CN116375832A - 蛋白质ZmFIGL1在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白质ZmFIGL1在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用。蛋白质ZmFIGL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。实验证明，与玉米自交系B73相比，突变体Zmfigl1‑1和突变体Zmfigl1‑2终变期染色体的交叉形成数量显著降低。由此可见，蛋白质ZmFIGL1可以调控玉米减数分裂交叉形成，蛋白质ZmFIGL1的含量越低，玉米减数分裂交叉形成的数量越少。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZmFIGL1在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用。
背景技术
玉米作为三大粮食作物之一，为人类的文明进步做出了不可磨灭的贡献。由于玉米籽粒和植株在组成成分方面的特点，决定了玉米的广泛利用价值，包括食用、饲用、工业加工等多种用途。为了进一步挖掘玉米在产量、抗病、抗逆等方面的潜能，需要不断的改良和优化自交系来实现优良等位基因的组合，从而源源不断的培育出优良的玉米品种，而研究玉米减数分裂重组便是增加优良遗传变异的重要途径之一。
减数分裂是生物生殖细胞染色体数目减半的一种细胞分裂方式。在减数分裂过程中，亲本的DNA只复制一次，但是细胞却连续分裂两次，最后产生染色体数目减半的雌雄配子。在减数第一次分裂过程中，同源染色体完成配对、联会以及遗传物质的交换。在减数第二次分裂中主要是姐妹染色体的分离。减数分裂对于物种延续的重要性不言而喻，一方面染色体数目减半的雌雄配子在完成受精后形成正常染色体数目的合子，使得物种在世代传递中保持染色体数目的恒定，保证了遗传上的稳定；另一方面减数分裂过程中非姐妹染色单体间遗传物质的相互交换即减数分裂重组，产生优良等位基因的组合，提高了后代的遗传多样性，从而增加物种适应自然环境变化的能力，保持了物种的延续。因此，减数分裂的重组过程为充分利用其遗传多样性进行创新育种提供了遗传学基础。
研究表明，不同物种间基因组的大小以及复杂程度差异很大，但是减数分裂交叉(Crossover，CO)形成受到严格的调控。在大多数的物种中，每对同源配对的染色体形成的交叉少于3个，而绝大多数的同源染色体间只形成1个交叉，保证在减数第一次分裂的时候同源染色体能够精准分离。不同玉米自交系间交叉的数量存在一定的差异，但每个减数分裂细胞形成的交叉数不超过20个，也就是说每对同源染色体间平均形成的交叉少于2个。根据是否受交叉干涉的影响可将交叉分为干涉敏感型和干涉不敏感型两种类型，干涉敏感型即一个交叉的产生会抑制其附近一定范围内另一个交叉的形成，而干涉不敏感型即相互靠近的两个交叉的形成互不干扰。相对于交叉形成的下限，对于每对同源染色体上形成交叉的上限并不特别清楚。理论上来说，促进交叉的形成将增加同源染色体之间遗传物质交换的概率，使得产生优良等位基因的组合以及打破不利基因连锁的几率也随之增加，进而为遗传育种提供丰富的遗传变异材料。同时，减少甚至是完全消除交叉的产生在作物育种中也具有较大的应用前景，例如水稻通过无融合生殖的方式实现了杂种优势的固定，其中减数分裂基因OsPAIR1突变后能够完全的消除掉交叉的形成，从而保证产生的种子与杂交种F1的遗传背景完全一致。此外，交叉形成蛋白可促使DNA双链断裂被修复形成交叉，在人为操控同源重组的过程中应用此类蛋白，迫使其在特定的位点形成交叉，有目的的实现遗传物质的交换。
发明内容
本发明的目的为调控玉米减数分裂交叉形成。
本发明首先保护一种培育减数分裂交叉形成减少的玉米的方法，可包括降低玉米中蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性，从而减少玉米减数分裂的交叉形成；
所述蛋白质ZmFIGL1为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与玉米减数分裂交叉形成相关的蛋白质。
其中，SEQ ID NO：2可由597个氨基酸残基组成。
上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO：1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上标签的编码序列得到。
上述方法中，所述玉米可为玉米自交系B73。
上述方法中，所述降低玉米中蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低玉米中蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性的目的。
上述方法中，所述降低玉米中蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性可通过化学试剂EMS诱变的方法来实现。
所述通过化学试剂EMS诱变具体可为通过化学试剂EMS诱变ZmFIGL1基因。例如在玉米自交系B73中通过化学试剂EMS诱变ZmFIGL1基因的方法，得到突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2。
本发明还保护一种培育减数分裂交叉形成增加的玉米的方法，包括增加玉米中上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性，从而增加玉米减数分裂的交叉形成。
上述方法中，所述增加玉米中上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性可通过向玉米中导入编码上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的核酸分子来实现。
本发明还保护上述任一所述蛋白质ZmFIGL1在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用。
本发明还保护编码上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的核酸分子在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用。
上述应用中，编码上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码区如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列由SEQ ID NO：3所示的DNA分子、SEQ ID NO：4所示的DNA分子和SEQID NO：5所示的DNA分子组成；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述任一所述蛋白质ZmFIGL1的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
SEQ ID NO：1由1794个核苷酸组成，SEQ ID NO：1的核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ZmFIGL1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ZmFIGL1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ZmFIGL1，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质ZmFIGL1的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述任一所述的应用中，所述调控玉米减数分裂交叉形成可为促进玉米减数分裂交叉形成或抑制玉米减数分裂交叉形成。
上述任一所述突变体Zmfigl1-1和上述任一所述突变体Zmfigl1-2均购自MEMD数据库(网址为：https://elabcaas.cn/memd/public/index.html#/pages/search/geneid)，产品目录号分别为EMS4-049bf4和EMS4-190934。
实验证明，与玉米自交系B73相比，突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2终变期染色体的交叉形成数量显著降低。蛋白质ZmFIGL1介导RAD51、DMC1参与单链入侵过程进而调控交叉的形成，即蛋白质ZmFIGL1作用于单链入侵过程正向调控交叉的形成。由此可见，蛋白质ZmFIGL1可以调控玉米减数分裂交叉形成，蛋白质ZmFIGL1的含量越低，玉米减数分裂交叉形成的数量越少。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为ZmFIGL1基因的结构、突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2的突变位点鉴定以及Zmfigl1-1差异剪切的检测结果。
图2为蛋白质ZmFIGL1调控玉米减数分裂交叉形成。
图3为实施例3中的荧光免疫分析实验结果。
图4为实施例3中的酵母双杂交和分裂荧光素酶互补实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、ZmFIGL1基因的获得
本发明的发明人经过大量实验，在玉米自交系B73的基因组中发现了只有一个拷贝的ZmFIGL1基因。ZmFIGL1基因位于第3号染色体，全长35432bp，共13个外显子(见图1)。
ZmFIGL1基因编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。ZmFIGL1基因编码蛋白质ZmFIGL1。蛋白质ZmFIGL1的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
ZmFIGL1基因全长的核苷酸序列依次由SEQ ID NO：3所示的DNA分子、SEQ ID NO：4所示的DNA分子和SEQ ID NO：5所示的DNA分子组成。
SEQ ID NO：1为
ATGTTGCAGCCCGAGGTTGTAGCTACACAGGAACACAAATTCAGTGCAGCTTTTGAGCTTGCAAGAACGGATGTTGGCTGTGTTTTTGCAAATCAGGGTGACAATAATGTTGAAAGAATCCAGCGTTCGAAGTATTTCCAAGCTCTTCTTCAGAAGTCTAAAGCAAATGTTTCTGAACAACGGAATGCAACATGTCAAGAGTTCTCAGTTCAATGGGCTCCATGCGTCGATGAAAGCCAAGCTGAAATGGAAAATGAGAAGCTAAGCATCAGGGCTTCAAAGTTAATGATGCAAACGAAGTTGACATCATTGTATAGCAGTAAGTCCTTGAAGACAAATGGCGTACCCAACAAAAATATGTTCAAATCAGAGAACTCATCTAAAGTGTGTGCCGGTGTTGAAAATAGAACAAGTCAAAATAGTAACAGGCGGCATGCTTACCTGGACGTTGAGGAGGATGAGAAATCCCATGGGCAATTGCAGAATGCAAAGTGGAAACATACAGGGTTCAGAAGTCCTATATTTGAGGTTGCAAATTCTCCATCAAGTAATGATGAAGCTGATGCTCCTGCCAATGAGTTTACGACTGCCAAGAGAATGATGGGGTTGGATGTTGTGCAAAAGCCAGCACAAAATGGTCCACAAGGTGCTTCTGTATCACCACAATGTGATAACAACTATAGTACACGGAATTATGGCGTGAGACCAAGTTGGAATTCTCGTCGTGGACCACGTGGTAGTTTTATACCCCCTATCAGAAACAATGGAGGATCAGGTACAACGATCTCACGGGTCACTGGTAAAAATGACGAGTCCATGGAAGATTCAACAAGGAAATGTATTGAAATGCTTTGTGCTCCTGATGGTGAGCTTCCTGAGAAGCTGAGGAATCTAGAACCTCGCCTTATTGAACATGTCAGTAATGAAATAATGGATAGGGATCCTAATGTCCGCTGGAATGACATAGCTGGTTTGGAACATGCAAAGAAGTGTGTGACAGAGATGGTGATATGGCCACTGCTACGTCCTGATATATTCCGTGGTTGTCGGTCTCCTGGAAGAGGTCTACTGTTGTTTGGACCTCCTGGAACAGGCAAAACCATGATTGGAAAGGCAATAGCTGGTGAAGCCAAGGCAACATTTTTCTACATATCTGCTAGTTCACTAACAAGCAAATGGATTGGTGAGGGTGAAAAACTTGTTCGGGCACTTTTTGGTGTGGCCAGTTGTCGTCAACCTGCTGTCATATTTGTGGATGAGATAGACTCATTATTATCTCAGCGCAAATCAGATGGTGAACATGAATCAAGCAGGAGACTGAAAACACAGTTTCTAATTGAGATGGAAGGTTTTGACACCGGAAATGAACAGATCTTACTTATAGGAGCAACAAACAGACCCCAGGAACTGGATGAAGCAGCGCGCAGGCGACTCACGAAACGTCTATACATCCCCCTTCCTTCATTAGAAGCACGGGCTTGGATAATTCGCAATCTATTGGAGAAAGATGGACTTTTCATGCTCTCGGAAGAAGAAACAAGTGCCATCTGTAAATTAACTGAAGGCTACTCAGGATCTGACATGAAAAACTTGGTGAAAGATGCCTCAATGGGACCACTAAGAGAGGCTCTTCAGACGGGCGTTGAAATCGCAAAGCTCAGCAAGGAGGATATGCGGCCAGTGATGCTGAAGGATTTCGAGAATGCTATGCGGGAGGTAAGACCTTCTGTTTCCTCAAGCGAGCTGGGGACTTATGAAGAATGGAACAGGCAGTTTGGGAGCCTATCGATCTAG
SEQ ID NO：2为：
MLQPEVVATQEHKFSAAFELARTDVGCVFANQGDNNVERIQRSKYFQALLQKSKANVSEQRNATCQEFSVQWAPCVDESQAEMENEKLSIRASKLMMQTKLTSLYSSKSLKTNGVPNKNMFKSENSSKVCAGVENRTSQNSNRRHAYLDVEEDEKSHGQLQNAKWKHTGFRSPIFEVANSPSSNDEADAPANEFTTAKRMMGLDVVQKPAQNGPQGASVSPQCDNNYSTRNYGVRPSWNSRRGPRGSFIPPIRNNGGSGTTISRVTGKNDESMEDSTRKCIEMLCAPDGELPEKLRNLEPRLIEHVSNEIMDRDPNVRWNDIAGLEHAKKCVTEMVIWPLLRPDIFRGCRSPGRGLLLFGPPGTGKTMIGKAIAGEAKATFFYISASSLTSKWIGEGEKLVRALFGVASCRQPAVIFVDEIDSLLSQRKSDGEHESSRRLKTQFLIEMEGFDTGNEQILLIGATNRPQELDEAARRRLTKRLYIPLPSLEARAWIIRNLLEKDGLFMLSEEETSAICKLTEGYSGSDMKNLVKDASMGPLREALQTGVEIAKLSKEDMRPVMLKDFENAMREVRPSVSSSELGTYEEWNRQFGSLSI
SEQ ID NO：3为：
TACAATGAACACGAAAGTCATTATTATTTTTAGCCTTGGCGCTATATGTTTGTTAGCAGAGGTTACATGATTCTTCTTTCGGAATAGGCGGAAAAATGAGAGCCTTCACTGTTGTTTATTTAGTAGAGGTTGAGATCGTATTTCAAATTATTAAGAACACTATTGTTTTAGATTCTTTCACATATTCATACGTTTGAAAAAAAACCGCATTCTCCATGATGTTTTGGTCATAGAGAATGTAATAAAAGTCCATTAAATAGCATTGATACTCCCATACTATAGTATTTTCCTTTGTGTTGAGGATTAATGCAACCACAGTGTTGTGGTTTGAACACTAATCGAGAAGGCCTCTTTACTGTTGTCTAGGTCAGTTATAACTTTCATATATGTGCTTCCATACACTTTAATGTTAGTAGTACAATTGCTGTTAGCAGATTAAAAACTTAGTTAAACATATGCGTACTCACATATTTATTATTTCTCTTTACATCAAGGATTCCCATGGACATGTGGTTGTCCATTACACAGATGTTGATACAAATGTTCAGCTCCTTTTTAGGTAAGTTATATGCACTACCTCTTTCAGTGACAACATGTACACTTATGTATTTATGTTGCGATGTTGCTTGCTTTCGAGCATTGTGACACAGTCACACTGCTACCAATATTTTTATCTAACACAATTAAGAAGTAGAAATGTGATGTTCTTTTAGCATTTTTTTTCTTTGGTTTGGAGGGGACCCAAGAAATGCTACAAGTTTTATTTGCTTCTAATGAAAATTATTGATATGTCGTCGGTTCCAAGCGATAGATATGTCGGCTAATCGTCTCAAGGAGAAGGATCCACCCCTGATTTTGTACCTGCACTTAAAAGCGCACAATGTCGAAAAAGAACTTGACATCAGATGTAATTTCTCTGTTTTAGAAAATATACCTCAAACTTTCTGACATAAGATATTCCTTAACATATTAACATATAGTATAATTGGTAGGTCCTCCTACTGGATACAAGAGAATCACAATAAGCTCAGAAACATATTTTGAATTAACGTAGATTGGCTTTGAGAGGTAAAAAATATGTACCTCATGTAGATAAAATAGATACATTTATTCTATCATGGCTATGAAATGACCTAAGTGATGAGTAAAATATGTAGGTCCACCATATCAATAGAAATGCAATGTAGATATTTAAGTAGTGAGTACATAAAAGCGCTTAAAGGTAAGTTATACAAATCTCTGTTATATTCTTAGACAGGATCAAGAAAAAAGTCCCTTCCAATGAAAATAATAGGTCAACGTATCTTGATTTCACCAGGTACCGTTGCTCATGTTGCAGCCCGAGGTTGTAGCTACACAGGAACACAAATTCAGGTACATTTTACACCTACATATCATCCTACAAACATGTTTTTTTCCTAACATTTTGTATGTTACCATAAAATTACTTTGTACACTACAGATATAAACAGTTTCATCTCAGATGACACAACAACAGCCGCAATATTTTGCTTTGACAATATTGCTAAACATATTCTTGGAAAACCTTGTGAACCCTGATGTCGTGAACACCTTTATGCAGTACATAGCTAATGTATTTTTATGATATTAATCATGCCCCTAGGACATGTTGCTACAACAGACCCTTTTGCATGTATGTATAGGACTATAGGTGATAGATCGATATCTTAGGCTACTAATAAATAGACTTGCTAGAAACGTACTTATATTGATGAGTACAATGCTGCTTGGAACATGTTGAACTAATCTGATTAATATATTTTTGTATGGCTTTTGTTGTGGTCGCTTATACAAGCCTACATATATTGCATTATTAGTACAAGCAAATCTTCTATACATGGGCTTCTATTCGCCAACTCTTTTCTATTGACTTTACCCTTACATATATATACTATGAGTTTCATATTAACTTACATATCATGTTTCTTACATACATATACTAAGTTTTATATTAACTTATATATATATATATATATATATATATATATATTCTGTATATTTTAAGATCCTGCAATCGAATTTGACATCGCGCGCTGGGCGCGCGACATACACTAGTATGTTAATAAAAGGAGAAGCATATGAGATATAAGAGACACCATGAACAATTGTATAACA
TTATTAATTCATTCTCATTTTACTATTATTATGGAGAAATAGAAACAATATTGAATTAATAAT
GTACCTTCGGCTTGACAGAAGATAAAAGTACAAGCGTGAAGCACGAGCCAGTACAAGT
CAGCGTGAACAGTACGGGGGTACTGTTCATCTATTTATAGGCACAGGACAGAGCATGTG
AGGAATTACAGTTATGCCCTTTACATTTACTATTGACTTATAGAAAAATCTATGAGGACTA
GATAGCCTTTTCCTCTTTAAGTCGGTTCCTTTTTCCGCGATTGAGCCGAAGCTCCCTTGC
GCATAGCTTCGGAGCAACGACAACCTTCGTCATGATTATGCTCTTCTCATCGTGTATGCTT
TTAACCTGAGTCCGAAGGTACCTGTCCATAAGCCATGCTTGGAAGACATTGTTAAATTAC
GTTTTTGAGGACCTTCAAAGGACGAAGGCCCCAACATATAGGGTGTTTGGTTTAATGAAT
GAGCTAGTGCATCATCTTCTCACTTCTCATTTTTTGGTTTGTGGAATGAAATGAATTGATC
CATCACCACCTCATTCCTCATAGTTAGTTAGTACTAATATGAGAAATGGAGTCATCCTACC
AAATTTGAGAAATGGACTCATGATGCACTATCTCATTTTGGATAGAGTGATTTCTCAAAC
CAAACACCCTATTAAAGTTTTAAACAACATACACTTCGGTTCTCTCATGACAACTACTAA
TTATCAAGAGTAATCAAGAAAACTTAGAAAGTGTTTGCTTTGAGGAATCACTCCATCAA
AGATTAGGTGGTGCATCATAAGTCCATTTCTTAAATTTAGGAATGACCCCATTCGTTATGA
GCAACGACTAATATGCAAGCATCCATTATGTGCAAGCGTGCAAGCAGATCTTTTGGTCCG
CTAGATCTAACCGTATGCTATATTTAATATTTAAATCCTCCCACCACCACTCGTGTACTTTT
ATAAAAAAAGTCCCTAACAAACCACAATTACACATATAGTTGGATTTAGATCCAATGTATT
AAAAGAGCTGCTTGCACGCTTGCATCTAATGAATGCTTGCATATTAATATGCCTTCATTAT
GTTAGTACTAACTAACTATGATGAATGAGATGCTGATGAATCAACTCATTTATTTCTACAA
ACCAAACAAAAAAAGGAAGTGAAAAAATGACGAACTAGTGTACTCCTCAAACCAAAC
ACCCTATTATATAATTTAATTGTACTGCAGAAGCTGAAAGTTTATATGCAAATCAAACATT
TGGTAAATCTTGTTTTAGGGTCCATAGATAGAGAGAAGTCCTCGCCGCAAAAAAGTTGA
ATCAACTTATTTGTTGAAGCTGTTTCACGGTACATAGATAGGGATAAGTCCGGGCGCAAA
AAAGCGGGAAACAAAGCGAAGTTGGGGCGGCGAGACGCGAGACGCGAGACGCGAGA
CGCGAGAAATGGCGGAGCCGCCTTTGGCCGCCGGCTGCACGACAAACTGGAGGAGGG
AGGCGGATGAGCGGCTGCGGCGCCTCCACTCCCTCCTCTTCGGCGCCGACGCCGCACTC
GAGCACGGGGACGCCACGGTGGCGCAGGCGCTCGCGCTCCGCCTCCTCGGCTTCCTCG
ACTCTCAGGCGCTAGCCGCAGGCGCGGGCCCCGAGGACGCCGCCTTCGTCGCGCCCATT
CGCACCGCGGCTTCCGCTCGGCTAGCCGCCGCCTCACGCGCCCGCGCCTCTGACTCCGA
CCGGTACGGAACACCGCCCTCGTCCCCGTGCAATGCACCCCCTCCCTATTTCGCGTCCG
AACTCGTGGAACGCGACGGTAACTATGCTGACTGTCCAGATCTAAAATATTATACTTCAG
TTGCTGAGACGTTGCTACAAATTTTTTTAGATTTAGTGTATGTGGTTTGGTTCTCACTGAT
CTTTGGAATTTGCGTTCTCGATGTCTTCTATTCTCATCCATATGAGATGTGGATGCACAGC
AGCACAGGTGTTGCAGTAATGTTTCTGCACTATATATAAGCAGTGGTTGGTAGAGCATGT
ATTTATGTTTCCAACCAGAAATAACATTTTAGAAAGTGCATGGGTAGATGGAAAGATATC
CTGCTATTTCTTTGCATGCACATGCTCTTTGATGTTGCTGTCGATTGCGATGCTAAGGAAT
TCTCATTGAAACTACTTGCTCAGTTGCAAGTAGCAGAATACTAGTCAGCTGGTACATGTG
CTAAAGTTGAATCTAACATGGGCAAACATGTTAGTAGTTGTTAAATGGGATGTTTATAGA
AAAGACATATTCAAAGTAGATGGTTCTATTCCACCAATATTAAGGTTGTGCAAATGTTTG
GAGTGTCACCATGTTCTACAAATGATTTATTGCTATCTAAGTTCTGTAATTGAAGCAGCAG
CCTCATCTTATATAGGGTTCACTAGAGTAATAATATTTCGTTTTTCTTATTTCTTTCGCATTG
TTTAATGTTTATGTTTTATTTGAAGCATAGTTATTAAGGCGGCAAGGCGAAGTAAGGCGA
CCGACCCCCCTTTTTATCTTTTAAGTAATAAGGCGTAAGGCGAGACGATGCCTTAATAATA
TATAAAAATAGATAATAAAAATAAAAAAACATAGAAATATAGTCTCAAATAGATGTATTAC
ACTAGCAAATAGGGTCTAGTCAGTCCAAGAAGCTCATAAACCAGCCCAGCAGCCCACTT
AGCCCATCAAAATTAGGTTACCCACCCCACACCTGCCAGCCACTTCTTTCCGTTCCCTCC
CATTCGCTCCCTAGCCGTCAGGCTCTTCTCCCCCCGCTGCCAACAGCCCAGCACTGAGC
TCGTCACCACCAGCAGCCCAACACTCAGGTCGCTGCCGCCAGCACTGCTCTGCGCATGT
GCGCCCCCTCTCCTCTTCCCTCCTCCCTCTATCTCGTCGCCAAATCTACTCTGGGCGGGC
GCCGGGCGCCTTCTAGGCCACCGACGCGGCCACTCAGGCGCGCCCTCACAACTGCCTTT
CCCTCCCTAACGTGGGTGCCAATGGGCAGAGTCCTCTCTCCCACTCGCATTCTGCTCGCC
TTAGGCGCTGGGTAAGGCGAAGCGGACGCCTTGTCTCGGCTGAGCGCTTTACCGCCTAG
GTGACGCTTAAGTGTCGCCTTGAGGACGTCTTAATAACTATGATTTGAAGCACCAATTAT
GATTGGCAAAGACCTGTAGCATACTACTTTTAATATTTAAGAAGCAAATAACCTTGGTTC
CTCGGACAATTTGTTCTCTTTCTCATGTGAAACATGTCCCAATTGTGTACTATCTCACAGA
TATAATTTTTTTGAGACCAGCACCTGTATTATAGTGTGCTAGTGTGAGACCAAAAAGGGT
ATATGTATCATAAGGCATGTTTAAGCATTCGAGGTTTGAAAAGTGTCAATTAAGAAATGTT
TGTGCAGATTTAAACCAATATTTGGAGCTTCATAAACAGGAATATCTGCAGCAACTTAAA
AAATTGTTGAATGTTCCCTTATCAGTCCCAGAAGTAGTAAAAGTTGGTTTTTTGTTTTTTT
CTATCTCTTTTAGTTTAGTTACAATAGCTGAAGAAAACAGTTATGCAATTTCTGCCTGTGG
TAATATATATTCATTTATAAAAATCACTGTTTGCTTTTGTATGGGTTTGGATTCTTGGAGATT
ACACTATAGCGTGTACGGTACATTCCTCTTTACGTGTTAATACTTGCCATTGATGTTCTTG
AGTTCAGTGCAGCTTTTGAGCTTGCAAGAACGGATGTTGGCTGTGTTTTTGCAAATCAG
GGTGACAATAATGTTGAAAGAATCCAGCGTTCGAAGTATTTCCAAGCTCTTCTTCAGAA
GTCTAAAGCAAATGTTTCTGAACAACGGGTATGATTTTCAACTTATTTTACTTCTCTTTTG
TGGTATTCTATAGTCTATACGTTTTTCATTTCATACCATTCTTCCTTAACTTTTCTGTTTATT
AAATTATCTATGAAGGGTGGTGTTGTCCTTACTGCTTATTATTAAGCACTATTTGAAGAGT
TACATAGATTTTAAAATTATTTCCACACTAACTTTAAACACCTTTTCTTTGCATATGATATG
CATTGAAATTTGAAAGAATGCAACATGTCAAGAGTTCTCAGTTCAATGGGCTCCATGCG
TCGATGAAAGCCAAGCTGAAATGGAAAATGAGAAGCTAAGCATCAGGGCTTCAAAGTT
AATGATGCAAACGAAGTTGACATCATTGTATAGCAGTAAGTCCTTGAAGACAAATGGCG
TACCCAACAAAAATATGTTCAAATCAGAGAACTCATCTAAAGTGTGTGCCGGTGTTGAA
AATAGAACAAGTCAAAATAGTAACAGGCGGCATGCTTACCTGGACGTTGAGGAGGATGA
GAAATCCCATGGGCAATTGCAGAATGCAAAGTGGAAACATACAGGGTTCAGAAGTCCTA
TATTTGAGGTTGCAAATTCTCCATCAAGTAATGATGAAGCTGATGCTCCTGCCAATGAGT
TTACGACTGCCAAGAGAATGATGGTATGCACAATTGTACGAATATGTACTTTTACCTGTG
CTGCTGATCGTCTATTATTTGTTGTATCATTTTATGTCCTGTTTGGCAAATATTTAGGACAA
GGGTTTGTATGCAAATTTCATAAAACACCAATGGTTTTAAATAGATAAATTACAACGTTTG
TTTTATTCAATTATAGGCTTGTAGACATTGGCTGTCAGTCTGCTTCTGTTTATACTTTATAG
GTTGTAGGTCTTGTTTGCATTAGTTGATTGTTATTAAGTTGCTAGCTTAAATCATATCATTT
TGTTTTTCTAAAGAACTACATTGACTAGTGCCCTAGCTAGGTAAATGGTTTGTCTATTTCT
CGCTTTTGTAGCTGCTGTCACTGAATGCAATCCTGAATCAGTGAATCACCAATATCAACA
GACAATACTATTTTTTGGGAAATATTTGTGTCAAATATTTATTTATTAAAATGTTGCTCTGT
AAATTATGATAATTGTCTCTTGATTAGCAAATTTGTCTCCTTCATCAAGCTATGTAAGTTCT
TTTTAGCTTCTATGCAAAGCTATAAACCCTTTAACCAAGGGATTTATTGCATGGCATGACA
CCATTAGCCACATATGTTACACACTTTTGAACTTCCATTGTGACACTAATTAATTGCCCGT
GCATTGCTACGGTTTCTATATATTATATTGGTAGATCTTGGTTAAATGAGATAGTTCTTCAA
ACACGATCCAAACTCAGAGATTCTCAGTTCGCGCCAAAGTGAGGCAATCGGGGATCAG
GACAGGGTCAACACAAGCACTGTTAGTCGGCGCGTCTAGCCAAACCAATGCCGAGCTA
GGCGTACAATGGTGCCGTCCCCCTTAGCACGGCGGATGCGACGGTGCGCCTCACGCAGG
TTTGAATGCGCGACGACGCAATCATGGGGTCGGGTCACACGGATCCGGCTGCTCGCATT
GCACCTAGGATTTCACCCTAGAGATGCCGGCGACGATGTGCTGAGAAGAAAGGTGGAG
ATTTAATAGTATCATGGCCCAACTCGACACGATTCAAAGTGGGTCTGTGCCATCTGTCTC
GAGAACCGTGAGTGCCTGAGCTGTCTTCTCTTTCTGGCACGATTATAGTTTTTTAGTTTTC
AAATTATTCATATGCATATATTTATATACATATATTTAGTTGGCCTTATATTGCTAGTGTATCA
ATGTTTTCAAGTCGTCCGATTAATCACGATTAATAGTCCAAGTCGGTTTGGAAAAAACGC
GATTAATCGCCAAGTCGTCTGACTAATCGCCAAGTCGGTTTGGAAAAAACGCGATTAAA
ACCCAAGTCGGTCAGCCAGAACGACCAGCAAGTCGTCCGACTTGAAAACATTGTACGA
TATGCATATATACAATTTTACCTAGACCTAGAATATATTATAAATTATTCAAATATGTGTTAG
GTTTGTTTTTCTTAGAAAATATTAGTGGAATTTCCTAGAGTTGGTTTCATTAATAGCACAA
CTTCGTCAATTTGTAACTAAGTTAAATATATTTCTTTTGTATTGCACAAGCACACTCTAGG
TCCACCGGTTAGAGACTTGAGCTTCGTGGTTGGCGGTCGCGGGTTCGAACTACAGCGGA
CGCATATTTCGGTTCGAGTCCTGCTTTTATTATTCCTTAGCGTGGGAGGCAGGCGGGAGA
AGATGCGCATGCGTGTGAGGAGGGGAGATGCACGAAGGAATTATTCACACTTAAATATA
GTAGAGTTGTCCCTCCCACGCTTCTTTACCTGCATTGATGATAATTCTAATGACTTGCCAA
CGTAATTGTTGGATAGAGCGAAACCCTAACCCTAATTGGGCAGGGGATATACTATTTTTAT
CCAGGAATGTGGGTCAAGGCCCATTACAATATACACATCACACTAACACCCCCTACAGTC
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GATGCCCCTTGGTGAAGATGTCGGTGAATTGTGAAGTGGTCAGGACGCGAAGAACGCG
GACATCGCCGACAACCACACGAGCGCGGGCGAAATGAAGGTCAATCTCTACATCCTTCC
TGCGTTGTGCTGCACGAGATTGGTGGAGAGATTGACTGCGCTGACGTTGCCGCAATAGA
CGACGGTGGCACGAACGAGGGGGTTGTGGAGCTCCTGGAGTAGTTGGCAAAGCCAGG
AAGCCTCGACCACGCTGTTGGCCACAACGCGATACTCAACCTAAGAGTTGGAGCGGGA
GACGGCAGGCTGCCGCTTCGAGGACCAAGAGACAAGGTTAGCGCCTAGGAACACGACA
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GGCCAAATGAGGTCGTAGTCGAGGGAGCCGTGAAGGTAGCGAAGAATCCGCTTGACAG
CGGTGAGGTGGGGCTCCCGCGGGGTGTGCATGTGAAGGCACACGTGCTGGACCGCGTA
GGCGATGTCGAGCATGGTGAACAGGTGAAGGTGAGATACTAGAGAGCCTCGGTGAGGT
TCCGGTAGGCCATCACGTCGCTGACCGGGGCGTCGTCGTCGTTTGAGATCTTCGTCTGA
GTGTTAGTAGGTGTGGAGCAGGGCCTGCATTCAGACATGCCACCCCGCTCCAAAATGTC
AAGGGCGTATTGATGCTGGTGAAGGAAGAGGCCCTAGGGGCGCTGCTCCACGATGACC
TCGAGGAAGTCGCGGAGAGGGCCGAGGTCATTCATCGCGAACTCACGCTGTAGATCGA
CGATCGTGCGTTGGAGGGCGACACTAGACGCTGTGAGCACGATGTCGTTGATGTAGAGG
AGGTAGACGGTGTCGTCGCCGCGTCGAAGGATGAACATGGACGTGTCCGACTTGGCTTC
GACGAAGTCGAGGGAGACCAAGTAGGAGGTGAAGCGACCATACCAGGCCCGAGGCGC
CTGCTTGAGGCCATACAAAGAGCGGTTAAGCTTACACACCATACCTGGGCGAGTGGAGT
CGACGAAGCTGGCGGGCGGGCTGGCTACAATACATTGTCTCGGTCAGAGTGCCGTGAA
GGAAGGCATTCTTGACGTCCAGATGGAGGACTGCCCAATCTTGGGCAAGGGAGAGGAC
GATCCAAACGGTGGCGAGCTTGATGACGAGGCTGAATGTTTCGTCGTAGTCCACTCCGA
GGCGCCGAGTGAAACCTCGAAGGATCCAATGGGCCTTGTATCGATCCAGGGAGTCGTTG
GACTTGAGCTTGTGGCGGAAGATCCACTTGCCGGTGTTCACATTGGTGCCAGGGGGACA
CGACACCAAGTCCGAGGTGTGGTTGGCTAGCAGGGTCACGTATTCCTCCATAGCGAGAC
GCCAATGAGGATCGACGAGCGTGGCATGGATGGAGGGGACAGGCAAGGGTGGCAAAGT
AACGTCGGCTGTGAGCACTAGTCGGTCGACAGGTCGAAGAACGTCGACCGATCGACGC
GTCACCATCGAGTGTGGCGTGGGTCGCAGTGGATAGCAACCGGATGGTGCACCAGCAG
CTCGCCACGGGAACGGGCCAGGGCATAGAGCGGTTCGTCGGAGGAGGGGACTGGTGG
ACCGGGCCACACATGTCGCTGATAGACGTGGGTGGGATCGACGAAGTGAGCCGAAGGT
GGGCGAGGAGGCGAGGCCGCCCGTGGCACGAGTGGATGTGACAAGGCTGCGTGTGGC
GTGGGTGGAGGCGACGTGTGGTGTGGGTAGAGGCAATAGGGTCGTGCGTGGCGCAGGC
GGAGGCAATGGTGCTGCTTGCGGCGCGAAAGAGGGTAGGGGAAGAGGAGGAACATCG
TCGCATCCGGCATCGAGGTCGGGAGGTGGGGCGGAGCTTAGTAACCAGGTTCCCGGATC
GATGGGATCGAGGAACGAGAACGTGGTACGCTACTAAAACTAGGATTTAACACTACTGG
AACAAGATTGTTCCCACGTTCTCGGAACGGAACGAACATTCCCGGAACGAGGAACGTG
GCCAAGTTCCCAGTTCCCGGTTACTAAGGGGCGGAGCCAACATGGGGGAAAACATCCT
CACCAAAGACAACATGCCAAGAGATGATGCGGTGGGTGAGAAGATCTAGGCATCGATAC
CCCTTGTGATCAAAGGAGTACCTAAGGAAAAGATAATGAGAGGATCTGCCGATCGGGGT
GAATGTTTGTGAGGAGCAGTTGCAAAAGTATTGGGATAGTAGGCACACCCGAAGACAC
GAATGTGCTTATAGGAGGGGCTGGTGCCGAAGAAGGCAAAGAACGGAGGGGGTGGTG
GACCGCCTTGGAGGGAAGACGATTGAGGAGGTAGATGGCTATGTTCAACGCCTCAACCC
AGTAGCGGGCGAGAAGAGAAGCCTGAAAAAGGAGACAACACATCATGTTGGTGGTGTT
ACGAATCATGCGCTCGACTCAGTCATCTGAGGGGAGGTGTGAGGGCACGACATCCGCAT
CACGCCGTGGGAGAGGTGCGAGACGTGGAGTTGTCAAACTCCCGTCCATTATCGCACTG
AACAACCCGGATGGTGCGACCGAACTGAGTCGACACCCACACAAAGAAGTGAGAAAG
ACTGTGAAGGTGCCAGACTTACGACGGAGGGGAAAGGTCCACAAGTAGTGAGAGAGTT
CTTCTAGGATGACCAGATAGTACCAGTAACCAGAGATGCTTAGAGTAGGGGATATCCAA
AGATTACAGTGGATGAGGTCAAAGGGGCGAGTAGCTCGGGACATGGAAGAAGAGAATG
GTAAGCAATTGTGACGCCCAAGTTGATAGACATGGCAAAGCGAGGTGGCGTTGCCGCG
GAGGAAAGGGATGGCTGAGGTGGCCGAGAGTCTGGAGAAGACGTCGTGGTCAGGGTG
GCCAAGATGATGGTGCCAAGTGGAGGTAGAGGTAGTGGAGGCGAGGGCGTAGAGTGTG
GCAACATGGGTAGAGGAAGGTGGGACAGGGAAGCGAATGGGATATAGGGACTGGAGGTSEQ ID NO：4为：
GTCGCATCGAGCAACCATAACACAAGTGGTAAGATCTCGTATGGTGAGCTTCCAAGGAT
CGAATTCCCTAGAACAGTGGTTGTCAGTGGTGAAGCGACAGAACGAGAGAAGGTTCCA
GATGATGTTGGGGGCAACAAGGATGTTGGTGAGGTAAAAAGACAGGGAAGGACCGTGT
CACCTAATGAGGTGCCGTTGCCGACAATGATGTAGGAAGGGAAGGTGGGGCTATGAGGA
TGGGGTAAAGAGACAATAATGTAGTCAGTAGTGGTGTGGTACGAGGCTTCAGAGTCGAC
AACCCAGTCGGTGGGAGGAGGGGGCTGCGAAGACATGGGGTACGATTGAGCCAGGGG
AGGCACCCCCACAGAGCCACCGAGAGGGGGCTGGGGTCGGGAGTGGCGAGCATGATG
TCGGCGATCATGGGTGGAGGAGACGACAAGGCTTCGTTTGTCATGGAGACAATCGCGG
CATCATGGACACAAATGGTCCAGTAGCGTGGCGGTCCTCCTGAGGTTGTATGGAGGCCG
AAGGGTGGAAGAGCTCGATGTAGACACCGAGAACCGGGTTCATGACCCGATCAAAGGC
CACAGATGTGCTCCGGAGAAGCTGTCCGTCGTAAAGAGAGACACACACGTGGTAGGGA
GGCACATGAACCGCGGTGGAGCGAAGGATGGATGTCGAAAGAGCAGGTGTAGGAAGG
GAGAGGCCGAAAGCGGTATAGTGGGTCGCAACAGAGCAGGGGGAGAAGTACGTGCTC
GCCAGTGGAGACCACATCGGGGCAGACCATGCACGAGGGTGAGGAAGAACGCTTGGC
ACAGAAAAGTGTGGCGTAGGCATGTAGCTGTAGGGATTGTTGTCAATGGGCGTGGGGAG
GAGTGGGGCTGCTGATGGGAGATTGGCCCAAGCTCCATGCAGGGGACGCAAAAGGGAT
GTCAGCGGTGTGGGCGTGGTCCTTGGCGCGCGCTTGTCGGCTCTGGGAGAGACGATGC
TGCGCGCGCTGCTGGGGAAGTGGAAGCCACACTCACCCACATTGGAGTGGATGCCGAC
GCTGGAGGAGTCGGCCGACGCAAGGCCGCCGCGTGGGGAGGAAGGCGCGTCGCAACC
AGGAGTAGAGGAACTGGGCACAGGGAGCGGCCAGGGGGTCGGGGGCGTGCTTGTGTG
GGGCGCAGTGCTGAGGAGATGGCCGTGTGGGGGCGCAGTGTTGGTTGCCGCTGGGGAA
GGGTCGGAGGGGGGCGCCAGCGGGGGAGGCGGCGACGCCCACGACCAGGGGAGAGG
AGGTGGGAGCGCGGGACGCGGGAGGAGTCGCGGGGCGCGAGGCGAGGCAGAGTCAC
GCACGAGCCTCGGTGAGTGAGAGGAGAGCGGCGGTGTGGGGTGGACACAACGTGGAC
TCGAGGCAAGTGGCCGTGACAGAGAAGTCACATCGGCGCTCAGCCTCGTCGGCCAACG
CGAGGAGCTCATTCGTGGACACGATGGCGTCGGACATGGCAGCAAGGAGGACAAGGGA
GGGGCTGGCGCCCGCGGGGGAGAGAGAGAGGCACCGAGGAGTGGTTGGCCGCCGCTG
GGAGGGAGGCCGGTGGCAGGCCCAGGTGGCTAGGGGAATGGGAGGAGGGAGAAGAGA
GAATCTAGCTGGATACCATGTTGGATAGATTGAAACCCTGATCCTAATTGGGTAGGATATA
TATTTTATATTTTTATATATCCAGGAATGTGGACCAAAGCCCATTGCAATATACATCACACT
AACAGTAATTTGTGCCTCTGCTGTGTTTTTTCCCTTTTCTAGGGGTTGGATGTTGTGCAA
AAGCCAGCACAAAATGGTCCACAAGGTGCTTCTGTATCACCACAATGTGATAACAACTA
TAGTACACGGAATTATGGCGTGAGACCAAGTTGGAATTCTCGTCGTGGACCACGTGGTA
GTTTTATACCCCCTATCAGAAACAATGGAGGATCAGGTACAACGATCTCACGGGTCACTG
GTAAAAATGACGAGTCCATGGAAGATTCAACAAGGAAATGGTTTGCATTTTCAACTTAA
GTATCAAATACCATTTGGATTATTTTATGTTTTGCTTCTTGTGATGGTTTTGTCACTAAAAA
TTGTGCATCACATATTCTATATGTCTAATGTGAATGATTAGTAGTCACACCTACAAACTATG
TATGTGCATATTCAATCTTACTAATATTTTTTTTTGGTAATTATCAGTATTGAAATGCTTTGT
GCTCCTGATGGTGAGCTTCCTGAGAAGCTGAGGAATCTAGAACCTCGCCTTATTGAACA
TGTCAGTAATGAAATAATGGATAGGGATCCTAATGTCCGCTGGAATGACATAGGTTTGTA
GTTTCCTTGTTGGTCTTCAGTATTTCTGTTGCCCCTGTGCTAATTCATGCCTCACTGCAAT
AGCTGGTTTGGAACATGCAAAGAAGTGTGTGACAGAGATGGTGATATGGCCACTGCTAC
GTCCTGATATATTCCGTGGTTGTCGGTCTCCTGGAAGAGGTCTACTGTTGTTTGGACCTC
CTGTGGGTATCTATCTCATCTTCTTGTGGCACGCCTCTCTTTCATGAATACTAAATATATGA
ACTATTTTCCACAGGGAACAGGCAAAACCATGATTGGAAAGGCAATAGCTGGTGAAGCC
AAGGCAACATTTTTCTACATATCTGCTAGTTCACTAACAAGCAAATGGGTATGCATGTCA
CTTGTTTTGATTTTTAACACTGATAATTTCATCAATTTACTATCAAAGCTGCATCATCTTTA
TATGCATACTCAAATTAATGTACCTTCAGAACCGTAACAGTCCCTACACCATTACCGGGTA
AATATCAACAGGAGGTGGCCAGATTTAAGTGGATTAGAGTACTAGAAGGGGGGAATGAT
TGGGGTCCAGGAGCTCATTCCTGCTTGATTGATATATACATATACACACACACATATATATA
TATATATATGTATATATGTATGTATATAACACTATTTGGTGGGAATTAAATTGATGCTTGTAG
CCATGGGATACAGGAAGTTGTTTTCTAATGTGTATGGTGGGTGTATGTTATCGTCAGATTT
AGAACCTAGTAGGCTGTTCAGGGTTTGGTTGCAAACCACTCAAACCAGCAAGCTAGGTA
CACCAAACTGCAAAGGAAGACGGTTTGTGTCGACCTGTCCAAAAAACTGTTGGACCCA
TTGTCTTCCTCATACGCCAAATCTGAGCTGTAAGATCCATTGTTCCCTGGTACTTGCTGTT
AGGACTTAGGAACTAGAGCCAGCATCACCGGCTAGCTACATCGGCAAGCTCCACGCTGG
TAAGGTCTTCCCAGGCCACACTGGTGAGCTCCACCAAGGCCATCCGCAGCCGTGGGTGC
TGCAACAGGGCAAGGCTCGTCGGAGTTGTGGCGTGGGTGTCAAACTGCGTCCTTGACG
TGGAGCTGCGATTCAAACTGCGATATGGACCTGGACACATAGCTGTGTTGCTGTCGCCT
GGACGTGTCAGCTGGACCAGCGACACTCACTGTGAGGTCAGGCTAGCGGAAGCGATGC
AAGCCGTGGCTGGATGTCATGCTGGAGCCAGTAGCGGTGGCAGTGCTGCACAACAAGG
AAAGCGTGGTTAAACTAATAAACCGTGGAAACCAATCCGCCTGGCGGACGTACAGGTTG
GTTTCAAAAACTATCTAAAGGGTCACAAAACCGTTGTTGAACAAGCCTAGTACCTAGGA
GATAAGCCCAAACCTTAGCTGCCTGGAGCAATGATATGTTCCCCAGCCCAAGAACATTGT
TCTAACTATTGTTCCAAAAAGACCTGCTTCATGTTTAACCTGTCAAACAAATCAGAAGAG
AGCCACTTTCATACTATGGTTTTTGTGTCCATCATCTTGTTTTCTGTGTTCCCATTCCTCCA
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GTACGTCAGCCCCTGTGGTGGTGTGGATTTCCTCGAGGAGACGGAAAGAAGGGGCCGA
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CCTGTTTCCTAAGCATGTCCTGTTTCCTAAGCATTCTCCTAGTTACTTGTGCTAGTTAATTA
TAGTCATTAAAGACCTTGAGCAGCTCAACAGGTGTGTGCGGCTGCCAAGGCTCCTATCA
GATTAGCTAAGCTCTAATGAGCTGTTATGTAATCAATGTGACTCATCTTTCTATATAATCAA
GCAATGATAGCTGAGGTTAATAGTCCCGGCAAAACACTCTGTCTACCTCTAACATTTGGT
ACCAGAGCTTAGGTTAGACACCTGAGAGCCTCAAGGCCGACTCCTCTCTTCTCTACTCA
TGTCGACCTCTGCTGAGCGCGCTGCCAGGCTCAAGGCCAAGGGAACCAGCGAAGGAG
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GAGGCGTTCGCAGTCACCACTGCGGGACCGGAGGCGCTGCCGCGGCGGTGGTCGCTAC
GAGTCGCCGCAAGGAAGGGTGGTGTACCGCGACTCCGACAGCGACACGGCGTGGCCGA
TGCTGGACAAGACGAATTACTACGAGTGGAGCCAGACTATGAAGCTAAGGATGCAGGC
GCGCGATCTCTGGGACGCCATTAAAGGCGGTCCTGTCCAGTTCCGCGATGACAGACGCG
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GGCTACGACGAAGGAGGCGTGGGACGCCATCGCTGCGACCCGCATCGGCGTGGACAGG
GTCCGTCGAGCAACGCTGCAGCGCCTACGCCGTGATTGGGAGAACATCAGCGTCAATCC
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GACTCTTGAGGAGGTGACTGGAAGGCTTAAGGCGGTGGACAATCGCGAAGAACAAGTA
CTGACCGAGCCGATGGCCATCAATGGCAAGCTGTTGTACACTGAGGAGCAGTGGAAAG
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GACGTGGTGGCGGACGAGGAGACGACAATGTTGCTGGCCGTGTCGGCCCCAACACCTG
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TGCACAACCTATCTGTCTCGCGGCGCGCAAGGATGTTGAGGCATGGCAGTGGCACGAAC
GTTTCGGCCATCTGAACTTCGATGCACTCCGGCGACTCAGCAAGGAGGAGATGGCGCGT
GGGATGCCGGTGGTCGATCATGTGGAGCAGGTATGTGACACTTGTGTCACCACGAAGCA
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TGCACGGTGATCTGTGCGGCCCAGTCACGCCAGCGACACCGGCGGGCAACCGCTACAT
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GATGGTGTGGTTGAGCGCAGGAATCAAACTGTGGTGGCCATGGCACGAGCTCTGCTCA
AGCAACGCCGGATGCCTTCTCGGTTTTGGGGGGAGGCTGTGATGACGGCTGTGCACATT
CTGAATCGATCTCCAACAAAGGCACTGAAGAATGTCACTCCGTATGAGGCATGGCATGG
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GGGTATGTTAGCAGATTTCTGGAGAAGCCAACAGCTGAACATCTTCAGGCTGTAAAAAG
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AACCCAAGCCTTGTGGTTGTCAAGGCTGTTTGCAGAATTATTGGGAAGAGAAGTTGAGG
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AGCTCGTCCACCATTGGAGTCGCGAACTTGTCCTTGAATGTCTTGTCATTGAGTGTCCTA
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AATCATCAGAATAAATGTATTTTTGATGGCTGGACCCCTAATGTTTCTCTAGCTCTCAAGA
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GCTGCCCTTCTCCCTATAGCATAGCTGTTGTTGTGTTCTATCTATTAGATGGACCTCCTTAG
GTTCTTGTGTTTTTGACCTTTGTAACGAAGTCCATGTACCTAGTCTATTTTAGACCTTTCA
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CTCGGTGGCACACTTCTGCTCGAGCTCATCCTTCTGAAGCTATGGGTAGCGGTACAGGC
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GGGAAGTCCACGAGGCTCGTTGAAAATTGCTCTGTATTGTTGGAGGAGGTGGTCTAGCA
GAGGCCGTTGGTGGTGAAAGTATAAGGCCCGGAGAGTCGACTCCAGGATGTCATCGTG
AGGGGAGCCCACACCCTTCCAGACGATGCGTGGATCACCACGTTGGAAGGTAGACGAC
GCCTAAGACAAGTACAAAACCGCCTAGGTTGATACTGAAACAATGGAAAAGTCCTCCAT
GTTGATGCACATGGCCATGTTGCGAGCCACTCCAGTGTAGGCTACATGGTTGCCATCGGC
CACCGTGACCCTCATGTTGTTGTCGCTTATCACTAGCCCGATGTAGCACATAACTCCACC
GCCGATGAAATTGTGGGTCGAGCTGACCTCAAGGAGGGCGAGGAGTTTGTGGCCATGG
ATGTAGACACTGAGGTGCATAGTCTCCTCAATTAGAATGTTGACGATGGCGTGGAGGGA
GATGACCTGGGAGCCAGGCTGCTCTATCGTAAAAGCCACATCGTCGGTGACATCGTCAG
CCAAGAAGTCGACTGCCTTGAGGTAGAACAATTGTTGGCATTGATGGCCCCTGCACATA
GGGCTCATCACAGCTGAAGCGTAGCCCTTGCCGTTGGTGTCCCAGCATCAGCTGGCGAT
AGGTGGCGAAATGGTCGTTGCAACAGGACCTGTTGTGGGGCGAGGCGTGGAGTGTAGA
CGCCATCGCTTCTTGTATGGGCGGCTCCTGCGACCGGGGCACGGGGTGTCCCATGAGGT
GCATGCAGCATCCCCAGTTGGTGTTGTGGAGGGTATGCAGTACGTGGGGTTAGGGTCGG
TAAGGTTGCCTCTGCGCGATGCTCGTATGCCAGGGCCACATGCATGGACGTCCGTAGGTC
TGGGGGGGCGTGTAGCTGGGCATCCACGCTGATGTGTTTCGGGAGGCCCCATATGAACA
AGCTAGCCTTCTGAGCGGCATCTAGTCAAGGTGTGTGACAAATCAGGGCATTGAAACGC
TCCTGGTTGTCATGTACCATGAAGGTAAAAGGGAGTCGCGCCAATATGGAGAGGTGGTT
AGTAGAGATGGCCGGTCTGAAGTGCAAGTTACAAAGCTCCTTGAAGCCCTTGTTCGGCT
CGAAGGCGTAAAACCACGTCTGTGTCGTGCCGTGTAGATTGTACGATGCGAGCGTGTGT
TGCCCTAAAAAAATTGCTCGCAATGGGTGAGCCAGTTTAGAGGATTCTCCAAGCCATCA
TGGGAGGTGAAATTGAGCTTGTTGATGTGAGGGATGCCGAACCCGGTGGCCATGCTGAG
GGTTGGTGCTGGTGGCGGCGACGAAGTGGGAACTACTTGAACACTAGGGCTAGTGTTA
CAGATAAGTTGGGTAGCGGTGACGGTGATGGTGGAAATTGATGAGGTGGATGGAATGGA
TGAGGTAGCGGTGGGTGGGGTGGCGGGCGACACGGTGTGTGGAGCAGTGGTGGCAGG
CGGTATTGCAGTGGTGGCTGAGTAAGTCGGAAACGCTGTCGTGGTGTACCCCGACATCC
ACTGCGGAAAGCCCTAGGGCATGTCACCTGCTGATGTTGACGCCTAATCCCTCTCCACG
GTGGCCAACCGCGAGAGGATGACGACCTACTGCACGTTGAGGTTGCCCATCTGCTAGGC
GACCTCGGAGAGGGCCTATGTCATGGCTTCGAGGGCAGATGGTGGCACTCCCTATGGTG
CCGGCGGAGATGAAGTCTTGTCGTCAATCGCAGCAGTAGCGTTGGAACCTGGCATTTCT
GATACAAGATTGGTAGGATCATTGATCCTATCGCAATTGAGAATTACTCAAAAAAGTGAG
ATTGGGGGTTGGAGTTGGAATTTCCGATTTCGGTAAGGCGCCATGATGGCGTGGGTGCA
GAGTAGCGGTGCTGCAACGAGCAAGGGCGAGAGAGATCATGTAGAGAAAGCCCTTGAG
GTCAGTCAAGATGTTTGCTTTGCTTGCCTTAAAATGGTTACATTGCCCTTAAAATGGTTCC
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TTGTGTTCTTAAACCAACTTAGTCACAGCAATCTCTATTCTAACTTCTTGAACTAGATTCA
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CACAAGGTTTTCGTAATTACTAGTATGCTGTGAAGATGACGAGTAGCTTCAGCTGCAGGG
ACATCGCTGCTCTCTCTCTCCCCCCCAACCACACGCACACACATTGTGAGAGCACCTAG
AGGTGGGGGGGTGAATAGGTGATCCTGTAAAATTCAACACTAAATAGCCACAAAACTTA
GTTATAGAAGTGTTAGTGCGACTAAGTAGTTGAGAAGCGAGTTCTTGAGGAAAAAAACA
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CAAGTGATCCGATGATCAACTTGAATACCATAACTTTTCTTCCTTATAATCTTTTCCCGTTT
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ACGAAGTAAGGTTGGGATAAGCAACACACACAAGACACAAATCGCAGCACACCCACGC
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ATTAATGTATCTATAAAAAGCAATATGTAAAGAGATGGTACAACATTGACAACAAAGAAG
AAGATTTGTGGGTC
实施例2、蛋白质ZmFIGL1的功能分析
一、突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2的鉴定
突变体Zmfigl1-1购自MEMD数据库(网址为：
https://elabcaas.cn/memd/public/index.html#/pages/search/geneid)，产品目录号EMS4-049bf4。
突变体Zmfigl1-2购自MEMD数据库，产品目录号为EMS4-190934。
突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2均是在玉米自交系B73中通过化学试剂EMS诱变ZmFIGL1基因得到的。
1、以突变体Zmfigl1-1或玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用引物Zmfigl1-1-F：5’-CAGGAACTGGATGAAGCAGC-3’和引物Zmfigl1-1-R：5’-TCATGTCAGATCCTGAGTAG-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
将PCR扩增产物进行测序。部分测序结果见图1(野生型为玉米自交系B73)。
将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果见图1(野生型为玉米自交系B73)。
结果表明，突变体Zmfigl1-1中，ZmFIGL1基因的第10内含子发生碱基突变，具体的：突变体Zmfigl1-1为差异剪切突变体，ZmFIGL1基因的第10内含子中的G(ZmFIGL1基因全长自5’末端起第34407位)突变为A，导致第10内含子的部分序列被剪切成为CDS编码序列，造成蛋白质ZmFIGL1的翻译提前终止。
2、以突变体Zmfigl1-2或玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用引物Zmfigl1-2-F：5’-CTAGGGGTTGGATGTTGTGC-3’和引物Zmfigl1-2-R：5’-CCTCAGCTTCTCAGGAAGC-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行测序。
部分测序结果见图1(野生型为玉米自交系B73)。测序结果表明，突变体Zmfigl1-2中，ZmFIGL1基因的第4外显子发生碱基突变，具体的：突变体Zmfigl1-2中ZmFIGL1基因的第4外显子中的G(ZmFIGL1基因全长自5’末端起第13549位)突变为A，形成了终止子，造成蛋白质ZmFIGL1的翻译提前终止。
二、蛋白质ZmFIGL1的功能分析
1、取待测玉米(玉米自交系B73、突变体Zmfigl1-1或突变体Zmfigl1-2)处于减数分裂时期的雄穗，用卡诺液(由无水乙醇和乙酸按体积3:1配制而成)固定24小时。
2、完成步骤1后，倒掉卡诺液，将雄穗浸泡于4℃、70％(v/v)乙醇水溶液，待用。
3、取1张干净的载玻片并滴加20μL45％(v/v)乙酸水溶液，之后从完成步骤2的雄穗中取合适大小的花药放在乙酸水溶液上，用镊子挤压花药释放出减数分裂细胞，去除花药残渣并加盖玻片，压片后用液氮冷冻，然后用刀片迅速撬掉盖玻片，接着依次用75％(v/v)乙醇水溶液、90％(v/v)乙醇水溶液和无水乙醇各脱水5min，晾干片子后滴加DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染液，加盖玻片后用显微镜观察。挑选清晰的终变期的细胞图片进行交叉数量的统计，棒状二价体为1个交叉，环状为2个交叉，“∞”的形状为3个交叉。
待测玉米的减数分裂染色体行为观察结果见图2中上图(野生型为玉米自交系B73，Zmfigl1-1为突变体Zmfigl1-1，Zmfigl1-2为突变体Zmfigl1-2)。结果表明，突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2均能够形成正常的二价体。
终变期染色体的交叉数量的统计结果见图2中下图(野生型为玉米自交系B73，Zmfigl1-1为突变体Zmfigl1-1，Zmfigl1-2为突变体Zmfigl1-2，n为用于统计的具体的细胞数)。结果表明，与玉米自交系B73相比，突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2终变期染色体的交叉形成数量显著降低。
由此可见，蛋白质ZmFIGL1可以调控玉米减数分裂交叉形成：蛋白质ZmFIGL1的含量越低，玉米减数分裂交叉形成的数量越少。
实施例3、蛋白质ZmFIGL1介导RAD51和DMC1参与单链入侵过程
单链入侵过程是减数分裂非常核心的一步，在整个减数分裂生物学过程中处于较上游的位置。RAD51和DMC1是重要的同源重组酶。在减数分裂过程中，双链DNA断裂产生DSB后被切割形成单链DNA，此时RAD51和DMC1通过其他蛋白的辅助作用与单链DNA结合，然后引导单链DNA入侵同源模板进行同源重组修复。
将待测玉米(玉米自交系B73、突变体Zmfigl1-1或突变体Zmfigl1-2)减数分裂时期的雄穗进行蛋白质的固定并实施荧光免疫实验，具体实验方法参照如下文献：Zhang，T.，Jing，J.，Liu，L.，andHe，Y.(2021).ZmRAD17 Is Required forAccurate Double-StrandBreak Repair During Maize Male Meiosis.Front.Plant Sci.12:1-9.
检测结果见图3(野生型为玉米自交系B73，Zmfigl1-1为突变体Zmfigl1-1，Zmfigl1-2为突变体Zmfigl1-2，n为用于统计的具体的细胞数)。结果表明，与玉米自交系B73相比，突变体Zmfigl1-1和突变体Zmfigl1-2中RAD51和DMC1的信号均显著降低，RAD51和DMC1位点的数量也显著降低。
为了进一步研究蛋白质ZmFIGL1是否与RAD51、DMC1直接互作，本发明的发明人还进行了酵母双杂交和分裂荧光素酶互补实验。检测结果见图4。结果表明，蛋白质ZmFIGL1可以与RAD51、DMC1直接互作。
上述结果表明，蛋白质ZmFIGL1介导RAD51、DMC1参与单链入侵过程进而调控交叉的形成，即蛋白质ZmFIGL1作用于单链入侵过程正向调控交叉的形成。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (9)
1.一种培育减数分裂交叉形成减少的玉米的方法，包括降低玉米中蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性，从而减少玉米减数分裂的交叉形成；
所述蛋白质ZmFIGL1为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示的蛋白质；
a2)在SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与玉米减数分裂交叉形成相关的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述降低玉米中蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性通过化学试剂EMS诱变的方法来实现。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述玉米为玉米自交系B73。
4.一种培育减数分裂交叉形成增加的玉米的方法，包括增加玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性，从而增加玉米减数分裂的交叉形成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述增加玉米中权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1的含量和/或活性通过向玉米中导入编码蛋白质ZmFIGL1的核酸分子来实现。
6.权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用。
7.编码权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1的核酸分子在调控玉米减数分裂交叉形成中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：编码权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1的核酸分子为如下b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：
b1)编码区如SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；
b3)核苷酸序列由SEQ ID NO：3所示的DNA分子、SEQ ID NO：4所示的DNA分子和SEQ IDNO：5所示的DNA分子组成；
b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1的DNA分子；
b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质ZmFIGL1的DNA分子。
9.根据权利要求6至8任一所述的应用，其特征在于：所述调控玉米减数分裂交叉形成为促进玉米减数分裂交叉形成或抑制玉米减数分裂交叉形成。
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