JP5841935B2 - 抗真菌薬標的 - Google Patents

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Description

本発明は、真菌ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＢタンパク質（phosphopantetheinyl transferase B proteins）（ＰＰＴＢ）及び抗真菌薬標的としてのそれらの使用、ＰＰＴＢ阻害剤のスクリーニング方法及び抗真菌化合物としてのそれらの使用、並びにそれらを含有する医薬組成物及び医薬における（具体的には抗真菌感染（antifungal infection）にかかりやすいか又はかかっている個体の治療における）それらの使用に関する。特に、該化合物は、例えばAspergillus及びCandida種の真菌により引き起こされる全身性又は局所性真菌感染の治療における使用を見出す。
発明の背景
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴ）は、コエンザイムＡ由来のホスホパンテテイニル基の付加により、それらの基質タンパク質を修飾する。S. cerevisiaeにおいては、３つのＰＰＴが存在する：ＬＹＳ５（ＰＰＴＡ）は、α−アミノアジピン酸レダクターゼ（リジン生合成経路の酵素）の活性化に必要であり、且つシデロホア及びポリケチド合成に重要である；ＰＰＴ２（ＰＰＴＢ）は、ミトコンドリアアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）（ミトコンドリア脂肪酸生合成に関与する）をパンテテイニル化する（pantetheinylates）；そしてＦＡＳ２脂肪酸合成酵素αサブユニット（細胞質脂肪酸合成に関与するＰＰＴ機能を有する、マルチドメインタンパク質である）。これらのＰＰＴはAspergillus fumigatus及びCandida albicansなどの他の真菌においても見出され、そしてＰＰＴＡ及びＰＰＴＢの相同体は細菌において見出され、ＰＰＴＡはサーファクチン合成酵素−活性化酵素（ｓｆｐ）ファミリーの細菌タンパク質に類似しており、ＰＰＴＢは細菌アシルキャリアータンパク質合成酵素に類似している。ＰＰＴＡは動物において見出されるが、ＰＰＴＢは見出されない。
ＰＰＴＢの特徴づけ及びＰＰＴＢの阻害剤を検出することが可能なスクリーニング方法の開発に基づき、本発明者らは、抗真菌薬を取得する新たな方法を解明した。本発明の一態様は、ＰＰＴＢが真菌において必須であるとの知見に関わる。本発明は、ハイスループットスクリーニングに適した、ｉｎ ｖｉｔｒｏで真菌ＰＰＴＢをアッセイする方法を提供することも目的とする。本発明は、真菌ＰＰＴＢの阻害剤をスクリーニングする方法も提供する。
また、本発明者らは、真菌（例えばC. albicans）は２つのＡＣＰ分子を有し得るが、その一方のみがＰＰＴＢの基質として適していることを見出した。更に、本発明者らは、驚くほど安定な反応生成物をもたらし且つアッセイが行なわれた後少なくとも５日間試料を読み取り可能にするアッセイ条件を特定し、その結果、多数の試料が処理され得る。
従って、本発明は以下を提供する：
−抗真菌剤の同定方法であって、候補化合物が
（ｉ）配列番号１０又は配列番号１９によって示される配列を含むＰＰＴＢタンパク質、
（ｉｉ）（ｉ）の相同体であるＰＰＴＢタンパク質、
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）と少なくとも５０％の同一性を有するタンパク質、
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の変異体又は断片（該断片は少なくとも５０アミノ酸の長さを有する）を含むタンパク質、
に結合するか否か又はこれを阻害するか否かを決定することを含み、
ここで（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の結合又は阻害は候補物質が抗真菌剤であることを示す、方法、
−抗真菌剤を同定するか又は取得するための、該方法の使用、
−抗真菌化合物としての使用のための、真菌ＰＰＴＢ機能を障害する、該方法によって同定される化合物、
−真菌感染の予防又は治療のための医薬の製造における、該方法によって同定される抗真菌剤の使用、
−本発明のスクリーニング方法によって同定される抗真菌剤を投与することを含む、真菌感染の予防又は治療方法、
−ＰＰＴＢ阻害剤及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
配列の説明
配列番号１及び２；A. fumigatusにおけるＰＰＴＢノックアウトのためのプライマー
配列番号３；プラスミドpMB4 zeo
配列番号４−６；ＰＰＴＢ遺伝子におけるトランスポゾン挿入部位の確認のためのプライマー
配列番号７；A. fumigatus ＰＰＴＢコード配列
配列番号８及び９；ＰＰＴＢノックアウト形質転換体のスクリーニングのためのプライマー
配列番号１０；A. fumigatus ＰＰＴＢタンパク質配列
配列番号１１；A. fumigatus ＡＣＰコード配列
配列番号１２；A. fumigatus ＡＣＰタンパク質配列
配列番号１３及び１４；A. fumigatus ＰＰＴＢのＰＣＲのためのプライマー
配列番号１５及び１６；A. fumigatus ＡＣＰのＰＣＲのためのプライマー
配列番号１７；ＰＣＲによって生成されたＡＣＰ配列
配列番号１８；C. albicans ＰＰＴＢコード配列
配列番号１９；C. albicans ＰＰＴＢタンパク質配列
配列番号２０及び２１；C. albicans ＰＰＴＢのＰＣＲのためのプライマー
配列番号２２；C. albicans ＡＣＰｇコード配列
配列番号２３；C. albicans ＡＣＰｇタンパク質配列
配列番号２４；C. albicans ＡＣＰｅコード配列
配列番号２５；C. albicans ＡＣＰｅタンパク質配列
配列番号２６及び２７；C. albicans ＡＣＰｇのＰＣＲのためのプライマー
配列番号２８及び２９；C. albicans ＡＣＰｅのＰＣＲのためのプライマー
配列番号３０及び３１；C. albicans ＰＰＴＢ遺伝子の５’領域のＰＣＲのためのプライマー；
配列番号３２及び３３；ＵＲＡ３−ＭＥＴ３コンストラクトの作製のためのプライマー；
配列番号３４及び３５；C. albicans ＰＰＴＢコード配列の最初の３９４ｂｐの増幅のためのプライマー；
配列番号３６及び３７；C. albicansにおけるＰＰＴＢノックアウトのためのプライマー
配列番号３８及び３９；ＰＰＴＢノックアウト形質転換体のスクリーニングのためのプライマー；
配列番号４０及び４１：ＰＰＴＢノックアウト形質転換体のスクリーニングのためのプライマー；
配列番号４２及び４３：ＰＰＴＢノックアウト形質転換体のスクリーニングのためのプライマー；
配列番号４４；ＰＰＴＢノックアウト形質転換体のスクリーニングのためのプライマー
発明の詳細な説明
上述のように、本発明は、抗真菌剤を同定するための、真菌ＰＰＴＢ及びＡＣＰタンパク質（真菌ＰＰＴＢ及びＡＣＰタンパク質の相同体及び／又は断片を含む）のものであるか又はそれらに由来する、特定のタンパク質配列（本明細書中「本発明のタンパク質」と称する）の使用に関する。本発明の方法は、可能性のある抗真菌剤として化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
本発明のタンパク質
本明細書中で使用される場合、ＰＰＴＢタンパク質（ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼＢ）は、コエンザイムＡ由来の４’−ホスホパンテテイン基のアシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）への転移を触媒することができる酵素として定義され得る。本発明のＰＰＴＢは一般に、酵素委員会の分類ＥＣ ２．７．８．−に入る。
本明細書中で使用される場合、用語必須真菌遺伝子は、真菌において遺伝的に破壊された場合（例えば発現しない場合）、最少培地若しくは合成培地（defined medium）上で、又はこの真菌を感染させたモルモット、マウス、ウサギ若しくはラットにおいて、該細胞の生存を妨げるか又は増殖を著しく遅らせるものとして定義され得る。
本明細書中で使用される場合、用語抗真菌剤は、真菌の増殖を遅らせるか、破壊するか若しくは妨げる薬剤、真菌感染を治療するために使用される薬剤、又は宿主に対する最小限の毒性で宿主から真菌病原体を選択的に除去する薬剤として定義され得る。化合物の抗真菌効果（antifungal efficacy）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば真菌の培養物を用いて）、又はｉｎ ｖｉｖｏで（例えば感染宿主において）測定され得る。
本発明のタンパク質（又は真菌ＰＰＴＢタンパク質若しくはＡＣＰ）は、そのファミリーの別のメンバーに対する配列類似性によって定義され得る。上述のように、この類似性は、（例えば配列番号１０、１２、１９又は２３の配列に対する）パーセント同一性に基づいてもよい。或いは、ＰＰＴＢタンパク質は、ＰＦＡＭ ４’−ホスホパンテテイントランスフェラーゼスーパーファミリーのメンバーとして特定されるタンパク質として定義され得る；ＡＣＰは、InterproプロファイルIPR003231、IPR006162、IPR006163又はIPR009081と一致するタンパク質として定義され得る。
本発明のタンパク質は、例えば本発明の方法において使用される場合、単離された形態（非細胞形態など）であり得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、ＰＰＴＢ又はＡＣＰを含む。タンパク質は、天然タンパク質、合成タンパク質又は組換えタンパク質を含み得る。タンパク質は、天然タンパク質、合成タンパク質又は組換えタンパク質の組合せを含み得る。本発明のタンパク質は、天然に存在するＰＰＴＢ又はＡＣＰタンパク質と同じか又は異なる配列を有し得る。タンパク質配列は、ｄｅ ｎｏｖｏ合成され得るか、又は天然アミノ酸／タンパク質配列、若しくはその誘導体であり得る。
本明細書中、用語「から単離された（isolated from）」は、「の（of）」と読まれ得ることが理解される。従って、特定の生物「から単離された」タンパク質への言及は、合成又は組換えなどの、それらをこの生物から取得すること以外の手段によって調製されたタンパク質を含む。
好ましくは、タンパク質は、真菌、より好ましくは糸状菌、なおより好ましくは子嚢菌から単離される。
好ましくは、本発明のタンパク質は、以下の属から独立に選択される生物から単離される: Absidia; Acremonium; Alternaria; Aspergillus; Bipolaris; Blastomyces; Blumeria; Candida; Cladosporium; Coccidioides; Colletotrichium; Cryptococcus; Curvularia; Encephalitozoon; Epicoccum; Epidermophyton; Exophiala; Exserohilum; Fonsecaea; Fusarium; Histoplasma; Leptosphaeria; Microsporum; Mycosphaerella; Neurospora; Paecilomyces; Paracoccidioides; Penicillium; Phialophora; Phytophthora; Plasmopara; Pneumocystis; Pseudallescheria; Pyricularia; Pythium; Puccinia; Rhizoctonia; Rhizomucor; Rhizopus; Saccharomyces; Scedosporium; Scopulariopsis; Sporothrix; Trichophyton; Trichosporon; Ustilago及びWangiella。
好ましくは、本発明のタンパク質は、以下の種から選択される生物から単離される: Absidia corymbifera; Acremonium spp.: Alternaria alternata; Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; Aspergillus niger; Aspergillus parasiticus; Aspergillus terreus; Bipolaris spp.; Blastomyces dermatitidis; Blumeria graminis; Candida albicans; Candida glabrata; Candida krusei; Candida parapsilosis; Candida tropicalis; Cladosporium carrionii; Cladosporium cladosporoides; Cladosporium herbarium; Coccidioides immitis; Coccidioides posadasii; Curvularia lunata; Colletotrichium trifolii; Cryptococcus neoformans; Encephalitozoon cuniculi; Epicoccum nigrum; Epidermophyton floccosum; Exophiala spp.; Exserohilum rostratum; Fonsecaea pedrosoi; Fusarium graminarium; Fusarium solani; Fusarium sporotrichoides; Histoplasma capsulatum; Leptosphaeria nodorum; Microsporum canis; Mycosphaerella graminicola; Paecilomyces lilanicus; Paecilomyces varioti; Paracoccidioides brasiliensis; Penicillium chrysogenum; Phialophora verrucosa; Phytophthora capsici; Phytophthora infestans; Plasmopara viticola; Pneumocystis jiroveci; Puccinia coronata; Puccinia graminis; Pyricularia oryzae; Pythium ultimum; Rhizoctonia solani; Rhizomucor spp.: Rhizopus spp.; Saccharomyces spp.; Scedosporium apiospermum; Scedosporium prolificans; Scopulariopsis brevicaulis; Sporothrix spp.; Trichophyton mentagrophytes; Trichophyton interdigitale; Trichophyton rubrum; Trichosporon asahii; Trichosporon beigelii及びUstilago maydis。
好ましくは、タンパク質は、Aspergillus属又はCandida属の生物から単離される。
好ましくは、タンパク質は、Aspergillus fumigatus種又はCandida albicans種の生物から単離される。
上述したタンパク質の変異体も提供され、それらは後述される。
一実施形態において、本発明のタンパク質は、配列番号１０、１２、１９若しくは２３に示される配列と実質的に類似のアミノ酸配列、又はその変異体を含む。
用語「天然アミノ酸／タンパク質」とは、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで生物源から天然に産生されるアミノ酸又はタンパク質を意味する。
用語「合成アミノ酸／タンパク質」とは、当該分野において公知のタンパク質合成装置を使用して、人工的に又はｄｅ ｎｏｖｏで製造されたアミノ酸又はタンパク質を意味する。
用語「組換えアミノ酸／タンパク質」とは、熟練した技術者に公知の組換えＤＮＡ又はタンパク質技術又は方法論を使用して製造されたアミノ酸又はタンパク質を意味する。
用語「相同体」とは、共通の祖先に起因して、類似又は同一の機能を有するタンパク質を意味する。例えば、A. fumigatus及びC. albicans（それらは共通の真菌祖先を共有すると考えられる）のＰＰＴＢタンパク質は、相同であると言われる。相同タンパク質は、配列レベルにおいてパーセント同一性を算出することによって比較され得る。
用語「変異体」、及び用語「実質的に類似の」は、本明細書中、関連する配列をいうために使用される。後述されるように、このような関連する配列は、典型的には、例えば配列の全長にわたり、又は所定の長さの一部分にわたり、所定の配列と相同である（所定の配列とパーセント同一性を共有する）。関連する配列は、この配列又は相同配列の断片でもあり得る。変異体タンパク質は、変異体ポリヌクレオチドによってコードされ得る。
用語「変異体」、及び用語「実質的に類似の」とは、配列が、言及された配列のいずれか１つのアミノ酸／タンパク質配列と、少なくとも３０％、好ましくは４０％、より好ましくは５０％、そしてなおより好ましくは、６０％の配列同一性を有することを意味する。言及された配列のいずれかに６５％よりも高い同一性を有するアミノ酸／タンパク質配列も想定される。言及された配列のいずれかと７０％よりも高い同一性を有するアミノ酸／タンパク質配列も想定される。言及された配列のいずれかと７５％よりも高い同一性を有するアミノ酸／タンパク質配列も想定される。言及された配列のいずれかと８０％よりも高い同一性を有するアミノ酸／タンパク質配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／タンパク質配列は、言及された配列のいずれかと８５％の同一性、より好ましくは９０％の同一性、なおより好ましくは９２％の同一性、なおより好ましくは９５％の同一性、なおより好ましくは９７％の同一性、なおより好ましくは９８％の同一性、そして最も好ましくは言及された配列のいずれかと９９％の同一性を有する。「実質的に類似の」配列は、関連する配列と同一であり得る。
上述したパーセント同一性は、原配列の全長にわたり、又は原配列の１５、２０、５０若しくは１００アミノ酸の領域にわたり、測定され得る。好ましい実施形態において、パーセント同一性は、配列番号１０、１２、１９又は２３に対して測定される。好ましくは変異体タンパク質は、配列番号１０、１２、１９若しくは２３、又は配列番号１０、１２、１９若しくは２３の一部分と、少なくとも４０％の同一性（少なくとも６０％、又は少なくとも８０％の同一性、又は少なくとも９０％など）を有する。
パーセント同一性は、アラインメントから（Ｎ／Ｔ）＊１００（ここで、Ｎは、２つの配列が同一の残基を共有する位置の数であり、そしてＴは、比較される位置の総数である）として算出される。或いは、パーセント同一性は、（Ｎ／Ｓ）＊１００（ここで、Ｓは、比較されているより短い配列の長さである）として算出され得る。
或いは、実質的に類似のタンパク質は、配列番号１０、１２、１９又は２３に示される配列から、少なくとも１アミノ酸（しかし５、１０、２０、５０又は１００アミノ酸未満）異なってもよい。このような違いは、それぞれ付加、欠失又は置換であり得る。
用語「変異体」、及び用語「実質的に類似の」は、関連するアミノ酸／タンパク質配列の断片（上記言及された、相同配列（特定の配列とパーセント同一性を有する）の断片を含む）も含む。アミノ酸／タンパク質断片は、典型的には、少なくとも１０アミノ酸（少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００又は５００アミノ酸など）を含む。断片は、タンパク質のいずれか又は両方の末端から、少なくとも３アミノ酸（少なくとも５、７、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又は１１０アミノ酸など）欠いてもよい。
他の適切な変異体は、相同なヌクレオチド配列を有するが、保存的変化を生じさせるために、置換するアミノ酸と同様の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変された配列の全部、又は一部を含むものである。例えば、小さく、非極性で、疎水性のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン及びメチオニンが挙げられる。大きく、非極性で、疎水性のアミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。極性で、中性のアミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。Candidaを含む特定の生物が、大多数の真核生物で使用されているコドンと比較して、非標準的なコドンを使用することが知られている。このような生物に由来するポリヌクレオチド及びタンパク質と本明細書に示される配列とのいかなる比較も、これらの差異を考慮に入れるべきである。
タンパク質配列における他の修飾（即ち、例えばアセチル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、タンパク質分解による切断又はリガンドへの結合によって、翻訳中又は翻訳後に生じる修飾）も想定され、特許請求される発明の範囲内である。
本発明のタンパク質は、好ましくはその誘導体又は変異体を生じさせるために、使用前に修飾され得る。タンパク質は、誘導体化され得る。タンパク質は、エピトープタグ化、融合パートナー又は精製タグ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ＮＵＳタグ、複数のヒスチジン又はマルトース結合タンパク質など）の付加、緑色蛍光タンパク質の付加、ビオチン若しくは蛍光タグ、発色団を含む分子の共有結合、セレノメチオニンの組み込み、放射性同位元素又は蛍光性／非蛍光性ランタニドキレートの封入又は付着によって、或いは上記タグ、タンパク質又はエピトープをコードする配列の付加によって、修飾され得る。
本発明のタンパク質は、融合タンパク質として使用され得、それは、別のタンパク質（又はその一部；好ましくは、タンパク質の少なくとも１０、２０又は５０アミノ酸の部分）のアミノ酸配列に、随意にＮ末端又はＣ末端において、共有結合（例えばペプチド結合）を介して融合された、ＰＰＴＢ若しくはＡＣＰポリペプチド又はその断片として定義される。
スクリーニング方法
本発明は、本発明のＰＰＴＢタンパク質の活性の阻害剤などの、ＰＰＴＢタンパク質のモジュレーターを同定するために使用され得るスクリーニング方法を提供する。この方法の一実施形態において、候補物質を本発明のＰＰＴＢタンパク質と接触させ、候補物質がタンパク質に結合するか又はタンパク質を調節するか否かが決定される。
モジュレーターは、タンパク質の活性を促進（刺激）又は阻害（拮抗）し得る。治療的モジュレーター（真菌感染に対する）は、本発明のタンパク質の活性を阻害する。
任意の適切な結合又は活性アッセイが使用され得る。候補物質がタンパク質に結合できるか否かを決定する方法は、候補物質にタンパク質を提供すること、及び、例えばタンパク質に結合する候補物質の量を測定することにより、結合が起こるか否かを決定することを含み得る。結合は、結合時に変化するタンパク質の特徴（分光学的変化など）を測定することにより決定され得る。結合は、候補の存在下及び非存在下において、反応基質又は生成物のレベルを測定し、このレベルを比較することにより測定され得る。結合は、候補の存在下及び非存在下において、反応の基質から標識を転移させること及び／又は反応の生成物へ標識を転移させることにより測定され得る。標識は、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団又は酵素であり得る。
本方法は、競合的結合法であり得る。これは、候補が、タンパク質に結合することが知られている薬剤（タンパク質に特異的な抗体又はタンパク質の基質など）へのそのタンパク質の結合を阻害することができるか否かを決定する。
候補物質がタンパク質の活性を調節するか否かは、タンパク質の活性を許容する条件下でそのタンパク質に候補物質を提供すること、及び候補物質が生成物の活性を調節することができるか否かを決定することにより決定され得る。
測定される活性は、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ活性などの本明細書中で言及される本発明のＰＰＴＢタンパク質の活性のいずれかであり得る。一実施形態において、スクリーニング方法は、候補物質の存在下又は非存在下でホスホパンテテイントランスフェラーゼ反応を行い、候補物質が本発明のタンパク質のトランスフェラーゼ活性を阻害するか否かを決定することを含み、ここでトランスフェラーゼ反応は、候補物質の非存在下ではタンパク質がＡＣＰのパンテテイニル化を触媒する条件下で、前記タンパク質をＡＣＰ及びコエンザイムＡと接触させることにより行なわれる。
好ましい実施形態において、ホスホパンテテイントランスフェラーゼ反応の阻害は、例えば蛍光標識されたコエンザイムＡを使用して蛍光ＡＣＰの生成を測定することにより、ＡＣＰに転移されたホスホパンテテインの量を検出することにより測定される。これは、蛍光偏光法を使用して測定され得る。本発明の更に好ましい実施形態において、ＡＣＰは、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲで標識されるが、他のフルオロフォアも使用され得る。
或いは、パンテテイニル基の転移は、標識されたコエンザイムＡ及び標識されたＡＣＰを使用して、蛍光共鳴エネルギー転移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）（ＦＲＥＴ）により測定され得る。
上記方法において試験され得る適切な候補物質としては、コンビナトリアルライブラリー、明確な化学的実体（defined chemical identities）、ペプチド及びペプチド模倣体、オリゴヌクレオチド並びに天然物のライブラリー（ディスプレイライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリー）など）が挙げられる。候補物質は化合物であり得る。例えば、反応当たり１０個の物質の初期のスクリーニング（screen）において候補物質のバッチが使用され得、阻害を示すバッチ由来の物質が個別に試験される。抗体産物（例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体並びにＣＤＲ移植抗体）も試験され得る。
本発明者らは、アッセイ生成物が驚くほど安定であり、アッセイが行なわれた後少なくとも５日までマイクロウェルプレートを読み取り可能にするような条件を特定した。従って、本発明の一実施形態において、アッセイは、随意に、以下の条件下で行なわれる：５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、及び／又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び／又はｐＨ６．７５で、及び／又は１％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ、及び／又は酵素活性が時間及びタンパク質濃度に関して直線範囲内にあるようなＰＰＴＢ酵素濃度で、及び／又は２０〜４０分間インキュベートされ、及び／又は室温においてインキュベートされ、及び／又は停止試薬が６０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０であり、及び／又はアッセイが＞０．７０のＺ’値を有し、及び／又はアッセイが＜４％の％ＣＶ１００％値を有し、及び／又はアッセイが＞１５のＷ値を有する。
本発明の別の実施形態において、アッセイは、随意に、以下の条件下で行なわれる：１０ｍＭ〜５００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、好ましくは２０ｍＭ〜２００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、より好ましくは３５ｍＭ〜１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、最も好ましくは５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ；及び／又は１〜５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、好ましくは２〜２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、より好ましくは５〜１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、最も好ましくは１０ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び／又はｐＨ４〜ｐＨ９で、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ８で、より好ましくはｐＨ６〜ｐＨ７で、最も好ましくはｐＨ６．７５で；及び／又は０％〜１０％ＤＭＳＯ、好ましくは０．１％〜５％ＤＭＳＯ、より好ましくは０．５％〜２％ＤＭＳＯ、最も好ましくは１％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを用いて；及び／又は酵素活性が時間及びタンパク質濃度に関して直線範囲内にあるようなＰＰＴＢ酵素濃度で；及び／又は２分間〜５時間、好ましくは１０分間〜２．５時間、より好ましくは１５分間〜１時間、最も好ましくは２０〜４０分間インキュベートされ；及び／又は５℃〜３７℃、好ましくは１０℃〜２５℃、より好ましくは１５℃〜２０℃、最も好ましくは室温でインキュベートされ；及び／又は停止試薬が１０〜５００ｍＭの濃度で且つｐＨ５．０〜１０．０のＥＤＴＡ、好ましくは２０〜２５０ｍＭの濃度で且つｐＨ６．０〜９．０のＥＤＴＡ、より好ましくは４０〜１００ｍＭの濃度で且つｐＨ７．０〜９．０のＥＤＴＡ、最も好ましくは６０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０であり；及び／又はアッセイが＞０．５０、好ましくは＞０．６０、より好ましくは＞０．６５、最も好ましくは＞０．７０のＺ’値を有し；及び／又はアッセイが＜１０％、好ましくは＜７％、より好ましくは＜５％、最も好ましくは＜４％の％ＣＶ１００％値を有し；及び／又はアッセイが＞８、好ましくは＞１０、より好ましくは＞１２、最も好ましくは＞１５のＷ値を有する。
本発明の更なる実施形態において、ＡＣＰ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ反応生成物は、少なくとも５日間まで安定であり、それゆえ５日後にＺ’＞０．７０、％ＣＶ１００％ ＜４％且つＷ＞１５である。
本発明の別の実施形態において、ＡＣＰ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ反応生成物は、少なくとも２日間、好ましくは３日間、より好ましくは４日間、最も好ましくは５日間まで安定であり、それゆえこの時間の後、アッセイは＞０．５０、好ましくは＞０．６０、より好ましくは＞０．６５、最も好ましくは＞０．７０のＺ’値を有し；且つ／又はアッセイは＜１０％、好ましくは＜７％、より好ましくは＜５％、最も好ましくは＜４％の％ＣＶ１００％値を有し；且つ／又はアッセイは＞８、好ましくは＞１０、より好ましくは＞１２、最も好ましくは＞１５のＷ値を有する。
真菌感染の治療
本発明の更なる態様に従って、真菌感染の治療用の医薬の調製のための本発明のタンパク質の使用が提供される。
好ましくは、医薬は、真菌感染を遅らせるか又は予防するのに適している。真菌感染は、ヒト、動物又は植物におけるものであり得る。タンパク質は、薬物の開発のために使用され得る。治療は、真菌感染を遅らせるか又は予防することを含み得る。好ましくは、薬物及び／又は医薬は、阻害剤、好ましくはＰＰＴＢ阻害剤を含む。好ましくは、薬物又は医薬は、タンパク質又はその断片の機能を阻害するのに適している。
好ましくは、真菌感染は、真菌、より好ましくは子嚢菌、なおより好ましくは、以下の属から選択される生物による感染を含む: Absidia; Acremonium; Alternaria; Aspergillus; Bipolaris; Blastomyces; Blumeria; Candida; Cladosporium; Coccidioides; Colletotrichium; Cryptococcus; Curvularia; Encephalitozoon; Epicoccum; Epidermophyton; Exophiala; Exserohilum; Fonsecaea; Fusarium; Histoplasma; Leptosphaeria; Microsporum; Mycosphaerella; Neurospora; Paecilomyces; Paracoccidioides; Penicillium; Phialophora; Phytophthora; Plasmopara; Pneumocystis; Pseudallescheria; Pyricularia; Pythium; Puccinia; Rhizoctonia; Rhizomucor; Rhizopus; Saccharomyces; Scedosporium; Scopulariopsis; Sporothrix; Trichophyton; Trichosporon; Ustilago及びWangiella。
好ましくは、真菌感染は、Aspergillus属又はCandida属由来の真菌による感染を含む。
好ましくは、真菌感染は、以下の種から選択される生物による感染を含む: Absidia corymbifera; Acremonium spp.; Alternaria alternata; Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus nidulans; Aspergillus niger; Aspergillus parasiticus; Aspergillus terreus; Bipolaris spp.; Blastomyces dermatitidis; Blumeria graminis; Candida albicans; Candida glabrata; Candida krusei; Candida parapsilosis; Candida tropicalis; Cladosporium carrionii; Cladosporium cladosporoides; Cladosporium herbarium; Coccidioides immitis; Coccidioides posadasii; Curvularia lunata; Colletotrichium trifolii; Cryptococcus neoformans; Encephalitozoon cuniculi; Epicoccum nigrum; Epidermophyton floccosum; Exophiala spp.; Exserohilum rostratum; Fonsecaea pedrosoi; Fusarium graminarium; Fusarium solani; Fusarium sporotrichoides; Histoplasma capsulatum; Leptosphaeria nodorum; Microsporum canis; Mycosphaerella graminicola; Paecilomyces lilanicus; Paecilomyces varioti; Paracoccidioides brasiliensis; Penicillium chrysogenum; Phialophora verrucosa; Phytophthora capsici; Phytophthora infestans; Plasmopara viticola; Pneumocystis jiroveci; Puccinia coronata; Puccinia graminis; Pyricularia oryzae; Pythium ultimum; Rhizoctonia solani; Rhizomucor spp.; Rhizopus spp.; Saccharomyces spp.; Scedosporium apiospermum; Scedosporium prolificans; Scopulariopsis brevicaulis; Sporothrix spp.; Trichophyton mentagrophytes; Trichophyton interdigitale; Trichophyton rubrum; Trichosporon asahii; Trichosporon beigelii及びUstilago maydis。
好ましくは、真菌感染は、Aspergillus fumigatus種又はCandida albicans種から選択される生物による感染を含む。
医薬組成物
治療（ヒト又は獣医学の）においてＰＰＴＢ阻害剤を使用するために、それらは通常は、例えばＰＰＴＢ阻害剤及び医薬上許容される担体を混合することにより、標準的な薬務に従って、医薬組成物へと製剤化される。
従って、本発明の更なる態様に従って、ＰＰＴＢ阻害剤及び医薬上許容される担体を含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、真菌感染の予防又は治療において、好ましくは、Aspergillus又はCandida真菌感染の治療において、特に有用である。
ＰＰＴＢ阻害剤は、薬物投与のために通常使用される経路のいずれかにより宿主に投与され得、例えばそれらは、非経口的、経口的、局所的（口腔内、舌下若しくは経皮を含む）に、又は吸入により投与され得る。いかなる場合においても、投与に最も適した経路は、その特定のＰＰＴＢ阻害剤、関与する感染性生物、宿主、並びに疾患の性質及び重症度並びに宿主の体調による。
ＰＰＴＢ阻害剤は、１以上の他の治療上活性のある（例えば抗真菌性の）化合物と組み合わせて（例えば同時に、連続的に又は別々に）投与され得る。
本明細書中に引用された全ての刊行物（特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない）は、個々の刊行物が、完全に記載されたかのように参照により本明細書中に組み込まれることが具体的且つ個別に示されたかのように、参照により本明細書中に組み込まれる。
以下の実施例は、単なる例示として解釈され、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されない。
本発明の実施形態は、添付の図面を参照して、例としてここに説明される：
図１は、A. fumigatus ＰＰＴＢの４つの推定的な阻害剤についてのＰＰＴＢスクリーニングからの阻害曲線を示す。 図２は、C. albicans ＰＰＴＢの２つの推定的な阻害剤についてのＰＰＴＢスクリーニングからの阻害曲線を示す。 図３は、メチオニン及びシステインの存在下及び非存在下でのC. albicans ＰＰＴＢ変異体の増殖を示す。
１．Aspergillus fumigatusにおけるＰＰＴＢのノックアウト
１．１ イントロダクション
A. fumigatusにおけるＰＰＴＢの重要性を決定するために、この遺伝子を、定方向突然変異誘発によりノックアウト（即ち破壊）した。A. fumigatusは、天然には一倍体であるため、２つの色彩変異体の一倍体のプロトプラスト融合により二倍体株をまず作り出し、緑色の二倍体（褐色の一倍体及び白色の一倍体から容易に識別できた）を得た。次いで、相同組換えにより、選択マーカー（ＰｙｒＧ）を二倍体株中の１コピーのＰＰＴＢ遺伝子へと導入し、ＰＰＴＢについてヘテロ接合性の二倍体株を得た。最後に、二倍体を再び一倍体化させ、２種類の一倍体（ウリジン及びウラシルを添加した通常の最少培地上で増殖するが添加なしでは増殖できない、破壊されていないＰＰＴＢ遺伝子を有するもの、及び破壊されたＰＰＴＢ遺伝子を有するもの）を作り出した。もしＰＰＴＢが必須でなければ、一倍体は添加した培地と添加しない培地の両方で増殖する；もしこの遺伝子が必須であれば、この一倍体はいずれの培地でも増殖できない。
１．２ 方法及び結果
上流及び下流隣接領域を含むA. fumigatus ＰＰＴＢ遺伝子を、単離したA. fumigatus AF293ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりクローン化した。Reddy mix Extensor ＰＣＲ mastermix（Abgene）を、以下のプライマーと共に使用した:
配列番号１；PPTB_KOcass F1；GCGTTGATGCAGCTGTGTAT
配列番号２；PPTB KOcass R1；TAGCCGAGGCAAGTAGCAGT
ＰＣＲ産物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Promega）を含む１ｘライゲーションバッファー中、１４℃で一晩ライゲーションすることにより、pGEMTEasyベクターに連結した。反応液をSelect96細胞（Promega）に形質転換し、形質転換体を診断的消化（SphI、NotI及びXbaIを用いた）によりスクリーニングし、ＰＰＴＢがpGEMTeasyにクローン化されていることを確認した。
pGEMTEasy_PPTB ＤＮＡを、EZ-TN5細菌トランスポゾンシステム（Epicentre）を使用して突然変異誘発させた。EZ-TN5トランスポゾンを、PshAI及びXmnIを用いた消化により、pMB4zeo（配列番号３）から遊離させた。トランスポゾンモザイク末端（ＭＥ）の間には、Aspergillusにおける選択のためのＰｙｒＧコンストラクト及び細菌における選択のためのゼオシン耐性コンストラクトがある。pGEMTEasy_PPTB ＤＮＡを、製造者の使用説明書によって指示されるようにEZ-TN5トランスポゾン及びEZ-TNトランスポサーゼの存在下でインキュベートした。トランスポサーゼ反応を、１／１０容量の１０ｘ停止液を用いて停止させた。１ｕｌの反応液を、エレクトロポレーションによりGenehogs electrocompetent E. coli（Invitrogen）に形質転換した。結果として生じたコロニーを、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによりスクリーニングし、ＰＰＴＢコード配列内で破壊されたクローンを特定した：
配列番号４：PPTBint F1：GTTCTTGGTTTCACCTCTGC；（コード配列の１２３ｂｐ上流に結合する）
配列番号５：BVK1：GAGCCAATATGCGAGAACACCCG；（トランスポゾン末端）
配列番号６：BVK6：CGACTACGCACTAGCCAACA；（トランスポゾン末端）
ＰＣＲで陽性だったプラスミドを配列決定に送り、挿入部位がＰＰＴＢコード配列（配列番号７）の塩基３６８〜３６９の間であることを見出した。
破壊されたＰＰＴＢコンストラクトをNotIを用いた消化によりpGEMTEasyから遊離させ、アガロースゲル電気泳動及びQiaquickカラム（Qiagen）上でのゲル精製により精製した。この断片を、プロトプラスト形質転換によりA. fumigatus CDP1に形質転換し、形質転換体を、BVK1、BVK6及びPPTBoutcass F1 & R1を使用するＰＣＲによりスクリーニングした:
配列番号８：PPTBoutcass F1；TCGGTGGGTTTGATGTAATC
配列番号９：PPTBoutcass R1；gacaggcggagataatgatg
１つの形質転換体がＰＰＴＢ部位における相同組換えについて陽性であり、即ち、この二倍体において、１コピーのＰＰＴＢ遺伝子が破壊されたＰＰＴＢコンストラクトに置換されていた。この形質転換体を、ＳＡＢ＋５ｍＭウリジン＋５ｍＭウラシル＋１．２μｇ／ｍｌベノミル上での再一倍体化に供した。一倍体コロニーを採取し、ＳＡＢＵＵ（非選択）及びＳＡＢ培地（選択）上に接種し、３日間３７℃にて増殖させた。非選択条件下では、褐色及び白色の一倍体が観察されたが、選択条件下では二倍体（緑色）又は時々異数体が観察されるのみだった（異数体はｐｐｔｂの無傷のコピー及び破壊されたコピーを有するため、それらは増殖する；これはＰＣＲによって確認した）。従って、ＰＰＴＢがA. fumigatusの増殖に必須であることが分かった。
２．組換えA. fumigatus ＰＰＴＢ及びＡＣＰの作製
２．１ A. fumigatus ＡＣＰの同定
A. fumigatus ＰＰＴＢ及びその基質ＡＣＰの配列は、公共のデータベース上でそれぞれAfu4g04040及びAfu1g06620として入手可能である。これらの配列と他の生物由来のオーソロガスな配列とのアラインメントは、ＰＰＴＢ配列が正しいことを示した；これは配列番号１０として示される。しかしながら、ＡＣＰ配列は、他の配列とはかなり異なることが見出され、従って、標準的なエキソン境界コンセンサスに従い且つ他のＡＣＰと良く整列するＡＣＰ配列を与えるようにゲノム配列から再予測した。新しいｃＤＮＡ配列を配列番号１１として示し、タンパク質配列を配列番号１２として示す。
２．２ ＰＣＲによる増幅及びＥＫ／ＬＩＣクローニング
ＰＣＲを使用して、ＰＰＴＢ及びＡＣＰをコードするｃＤＮＡクローンを作り出した。ＡＣＰは、Ｎ末端から〜５０アミノ酸（A. fumigatusにおいては、配列番号１２のアミノ酸１−４９）の除去により翻訳後にプロセシングされるため、切断された形態のＡＣＰを作り出した。KOD Hot Start ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を使用してＰＣＲを行い、A. fumigatus ｃＤＮＡから、ＰＰＴＢに対応する４８９ｂｐのＤＮＡ断片及びＡＣＰに対応する２９７ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲプライマー対を以下に示す。使用したアニーリング温度は、ＰＰＴＢについては６０℃、ＡＣＰについては５０℃であった。
ＰＰＴＢセンス；配列番号１３；GACGACGACAAGATGAAACTAATTCCTTTTCCA
ＰＰＴＢアンチセンス；配列番号１４；GAGGAGAAGCCCGGTTCAACCAGCCGCAAGCAC
ACP1F；配列番号１５；gacgacgacaagatgtctgcccccgccggt
ACP1R+stop；配列番号１６；GAGGAGAAGCCCGGTTAGTGGGCATCAGGCTGGGC
ＰＰＴＢ産物は、配列番号７にプライマー由来の突出を加えたものに相当した；ＡＣＰ産物は、配列番号１７にプライマー由来の突出を加えたものに相当した。
ＰＣＲ産物をアガロースゲルから切り取り、精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して相補的突出末端を作り出し、そしてEk/LICクローニングキットマニュアル（Novagen）に記載されたように、pET30 Ek/LICベクターにアニールさせた。NovaBlue GigaSinglesコンピテント細胞を熱ショックによる形質転換のために使用した。形質転換混合物をＬＢ寒天／カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）上に蒔いた。プラスミドＤＮＡを、製造者の使用説明書によりQiaprepスピンミニプレップキット（Qiagen）を使用してミニプレップによりいくつかのコロニーから調製し、上記プライマーを使用するＰＣＲ、並びにpET30-PPTBについてはXmnI、pET30-ACPについてはBglII及びSalIを用いた制限酵素消化により、インサートの存在について試験した。試験した全てのクローンは、関連するインサートを含んでいた。ＰＰＴＢ及びＡＣＰクローン由来のおよそ１μｇのプラスミドをＤＮＡ配列決定に送った；全てのインサート配列に誤りがないことを見出した。
最初の発現研究（以下を参照のこと）の後、ＰＰＴＢが不溶性であることを見出した。従って、ＰＰＴＢ ｃＤＮＡを、HindIII/KpnI制限酵素部位を介してpET43.1b（Novagen）（溶解性を促進するためのＮｕｓＡ融合タグ、及び選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子を含む）にクローン化した。エレクトロポレーションによるPPTB-pET43.1bコンストラクトを用いたGenehogsの形質転換の後、ＰＣＲ並びにKpnI及びHindIIIを用いた制限酵素消化により、正しいインサートを含むものとして４クローンを特定した。クローンPPTB-43.1b-1を配列決定し、誤りがないことを見出した。
２．３ A. fumigatus ＰＰＴＢ及びＡＣＰ融合タンパク質の過剰発現
BL21（DE3）Star細胞を、熱ショックにより、pET30-PPTB及びpET30-ACPプラスミドで形質転換し、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）及びグルコース（１％ｗ／ｖ）を添加した１０ｍｌ Luria Bertani（ＬＢ）培地中で、一晩振盪しながら３７℃にて増殖させた。１ｍｌの一晩の培養物を１０ｍｌ ＬＢ／カナマイシン／グルコースに添加し、６００ｎｍにおける光学密度が０．５−１に達するまで（約２時間）、３７℃にて振盪しながら増殖させた。次いで、０．５ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導し、培養物をおよそ２０時間、２０℃にて振盪しながら増殖させた。４℃にて１５分間、Falcon 6/300遠心分離機で３０００ｒｐｍ（２０００ｇ）にて遠心分離することにより細菌細胞を集め、上清を捨てた。Novagenマニュアルに記載されたように、ベンゾナーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）及びrLysozyme（１ＫＵ／ｍｌ）を添加したBugbusterで、細胞のペレットを溶解させた。Novagenマニュアルに記載されたように、１０μｌの試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシー染色により分析した。発現したタンパク質が可溶性であるか否か又は不溶性の封入体中に存在するか否かを確認するために、１０μｌの溶解した試料を、４℃にて１５分間、１６０００ｇにて遠心分離した。次いで、上清及びペレット（１０μｌ Ｈ２Ｏ中に再懸濁させた）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ＰＰＴＢタンパク質（２１．６ｋＤａ）は、部分的にのみ可溶性であることが見出され、精製及び保存で溶液から出てくることが観察された。従って、ＰＰＴＢを異なるベクター、pET43.1b（Novagen）にクローン化し、公知の溶解性促進剤であるＮｕｓＡとの融合タンパク質としてＰＰＴＢを発現させた。pET43.1b（上記を参照のこと）への更なるクローン化の後、２０℃における０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いた２０時間の誘導後、可溶性ＰＰＴＢ−ＮｕｓＡ（８０ｋＤａ）をBL21（DE3）細胞により発現させることに成功した。０．５ｍＭ ＩＰＴＧを用いた２０時間の誘導後、ＡＣＰ融合タンパク質（１４．５ｋＤａ）を２０℃にて発現させることに成功した。
２．４ ＰＰＴＢ及びＡＣＰの精製
ＰＰＴＢ及びＡＣＰを大量（５０−４００ｍｌ）培養から精製した。Novagenマニュアルに記載されたように、ベンゾナーゼ（２５Ｕ／ｍｌ）、rLysozyme（１ＫＵ／ｍｌ）及び１０ｍＭイミダゾールを添加したBugbusterで、細胞を溶解させ、４℃にて２０分間、１６０００ｇにて遠心分離することにより残骸を除去した。製造者の使用説明書（Novagen）によりNi-NTA His結合樹脂を使用して、ＰＰＴＢ及びＡＣＰタンパク質を上清から精製した。２５０ｍＭイミダゾールを使用して、タンパク質を樹脂から溶出した。次いで、製造者の使用説明書に従ってPD10脱塩カラム（GE Healthcare）を使用して、調製物を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５へと移した。画分をゲル電気泳動により分析した。
３．A. fumigatus ＰＰＴＢアッセイの開発
３．１ イントロダクション
現在利用可能なアッセイは、過度に労働集約的であるか、又はそれらが複数の工程を必要とする（即ち、それらが均一でない）ため、創薬の重要な部分であるハイスループットスクリーニングに適していない（例えば、Lambalot & Walsh (1995) J. Biol. Chem 270, 24658-24661；Stuible et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 22334-22339；EP1795608；Mofid et al. (2002) J. Biol. Chem., 277, 17023-17031）。
本研究において、ＰＰＴＢアッセイは、ＰＰＴＢ活性が標識をＡＣＰ上に転移させるように、蛍光標識されたコエンザイムＡ分子（ＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ）を使用した。従って、ＰＰＴＢ反応の後、ＰＰＴＢ反応の生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離すること及びＡＣＰのバンドが蛍光性になっているか否かを調べるために紫外光を照射することができた。ハイスループットスクリーニングのために、ＰＰＴＢアッセイは、蛍光偏光法のアプローチを使用した。これは、それらの蛍光寿命中に顕著な分子運動をするフルオロフォアによってもたらされる平面偏光の配向の変化を測定する。この寿命は、励起光子の吸収と蛍光を通じた光子の放射との間の期間として定義される。ＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ分子の回転は、それが顕著により大きいサイズの分子（この場合ＡＣＰ）に結合する場合に減少する。回転の減少は、Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ分子が平面偏光を解消する能力の低下を引き起こし、それが測定され得る。
３．２ Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−標識されたＣｏＡ（ＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ）の作製
Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲヨードアセトアミド（iodoacetimide）（Molecular Probes）をコエンザイムＡの末端−ＳＨ基に結合することにより、蛍光コエンザイムＡを作製した。６０ｍＭコエンザイムＡストックを無菌ｄｄＨ２Ｏ中に調製した。1５ｍＭ Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲヨードアセトアミドストックを、使用の直前にＤＭＳＯ中に調製し、光から保護した。Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ:ＣｏＡが１．５：１〜１：１の間のモル比を与えるように、ＣｏＡをＢｏｄｉｐｙ ＴＭＲヨードアセトアミドに添加した。次いで、標識反応において使用したＢｏｄｉｐｙ ＴＭＲ １ｍｇにつき２．５ｍｌのバッファー（１００ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ｐＨ７．５）を添加することにより容量を増加させ、試料をボルテックスし、氷上で３０分間、次いで室温にて１０分間インキュベートした。過剰な未反応のＢｏｄｉｐｙ ＴＭＲヨードアセトアミド標識を酢酸エチルで抽出することにより除去した；１０ｍｌ酢酸エチルを添加し、ボルテックスにより混合し、層を分離させ、有機層を除去した。これを、酢酸エチルが清澄なままで残り、且つ紫外光下で蛍光を発しなくなるまで、繰り返した。標識反応において使用したＢｏｄｉｐｙ ＴＭＲヨードアセトアミド１ｍｇにつき、およそ１．５ｍｌの強烈なピンク色の溶液が残った。−８０℃における保存の前に、ＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲをアッセイバッファーで１：５に希釈し、アリコートにした。
３．３ ＰＰＴＢアッセイ
予備的研究は、組換えＰＰＴＢが、マグネシウムイオン及びＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲの存在下で、組換えＡＣＰ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した）を標識できることを示し、ＰＰＴＢが機能的であることを示した。標識反応は、ＥＤＴＡの添加によって阻害された。蛍光偏光法を使用して更なる実験を行ない、ハイスループットスクリーニングのためにＰＰＴＢアッセイを最適化した。
４．A. fumigatus ＰＰＴＢの阻害剤についてのハイスループットスクリーニング
４．１ 装置
ＰＰＴＢ阻害剤についてのハイスループット蛍光偏光スクリーニングを、以下の装置を使用して黒色平底３８４ウェルプレート中で行なった：ディスペンスカセット及びプレートアダプターを備えたThermo Labsystems Multidrop 384マシン（Multidrop（登録商標）384）；Tecan Genesis Freedom及び２３５μｌチップヘッドを備えたTecan Te-Mo自動液体ハンドリングロボット、これらに加えて適切なＰＣ／ベースユニット／ソフトウェア；２３５μｌチップヘッドを備えたPerkinElmer Minitrak自動液体ハンドリングロボット、これに加えて適切なＰＣ／ベースユニット／ソフトウェア；並びにPerkinElmer Fusion-Alpha-FP HTプレート読み取り分光光度計、これに加えて適切なＦＰフィルター（励起フィルター５４０ｎｍ；発光フィルター５８０ｎｍ、両フィルターとも２０ｎｍバンド幅を有する）。
４．２ ストック溶液
バッファーＡ：６２．５ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６．７５）、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２。アッセイにおける終濃度は、５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２だった。
ＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−ＡＣＰ混合物：１１．６ｍｌ ＡＣＰ（３．４２１ｍｇ／ｍｌ）＋１８５４．７μｌ ＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲストック（上記セクション３．２を参照のこと）を、４℃にてバッファーＡで５２９．９ｍｌに調製した。
ＰＰＴＢ酵素：典型的には５０〜１００ｎｇ全タンパク質／ウェルで、ＰＰＴＢ酵素を使用した；時間及びタンパク質濃度の両方に関して反応直線性を与える濃度で、酵素を使用した。これは各酵素バッチについて決定しなければならなかった。酵素添加を必要とするスクリーニングの段階の直前に、１アリコートの酵素を氷上で解凍し、適切な容量のバッファーＡへと洗い流した。
停止試薬；６０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０。
４．３ ＰＰＴＢスクリーニングの実行
アッセイを黒色平底３８４ウェルプレート中で行なった。最初に、化合物ライブラリーをスクリーニングし、可能性のあるヒットを特定した：アッセイにおいて１％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ水中で０．０２ｍｇ／ｍｌの終濃度（４００ダルトンの分子量を有する化合物について５０μＭに相当する）を与えるように、化合物の溶液をウェルへとまず分注した。次いで、２０μｌのＰＰＴＢ酵素溶液をウェルに加えた；無酵素対照ウェルには２０μｌのバッファーＡを入れた。２０μｌのＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲ−ＡＣＰ混合物を全てのウェルに加え、プレートを室温にて３０分間インキュベートした。反応を２５μｌの停止試薬の添加により終結させ、その後プレートを分光光度計で読み取った。少なくとも８０％の阻害を与える化合物を可能性のあるヒットとみなした。
スクリーニングの質を、パラメーターＺ’、％ＣＶ及びＷを使用して測定し、これらは以下のように定義される（式中、「ＳＤ」は標準偏差を表し、「１００％対照」は、全てのウェルが阻害されていない反応を含む３８４マイクロウェルプレートであり、「０％対照」は、全てのウェルが完全に阻害された反応を含むか、又は酵素を含まない３８４マイクロウェルプレートである）：
Ｚ’＝１−（（３ＳＤ １００％対照＋３ＳＤ ０％対照）／（平均 １００％対照−平均 ０％対照））；
％ＣＶ＝（プレート全体からのデータの標準偏差／プレート全体からのデータの平均）ｘ１００；これは０％対照を有するプレート（％ＣＶ０％）又は１００％対照を有するプレート（％ＣＶ１００％）について算出され得る。
Ｗ＝（１００％対照−０％対照）／√((ＳＤ １００％対照）２＋（ＳＤ ０％対照）２））
驚いたことに、アッセイプレート中の反応生成物は、アッセイ後、少なくとも５日間安定であることが見出された：従って１時間後、アッセイの質パラメーターは以下の値を示した；Ｚ’＝０．８３、％ＣＶ１００％＝３．４％及びＷ＝２２．９；一方５日後、アッセイの質パラメーターはＺ’＝０．７７、％ＣＶ＝２．３％及びＷ＝１７．９の値を示した。また、標識されていないコエンザイムＡを使用してアッセイを行なった場合、ＣｏＡについてのＩＣ５０は、１日目に６．０２μＭ、１０５時間後に５．９０μＭであった。この安定性は、多数の化合物をスクリーニングすること及び多数のプレートを読み取ることを可能にした。検出方法として蛍光偏光法を使用する場合には、例えば、単純な吸光分光光度法（absorbance spectrophotometry）を用いる場合よりも個々のウェルを読み取るのに長い時間がかかるため、長い安定時間は特に重要である。１０，０００個の化合物について、アッセイの最初の段階（ストックからの化合物の分注から反応の停止まで）は、典型的には７時間かかった。プレートの読み取りは６０時間かかったが、１０時間も可能かもしれない。
次いで、４０μｇ／ｍｌ−４００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲（終濃度；４００ダルトンの分子量の化合物について１００μＭ−１ｎＭに相当する）にわたり、第二のスクリーニングにおいて可能性のあるヒットを試験した。試料データを図１（ハイスループットスクリーニングから特定した４つの化合物についての第二のスクリーニングの結果を示す）に示す。２つの化合物（Ａ及びＢ）は、優れたＩＣ５０値を有する阻害剤であることを見出し、一方２つ（Ｃ及びＤ）は不活性であることを見出した。典型的には、１０μＭ以下のＩＣ５０を有する化合物を優れた阻害剤とみなし、阻害曲線がシグモイドであり、５％〜９５％阻害の範囲が阻害剤濃度の２対数スパン（two log span）内であることを、好ましいと見なした。
５．Candida albicansにおけるＰＰＴＢの必須性
５．１ イントロダクション
A. fumigatus ＰＰＴＢのCandida albicansホモログは、CaO19.4812である。C. albicansは二倍体生物であるため、C. albicansにおけるＰＰＴＢの重要性を決定するためには両方の対立遺伝子を考慮しなければならない。一方の対立遺伝子を完全にノックアウトし、他方の対立遺伝子を調節可能なプロモーターＭＥＴ３の制御下に置くことを戦略とした。ＭＥＴ３プロモーターは、メチオニン及びシステインの存在により下方調節される（Care et al, 1999 Molecular Microbiology 34, 792-798）。
２回の相同的形質転換を行った；１回目はＰＰＴＢ開始コドンの直前にＭＥＴ３プロモーターを挿入するためであり、２回目は定方向突然変異誘発により残っている対立遺伝子を破壊するためである。C. albicans三重栄養要求株SN76（ura3/arg4/his1）を実験に使用した。プロモーター置換は、ＭＥＴ３プロモーター及びＵＲＡ３マーカーからなるコンストラクトを使用して行なった。定方向突然変異誘発は、ＡＲＧ４マーカーを有するコンストラクトを使用して実施した。ＰＰＴＢがこの真菌の増殖に必須であれば、残っている遺伝子のコピーがメチオニン及びシステインの存在により下方調節された場合、変異体は増殖しないはずである。しかしながら、メチオニン及びシステインの非存在下では、ＰＰＴＢが発現し、変異体は増殖するはずである。
５．２ 方法及び結果
プロモーター置換コンストラクトを融合ＰＣＲにより作製した。まず、３つのＰＣＲ産物を、５５℃のアニーリング温度及び６８℃の伸長温度でKOD ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を使用して調製した。ＰＰＴＢ遺伝子の５’領域の３９１ｂｐを、プライマーPPTBF（配列番号３０）及びPPTBMIDR（配列番号３１）を使用してSN76ゲノムＤＮＡから増幅した。２７３３ｂｐのURA3-MET3コンストラクトを、プライマーURA3MET3F（配列番号３２）及びURA3MET3R.（配列番号３３）を使用して調製した。C.albicans ＭＥＴ３プロモーター（Care et al, 1999 Molecular Microbiology 34 (4）, 792-798）がＲＰＳ１０部位の代わりにＵＲＡ３遺伝子の下流に挿入されたCIP10ベクター（Murad et al, 2000 Yeast 16, 325-327）からなるpMET3プラスミドを鋳型とした。ＰＰＴＢコード配列の最初の３９４ｂｐを、プライマーPPTBMIDF（配列番号３４）及びPPTBR（配列番号３５）を使用してSN76ゲノムＤＮＡから増幅した。
配列番号３０：PPTBF：CACGGTTTCACCAGTGTCTG
配列番号３１：PPTbMIDR：gatctaggcttggccaagtcggccgCTGGAAAAATTTCCCCGAGA
配列番号３２：URA3MET3F：CGGCCGACTTGGCCAAGCCTAGATC
配列番号３３：URA3MET3R：TGGGGAGGGTATTTACTTTTAAATA
配列番号３４：PPTbMIDF：TatttaaaagtaaataccctccccaATGCCAAAAGTAGGCACTGT
配列番号３５：PPTBR: CCTTCTGACGAAGTACTGTAGCAA
ＰＣＲ産物は、それらの末端に、反応液中に存在する３つのＰＣＲ産物と共にPPTBF（配列番号３０）及びPPTBR（配列番号３５）プライマーを使用する最後の融合ＰＣＲ反応において産物を融合させる２５ｂｐの重複配列を含んだ。３５４３ｂｐの産物を得た。この産物を使用して、酢酸リチウム法（Walther and Wendland, 2003 Current Genetics 42, 339-343）を使用してC. albicans SN76を形質転換し、続いて、３０℃にて３日間、ＳＤ寒天（アミノ酸を含まない１Ｘ酵母窒素源基礎培地＋２％グルコース＋２％ bacto寒天）＋アルギニン（０．２ｍＭ）＋ヒスチジン（０．２ｍＭ）プレート上でインキュベートした。結果として得られた形質転換体をＳＤ寒天＋アルギニン＋ヒスチジン上に接種し、４日間インキュベートした。ＰＣＲにより、ＭＥＴ３プロモーターの正しい挿入について、コロニーをスクリーニングした。これらの変異体の１つを２回目の形質転換のために選択した。この条件的ヘテロ接合体をPPTB#2と名づけた。
第二の対立遺伝子をノックアウトするために、鋳型としてのＡＲＧ４マーカー（Dennison et al, 2005 Fungal Genetics and Biology 42, 737-748）を含むCaARG4コンストラクト並びに長いプライマーPPTBARGF（配列番号３６）及びPPTBARGR（配列番号３７）（ここで２０ｂｐはプラスミド結合領域に相当し、１００ｂｐは標的挿入領域に相同的であった）を使用して、ＰＣＲにより、第二の形質転換コンストラクトを作製した。５５℃のアニーリング温度及び６８℃の伸長温度でKOD ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
配列番号３６：PPTBARGF：GGAAATTTTTCCAGCATCGAGTTAGTAGCTCTCTGTACCTTAATATCTACTACATGTGATGCCAAAAGTAGGCACTGTATTGGGTATAGGTGTTGATATCCCAGGGTTTTCCCAGTCACG
配列番号３７：PPTBARGR：CTTTAGATTTGATAAACCTTCTGACGAAGTACTGTAGCAATTACAAGAGAATCATCATGTGAGATACTAAGATGGAACTCTTCATCAGACAATTTGTATCACTAAAGGGAACAAAAGC
１００ｂｐのＰＰＴＢ遺伝子の５’及び３’隣接領域が隣接するＡＲＧ４マーカーからなる２４８６ｂｐの産物を得た。この産物を使用して、酢酸リチウムプロトコールを使用してPPTB#2を形質転換し、続いて、３０℃にて３日間、ＳＤ寒天＋ヒスチジン上でインキュベーションを行なった。結果として得られた形質転換体をＳＤ寒天＋ヒスチジン上に再接種した。選択したコロニーをＳＤ培地中に接種し、３０℃にて一晩インキュベートし、MasterPure Yeast ＤＮＡ抽出キット（Epicentre Biotechnologies）を使用してゲノムＤＮＡを単離した。以下のプライマー対を使用して、５回のＰＣＲ反応を実施し、両方の形質転換コンストラクトの正しい挿入及び野生型対立遺伝子がないことを特定した：PPTBUP（配列番号３８）及びURAMET3INTR（配列番号３９）（期待された産物のサイズ９８２ｂｐ）；PPTBD（配列番号４０）及びURAMET3INTF（配列番号４１）（期待された産物のサイズ＝１３１０ｂｐ）；PPTBUP（配列番号４２）及びARGINTR（配列番号４３）（期待された産物のサイズ＝１６６７ｂｐ）；PPTBD（配列番号４０）及びARGINTF（配列番号４４）（期待された産物のサイズ＝１７８９ｂｐ）；PPTBF（配列番号３０）＆PPTBR（配列番号３５）野生型のみについて期待された産物のサイズ＝７８５ｂｐ）。
配列番号３８：PPTBUP：GCTGTTCCCAAGTTTGGTGT
配列番号３９：URAMET3INTR：TGCTACTGGTGAGGCATGAG
配列番号４０：PPTBD：CAAGACCCATCACAATGTCG
配列番号４１：URAMET3INTF：attgctgtggatcacgtgc
配列番号４２：PPTBUP：GCTGTTCCCAAGTTTGGTGT
配列番号４３：ARGINTR：GCCCATCTAATAGGTTGAGC
配列番号４４：ARGINTF：gcaattcttgaacgagcaca
形質転換体の１つが、望ましい遺伝子型（一方の対立遺伝子がＭＥＴ３プロモーターの制御下にあり、第二の対立遺伝子が完全にノックアウトされている）を有することが示された。この条件的ヌル変異体をPPTB#11と名づけた。PPTB#11を、一晩ＳＤ培地＋ヒスチジン中で増殖させた。ＯＤ６００を測定し、ＳＤ＋ヒスチジン中でＯＤ６００を０．１に調節した。５μｌのこの培養物及びその後の５倍希釈物を、２．５ｍＭメチオニン及び２．５ｍＭシステインを含むか又は含まないＳＤ寒天＋ヒスチジン＋アルギニン＋ウリジン培地上に接種した。SN76親株及びPPTB2を対照として使用した。プレートを３０Ｃにて４日間インキュベートし、その結果を図３に示す。インキュベーション後、SN76及びPPTB#2は、メチオニン及びシステインの存在下及び非存在下で増殖した。条件的ヌル変異体PPTB#11は、メチオニン及びシステインの非存在下でのみ増殖し、それによってCa019.4812がC.albicansの増殖に必須の遺伝子であることを示した。
６．組換えC. albicans ＰＰＴＢ及びＡＣＰの製造
６．１ C. albicans ＰＰＴＢのクローン化、発現及び精製
Candida albicans ＰＰＴＢ、CaO19.4812は、単一エキソン遺伝子である；ＤＮＡ配列を配列番号１８に、タンパク質配列を配列番号１９に示す。C. albicansは、ＣＴＧコドンを、他の生物のほとんどにおいて見られるロイシンの代わりにセリンとして翻訳するが、この遺伝子内にはＣＴＧコドンはない。プライマー（配列番号２０（SK_CPPTB-F）及び配列番号２１（SK_CPPTB-R））並びにKOD Hot Start ＤＮＡポリメラーゼ（Novagen）を使用して、C. albicans ゲノムＤＮＡからＰＣＲによりC. albicans ＰＰＴＢ遺伝子を作り出した。
配列番号２０：SK_CPPTB-F：GAC GAC GAC AAG ATG CCA AAA GTA GGC ACT GTA T
配列番号２１；SK_CPPTB-R；GAG GAG AAGCCC GGT TTA GAT TTG ATA AAC CTT CT
ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、pET43.1に連結し、Novablue細胞に形質転換した。ＰＣＲ及び制限酵素消化により、正しいインサートについてコロニーを確認した。結果として得られたpET43-PPTBコンストラクトを使用して、BL21細胞を形質転換した。タンパク質発現の小規模誘導及びＰＰＴＢインサートの配列決定を行ない、タンパク質製造に適した誤りのないクローンを特定した。
アッセイ用のC. albicans ＰＰＴＢを製造するために、pET43.1-PPTBを含む細胞を使用して、１２ｍｌ ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／グルコース（１％）に接種し、培養物を３７℃にて一晩増殖させた。次いで、４ｍｌのこのものを１００ｍｌ ＬＢ／アンピシリン／グルコースに加え、ＯＤ６００が０．７４７に達するまで、２時間２０分間、培養物を増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを０．３ｍＭの終濃度まで加え、培養物を１５℃にて一晩振盪しながらインキュベートした。細胞のペレットを遠心分離により採取し、１つの５０ｍｌペレットを３ｍｌ BugBuster、２５Ｕ／ｍｌベンゾナーゼ、１ＫＵ／ｍｌ.リゾチーム、１０ｍＭイミダゾールで溶解し、その後、４℃にて２０分間、１６０００ｇにて遠心分離することにより、ライセートを清澄化した。Ni-NTA His結合樹脂を使用した更なる精製工程を、セクション２．４に記載したように行なった。
A. fumigatus ＡＣＰを基質として使用したC. albicans ＰＰＴＢ活性についてのアッセイは、弱いシグナルしか与えなかった。従って、組換えC. albicans ＡＣＰを製造し、C. albicans 酵素がC. albicans ＡＣＰをその基質として必要とするか否かを決定した。
６．２ C. albicans ＡＣＰのクローン化、発現及び精製
ＢＬＡＳＴ検索は、C. albicansが２つのＡＣＰ、CaO19.8439（ＡＣＰｇ）、及びCaO19.9975（ＡＣＰｅ）を有するが、ＡＣＰｇがS. cerevisiaeの唯一のＡＣＰにより良く似ていることを示した。配列番号及び切断後の成熟Ｎ末端の位置（上記２．２を参照のこと）を表１に示す。両方ともＣＴＧコドンを有さない単一エキソン遺伝子である。
KOD-Hot Startポリメラーゼ、C. albicans ｇＤＮＡ及び以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによりC. albicans ＡＣＰのｃＤＮＡを作り出した：
ＡＣＰｇ；CaO19.8439プライマー
配列番号２６；SK_GoodACP-F；GACGAC GAC AAG ATG GTT GCC CCA CCA ATT TC
配列番号２７；SK_GoodACP-R；GAG GAG AAG CCC GGT TTA TTT AGA TTC TTC TTT GT
ＡＣＰｅ；CaO19.9975プライマー
配列番号２８；SK_EvilACP-F；GAC GAC GAC AAG ATG AGT GCC TTC CCA GAA TT
配列番号２９；SK_EvilACP-R；GAG GAG AAG CCC GGT TTA ACA AGA ATC TGG TTG AG
ＰＣＲ産物をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し、pET30に連結し、Novablue細胞に形質転換し、ＬＢ／カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）上に蒔いた。コロニーをＰＣＲにより試験し、インサートについて確認し、次いでＤＮＡを調製し、制限酵素消化及び配列決定により更に確認した。誤りのないＤＮＡをE. coli BL21細胞に形質転換し、試験誘導が正しい分子量の可溶性タンパク質を生じさせることを見出した。
両方のＡＣＰについて、pET30-ACPを含むBL21細胞を、ＬＢ／カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）／グルコース（１％）中で一晩増殖させた。次いで、３ｍｌの培養物を５０ｍｌ ＬＢ／カナマイシン／グルコースに接種し、３７℃にて２時間増殖させ、その後、タンパク質発現をＩＰＴＧ（終濃度０．５ｍＭ）の添加により誘導し、その後、細胞を２０℃にて一晩振盪しながらインキュベートした。次いで、細菌のペレットを遠心分離により集め、タンパク質を上記のように精製した（セクション２．４）。PD10脱塩カラムを使用して、ＡＣＰ試料を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．５に交換した。
６．３ C. albicans ＰＰＴＢアッセイ.
A. fumigatus及びC. albicansの両方に由来するＰＰＴＢ及びＡＣＰ並びにＣｏＡ−Ｂｏｄｉｐｙ ＴＭＲを使用して、ＰＰＴＢアッセイを構築し、反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離し、紫外光下で可視化した。C. albicans ＰＰＴＢは、ＡＣＰｇを強くパンテテイニル化したが、ＡＣＰｅ及びA. fumigatus ＡＣＰは弱くパンテテイニル化された。A. fumigatus ＰＰＴＢは、A. fumigatus ＡＣＰ及びＡＣＰｇの両方をパンテテイニル化することができたが、ＡＣＰｅは弱くパンテテイニル化された。従って、C. albicans ＰＰＴＢは、正しい機能のためにC. albicans ＡＣＰｇを必要とする。
７．C. albicans ＰＰＴＢ阻害剤についてのハイスループットスクリーニング
C. albicans ＰＰＴＢ及びC. albicans ＡＣＰｇを使用し、タンパク質濃度を調節して、A. fumigatus ＰＰＴＢ（セクション４）について上記記載したように、C. albicans ＰＰＴＢの阻害剤についてのスクリーニングを行なった。A. fumigatus ＰＰＴＢに対して活性がある２つの化合物を、C. albicans酵素に対して試験した；結果を図２に示す。両方の化合物ともに、C. albicans酵素の優れた阻害剤であることを見出した；化合物Ｅが９．８μＭのＩＣ５０、化合物Ｆが７．１μＭのＩＣ５０を有することを見出した。
配列表

配列番号１
GCGTTGATGCAGCTGTGTAT

配列番号２
TAGCCGAGGCAAGTAGCAGT

配列番号３
AATTCGCCTCAAACAATGCTCTTCACCCTCTTCGCGGGTCTGAAATACCCTCACCTGGCAACAGCAATTGGCGCTTCATGGCTGTTTTTCCGATCTCTCTACTTGTACGGCTATGTGTACTCGGGTAAGCCACAAGGCAAGGGCAGATTGCTGGGAGGTTTCTTCTGGTTTTCTCAAGGCGCTCTGTGGGCTCTGAGTGTGTTTGGTGTTGCCAAAGACATGATCTCTTACTGAGAGTTATTCTGTGTCTGACGAAATATGTTGTGTATATATATATATGTACGTTAAAAGTTCCGTGGAGTTACCAGTGATTGACCAATGTTTTATCTTCTACAGTTCTGCCTGTCTACCCCATTCTCGCTGTACCTGACTACAGAGTAGTTTAATTGTGGTTGACCCCACAGTCGGAGGCGGAGGAATACAGCACCGATGTGGCCTGTCTCCATCCAGATTGGCACGCAATTTTTACACGCGGAAAAGATCGAGATAGAGTACGACTTTAAATTTAGTCCCCGGCGGCTTCTATTTTAGAATATTTGAGATTTGATTCTCAAGCAATTGATTTGGTTGGGTCACCCTCAATTGGATAATATACCTCATTGCTCGGCTACTTCAACTCATCAATCACCGTCATACCCCGCATATAACCCTCCATTCCCACGATGTCGTCCAAGTCGCAATTGACTTACGGTGCTCGAGCCAGCAAGCACCCCAATCCTCTGGCAAAGAGACTTTTTGAGATTGCCGAAGCAAAGAAGACAAACGTTACCGTCTCTGCTGATGTGACGACAACCCGAGAACTCCTGGACCTCGCTGACCGTACGGAAGCTGTTGGATCCAATACATATGCCGTCTAGCAATGGACTAATCAACTTTTGATGATACAGGTCTCGGTCCCTACATCGCCGTCATCAAGACACACATCGACATCCTCACCGATTTCAGCGTCGACACTATCAATGGCCTGAATGTGCTGGCTCAAAAGCACAACTTTTTGATCTTCGAGGACCGCAAATTCATCGACATCGGCAATACCGTCCAGAAGCAATACCACGGCGGTGCTCTGAGGATCTCCGAATGGGCCCACATTATCAACTGCAGCGTTCTCCCTGGCGAGGGCATCGTCGAGGCTCTGGCCCAGACCGCATCTGCGCAAGACTTCCCCTATGGTCCTGAGAGAGGACTGTTGGTCCTGGCAGAGATGACCTCCAAAGGATCGCTGGCTACGGGCGAGTATACCAAGGCATCGGTTGACTACGCTCGCAAATACAAGAACTTCGTTATGGGTTTCGTGTCGACGCGGGCCCTGACGGAAGTGCAGTCGGATGTGTCTTCAGCCTCGGAGGATGAAGATTTCGTGGTCTTCACGACGGGTGTGAACCTCTCTTCCAAAGGAGATAAGCTTGGACAGCAATACCAGACTCCTGCATCGGCTATTGGACGCGGTGCCGACTTTATCATCGCCGGTCGAGGCATCTACGCTGCTCCCGACCCGGTTGAAGCTGCACAGCGGTACCAGAAAGAAGGCTGGGAAGCTTATATGGCCAGAGTATGCGGCAAGTCATGATTTCCTCTTGGAGCAAAAGTGTAGTGCCAGTACGAGTGTTGTGGAGGAAGGCTGCATACATTGTGCCTGTCATTAAACGATGAGCTCGTCCGTATTGGCCCCTGTAATGCCATGTTTTCCGCCCCCAATCGTCAAGGTTTTCCCTTTGTTAGATTCCTACCAGTCATCTAGCAAGTGAGGTAAGCTTTGCCAGAAACGCCAAGGCTTTATCTATGTAGTCGATAAGCAAAGTGGACTGATAGCTTAATATGGAAGGTCCCTCAGGACAAGTCGACCTGTGCAGAAGAGATAACAGCTTGGCATCACGCATCAGTGCCTCCTCTCAGACAGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGCTCGAGCACGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAGAATTCCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGCCAACGACTACGCACTAGCCAACAAGAGCTTCAGGGTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCTGTCTTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGACAGCTGTCTCTTATACACATCTCAACCATCATCGATGAATTTTCTCGGGTGTTCTCGCATATTGGCTCG

配列番号４:
GTTCTTGGTTTCACCTCTGC

配列番号５:
GAGCCAATATGCGAGAACACCCG

配列番号６:
CGACTACGCACTAGCCAACA

配列番号７:
ATGAAACTAATTCCTTTTCCATATCCCCTCAATATAGGGACGGATGTCGTTCATCTCCCCCGAATTCTCCGCCTCATCAACCGTCCCGACTACTTCCACCGCTTCACCCGGCGGATCCTCCACGAACAGGAGCAGCGAGACTTCCGCACCAGATTCTCCCTCCCACCACCATCGTCCGGCGCAGAAAAGACTGGACTCAATCCAATAACGCCAGATATGGCGCGCTGGCTGGCTGGCCGTTTCGCGGCAAAAGAGGCAGCACGTAAGGCTGCTCCGGCCGGCGCGTCATCCCTCGGGTGGAAGGATGTTATTGTTAGGGTTGGTGAGGCCGATAAGGGAAGACCGGAGATTGTGTACTTGGATCCCATGGGCTGTGGAGAAACCGGCGGAGGCAGAGTAGGCAAGCTGTCTATCTCGCATGATGGGGATTATGTGGTTGCTACGGTGCTTGCGGCTGGTTGA

配列番号８:
TCGGTGGGTTTGATGTAATC

配列番号９:
GACAGGCGGAGATAATGATG

配列番号１０:
MKLIPFPYPLNIGTDVVHLPRILRLINRPDYFHRFTRRILHEQEQRDFRTRFSLPPPSSGAEKTGLNPITPDMARWLAGRFAAKEAARKAAPAGASSLGWKDVIVRVGEADKGRPEIVYLDPMGCGETGGGRVGKLSISHDGDYVVATVLAAG

配列番号１１:
ATGTTCCGTTCCGCTGTCGTCCGCTCGTTGAGAGCTTCCGTTCCCCGTGCTGTCAGGACTCCTGCTGCCTTCCAGATCCGTAGCTCTCCTGTTGCTCGTCCTGCTCAATTCGCCCCTCGCTTTGCTTACCAGGGTGTCCGCCTCTACTCTGCCCCCGCCGGTCTGAACAAGGAGGAGGTTGAGGGCCGGATAGTCAACCTCTTGAAGAACTTTGACAAGGTCTCCGATGCCAGCAAGATCAACGGCTCTTCCCACTTCTCGAACGACCTTGGTCTGGATTCCCTGGATACTGTTGAGGTTGTGATGGCTATTGAGGAGGAGTTCAGCATTGAGATCCCCGACAAGGAGGCCGACGCTATCCACAGTGTTGACAAGGCTGTTGAGTACATCCTTGCCCAGCCTGATGCCCACTAA

配列番号１２: MFRSAVVRSLRASVPRAVRTPAAFQIRSSPVARPAQFAPRFAYQGVRLYSAPAGLNKEEVEGRIVNLLKNFDKVSDASKINGSSHFSNDLGLDSLDTVEVVMAIEEEFSIEIPDKEADAIHSVDKAVEYILAQPDAH

配列番号１３:
GACGACGACAAGATGAAACTAATTCCTTTTCCA

配列番号１４:
GAGGAGAAGCCCGGTTCAACCAGCCGCAAGCAC

配列番号１５:
GACGACGACAAGATGTCTGCCCCCGCCGGT

配列番号１６:
GAGGAGAAGCCCGGTTAGTGGGCATCAGGCTGGGC

配列番号１７:
ATGTCTGCCCCCGCCGGTCTGAACAAGGAGGAGGTTGAGGGCCGGATAGTCAACCTCTTGAAGAACTTTGACAAGGTCTCCGATGCCAGCAAGATCAACGGCTCTTCCCACTTCTCGAACGACCTTGGTCTGGATTCCCTGGATACTGTTGAGGTTGTGATGGCTATTGAGGAGGAGTTCAGCATTGAGATCCCCGACAAGGAGGCCGACGCTATCCACAGTGTTGACAAGGCTGTTGAGTACATCCTTGCCCAGCCTGATGCCCACTAA

配列番号１８:
ATGCCAAAAGTAGGCACTGTATTGGGTATAGGTGTTGATATCGTCAATTCTGTCAGATTTGAAAGATTGTTGACAGCCAAAAGCACGTCTTTCGGAACAAGGCTATCCAAGCGAATTCTTCACCCAGAACACGAATTACCTTTGTTTCAGCAGATGCACTCACAACGACAAGCTCAATATCTTACTGGATCTTGGGCAGCAAAGGAAGCATTATTCAAGACATTGGACTTAAACTCACAGAAAGAGTTCAACTTTAACCAATGGTACCGCTTCCATGATTCCAATGGGAAGCCATTTATTTGGAACGATCGATACAAATTGTCTGATGAAGAGTTCCATCTTAGTATCTCACATGATGATTCTCTTGTAATTGCTACAGTACTTCGTCAGAAGGTTTATCAAATCTAA

配列番号１９:
MPKVGTVLGIGVDIVNSVRFERLLTAKSTSFGTRLSKRILHPEHELPLFQQMHSQRQAQYLTGSWAAKEALFKTLDLNSQKEFNFNQWYRFHDSNGKPFIWNDRYKLSDEEFHLSISHDDSLVIATVLRQKVYQI

配列番号２０:
GAC GAC GAC AAG ATG CCA AAA GTA GGC ACT GTA T

配列番号２１:
GAG GAG AAGCCC GGT TTA GAT TTG ATA AAC CTT CT

配列番号２２:
ATGTTTAAATTAGCTTTCCGTTCCATTCGTGCACCAGTTGCTAGAGCTTCATTTGTCAAACCAATTCGTTTTTATGTTGCCCCACCAATTTCCAAAGATGAAGTTACTTCAAGAGCCATTCAAGCTTTGAAAACCGTTGCTCCATTACAAGAATCCAATATCACATTAGAATCTTCTTTCCAAAAGGATTTGGGCTTAGATTCTTTAGATACTGTTGAAGCTTTAGTGGCATTGGAAGAAGAATTCGATTTAGAAATTCCTGATAAGATTTCTGATGAGATAAAGACTGTTGGGGAAGCTGTTGATTACATTTACAAAGAAGAATCTAAATAA

配列番号２３:
MFKLAFRSIRAPVARASFVKPIRFYVAPPISKDEVTSRAIQALKTVAPLQESNITLESSFQKDLGLDSLDTVEALVALEEEFDLEIPDKISDEIKTVGEAVDYIYKEESK

配列番号２４:
ATGTTTAGAACTACTTTATTAAAATCATTAAGAGCTTCAGTATCAAAACCTTCAATGGTGAAAACCATTCAATCATCATCAAGATCATTATTCACCATCACCACCATCACTAACAACAAAAATGTCACTCCTTTGACTTCATCAATGAACTTTATTCGTTGTTATAGTGCCTTCCCAGAATTAACTAGAGATATTGCTAAAGAAAGAATTATTGAATTATTAGAAGGTTATGATAAAGTAGATCAATCTAAAGGTGAAATCACTGAACAAAACTCATTTACTTCTGATTTAGGTTTGGATTCTTTAGATGTTGTTGAAGTGATTATGGAATTAGAACATGAATTTAATATTCAAATCCCTGATAATGAAGCCGATAGTTTAAAAACTGTTGGTCAAACTATTGATTATATTTTAGCTCAACCAGATTCTTGTTAA

配列番号２５:
MFRTTLLKSLRASVSKPSMVKTIQSSSRSLFTITTITNNKNVTPLTSSMNFIRCYSAFPELTRDIAKERIIELLEGYDKVDQSKGEITEQNSFTSDLGLDSLDVVEVIMELEHEFNIQIPDNEADSLKTVGQTIDYILAQPDSC

配列番号２６:
GACGAC GAC AAG ATG GTT GCC CCA CCA ATT TC

配列番号２７:
GAG GAG AAG CCC GGT TTA TTT AGA TTC TTC TTT GT

配列番号２８:
GAC GAC GAC AAG ATG AGT GCC TTC CCA GAA TT

配列番号２９:
GAG GAG AAG CCC GGT TTA ACA AGA ATC TGG TTG AG

配列番号３０:
CACGGTTTCACCAGTGTCTG

配列番号３１:
GATCTAGGCTTGGCCAAGTCGGCCGCTGGAAAAATTTCCCCGAGA

配列番号３２:
CGGCCGACTTGGCCAAGCCTAGATC

配列番号３３:
TGGGGAGGGTATTTACTTTTAAATA

配列番号３４:
TATTTAAAAGTAAATACCCTCCCCAATGCCAAAAGTAGGCACTGT

配列番号３５:
CCTTCTGACGAAGTACTGTAGCAA

配列番号３６: GGAAATTTTTCCAGCATCGAGTTAGTAGCTCTCTGTACCTTAATATCTACTACATGTGATGCCAAAAGTAGGCACTGTATTGGGTATAGGTGTTGATATCCCAGGGTTTTCCCAGTCACG

配列番号３７:
CTTTAGATTTGATAAACCTTCTGACGAAGTACTGTAGCAATTACAAGAGAATCATCATGTGAGATACTAAGATGGAACTCTTCATCAGACAATTTGTATCACTAAAGGGAACAAAAGC

配列番号３８:
GCTGTTCCCAAGTTTGGTGT

配列番号３９:
TGCTACTGGTGAGGCATGAG

配列番号４０:
CAAGACCCATCACAATGTCG
配列番号４１:
ATTGCTGTGGATCACGTGC

配列番号４２:
GCTGTTCCCAAGTTTGGTGT

配列番号４３:
GCCCATCTAATAGGTTGAGC

配列番号４４:
GCAATTCTTGAACGAGCACA

Claims (12)

  1. 抗真菌剤の同定方法であって、候補化合物が
    （ｉ）配列番号１０又は配列番号１９によって示される配列を含むＰＰＴＢタンパク質、
    （ｉｉ）（ｉ）と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質、
    （ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の、少なくとも１００アミノ酸の長さを有する断片を含むタンパク質、
    を阻害するか否かを決定することを含み、
    ここで（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の阻害は候補物質が抗真菌剤であることを示し、且つ（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）はＰＰＴＢ活性を有する、方法。
  2. 候補化合物が（ｉ）、（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）によるＡＣＰへのホスホパンテテイニル基の転移を阻害することが可能であるか否かを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
  3. 転移の検出がＡＣＰに結合しているフルオロフォアの蛍光特性における変化を測定することにより行なわれる、請求項２に記載の方法。
  4. ＡＣＰ分子が
    （ｉ）真菌ＡＣＰ、
    （ｉｉ）ＰＰＴＢタンパク質又は変異体と同じ真菌由来である真菌ＡＣＰ、
    （ｉｉｉ）配列番号１２又は配列番号２３によって示される配列を含むＡＣＰ、
    （ｉｖ）（ｉｉｉ）と少なくとも９０％の同一性を有するＡＣＰタンパク質、又は、
    （ｖ）（ｉｉｉ）又は（ｉｖ）の、少なくとも１００アミノ酸の長さを有する断片を含むＡＣＰタンパク質、
    である、
    請求項２又は３に記載の方法。
  5. ＡＣＰ分子又はその変異体は、１つより多くのＡＣＰを発現する真菌のものであり、かつ該真菌によって発現される少なくとも１つのＡＣＰ分子は、ＰＰＴＢの基質ではない、請求項４に記載の方法。
  6. 転移の検出が蛍光偏光法を使用して行なわれる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 以下の条件下で行なわれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法：
    − ５０ｍＭ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、及び／又は１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び／又は
    − ｐＨ６．７５で、及び／又は
    − １％ｖ／ｖ ＤＭＳＯを用いて、及び／又は
    − 酵素活性が時間及びタンパク質濃度に関して直線範囲内にあるようなＰＰＴＢ酵素濃度で、及び／又は
    − ２０〜４０分間インキュベートされ、及び／又は
    − １５〜３０℃の温度でインキュベートされ、及び／又は
    − 停止試薬がｐＨ８．０の６０ｍＭのＥＤＴＡであり、及び／又は
    − アッセイが＞０．７０のＺ’値を有し、及び／又は
    − アッセイが＜４％の％ＣＶ１００％値を有し、及び／又は
    − アッセイが＞１５のＷ値を有する。
  8. 該方法において、少なくとも５日間まで安定なＡＣＰ産物が形成され、それゆえ５日後にＺ’＞０．７０、％ＣＶ１００％ ＜４％且つＷ＞１５である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 少なくとも１０，０００の異なる化合物がスクリーニングされるハイスループットな方法である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 少なくとも１０，０００の異なる化合物が７０時間未満でスクリーニングされる、請求項９に記載の方法。
  11. 候補化合物の阻害曲線を決定することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 以下に基づき化合物を選択することを含む、請求項１１に記載の方法：
    −ＩＣ５０が１０μＭ以下であるか否か、及び／又は
    −阻害曲線がシグモイドであり、５％〜９５％阻害の範囲が阻害剤濃度の２対数スパン内であるか否か。
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