CN107502621B - 一种快速检测体内dna末端连接的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种快速检测体内DNA末端连接的方法，采用了制备含不同末端的线性质粒DNA线性质粒DNA经PEG转化拟南芥不同突变体的叶片原生质体；最后对DNA末端连接进行检测。本发明试验的供试样品微量即可，检测的样品稳定，可短期内反复检测，检测方法也相对简单，总体操作简单易行；同时利用PCR直接合成线性DNA片段，再经限制性内切酶酶切，即便酶切有部分不充分，也可从后序结果中鉴定出来，很好避免假阳性结果的出现，且结合qPCR能灵敏的检测出DNA末端连接的效率。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种快速检测体内DNA末端连接的方法。
背景技术
基因打靶（gene targeting）是指在内源目标基因处产生损伤，引入外源DNA片段，利用同源重组（homologous recombination, HR）的修复机制改变生物体的内源目标基因，旨在定点改造生物遗传信息，对遗传学的基础研究和改良生物题遗传性状都具有重要意义。而动植物等高等生物偏向于利用非同源重组机制即非同源末端连接（non-homologousend joining， NHEJ）去修复DNA损伤，若能在一定程度上抑制非同源末端连接或诱导同源重组，可在一定程度上提高基因打靶的效率。对非同源末端连接及同源重组及机制的研究对进一步提高基因打靶的效率意义重大，而对DNA末端连接效率及方式的鉴定对研究DNA重组机制十分重要。DNA末端连接的检测方法可分为体外和体内检测。体外检测是指将制备的活性蛋白与DNA末端连接底物建立体外连接体系，通过特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。虽然体外检测相对简单易行，但它并不能完全模拟生物体内环境，可能并不能真实的反映生物体内的反应情况。体内检测即指检测生物体活体细胞内建立DNA末端连接检测体系，通过表达产物（通常为荧光）的检测、特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。体内检测完全利用生物体建立检测体系，能更真实的反映DNA末端连接的情况，据目前报道，DNA末端连接的体内检测体系大约分以下两种方案模式。下面将分别详述。
方案一是连用可诱导表达的核酸限制性内切酶（如I-SceI等）载体及含该核酸限制性内切酶的酶切位点的报告基因（通常为荧光或荧光素酶）载体转化供试体，再通过对报告基因的产物检测去分析DNA末端连接。主要流程为构建可诱导表达的核酸限制性内切酶载体和含该核酸限制性内切酶的酶切位点的报告基因载体，内切酶的酶切位点在可检测的报告基因内或在控制可检测的报告基因的调控基因内等，将构建的诱导表达内切酶载体与含内切位点底物的报告载体皆转入供试体内，诱导内切酶表达后，产生断裂的DNA末端，经一定时间孵育后，DNA末端反应底物被细胞所修复，重新发出荧光，利用荧光检测系统（荧光显微镜、流式细胞仪、荧光素酶检测仪等）检测、核酸电泳、PCR技术及测序等分析其末端连接效率与形式。
方案二是体外制备线性的DNA末端连接底物，瞬时转化供试体，再通过特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。主要流程为构建含能不同限制性内切酶酶切位点的载体，这些不同限制性内切酶酶切相应底物能产生不同DNA末端，将载体转入大肠杆菌，利用大肠杆菌扩增体系，获得环状DNA产物，再用相应限制性内切酶酶切环状DNA得到含不同DNA末端的线性DNA，将含不同DNA末端的线性DNA转入供试体，经一定时间孵育后，DNA末端反应底物被转化细胞所修复，特定位点的酶切、核酸电泳、PCR技术及测序等检测手段去检测DNA末端连接。
上述方案一能很好模拟体内DNA末端连接环境，但其操作相对复杂，将两个载体转入供试体的效率往往不高，对供试体的转化效率及筛选有较高要求，耗时也长，此外荧光检测对产物量有一定要求，否则达不到荧光检测仪器的灵敏度；且荧光的检测也有时间限制，否则荧光将淬灭。
方案二操作相对简单，其体外制备不同DNA末端的线性DNA，需先构建含特定限制性内切酶酶切位点的载体，对特定限制性内切酶酶切位点的选择需受原始质粒的限制或需通过质粒重新构建，再通过限制性内切酶酶切环状DNA，若酶切不充分，可能对DNA末端连接产生假阳性的结果，DNA末端为单酶切时很难鉴定。对DNA末端连接的方式做出了检测，前人并未检测其连接效率，本人早期工作中所做的检测效率计算也较为粗略，在本发明中做了进一步改进。
本发明基本解决了上述的两种方法的缺点，试验的供试样品微量即可，检测的样品稳定，可供短期内反复检测，检测方法也相对简单，总体操作简单易行；本发明利用PCR直接合成线性DNA片段，再经限制性内切酶酶切，即便酶切有部分不充分，也可从后序结果中鉴定出来，很好避免假阳性结果的出现，且结合qPCR能灵敏的检测出DNA末端连接的效率。
发明内容
本发明的目的就在于一种快速检测体内DNA末端连接的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的目的可通过以下步骤来实现：
所述方法包括如下步骤：
(1)制备含不同末端的线性质粒DNA；
(2)线性质粒DNA经PEG转化拟南芥不同突变体的叶片原生质体；
(3)DNA末端连接的检测。
步骤（1）具体包括如下：选择3000~6000bp的载体为底物模板，以要切割的位点两侧的DNA序列设计PCR引物， 在引物的末端添加能酶切产生所需DNA末端的限制性内切酶的内切位点序列，本例中选用BamHI酶切位点，分别设计引物为q65:ctGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG, q66: ctGGATCCAGTCGACTGAATTGGTTC，用高保真Taq酶Phusion （Thermofisher）进行常规PCR扩增获得供所需DNA末端连接的底物，PCR产物纯化后，再经特定的内切酶BamHI酶切，获得BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA。
步骤（2）具体包括如下：将制备的BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA2ug加入圆底的2ml无菌EP管中，将100ul叶片原生质体加入到含DNA末端连接底物的EP管中，再在每管中缓慢加入110ul的过滤除菌的PEG溶液，在室温中孵育5-10min，再每管中加入440ul的W5溶液，缓慢混匀，200g离心2min，去上清，缓缓加入1ml W5溶液，混匀，25℃，黑暗培养，每个相同转化做两份，分别为孵育0h和24h后收样，提DNA。
步骤（3）具体包括如下：用荧光实时定量qPCR检测DNA末端连接的效率，分别设计两对引物，一对分别在线性质粒DNA末端（BamHI酶切位点）的两侧：q8 ：GTGACATCTCCACTGACGTAAG和q9：GATGAACTTCAGGGTCAGCTTG，另一对在线性质粒DNA上：q10：CAAGCTGACCCTGAAGTTCATC和 q11 ：GTTGTGGCGGATCTTGAAG；若同一条线性DNA末端相连，q8和q9引物经PCR扩增才有产物，若DNA末端没有相连，则q8和q9引物经PCR扩增没有产物；由此通过q8和q9引物PCR扩增产物量去检测拟南芥突变体对DNA末端连接效率；q10和q11引物在线性DNA上，无论DNA末端是否相连，经PCR扩增总有产物，用于线性DNA转化进原生质体的转化量的检测。
相对末端连接效率（relative end-joining efficiency，REE）计算公式为:
BamHI 和GFP 分别表示引物q8+q9 和引物 q10+11的经qPCR检测的产物量，X 代表线性DNA质粒，O 代表环状DNA质粒。0h和24h 为转化后孵育的时间点；标准差（standarddeviation，sd） 计算公式如下:
其中野生型（wild type，WT） 的检测值设为 1。
本发明的优点在于：
1，不同DNA末端的连接底物设计容易。可将BamHI酶切位点序列替换为其他酶切位点序列，通过设计不同引物，经PCR扩增，可简单快速大量的获得含各种不同类型的DNA末端的连接底物。
2，避免接连污染。在检测单一末端的连接效率时，PCR的产物为线性DNA，不存在环状DNA酶切去产生线性DNA时，酶切不充分，所存在的环状DNA与精确连接的产物所重复，从而产生的假阳性结果。本方法制备DNA末端时，BamHI酶切没有充分的话，参与反应的底物即为含保护碱基的平末端，可由测序的结果检测出来，而若采用环状DNA直接酶切，若酶切不充分，在做体内DNA末端连接反应后，这个污染与DNA末端精确连接的结果是一样的，并不能区分开，从而影响了实验结果的分析。
3，可操作性强，耗时短。原生质体或其他不少细胞的制备及转化都已技术成熟，从拟南芥原生质体的制备到产物DNA的提取，只需两天时间。
4，检测样品稳定。待检测的产物为DNA，相对活体细胞的荧光的检测，要稳定得多。
5，灵敏性强。由于qPCR可检测痕量变化，并无需大量细胞被转化，也使操作相对容易。
附图说明
图1 实验流程图。
图2 末端连接的比值图。
图3 BamHI和EcoRV双酶切结果。A中5号为丢失了DNA连接末端的BamHI酶切位点，B中13号为大段缺失。（泳道M为电泳的DNA Marker， 泳道uncut为未经BamHI和EcoRV双酶切的pART7-HA-GFP（s65t）质粒对照，其余泳道为连接产物转化E.coli，分别提取阳性单克隆质粒的BamHI和EcoRV双酶切鉴定结果。）。
具体实施方式
实施例1
用模式植物拟南芥为供试材料，主要的试验流程图如图1所示。
1，制备含不同末端的线性质粒DNA底物。
选择3000~6000bp的载体（以pART7-HA-GFP（s65t）(Jia et al., 2012)为例）为底物模板，以计划切割的位点两侧的DNA序列设计PCR引物，在引物的末端添加能酶切产生所需DNA末端的限制性内切酶（以BamHI为例）的内切位点序列，这样可以简单快速的制备任何需要的DNA末端，用高保真Taq酶PhusionTm进行常规PCR扩增pART7-HA-GFP（s65t）质粒（本实验室保存） （95℃ 5min, 95℃ 30sec, 60℃ 30sec, 75℃ 2min, 35个循环，72℃10min），获得供实验所需DNA末端连接的底物，PCR产物纯化后，再经特定的内切酶BamHI酶切，获得BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA底物。
本例中选用BamHI酶切位点，分别设计引物为q65: ctGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG,q66: ctGGATCCAGTCGACTGAATTGGTTC。
2，线性DNA经PEG转化拟南芥不同突变体的叶片原生质体。
拟南芥的培养条件。以拟南芥（生态型Col-0）突变体 ku80 (At1g48050), parp1(At2g31320), parp2 (At4g02390), parp1parp2 (p1p2)和parp1parp2Ku80 (p1p2k80)为例(Jia et al., 2013)。拟南芥种植为土培，21℃，16h光照/8h黑暗的光照周期，70%的相对湿度。
酶解法制备拟南芥不同突变替体的叶片原生质体。新鲜采集3-5周大的拟南芥花轮叶约1克，用去离子水清洗、晾干。将叶片切成0.5-1mm大小的小片，放入灭菌的平板，加入15ml过滤除菌的酶解液（1.5 %(w/v) cellulose R10, 0.4 %(w/v) macerozyme R10, 0.4M mannitol, 20 mM KCl, 20 mM MES pH5.7, 10 mM CaCl2, 0.1 %(w/v) BSA），28℃避光浸泡2-3小时。原生质体从拟南芥叶片中解离出来，将上述浸泡液过50 μm的网筛，去除未酶解的物质，将过滤液转移至圆底的Falcon管中，600rpm，离心5分钟，丢弃含破碎细胞的上清液，收集沉淀即为拟南芥叶片原生质体。用15ml冰置的W5溶液(154 mM NaCl, 125 mMCaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES pH5.7)轻柔清洗该沉淀2次，并用冰置的W5溶液稀释叶片原生质体，在显微镜下计数，将叶片原生质体稀释至2×105 cells/ml的终浓度，冰置30min。离心收集原生质体，并用MMg solution (0.4M甘露醇, 15mM MgCl2, 4mM MES pH5.7)在室温下稀释到2×105 cells/ml的终浓度。
PEG转化法将上述得到的线性DNA及环状DNA分别转化入拟南芥原生质体。以下操作都在超净台中进行。将制备的BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA底物2ug加入圆底的2ml无菌EP管中，将上述供试的100ul叶片原生质体分别加入到含DNA末端连接底物的EP管中，再在每管中缓慢加入110ul的过滤除菌的PEG溶液（40%PEG4000，0.2M甘露醇，0.1MCaCl2），在室温中孵育5-10min，再每管中加入440ul的W5溶液，缓慢混匀，注意一次不要超过6个样。200g离心2min，去上清，缓缓加入1ml W5溶液，混匀，25℃，黑暗培养。每个相同转化做两份，分别为孵育0h和24h后收样，提DNA。
3，DNA末端连接的检测。
荧光实时定量qPCR检测DNA末端连接的效率。从已转化线性DNA的叶片原生质体分别孵育0h和24h后提取原生质体总DNA，用荧光实时定量qPCR检测DNA末端连接的效率，其引物的设计如图B，分别设计两对引物，一对分别在线性质粒DNA末端（BamHI酶切位点）的两侧：q8 (GTGACATCTCCACTGACGTAAG)和q9 (GATGAACTTCAGGGTCAGCTTG)，另一对在线性质粒DNA上（本例中位于GFP基因上）：q10 (CAAGCTGACCCTGAAGTTCATC) 和 q11(GTTGTGGCGGATCTTGAAG)。线性DNA的2个DNA末端在细胞内的相连的结果有4种，其形式如图C所示。由于线性DNA转化入细胞的拷贝数很少，DNA末端相连常以就近原则，同一条线性DNA质粒两末端相连的机率占主要份额，在检测DNA末端连接效率时，我们只要考虑这一种形式。若同一条线性DNA末端相连，q8和q9引物经PCR扩增才有产物，若DNA末端没有相连，则q8和q9引物经PCR扩增没有产物。由此可通过q8和q9引物PCR扩增产物量去检测拟南芥不同突变体对DNA末端连接效率。q10和q11引物在线性DNA上，无论DNA末端是否相连，经PCR扩增总有产物，可用于线性DNA转化进原生质体的转化量的检测。DNA末端连接效率即可用q8+q9引物（其产物记作BamHI）和q10+11引物（其产物记作GFP）的PCR扩增产物量的相对比来表示。PCR是一个级联扩大的反应，对检测痕量DNA很有效，荧光实时定量qPCR灵敏度相当高，可用于对相关DNA的定量检测。每次qPCR设三个技术重复，DNA末端的转化做三个生物学重复。
用qPCR做绝对定量的对照标准曲线以10倍稀释的质粒来构建，用OpticonMonitor software软件来做线性回归曲线，其斜率k通常在-3.18~-3.42，r2 通常大于0.99。相对末端连接效率（relative end-joining efficiency，REE）计算公式为:
BamHI 和GFP 分别表示引物q8+q9 和引物 q10+11的经qPCR检测的产物量，X 代表线性DNA质粒，O 代表环状DNA质粒。0h和24h 为转化后孵育的时间点。标准差（standarddeviation，sd） 计算公式如下:
其中野生型（wild type，WT） 的检测值设为 1. 得到的末端连接的比值图如图2所示。
可见，抑制了NHEJ主要通路中一条的突变体parp1、parp2、p1p2、ku80都比野生型的DNA末端连接效率要低，而抑制了NHEJ两条主要通路的双、三突变体p1p2k80、x1k80却使DNA末端连接效率有所恢复，NHEJ可能还存在第三条通路，这条通路相当高效，在通常情况下被NHEJ的另两条通路所抑制。
用限制性酶切及测序可分析检测末端连接的方式。这个方案与前人的所做大致相当。将从原生质体里提取的DNA重新转化大肠杆菌DH5α，挑单克隆摇菌培养，抽提质粒。将抽提的质粒用BamHI和EcoRV双酶切，如果是精确的修复，则可切下734bp大小的小片段，若没有精确修复，要么丢失了DNA连接两末端的BamHI酶切位点，或是酶切产生了不同于734bp大小的小片段（连接产生大片段缺失，重新获得BamHI酶切位点）。每个原生质体转化后提取DNA的酶切统计结果如下表所示：
上表中Plant为所检测的各植株系；total为每个株系检测的转化E.coli的单克隆数；Losing BamHI site为检测的连接产物中，非精确连接使BamHI酶切位点丢失的个数；Large deletion为非精确连接中的大片段确缺失的个数。该酶切结果表明了野生型WT和各不同突变体之间DNA末端连接的精确性的差异，其中只有突变体p1p2k80和ku80出现了大片段缺失，说明缺失了KU80基因的突变体其连接的精确性大大下降，容易出现大片段缺失，KU80基因在DNA末端精确连接中起了重要作用。
BamHI和EcoRV双酶切结果如图3所示。泳道M为电泳的DNA Marker，泳道uncut为未经BamHI和EcoRV双酶切的pART7-HA-GFP（s65t）质粒对照，其余泳道为连接产物转化E.coli，分别提取阳性单克隆质粒的BamHI和EcoRV双酶切鉴定结果。A中5号为丢失了DNA连接末端的BamHI酶切位点，B中13号为大段缺失。
将非精确连接的连接产物DNA送测序，进一步分析其连接方式，测序结果汇总结果如下：
第一栏BamHI为末端精确连接后的产物序列，阴影部分BamHI的酶切位点序列；剩下的几行中左边一列为各实验株系，左边的序列为其非精确连接的序列，若某种连接产物出现的次数超过一次，则在该序列后的括弧里标注其出现的次数；短横线“-”表示核苷酸的缺失，其中出现的bp数为大片段缺失的核苷酸数；带下划线的碱基表示微同源末端连接的微同源序列。由此测序结果发现，KU80基因的突变体其连接产物容易出现带微同源重组的大片段缺失， KU80基因在一定程度上抑制了微同源重组的DNA末端连接。
若制备DNA末端时，BamHI酶切没有充分的话，参与反应的底物即为含保护碱基的平末端，可由测序的结果检测出来，而若采用环状DNA直接酶切，若酶切不充分，在做体内DNA末端连接反应后，这个污染与DNA末端精确连接的结果是一样的，并不能区分开，从而影响了实验结果的分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种快速检测体内DNA末端连接的方法
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Claims (2)
1.一种快速检测体内DNA末端连接的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)制备含不同末端的线性质粒DNA；
(2)线性质粒DNA经PEG转化拟南芥不同突变体的叶片原生质体；
(3)DNA末端连接的检测；
步骤（1）具体包括如下：选择3000~6000bp的载体为底物模板，以要切割的位点两侧的DNA序列设计PCR引物，在引物的末端添加能酶切产生所需DNA末端的限制性内切酶的内切位点序列，用高保真Taq酶Phusion进行常规PCR扩增获得所需DNA末端连接的底物，PCR产物纯化后，再经特定的内切酶BamHI酶切，获得BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA；
所述的PCR引物，是以BamHI 酶切位点设计， PCR引物分别为q65:ctGGATCCATGGTGAGCAAGGGCG,q66: ctGGATCCAGTCGACTGAATTGGTTC；
步骤（3）具体包括如下：用荧光实时定量qPCR检测DNA末端连接的效率，分别设计两对引物，一对分别在线性质粒DNA末端的两侧：q8 ：GTGACATCTCCACTGACGTAAG和q9 ：GATGAACTTCAGGGTCAGCTTG，另一对在线性质粒DNA上：q10 ：CAAGCTGACCCTGAAGTTCATC和q11 ：GTTGTGGCGGATCTTGAAG；若同一条线性DNA末端相连，q8和q9引物经PCR扩增才有产物，若DNA末端没有相连，则q8和q9引物经PCR扩增没有产物；由此通过q8和q9引物PCR扩增产物量去检测拟南芥突变体对DNA末端连接效率；q10和q11引物在线性DNA上，无论DNA末端是否相连，经PCR扩增总有产物，用于线性DNA转化进原生质体的转化量的检测；
相对末端连接效率计算公式为:
BamHI 和GFP 分别表示引物q8+q9 和引物 q10+11的经qPCR检测的产物量，X 代表线性DNA质粒，O 代表环状DNA质粒；0h和24h 为转化后孵育的时间点；标准差计算公式如下:
其中野生型WT 的检测值设为 1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）具体包括如下：将制备的BamHI酶切后的3’粘性末端的线性质粒DNA 2ug加入圆底的2ml无菌EP管中，将100ul叶片原生质体加入到含DNA末端连接底物的EP管中，再在每管中缓慢加入110ul的过滤除菌的PEG溶液，在室温中孵育5-10min，再每管中加入440ul的W5溶液，缓慢混匀，200g离心2min，去上清，缓缓加入1ml W5溶液，混匀，25℃，黑暗培养，每个相同转化做两份，分别为孵育0h和24h后收样，提DNA。
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