CN107058573B - 一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法。该构建方法包括以下步骤：S1，使用多重PCR技术扩增多个目标区域，得到扩增子；S2，采用Cas9/gRNA系统特异性切除所有扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体；S3，对扩增子的5’端进行磷酸化修饰，3’端添加“A”，采用连接酶将测序接头分别连接到扩增子的5’端和3’端，磁珠纯化后得到扩增子文库。使用Cas9/gRNA系统消化第1轮反应后的扩增子，能有效去除第1轮反应过程中产生的引物二聚体，提高文库的纯度，增强测序信号的信噪比，同时还可以提高测序数据的均一性，降低文库测序的数据量，降低扩增子文库构建的成本。

Description

一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的方法
技术领域
本发明属于高通量测序领域，具体而言，本发明涉及一种构建扩增子文库的方法。
背景技术
多重PCR靶向捕获测序技术是指，利用多重PCR技术同时对基因组DNA上的多个目标区域进行扩增，得到扩增子，然后通过酶连接或者通过PCR方式将二代测序接头添加到扩增子序列的两侧，得到扩增子文库，之后进行二代测序，获取目标区域的序列信息。多重PCR靶向捕获技术与液相杂交捕获测序技术相比，具有以下优势：1.灵敏度高、特异性强、文库构建所需样本量低；2.文库构建周期短，一次文库构建的通量高，文库构建的成本低；3.测序深度高，适合对热点区域进行测序分析。基于以上优势，多重PCR靶向捕获测序技术已受到诸多测序公司的重视，基于该技术开发出的测序产品在测序市场上广受欢迎和好评，并且需求量逐年上升。因此，多重PCR靶向捕获技术已经成为靶向测序技术中的重要一员，在推进全民享受低成本，高质量的靶向测序服务的道路上，发挥着越来越重要的作用。
尽管多重PCR靶向捕获测序技术的优势明显，但是该技术仍然存在一些不足，这严重制约了该技术的应用。在利用多重PCR技术进行靶向捕获测序时，获取的数据通常捕获率低、覆盖率低、均一性差，难以满足客户的要求。究其原因，主要是多重PCR反应过程中会产生大量的引物二聚体。引物二聚体不但会直接与目标区域的扩增子竞争引物和DNA聚合酶，同时还会加速底物的消耗，从而严重抑制目标区域的扩增。此外，引物二聚体由于片段小，比扩增子更有利于扩增，因此在测序时，引物二聚体更易发生桥式PCR反应成簇，导致测序数据中含有大量无效数据，增加测序的成本。这些问题随着多重捕获区域数目的增多而加剧，已经成为多重PCR靶向捕获测序应用道路上的拦路虎。
因此，本领域需要改进的多重PCR技术用于靶向捕获测序。
发明内容
为了克服现有技术中存在的问题，本发明提供了一种构建扩增子文库的方法，该方法能够有效去除文库构建过程中产生的引物二聚体，提高测序数据的捕获率，覆盖率和均一性。
因此，在第一方面中，本发明提供了一种构建扩增子文库方法，包括以下步骤：
S1：采用多重PCR引物对多个目标区域进行扩增，得到多个扩增子；
S2：采用Cas9/gRNA系统对所述扩增子进行消化，特异性识别和切割扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体；
S3：依次对所述扩增子进行5’端磷酸化修饰，3’端添加“A”，然后用连接酶将测序接头例如P5和P7连接到扩增子的5’端和3’端；
S4：将所述连接后的扩增子磁珠纯化后，得到扩增子文库，然后进行二代测序。
在优选的实施方案中，在所述方法的步骤S1中，所述多重PCR引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重PCR引物的5’端为通用序列。
在优选的实施方案中，在所述方法的步骤S1中，采用多重PCR引物对多个目标区域进行扩增，所述多重PCR引物的3’端是与目标区域互补配对的特异性序列，5’端是一段长度在23nt 以上的通用序列，其3’端的最后三个碱基通常为NGG。NGG序列前面的20碱基序列与Cas9/gRNA系统中gRNA 5’端的20碱基序列相同。
在优选的实施方案中，在所述方法的步骤S1和步骤S2之间，采用磁珠对多重PCR扩增产物进行纯化，去除引物，DNA聚合酶，dNTP等物质，得到高纯度的扩增子和引物二聚体。
在优选的实施方案中，在所述方法的步骤S2中，采用Cas9/gRNA系统对扩增子和引物二聚体两侧的通用序列进行特异性切割，去除引物二聚体和扩增子两侧的通用序列，去除引物二聚体。优选地，在所述方法的步骤S2中，采用Cas9蛋白酶和gRNA，对扩增子和引物二聚体进行消化处理，特异性切割掉扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体。所述 Cas9蛋白酶包含多种Cas9蛋白酶的变体，如切割双链、切割单链以及识别不同PAM结构。
在优选的实施方案中，在步骤S2和S3中，采用磁珠对S2步骤的酶切产物进行纯化，得到扩增子。
在优选的实施方案中，gRNA的5’端20碱基序列必须与多重PCR引物的5’端通用序列中的NGG序列前面的20个碱基序列一致。gRNA的来源包括化学合成和体外转录。如果体外使用T7DNA聚合酶转录gRNA，gRNA的5’端要求添加GG序列，从而被T7DNA聚合酶识别。如果使用T4DNA聚合酶进行转录，在gRNA的5’端通常添加X碱基，增加T4DNA聚合酶的识别和转录。gRNA加入到反应体系中的种类与多重PCR引物使用的通用序列种类一致。
在优选的实施方案中，在步骤S3中，对扩增子依次进行5’端磷酸化修饰，3’端添加“A”，然后用连接酶将测序接头例如P5和P7连接到扩增子的5’端和3’端。每一步操作结束后，均采用磁珠纯化扩增子。
在优选的实施方案中，所述操作步骤S3中，对所述扩增子的5’端进行磷酸化处理，对扩增子的3’端添加“A”，并采用连接酶将测序接头(例如P5和P7)分别连接到所述扩增子的5’端，磁珠纯化后，得到扩增子文库，进行二代测序。
在优选的实施方案中，在所述方法的步骤S1、S2和S3后，以及步骤S3中的扩增子5’端磷酸化修饰、扩增子3’端添加“A”、扩增子5’端和3’端分别连接接头序列例如P5和P7等操作后，均采用磁珠对所述扩增子进行纯化。
在第二方面中，本发明提供了一种利用Cas9/gRNA系统构建的扩增子文库，所述扩增子文库使用本发明第一方面的方法构建而成。
附图说明
通过以下附图对本发明进行说明
图1：基于Cas9/gRNA系统构建扩增子文库的流程图；
图2：Crispr/Cas9的元件及工作模式图。
图3Cas9/gRNA系统构建300重扩增子文库的质检结果。
具体实施方式
本发明提供了一种构建扩增子文库构建的方法，该方法能够有效去除文库构建过程中产生的引物二聚体，提高测序数据的捕获率，覆盖率和均一性。
在本发明中，在所述方法的步骤S1中，所述多重PCR引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重PCR引物的5’端为通用序列。
在本发明中，所述多重PCR引物5’端通用序列的长度在23nt以上，且通用序列3’端存在 NGG的碱基排列，NGG序列前面的20个碱基序列与Cas9/gRNA系统中gRNA 5’端的20个碱基序列一致。
在本发明中，使用多种不同的通用序列，在S2步骤中加入与之序列一致的gRNA。
在本发明中，所述方法的步骤S2中，采用Cas9蛋白酶和gRNA，对扩增子和引物二聚体进行消化处理，特异性切割掉扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体。
在本发明中，所述Cas9蛋白酶包含多种Cas9蛋白酶的变体，如所述变体切割双链、切割单链以及识别不同PAM结构。
在本发明中，gRNA的5’端的20个碱基序列与所述多重PCR引物5’端通用序列中的NGG 序列前面的20个碱基序列一致。在本发明中，gRNA的来源包括化学合成和体外转录，如果体外使用T7DNA聚合酶转录gRNA，gRNA的5’端要求在原有序列的基础上的添加GG序列，从而被T7DNA聚合酶识别；如果使用T4DNA聚合酶进行转录，在gRNA的5’端要求在原有序列的基础上添加X碱基，增加T4DNA聚合酶的识别和转录。
在本发明中，gRNA加入到反应体系中的种类与多重PCR引物使用的通用序列种类一致。
在本发明中，在所述方法的步骤S3中，对所述扩增子的5’端进行磷酸化处理，对扩增子的3’端添加“A”，并采用连接酶将测序接头列入P5和P7分别连接到所述扩增子的5’端，磁珠纯化后，得到扩增子文库，进行二代测序。
在本发明中，在所述方法的步骤S1、S2和S3后，以及步骤S3中的扩增子5’端磷酸化修饰、扩增子3’端添加“A”、扩增子5’端和3’端分别连接接头序列(例如P5和P7)等操作后，均采用磁珠对所述扩增子进行纯化。
虽然不希望拘囿于任何理论，但发明人认为Crispr/Cas9(clustered regularlyinterspaced palindromic repeat)系统可能对本发明的有益效果有促进作用。Crispr/Cas9(clustered regularly interspaced palindromic repeat)系统[1]是发现于细菌中的一种选择性免疫系统，能够特异性识别并切割侵入细菌内的外源gDNA,从而保护细菌。Crispr/Cas9系统主要由三部分组成： TracrRNA、Cas9蛋白和crRNA。TracrRNA的核酸序列位于cas9基因的上游，转录后经过III 型核酸酶的作用而成熟，其主要功能与crRNA中的重复序列互补配对，介导crRNA成熟。Cas9 蛋白具有两个重要的结构域，分别为HNH和RuvC。HNH切割crRNA与靶DNA杂交形成的双链，RuvC切割靶DNA解开后未配对的单链。此外，NHN和RuvC由一段富含精氨酸的α螺旋链接，该铰链区主要负责与gRNA-TargetDNA杂合体结合。crRNA的核酸序列由一连串的短重复序列被不同特异序列分隔形成。短重复序列主要与TracrRNA结合，特异序列来源于质粒或者外源gDNA，能够与外源靶DNA互补配对，从而对靶DNA进行特异性识别和切割。 Crispr/Cas9识别的靶序列要求在其3’端存在PAM序列，其碱基序列通常为NGG。PAM序列对于Crispr/Cas9识别靶DNA非常重要，缺失PAM结构将导致Crispr/Cas9无法识别和切割靶 DNA序列。Crispr/Cas9的工作流程主要包括以下几个：1.Crispr/Cas9复合体识别靶DNA上游的PAM结构，并引发靶DNA解链，形成R-loop结构；2.crRNA 5’的特异性序列(20nt)与解链的靶DNA互补配对，形成RNA-DNA二聚体结构；3.Cas9蛋白中HNH结构域在PAM 上游的第3个碱基处切割RNA-DNA二聚体，RuvC结构域也在PAM序列上游的第3个碱基处切割靶DNA中未配对的单链，从而将双链靶DNA切断，形成平末端；4.切断的双链通过非同源末端链接(NHEJ)或者同源修复，便可在切割的位置引入突变，导致靶DNA的序列发生改变。研究人员通过分子生物学技术，将TracrRNA和crRNA融合成一条gRNA(guide RNA)，进一步简化了Crispr/Cas9编辑靶基因的操作流程。目前，Crispr/Cas9因其操作简便，特异性高，已经成为靶基因编辑的主流工具。
本发明充分利用Cas9/gRNA系统特异性识别和切割靶DNA序列的特性，在多重PCR引物的5’端添加一段Cas9/gRNA系统识别的通用序列，经第一轮多重PCR反应后，采用Cas9/gRNA系统对扩增子和引物二聚体两侧的通用序列进行识别和切割，去除引物二聚体，随后对扩增子进行磁珠纯化，5’端进行磷酸化修饰，3’端添加“A”，采用连接酶将测序接头(例如P5和P7)分别连接到扩增子的5’端和3’端，磁珠纯化后得到扩增子文库，进行上机测序。
实施例1
利用该方法构建单个反应管300重扩增子文库的实施例1如下所示。
第1步：300重PCR反应扩增靶向产物
1.300重PCR的反应体系如下表1所示：DNA聚合酶，缓冲液和dNTP均为NEB的产品(货号M0493L)；模板是从293T细胞提取得到的gDNA；多重引物的浓度为5mM，引物序列分为5’端的通用序列和3’端的特异性序列。所有上游引物5’端的通用序列为 5’TCTGTCTATGACGCTGTATCCGG3’，所有下游引物5’端的通用序列为 5’ATCCACTGACATAGTCTGTATGG3’。300对多重引物3’端的特异性序列如表2所示。
表1 300重PCR的反应体系
试剂 体积(μl)
无核酸酶水 9.5
5×Q5反应缓冲物 5
10mM dNTPs 0.5
引物混合物(5mM) 4
模板DNA(10ng/μl) 5
Q5Hot Start High-Fidelity DNA聚合酶(2U/μl) 1
表2 300重引物3’端的特异性序列(SEQID NO.1-600)
Figure BDA0001305556260000041
Figure BDA0001305556260000051
Figure BDA0001305556260000061
Figure BDA0001305556260000071
Figure BDA0001305556260000081
Figure BDA0001305556260000091
Figure BDA0001305556260000101
1.2 300重PCR反应按照下表3进行操作
表3 300重PCR的反应条件
Figure BDA0001305556260000102
第2步：对第1轮的300重PCR产物进行磁珠纯化
2.1向25μl 300重PCR产物中加入40μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
2.2室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
2.3移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
2.4移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
2.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；
2.6将PCR管从磁力架取下，加入22μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；
2.7将PCR管重新置于磁力架上，静置4min；
2.8用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为多重PCR扩增产物。
第3步：gRNA的体外转录
本实施例采用NEB公司的sgRNA体外转录试剂盒(EnGenTMsgRNA Synthesis Kit)对靶RNA进行体外转录。由于在多重PCR反应中，上下游引物5’端的通用序列不同，因此需要体外转录2条gRNA。第1条gRNA(编号为gRNA1)的体外转录模板为5’ TTCTAATACGACTCACTATAGTCTGTCTATGACGCTGTATC3’，得到的gRNA1与Cas9 蛋白(本实施例采用的Cas9蛋白为NEB公司的产品(货号M0646))结合后，可以识别并切割扩增产物和引物二聚体中上游引物5’端的通用序列；第2条gRNA(编号为gRNA2) 的体外转录模板为
5’TTCTAATACGACTCACTATAGATCCACTGACATAGTCTGTA3’,得到的gRNA2 与Cas9蛋白结合后，可以识别并切割扩增产物和引物二聚体中下游引物5’端的通用序列。
3.1gRNA1和gRNA2的体外转录反应体系如下表4所示：
表4gRNA体外转录合成的反应体系
试剂 体积(μl)
无核酸酶水 3
EnGen 2X sgRNA Reaction Mix,S.pyogenes 10
Target-specifc DNA Oligo(1μM) 5
EnGen sgRNA Enzyme Mix 2
备注：Target-specifc DNA Oligo为gRNA1和gRNA2的体外转录模板
3.2将上述反应试剂加入到200μl的PCR反应管之后，37℃孵育30min，然后置于冰盒上暂存；
3.3向上述反应体系内加入30μl无核酸酶水，然后加入2μl DNase I，振荡混匀离心后，37℃孵育15min，去除反应体系内的DNA模板。
第4步：gRNA的纯化
第3步体外转录合成的gRNA使用ZYMO RESEARCH公司的RNA纯化试剂盒(RNAClean&ConcentratorTM-25)进行纯化，具体操作步骤如下：
4.1加入100μl RNA binding buffer到50μl gRNA体外转录产物中，振荡混匀；
4.2加入150μl 100％的乙醇到上述反应体系中，振荡混匀；
4.3将离心柱安放于收集管上，并将上述反应液转移到离心柱中(Zymo-SpinTMIICColumn)，12000g，离心30s，舍弃收集液；
4.4加入400μl RNA Prep Buffer到离心柱中，离心30s，舍弃收集液；
4.5加入700μl RNA Wash Buffer到离心柱中，离心30s，舍弃收集液；
4.6加入400μl RNA Wash Buffer到离心柱中，离心2min，将离心柱转移到RNase-free 的1.5ml离心管中；
4.7加入25μl RNase-free的ddH2O于离心柱的核酸吸附膜上，离心30s，得到纯化后的gRNA。
第5步：Cas9/gRNA消化多扩增子和引物二聚体两侧5’端的通用序列，去除引物二聚体
5.1本实施例采用的Cas9蛋白为NEB公司的产品(货号M0646)，首先将Cas9蛋白与gRNA1和gRNA2混合孵育，制备Cas9/gRNA1和Cas9/gRNA2复合体。反应体系如下表 5所示。
表5Cas9/gRNA1和Cas9/gRNA2复合体制备的反应体系
试剂 体积(μl)
无核酸酶水 13
10×Cas9 Nuclease Reaction Buffer 5
gRNA1(300nM) 5
gRNA2(300nM) 5
Cas9 Nuclease,S.pyogenes(1μM) 2
5.2将上述反应试剂混合后，25℃孵育10min；
5.3向上述反应体系内加入20μl第2步纯化得到的多重PCR产物，总体积为50μl，然后混匀离心，37℃孵育2h，消化多重PCR产物及引物二聚体两侧5’端的通用引物序列，去除引物二聚体；
第6步：磁珠纯化第5步的消化产物
6.1向50μl消化产物中加入75μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
6.2室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
6.3移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
6.4移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
6.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；
6.6将PCR管从磁力架取下，加入32μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；
6.7将PCR管重新置于磁力架上，静置4min；
6.8用移液器吸取30μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为去除两侧通用引物序列的多重PCR产物；
第7步：对扩增子的5’端添加磷酸基团
7.1本实施例中，对多重PCR产物5’端添加磷酸基团的试剂为KAPA Biosystems公司的产品(货号KK8234)，反应体系如下表6所示：
表6扩增子5’端磷酸化修饰的反应体系
试剂 体积(μl)
水 3
End Repair Buffer(10X) 4
End Repair Enzyme Mix 3
多重PCR产物 30
备注：多重PCR产物为第6步纯化得到的多重PCR产物
7.2将上述反应试剂混合后，振荡混匀，离心，20℃孵育30min；
第8步：对5’端添加磷酸基团的扩增子进行磁珠纯化
8.1向40μl 5’端添加磷酸基团后的多重PCR产物加入60μl室温平衡后的AMPureXP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
8.2室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
8.3移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
8.4移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
8.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发，得到的磁珠上有5’端磷酸化后的多重PCR产物，直接作为下一步反应的底物；
第9步：对扩增子的3’端添加“A”
9.1本实施例采用的试剂为KAPA Biosystems公司的产品(货号KK8234)，反应体系如下表7所示：
表7扩增子3’端添加“A”的反应体系
Figure BDA0001305556260000121
9.2将上述反应试剂混合后，振荡混匀，30℃孵育30min；
第10步：对3’端添加“A”后扩增子进行磁珠纯化
10.1向上述50μl反应体系内，加入90μl PEG/NaCl溶液，用移液器上下吹打混匀；
10.2室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s；
10.3移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
10.4室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发，磁珠结合的扩增子，直接作为下一步反应的底物；
第11步：将5’端含有磷酸基团和3’端添加“A”后的扩增子与Illumina平台的测序接头连接，得到扩增子文库
11.1本实施例中采购的DNA连接酶为KAPA Biosystems的产物(货号KK8235)。连接的反应体系如下表8所示。
表8扩增子与测序接头序列连接的反应体系
Figure BDA0001305556260000131
11.2将上述反应试剂混合后，振荡混匀，20℃孵育15min；
第12步：对连接后的扩增子文库进行磁珠纯化
12.1向上述50μl反应体系内，加入50μl PEG/NaCl溶液，用移液器上下吹打混匀；
12.2室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
12.3移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置 30s；
12.4移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
12.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；
12.6将PCR管从磁力架取下，加入22μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠，避免产生气泡，室温静置2min；
12.7将PCR管重新置于磁力架上，静置4min；
12.8用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为多重PCR 扩增产物。
第13步：对纯化后的扩增子文库进行PCR扩增，提高扩增子文库的浓度
13.1本实施例采用的引物和DNA聚合酶均为KAPA Biosystems公司的产品(货号KK2600)。PCR的反应体系如下表9所示：
表9扩增子文库扩增的反应体系
试剂 体积(μl)
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2X) 25
Library Amplifcation Primer Mix(10X) 5
Adapter-ligated library DNA 20
13.2将上述反应成分混合后，震荡混匀，离心，然后按照下表10进行PCR反应扩增；
表10扩增子文库PCR的反应条件
Figure BDA0001305556260000141
第14步：对PCR产物进行磁珠纯化，得到高浓度的文库
14.1向50μl PCR产物中加入70μl室温平衡后的AMPure XP磁珠，用移液器吸打混匀数次；
14.2室温孵育10min后，将PCR管置于DynaMag-96Side磁力架上3min；
14.3移除上清，PCR管继续放置在磁力架上，向管内加入180μl 80％乙醇溶液，静置 30s；
14.4移除上清，再加入180μl 80％乙醇溶液，静置30s后彻底移除上清(使用10μl移液器移除底部残留乙醇溶液)；
14.5室温静置10min，使残留乙醇彻底挥发；
14.6将PCR管从磁力架取下，加入22μl无核酸酶水，移液器轻轻吸打重悬磁珠,避免产生气泡，室温静置2min；
14.7将PCR管重新置于磁力架上，静置4min；
14.8用移液器吸取20μl上清液，转移到新的200μl PCR管内，管内上清液为多重PCR 扩增产物。
第15步：对扩增子文库进行浓度测量
取2μl文库使用
Figure BDA0001305556260000143
3.0Fluorometer(Qubit dsDNA HS Assay Kit)进行浓度测量，得到的文库浓度为7.84ng/μl；
第16步：对扩增子文库的片段分布进行质检
取2μl扩增子文库使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统(厚泽生物)进行质检，得到的质检峰图如图3所示：文库的靶条带位置正确，分布250-420bp之间，主峰位置在356bp；文库中基本没有引物二聚体。
第17步：对文库进行二代测序并进行数据分析
采用Illumina公司的Next-seq 500测序平台对上述文库进行二代测序，对得到的测序数据进行统计分析，结果如下表11所示：文库的碱基质量评分(％)为90.12％，比对率为 99.56％，覆盖率为100％，20％平均测序深度为98.84％，均一性高。文库的各项数据指标表现优异。
表11Cas9/gRNA系统构建300重扩增子文库的测序数据统计结果
Figure BDA0001305556260000142
参考文献：
[1]Doudna JA,Charpentier E.Genome editing.The new frontier of genomeengineering with CRISPR-Cas9.Science.2014Nov 28；346(6213):1258096.

Claims (6)

1.一种利用Cas9/gRNA系统构建扩增子的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：采用多重PCR引物对多个目标区域进行扩增，得到多个扩增子，采用磁珠对所述扩增子进行纯化，所述多重PCR引物的3’端为特异性序列，能够与模板互补配对；所述多重PCR引物的5’端为通用序列，所述多重PCR引物5’端通用序列的长度在24nt以上，且通用序列3’端存在NGG的碱基排列，通用序列能够被Cas9/gRNA系统中的gRNA互补配对，使用多种不同的通用序列；
S2：采用Cas9蛋白酶，并加入与多重PCR引物5’端通用序列互补配对的gRNA，对扩增子和引物二聚体进行消化处理，特异性切割掉扩增子和引物二聚体两侧的通用序列，去除引物二聚体，采用磁珠对所述扩增子进行纯化，gRNA的5’端与所述多重PCR引物的5’端的通用序列互补配对；gRNA加入到反应体系中的种类与多重PCR引物使用的通用序列种类一致；
S3：依次对所述扩增子进行5’端磷酸化修饰，对扩增子的3’端添加“A”，然后用连接酶将测序接头连接到扩增子的5’端和3’端；
S4：将所述连接后的扩增子磁珠纯化后，得到扩增子文库，然后进行二代测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas9蛋白酶为切割双链、切割单链或识别不同PAM结构的Cas9蛋白酶的变体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，gRNA来自化学合成。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2中，gRNA来自体外转录。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用T7DNA聚合酶转录 gRNA，gRNA的5’端添加GG序列。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，使用T4DNA聚合酶进行转录，在gRNA的5’端添加X碱基，增加T4DNA聚合酶的识别和转录。
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