JP2003532422A - １−デオキシ−ｄ−キシルロース生合成経路の遺伝子 - Google Patents
１−デオキシ−ｄ−キシルロース生合成経路の遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、Plasmodium falciparum由来のＤＮＡ配列、すなわちウイルス、真核生物および原核生物のゲノムに組込んだときにイソプレノイド生合成を変更する遺伝子lytBおよびyfgBに関する。本発明はまた、これらのトランスジェニックのウイルス、真核生物および原核生物を産生する遺伝子技術による方法、植物において除草、抗微生物、抗寄生生物、抗ウイルス、殺真菌および殺菌効果をを有する物質を同定する方法、およびヒトおよび動物において抗微生物、抗寄生生物、抗真菌、抗菌および抗ウイルス効果を有する物質を同定する方法にも関する。
Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野
本発明は、ウイルス、真核生物および原核生物のゲノムに組込んでイソプレノ
イド合成を変更するＤＮＡ配列、およびこれらのトランスジェニックのウイルス
、真核生物および原核生物を産生するための遺伝子工学の方法に関する。本発明
は、植物における除草、抗微生物、抗寄生生物、抗ウイルス、殺真菌または殺細
菌作用、またはヒトおよび動物における抗微生物、抗寄生生物、抗真菌、抗細菌
または抗ウイルス作用を有する物質の同定方法にも関する。
イド合成を変更するＤＮＡ配列、およびこれらのトランスジェニックのウイルス
、真核生物および原核生物を産生するための遺伝子工学の方法に関する。本発明
は、植物における除草、抗微生物、抗寄生生物、抗ウイルス、殺真菌または殺細
菌作用、またはヒトおよび動物における抗微生物、抗寄生生物、抗真菌、抗細菌
または抗ウイルス作用を有する物質の同定方法にも関する。
【０００２】背景技術
従来のアセテート／メバロネート経路、および代替のメバロネートとは独立し
た生合成経路であるデオキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート経路（ＤＯＸＰま
たはＭＥＰ経路）によるイソプレノイドを形成する生合成経路が、既に知られて
いる(Rohmer, M., Knani, M., Simonin, P., Sutter, B.,および Sahm, H. (199
3): Biochem. J. 295: 517-524)。
た生合成経路であるデオキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート経路（ＤＯＸＰま
たはＭＥＰ経路）によるイソプレノイドを形成する生合成経路が、既に知られて
いる(Rohmer, M., Knani, M., Simonin, P., Sutter, B.,および Sahm, H. (199
3): Biochem. J. 295: 517-524)。
【０００３】
しかしながら、ウイルス、真核生物および原核生物におけるデオキシ−Ｄ−キ
シルロースホスフェート経路を介して、どのようにして且つどのような経路でイ
ソプレノイド濃度を変化させることができるかについては知られていない。
シルロースホスフェート経路を介して、どのようにして且つどのような経路でイ
ソプレノイド濃度を変化させることができるかについては知られていない。
【０００４】
従って、ＤＯＸＰ経路に関与している酵素をコードするＤＮＡ配列が提供され
る。遺伝子（lytBおよびyfgB）および酵素（LytBおよびYfgB）はいずれもイソプ
レノイド生合成に関与しており、特定の生物の生存に本質的なものである（例１
および２）。
る。遺伝子（lytBおよびyfgB）および酵素（LytBおよびYfgB）はいずれもイソプ
レノイド生合成に関与しており、特定の生物の生存に本質的なものである（例１
および２）。
【０００５】
本発明は、下記のＤＮＡ配列：
配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列、または、配列番号５に記載のポリペプチドの類似体または誘導体であって
、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に減少させることなく１種類以上のアミノ
酸が欠失され、付加され、または他のアミノ酸で置換されているものをコードす
る、ＤＮＡ配列、および 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、または、配列番号１４に記載のポリペプチドの類似体または誘導体であ
って、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に減少させることなく１種類以上のア
ミノ酸が欠失され、付加され、または他のアミノ酸で置換されているものをコー
ドする、ＤＮＡ配列 に関する。
配列、または、配列番号５に記載のポリペプチドの類似体または誘導体であって
、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に減少させることなく１種類以上のアミノ
酸が欠失され、付加され、または他のアミノ酸で置換されているものをコードす
る、ＤＮＡ配列、および 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ配列、または、配列番号１４に記載のポリペプチドの類似体または誘導体であ
って、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に減少させることなく１種類以上のア
ミノ酸が欠失され、付加され、または他のアミノ酸で置換されているものをコー
ドする、ＤＮＡ配列 に関する。
【０００６】
本発明は、請求項１〜４によって更に定義される。本発明のなお一層の展開は
サブクレームによって定義される。
サブクレームによって定義される。
【０００７】
遺伝子およびそれらの遺伝子産物（ポリペプチド）は、それらの一次構造と共
に配列リストに挙げられており、下記の配置 配列番号1： lytB遺伝子 配列番号５： LytBタンパク質 配列番号９： yfgB遺伝子 配列番号１４： YfgBタンパク質 を有する。
に配列リストに挙げられており、下記の配置 配列番号1： lytB遺伝子 配列番号５： LytBタンパク質 配列番号９： yfgB遺伝子 配列番号１４： YfgBタンパク質 を有する。
【０００８】
このＤＮＡ配列はいずれも、Plasmodium falciparum 3D7株に由来する。
【０００９】
配列リストで述べたＤＮＡ配列の他に、遺伝子コードの縮重の結果異なるＤＮ
Ａ配列を有するが同じポリペプチドまたはこのポリペプチドの酵素作用を実質的
に減少させることなく１個以上のアミノ酸を欠失し、付加しもしくは他のアミノ
酸で置換したこのポリペプチドの類似体または誘導体をコードするものも好適で
ある。
Ａ配列を有するが同じポリペプチドまたはこのポリペプチドの酵素作用を実質的
に減少させることなく１個以上のアミノ酸を欠失し、付加しもしくは他のアミノ
酸で置換したこのポリペプチドの類似体または誘導体をコードするものも好適で
ある。
【００１０】
本発明による配列は、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース経路のイソプレノイド
生合成に関与するウイルス、真核生物および原核生物での遺伝子の過剰発現に好
適である。
生合成に関与するウイルス、真核生物および原核生物での遺伝子の過剰発現に好
適である。
【００１１】
本発明によれば、動物細胞、植物細胞、藻類、酵母および真菌は真核生物また
は真核細胞に属し、古細菌およびユーバクテリアは原核生物または原核細胞に属
する。
は真核細胞に属し、古細菌およびユーバクテリアは原核生物または原核細胞に属
する。
【００１２】
上記ＤＮＡ配列の一つを配置したＤＮＡ配列をゲノムに組込むと、ウイルス、
真核生物および原核生物での上記遺伝子の発現が可能になる。本発明に従って、
形質転換したウイルス、真核生物および原核生物をそれ自体が知られている方法
で培養し、この培養中に形成されたイソプレノイドを分離し、場合によっては精
製する。幾つかの場合には、イソプレノイドは周囲の空気中に直接放出されるの
で、総てのイソプレノイドを分離しなければならないわけではない。
真核生物および原核生物での上記遺伝子の発現が可能になる。本発明に従って、
形質転換したウイルス、真核生物および原核生物をそれ自体が知られている方法
で培養し、この培養中に形成されたイソプレノイドを分離し、場合によっては精
製する。幾つかの場合には、イソプレノイドは周囲の空気中に直接放出されるの
で、総てのイソプレノイドを分離しなければならないわけではない。
【００１３】
本発明はさらに、イソプレノイド発現を有するトランスジェニックのウイルス
、真核生物および原核生物の産生方法であって、下記の工程a)およびb)を含んで
なる方法に関する： a) 下記の部分配列i)〜iii)を有するＤＮＡ配列を調製し： i) ウイルス、真核生物、および原核生物において活性であって、目的とする
ターゲット組織またはターゲット細胞においてＲＮＡを確実に形成する、プロモ
ーター、 ii) 配列番号５または１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
または配列番号５または１４に記載の類似体または誘導体をコードする、ＤＮＡ
配列、 iii) ウイルス、真核生物、および原核生物においてＲＮＡの３′−末端にポ
リ−Ａ基を付加する、３′−非翻訳配列、 b) ベクター（例えば、プラスミド、ウイルスＤＮＡ）を用いてまたは用いるこ
となく、ウイルス、真核細胞および原核細胞のゲノムへのＤＮＡ配列の導入また
は組込みを行なう。
、真核生物および原核生物の産生方法であって、下記の工程a)およびb)を含んで
なる方法に関する： a) 下記の部分配列i)〜iii)を有するＤＮＡ配列を調製し： i) ウイルス、真核生物、および原核生物において活性であって、目的とする
ターゲット組織またはターゲット細胞においてＲＮＡを確実に形成する、プロモ
ーター、 ii) 配列番号５または１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
または配列番号５または１４に記載の類似体または誘導体をコードする、ＤＮＡ
配列、 iii) ウイルス、真核生物、および原核生物においてＲＮＡの３′−末端にポ
リ−Ａ基を付加する、３′−非翻訳配列、 b) ベクター（例えば、プラスミド、ウイルスＤＮＡ）を用いてまたは用いるこ
となく、ウイルス、真核細胞および原核細胞のゲノムへのＤＮＡ配列の導入また
は組込みを行なう。
【００１４】
完全な全植物体を、形質転換した植物細胞から再生することができる。
【００１５】
タンパク質をコードする配列番号1および配列番号９のヌクレオチド配列を有
する配列は、器官または細胞で確実に転写を行い且つ形成されるタンパク質をコ
ードする配列にセンス配向で（コード配列の５′−末端に対しプロモーターの３
′−末端を）カップリングするプロモーターで提供することができる。ｍＲＮＡ
合成の終結を決定する終結シグナルが、コード配列の３′−末端に結合する。発
現させるタンパク質を葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリア、液胞、サイト
ゾルまたは細胞間空隙のような亜細胞性コンパートメントに向けるため、いわゆ
るシグナル配列またはトランジットペプチドをプロモーターとコード配列との間
に置くこともできる。この配列は、タンパク質のコード配列と同じリーディング
フレームになければならない。本発明によるＤＮＡ配列を高等植物へ導入したも
のの調製には、E. coliについての複製シグナルを含んでなる多数のクローニン
グベクターと、形質転換細胞を選択することができるマーカーを利用することが
できる。ベクターの例はpBR 322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC 184、EM
BL 3などである。植物中への所望な遺伝子の導入の方法によっては、他のＤＮＡ
配列が必要なことがある。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質
転換に用いるときには、ＴｉおよびＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右制
限であるが、多くの場合は右および左制限を導入しようとする遺伝子に対するフ
ランキング領域として挿入しなければならない。植物細胞の形質転換に対するＴ
−ＤＮＡの使用は詳細に研究されており、欧州特許第ＥＰ１２０５１６号明細書
；Hoekama著, 「バイナリー植物ベクター系(The Binary Plant Vector System),
Offset-drukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), 第Ｖ章; Fraley et al
., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46、およびAn et al. (1985) EMBO J. 4, 277-
287に適当に記載されている。ＤＮＡがゲノムにいったん組込まれてしまうと、
これは原則的に安定であり、本来的に形質転換されている細胞の子孫にも保持さ
れる。これは通常は選択マーカーを含み、これは形質転換した植物細胞に殺生物
剤または抗生物質、とりわけカナマイシン、G 418、ブレオマイシン、ハイグロ
マイシンまたはホスフィノトリシンに対する耐性を付与する。従って、個々に使
用されるこのマーカーは、挿入したＤＮＡが欠けている細胞に対して形質転換細
胞を選択できるものであるべきである。
する配列は、器官または細胞で確実に転写を行い且つ形成されるタンパク質をコ
ードする配列にセンス配向で（コード配列の５′−末端に対しプロモーターの３
′−末端を）カップリングするプロモーターで提供することができる。ｍＲＮＡ
合成の終結を決定する終結シグナルが、コード配列の３′−末端に結合する。発
現させるタンパク質を葉緑体、アミロプラスト、ミトコンドリア、液胞、サイト
ゾルまたは細胞間空隙のような亜細胞性コンパートメントに向けるため、いわゆ
るシグナル配列またはトランジットペプチドをプロモーターとコード配列との間
に置くこともできる。この配列は、タンパク質のコード配列と同じリーディング
フレームになければならない。本発明によるＤＮＡ配列を高等植物へ導入したも
のの調製には、E. coliについての複製シグナルを含んでなる多数のクローニン
グベクターと、形質転換細胞を選択することができるマーカーを利用することが
できる。ベクターの例はpBR 322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC 184、EM
BL 3などである。植物中への所望な遺伝子の導入の方法によっては、他のＤＮＡ
配列が必要なことがある。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドを植物細胞の形質
転換に用いるときには、ＴｉおよびＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右制
限であるが、多くの場合は右および左制限を導入しようとする遺伝子に対するフ
ランキング領域として挿入しなければならない。植物細胞の形質転換に対するＴ
−ＤＮＡの使用は詳細に研究されており、欧州特許第ＥＰ１２０５１６号明細書
；Hoekama著, 「バイナリー植物ベクター系(The Binary Plant Vector System),
Offset-drukkerij Kanters B.V. Alblasserdam (1985), 第Ｖ章; Fraley et al
., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46、およびAn et al. (1985) EMBO J. 4, 277-
287に適当に記載されている。ＤＮＡがゲノムにいったん組込まれてしまうと、
これは原則的に安定であり、本来的に形質転換されている細胞の子孫にも保持さ
れる。これは通常は選択マーカーを含み、これは形質転換した植物細胞に殺生物
剤または抗生物質、とりわけカナマイシン、G 418、ブレオマイシン、ハイグロ
マイシンまたはホスフィノトリシンに対する耐性を付与する。従って、個々に使
用されるこのマーカーは、挿入したＤＮＡが欠けている細胞に対して形質転換細
胞を選択できるものであるべきである。
【００１６】
多くの手法が、植物へのＤＮＡの導入に利用することができる。これらの手法
としては、アグロバクテリア、例えば、Agrobacterium tumefaciens、プロトプ
ラストの融合、ＤＮＡの微量注入、電気穿孔並びに衝撃法を用いる形質転換、お
よびウイルス感染が挙げられる。次に、完全な植物体を、適当な培地であって選
択の目的で抗生物質または殺生物剤を含むことができる培地中で形質転換植物材
料から再生させることができる。注入および電気穿孔の目的で、特定の要件をプ
ラスミドに科することはない。しかしながら、完全な植物体をこの方法で形質転
換した細胞から再生させようとするときには、選択可能なマーカー遺伝子の存在
が必要である。形質転換細胞は、通常の方法で植物中で成長する(McCormick et
al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84)。植物は正常に成長させることがで
き、同じ形質転換した遺伝子配置または他の遺伝子配置を有する植物と交雑する
ことができる。それから生じる個体は、相当する特徴的な表現型を有する。
としては、アグロバクテリア、例えば、Agrobacterium tumefaciens、プロトプ
ラストの融合、ＤＮＡの微量注入、電気穿孔並びに衝撃法を用いる形質転換、お
よびウイルス感染が挙げられる。次に、完全な植物体を、適当な培地であって選
択の目的で抗生物質または殺生物剤を含むことができる培地中で形質転換植物材
料から再生させることができる。注入および電気穿孔の目的で、特定の要件をプ
ラスミドに科することはない。しかしながら、完全な植物体をこの方法で形質転
換した細胞から再生させようとするときには、選択可能なマーカー遺伝子の存在
が必要である。形質転換細胞は、通常の方法で植物中で成長する(McCormick et
al. (1986), Plant Cell Reports 5, 81-84)。植物は正常に成長させることがで
き、同じ形質転換した遺伝子配置または他の遺伝子配置を有する植物と交雑する
ことができる。それから生じる個体は、相当する特徴的な表現型を有する。
【００１７】
本発明はまた、本発明によるＤＮＡ配列を１個以上含んでなる発現ベクターを
提供する。このような発現ベクターは、本発明によるＤＮＡ配列に適当な機能調
節シグナルを提供することによって得られる。このような調節シグナルは発現に
関与するＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサーおよ
びリボソーム結合部位であり、宿主生物によって認識される。
提供する。このような発現ベクターは、本発明によるＤＮＡ配列に適当な機能調
節シグナルを提供することによって得られる。このような調節シグナルは発現に
関与するＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサーおよ
びリボソーム結合部位であり、宿主生物によって認識される。
【００１８】
例えば、宿主生物における組換えＤＮＡの複製または組換えを制御する他の調
節シグナルが、場合によっては発現ベクターの一成分となることもできる。
節シグナルが、場合によっては発現ベクターの一成分となることもできる。
【００１９】
本発明は、本発明によるＤＮＡ配列または発現ベクターで形質転換した宿主生
物も提供する。
物も提供する。
【００２０】
ＤＯＸＰ経路の固有の酵素を持たない宿主細胞および生物が、本発明による酵
素の発現に特に適している。このことは、古細菌、動物、ある種の真菌、粘菌、
およびある種のユーバクテリアに当てはまる。組換え酵素の検出および精製はこ
れらの固有の酵素活性が存在しないことによって実質的に促進される。結果とし
て、初めて、宿主細胞由来の粗製抽出物中で低コストで様々な化学物質および医
薬品によって本発明による組換え酵素の活性、および特に活性の阻害を測定する
こともできる。
素の発現に特に適している。このことは、古細菌、動物、ある種の真菌、粘菌、
およびある種のユーバクテリアに当てはまる。組換え酵素の検出および精製はこ
れらの固有の酵素活性が存在しないことによって実質的に促進される。結果とし
て、初めて、宿主細胞由来の粗製抽出物中で低コストで様々な化学物質および医
薬品によって本発明による組換え酵素の活性、および特に活性の阻害を測定する
こともできる。
【００２１】
次に、翻訳後修飾とポリペプチド鎖の自然な折り畳みを行わなければならない
ときには、本発明による酵素が真核細胞で発現するのが有利である。発現系によ
っては、ゲノムＤＮＡ配列が発現することにより更にイントロンがＤＮＡのスプ
ライシングによって除去され、酵素が寄生生物に特徴的なポリペプチド配列で産
生されることになる。イントロンをコードする配列も、組換えＤＮＡ技術によっ
て実験的に発現または挿入しようとするＤＮＡ配列から除去することもできる。
ときには、本発明による酵素が真核細胞で発現するのが有利である。発現系によ
っては、ゲノムＤＮＡ配列が発現することにより更にイントロンがＤＮＡのスプ
ライシングによって除去され、酵素が寄生生物に特徴的なポリペプチド配列で産
生されることになる。イントロンをコードする配列も、組換えＤＮＡ技術によっ
て実験的に発現または挿入しようとするＤＮＡ配列から除去することもできる。
【００２２】
タンパク質は、専門家に知られている方法によって宿主細胞または宿主細胞の
培養上清から分離することができる。酵素のイン・ビトロでの再活性化が必要な
こともある。
培養上清から分離することができる。酵素のイン・ビトロでの再活性化が必要な
こともある。
【００２３】
精製を容易にするため、本発明による酵素または酵素の部分配列を様々なペプ
チド鎖との融合タンパク質として発現することができる。オリゴヒスチジン配列
およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシンまたはカルモジュ
リン結合ペプチドから誘導される配列が、この目的に特に適している。チオレド
キシンから誘導される配列と融合したものは、その結果組換え酵素の溶解度が増
加するので、原核発現に特に適している。
チド鎖との融合タンパク質として発現することができる。オリゴヒスチジン配列
およびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、チオレドキシンまたはカルモジュ
リン結合ペプチドから誘導される配列が、この目的に特に適している。チオレド
キシンから誘導される配列と融合したものは、その結果組換え酵素の溶解度が増
加するので、原核発現に特に適している。
【００２４】
本発明による酵素またはこれらの酵素の部分配列は、専門家に知られているペ
プチドとの融合タンパク質として発現させ、組換え酵素が細胞外培地または宿主
細胞の特定のコンパートメントに輸送されるようにすることができる。結果とし
て、酵素の精製および生物活性の検討を容易にすることができる。
プチドとの融合タンパク質として発現させ、組換え酵素が細胞外培地または宿主
細胞の特定のコンパートメントに輸送されるようにすることができる。結果とし
て、酵素の精製および生物活性の検討を容易にすることができる。
【００２５】
本発明による酵素の発現において、個々のコドンを修飾するのが好都合である
ことを立証することができる。用いるコドンが寄生生物で異種発現系でのコドン
利用からはずれるときには、コード領域における塩基を選択的に置換してタンパ
ク質の合成を最適にすることも適当である。例えば、ＤＮＡの３′−領域に数個
の不安定化配列モティーフATTTAが存在するときには、非翻訳５′−または３′
−区分の欠失が適当であることも多い。次に、真核生物での好ましい発現の場合
には、これらを欠失するべきである。この種類の修飾は塩基の欠失、付加または
置換であり、本発明はこれらも提供する。
ことを立証することができる。用いるコドンが寄生生物で異種発現系でのコドン
利用からはずれるときには、コード領域における塩基を選択的に置換してタンパ
ク質の合成を最適にすることも適当である。例えば、ＤＮＡの３′−領域に数個
の不安定化配列モティーフATTTAが存在するときには、非翻訳５′−または３′
−区分の欠失が適当であることも多い。次に、真核生物での好ましい発現の場合
には、これらを欠失するべきである。この種類の修飾は塩基の欠失、付加または
置換であり、本発明はこれらも提供する。
【００２６】
本発明による酵素は、専門家に知られている手法によって標準化した条件下で
のイン・ビトロ翻訳によって得ることもできる。これに適する系は、ウサギ網状
赤血球および小麦胚芽エキスおよび細菌溶解産物である。ツメガエル卵母細胞で
のイン・ビトロ転写ｍＲＮＡの翻訳も可能である。
のイン・ビトロ翻訳によって得ることもできる。これに適する系は、ウサギ網状
赤血球および小麦胚芽エキスおよび細菌溶解産物である。ツメガエル卵母細胞で
のイン・ビトロ転写ｍＲＮＡの翻訳も可能である。
【００２７】
本発明による酵素のペプチド配列から誘導される配列を有するオリゴおよびポ
リペプチドは、化学合成によって調製することができる。配列を適当に選択すれ
ば、これらのペプチドは本発明による完全な酵素に特徴的な特性を有する。この
ようなペプチドは多量に調製することができ、酵素活性の速度論、酵素活性の調
節、酵素の三次元構造、様々な化学薬品および医薬品による酵素活性の阻害、お
よび様々なリガンドの結合形態および結合親和性の研究に特に適している。
リペプチドは、化学合成によって調製することができる。配列を適当に選択すれ
ば、これらのペプチドは本発明による完全な酵素に特徴的な特性を有する。この
ようなペプチドは多量に調製することができ、酵素活性の速度論、酵素活性の調
節、酵素の三次元構造、様々な化学薬品および医薬品による酵素活性の阻害、お
よび様々なリガンドの結合形態および結合親和性の研究に特に適している。
【００２８】
配列番号1および９の配列由来のヌクレオチドを有するＤＮＡが、本発明によ
る酵素の組換え調製に好ましく用いられる。
る酵素の組換え調製に好ましく用いられる。
【００２９】
上記のように、通常のアセテート／メバロネート経路の他に、イソプレノイド
の形成についての植物における代替メバロネートから独立した生合成経路である
デオキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート経路（ＤＯＸＰ経路）がある。このデ
オキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート代謝経路は多くの寄生生物、細菌、ウイ
ルスおよび真菌にも存在することが分かっている。
の形成についての植物における代替メバロネートから独立した生合成経路である
デオキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート経路（ＤＯＸＰ経路）がある。このデ
オキシ−Ｄ−キシルロースホスフェート代謝経路は多くの寄生生物、細菌、ウイ
ルスおよび真菌にも存在することが分かっている。
【００３０】
従って、本発明は、化合物のスクリーニングする方法にも関する。この方法に
よれば、組換え発現ベクターであって、配列番号1または配列番号９に記載のオ
リゴヌクレオチド配列またはその変異体または同族体の少なくとも一部を有する
ベクター、および更にヒトおよび動物で抗微生物、抗寄生生物、抗ウイルスおよ
び抗真菌作用をまたは植物で殺細菌、抗微生物、除草または殺真菌作用を有する
と考えられる化合物を含む宿主生物が提供される。この宿主生物を次に化合物と
接触させ、この化合物の活性を測定する。
よれば、組換え発現ベクターであって、配列番号1または配列番号９に記載のオ
リゴヌクレオチド配列またはその変異体または同族体の少なくとも一部を有する
ベクター、および更にヒトおよび動物で抗微生物、抗寄生生物、抗ウイルスおよ
び抗真菌作用をまたは植物で殺細菌、抗微生物、除草または殺真菌作用を有する
と考えられる化合物を含む宿主生物が提供される。この宿主生物を次に化合物と
接触させ、この化合物の活性を測定する。
【００３１】
本発明は、LytBおよびYfgBタンパク質の酵素活性の測定方法も提供する。これ
は、既知の手法によって測定することができる。これらの手法において、特定の
酵素の基質または産物として機能するＤＯＸＰ経路の中間体の濃度の変化は、光
度測定、蛍光測定またはクロマトグラフィー法によって決定される。濃度変化の
検出は、共役酵素分析法によって行い、１以上の追加酵素工程を介して検出を行
うこともできる。追加酵素はＤＯＸＰ経路に関与することもあり、または系に実
験的に加えることもできる。
は、既知の手法によって測定することができる。これらの手法において、特定の
酵素の基質または産物として機能するＤＯＸＰ経路の中間体の濃度の変化は、光
度測定、蛍光測定またはクロマトグラフィー法によって決定される。濃度変化の
検出は、共役酵素分析法によって行い、１以上の追加酵素工程を介して検出を行
うこともできる。追加酵素はＤＯＸＰ経路に関与することもあり、または系に実
験的に加えることもできる。
【００３２】
【実施例】例１
マラリア病原体であるPlasmodium falciparumの血液期(blood stages)の生存
にlytB遺伝子産物が必要であるかどうかを検討するため、P. falciparumの「遺
伝子破壊」（gene disruption）変異体の産生を試みた。この変異体では、選択
マーカーをコードする遺伝子を遺伝子工学の方法によってgcpe遺伝子に導入する
こととし、これを結果として不活性化することとした。このため、ピリメタミン
耐性を付与し且つP. falciparumのlytB遺伝子のコード配列由来の２個の断片が
隣接している発現カセットを含む構築体（pPflytBKO）を製造した。この構築体
は、フランキング配列を介する相同組換えによりgcpe遺伝子組込まれることとし
た。
にlytB遺伝子産物が必要であるかどうかを検討するため、P. falciparumの「遺
伝子破壊」（gene disruption）変異体の産生を試みた。この変異体では、選択
マーカーをコードする遺伝子を遺伝子工学の方法によってgcpe遺伝子に導入する
こととし、これを結果として不活性化することとした。このため、ピリメタミン
耐性を付与し且つP. falciparumのlytB遺伝子のコード配列由来の２個の断片が
隣接している発現カセットを含む構築体（pPflytBKO）を製造した。この構築体
は、フランキング配列を介する相同組換えによりgcpe遺伝子組込まれることとし
た。
【００３３】
記載した総てのＰＣＲ増幅は熱に安定なＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いて行
い、その結果、産物が平滑末端を獲得し、「平滑末端」連結に適する。lytB遺伝
子の配列をプライマー5'-ATG TCA GTT ACC ACA TTT TGT TCT TTA AAA AAA ACG G
-3'および5'-GTG ATT TCA TTT TTC TCT TTC TTT TAT CAT C-3'、および鋳型とし
てのP. falciparum 3D7株由来のゲノムＤＮＡを用いて増幅し、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化し、Sma Iで線形化したpUC 19ベクターにクローニン
グした（pUCPflytB）。ピリメタミン耐性が付与されるように修飾したToxoplasm
a gondiiのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を、選択マーカーとして用いた（Tg
DHFR-TS）。TgDHFR-TSは、P. falciparum カルモジュリン（Pf CAM）遺伝子の
５′−および３′−非翻訳要素の制御下で発現した。この発現カセットは、公表
されたプロトコールに準じて構築したプラスミドpTgD-TS.CAM5/3.KPから得た(Cr
abb, B. S. and Cowman, A. F. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7289
-7294)。この発現カセットは、鋳型としてpTgD-TS.CAM5/3.KPを用いて、プライ
マー5'-AATCTCTGAGCTTCTTCTTTG-3'および5'-GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-
3'を用いる増幅によって得た。次に、発現カセットpUCPfgcpeインサートに挿入
した。このために、pUCPflytBをインサート中でDsa Iで開き、突出部をＴ４およ
びクレノウＤＮＡポリメラーゼで完成した。増幅した発現カセットをリン酸化し
て「平滑末端」連結を介して挿入し、その結果としてpPflytBKOを得た。
い、その結果、産物が平滑末端を獲得し、「平滑末端」連結に適する。lytB遺伝
子の配列をプライマー5'-ATG TCA GTT ACC ACA TTT TGT TCT TTA AAA AAA ACG G
-3'および5'-GTG ATT TCA TTT TTC TCT TTC TTT TAT CAT C-3'、および鋳型とし
てのP. falciparum 3D7株由来のゲノムＤＮＡを用いて増幅し、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化し、Sma Iで線形化したpUC 19ベクターにクローニン
グした（pUCPflytB）。ピリメタミン耐性が付与されるように修飾したToxoplasm
a gondiiのジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を、選択マーカーとして用いた（Tg
DHFR-TS）。TgDHFR-TSは、P. falciparum カルモジュリン（Pf CAM）遺伝子の
５′−および３′−非翻訳要素の制御下で発現した。この発現カセットは、公表
されたプロトコールに準じて構築したプラスミドpTgD-TS.CAM5/3.KPから得た(Cr
abb, B. S. and Cowman, A. F. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7289
-7294)。この発現カセットは、鋳型としてpTgD-TS.CAM5/3.KPを用いて、プライ
マー5'-AATCTCTGAGCTTCTTCTTTG-3'および5'-GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-
3'を用いる増幅によって得た。次に、発現カセットpUCPfgcpeインサートに挿入
した。このために、pUCPflytBをインサート中でDsa Iで開き、突出部をＴ４およ
びクレノウＤＮＡポリメラーゼで完成した。増幅した発現カセットをリン酸化し
て「平滑末端」連結を介して挿入し、その結果としてpPflytBKOを得た。
【００３４】
電気穿孔によるトランスフェクションのため、１０cm培養皿の感染した赤血球
（3D7株、主としてリング期(ring stages)、約１５％が寄生虫血症）をペレット
化して０．８ml Cytomix（１２０mM ＫＣｌ; ０．１５mM ＣａＣｌ２; ２mM Ｅ
ＧＴＡ; ５mM ＭｇＣｌ２; １０mM Ｋ２ＨＰＯ４/ＫＨ２ＰＯ４; ２５mM ＨＥＰ
ＥＳ, ｐＨ７．６）に再懸濁させ、これはpPflytBKO由来のプラスミドＤＮＡ１
５０μgを含んでいた。電気穿孔は、４mm細胞で２．５kV、２００オームおよび
２５μFにて行った。次に、寄生生物を培養皿上に沈澱させ、インキュベーショ
ンした。トランスフェクションの４８時間後、４００nMピリメタミンを培地に加
え、更に４８時間後ピリメタミン濃度を１００nMに減少させた。２２日後、顕微
鏡下で耐性寄生生物を検出することができた。６週間後、ピリメタミン濃度を更
に３週間２μMまで増加させた。寄生生物を９６穴細胞培養プレート上で限界希
釈によってクローニングし、ピリメタミンの非存在下にて１１日間培養した。次
に、１μMピリメタミンを再度加えた。エピソーム性プラスミドはピリメタミン
の非存在下における培養によって失われ、それに続く回復した選択中にプラスミ
ドを染色体に組込んだ寄生生物のみが生き残ることができる。
（3D7株、主としてリング期(ring stages)、約１５％が寄生虫血症）をペレット
化して０．８ml Cytomix（１２０mM ＫＣｌ; ０．１５mM ＣａＣｌ２; ２mM Ｅ
ＧＴＡ; ５mM ＭｇＣｌ２; １０mM Ｋ２ＨＰＯ４/ＫＨ２ＰＯ４; ２５mM ＨＥＰ
ＥＳ, ｐＨ７．６）に再懸濁させ、これはpPflytBKO由来のプラスミドＤＮＡ１
５０μgを含んでいた。電気穿孔は、４mm細胞で２．５kV、２００オームおよび
２５μFにて行った。次に、寄生生物を培養皿上に沈澱させ、インキュベーショ
ンした。トランスフェクションの４８時間後、４００nMピリメタミンを培地に加
え、更に４８時間後ピリメタミン濃度を１００nMに減少させた。２２日後、顕微
鏡下で耐性寄生生物を検出することができた。６週間後、ピリメタミン濃度を更
に３週間２μMまで増加させた。寄生生物を９６穴細胞培養プレート上で限界希
釈によってクローニングし、ピリメタミンの非存在下にて１１日間培養した。次
に、１μMピリメタミンを再度加えた。エピソーム性プラスミドはピリメタミン
の非存在下における培養によって失われ、それに続く回復した選択中にプラスミ
ドを染色体に組込んだ寄生生物のみが生き残ることができる。
【００３５】
プラスミドはほとんどの寄生生物ではエピソームに存在すると思われたので、
寄生生物は５個のウェルのみで成長した。これらのクローンでは、ＲＴ−ＰＣＲ
によってlytB遺伝子の発現をこのようにして、プラスミドを非相同組換えによっ
てゲノムに組込み、寄生生物のlytB遺伝子は不活性化されなかった。このように
して、不活性化lytB遺伝子を有する寄生生物は生存可能であるとは思われず、従
って、この遺伝子は本質的である。最近の知見によれば、Plasmodium属は系統発
生的には下等藻類に近い(Fichera, M. E. and Roos, D. S. (1997) Nature, 390
, 407-409; K hler, S, Delwiche, C. F., Denny, P. W., Tilney, L. G., Webs
ter, P., Wilson, R. J. M., Palmer, J. D. and Roos, D. S. (1997) Nature,
275, 1485-1489)。従って、lytB遺伝子は植物にとっても本質的であると思われ
ると推定される。
寄生生物は５個のウェルのみで成長した。これらのクローンでは、ＲＴ−ＰＣＲ
によってlytB遺伝子の発現をこのようにして、プラスミドを非相同組換えによっ
てゲノムに組込み、寄生生物のlytB遺伝子は不活性化されなかった。このように
して、不活性化lytB遺伝子を有する寄生生物は生存可能であるとは思われず、従
って、この遺伝子は本質的である。最近の知見によれば、Plasmodium属は系統発
生的には下等藻類に近い(Fichera, M. E. and Roos, D. S. (1997) Nature, 390
, 407-409; K hler, S, Delwiche, C. F., Denny, P. W., Tilney, L. G., Webs
ter, P., Wilson, R. J. M., Palmer, J. D. and Roos, D. S. (1997) Nature,
275, 1485-1489)。従って、lytB遺伝子は植物にとっても本質的であると思われ
ると推定される。
【００３６】例２
マラリア病原体であるPlasmodium falciparumの血液期(blood stages)の生存
にyfgB遺伝子産物が必要であるかどうかを検討するため、P. falciparumの「遺
伝子破壊」変異体の産生を試みた。この変異体では、選択マーカーをコードする
遺伝子を遺伝子工学の方法によってyfgB遺伝子に導入することとし、これを結果
として不活性化することとした。このため、ピリメタミン耐性を付与し且つP. f alciparum のyfgB遺伝子のコード配列由来の２個の断片が隣接している発現カセ
ットを含む構築体（pPfyfgBKO）を製造した。この構築体は、フランキング配列
を介する相同組換えによりgcpe遺伝子組込まれることとした。
にyfgB遺伝子産物が必要であるかどうかを検討するため、P. falciparumの「遺
伝子破壊」変異体の産生を試みた。この変異体では、選択マーカーをコードする
遺伝子を遺伝子工学の方法によってyfgB遺伝子に導入することとし、これを結果
として不活性化することとした。このため、ピリメタミン耐性を付与し且つP. f alciparum のyfgB遺伝子のコード配列由来の２個の断片が隣接している発現カセ
ットを含む構築体（pPfyfgBKO）を製造した。この構築体は、フランキング配列
を介する相同組換えによりgcpe遺伝子組込まれることとした。
【００３７】
記載した総てのＰＣＲ増幅は熱に安定なＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いて行
い、その結果、産物が平滑末端を獲得し、「平滑末端」連結に適する。yfgB配列
をプライマー5'-ATG GAA AAG TCA AAA AGG TAC ATA AGC CTG-3'および5'-AGC AT
C GTC CAA ACG ATG AAA ATT TTC GTC-3'、および鋳型としてのP. falciparum 3D
7株由来のゲノムＤＮＡを用いて増幅し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化し、Sma Iで線形化したpUC 19ベクターにクローニングした（pUCPfyfgB）。
ピリメタミン耐性が付与されるように修飾したToxoplasma gondiiのジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子を、選択マーカーとして用いた（Tg DHFR-TS）。TgDHFR-T
Sは、P. falciparum カルモジュリン（Pf CAM）遺伝子の５′−および３′−非
翻訳要素の制御下で発現した。この発現カセットは、公表されたプロトコールに
準じて構築したプラスミドpTgD-TS.CAM5/3.KPから得た(Crabb, B. S. and Cowma
n, A. F. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7289-7294)。この発現カセ
ットは、鋳型としてpTgD-TS.CAM5/3.KPを用いて、プライマー5'-AATCTCTGAGCTTC
TTCTTTG-3'および5'-GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-3'を用いる増幅によっ
て得た。次に、発現カセットpUCPfyfgBインサートに挿入した。このために、pUC
Pfgcpeをインサート中でPac Iで開き、突出部をＴ４およびクレノウＤＮＡポリ
メラーゼで完成した。増幅した発現カセットをリン酸化して「平滑末端」連結を
介して挿入し、その結果としてpPfyfgBKOを得た。
い、その結果、産物が平滑末端を獲得し、「平滑末端」連結に適する。yfgB配列
をプライマー5'-ATG GAA AAG TCA AAA AGG TAC ATA AGC CTG-3'および5'-AGC AT
C GTC CAA ACG ATG AAA ATT TTC GTC-3'、および鋳型としてのP. falciparum 3D
7株由来のゲノムＤＮＡを用いて増幅し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化し、Sma Iで線形化したpUC 19ベクターにクローニングした（pUCPfyfgB）。
ピリメタミン耐性が付与されるように修飾したToxoplasma gondiiのジヒドロ葉
酸レダクターゼ遺伝子を、選択マーカーとして用いた（Tg DHFR-TS）。TgDHFR-T
Sは、P. falciparum カルモジュリン（Pf CAM）遺伝子の５′−および３′−非
翻訳要素の制御下で発現した。この発現カセットは、公表されたプロトコールに
準じて構築したプラスミドpTgD-TS.CAM5/3.KPから得た(Crabb, B. S. and Cowma
n, A. F. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7289-7294)。この発現カセ
ットは、鋳型としてpTgD-TS.CAM5/3.KPを用いて、プライマー5'-AATCTCTGAGCTTC
TTCTTTG-3'および5'-GGGGGAGCTCGAACTTAATAAAAAAGAGGAG-3'を用いる増幅によっ
て得た。次に、発現カセットpUCPfyfgBインサートに挿入した。このために、pUC
Pfgcpeをインサート中でPac Iで開き、突出部をＴ４およびクレノウＤＮＡポリ
メラーゼで完成した。増幅した発現カセットをリン酸化して「平滑末端」連結を
介して挿入し、その結果としてpPfyfgBKOを得た。
【００３８】
電気穿孔によるトランスフェクションのため、１０cm培養皿の感染した赤血球
（3D7株、主としてリング期(ring stages)、約１５％が寄生虫血症）をペレット
化して０．８ml Cytomix（１２０mM ＫＣｌ; ０．１５mM ＣａＣｌ２; ２mM Ｅ
ＧＴＡ; ５mM ＭｇＣｌ２; １０mM Ｋ２ＨＰＯ４/ＫＨ２ＰＯ４; ２５mM ＨＥＰ
ＥＳ, ｐＨ７．６）に再懸濁させ、これはpPfyfgBKO由来のプラスミドＤＮＡ１
５０μgを含んでいた。電気穿孔は、４mm細胞で２．５kV、２００オームおよび
２５μFにて行った。次に、寄生生物を培養皿上に沈澱させ、インキュベーショ
ンした。トランスフェクションの４８時間後、４００nMピリメタミンを培地に加
え、更に４８時間後ピリメタミン濃度を１００nMに減少させた。１８日後、顕微
鏡下で耐性寄生生物を検出することができた。６週間後、ピリメタミン濃度を更
に３週間２μMまで増加させた。寄生生物を９６穴細胞培養プレート上で限界希
釈によってクローニングし、ピリメタミンの非存在下にて１１日間培養した。次
に、１μMピリメタミンを再度加えた。エピソーム性プラスミドはピリメタミン
の非存在下における培養によって失われ、それに続く回復した選択中にプラスミ
ドを染色体に組込んだ寄生生物のみが生き残ることができる。寄生生物クローン
は、ピリメタミンの新たな添加により、全く生き残らなかった。この結果は、不
活性化したyfgB遺伝子を有する寄生生物は生育することができず、従ってこの遺
伝子は本質的であることを示唆している。最近の知見によれば、Plasmodium属は
系統発生的には下等藻類に近い(Fichera, M. E. and Roos, D. S. (1997) Natur
e, 390, 407-409; Koehler, S, Delwiche, C. F., Denny, P. W., Tilney, L. G
., Webster, P., Wilson, R. J. M., Palmer, J. D. and Roos, D. S. (1997) N
ature, 275, 1485-1489)。従って、yfgB遺伝子は植物にとっても本質的であると
思われると推定される。
（3D7株、主としてリング期(ring stages)、約１５％が寄生虫血症）をペレット
化して０．８ml Cytomix（１２０mM ＫＣｌ; ０．１５mM ＣａＣｌ２; ２mM Ｅ
ＧＴＡ; ５mM ＭｇＣｌ２; １０mM Ｋ２ＨＰＯ４/ＫＨ２ＰＯ４; ２５mM ＨＥＰ
ＥＳ, ｐＨ７．６）に再懸濁させ、これはpPfyfgBKO由来のプラスミドＤＮＡ１
５０μgを含んでいた。電気穿孔は、４mm細胞で２．５kV、２００オームおよび
２５μFにて行った。次に、寄生生物を培養皿上に沈澱させ、インキュベーショ
ンした。トランスフェクションの４８時間後、４００nMピリメタミンを培地に加
え、更に４８時間後ピリメタミン濃度を１００nMに減少させた。１８日後、顕微
鏡下で耐性寄生生物を検出することができた。６週間後、ピリメタミン濃度を更
に３週間２μMまで増加させた。寄生生物を９６穴細胞培養プレート上で限界希
釈によってクローニングし、ピリメタミンの非存在下にて１１日間培養した。次
に、１μMピリメタミンを再度加えた。エピソーム性プラスミドはピリメタミン
の非存在下における培養によって失われ、それに続く回復した選択中にプラスミ
ドを染色体に組込んだ寄生生物のみが生き残ることができる。寄生生物クローン
は、ピリメタミンの新たな添加により、全く生き残らなかった。この結果は、不
活性化したyfgB遺伝子を有する寄生生物は生育することができず、従ってこの遺
伝子は本質的であることを示唆している。最近の知見によれば、Plasmodium属は
系統発生的には下等藻類に近い(Fichera, M. E. and Roos, D. S. (1997) Natur
e, 390, 407-409; Koehler, S, Delwiche, C. F., Denny, P. W., Tilney, L. G
., Webster, P., Wilson, R. J. M., Palmer, J. D. and Roos, D. S. (1997) N
ature, 275, 1485-1489)。従って、yfgB遺伝子は植物にとっても本質的であると
思われると推定される。
【００３９】例３
：yfgBはEscherichia coliにとって本質的である。遺伝子置換プラスミドpKO3-ΔyfgBの構築
pKO3ベクターを用いて、E. coliの欠失変異体を産生した(Link, A. J.; Phill
ips, D.; Church, G. M.; J. Bacteriol. 179, 6228-6237)。欠失構築物を産生
するため、yfgB遺伝子の下流と上流の２個の配列を２つの非対称ＰＣＲバッチに
おいて増幅した。プライマーを１：１０のモル比（５０nMおよび５００nM）で用
いた。２つのＰＣＲ産物を、二回目のＰＣＲ増幅において一方の産物に融合した
。産物をpCR-TA-TOPO Cloning Kit (Invitrogen)を用いてクローニングし、制限
開裂部位Bam HIおよびSal Iを介してpKO3ベクターにクローニングした。下記の
プライマーを用いた。 yfgB-N-out, 5'-AGGATCCtccatcatcaaaccgaac-3' yfgB-N-in, 5'-TCＣＣＡＴＣＣＡＣＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＣＡＴctattccggcctcg
ttat-3' yfgB-C-in, 5'-ＡＴＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧGaagcggtctgatagc
catt-3' yfgB-C-out, 5'-AGTCGACaagtggagcctgcttttc-3'. 制限開裂部位には、下線を施してある。２１bpの「イン・フレーム」挿入を画定
する重複配列は、太文字（全角文字）で印刷してある。
ips, D.; Church, G. M.; J. Bacteriol. 179, 6228-6237)。欠失構築物を産生
するため、yfgB遺伝子の下流と上流の２個の配列を２つの非対称ＰＣＲバッチに
おいて増幅した。プライマーを１：１０のモル比（５０nMおよび５００nM）で用
いた。２つのＰＣＲ産物を、二回目のＰＣＲ増幅において一方の産物に融合した
。産物をpCR-TA-TOPO Cloning Kit (Invitrogen)を用いてクローニングし、制限
開裂部位Bam HIおよびSal Iを介してpKO3ベクターにクローニングした。下記の
プライマーを用いた。 yfgB-N-out, 5'-AGGATCCtccatcatcaaaccgaac-3' yfgB-N-in, 5'-TCＣＣＡＴＣＣＡＣＴＡＡＡＣＴＴＡＡＡＣＡＴctattccggcctcg
ttat-3' yfgB-C-in, 5'-ＡＴＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＡＧＴＧＧＡＴＧＧGaagcggtctgatagc
catt-3' yfgB-C-out, 5'-AGTCGACaagtggagcctgcttttc-3'. 制限開裂部位には、下線を施してある。２１bpの「イン・フレーム」挿入を画定
する重複配列は、太文字（全角文字）で印刷してある。
【００４０】欠失変異体wtΔyfgBの構築
「遺伝子置換」実験は、文献に記載されているのと同様の方法で行った(Link,
A. J.; Phillips, D.; Church, G. M.; J. Bacteriol. 179, 6228-6237)。プラ
スミドpKO3-ΔyfgBを、E. coli K-12株DSM No.498(ATCC23716)に形質転換した。
３０℃で１時間インキュベーションした後、組込まれたプラスミドを有する細菌
を、４３℃までの温度シフトにより選択した。続いて、スクロース耐性およびク
ロラムフェニコール感受性について試験することによって、ベクター配列を喪失
した細菌を選択した後、ＰＣＲによって所望な遺伝子型について分析を行った。
yfgB欠失を有する細菌は見出されず、このことは、yfgB遺伝子がE. coliにとっ
て本質的であることを示している。
A. J.; Phillips, D.; Church, G. M.; J. Bacteriol. 179, 6228-6237)。プラ
スミドpKO3-ΔyfgBを、E. coli K-12株DSM No.498(ATCC23716)に形質転換した。
３０℃で１時間インキュベーションした後、組込まれたプラスミドを有する細菌
を、４３℃までの温度シフトにより選択した。続いて、スクロース耐性およびク
ロラムフェニコール感受性について試験することによって、ベクター配列を喪失
した細菌を選択した後、ＰＣＲによって所望な遺伝子型について分析を行った。
yfgB欠失を有する細菌は見出されず、このことは、yfgB遺伝子がE. coliにとっ
て本質的であることを示している。
【配列表】
─────────────────────────────────────────────────────
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(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｂ０６５
1/21 7/00 ４Ｈ０４５
5/10 9/00
7/00 Ｃ１２Ｑ 1/02
9/00 1/25
Ｃ１２Ｑ 1/02 1/70
1/25 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ
1/70 Ｚ
Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ
Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
33/50 5/00 Ｃ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，
ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ
Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ
，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，
ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ
Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ
，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2B030 AA07 AD08 CA06 CA17 CA19
CB03 CD03 CD07 CD09
2G045 AA40 BA13 BB03 BB20 CB01
CB20 CB21 DA12 DA13 DA14
DA20 DA36 FB01 FB02 FB04
4B024 AA01 AA07 AA08 AA11 BA07
CA04 DA01 DA05 DA06 DA11
DA12 EA01 EA02 EA04 FA02
FA06 GA14 HA11
4B050 CC03 DD01 LL01 LL03 LL10
4B063 QA01 QQ21 QS02
4B065 AA26X AA57X AA72X AA86Y
AA89X AB01 BA03 CA27
CA44 CA46 CA47 CA53
4H045 AA20 AA30 BA10 CA22 DA89
EA05 EA06 EA20 EA50 FA74
GA21 GA30
Claims (21)
- 【請求項１】 配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、ＤＮ
Ａ配列、または、配列番号５に記載のポリペプチドの類似体または誘導体であっ
て、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に減少させることなく１種類以上のアミ
ノ酸が欠失され、付加され、または他のアミノ酸で置換されているものをコード
する、ＤＮＡ配列。 - 【請求項２】 配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のＤＮＡ配列。
- 【請求項３】 配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、Ｄ
ＮＡ配列または、配列番号１４に記載のポリペプチドの類似体または誘導体であ
って、該ポリペプチドの酵素作用を実質的に減少させることなく１種類以上のア
ミノ酸が欠失され、付加され、または他のアミノ酸で置換されているものをコー
ドする、ＤＮＡ配列。 - 【請求項４】 配列番号９に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３に記載のＤＮＡ配列。
- 【請求項５】 機能調節シグナル、特にプロモーター、オペレーター、エンハンサーおよびリ
ボソーム結合部位をさらに有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ
配列。 - 【請求項６】 下記の部分配列ｉ）〜iii）を有する、ＤＮＡ配列： i) ウイルス、真核生物、および原核生物において活性であって、目的とする
ターゲット組織またはターゲット細胞においてＲＮＡを確実に形成する、プロモ
ーター、 ii) 配列番号５または１４に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、
または配列番号５または１４に記載の類似体または誘導体をコードする、ＤＮＡ
配列、 iii) ウイルス、真核生物、および原核生物においてＲＮＡの３′−末端にポ
リ−Ａ基を付加する３′−非翻訳配列。 - 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか一項に記載の１個以上のＤＮＡ配列を含んでなる、発
現ベクター。 - 【請求項８】 １−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−ホスフェート代謝経路に関与するタンパ
ク質であって、 a) 配列番号１または９のＤＮＡ配列によってコードされるか、 b) 配列番号１または９のＤＮＡ配列と、または成熟タンパク質をコードする
ＤＮＡ領域におけるこれらのＤＮＡ配列の断片とハイブリダイズするＤＮＡ配列
によってコードされるか、または c) 遺伝子暗号の縮重なしにb)に定義した配列とハイブリダイズし且つ相当す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列によってコードさ
れる、タンパク質。 - 【請求項９】 配列番号５または１４のアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のタンパク質
。 - 【請求項１０】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、植物細胞。
- 【請求項１１】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含むものから再生される、
形質転換植物細胞およびトランスジェニック植物。 - 【請求項１２】 請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、イ
ソプレノイド発現を有するトランスジェニックのウイルス、真核生物、および原
核生物。 - 【請求項１３】 LytBおよびYfgBタンパク質の酵素活性を測定するための、請求項１〜４のいず
れか一項に記載のＤＮＡ配列の使用。 - 【請求項１４】 ウイルスおよび真核および原核細胞のイソプレノイド含量を変更、特に増加す
るための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列の使用。 - 【請求項１５】 LytBおよびYfgBタンパク質に対して阻害作用を有する物質を同定するための、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡ配列の使用。 - 【請求項１６】 寄生生物または壊滅(broken-down)寄生生物の培養上清をクロマトグラフィー
および電気泳動法によって精製することを特徴とする、請求項８に記載のタンパ
ク質を分離する方法。 - 【請求項１７】 タンパク質が、外来ＤＮＡのウイルス、原核または真核発現の産物であること
を特徴とする、請求項８に記載のタンパク質を分離する方法。 - 【請求項１８】 LytBおよびYfgBタンパク質の酵素活性の測定方法であって、基質、補助基質、
および産物の濃度変化を測定することを特徴とする、方法。 - 【請求項１９】 イソプレノイド発現を有するトランスジェニックのウイルス、真核生物および
原核生物の産生方法であって、請求項４または５に記載のＤＮＡ配列を、プラス
ミドを用いてまたは用いることなく、ウイルス、真核細胞および原核細胞のゲノ
ムに導入または組込むことを特徴とする、方法。 - 【請求項２０】 化合物のスクリーニング方法であって、 a) 組換え発現ベクターであって、配列番号１または配列番号９に記載のオリ
ゴヌクレオチド配列、またはこれの変異体または類似体の少なくとも一部を有す
るベクターを含む宿主細胞と、更にヒトおよび動物において抗真菌、抗生物質、
抗寄生生物または抗ウイルスの作用を有すると思われる化合物とを提供し、 b) 微生物をこの化合物と接触させ、 c) 化合物の抗真菌、抗生物質、抗寄生生物または抗ウイルスの活性を測定す
る ことを含んでなる、方法。 - 【請求項２１】 化合物のスクリーニング方法であって、 a) 組換え発現ベクターであって、配列番号1または配列番号９に記載のオリゴ
ヌクレオチド配列、またはこれの変異体または類似体の少なくとも一部を有する
ベクターを含む宿主細胞と、更にヒトおよび動物において抗真菌、抗生物質、抗
寄生生物または抗ウイルスの作用を有すると思われる化合物とを提供し、 b) 微生物をこの化合物と接触させ、 c) 化合物の殺菌、殺真菌または除草の活性を測定する ことを含んでなる、方法。
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