CN109355280A - 一种制备带特定末端的双链dna标准片段的方法 - Google Patents

一种制备带特定末端的双链dna标准片段的方法 Download PDF

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李剑辉
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Abstract

本发明提供一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，包括：步骤一、选取限制性内切酶：根据目的标准DNA的双端特性，筛选可产生相应末端的限制性内切酶，步骤二、筛选模板或构建模板：直接筛选模板：或者克隆构建模板：通过序列设计并合成带引物结合位点和酶切位点的短小片段；通过退火反应形成双端3’‑dT尾小片段双链；小片段通过连接反应构建到固定大小的PCR产物上；步骤三、通过特异性引物，经PCR扩增获得包含酶切位点和中间片段在内的DNA序列；步骤四、通过所筛选的限制性内切酶的酶切反应，切开两端酶切位点，获得特定双端的DNA片段；步骤五、纯化获得标准片段。本发明创造可以制备获得携带特定末端的DNA片段。

Description

一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法
技术领域
本发明涉及一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，属于生物技术领域。
背景技术
A/T连接是分子克隆的一种重要手段，也是目前二代测序领域中DNA文库构建环节中的一个重要步骤。评估实验所用连接酶和连接体系的连接性能，以及评测连接体系中是否有非目标连接产物，是评估选用合适连接酶和体系所必需的步骤，也是评测所产连接体系性能的重要程序。双端带3’-dA尾的DNA片段是用于体系评估评测的标准片段。
通常人们采用Taq DNA聚合酶等通过扩增延伸获得带3’-dA尾的DNA片段，该方法的所得产物中包含的片段类型较为多样。其中包含所需的双端携带3’-dA尾的片段，也包含一端为3’-dA尾而另一端为平末端的片段、双端都是平末端的片段、末端携带多个dA的片段等多种片段。另外，在NGS建库过程中，尤其是末端修复和末端加dA双步骤合并的方法中，其产生的片段类型更为多元，包含携带3’-dA、3’-dT、3’-dC和3’-dG凸出末端的片段等不同类型的片段。这些混合的片段不能较好地用于连接体系的评估评测。
另外，人们采用人工合成的方法获得双端3’-dA尾的DNA片段，基本上通过单链DNA序列合成后退火形成。对于短小片段，该方法比较简便有效，但是对于长片段，该方法受限于单链合成技术能力，同时也随着片段增加相应的成本也较大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，以解决上述问题。
本发明采用了如下技术方案：
一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法,其特征在于，包括：
步骤一、选取限制性内切酶：根据目的标准DNA的双端特性，筛选可产生相应末端的限制性内切酶，
步骤二、筛选模板或构建模板：
a直接筛选模板：根据目的标准DNA片段的大小和两端酶切位点需求，在已知基因组或DNA模板上筛选出合适的目的区域；
b克隆构建模板：
通过序列设计并合成带引物结合位点和酶切位点的短小片段；
通过退火反应形成双端3’-dT尾小片段双链；
将酶切位点小片段通过连接反应构建到固定大小的PCR产物上；
步骤三、扩增获得模板：通过特异性引物，经PCR扩增获得包含酶切位点和中间片段在内的DNA序列；
步骤四、酶切获得标准片段：通过所筛选的限制性内切酶的酶切反应，切开两端酶切位点，获得特定双端的DNA片段；
步骤五、纯化获得标准片段。
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
限制性内切酶选自：能够获得3’-dA尾末端的限制性内切酶，AhdI、BciVI、BmrI、HphI、Hpy188I、HpyAV、HpyCH4III、MboII、MnlI、NmeAIII、XcmI中的任意一种。
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
步骤二中，以pET21质粒为模板基因组，筛选获取扩增模板序列。
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
步骤二中，扩增模板序列如下：5’gtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagaca-3’
其中第1至第22位的碱基和第533到553位的碱基为下一步骤引物设计的区域，第169至第173位的碱基和459至第463位的碱基为酶切位点，第172位至第461位的碱基序列为目的标准品片段序列，为290bp。
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
步骤五中的纯化过程包括去除多余引物、双端酶切残留短片段以及缓冲液。
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
步骤三中，模板的扩增引物为：
引物1：GTGGTGTCGATGGTAGAACGAA
引物2：TGTCTTCGGTATCGTCGTATC
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
步骤四中，利用NEB Hpy188I酶切553bp PCR产物
进一步，本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，还具有这样的特征：
通过DNA磁珠筛选纯化PCR产物，获得干净的标准片段。
发明的有益效果
本发明的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，具有如下有益效果：
1.本发明创造可以制备获得携带特定末端的DNA片段，双端3’-dN尾的标准DNA片段，包括双端3’-dA尾的标准DNA片段或双端平末端片段等；
2.本发明创造可以制备不同片段大小的标准目标片段。
3.本发明所提供的方法成本更低。
4.本发明创造所制备标准片段不经高温、紫外照射等条件，无高温、紫外照射引起的DNA损伤；
5.本发明创造所制备标准片段可用于A/T连接等连接体系的性能评测。
附图说明
图1是使用2100生物分析仪检测连接产物分布的结果图。
具体实施方式
以下对本发明所提供的技术方案做进一步的详细说明。
步骤1，选取限制性内切酶：根据目的标准DNA的双端特性，筛选可产生相应末端的限制性内切酶；制备双端3’-dA尾标准片段，
步骤2，筛选模板或者构建模板：
a直接筛选模板：根据目的标准DNA片段的大小和两端酶切位点需求，在已知基因组或DNA模板上筛选出合适的目的区域；
b克隆构建模板：
通过序列设计并合成带引物结合位点和酶切位点的短小片段；
通过退火反应形成双端3’-dT尾小片段双链；
将酶切位点小片段通过连接反应构建到固定大小的PCR产物上；
步骤3，扩增获得模板：通过特异性引物，经PCR扩增获得包含酶切位点和中间片段在内的DNA序列；
步骤4，酶切获得标准片段：通过所筛选的限制性内切酶的酶切反应，切开两端酶切位点，获得特定双端的DNA片段；
步骤5，纯化获得标准片段：通过DNA磁珠筛选纯化PCR产物，去除多余引物、双端酶切残留短片段、缓冲液等，获得干净的标准片段。
在步骤2中，本实例中选用pET21质粒为模板基因组，筛选获取以下序列为扩增模板：
5’gtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagaca-3’
其中绿色为下一步骤引物设计的区域，黄色和蓝色区域为酶切位点，红色序列为目的标准品片段序列，为290bp。
其中第1至第22位的碱基和第533到553位的碱基为下一步骤引物设计的区域，第169至第173位的碱基和459至第463位的碱基为酶切位点，第172位至第461位的碱基序列为目的标准品片段序列，为290bp。
步骤3中，根据上述序列设计了扩增引物：
引物1：GTGGTGTCGATGGTAGAACGAA
引物2：TGTCTTCGGTATCGTCGTATC
所得PCR产物通过Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠，按试剂说明纯化回收。
步骤4中，酶切获得标准片段：
在本实例中，利用NEB Hpy188I酶切上述553bp PCR产物，按试剂说明设置酶切体系和时间，完成酶切反应；
并通过Hieff NGSTM DNA Selection Beads磁珠，按试剂说明纯化回收。
1、标准片段连接测试：
在本实例中，我们本标准为插入片段，利用T4DNA连接酶，连接NGS接头，并通过2100生物分析仪检测连接产物分布，见图1。
结果显示出了：未连接的标准品：289bp、单端连有接头单体的片段：347bp、双端连有接头单体或单端连有接头二聚体的片段：394bp、双端分别连有接头单体和接头二聚体的片段：位于394bp和534bp中间、双端连有接头二聚体的片段：534bp，五种片段均是单一独立的片段峰，区分度高，无其它杂带影响分析判断，可以有效用于连接效果的分析和评估。
本发明的方法用于制备带有特定末端的双链DNA标准片段，获得用于A/T连接体系评估评测的标准DNA片段。本发明创造可应用于A/T连接等连接体系的评估评测或其它分子克隆技术应用中。
序列表
<110> 翌圣生物科技(上海)有限公司
<120> 一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 553
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtggtgtcga tggtagaacg aagcggcgtc gaagcctgta aagcggcggt gcacaatctt 60
ctcgcgcaac gcgtcagtgg gctgatcatt aactatccgc tggatgacca ggatgccatt 120
gctgtggaag ctgcctgcac taatgttccg gcgttatttc ttgatgtctc tgaccagaca 180
cccatcaaca gtattatttt ctcccatgaa gacggtacgc gactgggcgt ggagcatctg 240
gtcgcattgg gtcaccagca aatcgcgctg ttagcgggcc cattaagttc tgtctcggcg 300
cgtctgcgtc tggctggctg gcataaatat ctcactcgca atcaaattca gccgatagcg 360
gaacgggaag gcgactggag tgccatgtcc ggttttcaac aaaccatgca aatgctgaat 420
gagggcatcg ttcccactgc gatgctggtt gccaacgatc agatggcgct gggcgcaatg 480
cgcgccatta ccgagtccgg gctgcgcgtt ggtgcggata tctcggtagt gggatacgac 540
gataccgaag aca 553
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gtggtgtcga tggtagaacg aa 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgtcttcggt atcgtcgtat c 21

Claims (8)

1.一种制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法,其特征在于，包括：
步骤一、选取限制性内切酶：根据目的标准DNA的双端特性，筛选可产生相应末端的限制性内切酶，
步骤二、筛选模板或构建模板：
a直接筛选模板：根据目的标准DNA片段的大小和两端酶切位点需求，在已知基因组或DNA模板上筛选出合适的目的区域；
b克隆构建模板：
通过序列设计并合成带引物结合位点和酶切位点的短小片段；
通过退火反应形成双端3’-dT尾小片段双链；
将酶切位点小片段通过连接反应构建到固定大小的PCR产物上；
步骤三、扩增获得模板：通过特异性引物，经PCR扩增获得包含酶切位点和中间片段在内的DNA序列；
步骤四、酶切获得标准片段：通过所筛选的限制性内切酶的酶切反应，切开两端酶切位点，获得特定双端的DNA片段；
步骤五、纯化获得标准片段。
2.如权利要求1所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
限制性内切酶选自：能够获得3’-dA尾末端的限制性内切酶，AhdI、BciVI、BmrI、HphI、Hpy188I、HpyAV、HpyCH4III、MboII、MnlI、NmeAIII、XcmI中的任意一种。
3.如权利要求1所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
步骤二中，以pET21质粒为模板基因组，筛选获取扩增模板序列。
4.如权利要求1所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
步骤二中，扩增模板序列如下：5’gtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagaca-3’
其中第1至第22位的碱基和第533到553位的碱基为下一步骤引物设计的区域，第169至第173位的碱基和459至第463位的碱基为酶切位点，第172位至第461位的碱基序列为目的标准品片段序列，为290bp。
5.如权利要求1所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
步骤五中的纯化过程包括去除多余引物、双端酶切残留短片段以及缓冲液。
6.如权利要求4所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
步骤三中，模板的扩增引物为：
引物1：GTGGTGTCGATGGTAGAACGAA
引物2：TGTCTTCGGTATCGTCGTATC。
7.如权利要求3所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
步骤四中，利用NEBHpy188I酶切553bpPCR产物。
8.如权利要求1所述的制备带特定末端的双链DNA标准片段的方法，其特征在于：
通过DNA磁珠筛选纯化PCR产物，获得干净的标准片段。
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