 (en) 1988-03-09 1989-09-20 Meiji Seika Kaisha Ltd. Glutamine synthesis gene and glutamine synthetase
DE68918494T2 (de) 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
DE3834738A1 (de) 1988-10-12 1990-04-19 Basf Lacke & Farben Verfahren zur herstellung eines mehrschichtigen ueberzuges, waessrige beschichtungszusammensetzungen, wasserverduennbare polyacrylatharze und verfahren zur herstellung von wasserverduennbaren polyacrylatharzen
US20020007053A1 (en) * 1989-02-06 2002-01-17 Barry Gerard Francis Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
EP0388186A1 (en) 1989-03-17 1990-09-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company External regulation of gene expression
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US5188960A (en) 1989-06-27 1993-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5126133A (en) 1989-06-27 1992-06-30 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolate active against lepidopteran pests, and genes encoding novel lepidopteran-active toxins
US5501967A (en) 1989-07-26 1996-03-26 Mogen International, N.V./Rijksuniversiteit Te Leiden Process for the site-directed integration of DNA into the genome of plants
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
GB9017539D0 (en) 1990-08-10 1990-09-26 Rhone Poulenc Agriculture New compositions of matter
GB8920519D0 (en) 1989-09-11 1989-10-25 Rhone Poulenc Ltd New compositions of matter
ES2150900T3 (es) 1989-10-31 2000-12-16 Monsanto Co Promotor para plantas transgenicas.
US5658772A (en) 1989-12-22 1997-08-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Site-specific recombination of DNA in plant cells
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
WO1991010725A1 (en) 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
WO1992004449A1 (en) * 1990-08-31 1992-03-19 Monsanto Company Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5633435A (en) 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
JP2859427B2 (ja) 1990-11-21 1999-02-17 株式会社東芝 超電導コイル装置
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
GB9101660D0 (en) 1991-01-25 1991-03-06 Rhone Poulenc Agriculture New compositions of matter
GB9310203D0 (en) 1993-05-18 1993-06-30 Rhone Poulenc Agriculture Compositions of new matter
GB9101659D0 (en) 1991-01-25 1991-03-06 Rhone Poulenc Agriculture Compositions of matter
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
USRE36449E (en) 1991-03-05 1999-12-14 Rhone-Poulenc Agro Chimeric gene for the transformation of plants
GB9114259D0 (en) 1991-07-02 1991-08-21 Ici Plc Plant derived enzyme and dna sequences
GB9115377D0 (en) 1991-07-17 1991-09-04 Rhone Poulenc Agriculture New compositions of matter
GB9115909D0 (en) 1991-07-23 1991-09-04 Nickerson Int Seed Recombinant dna
GB9116834D0 (en) 1991-08-05 1991-09-18 Rhone Poulenc Agriculture Compositions of new matter
GB9304200D0 (en) 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5304730A (en) 1991-09-03 1994-04-19 Monsanto Company Virus resistant plants and method therefore
US5334753A (en) 1992-03-12 1994-08-02 Rhone-Poulenc Agriculture Ltd Processes for preparing ortho-substituted benzoic acids
US5510417A (en) 1992-04-21 1996-04-23 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Aqueous polyester dispersion suitable for use as a coating composition
EP0604662B1 (en) 1992-07-07 2008-06-18 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon
AU670316B2 (en) 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
US5332808A (en) 1992-09-08 1994-07-26 North Carolina State University DNA encoding a ribosome inactivating protein
US5607914A (en) 1993-01-13 1997-03-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic antimicrobial peptides
GB9302071D0 (en) 1993-02-03 1993-03-24 Rhone Poulenc Agriculture Compositions of matter
DE69422837T2 (de) 1993-05-18 2000-08-17 Rhone-Poulenc Agriculture Ltd., Ongar 2-Cyan-1-sulfonamidophenyl-1,3-dion-Derivate und deren Verwendung als Herbizide
DE4317845A1 (de) 1993-05-28 1994-12-01 Bayer Ag Desoxyribonukleinsäuren
US5789156A (en) 1993-06-14 1998-08-04 Basf Ag Tetracycline-regulated transcriptional inhibitors
US5814618A (en) 1993-06-14 1998-09-29 Basf Aktiengesellschaft Methods for regulating gene expression
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5506195A (en) 1994-11-01 1996-04-09 Zeneca Limited Selective 1,3-cyclohexanedione corn herbicide
CN1134542C (zh) 1994-12-30 2004-01-14 赛迷尼思蔬菜种子公司 表达含有多个基因的dna构建体具有抗病毒抗性的转基因植物
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
US5659026A (en) 1995-03-24 1997-08-19 Pioneer Hi-Bred International ALS3 promoter
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
ES2275278T3 (es) 1995-09-22 2007-06-01 Syngenta Limited Promotores de glutacion-s-transferasa de plantas.
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
US5693512A (en) 1996-03-01 1997-12-02 The Ohio State Research Foundation Method for transforming plant tissue by sonication
IE80657B1 (en) 1996-03-29 1998-11-04 Merial Sas Insecticidal combination to control mammal fleas in particular fleas on cats and dogs
JP2000513228A (ja) 1996-06-27 2000-10-10 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー ｐ―ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼの植物遺伝子
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
US5994123A (en) 1996-08-09 1999-11-30 Regents Of University Of Minnesota Sugarcane bacilliform virus promoter
US6489462B1 (en) 1996-08-09 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota Sugarcane bacilliform virus promoter
US6140078A (en) 1996-09-05 2000-10-31 Unilever Patent Holdings Salt-inducible promoter derivable from a lactic acid bacterium, and its use in a lactic acid bacterium for production of a desired protein
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6096947A (en) 1997-01-14 2000-08-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for improving transformation efficiency
WO1998031822A1 (en) 1997-01-20 1998-07-23 Plant Genetic Systems, N.V. Pathogen-induced plant promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US5922564A (en) 1997-02-24 1999-07-13 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
US5886775A (en) 1997-03-12 1999-03-23 M+Ind Noncontact digitizing imaging system
US7105724B2 (en) 1997-04-04 2006-09-12 Board Of Regents Of University Of Nebraska Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms
GB9711015D0 (en) 1997-05-28 1997-07-23 Zeneca Ltd Improvements in or relating to organic compounds
DK0991764T3 (da) 1997-06-12 2006-11-13 Dow Agrosciences Llc Regulatoriske sekvenser for transgene planter
US6245968B1 (en) 1997-11-07 2001-06-12 Aventis Cropscience S.A. Mutated hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, DNA sequence and isolation of plants which contain such a gene and which are tolerant to herbicides
US6720475B1 (en) 1997-11-18 2004-04-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Modified nucleic acid sequence encoding FLP recombinase
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
AR014491A1 (es) 1998-01-29 2001-02-28 Dow Agrosciences Llc Metodo para obtener plantas transgenicas fertiles de gossypium hirsutum.
BR9907997A (pt) 1998-02-20 2000-10-24 Zeneca Ltd Promotor especìfico de pólen
WO1999043819A1 (en) 1998-02-26 1999-09-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize pr-1 genes and promoters
ES2273127T3 (es) 1998-02-26 2007-05-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Promotor alfa-tubulin 3-18 del maiz.
AUPP249298A0 (en) 1998-03-20 1998-04-23 Ag-Gene Australia Limited Synthetic genes and genetic constructs comprising same I
US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
US6037522A (en) * 1998-06-23 2000-03-14 Rhone-Poulenc Agro Agrobacterium-mediated transformation of monocots
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
AR021484A1 (es) 1998-09-10 2002-07-24 Pioneer Hi Bred Int Nuevos receptores de ecdisona y metodos de uso de los mismos
ES2264283T3 (es) 1998-10-23 2006-12-16 Mycogen Corporation Polinucleotidos optimizados de plantas que codifican proteinas pesticidas de aproximadamente 15kda y aproximadamente 45kda.
US6489542B1 (en) * 1998-11-04 2002-12-03 Monsanto Technology Llc Methods for transforming plants to express Cry2Ab δ-endotoxins targeted to the plastids
US6515206B1 (en) 1998-12-23 2003-02-04 Calgene Llc Plastid transformation of Brassica
WO2000042207A2 (en) 1999-01-14 2000-07-20 Monsanto Technology Llc Soybean transformation method
AU3210100A (en) 1999-01-19 2000-08-01 Maxygen, Inc. Methods for making character strings, polynucleotides and polypeptides having desired characteristics
WO2000066748A1 (en) * 1999-04-29 2000-11-09 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
MXPA01010930A (es) * 1999-04-29 2003-06-30 Syngenta Ltd Plantas resistentes a herbicidas.
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
US6677503B1 (en) 1999-06-23 2004-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses
AR025996A1 (es) * 1999-10-07 2002-12-26 Valigen Us Inc Plantas no transgenicas resistentes a los herbicidas.
AU3289601A (en) 2000-01-21 2001-07-31 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel root-preferred promoter elements and methods of use
US6388170B1 (en) 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
AU2001287862B2 (en) * 2000-09-29 2006-12-14 Syngenta Limited Herbicide resistant plants
US7074985B2 (en) 2002-02-15 2006-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Development of a stress-responsive promoter from maize
EP2368982A3 (en) 2002-03-21 2011-10-12 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
DE10224889A1 (de) 2002-06-04 2003-12-18 Metanomics Gmbh & Co Kgaa Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen
CA2490274A1 (en) 2002-06-27 2004-01-08 Dow Agrosciences Llc Use of regulatory sequences in transgenic plants
BR0312771A (pt) * 2002-07-18 2005-05-03 Monsanto Technology Llc Métodos para usar polinucleotìdeos artificiais e composições destes para reduzir silenciamento de transgene
US7045684B1 (en) 2002-08-19 2006-05-16 Mertec, Llc Glyphosate-resistant plants
DE03779067T1 (de) 2002-11-12 2006-06-22 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Evrogen" Fluoreszenzproteine und chromoproteine aus nicht-aequorea-hydrozoa-spezies sowie verfahren zur verwendung davon
AU2003287115A1 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo "Evrogen" Fluorescent proteins from copepoda species and methods for using same
AU2004213818B2 (en) * 2003-02-18 2008-06-05 Monsanto Technology Llc Glyphosate resistant class I 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS)
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
CA2534296C (en) 2003-08-08 2013-03-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
KR100537955B1 (ko) 2003-10-29 2005-12-20 학교법인고려중앙학원 꽃가루 특이적 유전자 발현 프로모터
US20050102713A1 (en) 2003-11-07 2005-05-12 Merlo Donald J. Use of untranslated region of osmotin gene to enhance transgene expression in plants
US7317146B2 (en) 2003-12-31 2008-01-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Production of cereal grain with reduced starch granule size and uses thereof
EP2308977B2 (en) * 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
ATE482281T1 (de) * 2004-06-09 2010-10-15 Pioneer Hi Bred Int Plastiden transit peptide
BRPI0512589A (pt) 2004-06-24 2008-03-25 Monsanto Technology Llc epsps resistente a glifosato microbiano reivindicação de prioridade
NZ553225A (en) * 2004-08-13 2010-02-26 Athlomics Pty Ltd Microarray-mediated diagnosis of herpes virus infection by monitoring hostÆs differential gene expression upon infection
KR101337016B1 (ko) 2004-09-29 2013-12-05 파이어니어 하이 부렛드 인터내쇼날 인코포레이팃드 옥수수 이벤트 ｄａｓ-59122-7 및 그의 탐지 방법
CN1789412B (zh) * 2004-12-16 2011-04-20 北京大学 利用片段互补技术重建5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性
EP3581024A1 (en) 2005-03-02 2019-12-18 Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria Herbicide-resistant rice plants, polynucleotides encoding herbicide-resistant acetohydroxyacid synthase large subunit proteins, and methods of use
US20060207721A1 (en) 2005-03-17 2006-09-21 Greg Slominski Polymer adhesive splicing of water-soluble, orally ingestible thin film webs
CN101175850B (zh) 2005-04-08 2013-09-04 阿则耐克斯公司 一类新型epsp合酶的鉴定
JP4772451B2 (ja) 2005-10-18 2011-09-14 株式会社リコー 画像形成装置
BRPI0618025B1 (pt) * 2005-10-28 2016-12-27 Dow Agrosciences Llc método para controlar ervas daninhas em uma área, polinucleotídeo isolado, célula de planta e planta resistente a herbicida
US7674958B2 (en) 2005-12-01 2010-03-09 Athenix Corporation GRG23 and GRG51 genes conferring herbicide resistance
ZA200804596B (en) * 2005-12-01 2009-09-30 Athenix Corp GRG23 and GRG51 genes conferring herbicide resistance
US20080313769A9 (en) 2006-01-12 2008-12-18 Athenix Corporation EPSP synthase domains conferring glyphosate resistance
ES2531882T3 (es) 2006-01-12 2015-03-20 Cibus Europe B.V. EPSPS mutantes
CN101437843B (zh) 2006-01-23 2013-08-07 密歇根州立大学评议会 抗草甘膦植物的育种方法及组合物
US9045765B2 (en) 2006-06-09 2015-06-02 Athenix Corporation EPSP synthase genes conferring herbicide resistance
EP2027261B1 (en) * 2006-06-09 2010-12-15 Athenix Corporation Novel epsp synthase genes conferring herbicide resistance
USPP19043P3 (en) 2006-06-12 2008-07-22 Regents Of The University Of Minnesota Chrysanthemum plant named ‘95-169-8’
AR061366A1 (es) * 2006-06-13 2008-08-20 Athenix Corp Epsp sintasas mejoradas: composiciones y metodos de uso de las mismas
CN101501197A (zh) 2006-06-13 2009-08-05 阿则耐克斯公司 改善的epsp合酶：组合物及使用方法
EP2032707B1 (en) * 2006-06-27 2012-06-06 Athenix Corporation Grg36: a novel epsp synthase gene conferring herbicide resistance
US8003854B2 (en) 2006-06-27 2011-08-23 Athenix Corp. GRG32: a novel EPSP synthase gene conferring herbicide resistance
KR101447300B1 (ko) * 2006-08-11 2014-10-07 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 안트라닐레이트 신타제의 엽록체를 표적으로 하는 발현에 의한 고-트립토판 옥수수의 생산
EP2049663B1 (en) 2006-08-11 2015-02-25 Dow AgroSciences LLC Zinc finger nuclease-mediated homologous recombination
CN101144087A (zh) * 2006-09-15 2008-03-19 四川大学 盐生杜氏藻epsp合成酶及其制备方法与应用
AR064795A1 (es) * 2006-10-25 2009-04-29 Dunwoody Paul Robert Sistemas de cultivo para el manejo de malezas
PT2087124E (pt) 2006-11-29 2011-07-29 Athenix Corp Epsp sintases grg23 melhoradas: composições e processos de utilização
EP2094831B1 (en) 2006-12-07 2015-09-16 Dow AgroSciences LLC Novel selectable marker genes
AU2007334468B2 (en) 2006-12-14 2013-02-07 Corteva Agriscience Llc Optimized non-canonical zinc finger proteins
US7838729B2 (en) * 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
US8609936B2 (en) * 2007-04-27 2013-12-17 Monsanto Technology Llc Hemipteran-and coleopteran active toxin proteins from Bacillus thuringiensis
AU2008251445B2 (en) * 2007-05-09 2014-04-03 Corteva Agriscience Llc Novel herbicide resistance genes
US8722410B2 (en) 2007-10-05 2014-05-13 Dow Agrosciences, Llc. Methods for transferring molecular substances into plant cells
MX2010005352A (es) * 2007-11-15 2010-07-02 Monsanto Technology Llc Plantas y semillas de soya correspondientes al evento transgenico mon87701 y metodos de deteccion del mismo.
AU2009212130B2 (en) * 2008-02-10 2012-07-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for plant pest control
BR122017015607B1 (pt) * 2008-05-21 2024-02-06 Basf Se Composição herbicida, e, métodos para controlar vegetação indesejável e para tratamento de queimada de vegetação indesejável em culturas
EP2299804A4 (en) 2008-06-11 2011-05-18 Dow Agrosciences Llc RECOMBINANT PRODUCTS FOR EXPRESSION OF HERBICIDE TOLERANT GENES, ASSOCIATED PLANTS, AND COMBINATIONS OF ASSOCIATED CHARACTERS
BRPI0911744A2 (pt) 2008-08-01 2015-08-18 Bayer Bioscience Nv "método para aumentar a produção de biomassa e/ou a produção de sementes e/ou a fixação de carbono em plantas de arroz, planta de arroz, transgênico, semente de arroz, grão de arroz, farinha e produto alimentício"
BRPI0918617A2 (pt) 2008-09-08 2015-08-25 Athenix Corp Composições e métodos para expressão de uma sequência nucleotídica heteróloga em plantas
US20100107446A1 (en) 2008-11-05 2010-05-06 Doris Peet Shoe accessory
GB2465749B (en) * 2008-11-25 2013-05-08 Algentech Sas Plant cell transformation method
DK2370575T3 (en) * 2008-12-17 2018-02-05 Dow Agrosciences Llc TARGETED INTEGRATION IN THE ZP15 LOCUS
AU2009333021B2 (en) * 2008-12-31 2015-09-10 Sapphire Energy, Inc. Genetically engineered herbicide resistant algae
CN101886088B (zh) * 2009-05-15 2013-04-17 北京大学 转基因构建体和转基因植物
EP2456875A4 (en) * 2009-07-21 2013-03-20 Syngenta Participations Ag TRANSIT PEPTIDES TO PLASES DERIVED FROM LOWER PHOTOSYNTHETIC EUKARYOTICS AND METHODS
US8598413B2 (en) 2009-08-19 2013-12-03 Dow AgroSciecnes, LLC. AAD-1 event DAS-40278-9, related transgenic corn lines, event-specific identification thereof, and methods of weed control involving AAD-1
US8578771B2 (en) 2010-03-05 2013-11-12 Lockheed Martin Corporation Compact gradiometer with accelerometer based rotational control
CN101831443A (zh) * 2010-03-25 2010-09-15 中国农业科学院生物技术研究所 编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因及其应用
EP2580230B1 (en) 2010-06-11 2017-08-23 Syngenta Participations AG Compositions and methods for protein production
WO2012021785A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods comprising sequences having hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (hppd) activity
US9150625B2 (en) * 2011-05-23 2015-10-06 E I Du Pont De Nemours And Company Chloroplast transit peptides and methods of their use
MX344968B (es) 2012-02-01 2017-01-12 Dow Agrosciences Llc Peptido de transito al cloroplasto.
AU2013205557B2 (en) * 2012-04-17 2016-04-21 Corteva Agriscience Llc Synthetic brassica-derived chloroplast transit peptides
KR20180038048A (ko) * 2015-08-20 2018-04-13 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 엽록체 전이 펩티드

Also Published As

Publication number Publication date
HUE042672T2 (hu) 2019-07-29
WO2013116768A1 (en) 2013-08-08
AU2013205521A1 (en) 2013-08-15
MX348268B (es) 2017-06-05
PH12014501726A1 (en) 2014-11-10
KR102045097B1 (ko) 2019-11-14
AU2016202277B2 (en) 2017-10-05
CO7061041A2 (es) 2014-09-19
EP2809144A4 (en) 2015-10-21
JP2015506701A (ja) 2015-03-05
TW201335365A (zh) 2013-09-01
TWI637054B (zh) 2018-10-01
JP2015511815A (ja) 2015-04-23
EP3219200B1 (en) 2020-05-06
EP3470522A2 (en) 2019-04-17
MX343876B (es) 2016-11-25
AU2013205606A1 (en) 2013-08-15
CA2863405C (en) 2023-09-19
US20130212737A1 (en) 2013-08-15
EP2809147A4 (en) 2015-08-05
CL2014002018A1 (es) 2014-11-21
US20130205441A1 (en) 2013-08-08
ZA201406002B (en) 2016-08-31
NZ628989A (en) 2016-07-29
RU2014135442A (ru) 2016-03-27
CO7061036A2 (es) 2014-09-19
KR20140119187A (ko) 2014-10-08
KR20140120934A (ko) 2014-10-14
BR112014018903A2 (pt) 2020-10-27
CO7061038A2 (es) 2014-09-19
CA2863196A1 (en) 2013-08-08
ZA201406143B (en) 2016-06-29
IL243904A0 (en) 2016-04-21
AU2015215946B2 (en) 2017-06-22
CN108192901A (zh) 2018-06-22
JP6242345B2 (ja) 2017-12-06
NZ712168A (en) 2016-05-27
ZA201405891B (en) 2016-08-31
JP2015511126A (ja) 2015-04-16
US20130219552A1 (en) 2013-08-22
IL233911B (en) 2018-08-30
US20170073696A1 (en) 2017-03-16
MX354522B (es) 2018-03-08
UY34607A (es) 2013-09-02
CN110577933A (zh) 2019-12-17
RU2636036C2 (ru) 2017-11-17
US20200157555A1 (en) 2020-05-21
CN104219950B (zh) 2018-02-06
RU2634411C2 (ru) 2017-10-26
CN104219949A (zh) 2014-12-17
CN104519734A (zh) 2015-04-15
EP3235373A1 (en) 2017-10-25
US20130205440A1 (en) 2013-08-08
ZA201406142B (en) 2016-06-29
EP2809143A4 (en) 2015-12-16
US20130295638A1 (en) 2013-11-07
EP3219200A1 (en) 2017-09-20
RU2720973C2 (ru) 2020-05-15
US20160304897A1 (en) 2016-10-20
TW201336991A (zh) 2013-09-16
CO7061035A2 (es) 2014-09-19
CA2863194A1 (en) 2013-08-08
JP2015505480A (ja) 2015-02-23
US9359614B2 (en) 2016-06-07
JP2015506702A (ja) 2015-03-05
CL2014002020A1 (es) 2014-11-21
AU2013205600B2 (en) 2016-05-19
NZ629394A (en) 2015-09-25
AU2015210439A1 (en) 2015-09-03
CO7061037A2 (es) 2014-09-19
AU2013205600A1 (en) 2013-08-15
JP6251193B2 (ja) 2017-12-20
CN107119060A (zh) 2017-09-01
AU2013205521B2 (en) 2016-10-13
AR090416A1 (es) 2014-11-12
WO2013116764A1 (en) 2013-08-08
RU2632648C2 (ru) 2017-10-06
MX2014009345A (es) 2015-10-05
MX344968B (es) 2017-01-12
BR112014019043A2 (pt) 2017-07-04
BR102013002592A2 (pt) 2015-08-04
BR102013002598A2 (pt) 2019-03-06
KR102078764B1 (ko) 2020-02-19
AU2013205441B2 (en) 2016-10-27
AR090418A1 (es) 2014-11-12
US9540654B2 (en) 2017-01-10
KR20140132352A (ko) 2014-11-17
AU2013205441A1 (en) 2013-08-15
AU2013205525B2 (en) 2016-12-22
AU2013205604A1 (en) 2013-08-15
RU2014135403A (ru) 2016-03-27
EP2809148B1 (en) 2019-05-15
BR112014018832A2 (pt) 2017-07-04
US9873883B2 (en) 2018-01-23
KR20140132354A (ko) 2014-11-17
NZ629051A (en) 2016-10-28
EP2809144B1 (en) 2019-11-13
EP2809147A1 (en) 2014-12-10
CA2863201A1 (en) 2013-08-08
BR102013002592B1 (pt) 2022-06-07
AU2017200562B2 (en) 2018-07-26
KR20140119186A (ko) 2014-10-08
AR089872A1 (es) 2014-09-24
RU2014135340A (ru) 2016-03-20
UA115546C2 (uk) 2017-11-27
JP6466172B2 (ja) 2019-02-06
IL233860B (en) 2019-01-31
RU2014135324A (ru) 2016-03-20
IL233861B (en) 2018-04-30
ZA201406338B (en) 2016-05-25
NZ628549A (en) 2016-10-28
WO2013116758A1 (en) 2013-08-08
RU2017132988A3 (pt) 2019-02-07
JP2015506703A (ja) 2015-03-05
CN108285901A (zh) 2018-07-17
UY34606A (es) 2013-09-02
EP2809148A4 (en) 2015-12-09
US20170114332A1 (en) 2017-04-27
BR112014018916A2 (pt) 2017-07-04
RU2014135335A (ru) 2016-03-20
EP2809142B1 (en) 2019-05-15
EP2809147B1 (en) 2018-09-19
EP2809145A1 (en) 2014-12-10
US20130217577A1 (en) 2013-08-22
AU2015210439B2 (en) 2017-05-25
EP3235373B1 (en) 2020-05-13
AP2014007886A0 (en) 2014-08-31
CN104202968A (zh) 2014-12-10
AU2017200562A1 (en) 2017-02-23
BR102013002599A2 (pt) 2015-08-11
US20170022517A1 (en) 2017-01-26
KR102036395B1 (ko) 2019-10-24
CN104202967A (zh) 2014-12-10
MX349666B (es) 2017-08-08
UA116980C2 (uk) 2018-06-11
PH12014501727A1 (en) 2014-11-10
ZA201406003B (en) 2015-11-25
EP2809142A1 (en) 2014-12-10
EP2809142A4 (en) 2015-09-16
MX2014009351A (es) 2015-02-20
US20170058286A1 (en) 2017-03-02
CA2863196C (en) 2021-08-10
PH12014501729A1 (en) 2014-11-10
CA2863400A1 (en) 2013-08-08
MX351310B (es) 2017-10-09
CL2014002017A1 (es) 2014-11-21
RU2017132988A (ru) 2019-02-07
US10421972B2 (en) 2019-09-24
US9493781B2 (en) 2016-11-15
MX2014009349A (es) 2016-06-21
PH12014501726B1 (en) 2014-11-10
BR112014019043B8 (pt) 2023-05-16
RU2017133853A (ru) 2019-02-07
BR102013002598B1 (pt) 2022-05-31
BR102013002599B1 (pt) 2022-04-05
BR112014018916B8 (pt) 2023-05-16
WO2013116773A1 (en) 2013-08-08
UY34608A (es) 2013-09-02
RU2627169C2 (ru) 2017-08-03
RU2626535C2 (ru) 2017-07-28
KR102047336B1 (ko) 2019-11-22
ES2716481T3 (es) 2019-06-12
US9506077B2 (en) 2016-11-29
KR20140132353A (ko) 2014-11-17
CA2863402A1 (en) 2013-08-08
CA2863194C (en) 2021-07-27
AR090417A1 (es) 2014-11-12
UA116198C2 (uk) 2018-02-26
CA2863400C (en) 2022-06-14
CN104219950A (zh) 2014-12-17
EP3470522A3 (en) 2019-06-19
CO7051012A2 (es) 2014-09-10
MX2014009348A (es) 2015-02-20
EP2809148A1 (en) 2014-12-10
US10428339B2 (en) 2019-10-01
CL2014002016A1 (es) 2014-11-21
JP2018068304A (ja) 2018-05-10
JP6537825B2 (ja) 2019-07-10
AP2014007895A0 (en) 2014-08-31
CL2014002021A1 (es) 2014-11-21
US9382549B2 (en) 2016-07-05
AU2016202277A1 (en) 2016-05-05
AR089874A1 (es) 2014-09-24
US10577618B2 (en) 2020-03-03
UA115545C2 (uk) 2017-11-27
RU2721122C2 (ru) 2020-05-18
RU2014135466A (ru) 2016-03-20
RU2636037C2 (ru) 2017-11-17
AR089873A1 (es) 2014-09-24
AP2014007885A0 (en) 2014-08-31
CN104202969A (zh) 2014-12-10
AU2018253607A1 (en) 2018-11-22
UA115547C2 (uk) 2017-11-27
AU2013205606B2 (en) 2015-05-21
US9493780B2 (en) 2016-11-15
AU2013205525A1 (en) 2013-08-15
AP2014007887A0 (en) 2014-08-31
AU2018253607B2 (en) 2021-05-06
US20130210114A1 (en) 2013-08-15
WO2013116782A1 (en) 2013-08-08
TW201341394A (zh) 2013-10-16
IL233858A (en) 2017-10-31
RU2017133853A3 (pt) 2019-02-07
MX345618B (es) 2017-02-07
US10577619B2 (en) 2020-03-03
CA2863405A1 (en) 2013-08-08
AU2015215946A1 (en) 2015-09-17
BR112014019043B1 (pt) 2022-08-09
JP6349261B2 (ja) 2018-06-27
AU2013205604B2 (en) 2015-05-07
EP2809145A4 (en) 2015-09-16
AR091306A1 (es) 2015-01-28
MX352662B (es) 2017-12-04
MX2014009342A (es) 2015-02-20
JP2019047803A (ja) 2019-03-28
CN104219949B (zh) 2018-03-30
PH12014501728A1 (en) 2014-11-17
CL2014002015A1 (es) 2014-11-21
BR122022004161B1 (pt) 2022-11-08
MX2014009343A (es) 2015-06-05
CN107119061A (zh) 2017-09-01
WO2013116700A1 (en) 2013-08-08
EP2809143A1 (en) 2014-12-10
EP2809144A1 (en) 2014-12-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10577618B2 (en) Class of glyphosate resistance genes

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 01/02/2013, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS

B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: CORTEVA AGRISCIENCE LLC (US)

B21F Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time

Free format text: REFERENTE A 11A ANUIDADE.

B24D Patent annual fee: restoration after fee payment