CN107287230A - 一种质粒载体及其构建方法 - Google Patents
一种质粒载体及其构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107287230A CN107287230A CN201710656310.2A CN201710656310A CN107287230A CN 107287230 A CN107287230 A CN 107287230A CN 201710656310 A CN201710656310 A CN 201710656310A CN 107287230 A CN107287230 A CN 107287230A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fragment
- plasmid vector
- plasmid
- ccdb
- template
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 58
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 47
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 101150102092 ccdB gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 75
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 60
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 21
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 21
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 12
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 claims description 4
- 108010025592 aminoadipoyl-cysteinyl-allylglycine Proteins 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 9
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 6
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 2
- 241000305071 Enterobacterales Species 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DUJGMZAICVPCBJ-VDAHYXPESA-N 4-amino-1-[(1r,4r,5s)-4,5-dihydroxy-3-(hydroxymethyl)cyclopent-2-en-1-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1 DUJGMZAICVPCBJ-VDAHYXPESA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 description 1
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 1
- 108090000323 DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000003915 DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000205160 Pyrococcus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。质粒载体为闭合环状的双链DNA，含有两个多克隆位点区，在两个多克隆位点区之间存在一个ccdB 表达框，可在多数大肠杆菌菌株中组成型表达毒性蛋白ccdB，作为负筛选标记。基于质粒载体的多克隆位点的设计，该质粒可用于进行定向TA克隆和改进的无背景粘性末端克隆。另外，本质粒载体还可以直接用于蛋白表达和纯化。各功能均得到验证。本发明所涉及的质粒载体因其更方便和高效，将在基因工程领域发挥重要的作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。
背景技术
分子克隆是研究基因结构和功能的基础，是分子生物学的核心技术。分子克隆方法可分为两类：依赖连接酶的克隆和不依赖连接酶的克隆。其中，依赖连接酶的克隆方法主要有三种，包括：平末端连接、粘性末端连接和TA克隆。近些年，各种不依赖连接酶的克隆策略也得到快速发展，比如：CPEC、FastCloning、Gateway、LIC、OEC、PIPE、SLIC、SLiCE、USER和重组酶克隆等技术（Yao S, Hart DJ, An Y. Recent advances in universal TAcloning methods for use in function studies. Protein Eng Des Sel. 2016; 1-6.）。尽管不依赖连接酶的克隆方法有很多成功的应用实例，但是仍然不能完全取代依赖连接酶的克隆方法。
作为一种依赖连接酶的克隆方法，粘性末端连接方法是目前应用最为广泛的分子克隆方法之一。但在某些情况下，由于无法获取合适的限制性酶切位点，因此为粘性末端克隆带来了不便。另外，由于产生粘性末端的酶切位点都具有回文结构，经酶切后的末端能与其自身互补，所以容易在后续的克隆步骤中产生两个质粒载体之间的连接和环化，从而产生假阳性。而TA克隆方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq聚合酶）的末端转移酶活性，在聚合酶链式反应（PCR）扩增插入片段的过程中在产物的3'端额外加入一个碱基“A”。而TA克隆所使用的T载体的3'端有一个凸出的碱基“T”，刚好可以与上述插入片段的3'末端的碱基“A”互补配对，通过连接可以实现TA克隆。TA克隆是目前克隆PCR产物最快捷、简便的方法之一。该方法无需选择合适的酶切位点，甚至可用于克隆序列未知的DNA片段。目前， T载体的制备方法常见的有两种。一种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用某些内切酶酶切能够产生3'端具有单个凸出的碱基“T”的线性T载体。另一种方法是利用某些DNA聚合酶（如Taq酶）不依赖模板的末端转移酶活性，将单个脱氧胸腺核苷酸（dTTP）添加到线状载体3'端（Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCRproducts. Nucleic Acids Res. 1991;19(5):1154.）。与第二种方法相比，第一种方法更稳定、快捷、高效。另外，第二种方法在制备T载体时，会出现加尾效率较低和加尾过程中线性质粒两端的序列有时会被部分删除等问题（Shuman S. Novel approach to molecularcloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. J BiolChem. 1994 Dec 23;269(51):32678-32684.）。目前TA克隆主要存在的问题是克隆过程中片段可以随机的以正反两个方向插入到T载体中，这就造成了至少有一半的克隆外假阳性，从而增加了筛选的压力。
尽管粘性末端克隆和TA克隆都有很多成功的例子，但是如何有效地解决粘性末端克隆过程中无法获取合适的限制性酶切位点，不利于克隆的顺利进行。另外，由于酶切位点具有回文结构，而导致的两个质粒载体之间的连接和环化，也是一个是亟待解决的问题。另外，实现定向TA克隆，减小后续筛选的工作量，也具有重要的意义，但是目前还没有任何质粒载体能够同时解决上述两个问题。既有克隆功能，又具有表达功能的载体具有显著的优势。但是目前很多载体只适用于克隆，而实现目的基因的表达与纯化则需要亚克隆到表达载体上。因此，既有克隆功能，又具有表达功能的载体具有显著的优势。
现有的质粒载体虽然已经很多，但是普遍存在一些缺点，比如克隆效率不高，特别是过程中经常会出现假阳性，从而增加了后续筛选的压力。这些假阳性可能是由于载体的酶切不够彻底，或者是两个载体之间发生了收尾相连并形成环化。而TA克隆作为一种简易的克隆方法，则存在克隆过程无法定向的问题（即只有一半的克隆的插入片段与载体的连接方式与预期相符）。另外，常用的T载体不能兼具克隆和表达功能。
综上所述，一种不依赖限制性酶切位点、可避免质粒载体之间的连接和环化、同时能够用于实现定向TA克隆，并具有表达和纯化功能的载体具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有广泛的应用前景、兼具定向TA克隆，无背景粘性末端克隆和表达功能的质粒载体及其构建方法。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种可用于定向TA克隆和无背景粘性末端克隆，并具有表达功能的质粒载体，载体包括启动子和终止子，载体为闭合环状双链DNA，含有两个克隆位点区，每个克隆位点区含有一个AhdI位点和一个BsaI位点。两个AhdI位点分别能产生凸出“T”末端并引入AvrII和NcoI识别位点一半序列；而这两个BsaI位点经过酶切后可引入两个互补对称的粘性末端，其3’凸出碱基序列不互补，而且每个粘性末端的3’凸出碱基序列不会自身回文互补，可有效避免粘性末端克隆过程中载体片段的首尾相连，从而实现完全无背景的粘性末端克隆。在两个克隆位点区之间为毒性蛋白标记ccdB 基因。
所述载体还包括卡纳霉素抗性基因序列、pMB1复制子和C末端His-tag编码序列。
所述启动子为T7启动子，终止子为T7终止子。
所述载体为SEQ ID No:1中所示的碱基序列；载体中所示的DNA功能区：特殊设计的克隆位点区的AhdI 位点用于制备T载体，进行TA克隆；BsaI位点用于制备末端随机的粘性末端载体，进行粘性末端克隆； T7 promoter 和T7 terminator 使该质粒具有蛋白表达功能；C末端His-tag区使得表达后的蛋白能被镍柱纯化；ccdB基因序列编码毒性蛋白，作为克隆过程的负筛选标记，确保克隆没有假阳性。
一种可用于定向TA克隆和无背景粘性末端克隆，并具有表达功能的质粒载体的构建方法：
1）以质粒pET3a为模板，PHis-for1和PHis-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1，待用；PHis-for1：5’- AAAAC TGCAG CACCA CCACC ACCAC CACTA AGGCTGCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’ 和PHis-rev1：5’- GTAGT TTATC ACAGT TAAATTGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’；
2）以质粒pET9a为模板，PET9-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2，待用；PET9-for1: 5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATAT CCCTG ACTGCGTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC -3’ 和PET9-rev1: 5’-CAAAG GCCAG CAAAA GGCCAGGAAC CGTAA AAAGG CCGCG TTGCT GGCGT TT-3’；
3）以上述片段1和片段2混合物为模板，PHis-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2，待用；
4）以质粒pET3a为模板，PT7-for2和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段3，待用； PT7-for2：5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTG GTACC AGATC TCGATCCCGC GAAAT TAATA CGAC-3’ 和PT7-rev2：5’-AAAAC TGCAG CATAT GTATA TCTCC TTCTTAAAGT TAAAC AAAAT TATTT CTAGA GGG-3’；
5）以上述片段1+2和片段3混合物为模板，PHis-for1和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2+3，待用；
6）将步骤5）获得PCR产物（即片段1+2+3）经PCR纯化后，同时用PstI单酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶，回收酶切产物；
7）将步骤6）得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接，而后转化大肠杆菌JM109菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-orig。所述连接体系为含175 U T4 DNA连接酶（TaKaRa Co.），1×连接buffer，约30 ng酶切产物（步骤6）得到的片段。
8）以质粒PhisKan5为模板，CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段4，待用； CcdB-For2-middle：5’-GCCTG TCGAC CCTGGGTCTG GAGAC CGGCT TACTA AAAGC CAGAT AACAG TATGC G-3’ 和CcdB-Rev2-middle：5’-CCAGG CCTGA CCATA GGTCG ACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATA AGGGA GCCTG AC-3’；
9）以步骤8）所获得的片段4为模板，CcdB-For2和CcdB-Rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段5，待用； CcdB-For2：5’-CGCGC ATATG ACTAG TAGGC CTGTC GACCCTGGGT CTGGA GACCG GC-3’ 和CcdB-Rev2：5’-CATCT GCAGG AGCTC GGATC CAGGC CTGACCATAG GTCGA CGAGA GACCG ACTGG C-3’；
10）将步骤9）获得PCR产物（即片段5）和步骤7）获得pANY-orig同时用PstI和NdeI进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶,回收酶切产物；
11）将步骤10）得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接，而后转化大肠杆菌DB3.1菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY2。所述连接体系为含175 U T4 DNA连接酶（TaKaRa Co.），1×连接buffer，约30 ng酶切产物（步骤10）得到的两个片段。
与现有的克隆和表达质粒相比，本发明pANY2具有以下显著优势：
1）不同于以往的T载体，本发明制备的T载体可以实现定向TA克隆。由于质粒载体中AhdI位点的独特设计，使得酶切后在载体片段两端各引入一个3’凸出一个“T”碱基的同时，分别引入一半的AvrII和NcoI识别位点。在插入片段的末端设计另外一半的AvrII和NcoI识别位点，这样TA克隆过程中反向连接的产物将同时具有完整的AvrII和NcoI识别位点，这样可以通过酶切的方式剔除反向连接产物，从而实现定向TA克隆。
2）与常规粘性末端克隆载体不同的是，本克隆载体可以实现完全无背景的粘性末端克隆。 本载体通过BsaI酶切可引入两个粘性末端，其3’凸出碱基序列不互补，而且每个粘性末端的3’凸出碱基序列自身也不回文互补，这样可有效避免粘性末端克隆过程中载体片段的首尾相连，从而实现完全无背景的粘性末端克隆。
3）通常情况下，在载体的制备过程中，质粒由于酶切不够彻底等原因，会导致非重组转化子的本底过高，产生假阳性。而在制备载体的过程中，虽然可以通过电泳和胶回收的方法帮助去除这些未经酶切的质粒，这样不仅增加了工作量，而且效果往往不够理想。而pANY2在两个克隆位点间隔区引入了毒蛋白基因ccdB，作为负筛选标记。这样，在载体制备过程中不需要胶回收等复杂步骤，就可以彻底清除前载体污染，实现零背景克隆。
4）通常情况下，大片段的克隆效率较低。而pANY2的载体部分小于2 kb，远远小于目前常见的质粒载体，使得该载体在克隆的过程中效率显著优于现在的大部分克隆载体。
5）本质粒载体既有克隆功能，又具有表达功能，这样克隆后得到的重组质粒不需要进行亚克隆就能实现表达，因此具有一定的优势。另外，该质粒载体具有C末端组氨酸标签His-tag，因此既可以对克隆的片段进行表达，又可以方便地进行蛋白质纯化。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pANY2 质粒图谱。其中T7promotor：T7启动子；T7terminator：T7终止子；Histag：组氨酸尾巴；Kana：卡那霉素抗性蛋白；pMB1 replicon：大肠杆菌pMB1型复制子；rbs：核糖体结合位点；ccdB：编码ccdB毒蛋白的基因序列，ccdB蛋白通过干扰大肠杆菌的DNA促旋酶，抑制大多数大肠杆菌（如JM109、DH5α、BL21等）的生长增殖，但是不抑制特殊大肠杆菌菌株（如DB3.1）的生长繁殖；AhdI：AhdI酶切位点；BsaI：BsaI酶切位点。
图2为本发明实施例提供的pANY2 的BsaI酶切电泳图（M：DNA ladder；1：pANY2酶切）。
图3为本发明实施例提供的pANY2的AhdI酶切电泳图（M：DNA ladder；1：pANY2酶切）。
图4为本发明实施例提供的定向TA克隆的过程示意图。质粒pANY2的多克隆位点区含有两个AhdI，经过AhdI酶切后，在载体末端引入3’-T的同时还产生AvrII 和 NcoI一半的识别序列；而用于PCR扩增插入片段的引物序列中则含有AvrII 和 NcoI的另外一半识别序列。如果连接方向与预期相反，则会产生新的AvrII 和 NcoI酶切位点；而连接方向与预期相符时，则不会产生新的AvrII 和 NcoI酶切位点。这样，就可以通过AvrII 或 NcoI酶切，剔除反向连接的克隆，从而达到定向TA克隆。
图5为本发明实施例提供的pANY2-TA-pfLamA双酶切（NdeI和PstI双酶切）电泳图（M：DNA ladder；1：pANY2-TA-pfLamA双酶切）。
图6为本发明实施例提供的pANY2-TA-pfLamA物理图谱，其中pMB1 replicon：大肠杆菌pMB1型复制子；rbs：核糖体结合位点；T7promotor：T7启动子；T7 terminator：T7终止子； Kana：卡那霉素抗性蛋白； Histag：组氨酸尾巴；pfLamA（+）：正向连接的编码凝结多糖水解酶基因序列。
图7为本发明实施例提供的无背景粘性末端克隆的过程示意图。a. 质粒pANY2的多克隆位点区含有两个BsaI，经过BsaI酶切后，在线性载体的两侧引入可任意设计的粘性末端；而用于PCR扩增插入片段的引物序列中也含有BsaI识别位点，可以通过BsaI产生可任意设计的粘性末端。由于插入片段和载体的粘性末端完全互补，所以通过连接可将插入片段连入载体中。在连接过程中加入BsaI酶进行酶切，可以避免原始质粒的污染。b. 由于可任意设计的粘性末端不是回文结构，所以可以有效的避免载体自身环化或者两个载体之间收尾互连，从而实现无背景粘性末端克隆。
图8为本发明实施例提供的pANY2-sticky-pfLamA双酶切（NdeI和PstI双酶切）电泳图 （M：DNA ladder；1-4：pfLamA双酶切）。
图9为本发明实施例提供的pANY2-sticky-pfLamA物理图谱，其中pMB1 replicon：大肠杆菌pMB1型复制子；rbs：核糖体结合位点；T7promotor：T7启动子；T7 terminator：T7终止子； Kana：卡那霉素抗性蛋白； Histag：组氨酸尾巴；pfLamA：编码凝结多糖水解酶基因序列。
图10为SDS-PAGE电泳检测蛋白表达水平和纯化效率图。M：protein ladder；1：含pANY2空质粒的菌的粗提液；2：含pANY2空质粒菌裂解液的纯化；3：含pET11-pfLamA质粒菌的粗提液；4：含pET11-pfLamA质粒菌裂解液的纯化；5：含pANY2-TA-pfLamA质粒菌的粗提液；6：含pANY2-TA-pfLamA质粒菌裂解液的纯化；7：含pANY2-sticky-pfLamA质粒菌的粗提液；8：含pANY2-sticky-pfLamA质粒菌裂解液的纯化。
图11为刚果红法检测pANY2表达pfLamA的酶活性图；1：含pANY2质粒的菌株表达的蛋白经镍柱纯化产物；2：含有pET11-pfLamA的菌株表达的蛋白经镍柱纯化产物；:3：含有pANY2-TA-pfLamA的菌株表达的蛋白经镍柱纯化产物；4：含有pANY2-sticky-pfLamA的菌株表达的蛋白经镍柱纯化产物。
图12为DNS法测定pANY2表达pfLamA的酶活性图，1：凝结多糖空白对照；2：含有pANY2空质粒的菌表达的蛋白分解凝结多糖；3：含有pET11-pfLamA的菌表达的蛋白分解凝结多糖；4：含有pANY2-TA-pfLamA的菌表达的蛋白分解凝结多糖；5：含有pANY2-sticky-pfLamA的菌表达的蛋白分解凝结多糖。
具体实施方式
下面结合说明书附图对本发明作进一步的解释说明。质粒载体为闭合环状的双链DNA，含有两个多克隆位点区，在两个多克隆位点区之间存在一个ccdB 表达框，可在多数大肠杆菌菌株中组成型表达毒性蛋白ccdB，作为负筛选标记。基于质粒载体的多克隆位点的设计，该质粒可用于进行定向TA克隆和改进的无背景粘性末端克隆。另外，本质粒载体还可以直接用于蛋白表达和纯化。各功能均得到验证。本发明所涉及的质粒载体因其更方便和高效，将在基因工程领域发挥重要的作用。
本发明构建新型的质粒，同时兼具以下优势与特点：1）将AvrII 和NcoI酶切位点的部分序列设计到质粒的AhdI和插入片段的引物中，这样TA克隆后可通过AvrII 和NcoI酶切将连接方向与预期相反的克隆删除，从而实现定向TA克隆；2）本质粒通过两种策略实现无背景粘末端克隆：质粒的多克隆位点之间插入了ccdB毒蛋白编码基因，可以避免由于载体酶切不彻底造成的假阳性；通过BsaI 在载体和插入片段中分别引入非回文结构的DNA序列，克隆过程中，载体和插入片段粘性末端互补配对的同时，载体不能发生分子内或分子间自连；3）该质粒既具有无背景定向基因克隆的功能，又能通过IPTG诱导实现蛋白蛋白表达。同时由于质粒上具有组氨酸标签，所以还能利用镍柱对表达的蛋白进行纯化。在应用实例中，本发明质粒载体在定向TA克隆、无背景粘性末端克隆、蛋白表达和纯化方面的功能得到了验证。本发明质粒载体既可以同时应用两种常用的克隆策略，而且可高效、方便地进行蛋白表达和纯化，从而节省了亚克隆步骤，因此本发明质粒载体因其高效、便捷，预期将在生物科学的各个领域发挥重要的作用。
实施例1:质粒载体pANY2的获得
1）以质粒pET3a为模板，PHis-for1和PHis-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1，待用； PHis-for1：5’- AAAAC TGCAG CACCA CCACC ACCAC CACTA AGGCTGCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’ 和PHis-rev1：5’- GTAGT TTATC ACAGT TAAATTGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’。PCR扩增的反应体系为：20µl反应体系中含10 x Pfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 U Pfu酶，0.2 mmol/LdNTPs，模板2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s； 72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。
2）以质粒pET9a为模板，PET9-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2，待用；PET9-for1: 5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATAT CCCTG ACTGCGTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC -3’ 和PET9-rev1: 5’-CAAAG GCCAG CAAAA GGCCAGGAAC CGTAA AAAGG CCGCG TTGCT GGCGT TT-3’；PCR扩增的反应体系为：20 µl反应体系中含10 x Pfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 U Pfu酶，0.2 mmol/L dNTPs，模板2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s； 72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。
3）以上述片段1和片段2混合物为模板，PHis-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2，待用；PCR扩增的反应体系为：20 µl反应体系中含10 xPfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 U Pfu酶，0.2 mmol/L dNTPs，模板各2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s；72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。
4）以质粒pET3a为模板，PT7-for2和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段3，待用； PT7-for2：5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTG GTACC AGATCTCGAT CCCGC GAAAT TAATA CGAC-3’ 和PT7-rev2：5’-AAAAC TGCAG CATAT GTATA TCTCCTTCTT AAAGT TAAAC AAAAT TATTT CTAGA GGG-3’； PCR扩增的反应体系为：20 µl反应体系中含10 x Pfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 U Pfu酶，0.2 mmol/L dNTPs，模板2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s； 72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。
5）以上述片段1+2和片段3混合物为模板，PHis-for1和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2+3，待用；PCR扩增的反应体系为：20 µl反应体系中含10 x Pfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 U Pfu酶，0.2 mmol/L dNTPs，模板各2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s； 72℃，4 min）×25，72℃最后延伸10 min。
6）将步骤5）获得PCR产物（即片段1+2+3）经PCR纯化后，同时用PstI单酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶,回收酶切产物。
7）将步骤6）得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接，而后转化大肠杆菌JM109菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-orig。
8）以质粒PhisKan5为模板，CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段4，待用； CcdB-For2-middle：5’-GCCTG TCGAC CCTGGGTCTG GAGAC CGGCT TACTA AAAGC CAGAT AACAG TATGC G-3’ 和CcdB-Rev2-middle：5’-CCAGG CCTGA CCATA GGTCG ACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATA AGGGA GCCTG AC-3’； PCR扩增的反应体系为：20 µl反应体系中含10 x Pfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 UPfu酶，0.2 mmol/L dNTPs，模板2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s； 72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。
9）以步骤8）所获得的片段4为模板，CcdB-For2和CcdB-Rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段5，待用； CcdB-For2：5’-CGCGC ATATG ACTAG TAGGC CTGTCGACCC TGGGT CTGGA GACCG GC-3’ 和CcdB-Rev2：5’-CATCT GCAGG AGCTC GGATC CAGGCCTGAC CATAG GTCGA CGAGA GACCG ACTGG C-3’； PCR扩增的反应体系为：20 µl反应体系中含10 x Pfu buffer 2 µl，引物各10 µmol/L，2 U Pfu酶，0.2 mmol/L dNTPs，模板2 ng左右，以灭菌的去离子水补齐；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s； 63℃，30 s； 72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。
10）将步骤9）获得PCR产物（即片段5）和步骤7）获得pANY-orig同时用PstI和NdeI进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶,回收酶切产物；
11）将步骤10）得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接。20µl连接体系为含175 U T4 DNA连接酶（TaKaRa Co.），1×连接buffer（TaKaRa Co.），约30 ng酶切产物（步骤3）片段）。而后转化大肠杆菌DB3.1菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY2。经Kana抗性和双酶切（NdeI和PstI）验证筛选得到阳性菌落，阳性菌落液体培养后提取质粒，经测序鉴定正确后命名为pANY2。该质粒具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。
SEQ ID No:1 pANY2(2664bp)：
caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagacgacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctggagaccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcagcgtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaatatctccggtctggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggaaagcggaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgctgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagccagtcggtctctcgtcgacctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag
实施例2:上述实例获得pANY2用于定向TA克隆的功能验证
采用pANY2进行定向TA克隆的过程和原理如图4所示。质粒pANY2的多克隆位点区含有两个AhdI，经过AhdI酶切后，在载体末端引入3’-T的同时还产生AvrII 和 NcoI一半的识别序列；而用于PCR扩增插入片段的引物序列中则含有AvrII 和 NcoI的另外一半识别序列。如果连接方向与预期相反，则会产生新的AvrII 和 NcoI酶切位点；而连接方向与预期相符时，则不会产生新的AvrII 和 NcoI酶切位点。这样，就可以通过AvrII 或 NcoI酶切，剔除反向连接的克隆，从而达到定向TA克隆的目标。
具体的克隆的步骤如下：
1）用AhdI酶切上述获得质粒pANY2，酶切反应体系如下：120 µl酶切体系中包含10 UAhdI内切酶（NEB公司），1× buffer， 4 µg pANY2质粒DNA。37℃酶切6小时后，经过酶切后的大片段即是T载体，命名为pANY2-T，不需胶回收。
2）以质粒pET9d-pfLamA（Ilari A, Fiorillo A, Angelaccio S, Florio R,Chiaraluce R, van der Oost J, Consalvi V. Crystal structure of a family 16endoglucanase from the hyperthermophile Pyrococcus furiosus--structural basisof substrate recognition. FEBS J. 2009;276(4):1048-1058.）为模板，用pfLamA-For-AhdI（GGCAT GGTCC CTGAA GTGAT AGAAA TAGAT GGAAA ACAG）和pfLamA-Rev-AhdI（AGGACCACTA ACGAA TGAGT AAACC CTTAC ATAAT CC）引物进行PCR。PCR反应体系如下：20 µl反应体系中含10×PCR Buffer（TaKaRa Co.）2µl，2 U Taq酶，引物各10 µmol/L，模板1 ng，0.2mmol/L dNTPs，以灭菌的去离子水补齐；PCR的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s；63℃，30 s；72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。
3）将上述步骤2得到的片段与pANY2-T（即T载体）进行连接，连接体系为：20 µl连接体系中含175 U T4DNA连接酶（TaKaRa Co.），1 ×连接buffer，5 U AvrII，5 U NcoI，30ng PCR和酶切产物。37℃反应2小时。
将连接产物按照常规方法转化大肠杆菌JM109菌株后，挑取经Kana抗性筛选得到的菌落，液体培养，提取质粒进行NdeI和PstI双酶切验证（电泳图如图5所示）。随机取阳性克隆提取质粒，进行测序鉴定，将测序鉴定TA连接成功的质粒命名为pANY2-TA-pfLamA（物理图谱如图6所示），该质粒具有序列表中序列2核苷酸序列。随机测序的结果表明，所有的阳性克隆均为正向连接，而且没有假阳性克隆出现。所以，pANY2可以有效的进行T载体制备，并且用于定向TA克隆。
SEQ ID No:2 pANY2-TA-pfLamA (2769bp)：
caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagacgacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgactagtaggcctgtcgaccctggcatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtggagacttatttggcacgatgagtttgaaggttccgaagtaaataaagaatactggacatttgagaagggaaatggaatagcttatggaatcccgggatgggggaatggagagcttgaatactacacggaaaacaacacctatattgtaaatggcacccttgtcattgaggccagaaaagaaataattactgatcctaacgaaggaacgtttctctacacttcatcaagacttaagactgaaggtaaggtagaatttagccctccagtagttgttgaggctagaataaagcttccaaaaggtaaaggtttatggcctgcattctggatgttggggagcaacataagggaagtaggctggccaaattgtggagaaatagacataatggagttccttggccatgagccacggacaattcacggaactgttcatggcccaggttactcgggaagtaaaggaattactagggcctatacactccctgaaggtgttccagactttacagaagacttccatgtatttggaatagtttggtatccggataaaataaagtggtacgttgatggaactttttatcatgaggttacaaaagaacaagtggaggctatgggctatgagtgggtcttcgataagcccttctatataatccttaatcttgcagtgggtggttattggccaggaaaccccgatgctacaactccatttccagcaaagatggtggtggattatgtaagggtttactcattcgttagtggtcctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag
实施例3:对上述实例获得pANY2用于无背景粘性末端克隆的功能验证
采用pANY2进行无背景粘性末端克隆的过程和原理如图7-a所示。质粒pANY2的多克隆位点区含有两个BsaI，经过BsaI酶切后，在线性载体的两侧引入可任意设计的粘性末端；而用于PCR扩增插入片段的引物序列中也含有BsaI识别位点，可以通过BsaI产生可任意设计的粘性末端。由于插入片段和载体的粘性末端完全互补，所以通过连接可将插入片段连入载体中。在连接过程中加入BsaI酶进行酶切，可以避免原始质粒的污染。如图7-b所示，由于可任意设计的粘性末端不是回文结构，所以可以有效的避免载体自身环化或者两个载体之间首尾互连，从而实现无背景粘性末端克隆。
其克隆过程的具体步骤为：
1）用BsaI酶切上述获得质粒pANY2，酶切反应体系如下：120 µl酶切体系中包含10 UBsaI内切酶（NEB公司），1× buffer， 4 µg pANY2质粒DNA。37℃酶切1小时后，经过酶切后的大片段即是粘性末端载体，不需胶回收。
2）以质粒pET9d-pfLamA为模板，用pfLamA-For-BsaI（GATCG GTCTC GGTCT ATGGTCCCTG AAGTG ATAGA AATAG ATGGA AAACA G）和pfLamA-Rev-BsaI（GTACG GTCTC TGACGACCAC TAACG AATGA GTAAA CCCTT ACATA ATCC）引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：20 µl反应体系中含10×PCR Buffer（TaKaRa Co.）2µl，2 U Taq酶，引物各10 µmol/L，模板1ng，0.2 mmol/L dNTPs，以灭菌的去离子水补齐；PCR的循环程序为：94℃预变性3 min，（94℃，30 s；63℃，30 s；72℃，2 min）×25，72℃最后延伸10 min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。
3）将上述步骤2得到的片段与步骤1得到的粘性末端载体进行连接，连接体系为：20 µl连接体系中含175 U T4DNA连接酶（TaKaRa Co.），1 ×连接buffer， 30 ng PCR和酶切产物。室温连接16小时。将连接产物按照常规方法转化大肠杆菌JM109菌株后，挑取经Kana抗性筛选得到的菌落，液体培养，提取质粒进行NdeI和PstI双酶切验证（电泳图如图8所示）。随机取阳性克隆提取质粒，进行测序鉴定，将测序鉴定连接成功的质粒命名为pANY2-sticky-pfLamA（物理图谱如图9所示），该质粒具有序列表中序列3核苷酸序列。随机测序的结果表明，所有的阳性克隆均为阳性克隆，而且没有假阳性克隆出现。所以，pANY2可以有效的进行无背景的粘性末端克隆。
SEQ ID No:3 pANY2-sticky-pfLamA (2778bp)：
caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagacgacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtggagacttatttggcacgatgagtttgaaggttccgaagtaaataaagaatactggacatttgagaagggaaatggaatagcttatggaatcccgggatgggggaatggagagcttgaatactacacggaaaacaacacctatattgtaaatggcacccttgtcattgaggccagaaaagaaataattactgatcctaacgaaggaacgtttctctacacttcatcaagacttaagactgaaggtaaggtagaatttagccctccagtagttgttgaggctagaataaagcttccaaaaggtaaaggtttatggcctgcattctggatgttggggagcaacataagggaagtaggctggccaaattgtggagaaatagacataatggagttccttggccatgagccacggacaattcacggaactgttcatggcccaggttactcgggaagtaaaggaattactagggcctatacactccctgaaggtgttccagactttacagaagacttccatgtatttggaatagtttggtatccggataaaataaagtggtacgttgatggaactttttatcatgaggttacaaaagaacaagtggaggctatgggctatgagtgggtcttcgataagcccttctatataatccttaatcttgcagtgggtggttattggccaggaaaccccgatgctacaactccatttccagcaaagatggtggtggattatgtaagggtttactcattcgttagtggtcgtcgacctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag
实施例4:pANY2用于蛋白表达和纯化的功能验证
1）将上述实施例2和3中所获得的pANY2-TA-pfLamA和pANY2-sticky-pfLamA转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，进行IPTG诱导表达，提取凝结多糖水解酶pfLamA的粗酶液。作为对照，将质粒pET11-pfLamA（pfLamA克隆于通用载体pET11）转化大肠杆菌BL21（DE3）并将空质粒pANY2转化大肠杆菌DB3.1，同样进行IPTG诱导表达和粗提液的提取。
2）将含有步骤1）中所述的转化四种质粒的大肠杆菌工程菌用TB培养基培养，用IPTG诱导表达，并用HIS GraviTrap Ni-NTA蛋白纯化试剂盒（上海超研生物科技有限公司）进行纯化。纯化产物进行SDS-PAGE电泳分析（如图10所示）。结果表明，在蛋白表达水平和蛋白纯化效率方面，pANY2与pET11相似，甚至优于pET11。值得注意的是，不同多克隆位点的选择对蛋白表达量影响非常显著。
3）将步骤2）获得的四份纯化后蛋白取10 µl 点在含有1％凝结多糖的LB平板上，刚果红染色后观察透明圈的产生情况，如图11所示。结果表明，pANY2可以有效的进行蛋白质表达，表达后的酶pfLamA能使得平板产生明显透明圈。
4）将步骤2）得到的四份纯化的蛋白以凝结多糖为底物进行反应，反应过程如下列方程所示：
通过DNS法测定酶催化反应的结果，如图12所示。结果进一步表明，pANY2可以有效的进行蛋白质表达和纯化，纯化后的酶pfLamA能使得凝结多糖产生明显的颜色变化。
Claims (8)
1.一种质粒载体，其特征在于：质粒载体为闭合环状双链DNA，含有两个BsaI酶切位点（5’-GGTCTCN↓NNNNN-3’）、粘性末端；含有两个特定序列的AhdI酶切位点、一半的AvrII和NcoI识别位点序列，克隆位点之间含有一个ccdB 表达框。
2.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述载体还包括卡那霉素抗性基因序列、pMB1复制子和C末端His-tag编码序列。
3.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述载体启动子为T7启动子，终止子为T7终止子。
4.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述两个克隆位点区各含有一个AhdI位点，通过AhdI酶切可在载体片段两端各引入一个3’凸出单个“T”碱基，形成T载体。
5.按权利要求1所述的质粒载体，其特征在于：所述两个克隆位点区各含有一个BsaI位点，通过BsaI酶切可引入两个粘性末端，其3’凸出碱基序列不互补，而且每个粘性末端的3’凸出碱基序列自身无法回文互补。
6.按权利要求1-5任意一项所述的质粒载体，其特征在于：所述载体为SEQ ID No:1中所示的碱基序列。
7.一种权利要求1所述的质粒载体的构建方法，其特征在于：
1）以质粒pET3a为模板，PHis-for1和PHis-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1，待用； PHis-for1：5’- AAAAC TGCAG CACCA CCACC ACCAC CACTA AGGCTGCTAA CAAAG CCCGA AAGGA AGCTG-3’ 和PHis-rev1：5’- GTAGT TTATC ACAGT TAAATTGCTA ACGCA GTCAG GGATA TCCGG ATATA GTTCC TCCTT TC-3’；
2）以质粒pET9a为模板，PET9-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段2，待用；PET9-for1: 5’-GAAAG GAGGA ACTAT ATCCG GATAT CCCTG ACTGCGTTAG CAATT TAACT GTGAT AAACT AC -3’ 和PET9-rev1: 5’-CAAAG GCCAG CAAAA GGCCAGGAAC CGTAA AAAGG CCGCG TTGCT GGCGT TT-3’；
3）以上述片段1和片段2混合物为模板，PHis-for1和PET9-rev1为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2，待用；
4）以质粒pET3a为模板，PT7-for2和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段3，待用； PT7-for2：5’-GTTCC TGGCC TTTTG CTGGC CTTTG GTACC AGATC TCGATCCCGC GAAAT TAATA CGAC-3’ 和PT7-rev2：5’-AAAAC TGCAG CATAT GTATA TCTCC TTCTTAAAGT TAAAC AAAAT TATTT CTAGA GGG-3’；
5）以上述片段1+2和片段3混合物为模板，PHis-for1和PT7-rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段1+2+3，待用；
6）将步骤5）获得PCR产物（即片段1+2+3）经PCR纯化后，同时用PstI单酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶，回收酶切产物；
7）将步骤6）得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接，而后转化大肠杆菌JM109菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY-orig；
8）以质粒PhisKan5为模板，CcdB-For2-middle和CcdB-Rev2-middle为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段4，待用； CcdB-For2-middle：5’-GCCTG TCGAC CCTGG GTCTGGAGAC CGGCT TACTA AAAGC CAGAT AACAG TATGC G-3’和CcdB-Rev2-middle：5’-CCAGGCCTGA CCATA GGTCG ACGAG AGACC GACTG GCTGT GTATA AGGGA GCCTG AC-3’；
9）以步骤8）所获得的片段4为模板，CcdB-For2和CcdB-Rev2为上下游引物进行PCR扩增，扩增产物命名为片段5，待用；CcdB-For2：5’-CGCGC ATATG ACTAG TAGGC CTGTC GACCCTGGGT CTGGA GACCG GC-3’ 和CcdB-Rev2：5’-CATCT GCAGG AGCTC GGATC CAGGC CTGACCATAG GTCGA CGAGA GACCG ACTGG C-3’；
10）将步骤9）获得PCR产物（即片段5）和步骤7）获得pANY-orig同时用PstI和NdeI进行双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳后切胶，回收酶切产物；
11）将步骤10）得到的酶切后的片段于连接体系内在室温下进行连接，而后转化大肠杆菌DB3.1菌株，再经抗性筛选即得质粒载体pANY2。
8.按权利要求7所述的质粒载体的构建方法，其特征在于：所述连接体系为含175 U T4DNA连接酶（TaKaRa Co.），1×连接buffer，约30 ng酶切产物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710656310.2A CN107287230B (zh) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 一种质粒载体及其构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710656310.2A CN107287230B (zh) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 一种质粒载体及其构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107287230A true CN107287230A (zh) | 2017-10-24 |
| CN107287230B CN107287230B (zh) | 2020-10-13 |
Family
ID=60105429
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710656310.2A Expired - Fee Related CN107287230B (zh) | 2017-08-03 | 2017-08-03 | 一种质粒载体及其构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107287230B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108359678A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-08-03 | 沈阳农业大学 | 一种能高效克隆和温度诱导表达的质粒载体及其构建方法 |
| CN108588102A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-09-28 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种前t载体及其组成的t载体和应用 |
| CN109355280A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-19 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 一种制备带特定末端的双链dna标准片段的方法 |
| CN112852856A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-05-28 | 沈阳农业大学 | 一种基于ELP-Intein和ccdB的高效质粒载体及其使用方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942478A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-12 | 上海交通大学 | 用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法 |
| CN105821073A (zh) * | 2015-01-27 | 2016-08-03 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法 |
-
2017
- 2017-08-03 CN CN201710656310.2A patent/CN107287230B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942478A (zh) * | 2010-08-31 | 2011-01-12 | 上海交通大学 | 用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法 |
| CN105821073A (zh) * | 2015-01-27 | 2016-08-03 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种通过基因瞬时表达对整株植物定点改造的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| NATSUKO GODA ET AL: "The PRESAT-vector: Asymmetric T-vector for high-throughput screening of soluble protein domains for structural proteomics", 《PROTEIN SCIENCE》 * |
| 叶纪诚等: "《生物化学与分子生物学》", 30 April 2014 * |
| 朱睦元等: "《现代遗传学实验》", 31 May 2009 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108588102A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-09-28 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种前t载体及其组成的t载体和应用 |
| CN108588102B (zh) * | 2017-12-29 | 2021-10-08 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种前t载体及其组成的t载体和应用 |
| CN108359678A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-08-03 | 沈阳农业大学 | 一种能高效克隆和温度诱导表达的质粒载体及其构建方法 |
| CN109355280A (zh) * | 2018-10-18 | 2019-02-19 | 翌圣生物科技（上海）有限公司 | 一种制备带特定末端的双链dna标准片段的方法 |
| CN112852856A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-05-28 | 沈阳农业大学 | 一种基于ELP-Intein和ccdB的高效质粒载体及其使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107287230B (zh) | 2020-10-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107287230A (zh) | 一种质粒载体及其构建方法 | |
| CN107257854B (zh) | 聚合酶变体 | |
| AU2011220536B2 (en) | Modified proteins and methods of making and using same | |
| US20080176293A1 (en) | RNA-Dependent RNA Polymerase, Methods And Kits For The Amplification And/Or Labelling Of RNA | |
| CN105283558A (zh) | 使用热稳定的TthPrimPol扩增和测序的方法 | |
| SG194826A1 (en) | Transcription terminator sequences | |
| US20190330602A1 (en) | DNA polymerase variant and application thereof | |
| JP2003510052A (ja) | 改良されたポリヌクレオチド合成のための方法と組成物 | |
| CN111819188A (zh) | 融合单链DNA聚合酶Bst、编码融合DNA聚合酶NeqSSB-Bst的核酸分子、其制备方法和用途 | |
| KR101600902B1 (ko) | 코돈 조합화 및 변이유발을 이용한 유전자 라이브러리의 합성 방법 | |
| CN105176946A (zh) | 一种尿嘧啶dna糖苷酶、制备方法及其应用 | |
| CN108359678A (zh) | 一种能高效克隆和温度诱导表达的质粒载体及其构建方法 | |
| CN114561374A (zh) | 一种新型嗜热核酸内切酶突变体及其制备方法和应用 | |
| US5834253A (en) | Bacillus stearothermophilus DNA polymerase with proof-reading 3'-5' exonuclease activity | |
| CN109504748A (zh) | 一种提高RAA技术在SNPs检测中特异性的方法 | |
| CN107254483A (zh) | 一种用于多种克隆策略并具有表达功能的质粒载体及其构建方法 | |
| WO2014205882A1 (zh) | 一种高保真dna聚合酶及其制备和应用 | |
| CN116397015A (zh) | 一种单核苷酸精度的全长tRNA高通量测序方法 | |
| Liu et al. | A universal mini-vector and an annealing of PCR products (APP)-based cloning strategy for convenient molecular biological manipulations | |
| CN104130984A (zh) | 作用于杂色曲菌素的黄曲霉毒素氧化酶 | |
| CN114829593B (zh) | 嵌合dna聚合酶及其应用 | |
| CN103205449B (zh) | 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法 | |
| CN101503698A (zh) | 一种无假阳性t载体及制备方法 | |
| CN113817803A (zh) | 一种携带修饰的小rna的建库方法及其应用 | |
| US20230257803A1 (en) | Strand displacing amplification enzymes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201013 |