JP4395632B2

JP4395632B2 - ミスマッチエンドヌクレアーゼ及び使用方法

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Publication number: JP4395632B2
Application number: JP2003566160A
Authority: JP
Inventors: エス．パジェット，ハル; エー．ベーフォングス，アンドリュー; エス．ボジャーニ，ファクリー; エル．スミス，マーク; エー．リンドボー，ジョン; ピー．フィッツモーリス，ウェイン
Original assignee: ノビシバイオテック，リミティドライアビリティカンパニー
Priority date: 2002-02-01
Filing date: 2003-01-31
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2023-01-31
Also published as: ATE366807T1; US20060194288A1; US7056740B2; AU2003207776B2; AU2003207776A1; US7078211B2; WO2003066809A2; JP2005529586A; EP1565557B1; DE60314902D1; CA2473187A1; EP1565557A2; WO2003066809A3; US20030157682A1; US20030148315A1; CA2473187C; DE60314902T2; US7273739B2; US20080145913A1; EP1565557A4

Description

発明の分野
本発明は一般に、分子生物学そしてより特定的にはミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素及び関連する核酸分子の集団を生成する方法又は単一ヌクレオチド多形現象の検出におけるそれらの使用に関する。

背景情報
ＤＮＡシャッフリングは、加速された形で進化させるべく２つ以上のＤＮＡ配列間の組換え体を得るための強力な手段である。ＤＮＡシャッフリングプロセスのための親ＤＮＡつまり入力ＤＮＡは、標準的に、野生型に比べていくつかの改善された特性をもつ一定の与えられた遺伝子の突然変異体又は変異体である。ＤＮＡシャッフリング産物は、新しい配列組合せの結果としてもたらされる加法的又は相乗的効果についてその後分析することのできる親核酸からの遺伝子配列の基本的にランダムである再集合のプールを表わしている。

再帰的な配列再集合(Recursive sequence reassortment)というのは、適切な特性をもつ変異体のみが、次世代の産生に対し自らの遺伝子物質を寄与することを許されている進化プロセスと類似である。ＤＮＡ−シャッフリングを媒介にした配列再集合とそれに続く性能の増分的改善についての試験を通して、最適化された変異体が生成される。再集合と試験の付加的なサイクルは、プロセスの以前のラウンドにおいて識別された遺伝的改善の新しい組合せを含有する遺伝子の生成を導く。有益な遺伝的変化を再集合し組合せることで、考えられる配列組合せ全てを個別に生成しスクリーニングする必要なく、最適化された配列を発生させることができる。

シャッフリングは、すでに改善された配列に対するその後の改善が大方偶然の発見の結果としてもたらされるランダム突然変異誘発とは、はっきりと異なっている。例えば、所望の１組の増強された特性をもつタンパク質を得るためには、さまざまな有益な突然変異の組合せを含む突然変異体を同定することが必要となるかもしれない。これらの有益な遺伝的変化を組合せるためのプロセスが全く利用可能でない場合、さらなるランダム突然変異誘発が必要とされることになる。しかしながら、ランダム突然変異誘発は、数多くの突然変異体を生成しスクリーニングする反復的サイクルを必要とし、結果として、単調できわめて労働集約型のプロセスをもたらす。その上、配列が望ましくない効果をもつ突然変異を受ける率は、配列の情報量と共に増大する。従って、情報量、ライブラリサイズ及び突然変異誘発率が増大するにつれて、有益な突然変異に対する有害な突然変異の比は増大することになり、さらなる改善の選択を増々隠ぺいする。最後に、一部のコンピュータシミュレーションから、点突然変異誘発単独では、連続した劇的な配列進化に必要とされる大規模ブロック変化を可能にするには漸進的すぎることが多い可能性があるということが示唆されている。

変異性(error-prone)ＰＣＲでは、１つの配列上でランダムに低レベルの点突然変異を導入するために、低忠実度重合条件が使用される。しかしながら、この方法に対する１つの制約条件は、公表された変異性ＰＣＲプロトコルがポリメラーゼの伸長性が低いという欠点を有し、このため、平均的なサイズの遺伝子においてランダム突然変異誘発を生成する上でこのアプローチは効果のないものになっている、ということにある。

オリゴヌクレオチド特異的ランダム突然変異誘発においては、短かい配列が合成的に突然変異誘発されるオリゴヌクレオチドで置換される。遠位突然変異の組合せを生成するためには、異なるオリゴヌクレオチドにより異なる部位に同時に対処しなければならない。この要領で得られるライブラリサイズは全部位を飽和するのに必要とされるライブラリサイズに比べて制限されたものであることから、最適化のために多数の選択ラウンドを要求することが必要となる。合成オリゴヌクレオチドでの突然変異誘発には、各々の選択ラウンドの後の個々のクローンの配列決定とそれに続く、それらの系統群分類、単一系統群の任意選択及びコンセンサスモチーフへの縮小が必要である。かかるモチーフは、再合成され単一の遺伝子内に再挿入され、その後付加的に選択される。この段階は、統計上の障害を作り出し、労働集約型で、数多くの合成ラウンドにとっては実用的でない。

これらの理由から、例えば配列微調整用といったような比較的少ない配列改変サイクルを必要とする突然変異誘発プロトコルのためには、変異性ＰＣＲ及びオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用できるが、特に大型遺伝子配列上の数多くの突然変異及び選択サイクルを必要とする手順についてのその有用性には限界がある。

上述の通り、ランダムに突然変異を受けた遺伝子から改良型遺伝子産物を産生するための従来の方法の実用性には限界がある。ランダムに再集合された遺伝子配列を産生するための１つの認知された方法は、長いヌクレオチド鎖をさらに短かい断片に分割するために酵素を使用する。分割作用物質はこのとき、遺伝物質から分離され、遺伝物質は、それがポリヌクレオチドの鎖として再構築できるような形で増幅され、ここでこれらの再構築は、ランダムであるか又は特定の順序に従ったものである。該方法には、ランダムフラグメントへと破断された遺伝子変異体を組立てるために数ラウンドの増幅が必要である（（Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b）米国特許第５，６０５，７９３号、米国特許第５，８１１，２３８号、米国特許第５，８３０，７２１号、米国特許第５，９２８，９０５号、米国特許第６，０９６，５４８号、米国特許第６，１１７，６７９号、米国特許第６，１６５，７９３号、米国特許第６，１５３，４１０号）。この方法の変形形態では、再構築に先立ちフラグメントを生成するために、プライマ及び制限されたポリメラーゼ拡張が用いられる（米国特許第第５，９６５，４０８号、米国特許第６，１５９，６８７号）。

しかしながら、両方の方法共限界がある。これらの方法は、技術的に複雑であるという点に欠点がある。このことは、充分に経験あるスタッフを有する施設に対するこれらの方法の応用可能性を制限する。さらに、意図されない突然変異誘発やサイズが増大する大型標的分子の再構築の難易度の増加を含めたフラグメントからの分子の再構築から生じる複雑さが存在し、このことは長いポリヌクレオチドストランドを再構築するためのこれらの方法の有用性を制限する。

フラグメント化及び再構築ベースの遺伝子シャッフリングのこれらの方法がもつもう１つの限界には、親テンプレートポリヌクレオチドの非相同が増大する場合に遭遇する。これらのプロセスのアニーリング段階においては、小さなポリヌクレオチドフラグメントは、適切にアニールするのに塩基対合相互作用の結果得られる安定化力に依存している。小さなアニーリング領域は、その短かい長さに起因して安定化力に制限があることから、相補性の高い配列のアニーリングが、より発散的配列に比べて有利とされる。このようなケースでは、これらの方法は、特定の親テンプレートからの相補的１本鎖のアニーリングに起因して親テンプレートポリヌクレオチドを再生する強い傾向を有する。従って、親テンプレートは、基本的に、自ら再構築して、組換え型分子の検出難易度を増大させるライブラリ内の未変化のポリヌクレオチドのバックグラウンドを作り出す。この問題は、親テンプレートがさらに非相同になるにつれて、つまり親テンプレート間の配列同一性百分率が減少するにつれて、増々重大になる。この成果は、Patten et al., 1997; Crameri et al., 1998; Harayama, 1998; Kumamaru et al., 1998; Chang et al., 1999; Hansson et al., 1999）、によって報告された系統群シャッフリング方法を用いてｘｙＩＥ及びｎａｈＨの間で組換え体を生成することを試みたKikuchi et al., (Gene 243 : 133-137, 2000)によって実証された。Kikuchi et al.,は、基本的にいかなる組換え体（＜１％）も生成されないことを発見した。彼らは又、１本鎖ＤＮＡのフラグメント化及び再構築によってキメラ遺伝子の形成を改善するための方法をも開示した。

組換え体の低効率回収という特徴は、より低い配列同一性百分率をもつ親テンプレートすなわち、さらに多様である親テンプレートから新規ポリヌクレオチドを生成するためのこれらの方法の有用性を制限している。

従って、これらのニーズに対処する遺伝子配列生成方法に対するニーズが存在している。ヘテロ２本鎖分子を形成し次に、ミスマッチ部位における配列情報が１本のストランドからもう１本のストランドへと移送されるような形でミスマッチに対処することによって、in vitroで関連するポリヌクレオチドの中から突然変異を再集合するための方法が開発されてきた。ミスマッチは、ａ）ミスマッチ部位で配列ストランドを認識しニックする酵素、ｂ）ｄＮＴＰの存在下でのプルーフリーディング活性をもつポリメラーゼ及びｃ）リガーゼを含有する反応の中でヘテロ２本鎖分子をインキュベートすることによって対処される。これらのそれぞれの活性は、一定の与えられたミスマッチ部位でヘテロ２本鎖がニックされ、不対合塩基がストランドのうちの１本から切除され次にテンプレートとして反対側のストランドを用いて置換され、ニックが密封されるような形で、一斉に作用する。出力ポリヌクレオチドは、クローニングの前に増幅されるか、又は、直接クローニングされて物性の改善についてテストされる可能性がある。ミスマッチ解消再集合及び試験の付加的サイクルにより、さらなる改善が導かれるかもしれない。

この方法では、核酸配列の相対するストランドに沿った１つの塩基又は、一列の塩基配列の間のミスマッチの部位における認識及びニッキング能力をもつミスマッチエンドヌクレアーゼが利用されている。

ミスマッチを認識することになる酵素に対処するために、我々は、ＣＥＬＩ酵素及びＲＥＳＩと呼ばれる新規の酵素について遺伝子をクローニングした。これらの酵素は両方共ミスマッチエンドヌクレアーゼであり、共に、染色体、プラスミド、遺伝子、遺伝子の一部分又は核酸の任意の人工配列といったような核酸配列に沿った塩基対ミスマッチを認識するのに特に適している。

発明の要約
本発明は、１つのヌクレオチド配列内の塩基ミスマッチを検出し塩基ミスマッチの部位で配列をニックする能力をもつ酵素ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩを提供する。これらの酵素は、それらが発生する未変性植物から得られる。本明細書では、宿主主体内にクローニングすることにより宿主主体内の組換え型酵素としてそれらを作る方法が提供されている。

ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩは、新しい遺伝子を開発するための遺伝子シャッフリング技術、及びガン罹病性の証拠を検出するための単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）検出において有用である。

同様に提供されているのは、遺伝子コピー数を増幅するか又はプラスミド又はウイルスベクター内で酵素をコードさせることになる宿主主体まで移送するため、プラスミド又はウイルスベクター内にＣＥＬＩ及びＲＥＳＩ遺伝子をクローニングする方法である。

同様に提供されているのは、ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩＫＺを植物宿主にする方法である。

ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩ核酸配列は、ブタペスト条約に基づいてＡＴＣＣに寄託された。

同様に提供されているのは、ヘテロ２本鎖分子を形成し次に、ミスマッチ部位における配列情報が１本のストランドからもう１本のストランドへと移送されるような形でミスマッチに対処することによって、in vitroで関連するポリヌクレオチドの中から突然変異を再集合するための、ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩを用いる方法についての完全な記述である。ミスマッチは、ミスマッチを認識し、ミスマッチ部位で配列ストランドの１本をニックする酵素、ｄＮＴＰの存在下でのプルーフリーディング活性をもつポリメラーゼ及びリガーゼを含有する反応の中でヘテロ２本鎖分子をインキュベートすることによって対処される。これらのそれぞれの活性は、一定の与えられたミスマッチ部位でヘテロ２本鎖がニックされ、不対合塩基がストランドのうちの１本から切除され次にテンプレートとして反対側のストランドを用いて置換され、ニックが密封されるような形で、一斉に作用する。出力ポリヌクレオチドは、クローニングの前に増幅されるか、又は、直接クローニングされて物性の改善についてテストされる可能性がある。ミスマッチ解消再集合及び試験の付加的サイクルにより、さらなる改善が導かれるかもしれない。

該方法は、少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有するヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列内の相補的塩基対数を増大させる方法としても記述されており、該方法には、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供される有効量のミスマッチ特異的ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性をもつヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列を混合する段階、及び多数の非相補的ヌクレオチド塩基対が相補的塩基対へと転換されるのに充分な時間経過させる段階が含まれここでストランド間の相同性は、少なくとも１つの相補的塩基対によって増大する。

該方法は同様に、少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有するヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列から配列変異体の集団を作るin vitro方法としても記述されており、該方法には、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供される有効量のミスマッチ特異的ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性をもつヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列のコピーを混合する段階、及び多数の非相補的ヌクレオチド塩基対が相補的塩基対へと転換されるのに充分な時間経過させる段階が含まれここで多様なポリヌクレオチド配列集団が結果としてもたらされる。

該方法は同様に、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチド配列を得るin vitro方法としても記述され、該方法には、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列を調製する段階；ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供される有効量のミスマッチ特異的ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性とヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列のコピーを混合する段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列のストランド間の相補性百分率が増大できるのに充分な時間経過させる段階（ここで集団内の配列多様性は増大する）；及び所望の機能的特性について、変異体集団をスクリーニング又は選択する段階、が含まれる。

該方法は同様に、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを得るin vitro方法としても記述されており、これには、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供される有効量のミスマッチ特異的ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性とヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列のコピーを混合する段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列内のミスマッチヌクレオチド塩基対の一部分又は全てが相補的塩基に転換されるのに充分な時間経過させる段階（なおここで多様なポリヌクレオチド配列集団が結果としてもたらされる）；所望の機能的特性を有する変異体集団についてスクリーニング又は選択する段階；１本鎖ポリヌクレオチド配列の集団を得るために前記変異体集団を変性する段階；多様なヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列を形成するべく前記１本鎖ポリヌクレオチド配列集団をアニールする段階；有効量のミスマッチ特異的ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性とヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列を混合する段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列内のミスマッチヌクレオチド塩基対の一部分又は全てが相補的塩基に転換されるのに充分な時間経過させる段階（なおここで多様なポリヌクレオチド配列集団が結果としてもたらされる）；及び所望の機能的特性を有する変異体集団についてスクリーニング又は選択する段階が含まれる。ＤＮＡは、ＤＮＡの転写によりスクリーニングに先立ってＲＮＡに変換され得る。プルーフリーディングの後にストランドを密封するべくリガーゼ活性を添加することができる。

この方法の利点の１つは、配列が環状又は線状のいずれかであるという点にある。これにより、ほぼ無制限の配列長のシャッフリングが可能となる。変異体ポリヌクレオチド配列は、異なる量の相補性をもつ。我々は、４７％という低い配列相同性で２つのポリヌクレオチドの間のポリヌクレオチドヘテロ２本鎖の相補性が増大することを報告している。

このプロセスは、数多くの部位で同時に、そして一定の与えられたヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子のいずれかのストランド上で発生し得る。結果は、出発配列の集団よりも多様である配列変異体の集団を提供するための入力ストランド間の配列差のランダム化である。

もう１つの実施形態においては、所望の機能的特性をもつタンパク質をコードする再集合されたＤＮＡ分子を同定する方法には、少なくとも１つの１本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子を提供する段階であってこの１本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子又はその相補的ストランドが１つのタンパク質をコードする段階；１本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子に対しハイブリダイズする能力をもつ単数又は複数の同一でない１本鎖ＤＮＡ分子を提供する段階（なお、前記ＤＮＡ分子は該タンパク質の少なくとも１つの付加的な変異体をコードする）；１本鎖ウラシル含有ＤＮＡ分子と段階（ｂ）の少なくとも１つの１本鎖ＤＮＡ分子を接触させ、かくしてアニールされたＤＮＡ分子を産生する段階；ミスマッチエンドヌクレアーゼプルーフリーディングポリメラーゼ及びリガーゼと共にアニール済みＤＮＡ分子をインキュベートし、かくしてウラシル含有ＤＮＡ分子にアニール済みの配列再集合されたＤＮＡストランドを産生する段階；ウラシル含有ＤＮＡ分子が増幅されない条件下で再集合されたＤＮＡストランドを増幅し、かくして再集合されたＤＮＡ分子の集団を産生する段階；及び所望の機能的特性をもつポリペプチドをコードするものを同定するべく、再集合されたＤＮＡ分子の集団をスクリーニング又は選択し、かくして、所望の機能的特製をもつポリペプチドをコードする単数又は複数のＤＮＡ分子を同定する段階が含まれる。このプロセスも同様に、テンプレートとしてＲＮＡ分子を用いて行なうことができる。

１実施形態においては、ＣＥＬＩは、配列番号０１、配列番号０２又は配列番号０３又は配列番号０４の核酸配列を含む核酸分子である。

もう１つの実施形態においては、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号０３又は配列番号０４によって表わされるようなＣＥＬＩの核酸配列を含む組換え型ウイルスが提示されている。

もう１つの実施形態においては、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号０３又は配列番号０４によって表わされるようなＣＥＬＩの核酸配列を含む組換え型プラスミドが提示されている。

もう１つの実施形態においては、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号０３又は配列番号０４によって表わされるようなＣＥＬＩの核酸配列をコードする組換え型ウイルスを含む植物又は植物細胞が提示されている。

もう１つの実施形態においては、配列番号０１又は配列番号０２又は配列番号０３又は配列番号０４によって表わされるようなＣＥＬＩの核酸配列をコードする組換え型プラスミドを含む植物又は植物細胞が提示されている。

もう１つの実施形態においては、組換え型ウイルスは、植物ウイルス、動物ウイルス、真菌ウイルス又は細菌ウイルスである。

もう１つの実施形態においては、組換え型ウイルスを用いてＣＥＬＩエンドヌクレアーゼを発現する方法が提示されている。

もう１つの実施形態では、ヘテロ２本鎖が少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有する、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドから配列変異体を作るin vitro方法の中でＣＥＬＩを使用する方法において、
ａ．少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；
ｂ．有効量のＣＥＬＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼと前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合わせる段階、及び
相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させる段階（ここで単数又は複数の変異体が作られる）、
を含んで成る方法。
１実施形態においては、ＲＥＳＩは、配列番号１６の核酸配列を含む核酸分子である。配列番号３４のＲＥＳＩアミノ酸配列が提示されている。

もう１つの実施形態では、配列番号１６により表わされているようなＲＥＳＩの核酸配列を含む組換え型ウイルス。

もう１つの実施形態では、配列番号１６により表わされているようなＲＥＳＩの核酸配列をコードする組換え型ウイルスを含む植物又は植物細胞。

もう１つの実施形態では、配列番号１６により表わされているようなＲＥＳＩの核酸配列をコードする組換え型プラスミドを含む植物又は植物細胞。

もう１つの実施形態においては、組換え型ウイルスを用いてＲＥＳＩエンドヌクレアーゼを発現する方法が提示されている。

もう１つの実施形態では、ヘテロ２本鎖が少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有する、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドから配列変異体を作るin vitro方法の中でＲＥＳＩを使用する方法において、
ａ．少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；
ｂ．有効量のＲＥＳＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼと前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合わせる段階、及び
相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させる段階（ここで単数又は複数の変異体が作られる）、
を含んで成る方法。

定義
本明細書で各用語に対し与えられた範囲を含めて、明細書及びクレームを明確かつ一貫性をもって理解できるようにするために以下の定義が提供される。

本明細書に使用されているように、「増幅」という語は、ポリヌクレオチドのコピー数が増大されるプロセスを意味する。

本明細書で使用されている「アニーリング」という語は、少なくとも部分的に相補的なヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションによる少なくとも部分的に２本鎖である核酸の形成を意味する。部分的に２本鎖である核酸は、比較的小さい核酸ストランドのさらに長い核酸ストランドへのハイブリダイゼーションに起因する可能性があり、ここで小さい方の核酸はより大きい核酸の一部分と１００％同一である。部分的に２本鎖である核酸は同様に、１００％の同一性を共有しないものの特定のハイブリダイゼーション条件一式の下でハイブリダイズするのに充分な相同性をもつ２つの核酸ストランドのハイブリダイゼーションに起因する可能性もある。

本明細書で使用されているように、「クランプ」という語は、ＰＣＲプライマへのクランプ配列の取込みなどによりポリヌクレオチドの一端部に付加されたユニークなヌクレオチド配列を意味する。クランプ配列は、異なる親（すなわちヘテロ２本鎖分子）からのストランドのハイブリダイゼーションから生じるポリヌクレオチドのみの増幅を可能にし、かくして以前に記述されたような（Skarfstad, J. Bact, 第１８２巻, No11, P3008〜3016）全長ハイブリッド産物の産生を確保するように意図されている。

本明細書で使用されている「分割する」という語は、酵素でポリヌクレオチドを消化すること、又そうでなければポリヌクレオチド内部のホスホジエステル結合を破断することを意味する。本明細書で使用されている「ストランド分割活性」又は「分割」という語は、ニック形成の場合のように、ポリヌクレオチドストランドのバックボーン内でのホスホジエステル結合の破断を意味する。ストランド分割活性は酵素作用物質によって提供され得る。かかる作用物質には、ＣＥＬＩ、ＲＥＳＩ及びそれらの変異体が含まれる。

本明細書で使用されているように、「相補的塩基対」という語は、１本のストランド内のアデニンがもう１本のストランド内の相対するチミン（又はウラシル）であり、１本のストランド内のシトシンがもう１本のストランド内の相対するグアニンであるような２重らせん内のＤＮＡ（又はＲＮＡ）塩基の対応を意味する。

本明細書で用いられている「〜に相補的な」という語は、ここでは、相補的配列が基準ポリヌクレオチド配列の全て又は一部分の逆補体と同一であること又は１本のストランド内の各ヌクレオチドが相対するストランド内の１つのヌクレオチド又はその類似体と１つの塩基対を形成できることを意味するものとして使用されている。例示を目的として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は、基準配列「ＧＴＡＴＡ」と相補的である。

本明細書で使用されているように、「変性する」又は「変性された」という語は、核酸に関して用いられる場合、２本鎖核酸の１本鎖核酸への転換を意味する。２本鎖核酸の変性方法は、当業者にとって周知であり、例えば塩基対合を不安定にする作用物質の添加、温度上昇、塩の低減又はそれらの組合せを含む。これらの因子は、ストランドの相補性に従って、つまりストランドが１００％の相補性をもつか又は単数又は複数の非相補的ヌクレオチドを有するかに応じて適用される。

本明細書で使用される「所望の機能的特性」という語は、ポリペプチドのコード化、リンクされたポリヌクレオチドの転写の促進、タンパク質の結合、ウイルスベクターの機能の改善などを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）選択又はスクリーニング可能な表現型特性を意味している。このような所望の機能的特性をもつポリヌクレオチドは、適切な植物、動物、真菌、酵母又は細菌発現ベクターからの発現、遺伝子導入植物、動物又は微生物を形成するための組込み、リボザイムの機能などを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）数多くの方法で使用可能である。

本明細書で用いられる「ＤＮＡシャッフリング」という語は、ここでは、実質的に相同であるものの同一でない配列の間の配列情報の再集合を表わすために使用されている。

本明細書で用いられる「有効量」という語は、作用物質がその所望の活性を提供するのに必要である作用物質の量を意味する。本発明については、この決定は当業者の知識範囲内に充分入るものである。

本明細書で使用されている「宿主」という語は、ベクター又は植物ウイルス核酸を複製する能力をもちかつウイルスベクター又は植物ウイルス核酸を含むウイルスによる感染を受ける可能性のある細胞、組織又は生体を意味する。この語は、該当する場合、原核及び真核細胞、器官、組織又は生体を含むように意図されている。

本明細書で使用されているように、「感染」という語は、ウイルス核酸が複製され、ウイルスタンパク質が合成され、新しいウイルス粒子が組立てられる、１つの宿主に対しその核酸を移送するか又は宿主内にウイルス核酸を導入するウイルスの能力を意味する。この情況では、「伝染性」及び「感染性」という語は、本明細書で互換的に用いられている。

本明細書で使用される「変性」という語は、１）ＯＲＳＶ及びブロムモザイクウイルスといったような植物ウイルスプロモータ、２）ヒトシンドビスウイルスプロモータといったようなその他の生体からのウイルスプロモータ及び３）合成プロモータを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）サブゲノムｍＲＮＡの産生を促進するあらゆるＲＮＡ配列を意味する。

本明細書で使用されている「表現型形質」という語は、１つの遺伝子の発現の結果得られる観察可能な特性を意味する。

本明細書で用いられる「植物細胞」という語は、プロトプラスト及び細胞壁から成る構造的及び生理的植物単位を意味する。

本明細書で用いられる「植物器官」という語は、根、茎、葉又は胚といった植物のはっきりとした、目に見えて分化した部分を意味する。

本明細書で用いられる「植物組織」という語は、in planta又は培養中の植物のあらゆる組織を意味する。この語は、構造的及び機能的単位へと組織された植物細胞の任意のグループ、又は植物全体、植物細胞、植物器官、プロトプラスト、細胞培養を内含するように意図されている。

本明細書で使用する通りの「産生細胞」という語は、ベクター又はウイルスベクターを複製する能力を有するものの必ずしもそのウイルスに対する宿主ではない細胞、組織又は生体を意味する。この語は、細菌、酵母、真菌及び植物組織といったような原核及び真核細胞、器官、組織又は生体を内含するものとして意図されている。

本明細書で用いられる「プロモータ」という語は、コーディング配列の転写の開始に関与するコーディング配列に隣接する５′−フランキング、非コーディング配列を意味する。

本明細書で用いられる「プロトプラスト」という語は、細胞培養又は全植物への再生の潜在能をもつ、細胞壁の無い単離された植物細胞を意味する。

本明細書で用いられる「組換え型植物ウイルス核酸」という語は、変性核酸配列を含有するように修飾された植物ウイルス核酸を意味する。

本明細書で用いられる「組換え型植物ウイルス」という語は、組換え型植物ウイルス核酸を含有する植物ウイルスを意味する。

本明細書で用いられる「サブゲノムプロモータ」という語は、ウイルス核酸のサブゲノムｍＲＮＡのプロモータを意味する。

本明細書で用いられる「実質的配列相同性」という語は、互いに実質的に機能的に等価であるヌクレオチド配列を意味する。実質的配列相同性をもつこのような配列の間のヌクレオチドの差異は、かかる配列によりコードされるＲＮＡ又は遺伝子産物の機能に影響を及ぼすという点ではあまり重要でない。

本明細書で用いられる「転写」という語は、ＤＮＡ配列の相補的コピーとしてのＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の産生を意味する。

本明細書で用いられる「ベクター」という語は、細胞間にＤＮＡセグメントを移送する自己複製ＤＮＡ分子を意味する。

本明細書で用いられる「ウイルス」という語は、タンパク質内で包膜された核酸から成る感染性作用物質を意味する。ウイルスは、以上で記述されているように、１−、２−、３−又はマルチパータイトウイルスであり得る。

本明細書で用いられる「ミスマッチ解消による遺伝的再集合（ＧＲＡＭＭＲ）」という語は、２つの同一でないポリヌクレオチドからヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを作り；１本のストランド内で塩基対ミスマッチ部位又はその近くでニックを導入し；ニックが発生したミスマッチ部位からミスマッチ塩基（単複）を除去し；第１のストランド内の塩基（単複）を相補的塩基で除去した塩基（単複）を置換するべくテンプレートとして相対するストランドを使用することによって、非同一性ポリヌクレオチド配列間で配列変動を再分配するin vitro方法により、関連するポリヌクレオチドの間の配列変動を再集合するための方法を意味する。この方法により、ミスマッチ部位において１つのストランドからもう１つのストランドまで情報が移送される。

このプロセスでは部分的に相補的な分子内の多重部位に独立した形で同時に対処することができる。その結果、ポリヌクレオチド配列内の相補的塩基対百分率は増加する。

ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列の２本のストランド間の単数又は複数の塩基対ミスマッチは、該ミスマッチのうちの単数又は複数のものを解消させるべく、有効量のＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素により提供されるミスマッチ特異的ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性とヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列を混合するin vitro方法によって解消される。この方法により、ミスマッチの部位において、１本のストランドからもう１本のストランドまで情報が移送される。

ミスマッチは、互いに相対して発生する２つの非相補的塩基の結果であり得る。ミスマッチ部位は、隣接するミスマッチによって不安定にされるヌクレオチド塩基対を含めた任意の数の不対合ヌクレオチドのクラスタで構成され得る。ミスマッチは同様に、相対するストランド上に数値的相対物をもたない１本のストランド上で単数又は複数の塩基が発生した結果でもありうる。例えばミスマッチの部位において、１本のストランド上に１つの不対合塩基が存在しもう１本のストランド上には不対合塩基が全く存在しない可能性がある。この結果、その部位で１つのストランド内に単一の不対合ヌクレオチドが収納されている配列長非相同性部位がもたらされることになる。このミスマッチ部位で最初にニックされるストランドに応じて、本発明のプロセスは、より短かいストランドとの関係における単一の塩基の挿入か、又は当初追加の不対合ヌクレオチドを有していたストランドとの関係における単一の塩基対の欠失のいずれかの結果をもたらすことになる。１本のストランドからもう１本のストランドへの配列長情報の移送というこの原理は、２本のストランド上の不対合塩基数が互いに等しくないあらゆるミスマッチ部位に適用可能である。

通常、反応の中には、ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドの数多くのコピーが存在する。この状況において、ミスマッチ部位における配列情報は、ポリヌクレオチドの１つのコピー上の上部ストランドから及びもう１つのコピー内の下部ストランドからテンプレートされ得る。充分な数のコピーが利用可能であると仮定すると、単一のミスマッチが存在する場合には２つの出力変異体が可能である。２つのミスマッチ部位が存在する場合には、２変異体×２が結果としてもたらされる可能性がある。ｎ個のミスマッチ部位が存在する場合には、１回のミスマッチ解消につき少なくとも２乗〜ｎ乗つまり２ⁿの直伝的再集合が可能である。考えられる結果は、少なくとも２ⁿ個の変異体ポリヌクレオチドである。ここで少なくともと言っているのは、正確なメカニズムが完全に理解されていないからである。長さ２塩基以上のミスマッチ部位については、個々の事象が１個、２個又はそれ以上のミスマッチ対をテンプレートし得ると推測することができる。その場合には、変異体の推定数が増大する結果となるだろう。

本明細書で用いられる「ＧＥＮＥＷＡＲＥ」又は「ＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)」という語は、少なくとも部分的にトバモウイルスから誘導され付加的な（通常は非相同な）サブゲノムプロモータを含有するべく修飾されたウイルスベクターを意味する。天然に見られるトバモウイルスは、標準的に運動タンパク質及び外皮タンパク質のためのサブゲノムプロモータを含有する。ＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)は、Large Scale Biology社の登録商標である。

本明細書で用いられる「粒度」という語は、一定の与えられた子孫ポリヌクレオチド内で隣接配列として発生する一定の与えられた親ポリヌクレオチド配列からの核酸の配列情報量を意味する。

本明細書で用いられる「テンプレート配列」という語は、ＧＲＡＭＭＲの遺伝情報の移送を結果としてもたらすように第２のポリヌクレオチド配列に対し部分的相補性をもつ第１の１本鎖ポリヌクレオチド配列を意味する。

テンプレートストランドから移送される配列情報単位が大きくなればなるほど、粒度は高くなる。テンプレートストランドから移送される配列情報のブロックが小さくなればなるほど、粒度は低く又は細かくなる。より低い粒度は、ＤＮＡシャッフリング又は再集合方法が、遺伝情報のさらに小さな離散的ブロックをテンプレートストランドから第２のストランドまで移送できる、ということを表わす。比較的低い粒度をもつＤＮＡシャッフリング又は再集合方法の利点は、それが、より小さい核酸配列をその他のものから解消し配列情報を移送できるという点にある。主として高い粒度を戻すＤＮＡシャッフリング又は再集合方法は、その他のものからより小さい核酸配列を容易に解消することができない。

本明細書で用いられる「ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド」という語は、標準的には同一でない別々のストランドである複数の一本鎖をアニールすることにより形成される２本鎖ポリヌクレオチドを意味する。ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドは１本鎖ループ又はバブルとして存在する非対合領域を有する可能性がある。ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド領域は同様に、部分的自己相補性によってストランドのアニーリング部分が同一でないステムループ構造の形成が可能となっている１つの１本鎖ポリヌクレオチドによって形成される可能性もある。

本明細書で用いられる「ヘテロ２本鎖ＤＮＡ」という語は、標準的には同一でない別々のストランドである複数の一本鎖をアニールすることにより形成される２本鎖ＤＮＡを意味する。ヘテロ２本鎖ＤＮＡは１本鎖ループ又はバブルとして存在する非対合領域を有する可能性がある。ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド領域は同様に、部分的自己相補性によってストランドのアニーリング部分が同一でないステムループ構造の形成が可能となっている１つの１本鎖ポリヌクレオチドによって形成される可能性もある。

本明細書で用いられる「相同性」という語は、１本鎖核酸配列が、少なくとも部分的に相補性である１本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの度合は、以下で論述するような温度及び塩濃度といったようなハイブリダイゼーション条件及び配列間の同一性の量を含めた数多くの因子によって左右され得る。

核酸は、それらが自然に又は人工的に共通の祖先配列から誘導された場合に、「相同性」をもつ。天然の進化の間、これは、２つ以上の子孫配列が経時的にすなわち突然変異及び自然淘汰に起因して親配列から分岐する場合に起こる。人工的条件下では、分岐は例えば２つの基本的要領のうちの１方で発生する。第１に、子孫核酸を産生するべく例えば標準的クローニングの間に発生するように一定の与えられた配列をもう１つの配列と人工的に組換えることができ、又一定の与えられた配列を化学的に修飾することもでき、そうでなければ、結果として得られる分子を修飾するべく操作することもできる。代替的には、選択された親核酸配列から配列が変動した核酸を合成することにより、核酸を新たに合成することが可能である。２つの核酸の祖先についての明確な知識が全く存在しない場合、相同性は標準的に２つの配列間の配列比較により推測される。２つの核酸配列が核酸の各々の有意な部分全体にわたる配列類似性を示す場合、２つの核酸が祖先を共有することが推測される。相同性を確立する配列類似性の精確なレベルは、当該技術分野においてさまざまな因子に応じて変動する。

本開示の目的では、２つの核酸は、２つの核酸分子間でＧＲＡＭＭＲが媒介する情報移送が発生できるようにするのに充分な配列同一性を共有する場合に、相同であるとみなされる。

本明細書で用いられる「同一の」又は「同一性」という語は、２つの核酸配列が同じ配列又は相補的配列を有することを意味している。かくして「同一性部域」というのは、１つのポリヌクレオチドの領域又は部域又はポリヌクレオチド全体がもう１つのポリヌクレオチドの部域と同一又は相補的であることを意味している。

本明細書で用いられる「相補性百分率の増大」という語は、ヘテロ２本鎖分子内の相補的塩基対の百分率がより大きくなることを意味する。

本明細書で用いられる「リガーゼ」という語は、核酸内の隣接するヌクレオチド間のホスホジエステル結合を確立する酵素を意味する。

本明細書で使用される「ミスマッチ」という語は、（「Ａ」と「Ｔ」（又は「Ｕ」）又は「Ｇ」と「Ｃ」以外である）正常な塩基対合相互作用を形成することのできない塩基対を意味する。

本明細書で用いられる「ミスマッチ解消」という語は、ミスマッチ塩基対の相補的塩基対への転換を意味する。

本明細書で用いられる「突然変異」という語は、野生型又は基準核酸配列の配列変化又は１つのポリペプチドの配列変化を意味する。かかる突然変異は、塩基転位又は塩基転換といった点突然変異でありうる。突然変異は欠失、挿入又は重複でありうる。

本明細書で用いられる「核酸」又は「核酸分子」という語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）といったようなポリヌクレオチドを意味し、１本鎖及び２本鎖核酸ならびにオリゴヌクレオチドを包含する。本発明で有用な核酸には、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ＰＣＲ産物、及び合成オリゴヌクレオチドが含まれ、センスストランド、アンチセンスストランド又はその両方を表わすことができる。核酸は一般に、４つの天然に発生するヌクレオチドアデニン、グアニン、シトシン、及びチミジン／ウリジンを取込んでいる。本発明の核酸は、同様に、所望のポリヌクレオチド産物を生成するのに充分な効率でポリメラーゼによりポリヌクレオチド内に取込まれ得るかぎりにおいてその誘導体を含めた、天然に発生する又は非天然その他のヌクレオチドを取込むこともできる。

本明細書で用いられる「親核酸」というのは、部分的に相補性をもつ核酸の出発集団内のもとの１本鎖核酸と１００％同一である配列を有する２本鎖核酸を意味する。親核酸には、例えば図２の例示において、本発明の方法での出発集団として部分的に相補的な核酸の組合せ1+/4-又は2-/3+が使用された場合に、核酸Ｘ及びＹが含まれることになる。

本明細書で用いられる「部分的に相補的な」という語は、もう１つの核酸に対し実質的に相補的な配列を有するものの少なくとも２つ以上のヌクレオチドだけその他の核酸と異なっている核酸を意味する。

本明細書で用いられる「部分的に相補的な核酸集団」という語は、その集団内のその他のいずれの配列グループについても正確な相補的配列をもたない特定のグループに属する核酸を全く含まず、実質的に相補的な配列を有する核酸の個々のグループを含む核酸の１集団を意味する。

本明細書で用いられているように、部分的に相補的な核酸集団の任意の成員は、その集団のもう１つの核酸又はそれに対する補体と、２つ以上のヌクレオチドだけ異なっている。このようにして、部分的に相補的な核酸は、正確に相補的である配列すなわち１００％の相補性をもつ相補性配列を含む集団を特定的に除外する。従って、かかる部分的相補的な核酸集団の各々の成員は、その集団のその他の成員と、両ストランドを含めた２つ以上のヌクレオチドだけ異なっている。１つのストランドは、上部ストランドと呼称され、その補体は下部ストランドと呼称される。

本明細書で用いられる「上部」ストランドという語は、５′から３′の方向で読取られたポリヌクレオチドを意味する。配列は下部又は上部ストランドと呼ばれるものの、溶解状態では１つのストランドを上部又は下部ストランドとして固定する配向が全く存在しないことから、かかる呼称は相補的ストランドを区別するために意図されている。

例えば、１本鎖の部分的に相補的な核酸集団を生成するために４つのストランドのいずれでも使用する潜在性を伴って、２つの核酸成員を含む集団を、２つの２本鎖核酸から誘導することが可能である。本発明の部分的相補的な核酸集団を得るために使用可能な２つの核酸のストランドの潜在的組合せの一例が、図２に示されている。部分的相補的な核酸集団の潜在的成員である２つの核酸配列は、「Ｘ」（ＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧ）及び「Ｙ」（ＡＧＡＣＣＧＡＴＴＧ）（図２Ａ）と呼称される。核酸配列は２つの位置（「☆」で表わされた位置４及び６）で異なっている。核酸Ｘ及びＹの「上部」ストランドは、それぞれ「１＋」及び「３＋」と呼称され、核酸Ｘ及びＹの「下部」ストランドはそれぞれ「２−」及び「４−」と呼称される。

図２Ｂは、４つの核酸ストランドの考えられる組合せを示す。６つの考えられるストランド組合せのうち1+/2-、1+/4-、2-/3+又は3+/4-の組合せのみが、部分的に相補的な核酸集団の所要の上部及び下部ストランドを含んでいる。これらの上部/下部配列組合せのうち1+/4-又は2-/3+のみが、少なくとも1つのヌクレオチドだけ異なる相補的配列を有することから、2つの異なる分子の部分的相補的な核酸集団の一例を含んでいる。残りの組合せ1+/2-及び2+/4-は、正確に相補的な配列を含有し、従って、本発明の部分的相補的な核酸集団を含まない。

２つの異なる分子の集団の上述の例においては、部分的相補的な核酸分子集団は、単数又は複数のヌクレオチドだけ異なるものの同じ方向である1+/3+又は2-/4-といったストランドの組合せを除外していた。しかしながら、同じストランドをもつ核酸のこのような組合せは、その集団が少なくとも１つの下部ストランド及び少なくとも１つの上部ストランドを含むかぎり、より大きな集団内に包含され得るということがわかる。例えば、ストランド５＋及び６−を伴う第３の核酸「Ｚ」が内含される場合、組合せ１＋／３＋／６−又は２−／４−５＋は部分的相補的な核酸集団を含むことになる。同様にして、集団が少なくとも１つの上部ストランド及び少なくとも１つの下部ストランドを含むかぎり、そして集団が正確な補体である成員を全く含まないかぎり、本発明の部分的相補的な核酸集団を生成するために任意の数の核酸及びその対応する上部及び下部ストランドを組合せることができる。

本発明の核酸の集団は、約３個以上、約４個以上、約５個以上、約６個以上、約７個以上、約８個以上、約９個以上、約１０個以上、約１２個以上、約１５個以上、約２０個以上、約２５個以上、約３０個以上、約４０個以上、約５０個以上、約７５個以上、約１００個以上、約１５０個以上、約２００個以上、約２５０個以上、約３００個以上、約３５０個以上、約４００個以上、約４５０個以上、約５００個以上又さらには約１０００個以上の異なる核酸分子であり得る。１つの集団は又、約２０００個以上、約５０００個以上、約１×１０⁴個以上、約１×１０⁵個以上、約１×１０⁶個以上、約１×１０⁷個以上さらには約１×１０⁸個以上の異なる核酸をも含むことができる。当業者であれば、本明細書で開示されているように、所望の再集合実験の成果及び利用可能なスクリーニング方法の性質に応じて本発明の方法の中に内含すべき望ましい集団を容易に決定することができる。

本明細書で使用されているように、「ポリメラーゼ」という語は、ヌクレオチドの重合体すなわちポリヌクレオチドのテンプレート誘導的な形での形成の触媒として作用する酵素を意味している。本発明において有用なポリメラーゼは、動物、植物、細菌及びウイルスポリメラーゼを含めたあらゆる生体又は供給源から誘導可能である。ポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡをＤＮＡへと転写する能力をもつ逆転写酵素であり得る。

本明細書で用いられる「プルーフリーディング」という語は、ミスマッチヌクレオチドといったようなヌクレオチドが３′−から−５′という形で除去されかつ標準的には塩基対合ヌクレオチドにより置換され得る場合の酵素の特性を描写するものである。挿入又は欠失によりひき起こされるループを扱かう場合、プルーフリーディングにはミスマッチヌクレオチド（単複）の除去のみ又は塩基対合ヌクレオチド（単複）の付加のみが関与しうる。

本明細書で用いられる「組換え型」ポリヌクレオチドという語は、少なくとも２つの異なるポリヌクレオチドからの配列情報を含むポリヌクレオチドを意味する。

本明細書で用いられる「関連するポリヌクレオチド」という語は、ポリヌクレオチドの一領域又は部域が同一であること、及びポリヌクレオチドの一領域又は部域が同一でないことを意味する。

本明細書で用いられるＤＮＡ「再集合」という語は、ここでは同一でない配列間の配列変動再分配を表わすために用いられている。

本明細書で用いられる「レプリコン」という語は、一定長のポリヌクレオチド及び複製の開始のためのその部位を含めた遺伝的複製単位を意味する。

本明細書で用いられる「配列多様性」という語は、非同一ポリヌクレオチドの豊富さを意味する。「集団内での配列多様性を増大させる」という語は、１つの集団内での非同一ポリヌクレオチドの相対的豊富さを増大させることを意味する。

本明細書で用いられる「配列変異体」という語は、基準分子に比べて単数又は複数の配列差を伴う分子（ＤＮＡ、ＲＮＡポリヌクレオチドなど）を意味する。例えば、ＧＲＡＭＭＲプロセス中にヘテロ２本鎖分子全体を通して発生する別々の独立したミスマッチ解消事象の和は、その分子全体を通した配列情報の再集合を結果としてもたらす。配列情報は、「配列変異体」の複合ライブラリを生成するためにさまざまな組合せの形に再集合することになる。

本明細書で用いられる「ミスマッチ特異的ストランド分割」という語は、ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド配列上のらせん外塩基（単複）又は１つのミスマッチ塩基対又はミスマッチ塩基対グループの部位を認識しそのミスマッチの部位において１つのストランドを分割する作用物質によるストランド分割活性を意味する。

ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチド「充分な時間」という語は、１つの反応又はプロセスか所望の産物を提供するのに必要な時限を意味する。本発明については、充分な時間の決定は、当業者の知識範囲内に充分入るものである。「充分な時間」は、反応の機能性又は所望の産物の質に影響を及ぼすことなく熟練者の希望に応じて広く変動しうる。

本明細書で用いられる「野生型」という語は、核酸フラグメントがいかなる突然変異も含まないことを意味している。「野生型」タンパク質は、そのタンパク質が天然に見られる活性レベルで活性であり、標準的には天然に発見されるアミノ酸配列であることを意味する。１つの態様では、「野生型」又は「親配列」という語は、本発明の操作の前の出発又は基準配列を表わすことができる。

本明細書で使用されるポリペプチド表記においては、標準的な用法及び慣習に従って、左側方向は、アミノ末端方向であり、右側方向はカルボキシ末端方向である。同様にして、相反する規定のないかぎり、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は、５′末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５′方向と呼ばれる。初期ＲＮＡ写しの５′から３′への付加の方向は、転写方向と呼ばれる。

発明の詳細な説明
本発明は、ＣＥＬＩエードヌクレアーゼの発現のためのベクター又はプラスミドとして有用である配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３又は配列番号０４を内含する核酸配列を提供している。配列番号０３及び配列番号０４の核酸分子は、それぞれ配列番号０１及び配列番号０２内に含まれたＣＥＬＩ読取り枠である。配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３及び配列番号０４の核酸分子の調製及び使用は、本明細書の例２内でさらに教示されている。本発明は同様に、ＲＥＳＩエンドヌクレアーゼの発現のためのベクター又はプラスミドとして有用である図３の核酸配列（配列番号１６）を含む核酸分子をも提供する。

植物由来のミスマッチエンドヌクレアーゼは、ハイブリダイズされた核酸ストランド間のミスマッチを検出し、かかるハイブリダイズされたストランド間のポリヌクレオチドループ及び挿入を検出し、かかるハイブリダイズされたストランド間の多形現象を検出し、ポリヌクレオチドストランド内の配列の差異を検出し、フランキングＤＮＡ配列に実質的に不利な効果無く標的ポリヌクレオチド配列内のかかる突然変異を検出する能力をもつ（Yeung, Anthony, T.及びPatrick J. Hagan国際特許出願第ＷＯ９７／４６７０１号）。これらのエンドヌクレアーゼは、多様な植物内で発見され、恐らくは、植物界全体にわたり発見される。これらは、アルファファの芽、アスパラガス、緑豆苗条、セロリの茎、茶の葉、アイスバーグレタス、パセリ、セロリーキャベツ、ブロッコリの葉っぱ、キャベツ、カリフラワの葉っぱ及びトマトの中に発見されてきた（Oleykowski, C.A. et al., Nucleic Acids Research, 1998, 第26巻No. 4597-4702）。

植物由来のエンドヌクレアーゼは、現在、ハイブリダイズされた配列から複数組のヌクレオチド配列変異体を進化させるプロセスにおいて使用することができる。このプロセスにおいては、ミスマッチエンドヌクレアーゼは、ミスマッチ塩基を検出し、ハイブリダイズされたストランドのうちの少なくとも１つをニックする。このとき、ポリメラーゼ酵素が、単数又は複数のミスマッチ塩基を、反対側のストランド上の塩基対を相補する単数又は複数の塩基と置換する。このとき、ニックはリガーゼ酵素により密閉される。ハイブリッド上に２つ以上のミスマッチ部位が存在する場合には、置換が行なわれるミスマッチの位置と数及び塩基置換が行なわれるストランドに応じて変異体配列の一集団が結果としてもたらされることになる。配列変異体の進化においては、配列の全てのコピー上の全てのミスマッチが解消されることが必ずしも望ましいわけではない。一組の配列変異体から、好ましい活性をもつ単数又は複数の変異体を選択することができる。ＲＥＳＩ及びＣＥＬＩは、このプロセスにおいて有用なミスマッチエンドヌクレアーゼを例証するものである。ＧＲＡＭＭＲ反応では、その他の植物由来のミスマッチエンドヌクレアーゼも同様に有用である。

本発明は同様に、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４又は図３（配列番号１６）から成るグループの中から選択された核酸配列から成る組換え型植物ウイルス核酸を用いてＣＥＬＩ又はＲＥＳＩエンドヌクレアーゼを発現するためのプロセスをも提供する。

本発明は同様に、植物細胞が宿主細胞又は産生細胞である、植物細胞内のＣＥＬＩ又はＲＥＳＩエンドヌクレアーゼを転写又は発現する能力をもつサブゲノミックプロモータから成る組換え型植物ウイルス核酸をも提供している。

もう１つの実施形態においては、未変性外皮タンパク質コーディング配列が、ウイルス核酸、変性植物ウイルス外皮タンパク質コーディング配列及び変性プロモータから欠失されている、好ましくは、植物宿主内での発現、組換え型植物ウイルス核酸のパッケージング及び組換え型植物ウイルス核酸による宿主の全身的感染の確保の能力をもつ変性外皮タンパク質コーディング配列のサブゲノミックプロモータが挿入されている、植物ウイルス核酸が提供される。代替的には、外皮タンパク質遺伝子は、融合タンパク質が産生されるような形で、内部への変性核酸配列を挿入することによって不活性化され得る。組換え型植物ウイルス核酸は、単数又は複数の付加的な変性サブゲノミックプロモータを含有し得る。各々の変性サブゲノミックプロモータは、植物宿主内で隣接する遺伝子又は核酸配列を転写又は発現する能力をもち、かつ互いの及び未変性サブゲノミックプロモータとの組換えの能力をもたない。変性（外来性）核酸配列を、未変性植物ウイルスサブゲノミックプロモータに隣接して、又は複数の核酸配列が内含されている場合には該未変性及び変性植物ウイルスサブゲノミックプロモータに隣接して挿入することが可能である。変性核酸配列は、所望の産物を産生するべく、サブゲノミックプロモータの制御下で宿主植物内で転写又は発現される。

もう１つの実施形態においては、未変性外皮タンパク質コーディング配列の変性外皮タンパク質コーディング配列に代って変性外皮タンパク質サブゲノミックプロモータの１つに隣接して配置されるという点を除いて、第１の実施形態の場合と同じ組換え型植物ウイルス核酸が提供されている。

さらにもう１つの実施形態においては、未変性外皮タンパク質遺伝子がそのサブゲノミックプロモータに隣接し、単数又は複数の変性サブゲノミックプロモータがウイルス核酸内に挿入されている組換え型植物ウイルス核酸が提供されている。挿入された変性サブゲノミックプロモータは、植物宿主内で隣接する遺伝子を転写又は発現する能力を有し、かつ互いに及び未変性サブゲノミックプロモータと組換えする能力をもたない。所望の産物を産生するべくサブゲノミックプロモータの制御下で宿主植物内で転写又は発現されるように、変性サブゲノミック植物ウイルスプロモータに隣接して、変性核酸配列を挿入することができる。

もう１つの実施形態においては、未変性外皮タンパク質コーディング配列が変性外皮タンパク質コーディング配列により置換されているという点を除いて第３の実施形態の場合と同じ組換え型植物ウイルス核酸が提供される。

ウイルスベクターは、組換え型植物ウイルスを産生するべく組換え型植物ウイルス核酸によりコードされた外皮タンパク質によって包膜される。該組換え型植物ウイルス核酸又は組換え型植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために用いられる。該組換え型植物ウイルス核酸は、宿主内での複製、宿主内での全身的蔓延及び所望の産物を産生するための宿主内の外来性遺伝子（単複）の転写又は発現の能力をもつ。

本発明のもう１つの実施形態は、変性（外来性）核酸配列の維持及び転写又は発現について安定しておりかつ宿主植物内でかかる外来性配列を全身的に転写又は発現する能力をもつ組換え型植物ウイルス核酸及び組換え型ウイルスに向けられている。より特定的には、本発明に従った組換え型植物ウイルス核酸は、未変性植物ウイルスサブゲノミックプロモータ、少なくとも１つの変性植物ウイルスサブゲノミックプロモータ、植物ウイルス外皮タンパク質コーディング配列そして任意には、少なくとも１つの変性核酸配列を含んで成る。

本発明は、組換え型植物ウイルス核酸を含有する組換え型植物ウイルスによるか又は植物宿主の感染を受けた組織内で転写又は発現される単数又は複数の変性核酸配列を含有する組換え型植物ウイルス核酸による植物宿主の感染を提供する。コーディング配列の産物は、植物から回収されてもよいし、或いは又、植物内で表現型形質をひき起こすこともできる。

本発明の特長のいずれかを達成する上での第１段階は、植物ウイルス核酸の生理学的機能を破壊することなく植物ウイルス核酸内に単数又は複数の変性サブゲノミックプロモータが挿入されるように既知の従来の技術により植物ウイルスヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を修飾することにある。サブゲノミックプロモータは、組換え型植物ウイルス核酸又は組換え型植物ウイルスの感染を受けた植物宿主内の隣接する核酸配列を転写又は発現する能力をもつ。未変性外皮タンパク質コーディング配列は２つの実施形態において欠失され得、第２の実施形態では変性サブゲノミックプロモータの制御下に置かれて良く、又、さらなる実施形態においては保持され得る。変性外皮タンパク質遺伝子は、欠失されるか又はその他の形で不活性化された場合、変性サブゲノミックプロモータの１つの制御下に挿入されるか又は、任意には未変性外皮タンパク質サブゲノミックプロモータの制御下で挿入される。変性外皮タンパク質は、組換え型植物ウイルス核酸を包膜して組換え型植物ウイルスを産生する能力をもつ。かくして組換え型植物ウイルス核酸は、未変性又は変性サブゲノミックプロモータのうちの１つの制御下で未変性又は変性外皮タンパク質コーディング配列でありうる外皮タンパク質コーディング配列を含有する。外皮タンパク質は、植物宿主の全身的感染に関与する。

この必要条件を満たし従って適切であるウイルスの一部分としては、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、カウピーモザイクウイルス（ＣＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）、キュウリ緑斑モザイクウイルススイカ菌株（ＣＧＭＭＶ−Ｗ）及びオートムギモザイクウイルス（ＯＭＶ）といったタバコモザイクウイルス群由来のウイルス、及びブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）、ソラマメ斑紋ウイルス及びカウピークロロチックウイルスといったようなブロムモザイクウイルス群由来のウイルスが含まれる。付加的な適切なウイルスとしては、イネ壊死ウイルス（ＲＮＶ）及びトマトゴールドモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）、キャッサバラテントウイルス（ＣＬＶ）及びトウモロコシ条斑ウイルス（ＭＳＶ）といったようなジェミニウイルスが含まれる。

本発明のもう１つの実施形態は、植物宿主内で転写される能力をもつ単数又は複数の変性核酸配列をさらに含む組換え型植物ウイルス核酸である。変性核酸配列は、使用される特定の実施形態に応じて、変性ウイルスサブゲノミックプロモータのうちの１つ及び／又は未変性外皮タンパク質遺伝子プロモータに隣接して置かれる。変性核酸を従来の技術によって挿入することもできるし、又、融合タンパク質が産生されるように変性核酸配列を未変性外皮タンパク質コーディング配列内に又はそれに隣接して挿入することもできる。転写されている変性核酸配列は、アンチセンスメカニズムにより表現型形質の発現を調節する能力をもつＲＮＡとして転写され得る。代替的には、組換え型植物ウイルス核酸内の変性核酸配列を植物宿主内で転写又は翻訳させて表現型形質を産生することが可能である。変性核酸配列（単複）は、複数の表現型形質の発現についてもコードすることができる。変性核酸配列を含有する組換え型植物ウイルス核酸は、いかなるウイルスサブゲノミックプロモータが利用されようとも変性核酸配列（単複）かそのプロモータに対し適正な配向にあるように、従来の技術を用いて構築される。

本発明はさらに、宿主細胞か又は産生細胞である、配列番号０１、配列番号０２、配列番号０３、配列番号０４又は図３（配列番号１６）から成るグループの中から選択された核酸配列で構成されているベクター又はプラスミドを含む植物細胞を提供している。

ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩ酵素を作る方法は、植物ウイルスベクターに制限されるわけではない。これらの遺伝子又はその変異体は、今日の技術において既知の複数の方法のうちのいずれによってでも、又いずれの既知の宿主生体内にでも導入され得る。さまざまな宿主細胞を形質転換するための方法が、Klein et al.「粒子ボンバードメントによる微生物、植物及び動物の形質転換」Bio/Technol. New York, N.Y., Nature Publishing Company, 1992年３月、v.10 (3) pp.286〜291内で開示されている。多種多様な高等植物種を形質転換するための技術は、周知であり、技術、科学、及び特許文献内で記述されている。例えば、Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988)を参照のこと。

例えば、電気穿孔法、ＰＥＧ媒介トランスフェクション、粒子ボンバードメント、シリコンファイバ送達又は植物細胞プロトプラスト又は胚体カルスのマイクロインジェクションといったような技術を用いて植物細胞のゲノミックＤＮＡ内に直接ＤＮＡ構成体を導入することができる。例えば、Tomes et al., マイクロプロジェクタイルボンバードメントを介した無傷の植物細胞内への直接的ＤＮＡ移入、ｐ１９７−２１３、植物細胞、組織及び器官培養、基礎方法、O. L. Gamborg及びG. C. Phillips編、Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995中を参照のこと。ポリエチレングリコール沈殿法を用いたＤＮＡ構成体の導入は、Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717-2722 (1984)内に記述されている。電気穿孔技術は、Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824 (1985)の中で記述されている。弾丸形質転換技術は、Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)の中で記述されている。

代替的には、ＤＮＡ構成体を適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組合せ、従来のAgrobacterium tumefaciens宿主ベクターの中に導入することができる。Agrobacterium tumefaciensの病原力機能は、細胞が細菌の感染を受けている場合に植物細胞ＤＮＡ内への構成体及び隣接マーカーの挿入を導くことになる。Agrobacterium tumefaciens媒介形質転換技術は、科学文献の中で充分に記述されている。例えば、Horsch et al., Science 233: 496-498 (1984)、及びFraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803 (1983)を参照のこと。例えば、トウモロコシのAgrobacterium形質転換は、米国特許第５，９８１，８４０号に記述されている。

単子葉植物のAgrobacterium形質転換は、米国特許第５，５９１，６１６号の中で記述されている。大豆のAgrobacterium形質転換は、米国特許第５，５６３，０５５号の中で記述されている。

その他の形質転換方法としては、（１）Agrobacterium rhizogenes媒介形質転換（例えば、Lichtenstein及びFuller、遺伝子工学、第６巻、PWJ Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987中；及びLichtenstein, C. P., 及びDraper, J., DNAクローニング第ＩＩ巻、D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985中を参照）ＰＣＴ／ＵＳ８７／０２５１２出願（１９８８年４月７日公示のＷＯ８８／０２４０５）は、A. tumefaciensベクターｐＡＲＣ８又はｐＡＲＣ１６と共にA. rhizogenes菌株Ａ４及びそのＲiプラスミドを使用することを記述している、（２）リポゾーム媒介ＤＮＡ摂取（例えば、Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353, 1984参照）（３）渦流方法（例えば、Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 1228, (1990)参照）が含まれる。

ＤＮＡは同様に、Zhou et al.,、酵素学方法101: 433 (1983)中；D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107: 367 (1987); Luo et al., Plane Mol. Biol. Reporter, 6: 165 (1988)に記述されているように、花粉中への直接的ＤＮＡ移入によっても、植物内に導入可能である。ポリペプチドコーディング核酸の発現は、Pena et al., Nature, 325: 274 (1987)により記述されているように植物の生殖器官内へのＤＮＡの注入によって得ることができる。ＤＮＡは同様に、未成熟の胚芽の細胞内に直接注入することもでき、Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet., 75: 30 (1987); 及びBenbrook et al., Bio Expo 1986議事録中、Butterworth, Stoneham, Mass., pp.27-54 (1986)により記述されているように乾燥胚芽の再水和。

以上の形質転換技術のいずれかにより誘導される形質転換済みの植物細胞は、形質転換された遺伝子型を有する全植物を再生するように培養可能である。かかる再生技術は、往々にして組織培養成長培地中での或る種の植物ホルモンの操作に依存し、標準的には本発明のポリヌクレオチドと共に導入された殺菌剤及び／又は除草剤マーカーに依存する。トウモロコシの形質転換及び再生については、Gordon-Kamm et al.,「植物細胞」, 2: 603-618 (1990)を参照のこと。

ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩ及びそれらの変異体は同様に、その他の宿主又は宿主／ベクター系によっても作ることができる。ポリヌクレオチド配列を、遺伝子配列の挿入又は取込みにより操作された当該技術分野で既知の組換え型プラスミド、ウイルス又はその他のビヒクルの中に挿入することが可能である。このような発現ベクターは、宿主の挿入済み遺伝子配列の効率の良い転写を容易にするプロモータ配列を含んでいる。発現ベクターは標準的には、複製起点つまりプロモータを含む。本発明で使用するのに適したベクターには、細菌内での発現のためのＴ７ベースの発現ベクター（Rosenberg, et al., Gene 56: 125, 1987）、哺乳動物細胞内での発現のためのｐＭＳＸＮＤ発現ベクター（Lee 及び Nathans, J. Biol. Chem., 263: 3521, 1988）及び昆虫細胞内での発現のためのバキュロウイルス由来のベクターが含まれるが、これらに制限されるわけではない。ＤＮＡセグメントは、例えばプロモータ（例えばＴ７、メタロチオネインＩ又はポリヘドリンプロモータ）といった調節要素に操作可能な形でリンクされたベクターの中に存在し得る。

ポリヌクレオチド配列は、原核生物又は真核生物のいずれの中でも発現可能である。宿主には、細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物生体が含まれ得る。原核生物内で真核又はウイルス配列を有するＤＮＡ配列を発現する方法は、当該技術分野において周知である。宿主内で発現又は複製する能力をもつ生物学的に機能的なウイルス及びプラスミドＤＮＡベクターが、当該技術分野において既知である。かかるベクターは、本発明のＤＮＡ配列を取込むために用いられる。

当業者にとって周知である方法を、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法には、組換え型ＤＮＡ技術、合成技術及びin vivo組換え型／遺伝子技術が含まれる（例えば、Maniatis et al., 1989分子クローニング；実験室マニュアル、Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.を参照のこと）。

ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列を発現するために、さまざまな宿主発現ベクター系を利用することができる。これらには、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列を含有する組換え型バクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌といったような微生物；ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列を含有する組換え型酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列を含有する組換え型ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）での感染を受けた昆虫細胞系；又はＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列を含有する組換え型ウイルス発現ベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）での感染を受けた動物細胞系、又は安定した発現のために工学処置された形質転換済み動物細胞系が含まれるが、これらに制限されるわけではない。

利用される宿主／ベクター系に応じて、構成性及び誘発性プロモータ、転写エンハンサ要素、転写ターミネータなどを含めた数多くの適切な転写及び翻訳要素のうちの任意のものを発現ベクター内で使用することができる（例えば、Bitter et al., 1987、酵素学方法153: 516-544を参照のこと）。例えば、細菌系の中でクローニングする場合、バクテリオファージ、lambda、plac、ptrp、ptacのｐＬ（ptrp-lacハイブリッドプロモータ）といったような誘発可能なプロモータを使用することができる。哺乳動物細胞系内でクローニングする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモータ（例えばメタロチオネインプロモータ）又は哺乳動物ウイルスから誘導されたプロモータ（例えばレトロウイルス長末端反復；アデノウイルス後期プロモータ；ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を使用することができる。組換え型ＤＮＡ又は合成技術により産生されたプロモータは同様に、挿入済みのＲＥＳＩ又はＣＥＬＴコーディング配列の転写を提供するために使用することもできる。

細菌系においては、発現されたタンパク質について意図された用途に応じて、数多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、ＲＥＳＩ又はＣＥＬＩを大量に産生させるべきである場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質の発現を導くベクターが望ましいかもしれない。回収の一助となるべく分割部位を含むように工学処理されているベクターが好ましい。かかるベクターとしては、ハイブリッド−lacZタンパク質が産生されるようにlacZコーディング領域と同一枠内でベクター内にＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列を連結させることができるE. coli発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., EMBOJ. 2: 1791, 1983）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509）などが含まれるが、これらに制限されるわけではない。

酵母においては、構成性又は誘発性プロモータを含む数多くのベクターを使用することができる。再考のためには、分子生物学における現行プロトコル、第２巻1988, Ed. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13; Grant et al., 1987,「酵母のための発現及び分泌ベクター」酵素学方法Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp. 516-544中; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; 及びBitter, 1987, 酵母内の非相同遺伝子発現、酵素学方法、Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; 及び酵母サッカロマイセスの分子生物学, 1982, Eds. Strathem et al., Cold Spring Harbor Press, 第Ｉ及びＩＩ巻を参照。ＡＤＨ又はＬＥＵ２といった構成性酵母プロモータ又は、ＧＡＬといったような誘発性プロモータを使用することができる（酵母におけるクローニング、Ch. 3, R. Rothstein, ＤＮＡクローニング第ＩＩ巻、実践アプローチ、D M Glover編, 1986, IRL Press, Wash., D.C.）。代替的には、酵母染色体内への外来性ＤＮＡ配列の組込みを促進するベクターを使用することもできる。

真核生物系そして好ましくは哺乳動物発現系は、発現された哺乳動物タンパク質の適正な翻訳後修飾の発生を可能にする。一次写しの適切な処置、グリコシル化、リン酸化そして有利には遺伝子産物の分泌のための細胞メカニズムを有する真核細胞を、ＲＥＳＩ又はＣＥＬＩの発現のための宿主細胞として使用することができる。哺乳動物系統が好ましいかもしれない。このような細胞系統には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３及びＷＩ３８が含まれるが、これらに制限されるわけではない。

組換え型ウイルス又はウイルス要素を利用して発現を導く哺乳動物細胞系を、工学処理することが可能である。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する場合、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩコーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモータ及びトリパータイトリーダー配列に連結することができる。このキメラ遺伝子は次に、in vitro又はin vivo組換えによりアデノウイルスゲノム内に挿入可能である。ウイルスゲノムの可欠領域（例えば領域Ｅ１又はＥ３）内挿入は結果として、感染を受けた宿主内でタンパク質を発現する能力をもつ生存可能な組換え型ウイルスをもたらす。礼えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3655-3659を参照のこと。代替的には、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモータを使用することができる（例えば、Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol. 49: 857-864; Panicali et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 4927-4931を参照のこと。染色体外要素として複製する能力をもつウシ乳頭腫ウイルスに基づくベクター（Sarver, et al., 1981, Mol. Cell. Biol. 1: 486）。このＤＮＡがマウス細胞内に侵入したすぐ後に、プラスミドは、細胞１個あたり約１００〜２００コピーまで複製する。挿入済みｃＤＮＡの転写は、宿主の染色体の中へのプラスミドの組込みを必要とせず、かくして高レベルの発現を生み出す。これらのベクターは、例えばｎｅｏ遺伝子といったように、選択可能なマーカーをプラスミド内に内含させることによって、安定した発現のために使用することができる。代替的には、宿主細胞内のＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ遺伝子の発現を導入し導く能力をもつベクターとしての使用のために、レトロウイルスゲノムを修飾することができる（Cone & Mulligan, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349-6353）。高レベルの発現は同様に、メタロチオニンＩＩＡプロモータ及び熱ショックプロモータを含むもののこれらに制限されるわけではない誘発性プロモータを用いて達成することもできる。

適切な発現制御要素（例えばプロモータ、エンハンサ、配列、転写、ターミネータ、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーによって制御されるＣＥＬＩ又はＲＥＳＩｃＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。組換え型プラスミド内の選択可能マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体内に安定した形で組込ませ、成長させて病巣を形成させることを可能にし、この病巣自体はクローニングされ、細胞系統へと拡張され得る。例えば、外来性ＤＮＡの導入に続いて、工学処理された細胞は、富化された培地内で１〜２日間成長でき、次に選択培地へと切換えられる。単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler, et al., 1977, Cell 11: 223）、ハイポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy, et al., 1980, Cell 22: 817）遺伝子を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-又はａｐｒｔ^-細胞内で利用することができる。同様に、メトトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567; O’Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527）；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerre, et al., 1984, Gene 30: 147）遺伝子についての選択のベースとして、代謝拮抗物質耐性を使用することが可能である。最近では、付加的な選択可能遺伝子、すなわち細胞がトリプトファンの代りにインドールを用いることを可能にするｔｒｐＢ；ヒスチジンの代りにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤ（Hartman & Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047）；及びオルミチンデカルボキシラーゼ阻害物質、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（McConlogue L., 1987, 分子生物学における現行情報通信中、Cold Spring Harbor Laboratory ed.）が記述されてきている。

組換え型ＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者が充分に知る通りの従来の技術によって、実施可能である。宿主がE. coliといったような原核生物である場合、ＤＮＡ摂取能力をもつコンピテント細胞を、対数増殖期の後で収獲した細胞から調製し、その後当該技術分野において周知の手順を用いてＣａＣｌ．ｓｕｂ．２方法で処理することができる。代替的には、ＭｇＣｌ．ｓｕｂ．２又はＲｂＣｌを使用することもできる。形質転換は同様に、望ましい場合、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に実施することもできる。

動物及び下等真核動物（例えば酵母）宿主細胞は、応答能があるか又はさまざまな手段により形質転換のために応答能を付与される。動物細胞内にＤＮＡを導入する周知の方法は複数存在する。これらには、リン酸カルシウム共沈物、マイクロインジェクション、電気穿孔法、パーティクルガン法、リポゾーム内に包まれたプラスミドの挿入が含まれ、そうでなければウイルスベクターを使用することができる。真核細胞は同様に、本発明のＣＥＬＩ又はＲＥＳＩをコードするＤＮＡ配列、及び単純ヘルペスチミジンキナーゼといった選択可能な表現型をコードする第２の外来性ＤＮＡ分子を用いて同時形質転換させることもできる。もう１つの方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、シンドビスウイルス又はウシ乳頭腫ウイルスといった真核生物ウイルスベクタを用いて、真核細胞を過渡的に感染又は形質転換させタンパク質を発現することにある。（例えば、真核生物ウイルスベクター、Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzmnan ed., 1982を参照のこと）。トランスフェクションを受けた細胞は、当該技術分野において周知の手段により培養される。Kuchler, R. J., 細胞培養及びウイルス学における生化学方法、Dowden, Hutchinson及びRoss, Inc. (1977)。

本発明は、ヘテロ２本鎖が少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有する、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドから配列変異体を作るin vitro方法において、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供されるストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性をもつ有効量の単数又は複数の作用物質と前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；及び相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させ、ここで少なくとも単数又は複数の変異体が作られる段階を含んで成る方法を提供する。

本発明のもう１つの態様は、ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドが環状、線状又はレプリコンであるものである。

本発明のもう１つの態様は、所望の変異体が異なる量の相補性を有するものである。
本発明のもう１つの態様は、ストランド分割活性、プルーフリーディング活性及びリガーゼ活性が逐次的に又は同時に付加されるものである。

本発明のもう１つの態様は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、E. coli ＤＮＡリガーゼ、又はＴａｇＤＮＡリガーゼといったような作用物質によって提供されるリガーゼ活性の付加を提供する。

本発明のもう１つの態様においては、ストランド分割活性は、ＣＥＬＩ、ＲＥＳＩ、Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ又はＴ７エンドヌクレアーゼＩといったような酵素によって提供される。

本発明のもう１つの態様においては、ポリメラーゼ活性がＰｏｌベータによって提供される。

本発明のもう１つの態様においては、プルーフリーディング活性が、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ又はＴ７ＤＮＡポリメラーゼによって提供される。

本発明のもう１つの態様においては、有効量のストランド分割活性及びプルーフリーディング活性及びリガーゼ活性が、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びE. coli ＤＮＡリガーゼによって提供される。

本発明のもう１つの態様においては、有効量のストランド分割活性及びプルーフリーディング活性及びリガーゼ活性が、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼによって提供される。

本発明のもう１つの実施形態は、配列の集団内の多様性を増大させるin vitro方法において、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；プルーフリーディング活性、リガーゼ活性及びＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供されるストランド分割活性をもつ有効量の単数又は複数の作用物質とヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；及び相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させ、ここで集団中の多様性が増大させられる段階、を含んで成る方法を提供する。

本発明のもう１つの実施形態は、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを得る方法において、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；プルーフリーディング活性、リガーゼ活性及びＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供されるストランド分割活性をもつ有効量の単数又は複数の作用物質と前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのストランド間の相補性百分率を増大させるのに充分な時間を与え、ここで集団中の多様性が増大させられる段階、及び所望の機能的特性について変異体集団をスクリーニング又は選択する段階、を含んで成る方法を提供する。

本発明のもう１つの実施形態は、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを得る方法において、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；プルーフリーディング活性、リガーゼ活性及びＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供されるストランド分割活性をもつ有効量の単数又は複数の作用物質と前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのストランド間の相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させ、ここで集団中の多様性が増大させられる段階；ＤＮＡをＲＮＡに転換させる段階、及び所望の機能的特性についてリボ核酸変異体集団をスクリーニング又は選択する段階、を含んで成る方法を提供する。

さらに本発明のもう１つの実施形態は、所望の機能的特性を有するポリヌクレオチドを得る方法において、少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；プルーフリーディング活性、リガーゼ活性及びＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供される＜ストランド分割活性（原文抜け）＞をもつ有効量の単数又は複数の作用物質と前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのストランド間の相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させ、前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドをＲＮＡに、前記ＲＮＡをポリペプチドに転換させる段階、及び前記所望の機能的特性についてポリペプチド変異体集団をスクリーニング又は選択する段階、を含んで成る方法を提供する。

本発明のさらにもう１つの実施形態は、所望の機能的特性をコードするポリヌクレオチドを得る方法において、ヘテロ２本鎖が任意には約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、６２％、５８％又は４７％同一でそのサイズが約１００、１０００、１０，０００又は１００，０００塩基対以上である少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；プルーフリーディング活性、リガーゼ活性及びＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供されるストランド分割活性をもつ有効量の単数又は複数の作用物質と前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのストランド間の相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させ、所望の機能的特性を有する変異体集団をスクリーニング又は選択する段階；１本鎖ポリヌクレオチドを得るべく前記変異体集団を変性させる段階；少なくとも１つの第２のヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを形成するべく前記１本鎖ポリヌクレオチドをアニールする段階；プルーフリーディング活性、リガーゼ活性及びＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ酵素によって提供されるストランド分割活性をもつ有効量の単数又は複数の作用物質とヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを組合せる段階；ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのストランド間、及び相補性百分率を増大させるのに充分な時間経過させる段階、を含んで成る方法を提供する。

本発明は、標準的に増幅済み及び／又はクローニング済みポリヌクレオチドの形で改良型ポリヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列集団を生成する方法において、該改良型ポリヌクレオチド配列（単複）が選択又はスクリーニングの対象となりうる少なくとも１つの所望の表現型特徴（例えばポリペプチドをコードする、リンクされたポリヌクレオチドの転写を促進する、タンパク質を結合する、ウイルスベクターの機能を改善するなど）を有する方法に関する。かかる所望のポリヌクレオチドは、適切な植物、動物、真菌、酵母又は細菌発現ベクターからの発現、遺伝子導入植物、動物又は微生物を形成するための組込み、リボザイムの発現などといった数多くの方法で使用することが可能である。

ＧＲＡＭＭＲは、in vitro反応におけるヘテロ２本鎖ＤＮＡストランド上のミスマッチ塩基対の解消を提供する。この反応は、ミスマッチ又はその近くでの１つのストランド又はもう１つのストランドの分割とそれに続く分割済みストランドからのミスマッチ塩基の切除及びもう１方のストランドの配列に対しテンプレートされたヌクレオチドを結果として得られた空隙の中に満たすための重合から始まる。結果として得られるニックは、バックボーンを再結合させるべく連結により密封され得る。ヘテロ２本鎖分子全体を通して発生する別々の独立したミスマッチ解消事象の合計の結果、その分子全体にわたる配列情報の再集合がもたらされることになる。配列情報は、配列変異体の複合ライブラリを生成するべくさまざまな組合せの形で再集合することになる。

ＧＲＡＭＭＲの１実施形態においては、突然変異誘発ＰＣＲ、化学的突然変異誘発などといった当該技術分野において既知のあらゆる方法によって突然変異体ライブラリが生成され、その後所望の特性をもつ突然変異体についてスクリーニング又は選択が行なわれる。突然変異体ＤＮＡは、混合され、１本鎖へと変性され、アニールさせられる。ハイブリダイズする部分的に相補的なストランドは、ミスマッチの部位において塩基対合していないヌクレオチドを有することになる。ＣＥＬＩ（Oleykowski et al., 1998; Yang et al., 2000）又はＲＥＳＩといった類似のミスマッチ特異的活性での処理は、ミスマッチ又はその近くでの１方又は他方のポリヌクレオチドストランドのニッキングをひき起こすことになる。さらに、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ又は、挿入／欠失又はその近くでニックし得る。プルーフリーディング活性（例えばＴ４ＤＮＡＰｏｌ）を含有するポリメラーゼの存在は、ミスマッチの切除を可能にし、その後のポリメラーゼ活性は、その他のストランドをテンプレートとして用いて空隙を満たすことになる。５′〜３′エキソヌクレアーゼ活性及びストランド変位活性が欠如したポリメラーゼが空隙を満たし、それがもとのＣＥＬＩ分割部位にあるＤＮＡの５′末端に達した時点で重合を止め、かくして短かい配列区画のみを再合成することになる。このときＤＮＡリガーゼ（例えばＴ４ＤＮＡリガーゼ又はE. coli ＤＮＡリガーゼ）は、リン酸塩バックボーンを回復させることによりニックを密封することができる。このプロセスは、数多くの部位でそして一定の与えられたヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子のいずれかのストランド上で同時に起こり得る。その結果は、出発配列の集団よりもさらに多様な配列変異体集団を提供するための入力ストランド間の配列差異のランダム化である。これらの出力ポリヌクレオチドは、適切なベクター内に直接クローニングされ得るか又は、クローニングの前にＰＣＲにより増幅され得る。代替的には、反応は、ＧＲＡＭＭＲ反応の後適切な宿主内に直接導入され得る２本鎖環状プラスミド分子又はその他の適切なレプリコンという状況の範囲内でヘテロ２本鎖領域上で実施可能である。もう１つの変形形態においては、出力ポリヌクレオチドをＲＮＡポリヌクレオチドへと転写し、例えばウイルスベクター転写プラスミドの場合のように植物上へ植物ウイルスベクターを接種することによって直接使用することができる。結果として得られたクローンは、所望の特性における改善についての選択又はスクリーンに付される。このとき、付加的な改善を得ようとして選択されたクローンで単数又は複数回全プロセスを反復することができる。

出力ポリヌクレオチドが直接クローニングされる場合、クローニング宿主内の複製時点で同じ細胞内の２つの異なるプラスミドを導き得る不完全に解消した分子の存続の可能性が存在する。これらのプラスミドは潜在的に混合プラスミドコロニーを発生させる。このような可能性を回避したい場合、出力ポリヌクレオチド分子を宿主内で成長させて複製／解消を可能にし、ポリヌクレオチドを単複し新しい宿主細胞へと再度形質転換させることができる。

もう１つの実施形態では、１分子につき２つ以上の親から入力された配列が望まれる場合、上述の手順は、出力ポリヌクレオチドのあらゆるクローニングの前に循環的に実施される。ＧＲＡＭＭＲ反応の後、２本鎖ポリヌクレオチドは変性され、アニールさせられ、ミスマッチ解消プロセスが反復される。所望の回数のこのようなサイクルの後、出力ポリヌクレオチドを直接クローニングし、適切なベクター内に導入することができ、そうでなければクローニングの前にこれらをＰＣＲで増幅させることができる。結果として得られたクローンは、所望の特性の改善についての選択又はスクリーンに付される。

もう１つの実施形態では、所望の突然変異から有害な突然変異のバックグラウンドを除去する一助となるべく「分子戻し交配」が実施される。該方法を実施するため、所望の突然変異体ＤＮＡのプールを野生型ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。クローンを改善について選択し、さらなる有意な変化が全くなくなるまで再び野生型に戻し交配させることができる。

プロセスの効率は、ヘテロ２本鎖分子について出発集団を富化させ、かくして未改変親型出力分子の数を削減するさまざまな方法によって改善される。ミスマッチハイブリッドは、アプタマー、染料又はミスマッチＤＮＡに結合するその他の作用物質を用いて親和性精製され得る。好ましい実施形態は、ＭｕｔＳタンパク質親和性マトリックス（Wagner et al., Nucleic Acids Res. 23 (19): 3944-3948 (1995); Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 83: 5057-5061 (1986)）又はミスマッチ結合性ただし非分割性のファージＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ突然変異体（Golz及びKemper, Nucleic Acids Research, 1999; 27: e7）の使用である。

１つの実施形態においては、手順は、入力ポリヌクレオチドが各々の配列変異体の１本鎖から成るように修正される。例えば、部分的相補的な１本鎖分子を生成するべく非対称ＰＣＲにより異なる親配列から、ストランドの性質が相対する複数の１本鎖ＤＮＡが産生される。ヘテロ２本鎖を作るためのストランド相互のアニーリングは、例２で記述されている通りに実施される。代替的には、Lambdaエキソヌクレアーゼで各々の親２本鎖ＤＮＡの１つのストランドを優先的に消化し、その後続いて残りのストランドを互いに対してアニールすることにより、１本鎖ＤＮＡを生成することができる。この実施形態においては、アニーリングストランドには、再アニールすべき１００％相補性ストランドが全く存在しない。従って、より高い再集合配列変異効率を導く出力ポリヌクレオチドの中の未修飾ポリヌクレオチドすなわち「親ポリヌクレオチド」のより低いバックグラウンドが存在する。この効率の増大は、所望のポリヌクレオチドについてテストするために、選択よりもむしろスクリーンが利用される状況において特に貴重なものとなる。

ヘテロ２本鎖形成のためのもう１つの方法は、２本鎖親ＤＮＡを混合し、ストランドを解離するべく変性させ、１本鎖ＤＮＡが互いにアニールしてヘテロ２本鎖及び親ホモ２本鎖集団を生成するようにすることにある。次に、ＭｕｔＳ又は非分割性Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ突然変異体を用いた上述の方法のようなヘテロ２本鎖捕捉方法により、ヘテロ２本鎖を選択的に富化することができる。代替的には、ヘテロ２本鎖内では分割されず親ホモ２本鎖分子内で分割される制限酵素によって、集団内の親ホモ２本鎖分子を分割することが可能である。次に未分割のヘテロ２本鎖ＤＮＡを、例９に記述されているように全長プラスミドヘテロ２本鎖分子上に全長プラスミドを生成する目的で実施された通りにアガロースゲル内でのサイズ分画によって単離することができる。次に、ＤＮＡリガーゼとのインキュベーションにより、これらの全長ヘテロ２本鎖プラスミド分子内でのニックシーリングがもたらされた。

もう１つの実施形態においては、「クランプ」配列を添加することによって、親又は入力２本鎖ポリヌクレオチドが修飾される。１つの入力ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドプールは、５′プライマ内に１つのユニーク配列の付加を伴ってＰＣＲによって増幅される。もう一方の入力ポリヌクレオチド又はプールは、３′プライマ内に１つのユニーク配列の付加を伴ってＰＣＲにより増幅される。クランプ配列は、ＧＲＡＭＭＲ反応の産物のクローニング段階において、第１のポリヌクレオチド（又はプール）からの５′クランプ及び第２のポリヌクレオチド（又はプール）からの３′末端を伴う産物のみがクローニングのための適切な末端を有することになるような形で、問題の遺伝子の５′末端のための１つのユニーク制限酵素部位及び３′末端のためのもう１つを含有するように設計され得る。代替的には、ＧＲＡＭＭＲ反応の産物は、類似の結果を達成するべく５′及び３′クランプのユニーク配列を用いてＰＣＲ増幅され得る。従って、再集合配列変異の効率をより高くする出力ポリヌクレオチドクローンの中の未修飾ポリヌクレオチドすなわち「親ポリヌクレオチド」のより低いバックグラウンドが存在する。この効率の増大は、所望のポリヌクレオチドについてテストするために選択が利用される状況において、特に貴重なものとなる。任意には、いずれかの親が上部ストランドとして役立つことができかくして両方の相互ヘテロ２本鎖がミスマッチ解消反応に参加できるようにするようにクランププライマ配列と相補的なオリゴヌクレオチドプライマをＧＲＡＭＭＲ反応に対し付加することができる。

ヘテロ２本鎖の１つの末端から延びる１本鎖クランプ配列がヘテロ２本鎖のもう１方の末端から延びる１本鎖クランプ配列と相補的である上述の通りの末端クランプ配列を親２本鎖ＤＮＡが有している、環式ヘテロ２本鎖化ポリヌクレオチドを生成するためのもう１つの方法が実施される。これらの相補的１本鎖クランプはアニールさせられ、かくしてヘテロ２本鎖化されたＤＮＡ分子を環状化させる。同一配列の再アニーリングの結果得られる親ホモ２本鎖は、１つのクランプ配列しかもたず、従って、環状化が起こり得るその末端において相補的１本鎖配列を全く有していない。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ及びＤＮＡリガーゼは、それぞれ環状分子内のあらゆる空隙を満たすため及びバックボーン内のニックをシールするために用いられ、共有結合により閉鎖された環状ヘテロ２本鎖分子の集団を形成する結果となることができる。共有結合で閉鎖された環状ヘテロ２本鎖分子は、さらなる変性条件に付された場合にその構成要素ストランドへと解離しないことから、より多くの線状２本鎖親２重鎖を閉鎖環状ヘテロ２本鎖に転換するために、変性、環状化及び連結のプロセスを反復することができる。

もう１つの実施形態においては、１本鎖環状ファージミドＤＮＡの１領域を、関連するものの同一でない線状ＤＮＡにハイブリダイズでき、これを次にＴ７ＤＮＡポリメラーゼ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼといったポリメラーゼに加えてＴ４遺伝子３２タンパク質を用いて拡張させることができ、その後結果として得られたニックにおいて連結させて、ＤＮＡ間の差異部位にヘテロ２本鎖化された領域を伴う環状２本鎖分子を得ることができる。次に、この分子上でＧＲＡＭＭＲを実施して配列再集合された分子ライブラリを得ることができる。

代替的には、プラスミドバックボーンとの関係において相対するストランド極性の２つの１本鎖環状ファージミドＤＮＡ及び再集合の標的である親遺伝子配列が互いに対しアニールされる。ファージｆ１起点配列が存在する広範なミスマッチ領域が発生することになる。しかしながら、ＧＲＡＭＭＲ処理の時点で、この広範なミスマッチ領域は、機能的ｆ１起点を回復するいずれかの親タイプ配列へと戻ることができる。これらの２本鎖分子は同様に、問題の親遺伝子をコードするストランド間の差異部位においてミスマッチ領域を含むことになる。このとき、この分子上でＧＲＡＭＭＲを実施して、配列再集合された分子のライブラリを得ることができる。

以上の段落で論述された通り、出発ＤＮＡ又は入力ＤＮＡは、任意の数の形態をもつものであり得る。例えば入力ＤＮＡは、例２で教示されているように、全長、１本鎖及び相対する方向のものであり得る。代替的には、入力ＤＮＡは同様に、全長ストランドのフラグメントでもありうる。入力ＤＮＡは、いずれか１方又は両方共、２本鎖であり得、そうでなければ、メチル化、ホスホロチオレートリンケージ、ペプチド、核酸、ＤＮＡ内へのウラシル取込み、１方又は両方のストランド内でのＲＮＡ置換などによって修飾可能である。２重鎖のいずれかのストランドは、両ストランドに沿って連続しているか、不連続ではあるものの隣接しているか、重複を伴って不連続であるか、又は空隙を伴って不連続であり得る。

ＤＮＡフラグメント化及び再構築ベースのＤＮＡシャッフリングスキームに対してＧＲＡＭＭＲを適用することも可能である。例えば、遺伝子再構築中の変性、アニーリング及び延長サイクルを通して遺伝子フラグメントが取られる方法においては、中間段階としてＧＲＡＭＭＲを利用することができる。

このような１つの実施形態においては、１つの遺伝子又は突然変異体遺伝子プールからのＤＮＡは、酵素、機械的又は化学的手段によってフラグメント化され、任意には、１つのサイズ範囲の前記フラグメントは、アガロースゲル上の分離といったような手段により単離される。野生型又は所望の変異体又はそのプールといったような出発ポリヌクレオチドは、フラグメントに付加され、混合物は変性され次にアニールされる。アニールされたポリヌクレオチドはポリメラーゼで処理されて、テンプレートとして無傷ストランドを用いて１本鎖空隙を満たす。結果としての部分的に相補的な２本鎖は、ミスマッチ部位において非塩基対合ヌクレオチドを有することになる。ＣＥＬＩ（Oleykowski et al., 1998; Yang et al., 2000）又はＲＥＳＩといった類似の活性をもつ作用物質での処理は、ミスマッチ又はその近くでの１方の又はもう一方のポリヌクレオチドストランドのニッキングをひき起こすことになる。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼといったようなプルーフリーディング活性を含有するポリメラーゼの付加により、ミスマッチの切除が可能となり、その後のポリメラーゼ活性は、もう１方のストランドをテンプレートとして用いて空隙を満たすことになる。このとき、Ｔ４ＤＮＡリガーゼといったようなＤＮＡリガーゼが、リン酸塩バックボーンを回復することによってニックをシールすることができる。その結果、潜在的に改善された特性をもつ出力ストランドを提供する目的での入力ストランドの間での配列変異のランダム化がもたらされる。これらの出力ポリヌクレオチドは、適切なベクター内に直接クローニングされ得、そうでなければ、これらをクローニングの前にＰＣＲで増幅することができる。結果として得られたクローンは、所望の特性の改善のため、選択又はスクリーンに付される。

このような１実施形態においては、突然変異体遺伝子のプールからのＤＮＡは、酵素的、機械的又は化学的手段によってフラグメント化されるか又は、親テンプレートにアニールされたランダムオリゴヌクレオチドの制限された延長によってフラグメントが生成され（米国特許第５，９６５，４０８号）、任意にはアガロースゲル上の分離といったような手段により１サイズ範囲の前記フラグメントが単離される。混合物は変性され、次にアニールされる。アニールされたポリヌクレオチドは任意には、１本鎖空隙を満たすべくポリメラーゼで処理される。結果としての部分的に相補的な２本鎖フラグメントは、ミスマッチ部位において非塩基対合ヌクレオチドを有することになる。ＣＥＬＩ（Oleykowski et al., 1998; Yang et al., 2000）又はＲＥＳＩといった類似の活性をもつ作用物質での処理は、各ミスマッチの一方の又はもう一方のポリヌクレオチドストランド３′のニッキングをひき起こすことになる。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼといったようなプルーフリーディング活性を含有するポリメラーゼの活性により、ミスマッチの切除が可能となり、その後のポリメラーゼ活性は、もう一方のストランドをテンプレートとして用いて空隙を満たすことになる。任意には、このとき、Ｔ４ＤＮＡリガーゼといったようなＤＮＡリガーゼが、リン酸塩バックボーンを回復することによってニックをシールすることができる。その結果、潜在的に改善された特性をもつ出力ストランドを提供する目的での入力ストランドの間での配列変異のランダム化がもたらされる。その後の変性、アニーリング及びＧＲＡＭＭＲラウンドが、遺伝子の再構築を可能にする。再構築された遺伝子の所望の部分を増幅するためにＰＣＲを使用することができる。これらのＰＣＲ出力ポリヌクレオチドは、適切なベクター内に直接クローニングされ得る。結果として得られたクローンは、所望の特性について、選択又はスクリーンに付される。

本発明のもう１つの実施形態は、もう１つの遺伝子又は複数の遺伝子のフラグメントがアニールする連続足場ストランドで出発する段階を提供する。フラップ及びギヤップは、Coco et al., Nature Biotech 19 (01) 354; 米国特許第６，３１９，７１３号に記述されているようにトリミングされ満たされ、ＧＲＡＭＭＲが実施される。このプロセスにおいては、ＧＲＡＭＭＲは、テンプレートストランドとフラップ及びギヤップのトリミング及び連結の結果としてのストランドの間の配列情報の移送を可能にすることによって、さらなる配列再集合をもたらすことになる。この方法は、１つの連続したストランド内に特異的配列パッチを取込みそれに続いて、足場とミスマッチする残基のＧＲＡＭＭＲを行なうという利点を提供する。同じ配列又は遺伝子に対し同時に数多くのフラグメントをアニールすることにより、数多くの個々の部位を同時に対処でき、かくして、多数の配列又は遺伝子を直ちに再集合することが可能となる。当該実施形態においては、足場は必ずしも分解されず、むしろ、２重鎖を直接クローニングするか又はクローニングの前にＰＣＲで増幅することができる。徹底的なミスマッチ解消の結果、完全に２重化されたＤＮＡが得られる。部分的ミスマッチ解消は、基本的に１つの２重鎖につき２つの異なる再集合された産物を結果としてもたらす。

当該開示から認識できるように、ＧＲＡＭＭＲを同様に、そのプロセス内の１段階として関連ＤＮＡのアニーリングを内含するさまざまな方法に対し適用することもできる。例えば、数多くの部位特異的突然変異誘発プロトコルが、ファージミド又は変性プラスミドのいずれかの１本鎖形態をした環状ＤＮＡに対する突然変異体コーディングＤＮＡ分子のアニーリングを要求する。これらのＤＮＡは、次に１つのポリメラーゼで延長され、その後ひき続いてニックをシールするためにリガーゼで処理され、親配列を除去するべくさらに操作され、所望の単数又は複数の突然変異が親遺伝子バックグラウンド内に取込まれた状態で残される。これらのプロトコルは一般に、特定のＤＮＡ配列内へ特異的突然変異を取込むのに使用されるものの、２つのストランドの間の配列変異を再集合するべくこのようなプロセスの中で生成されたヘテロ２本鎖化分子にＧＲＡＭＭＲ反応を適用することができ、かくして、再集合された遺伝子変異を伴うさまざまな後代セットが結果としてもたらされるようにすることが実行可能である。

もう１つの実施形態は、問題のＤＮＡの特定の領域のみに対する再集合の配列ラウンドを提供する。例えば、ＤＮＡフラグメントが環状１本鎖ファージミドＤＮＡにアニールされ、ＧＲＡＭＭＲが実施される。フラグメントは、それらが出力材料内に物理的に取込まれるのを防ぐように処理できる。例えば、これらを延長不可にするジ−デオキシ残基で３′末端において終結させることが可能である。多数の再集合ラウンドを実施することができるものの、もとの入力１本鎖ＤＮＡクローンからの修飾された分子のみが回収されることになる。その結果、この再集合において使用されるＤＮＡフラグメントは最終産物に対し配列情報のみを寄与し、最終的な回収可能な産物内に物理的に組込まれることはない。

選択されたライブラリ成員間の組換えを得るべく、タンパク質、ペプチド又はアプタマー表示方法のためにＧＲＡＭＭＲを使用することができる。ＧＲＡＭＭＲには入力ＤＮＡのフラグメント化が必要とされないことから、配列のきわめて小さいストレッチ間での配列情報を再集合することが可能であり得る。例えば、標的結合といった特定の特性について選択されたＲＮＡアプタマー又は小さいペプチドをコードするＤＮＡを再集合することができる。選択されたＤＮＡ分子の間でアニーリングが発生するためには、特定のデフォルトセットに対するコドンウォッブル塩基同一性の偏向を通してか又は類似の結合活性に起因する類似性を担持するランダム化された配列セグメントの領域内で例えばコーディング配列の５′及び３′領域において分子間で一部の配列相同性レベルが共有されるべきである。

ＧＲＡＭＭＲが行なわれる反応温度の操作が有用であり得る。例えば、温度が比較的低くなるとヘテロ２本鎖の安定化を助けることとなり、ＧＲＡＭＭＲをよりミスマッチレベルの高い基質上に実施することが可能となる。同様にして、塩、ＰＥＧ、ホルムアミド、などといったストランド間の塩基対合に影響を及ぼす添加剤を使用して、ＧＲＡＭＭＲ反応内のヘテロ２本鎖の安定性を改変し、かくして反応の成果に影響を与えることができる。

もう１つの実施形態は、ＧＲＡＭＭＲによるゾーン突然変異誘発、すなわち、多重塩基対合の潜在能力をもつヌクレオチド類似体を用いたミスマッチ残基及びそのすぐ近くにおけるランダム又は半ランダム突然変異を提供する。このことは、問題の特定の点における基本的にランダムな突然変異誘発の集中を提供し、本発明に対しもう１つの利点を追加する。類似するものの互いにわずかに異なる機能をもつ遺伝子群、例えば数多くの酵素が、その独自の特定の活性について操作可能になる領域内で互いに中庸な配列差異を示すことになる。これらの活性には、基質の選好性、総合パートナー、調節部位などが含まれ得る。これらの機能を支配する遺伝子配列は、関連する遺伝子の集団内部で非相同的であるべきである。かかる機能の特異性はこれらのアミノ酸及びそれらの隣接アミノ酸と結びつけられることがわかっているため、ＧＲＡＭＭＲ突然変異誘発は、遺伝子間の配列情報を再集合することに加えて、これらの領域にランダム突然変異誘発を導きそれらの機能を展開させ、しかもその間ランダム化に対する寛容度が潜在的に低いその他の配列、例えば構造的枠組、不変残基及びその他のこのような重要な部位を混乱させないことが可能である。

全く異なる機能をもつ異なる酵素は、活性部位及び調節部位といったような操作可能領域内でちょうど異ならないものとなる。これらは、遺伝的浮動を通して発生するその他の相互の差異を有する確率が高い。従って、かかる変化の場所におけるさらなるランダム化は、突然変異誘発実験の成果にとって有害又は最小限の重要性しかもたない。又は中性的であるとみなすことができる。かかる重要度の低い部位から離れるように及び１つの酵素の活性部位といったようなランダム突然変異誘発のためのより優れた結果を提示できる部位に向かってランダム突然変異誘発を導くためには、これらの領域内のヌクレオチド相補性の全体的レベルを増減させるべく遺伝子のコドン使用頻度の偏向を操作することができる。相補性がさらに大きい領域が、相補性が比較的低い領域に比べてＧＲＡＭＭＲに対する感受性が低い場合には、一定の与えられた部位におけるＧＲＡＭＭＥＲ誘導されたゾーンランダム突然変異誘発の度合を変調させることができる。

任意のＤＮＡシャッフリング実験において、シャッフリングされた後代の集団内で得られるシャッフリングされていないＤＮＡ又は親ＤＮＡの集団を最小限におさえることが望ましい。これを達成するために、数多くのアプローチを使用することができる。シャッフリングされるべき遺伝子が別々のただしその他の点では同一であるプラスミドの上に存在するプラスミドオンプラスミドのＤＮＡシャッフリングフォーマットにおいては、各々のプラスミドは、存在する１つの又はもう１つの異なるユニーク制限部位において線状化される。制限エンドヌクレアーゼの除去の後、線状化されたＤＮＡは混合され、融解して離され、ニックされ閉鎖された環状ヘテロ２本鎖分子であるか又は２本鎖及び線状ホモ２本鎖であるヘテロ２本鎖ＤＮＡの集団が形成するようにアニールさせられる。ＧＲＡＭＭＲ反応のための所望の基質を表わしているのは、環状２本鎖ヘテロ２本鎖ＤＮＡ分子の集団である。ゲル分画によりこの所望の集団を富化すること又はこの集団の物理的分離を必要としないもののむしろシャッフリングを受けていない親分子の回収を促進するような１つの又は数多くの方法を使用することが可能である。このような方法のいくつかを以下で列挙する。

まず第１に、線状親ホモ２本鎖及び環状２本鎖ヘテロ２本鎖の混合集団のＧＲＡＭＭＲ反応の後、E. coliの形質転換が一般に実施される。環状ＤＮＡはE. coliを形質転換させる上でその線状化された対応物よりもはるかに効率が良いことから、この段階で、形質転換−コンピテント分子へのその環状化を防止することにより親ホモ２本鎖を強力に弁別することができる。E. coli ＤＮＡリガーゼをＧＲＡＭＭＲ反応のリガーゼ成分として使用することは、制限エンドヌクレアーゼ分割から結果としてもたらされる短かい粘着末端を接合するよりもさらに効率良くニックをシールすることから、親ホモ２本鎖の再環状化を防止するのに役立つことになる。さらに、この酵素は、きわめて低い効率で平滑末端を連結する。この戦略を使用する結果、ＧＲＡＭＭＲ反応を伴うE. coliの形質転換の結果としての後代は、シャッフリングされない親遺伝子が涸渇し、ヘテロ２本鎖基質としてＧＲＡＭＭＲ反応に入る分子が富化される。

ＧＲＡＭＭＲ出力分子の集団から親遺伝子汚染を除外するためのもう１つの方法は、選択可能マーカー内部にプラスミド線状化部位を位置づけすることである。部位は、ヘテロ２本鎖の付着末端の間でアニーリングが起こることができるようにするため互いに充分に離隔しているべきであり、充てん又はトリミングされ得るオーバーハングを有するか又は分割時点で配列の欠失をひき起こすかのいずれかであるべきである。上述のように、シャッフリングされるべき遺伝子を含有するプラスミドは部位のうちのいずれかにおいて線状化される。制限エンドヌクレアーゼの除去後、線状化されたＤＮＡは混合され、融合され、アニールさせられる。結果として得られた標本は、ヘテロ２本鎖及び線状ホモ２本鎖の混合で構成されている。この標本はこのとき、ｄＮＴＰの存在下でＴ４ＤＮＡポリメラーゼといったようなプルーフリーディングポリメラーゼで処理され得る。環状ホモ２本鎖は影響を受けていない状態にあるべきであり、一方線状親ホモ２本鎖はその末端において平滑化されていることになり、ＧＲＡＭＭＲ反応内の任意の点でその分子が再環状化状態選択可能マーカーの配列に対し有効に塩基を付加又は欠失させる。これらの配列の付加又は欠失が選択可能マーカーの機能の分断を結果としてもたらす場合には、結果としての分子は適切な選択の下で回収されなくなる。

シャッフル済みライブラリの未シャッフル親汚染を防止するために使用できるもう１つの方法は、融合及びアニーリングに先立ち線状化されたＤＮＡを脱リンすることである。線状ホモ２本鎖分子は、環状ヘテロ２本鎖が各ストランド内に単一のニックを単に含有しているもののなお環状ひいてはE. coli内への効率の良い形質転換に対する応答能をもつ状態にとどまることになるのに対して、環状分子内に連結することができない状態にされることになる。

シャッフル済みライブラリの未シャッフル親汚染を防止するために使用できるもう１つの方法は、ヘテロ２本鎖化された分子内のミスマッチによりその認識部位が重複される酵素で消化を行なうことである。これらの部位における親ホモ２本鎖の消化は、親汚染を低減させるべく上述の処理のいずれかを受けることができるように、結果としての分子を線状にすることになる。結果としての分子は同様に、さらに小さくすることもでき、かくして無傷の環状ヘテロ２本鎖分子からの分離が容易になる。

シャッフリング実験から未シャッフル親分子を除外することに加えて２つ以上の親遺伝子の集団のいずれか２つ以上の遺伝子の間のシャッフリングを防止することが望まれる場合、上述の同じ原則が適用され得る。

本発明においては、ランダム再集合は、in vitro ＤＮＡミスマッチ解消反応において起こる。この方法では、以前の突然変異再集合（「シャッフリング」）方法の基礎として役立つ「遺伝子再構築」のいずれの段階も必要とされない。その代り、これは、in vitroでのハイブリダイゼーション及びミスマッチ解消によりＤＮＡの単数又は複数のストランドからの配列変異をもう１つのＤＮＡストランド内に伝達するために、再構成された又は人工的なＤＮＡミスマッチ解消システムの能力に基づいている。

一般に、組換え型ＤＮＡ技術の標準技法が、本明細書に各々参考として全体が内含されている、例えば（Ausubel, 1987, Ausubel, 1999; Sambrook et al., 1989）といったさまざまな刊行物の中で記述されている。メーカーの勧告に従って、ポリヌクレオチド修飾用酵素が使用された。望ましい場合、予め定められたＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲアンプリマーを熟練者の裁量にて選択することができる。

ＧＲＡＭＭＲ反応に関与する本発明中で教示された活性の各々を、類似の活性をもつ機能的に等価の作用物質と互換することができるということ、及びかかる変更が本発明の範囲内に入ることがわかる。例えば、例６に表わされているように、ＴａｇＤＮＡリガーゼはＴ４ＤＮＡリガーゼに置換できる。E. coli ＤＮＡリガーゼといったその他のリガーゼも、置換され得る。同様にして、例１２に示されているように、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼをＴ４ＤＮＡポリメラーゼに置換させることができる。適切なプルーフリーディング活性をもつその他の酵素が、ＧＲＡＭＭＲ反応に必要とされるプルーフリーディング活性のためにこれらの酵素のいずれかの代りに機能することができる。類似の要領で、ＧＲＡＭＭＲのために働くことが実証されたものと機能的に等価の活性を伴うあらゆるポリメラーゼ置換のために使用することができる。

ストランド分割を、数多くの方法でもたらすことができる。ＣＥＬＩに加えて、さまざまな植物種からの抽出物の中に発見される潜在的に類似の活性及び数多くの機能的等価物（Oleykowski, Nucleic Acids Res 1998; 26: 4597-602）を使用することができる。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ及びＳＰヌクレアーゼといったようなその他のミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ（Oleykowski, Bio-Chemistry 1999; 38: 2200-5）を使用することができる。もう１つの特に有用なミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼは、ＲＥＳＩである。

ＣＥＬＩ及びＲＥＳＩは、所望の特性をもつ酵素変異体を得るために修飾され得る。植物を調査することにより、その他の供給源からの相同な核酸配列を発見することができる。代替的には、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩは突然変異を受けることができ、ヘテロ２本鎖分子を形成するべく１００％未満の同一性をもつ相対するストランドを合わせることができる。本明細書で開示された当該方法又はもう１つの方法を用いて、新しいＣＥＬＩ及びＲＥＳＩ酵素変異体を進化させることが可能である。

ＣＥＬＩはミスマッチエンドヌクレアーゼである。
ＣＥＩはセロリから単離されたミスマッチエンドヌクレアーゼである。ターゲティングされたポリヌクレオチド配列内の突然変異、特にガンに付随する突然変異の検出のための診断方法におけるＣＥＬＩの使用が、米国特許第５，８６９，２４５号で開示されている。ＣＥＬＩを単離し調製する方法も同様にこの特許内で開示されている。しかしながら、この特許内には、ＤＮＡ配列の再集合におけるＣＥＬＩの使用に関しての開示は全く存在しない。

ＣＥＬＩをコードする核酸分子が、ＰＣＴ出願公報第ＷＯ０１／６２９７４Ａ１内で開示されている。米国特許第５，８６９，２４５号と同様、ガンに付随するターゲティングされたポリヌクレオチド配列内の突然変異の検出のための診断方法におけるＣＥＬＩの使用が開示されている。ここでも同様に、ＤＮＡ配列再集合におけるＣＥＬＩの使用に関する開示は全く存在しない。

ＲＥＳＩはミスマッチエンドヌクレアーゼである。
ターゲティングされたポリヌクレオチド配列内の突然変異特にガンに付随する突然変異の検出のための診断方法において、ＲＥＳＩエンドヌクレアーゼの使用が考慮されている。これらのタイプの診断方法のうちの一部分の例が、米国特許第５，８６９，２４５号及びDel Tito et alの中で開示されている。ＲＥＳＩの使用は、同様に、大型ゲノム領域内で突然変異を検出するための方法Sokurenko et al.,の中で、及びMcCallum et al.に開示されているようにＴＩＬＬＩＮＧといったような突然変異スクリーニング方法のために、考慮されている。

in vitroでの８個の考えられる塩基ミスマッチのいずれか又は８、４又は１個のヌクレオチドのＤＮＡ−ループとのファージＴ４のエンドヌクレアーゼＶＩＩの反応性は、「ファージＴ４のエンドヌクレアーゼＶＩＩがin vitroでのミスマッチの矯正を開始させる」Solaro, et al., J. Mol Biol 230 (93) 868の中で開示されている。この刊行物は、誤対合の６つのヌクレオチド３′の内部でニック及びカウンタニックを作り上げることによりエンドヌクレアーゼＶＩＩが２本鎖破断を導入するメカニズムについて報告している。該刊行物は、第１のニックとカウンタニックの発生の間の時間的遅延が、ｇｐ４３の３′〜５′エンドヌクレアーゼ活性に誤対合を除去させかつそのポリメラーゼ活性がカウンタニックの発生前にギヤップを満たすことができるようにするのに充分なものであったということを開示している。ヌクレオチドは、いずれかのストランド上でのミスマッチの３′に位置特定され第１の安定した塩基対におけるミスマッチの５′で停止する第１のニックから消去される。ポリメラーゼ活性は、５′から３′方向で、ＤＮＡリガーゼによりシールされている初期ニックに向かって進む。その結果、３から４個のヌクレオチドの非常に短かい修飾トラックが、先のミスマッチの部位を横断して延びる。該刊行物は、ファージＴ４内でエンドヌクレアーゼＶＩＩが有し得るさまざまな活性に関する論述で終結している。しかしながら、該刊行物は、ファージＴ４の外でのエンドヌクレアーゼＶＩＩについての実践的有用性を全く開示せず、ＤＮＡ再集合におけるその適用可能性に関しての開示は全く存在しない。

Escherichia coliにおけるin vivoでのキメラＤＮＡ配列のライブラリの作成方法が、Nucleic Acids Research, 1999, Vol 27, No. 18, e18, Volkov, A. A., Shao, Z., 及びArnold, F.H. Abostado, J.P., et al., (1984). Proc Natl Acad Sci USA 81 (18): 5792-5796. Cami, B.P., et al., (1984). Proc Natl Acad Sci USA 81 (2): 503-507. Chang, S.D., et al., (1984). Gene 29 (3): 255-261の中で開示されている。該方法は、各々の親の要素から成る新しい再組合せされた配列のライブラリがヘテロ２本鎖内の非同一性の領域の修復によって作り出される、E. coliを形質転換するためのin vitroで形成されたヘテロ２本鎖を使用している。これらの刊行物は、既存のＤＮＡ組換え方法に対する便利な追加としてのこの方法の使用を開示しているが、開示された方法は、E. coliのin vivo環境内に制限されている。E. coli. Volkov, A.A., et al., 酵素学方法328: 456-463 (2000) Academic Press, Inc., San Diegoは、E. coli内のミスマッチ修復のために利用可能なメカニズムが複数存在すると述べており、又ＭｕｔＳ／２／Ｈ酵素系を利用する「長パッチ」修復メカニズムが恐らくはヘテロ２本鎖修復の原因であったと推測している。

本発明を例示するために、以下の制限的な意味のない例が提供されている。
例１
ＣＥＬＩエンドヌクレアーゼのクローニング、発現及び精製
この例は、本明細書とｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩＡｖｒ（配列番号１）及びｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６ＨＩＳ（配列番号２）として識別されている植物からのＣＥＬＩエンドヌクレアーゼを発現させるために用いられた核酸分子の調製について教示している。特に、この例では、本明細書に参考として内含された米国特許第５，３１６，９３１、５，５８９，３６７号、５，８６６，７８５号及び５，８８９，１９０号に教示された開示が言及されている。

セロリＲＮＡ抽出：
現地の市場でセロリを購入した。少量のセロリ組織（０．５〜０．７５グラム）を刻み、液体窒素内で冷凍し、破砕ガラスの存在下で乳鉢内で乳棒によりすりつぶした。４００マイクロリットルのTrizolを添加しさらにすりつぶした後、７００マイクロリットルの抽出物を除去し、５分間氷上に保った。その後２００マイクロリットルのクロロホルムを添加し、標本を遠心分離に付し、室温で３分間放置し、１０分間１５，０００ｇで再度遠心分離に付した。水性層を新しい試験管に取り出し、等体積のイソプロパノールを添加した。試験管を倒置して混合させ、１０分間室温で放置しその後４℃で１０分間１５０００ｇでの遠心分離に付した。ペレットを２回、７０％のエタノール４００マイクロリットルの中で洗浄し、空気乾燥させ、４０マイクロリットルの精製水の中で再懸濁させた。１マイクロリットルのＲＮａｓｉｎを添加し、１％のアガロースゲル上で３．５マイクロリットルを走らせて、ＲＮＡ調製物の品質をチェックした（ゲル写真）。残りは、さらなる使用まで−７０℃で貯蔵した。

ＣＥＬＩ遺伝子クローニング及びウイルスベクターによる発見
セロリからの合計ＲＮＡを逆転写とその後のＰＣＲに付して、ＣＥＬＩ遺伝子配列をコードするｃＤＮＡを増幅した。別々の反応において、合計セロリＲＮＡ調製物を１１マイクロリットル、ＣＥＬＩ−Ａｖｒ−Ｒ、ＣＥＬＩ−６Ｈ−Ｒのいずれか１マイクロリットル（５０ピコモル）又はオリゴｄＴプライマ２マイクロリットルと混合した。ＣＥＬＩ遺伝子の３′末端に対し６−Ｈｉｓタグ及びリンカーペプチドをコードする配列を付加するのにＣＥＬＩ−６Ｈ−Ｒを使用する一方で、ｃＤＮＡをプライミングし遺伝子増幅するためにＣＥＬＩ−Ａｖｒ−Ｒを使用した。１分間７０℃まで標本を加熱し、氷上で急速冷蔵した後、各反応に対して４マイクロリットルの０．１ＭＤＴＴ、１マイクロリットルのSuperscript ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を添加した。１時間４２℃で反応をインキュベートした。

Ｔａｇ−Ｐｆｕ混合物又はＰｆｕ単独で、W.M. Barnes (Proc Natl Acad Sci. USA, 1994 Mar 15: 91(6): 2216-20)の方法を用いて、ＣＥＬＩｃＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を実施した。プライマＣＥＬＩ−Ｐａｃ−Ｆ（順方向プライマとして）をＣＥＬＩ−Ａｖｒ−Ｒ（逆方向プライマとして）と対合させて用いたＰＣＲのためのテンプレートとして、ＣＥＬＩ−Ａｖｒ−ＲでプライミングされたＲＴ反応を用いた。その他のＰＣＲでは、上述のプライマ対の両方のためのテンプレートとして、オリゴｄＴでプライミングさせたＲＴ反応を用いた。全てのＰＣＲ反応は、５０℃でのアニーリングと７２℃での２分間の延長の３０サイクルを用いて１００マイクロリットルの中で実施した。アガロースゲル電気泳動により、結果として得られた反応のアリコートを分析した。Ｐｆｕが唯一のポリメラーゼとして使用された反応は、いかなる産物も示さなかった。Ｔａｇ／Ｐｆｕ混合物で実施された全ての反応は、予想されたサイズの産物を生み出した。しかしながらＣＥＬＩ特異的プライマ対でプライミングされたｃＤＮＡから増幅したものは、オリゴ−ｄＴでプライミングされたｃＤＮＡから増幅した反応に比べて、より多くの産物を提供した。最も多くの産物を提供したＰＣＲ反応からのＤＮＡは、Zymoclean ＤＮＡスピンカラムキットを用いて精製され、ＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩで消化され、ゲル単離され、トバモウイルスベースのＧＥＮＥ−ＷＡＲＥ(登録商標)ベクターであるＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩ消化したプラスミドｐＲＴ１３０へと連結した。各連続２マイクロリットルをＤＨ５αコンピテントE. coliへと形質転換させ、ＬＢ−ａｍｐ寒天平板上で一晩培養した。コロニーを取り上げ、液体培地内で一晩成長させ、Qiagenプラスミド調製物キットを用いてプラスミドＤＮＡを単離した。各構成体からの１２クローンをＰａｃＩ及びＡｖｒＩＩでの消化によりスクリーニングし、各セットの１２のうち１１が適正サイズのインサートについて陽性であった。各構成体についてのクローンのうち１０個をin vitroで転写させ、ＲＮＡをN. benthamiana植物に接種した。さらに、１０クローンの両セット内のＣＥＬＩ遺伝子インサートを配列分析に付した。未変性形態のＣＥＬＩをコードするインサートを含有する複数のクローンが、ＷＯ０１／６２９７４Ａ１内の公表されたＣＥＬＩ配列と同一の配列を有していた。６−ヒスチジン配列に融合されたＣＥＬＩをコードするインサートを含む１つのクローンが、公表されたＣＥＬＩ配列と同一であった。各々（それぞれｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩＡｖｒ−Ｂ３及びｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９）の１つのクローンをさらなる作業のために選択した。これらのクローン内のＣＥＬＩコーディング配列をその後もう１つのＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)ベクターまで移送した。これらのクローンｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩＡｖｒ−Ｂ３及びｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９の配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２として提供される。

クローニングされたＣＥＬＩ活性の検定：
ＣＥＬＩ配列を含有するＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)構成体が活性のＣＥＬＩ酵素を産生できるか否かを決定するため、ｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩＡｖｒ及びｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ及びＧＦＰ−ＧＥＮＥＷＡＲＥ対照−被感染植物の標本を収獲し、ｐＨ８．０のトリス−ＨＣｌ中で小型乳鉢内で乳棒により均質化させた。抽出物を清澄化し、スーパーコイルＤＮＡニッキング活性について検定した。１０マイクロリットルの合計体積で１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液中に１マイクログラムのｐＵＣ１９誘導体のスーパコイルプラスミド調製物を含有する反応の中で、各々のスーパーコイルＤＮＡニッキング検定を実施した。反応に対し添加された植物抽出物の量は、０．１マイクロリットル、０．０１マイクロリットル又は０．００１マイクロリットルであり、４２℃で３０時間インキュベートされ、臭化エチジウムの存在下で、１％のＴＢＥ−アガロースゲル上で走行させた。ＧＦＰ−ＧＥＮＥＷＡＲＥ対照被感染植物抽出物内ではニッキング活性はほとんど又は全く検出されなかったが、ＣＥＬＩ−ＧＥＮＥＷＡＲＥ構成体に感染した植物からの抽出物は、プラスミドＤＮＡ基質に対するかなりの量の活性を示した。

ｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩＡｖｒ−Ｂ３及びｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９での接種を受けた植物の抽出物に対して、付加的な活性検定を実施した。これらの検定においては、感染を受けた葉から細胞内流体を洗浄し、残りの洗浄済み葉組織から得た材料とは別々に検定した。インキュベーションが１時間３７℃であったという点を除いて、上述の通りに検定を実施した。標本を臭化エチジウムの存在下で１％のＴＢＥアガロースゲル上に走行させ、写真を撮った。

被感染N. benthamiana植物からの６Ｈｉｓタグ付けされたＣＥＬＩの精製：
播種から２０〜２１日目にｐＲＴ１３０−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９からのＲＮＡ写しを、N-benthamiana植物に接種した。接種後１０日目に９６本の被感染植物から組織を収獲し、細胞内流体洗浄に付した。手短に言うと、感染を受けた葉及び茎材料を３０秒間、冷蔵した浸透緩衝液（７ｍＭのβ−ＭＥの存在下のｐＨ４の５０ｍＭのリン酸塩）で２回真空浸透させた。浸透させた組織をぬぐい取って、余剰の緩衝液を吸着させ、バスケット回転子（Beckman）を用いて２０分間２５００×ｇで遠心分離により分泌済みタンパク質を回収した。ＰＭＳＦを、最終濃度１ｍＭとなるまで組換え型ＣＥＬＩを含む抽出された細胞内流体（ＩＦ）に添加し、攪拌しながら１５分間２５℃でインキュベートした。イミダゾール（ｐＨ６．０）とＮａＣｌをそれぞれ最終濃度５ｍＭ及び０．５Ｍまで抽出物に添加した後、ＩＦをｐＨ５．２に調整し、１．２μのSartorius ＧＦ膜（Whatman）を通してろ過してRubisco及び緑色顔料の大部分を除去した。清澄化直後に、濃縮ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７．０に調整し、２０分間氷上でインキュベートして非タンパク質様材料を沈殿させた。０．８μ又は０．６５／０．４５μのSartorius ＧＦ（Whatman）を用いてＩＦをさらに清澄させた。３００ｃｍ／時の線速度で、５ｍＭのイミダゾールを含有する結合用緩衝液（５０ｍＭのリン酸塩、０．５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．０）で平衡化されたＮｉ²⁺ Fast Flow Sepharose (Amersham, Pharmacia Biotech, NJ)を用いて、金属キレート化アフィニティクロマトグラフィにより、清澄済みＩＦから組換え型ＣＥＬＩを精製した。未結合タンパク質を２０ｍＭのイミダゾール／結合用緩衝液で洗浄し、結合用緩衝液中で２０〜４００Ｍのイミダゾールの線形勾配でＮｉ²⁺セファロースからＣＥＬＩを溶出した。なおもイミダゾールを含有する画分を上述の通りにスーパーコイルＤＮＡニッキング活性について検定したが、無視できる程度の活性しかないことがわかった。その後、同じ画分を、１０ｋＤの分子量のカットオフ透析チュービング（Pierce）を用いて、ＺｎＣｌ₂の存在下でｐＨ８．０の０．１Ｍのトリス−ＨＣｌに対して透析し、再び検定した。この透析の後、スーパーコイルＤＮＡニッキング活性を回復した。

ＸｃｅｌｌＩＩＭｉｎｉ−Ｃｅｌｌ器具（Invitrogen, Carlesbad, CA）を用いて、Laemmliの緩衝液系の中で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、ＩＦ及び精製済みＣＥＬＩタンパク質を分析した。タンパク質バンドを、クーマシーブリリアントブルー及び銀染色により可視化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査し、Ｂｉｏ−Ｒａｄゲル撮像装置を用いて分析した。

精製済みＣＥＬＩの質量分析
マトリクス援用レーザー／脱着イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）により、精製済みＣＥＬＩの平均分子質量を決定した。５０％のアセトニトリル／水でＣＥＬＩのアリコートを１：１０に希釈し、ＰＥバイオシステムＤＥＰｒｏ質量分析計を用いてシナピン酸マトリクス（１：１ｖ／ｖ）と混合した。陽−線状イオンモードで２５ｋＶの加速電圧を用いて、質量分析を実施した。

精製済みＣＥＬＩから単離したペプチドの質量分析
１４％ゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でＣＥＬＩを分離し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。単一の均質なバンドが目に見えた。このバンドを切除し、完全に脱染色した。３７℃で３０分間５０％のアセトニトリル中の１０ｍＭのＤＤＴの存在下で、タンパク質を還元し、還元したスルフヒドロ基を、光の無い状態で２４℃で３０分間、５０％のアセトニトリル中の２８ｍＭのヨードアセタミドの存在下で遮断した。ゲルピースを５０％のアセトニトリルで洗浄し、部分的脱水後、切除したＣＥＬＩバンドを高純度トリプシン（Promega）溶液中で浸解させた。タンパク質分解消化を、１６時間３７℃で続行させた。結果として得られたペプチドを５０％のアセトニトリルでゲルピースから溶出し０．１％のトリ−フルオロ酢酸（ＴＦＡ）をSpeed Vac内で濃縮した。ペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のマトリクス中で、混合したトリプシン消化物を結晶化させ、２０ｋＶの加速電圧とリフレクタ陽イオンモードで動作させた遅延抽出を備えたPerSeptive Biosystem ＤＥ−ＳＴＲＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いることによって、分析した。予想理論質量をＭＳ−消化物（Protein Prospector）又はＧＰＭＡＷプログラム（Lighthouse Data, Odense, Denmark）により計算した。縦列型質量分析（ナノエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ））のために、ペプチド標本を５％のアセトニトリル／０．１％蟻酸で希釈し、ＬＣＭＳ／ＭＳに付し、４重極直交飛行時間型質量分光計器（micromass, inc., マンチェスター、ＵＫ）上で分析した。データをMslynxで処理し、データベースをSonarで探査した。

ウイルス発現した組換え型ＣＥＬＩをＩＦに対し分泌した。清澄化したＩＦ抽出済み材料を用いて、Ｈｉｓ−ｔａｇＣＥＬＩ活性を精製した。１段階Ｎｉ²⁺親和性クロマトグラフィ分離を用いて、ＣＥＬＩを精製した。クーマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析法によって決定されるように、高度に精製された均質な単一のタンパク質バンドを精製した。成熟タンパク質のサイズ及びグリコシル化パーセントは、セロリから単離したＣＥＬＩタンパク質について報告されたもの（Yang et al., 2000）と一致している。精製済みＣＥＬＩは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により決定されるように、４０ｋＤの平均分子質量を有し、２３．５質量％のグリコシル化を表わす。ＣＥＬＩは、アミノ酸位置５８、１１６、１３４及び２０８において、４つの潜在的グリコシル化部位を有する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより回収されたペプチド１０７−１２５（Ｋ）ＤＭＣＶＡＧＡＩＱＮＦＴＳＱＬＧＨＦＲ（Ｈ）（配列番号３５）の質量に対応する２１５２，６０８６（２１５２，００６８理論上）Ｄａのモノアイソトピック質量は、アスパラギン１１６がグリコシル化されないことを表わしている。これらのゲル分析及び質量分析データは、合わさって、ＣＥＬＩタンパク質の有意な画分が回収可能であること、及びタンパク質がN. benthamiana植物内で正しく処理されたことを表わしている。

その後の実験のために、ｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９を用いて６−Ｈｉｓでタグ付けされたＣＥＬＩ酵素を産生した。このクローンを転写し、N. benthamiana植物上に接種し、これを感染から８日後に収獲した。植物材料を、２体積の抽出緩衝液（５００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａＰｉ、２５ｍＭのトリスｐＨ８．０、７ｍＭのベータ−メルカプトエタノール、２ｍＭのＰＭＳＭと組合せ、真空浸透させた。緩衝液浸透の後、組織を搾汁装置内で浸漬させ、結果として得た緑色の汁を４％ｗ／ｖのポリエチレングリコールに対し調整し、１時間４℃に放置した。緑色汁を２０分間低速（３５００×ｇ）での遠心分離により清澄させるか、又はパーライト（２％ｗ／ｖ）と組合せ１．２μｍのフィルタを通してろ過した。金属アフィニティクロマトグラフィにより清澄済みの緑色汁からタグ付けされたＣＥＬＩを選択的に精製することができる。緑色汁をニッケル−ＮＴＡ樹脂と組合わせＣＥＬＩのパッチ結合を実施するか；又はカラムフォーマットで精製を実施し、ここで緑色汁がニッケル−ＮＴＡ樹脂の床を通して流れることができるようにした。結合のため、清澄済み緑色汁を１０％ｗ／ｖのグリセロール及び１０ｍＭイミダゾールに対し調整した。結合の後、樹脂を洗浄緩衝液（３３０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのイミダゾール）で徹底的に洗浄し、結合したＣＥＬＩ酵素を、４００ｍＭのイミダゾールを含有する１×リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の２樹脂床体積内でニッケル−ＮＴＡ樹脂から溶出させた。ＣＥＬＩ調製物をその後、１×ＰＢＳに対し透析して、イミダゾールを除去し、活性について検定し、使用までグリセロールを伴って又は伴わずに−２０℃で貯蔵した。

例２
ＣＥＬＩによるミスマッチＤＮＡ基質の分割
この例は、ＣＥＬＩ酵素の調製及びミスマッチＤＮＡ基質の分割におけるその使用について教示している。

ＣＥＬＩ酵素は、均質化、硫酸アンモニウムそして本明細書に参考として内含されているYang et al. (Biochemistry, 39: 3533-3541 (2000))によって記述されたコンカナバリンＡ−セファロースプロトコルを用いて、セロリの茎から調製された。１．５ｋｇの冷蔵セロリの茎の標本を搾汁装置を用いて均質化した。１リットルの汁を収集し、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．７に至るまで１００マイクロモルのフッ化フェニルメチルスルフォニル（ＰＭＳＦ）で調整し、２層のミラクロスを通してろ過した。氷上で攪拌しながら、２５％飽和に至るまで固体（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄をゆっくりと添加した。３０分後、４℃で１．５時間２７０００ｇで懸濁液を遠心分離に付した。上清を収集し、氷上で攪拌しながら固体（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で８０％飽和まで調整しその後２時間２７，０００ｇでの遠心分離に付した。緩衝液Ｂ（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、０．５ＭのＫＣｌ、１００マイクロモルのＰＭＳＦ）中にペレットを再懸濁させ、同じ緩衝液に対し透析させた。

コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）セファロースアフィニティクロマトグラフィを、まず第１に透析済み標本を穏やかに攪拌しながら一晩２ｍｌのＣｏｎＡ樹脂と共にインキュベートさせることによって実施した。ＣｏｎＡ樹脂を次に直径０．５ｃｍのカラム内に詰め込み、複数カラム体積の緩衝液Ｂで洗浄した。緩衝液Ｂ中の０．３Ｍのアルファーメチル−マンノシドを用いて、溶出を実施した。１ｍｌのアリコート中に、画分を収集した。本明細書に参考として内含されているOleykowski et al. (Nucleic Acid Research 26: 4597-4602 (1998))によって記述されている通り、４５℃で３０分間緩衝液Ｄ１２０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＫＣＬ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）中でミスマッチプローブと共に各画分０．１マイクロリットルをインキュベートすることによって、放射線標識付けしたミスマッチ基質上でミスマッチ分割活性について画分を検定した。反応産物を、７％の尿素を含有する１０％のＴＢＥ−ＰＡＧＥゲル上の分離とそれに続くオートラジオグラフィにより視覚化した。ミスマッチ分割活性をもつＣＥＬＩ画分のアリコートを−２０℃で凍結した状態で貯蔵した。その後、一連のＣＥＬＩ画分＃５の５倍希釈液を、放射線標識付けされたミスマッチ基質のミスマッチ分割について分析した。反応は、緩衝液Ｄ、New England BioLabs（ＮＥＢ）のＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、１ｍＭのＡＴＰ、２５マイクログラム／ｍｌのＢＳＡ）又はＧｉｂｃｏ／ＢＲＬＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰ、５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール−８０００）のいずれかの中で実施した。上述のとおりに、反応産物を視覚化した。緩衝液Ｄ中及びＮＥＢのＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の分割活性は、おおよそ同等であることがわかったが、一方ＰＥＧ含有Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬリガーゼ緩衝液内での分割は、その他の緩衝液に比べて５〜１０倍増強されていた。

ＣＥＬＩ活性の付加的な分析は、基質として２つの異なる線色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）由来の確定したヘテロ２本鎖ＤＮＡを用いて実施した。このＧＦＰヘテロ２本鎖基質は、センスストランド上のサイクル３ＧＦＰ（配列番号３０）及びアンチセンスストランド上の野生型ＧＦＰ（配列番号２９）に対応する１本鎖ＤＮＡをアニールすることによって調製した。１本鎖ＤＮＡを、非対称ＰＣＲによって合成し、アガロースゲル電気泳動によって単離させた。１×ＮＥＢ制限酵素緩衝液₂（１０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．９、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトール）の存在下で９０℃まで加熱し室温まで冷却することによりアニールした後、アガロースゲル電気泳動とそれに続くヘテロ２本鎖バンドの切除及びQiaquick ＤＮＡスピンカラムを用いた抽出により、ヘテロ２本鎖ＤＮＡを単離した。長さ１又は２ヌクレオチドの合計２８個のミスマッチがヘテロ２本鎖分子の長さ全体にわたって発生する。ミスマッチの分布は、１又は２個のヌクレオチドによって分離された複数のミスマッチの小さなクラスタからいずれかの側で３０以上の塩基対によって分離されたミスマッチまでに至る。

一連の１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中のＣＥＬＩの３倍希釈液を調製し、各々の１マイクロリットルのアリコートを、各々０．５マイクログラムのスーパーコイルプラスミド調製物又は１００ナノグラムのサイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ２本鎖のいずれかを基質として含有する２つの別々の一連の１０マイクロリットル反応中でインキュベートした。全ての反応は、１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液内で起こった。反応を３０分間４５℃でインキュベートし、臭化エチジウムの存在下で１．５％のＴＢＥ−アガロースゲル上で走行させた。

増大する量のＣＥＬＩでのスーパーコイルプラスミド調製物の処理の結果、スーパーコイルＤＮＡはまずニックされた環状分子に、次に線状分子に、そして次にランダムサイズのより小さなＤＮＡフラグメントに転換された。ＣＥＬＩ調製物でミスマッチしたＧＦＰ基質を処理した結果、全長ヘテロ２本鎖は、ミスマッチクラスタの近辺で相対するＤＮＡストランド上の分割を表わしている確率の高いはしご状のＤＮＡバンドへと消化された。さらなる消化の結果、ＣＥＬＩ調製物によるヘテロ２本鎖ＤＮＡの限界消化物を表わし得るより小さなＤＮＡへとミスマッチしたＧＦＰ基質が転換された。

例３
ＧＲＡＭＭＲ反応におけるクローニングされたＣＥＬＩの使用
この例は、結果に顕著な変化無く、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合においてセロリから精製した未変性ＣＥＬＩ酵素の代りにクローニングされた供給源からのＣＥＬＩを使用できるということを教示している。

ＣＥＬＩのｃＤＮＡは、セロリのＲＮＡからクローニングされた。遺伝子を、ＴＭＶウイルスベクター内に挿入し発現させた。Nicotiana benthamiana植物を感染させるために、構成体の写しを使用した。感染した組織を収獲し、ＣＥＬＩ酵素を精製した。精製した酵素を用いて得たＧＲＡＭＭＲ反応の結果を、セロリから精製したＣＥＬＩを用いたものと比較し、類似していることがわかった。

１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、０．２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ及び１．０マイクロリットルのセロリから精製したＣＥＬＩ（例２に記述されている画分５）又はクローニングされた供給源から精製した０．３マイクロリットルのＣＥＬＩのいずれかを含む１０マイクロリットル中の、例３に記述されている通りの環状２本鎖ヘテロ２本鎖ＧＦＰプラスミド基質２１ナノグラムを用いて、反応を開始した。３０分後に、各反応の１マイクロリットルのアリコートを、コンピテントＤＨ５−アルファE. coliに形質転換し、次にこれをＬＢａｍｐ平板上に固定した。コロニーを取上げ培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰ分析により検査し、その後ＧＦＰ遺伝子配列の配列分析を行なった。ＲＦＬＰの結果は、制限部位の再集合すなわちＧＲＡＭＭＲがセロリ由来のＣＥＬＩならびにクローニングされたＣＥＬＩ含有反応の両方において発生したということを示していた。ＤＮＡ配列分析がこれらの結果を確認した。従って、データは、ＧＲＡＭＭＲについてはクローニングされた供給源からのＣＥＬＩをセロリからのＣＥＬＩの代りに使用することができるということを示している。さらに、データは、それが、セロリからＣＥＬＩを抽出する上で用いられる精製段階の結果としての偶然一致した結果ではなくむしろ、ＧＲＡＭＭＲ反応の一部であるＣＥＬＩ活性であるということを実証している。

例４
ＲＥＳＩエンドヌクレアーゼのクローニング、発現及び使用
この例は、Selaginella lepidophyllaからのｃＤＮＡライブラリの構築、エンドヌクレアーゼをコードするライブラリからの核酸配列の同定、及び本明細書で「ＲＥＳＩ」と呼称されている新しいエンドヌクレアーゼの発現について教示する。標準的な方法を用いて調製されたオリゴ−ｄＴでプライミングされたｃＤＮＡ及びTrizol方法を用いて、テマリカタヒバSelaginella lepidophyllaの組織からＲＮＡを抽出した。結果として得たｃＤＮＡをＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)ベースのクローニングベクター内に連結させ、連結産物をコンピテントE. coli 細胞へと形質転換させた。ＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)ｃＤＮＡクローンを含む細菌コロニーを無作為に取り上げ、ＤＮＡの調製及びクローニングされたｃＤＮＡ配列の決定の前に液体培養として成長させた。クローニングされたSelaginella ｃＤＮＡについての配列ファイルをデータベース内にロードし、その後ＣＥＬＩ遺伝子のＤＮＡ配列と類似性をもつ配列についてＢＬＡＳＴ分析により探索した。ＢＬＡＳＴ分析を同様に、その他の種から得たｃＤＮＡの配列を含有するその他のＤＮＡ配列データベース上でも実施した。

セロリのＣＥＬＩ配列に対し一定レベルの相同性を示したＢＬＡＳＴヒットを、複数の種からのライブラリ内で同定し、対応するＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)−ｃＤＮＡクローンを単一のＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)−ｃＤＮＡクローンセット内に再配置させた。このｃＤＮＡクローンセットを次にin vitroで転写させて感染性ＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)写しを生成し、これらの写しを次に、GENEWARE(登録商標)ｃウイルスゲノム内部でコードされたｃＤＮＡ配列の発現分析のため、Nicotiana benthamiana植物上の葉の上に接種した。接種後７日目に、感染した植物から葉の標本を取り上げ、２体積の水の中で均質化させた。その後、抽出物をスーパーコイルＤＮＡのニッキング及び分割活性について検定した。

スーパーコイルＤＮＡの各々のニッキング検定は、合計体積１０マイクロリットルで１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中のｐＵＣ１９−誘導体のスーパーコイルプラスミド調製物０．５マイクログラムを含有する反応の中で実施された。反応に添加された植物抽出物の量は、１マイクロリットル、０．３３マイクロリットル又は０．０１１マイクロリットルであり、これを３０分間３７℃でインキュベートさせ、Gelstar蛍光ＤＮＡ染色試薬の存在下で１％のＴＡＥ−アガロースゲル上で走行させた。感染を受けていない植物抽出物内では、ニッキング活性はほとんど又は全く検出されず、一方Selaginella lepidophyllaからの単一の遺伝子のためのｃＤＮＡを含むＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)構成体での感染を受けた植物からの抽出物のみが、プラスミドＤＮＡ基質に対するかなりの量の活性を示した。

これらのクローンの完全な遺伝子配列を決定し、読取り枠からあらゆる非コーディング５′及び３′配列を差引いたものを増幅させ、６ヒスチジンテールをコードされたタンパク質のＣ末端に付加するようにＰＣＲプライマを設計した。その後、活性全長Selaginellaクローンの１つからＯＲＦを増幅するためにプライマを使用した。その後、結果として得られたＰＣＲ産物を、in plantaでの発現のためＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)ベクターｐＤＮ４内に、ＰａｃＩとＡｖｒＩＩ部位の間でクローニングした。ＲＥＳＩＯＲＦ（配列番号１６）を含有しＲＥＳＩタンパク質（配列番号３４）をコードする結果としてのクローンｐＬＳＢ２２２５を配列決定して、遺伝子が適正に挿入されたことを確認し、次にin vitroで転写した後N. benthamiana植物上に感染性写しを接種した。接種後７日目に、上述の通り被感染植物抽出物を作り、クローニングされた酵素の活性を確認するべくスーパーコイルＤＮＡニッキング及び消化活性について検定した。

スーパーコイルＤＮＡの各々のニッキング検定は、合計体積１０マイクロリットルで５０ｍＭのＫＣｌの存在下で１×ＮＥＢ E. coli ＤＮＡリガーゼ緩衝液中のｐＵＣ１９−誘導体のスーパーコイルプラスミド調製物０．５マイクログラムを含有する反応の中で実施された。反応に添加された植物抽出物の量は、０．２マイクロリットル、０．０４マイクロリットル、０．００８マイクロリットル又は０．００１６マイクロリットルであり、これを３０分間３７℃でインキュベートさせ、Gelstar蛍光ＤＮＡ染色試薬の存在下で０．８％のＴＡＥ−アガロースゲル上で走行させた。感染を受けていない植物抽出物内では、ニッキング活性はほとんど又は全く検出されず、一方ＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)−Selaginella構成体ｐＬＳＢ２２２５での感染を受けた植物からの抽出物は、プラスミドＤＮＡ基質に対するかなりの量の活性を示した。

この検定中で陽性の結果を得た後、ＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)産生ＣＥＬＩ酵素の代りにミスマッチ解消反応の一成分として作動するこの酵素の能力をテストするために、ＧＲＡＭＭＲ反応において、ｐＬＳＢ２２２５感染植物の抽出物を用いた。

例５
ＧＲＡＭＭＲ反応におけるＲＥＳＩの使用
この例は、結果に顕著な変化無く、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合においてセロリから精製した未変性ＣＥＬＩ酵素の代りにＲＥＳＩを使用できるということを教示している。

ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）によりコードされるｐＢＳ誘導体（Stratagene, La Jalla, CA）内の野生型Aequorea Victoria ＧＦＰ遺伝子（Prasher, et al., Gene 111 (92) 229）と突然変異を伴う変異体の間でＧＲＡＭＭＲを実施して、E. coli内の蛍光強度を増大させ発光波長を青色光発光に改変した（Crameri, et al., Nat Biotechnol 14 (96) 315; Heim et al., PNAS91 (94) 12501; Yang, et al., J Biol Chem 273 (98) 8212）。図５に示されているように（配列番号３２）プラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰによりコードされたこの変異体遺伝子（配列番号３３）は、長波ＵＶ光により励起された時点で明るい青色光を発する蛍光タンパク質をコードする。

ＧＦＰ／ｃ３ＢＦｐヘテロ２本鎖上で、環状の２本鎖プラスミドＤＮＡの状況下でＧＲＡＭＭＲ反応を実施した。まず最初にそれぞれＫｐｎＩ及びＮｇｏＭＩＶでの消化によりｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）及びｐＢＳＣ３ＢＦＰ（図５、配列番号３２）を線状化させ、次にＤＮＡスピンカラムを用いて消化済みＤＮＡを精製することによって、環状の全プラスミドヘテロ２本鎖ＤＮＡ基質を調製した。次に、２つの線状化されたプラスミドを各々２００ナノグラムずつ混合し、２０マイクロリットルの体積で１×ＳＳＰＥ（１８０ｎＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）までもっていった。その後、混合物を４分間９５℃でインキュベートし、氷水の中に浸し、そこで１０分間置いてから３７℃でインキュベートした。３０分後に、アニールしたＤＮＡ標本を氷に戻し、ＧＲＡＭＭＲ反応内での使用までそれを保持した。

独立した２つの一連のシャッフリング反応を実施して、ＧＲＡＭＭＲによる配列シャッフリングを容易にするその能力に関してＲＥＳＩとＣＥＬＩを比較した。各々のＧＲＡＭＭＲ反応は、１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、２単位のE. coli ＤＮＡリガーゼ及び各ｄＮＴＰを５ナノモルずつを、５０ｍＭになるまでＫＣｌで補足された１×ＮＥＢ E. coliリガーゼ緩衝液内に含有していた。上述のカクテルのアリコートを含む２つの一連の試験管の各々に対して、１／３、１／９、１／２７、１／８１又は１／２４３の希釈度でＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)で発現されたＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ抽出物の１マイクロリットルのアリコートを添加した。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応も同様に調製した。各々の反応に対して、アニールされたＤＮＡヘテロ２本鎖基質２０ナノグラムを含有する１マイクロリットルのアリコートを添加し、反応を室温で１時間そして氷上で３０分間インキュベートしてから、コンピテントE. coli内に形質転換させた。

長波ＵＶ照射により、結果として得たコロニーの中で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を視覚化することができた。親野生型ＧＦＰは、薄暗い緑色蛍光を有し、親ｃ３ＢＦＰは明るい青色蛍光を与えた。これらの蛍光タンパク質をコードする遺伝子においては、発光色を決定する配列及び蛍光強度を支配する配列は、互いに異なる位置にある。ＤＮＡシャッフリングの結果、蛍光強度を支配する配列から発光色を決定する配列の「リンキング解除」がもたらされる。従って、結果としての後代は、発光色及び強度の機能的特性の再集合を示すことが予想されることになる。従って、各反応において起こったＤＮＡシャッフリングの範囲の尺度は、対応する平板上の細菌コロニーからの蛍光の強度及び色を検討することによって評定できた。ゼロ−ヌクレアーゼ対照においては、薄暗い緑色と明るい青色のコロニーのみが観察された。しかしながら、ＣＥＬＩ又はＲＥＳＩのいずれかを含む反応からのＤＮＡで形質転換された細胞を伴う平板上では、幾つかの明るい緑色ならびにいくつかの薄暗い青色コロニーが観察され、ＤＮＡ配列のシャッフリングが起こったことを表わしていた。ＤＮＡ配列分析は、これがまさに該当していること、そして平均してシャッフリングされたクローンの回収がＣＥＬＩ及びＲＥＳＩの両方について８５％を超えたことそして情報転送事象の数及び分布が両方の酵素について類似であることを確認した。しかしながら、この実験におけるＲＥＳＩの活性は、さらに高濃度のＲＥＳＩの調製物で処理された反応の形質転換効率が低いことによって表わされているように、ＣＥＬＩの活性よりも数倍高いように思われた。

例６
ミスマッチ解消カクテルでの全長ＧＦＰ遺伝子の保存
この例は、全長ＧＦＰ遺伝子を保存するさまざまなミスマッチ解消カクテルを教示する。

ミスマッチＧＦＰ基質を、共に合成ミスマッチ解消系を構成する酵素カクテルの存在下で、さまざまな濃度のＣＥＬＩで処理した。使用された酵素は、ＣＥＬＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡリガーゼであった。ＣＥＬＩ活性は、ミスマッチ塩基のヘテロ２本鎖３′をニックするはずである。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、ニックされたヘテロ２本鎖からのミスマッチ塩基の切除のための３′−５′プルーフリーディング活性を含んでいる。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ギヤップを満たす能力をもつＤＮＡポリメラーゼを含んでいる。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、修復された分子内のニックをシールする。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは同様に、５′フラップ−アーゼ活性をも有している。

ＧＦＰヘテロ２本鎖基板内のミスマッチを解消するのに役立つことになる反応条件を同定するために、マトリクス実験を実施した。１つの実験においては、８つの異なる濃度での（上述の）ＣＥＬＩ画分Ｎｏ．５の階段希釈を用いて、マトリクスフォーマットで、サイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ２本鎖をインキュベートした。各反応は、１０マイクロリットルの反応体積中、各２５０マイクロモルのｄＮＴＰ及び１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液内の０．２マイクロリットルのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）及び１００ナノグラムのヘテロ２本鎖基質を含んでいた。全体として、マトリクスは９６の個々の反応を含んでいた。１つのフルセットの反応を３０分間室温でインキュベートする一方で、もう１つのフルセットを３０分間３７℃でインキュベートした。

インキュベーション後、各反応からＧＦＰ遺伝子を増幅するためにＰＣＲを使用した。その後、各ＰＣＲからのアリコートをＨｉｎｄＩＩＩ及びＨｐａＩで消化し、臭化エチジウムを用いて３％のアガロースゲル上で電気泳動した。サイクル３ＧＦＰのみがＨｉｎｄＩＩＩ部位を有し、野生型のみがＨｐａＩ部位をコードする。

ＤＮＡミスマッチ解消がＨｉｎｄＩＩＩ又はＨｐａＩのいずれかのミスマッチ部位で起こった場合には、ＰＣＲ産物の一定の割合が両方の部位を含むものと予想され、新規のバンドを生成することになる。このバンドは、ＣＥＬＩもＴ４ＤＮＡポリメラーゼもＴａｑＤＮＡポリメラーゼももたない負の対照標本を含めた全ての標本内で観察された。結果は、バックグラウンド組換えの基底レベルがＧＲＡＭＭＲ反応内以外の実験内の或る時点つまり考えられるものとしてはＰＣＲ段階において起こっていた可能性がある、ということを示唆していた。ＰＣＲを媒介とする組換えは、増幅中に関連する配列間で或る頻度で発生するものとして知られている（Paabo, et al., J Biol Chem 265 (90) 4718-4721）。

もう１つの実験では、２００ナノグラムのサイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ２本鎖を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（０．２単位：ＧｉｂｃｏＢＲＬ）の存在下又は不在下で２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼと共にさまざまな濃度のＣＥＬＩ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した。各反応は、２０マイクロリットルの最終体積で０．０５ｍＭの各ｄＮＴＰと共に１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液を含んでいた。３７℃で３０分間、反応をインキュベートし、臭化エチジウムの存在下で２％のＴＢＥ−アガロースゲル上に１０マイクロリットルを走行させた。結果は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、ただしＴ４ＤＮＡポリメラーゼの不在下で、増大する量のＣＥＬＩがヘテロ２本鎖ＤＮＡのより大幅な分解をひき起こしたが、この効果は反応中のＴ４ＤＮＡの量を増大させることによって対抗可能であるということを示した。これらの結果は、完全な反応のさまざまな構成要素が一緒に作用してＤＮＡミスマッチ解消を通して全長遺伝子の無欠性を保存できるということを示していた。

これらの結果に基づいて拡張しこの合成系のためのＤＮＡミスマッチ解消のための付加的な条件を同定するため、もう１つのマトリクス実験を実施した。１０マイクロリットルの反応体積で各ｄＮＴＰを０．５ｍＭずつ含む１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の０．２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの存在下で、さまざまな濃度のＣＥＬＩ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼで、６０ナノグラムのサイクル３／野生型ＧＦＰヘテロ２本鎖を処理した。２０℃、３０℃、３７℃又は４５℃で１時間、各反応セットをインキュベートした。その後、全ての反応を、臭化エチジウムの存在下で１．５％のＴＢＥ−アガロースゲル上に走行させた。結果は、ＧＦＰヘテロ２本鎖がＣＥＬＩ調製物単独により離散的フラグメントへと分割される、ということを示した。ＤＮＡミスマッチ解消の成功は、ＣＥＬＩの存在下でミスマッチ解消系のその他の成分によりＧＦＰ配列の見かけの全長無欠性が維持される度合により、当初評価された。この検定内の全長分子として高い割合のＤＮＡを保存する酵素濃度及び温度の条件を、同定した。すなわち、実験内で一定に保たれたその他の反応成分の存在下での１マイクロリットル（１単位）のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを伴う、１マイクロリットルのＣＥＬ１画分５調製（例２に記述されたもの）。反応温度が上昇するにつれて、ＣＥＬＩの分解活性もそれに従って増大することがわかった。その上、修復反応のその他の成分は２０℃３０℃及び３７℃で全長ＤＮＡの無欠性を保つべく作用するものの、４５℃では全長ＤＮＡを保存する上で著しく効率が低いということが示された。これらの結果から、我々は、これらの実験条件下で、４５℃でのインキュベーションがＧＲＡＭＭＲプロセスにとって最適でなかったこと、そして２０℃、３０℃及び３７℃でのインキュベーションが許容可能であること、という結論を下した。

例７
ＤＮＡミスマッチ解消（ＧＲＡＭＭＲ）後のＧＦＰヘテロ２本鎖ＤＮＡへの制限部位の回復

この実験は、制限部位の回復を実証することにより、ＤＮＡミスマッチ解消（ＧＲＡＭＭＲ）による遺伝的再集合の実現可能性を教示している。

以上に記した最適な条件（１×の反応は、１０マイクロリットルの反応体積で各ｄＮＴＰを各々０．５ｍＭ含む１×ＮＥＢＴ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液中の０．２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ及び２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの存在下で１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、（例２に記されている）１マイクロリットルのＣＥＬＩ画分５、６０ナノグラムのヘテロ２本鎖ＤＮＡを含んでいた）を用いて、１時間３７℃で実施されたＧＲＡＭＭＲ反応の２０倍の拡大の全長産物を、ゲル単離させ、ＧＦＰヘテロ２本鎖内のミスマッチと重複する認識部位をもつエンドヌクレアーゼにより制限分析に付し、かくして制限酵素分割に対する耐性をＤＮＡ内のこれらの部位に付与した。使用した酵素は、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｐａＩ及びＸｈｏＩであった。負の対照は、未処理のＧＦＰヘテロ２本鎖で構成されていた。正の対照は、個別に、サイクル３又は野生型ＧＦＰ配列で構成されていた。全ての対照は、ＤＮＡミスマッチ解消反応の産物と同じ酵素で消化された。全ての標本を、臭化エチジウムの存在下で２％のＴＢＥ−アガロースゲル上を走行させた。

ミスマッチ解消カクテルでの処理後、一定の割合のＤＮＡがＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼに対する感応性を獲得し、ＤＮＡミスマッチ解消が発生したことを示した。負の対照内で低レベルの分割が発生したことから、ＨｐａＩ−カット標本を解釈することはできなかった。ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位は、ＧＲＡＭＭＲ処理された標本内で異なる分割度を示した。ＸｈｏＩ部位の回復は、それ自体ＨｉｎｄＩＩＩ部位における回復よりもさらに大規模であるＢａｍＨＩ部位のものよりもさらに大規模であった。

分割が発生する程度は、ＤＮＡ内のミスマッチがその部位で解消された程度を表わす。ミスマッチ解消効率の差は、これらの部位に存在するミスマッチの性質又は密度に関係する可能性がある。例えば、ＸｈｏＩ部位は、３ミスマッチクラスタにわたり、一方、ＢａｍＨＩ部位は、２つのミスマッチにわたり、ＨｉｎｄＩＩＩ部位は単一のミスマッチにわたる。

例８
ＧＲＡＭＭＲ処理されたＧＦＰ遺伝子
この例は、ＧＲＡＭＭＲがヘテロ２本鎖内の２つの遺伝子配列間の配列変動を再集合できること及び、直接クローニングされたか又はクローニングの前にＰＣＲ増幅されたＧＲＡＭＭＲ産物の有意な差異は全く存在しないこと、を実証している。

例７のＧＲＡＭＭＲ処理されたＤＮＡ分子は、その後、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Invitrogen）内に連結によって直接クローニングされるか、又はＰＣＲ増幅されメーカーの指示に従ってｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ内に連結され、その後E. coli内へと形質転換された。個々のコロニーを採取し液体培地内で成長させた後、ＤＮＡを調製し、ＧＦＰインサートの配列を決定した。負の対照として、未処理のＧＦＰヘテロ２本鎖基質を直接クローニングさせるか、又はプラスミド内へのクローニングに先立ちＰＣＲ増幅させた。

ＧＲＡＭＭＲでは、１本のストランドからもう１本のストランドへの情報転送プロセスから、配列情報の再集合が結果としてもたらされる。これらの情報転送部位は、組換えベースのＤＮＡシャッフリング方法において発生する交差事象と類似している。しかしながら、これらの再集合実験の結果を関係づけする目的で、ＧＲＡＭＭＲ出力配列は、交差に関連して記述される。ＧＲＡＭＭＲで処理されたＧＦＰ遺伝子から誘導された２０の全長ＧＦＰクローンの配列を分析した。これらのクローンのうちの４つは、ＧＲＡＭＭＲ反応（ＰＣＲ増幅無し）の後にｐＺｅｒｏＢｌｕｎｔ（Invitrogen）内に直接クローニングされたＤＮＡから誘導された。その他の１６の配列は、ＰＣＲ増幅の後にクローニングされた。これらの全長ＧＦＰ配列の分析は、２０の配列全てが、遺伝子１つあたり１〜１０個の間の交差をもつ配列再集合を受けたということを明らかにした。合計９９の交差がこの遺伝子セット内に見い出され、１遺伝子あたり平均約５個の交差を与えた。第１のミスマッチと第２のミスマッチ間の約５９０個のヌクレオチドという距離で、１２０の塩基対あたりおおよそ１つの交差という全体的頻度が計算された。この２０クローンのセット内で、ＰＣＲプライマ配列間にある配列内部で合計７つの点突然変異が発生し、おおよそ０．０５％の突然変異頻度を生み出した。

ＧＲＡＭＭＲ反応を受けなかった３５のクローンが配列決定された。これらの対照のうち、１４個が直接的クローニングから誘導され、２１がテンプレートとしてＧＦＰヘテロ２本鎖を用いたＰＣＲ増幅の後に得られた。これらの３５のＧＲＡＭＭＲ処理されていない対照クローンのうち、８個が組換え体であり、１〜３の交差範囲にわたり、大部分が単一の交差事象であった。ＰＣＲプライマ間にある配列内で合計２５の点突然変異が発生し、およそ０．１％の突然変異頻度を生み出した。

直接クローニングされたか又はＰＣＲ増幅されたＧＲＡＭＭＲ処理済み産物の間には、いかなる有意な差異も観察されなかった。しかしながら特にＧＲＡＭＭＲ処理されていない対照においては、組換え体の頻度は、直接クローニングされたＤＮＡ内よりもＰＣＲ増幅されたＤＮＡ内でさらに高い。このより高い頻度は、或る一定の組換えレベルが「ジャンピングＰＣＲ」によってひき起こされることがわかっているその他のものによって得られた結果と一貫性あるものである（Paabo, et al.,「ＤＮＡ損傷が、酵素増幅中のテンプレート間のジャンピングを促進する」. J. Biol Chem 265 (90) 4718-4721）。

例９
ＧＦＰプラスミドのＤＮＡミスマッチ解消によるプラスミドオンプラスミド遺伝的再集合（ＰＯＰＧＲＡＭＭＲ）のためのヘテロ２本鎖基質の調製

この例は、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合のためのヘテロ２本鎖基質が無傷の環状プラスミドの形をとりうるということを教示している。サイクル３−ＧＦＰ及び野生型ＧＦＰヘテロ２本鎖分子を、プラスミドオンプラスミド（ポリペプチド）フォーマットで調製した。このフォーマットでは、環状２本鎖プラスミドベクターバックボーンという状況の中でＧＦＰ配列を再集合した。こうして、ＧＲＡＭＭＲ反応のアリコートを用いてE. coliの直接的形質転換による再集合された産物の回収が可能となる。その結果、再集合されたクローンを得るために、ＧＲＡＭＭＲ処理されたＤＮＡのＰＣＲ増幅もその他の付加的な操作も不要であった。

野生型ＧＦＰ（配列番号２９）及びサイクル３ＧＦＰ（配列番号３０）を含むＰＯＰ−ＧＲＡＭＭＲ反応のためのミスマッチＤＮＡ基質を生成し、それぞれ２つのｐBluescriptベースのプラスミドｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）及びｐＢＳＣ３ＧＦＰ（配列番号１７）を結果としてもたらした。野生型及びサイクル３ＧＦＰが互いに異なっている部位において２つのプラスミド間の唯一の配列差が発生するような形で、ｐBluescriptポリリンカーのＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ部位の間にＧＦＰを挿入した。ＳａｐＩでのプラスミドバックボーンの消化により両方のプラスミドを線状化し、ＤＮＡスピン−カラムを用いて浄化し、混合し、１×ＰＣＲ緩衝液（Barnes, 1994; ＰＮＡＳ, 91, 2216-2220）まで補正し、３分間沸とう水浴の中で加熱し、未変性ＤＮＡストランドをアニールすべく室温までゆっくりと冷却した。これらのＤＮＡを変性しアニールすることにより、２重鎖の混合、親２重鎖の再形成及び２つの入力プラスミドの各々からのストランドのアニーリングからのヘテロ２本鎖の形成が導かれた。親２重鎖は、ＧＲＡＭＭＲにとって望ましくないものとみなされ、いずれか一方の親２重鎖に切り込むもののヘテロ２本鎖化された分子には切り込まない制限酵素での消化により除去された。ＰｍｌＩが野生型ＧＦＰ配列にのみ切り込みＸｈｏＩがサイクル３ＧＦＰのみを切ることから、この作業のためには、ＰｍｌＩ及びＸｈｏＩが選択された。これらの酵素での処理の後、産物をアガロースゲル上で解消させた。全長未切断ヘテロ２本鎖分子をアガロースゲル内のＰｍｌＩ及びＸｈｏＩで切断された親ホモ２本鎖から解消させ、バンドの切除及びＤＮＡスピンカラムでの精製により精製した。

結果として得られたヘテロ２本鎖分子集団をＤＮＡリガーゼで処理して、線状ＤＮＡを環状２本鎖ＤＮＡヘテロ２本鎖へと転換した。アガロースゲルシフト分析による確認の後、ＧＲＡＭＭＲ反応のための基質として、環状２本鎖ＧＦＰヘテロ２本鎖プラスミドを使用した。結果として得られたクローンの例が、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８として内含されている。

例１０
ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合のための反応パラメータ例
ＣＥＬＩ及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼ濃度の比較
ＧＲＡＭＭＲ反応には、数多くの酵素活性の相互作用が関与している。ＣＥＬＩ濃度、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ濃度、反応温度、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのＴ７ＤＮＡポリメラーゼによる置換、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの存在、及びＣＥＬＩ酵素の供給源といったようなＧＲＡＭＭＲ反応に付随する複数のパラメータが検討された。In vitro ＤＮＡミスマッチ解消反応の限界を検討するために、３つの異なるＣＥＬＩ濃度対２つのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ濃度のマトリクスが構成された。

例９に記述されたように調製された環状２本鎖のヘテロ２本鎖化されたプラスミド２１ナノグラム（２１ｎｇ）を、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、１．０単位のＴａｑポリメラーゼ、０．２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１．０又は０．２単位のＴ４ポリメラーゼ、０．３、０．１又は０．０３マイクロリットルのＣＥＬＩ調製物（例２に記述された画分５）を含む、一連の１０マイクロリットル反応内で、基質として使用した。３つのＣＥＬＩ濃度との２つのＴ４ポリメラーゼ濃度の全６つの組合せを表わす６つの反応を調製し、５マイクロリットルの等価のセットに分け、２０℃又は３７℃のいずれかでインキュベートした。その他の反応成分と共に０．２単位のＴ４ポリメラーゼを含みＣＥＬＩを全く含まない対照反応を調製し、３７℃でインキュベートした。３０分後、各反応の１マイクロリットルのアリコートをコンピテントＤＨ５−アルファE. coli内に形質転換し、これを次にＬＢａｍｐ平板上に固定した。コロニーを採取し培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、制限フラグメント長多形現象分析（ＲＦＬＰ）とそれに続くＧＦＰ遺伝子配列の配列分析によって検査した。ＲＦＬＰ分析は、野生型及びサイクル３ＧＦＰ遺伝子の間の複数の制限酵素認識部位に基づいていた。ＲＦＬＰ結果は、ＣＥＬＩ／Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ／温度マトリクス全体を通して、制限部位の再集合すなわちＧＲＡＭＭＲが起こったこと、及びゼロＣＥＬＩ対照クローン内ではかかる再集合が全く起こらなかったことを示していた。ＤＮＡ配列分析は、再集合がＣＥＬＩ含有標本全ての中で発生したことを確認した。配列決定は同様に、恐らくはE. coli内の修復又はランダム突然変異のいずれかの結果として１つの遺伝子配列からもう１つの遺伝子配列への単一塩基変更を有していた１６の対照クローンのうちの単一のクローンを除いて、ゼロ−ＣＥＬＩ対照が再集合されていないことを確認した。複数のＧＲＡＭＭＲ−出力ＧＦＰクローン例の配列が示され、これらは全て、３７℃でインキュベートされた１．０単位のＴ４ポリメラーゼ及び０．３マイクロリットルのＣＥＬＩ調製物を含む反応に由来していた。親野生型及びサイクル３ＧＦＰ遺伝子が、参考としてまず示されている。

例１１
ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合のためにＴａｑポリメラーゼは必要とされない

この実験は、ＴａｑポリメラーゼがＧＲＡＭＭＲの機能に全くとは言わないまでも劇的には貢献も干渉もしないということを教示している。Ｔａｑポリメラーゼは、５′フラップ−アーゼ活性を有するものとして報告されており、ＧＲＡＭＭＲ反応を受けるヘテロ２本鎖化されたＤＮＡ内で望ましくない５′フラップ−アーゼ活性を有するものとして報告されており、ＧＲＡＭＭＲ反応を受けるヘテロ２本鎖化されたＤＮＡ内で望ましくない５′フラップが形成され存続する可能性に対する予防策として以上の例の教示の中に含まれてきた。

ＧＲＡＭＭＲ反応は、例１０にあるように、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、１．０単位のＴ４ポリメラーゼ、１．０マイクロリットルのＣＥＬＩ調製物（例２に記述された画分５）及び０．２単位、０．５単位のＴａｑポリメラーゼを含有するか又はＴａｑポリメラーゼを全く含まない１０マイクロリットルの反応の中で、２１ナノグラムの環状２本鎖のヘテロ２本鎖化されたＧＦＰプラスミド基質を用いて構成された。３０分後、各反応の１マイクロリットルのアリコートをコンピテントＤＨ５−アルファE. coli内に形質転換し、これを次にＬＢａｍｐ平板上に固定した。コロニーを採取し培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰ分析によって検査した。ＲＦＬＰ結果は、制限部位の再集合、すなわちＧＲＡＭＭＲが、ＧＲＡＭＭＲ反応内でＴａｑポリメラーゼの存在下及び不在下の両方で発生したことを示した。ＤＮＡ配列分析がこれらの結果を確認した。従って、データは、ＴａｑポリメラーゼがＧＲＡＭＭＲにとって不要であったことを示している。

例１２
ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合のための代替的プルーフリーディングポリメラーゼ

この実験は、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合がＴ４ポリメラーゼの使用に制限されないことそしてその代わりに代替的ポリメラーゼを使用できることを教示している。

反応は、例１０にあるように、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、１０又は２単位のＴ７ポリメラーゼ、１．０マイクロリットルのＣＥＬＩ調製物（例２に記述された画分５）及び２．５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する１０マイクロリットルの反応の中で、２１ナノグラムの環状２本鎖のヘテロ２本鎖化されたＧＦＰプラスミド基質を用いて、開始された。３０分後、各反応の１マイクロリットルのアリコートをコンピテントＤＨ５−アルファE. coli内に形質転換し、これを次にＬＢａｍｐ平板上に固定した。コロニーを採取し培養した。プラスミドＤＮＡを抽出し、ＲＦＬＰ分析とそれに続くＧＦＰ遺伝子配列の配列分析によって検査した。ＲＦＬＰ結果は、制限部位の再集合、すなわちＧＲＡＭＭＲが、両方のＴ７ポリメラーゼ含有反応において発生したことを示した。ＤＮＡ配列分析がこれらの結果を確認した。従って、データは、Ｔ７ポリメラーゼが、ＧＲＡＭＭＲのためにＴ４ポリメラーゼに置換できることを示している。さらに、データは、個々の成分及び官能基を、ＧＲＡＭＭＲ内で広く置換させ、なおも類似の結果を得ることができる、ということを示している。

例１３
ウイルスベクター内のトバモウイルス３０Ｋ遺伝子の分子育種
以上の例では、きわめて相同性の高い（例えばｗｔＧＦＰ及びサイクル３ＧＦＰは９６％同一である）配列を再集合するために、ＤＮＡミスマッチ解消による遺伝的再集合が有用であることが教示されてきた。この例は、トバモウイルス運動タンパク質遺伝子をコードする遺伝子といったようなより一層多様性の高い核酸配列を再集合するためにＧＲＡＭＭＲを使用できるということを教示している。

約７５％同一である２つのトバモウイルス運動タンパク質ＣＭＰ＞遺伝子のヘテロ２本鎖が生成された。非対称ＰＣＲにより合成されたストランドの性質が相対する部分的に相補的な１本鎖ＤＮＡ（１本のストランドはタバコモザイクウイルスＵ１型菌株（ＴＭＶ−Ｕ１）由来の運動タンパク質遺伝子をコードし（配列番号９）、もう一方はトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）由来の運動タンパク質をコードする（配列番号１０））をアニールすることによって、ヘテロ２本鎖基質を調製した。２つの部分的に相補的な運動タンパク質遺伝子の配列を、その末端でのＤＮＡのアニーリングを促進しＰＣＲ増幅及びクローニングを容易にするために、絶対的相補性の３３個のヌクレオチドでフランキングした。アニーリング反応は、３３３ｍＭのＮａＣｌ、３３ｍＭのＭｇＣ１２、３．３ｍＭのジチオトレイトール、１６６ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７を含む１５０マイクロリットルの反応の中で各々の１本鎖ＤＮＡを２．５マイクログラムずつ混合し、９５℃で１分間インキュベートしその後室温までゆっくりと冷却することによって行なわれた。ＧＲＡＭＭＲは、１×ＮＥＢリガーゼ緩衝液、０．５ｍＭの各々のｄＮＴＰ、０．４単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、２．０単位のＴ４ポリメラーゼ及びＣＥＬＩを含む２０マイクロリットルの反応内でヘテロ２本鎖基質を５マイクロリットルインキュベートすることによって実施された。ＣＥＬＩは、クローニングされた調製物に由来するものであり、使用された量は、２マイクロリットルの調製物から変動し、５つの３倍段階希釈が続いた。ＣＥＬＩを全く含まない７番目の調製物を調製し、これが対照として用いられた。

室温で一時間置いた後、StrataprepスピンＤＮＡ精製カラム（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて反応からＤＮＡを精製し、２つの配列のフランキングプライマ結合部位に対しアニールするように設計されたプライマを用いたＰＣＲ反応のためのテンプレートとしてこれを使用した。各反応からのＰＣＲ産物をStrataprepカラムを用いて精製し、ＡｖｒＩＩ及びＰａｃＩで消化し、類似の要領で切断されたｐＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)−ＭＰ−Ａｖｒ−Ｐａｃの運動タンパク質スロット内に連結した。このプラスミドは、その他の運動タンパク質遺伝子によるその置換を可能にするべく運動タンパク質をフランキングするＡｖｒＩＩ及びＰａｃＩ部位で修飾された全長感染性トバモウイルス−ＧＦＰクローンを含有していた。ＤＨ５−アルファE. coliの形質転換及び平板固定の後、コロニーを採取し、培養を成長させ、ＤＮＡを抽出した。運動タンパク質インサートを両方向からＤＮＡ配列分析に付し、配列データは、ＧＲＡＭＭＲで処理された材料から誘導されたインサートの大部分において、再集合された配列がＴＭＶ−Ｕ１及びＴｏＭＶ運動タンパク質遺伝子配列の両方で構成されていることを確認した。複数のＧＲＡＭＭＲ出力ＭＰクローンのＤＮＡ配列は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５として示されている。

例１４
ＤＮＡミスマッチ解消によるプラスミドオンプラスミド遺伝的再集合（ＰＯＰＧＲＡＭＭＲ）を用いたウイルスベクター内での多様性の高いトバモウイルス３０Ｋ遺伝子の分子育種

例４は、ＧＲＡＭＭＲを用いたトバモウイルスの複数の多様性菌株（同一性約７５％、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＭＰ−Ａｖｒ−Ｐａｃベクター内にクローニング）からの運動タンパク質（ＭＰ）遺伝子のＭＥＡについて教示している。この例は、より一層多様性の高い種を再集合するためのプラスミドオンプラスミドＧＲＡＭＭＲ（ＰＯＰＧＲＡＭＭＲ）の使用について教示している。

トバモウイルスＴＭＶ−Ｃｇ（図６、配列番号１８）、ＴＭＶ−Ｏｂ（図７、配列番号１９）、ＴＭＶ−Ｕ₂（図８、配列番号２０）、ＴＭＶ−Ｕ₁（配列番号９）及びトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）（配列番号１０）由来の出発親ＭＰ遺伝子を使用した。ＳｍａＩでの消化により、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶＭＰのプラスミドを線状化した。ＴＭＶ−Ｃｇ、ＴＭＶ−Ｏｂ、ＴＭＶ−Ｕ２又はＴＭＶ−Ｕ１のいずれかに由来するＭＰ遺伝子を含むｐＧＥＮＥＷＡＲＥのプラスミドを、ＳｔｕＩで消化した。ＤＮＡスピンカラムを用いて、消化したｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＭＰ構成体を精製した。以下のヘテロ２本鎖対が生成された：

ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＣｇＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶＭＰ、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴＭＶ−ＯｂＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶＭＰ、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴＭＶ−Ｕ２ＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶＭＰ、ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴＭＶ−Ｕ１ＭＰとｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＴｏＭＶＭＰ。これらのＭＰ遺伝子配列のヘテロ２本鎖はそれぞれ４７％、５８％、６２％及び７５％の同一性を有する。ヘテロ２本鎖ＤＮＡは、２０マイクロリットルの体積で１×ＳＳＰＥ（１８０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）内で２つの線状化されたプラスミドの各々を２００ナノグラムずつ混合することによって生成された。混合物を４分間９５℃でインキュベートし、氷水中に浸漬し、３７℃でのインキュベーションに先立って１０分間ここにとどめた。３０分後、アニールされたＤＮＡ標本を次に氷に戻し、ここにＧＲＡＭＭＲ反応中での使用まで保持した。

各１０マイクロリットルのＧＲＡＭＭＲ反応は、５０ｍＭになるまでＫＣｌで補足された１×ＮＥＢ E. coli ＤＮＡリガーゼ緩衝液内で０．５ｍＭずつの各ｄＮＴＰ、２単位のE. coli ＤＮＡリガーゼ及び１単位のＴ４ポリメラーゼを含んでいた。次にＣＥＬＩの１マイクロリットルのアリコート（１／３、１／９、１／２７、１／８１、１／２４３、又は１／７２９希釈）を添加した。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応も調製した。各反応に対して、アニールされたＤＮＡヘテロ２本鎖基質２０ナノグラムを含む１マイクロリットルのアリコートを添加し、コンピテントE. coliへの形質転換の前に１時間室温でそして３０分間氷上でインキュベートした。

両方の方向からＤＮＡ配列分析を実施し、配列データは、ＧＲＡＭＭＲで処理した材料が、両方の親運動タンパク質遺伝子配列からの情報を含む再集合された配列であるということを示した。ＧＲＡＭＭＲ反応に由来する複数の出力ｐＧＥＮＥＷＡＲＥ−ＭＰクローン例のＤＮＡ配列は、以下のように示されている：ＴＭＶ−Ｃｇ／ＴｏＭＶクローン、図９、配列番号２１、及び図１０、配列番号２２；ＴＭＶ−Ｏｂ／ＴｏＭＶクローン、図１１、配列番号２３及び図１２、配列番号２４；ＴＭＶ−Ｕ２／ＴｏＭＶクローン、図１３、配列番号２５及び図１４、配列番号２６；及びＴＭＶ−Ｕ１／ＴｏＭＶクローン、図５、配列番号２７及び図１６、配列番号２８。

例１５
選択可能マーカー内で分割するエンドヌクレアーゼを用いた線状化されたＤＮＡ基質上のＧＲＡＭＭＲ

この例は、ＤＮＡ基質分子が、選択可能なマーカー遺伝子内で分割する制限エンドヌクレアーゼで線状化されているＧＲＡＭＭＲ反応について教示する。

ＧＲＡＭＭＲは、ｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列番号３１）によりコードされたｐＢＳ誘導体（Stratagene, La Jolla, CA）内の野生型Aequorea Victoria ＧＦＰ遺伝子と、E. coli内の蛍光強度を増大し、青色光発光へと発光波長を改変するべく突然変異を伴う変異体との間で実施される（Crameri, et al., Nat Biotechnol 14 (96) 315; Heim et al., PNAS91 (94) 12501; Yang, et al., J Biol Chem 273 (98) 8212）。プラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰ（配列番号３２）によってコードされるこの変異体遺伝子は、長波ＵＶ光によって励起された場合に明るい青色光を発出する蛍光タンパク質をコードする。

ＧＲＡＭＭＲ反応は、環状２本鎖プラスミドＤＮＡの状況において、ＧＦＰ／Ｃ３ＢＦＰヘテロ２本鎖上で実施される。環状全プラスミドヘテロ２本鎖ＤＮＡ基質は、それぞれＡｈｄＩ及びＢｃｇＩでの消化によりまず第１にｐＢＳＷＴＧＦＰ（配列３１）及びｐＢＳＣ３ＦＰ（配列番号３２）を線状化し、次にＤＮＡスピンカラムを用いて消化済みＤＮＡを精製することによって調製される。次に、２つの線状化されたプラスミドの各々を２００ナノグラムずつ混合し、２０マイクロリットルの体積で１×ＳＳＰＥ（１８０ｎＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ₂ＰＯ₄、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）までもっていく。その後、混合物を４分間９５℃でインキュベートし、氷水中に浸漬し、３７℃でのインキュベーションに先立って１０分間ここにとどめる。３０分後、アニールされたＤＮＡ標本を次に氷に戻し、ここにＧＲＡＭＭＲ反応中での使用まで保持する。

２つの独立した一連の再集合反応を実施して、ＧＲＡＭＭＲによる配列再集合を容易にするそれらの能力についてＲＥＳＩとＣＥＬＩを比較する。まず各々の反応を、５０ｍＭになるまでＫＣｌで補足された１×ＮＥＢ E. coliリガーゼ緩衝液中の各ｄＮＴＰ５ナノモルずつの存在下でＴ４ポリメラーゼ１単位を用いて室温で１０分間処理する。その後、２単位のE. coli ＤＮＡリガーゼを添加する。次に、２つの別々の酵素希釈系列を実施する。上述のカクテルのアリコートの入った２組の一連の試験管の各々に対して、１／３、１／９、１／２７、１／８１又は１／２４３といった希釈度でＧＥＮＥＷＡＲＥ(登録商標)で発現されたＣＥＬＩ又はＲＥＳＩ抽出物を添加する。エンドヌクレアーゼを含まない対照反応も調製する。各反応に対して、アニールされたＤＮＡヘテロ２本鎖基質２０ナノグラムを含む１マイクロリットルのアリコートを添加し、コンピテントE. coliへの形質転換の前に１時間室温でそして３０分間氷上でインキュベートする。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を、長波ＵＶ照射により、結果として得られたコロニー内で視覚化させる。親野生型ＧＦＰは、薄暗い緑色蛍光を与え、親ｃ３ＢＦＰは明るい青色蛍光を与える。これらの蛍光タンパク質をコードする遺伝子においては、発光色を決定する配列及び蛍光強度を支配する配列が、互いに異なる位置にある。ＤＮＡ再集合の結果、蛍光強度を支配する配列から発光色を決定する配列の「リンキング解除」がもたらされる。従って、結果としての後代は、発光色及び強度の機能的特性の再集合を示すことが予想されることになる。従って、各反応において起こったＤＮＡ再集合の範囲の尺度は、対応する平板上の細菌コロニーからの蛍光の強度及び色を検討することによって評定できる。

例１８
ＲＥＳＩ及びマルチプレクス解析を用いたＤＮＡ突然変異の検出
ミスマッチ検出のためのＲＥＳＩの感度を、プールされたＤＮＡ標本の中の突然変異を検出するその能力によって例示する。ＤＮＡを、遺伝子スクリーニングを受けた個体由来の末梢血リンパ球から得る。乳ガンのみ、卵巣ガンのみ、乳ガン／卵巣ガン症候群グループ又は非乳ガン／卵巣ガン対照標本から、標本を得る。遺伝子のこの領域をＰＣＲ増幅するために、ＢＲＣＡＩのエキソン２に特異的な標識づけされていないプライマを利用する。エキソン２の野生型ＰＣＲ産物をγ−³²Ｐ−ＡＴＰで標識づけする。簡単に言うと、Wizard手順（Promega）により、１０ピコモルのＰＣＲ産物を精製する。その後、３７℃で１時間、３０μｌの１×キナーゼ緩衝液（７０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐｈ７．６）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのジチオトレイトール）中６，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌにて１５ピコモルのγ−³²Ｐ−ＡＴＰ及びＴ４キナーゼを用いてエキソン２野生型産物をリン酸化する。１μｌの０．５ＭのＥＤＴＡで反応を停止させる。反応体積を１×ＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて５０μｌまでもってゆき、Pharmacia Probe Quantカラムを通して処理する。その後、個々の標識づけされていないＰＣＲ増幅した実験標本でのハイブリダイゼーションのために、標識づけされたＤＮＡ（１００μｌ中で１ｐｍｏｌ／μｌ）を使用する。個々の標本各々について、１００ｆｍｏｌの標識づけされていないＰＣＲ増幅済み産物を、ＲＥＳＩ反応緩衝液（２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中の³²Ｐ−標識づけされた野生型ＰＣＲ産物と共にインキュベートする。変性及び復元の後、ヘテロ２本鎖化された放射性標識づけ済みのＰＣＲ産物を、１×ＲＥＳ反応緩衝液中で３７℃で３０分間ＲＥＳＩに露呈し、１０μｌの停止混合物（７５％のホルムアミド、４７ｍＭのＥＤＴＡ、１．５％のＳＤＳ、キシレンシアノール及びブロモフェノールブルー）を添加して停止させる。ヘテロ２本鎖を個別に酵素で処理するか又は、１本の標本試験管内にプールして処理する。反応の産物を、７Ｍの尿素を含む１５％のポリアクリルアミドゲル上に装てんする。

プールされたＤＮＡ標本中で突然変異を検出するＲＥＳＩの能力をさらに例示するため、単一の反応試験管内でＲＥＳＩに対し、１、２、３、５、１０又は３０個のヘテロ２本鎖化された放射性標識付け済みＰＣＲ産物（ここでもＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン２から増幅されたもの）を露呈し、産物を、７Ｍの尿素を含む６％のポリアクリルアミドゲル上で走行させる。上述の通りに標本を増幅し、放射性標識付けする。各プールは、１つの突然変異（ＡＧ欠失）を有する１つの標本のみを含んでいる。各プール内のその他の標本は、野生型である。対照標本は、ＲＥＳＩに露呈させない。突然変異が存在するプールされた標本中では、ＲＥＳＩは、一貫してＰＣＲ産物を分割し、余剰の野生型でＴＵＴを受けていないＤＮＡの存在下での酵素の感度を例示している。対照として、突然変異を全く含まないヘテロ２本鎖化されたＰＣＲ産物を分析し、突然変異に対応する切断バンドは全く現われない。

例１７
ハイリスク系統群から得た標本中でのＲＥＳ−１による突然変異及び多形現象の検出
ＢＲＣＡ１遺伝子内のエキソンに特異的なＰＣＲプライマセットを合成する。ＢＲＣＡ１の遺伝子配列は既知である。エキソン境界及び対応する塩基番号は表ＩＩに示されている。当業者であれば、分子生物学における現行プロトコル、Ausubel et al., John Wiley and Sons, Inc編（１９９５）で記されている方法に従って、所望の配列を増幅するためのプライマを容易に設計することができる。これらのプライマは、各ＰＣＲ反応において１つのプライマが５′末端で蛍光性標識６−ＦＡＭで標識づけされる一方でもう１つのプライマがもう１つの色の標識ＴＥＴで同様に標識づけされるような形で計画されている。かくして、１つのＰＣＲ産物は、いずれかのストランド内のＤＮＡニッキング事象を独立して観察でき、測定値を裏付けできるような形で２色で標識づけされることになる。

ハイリスク系統群内の個体に由来する末梢血標本を収集し、ＤＮＡを単離する。Elongare（ＢＲＬ）を用いてＰＣＲ産物を増幅し、Wizard ＰＣＲ Preps (Promega) を用いて精製する。ＤＮＡを９４℃まで加熱し、１×ＲＥＳＩ緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌｐＨ７．４、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ₂）内でゆっくりと冷却してヘテロ２本鎖を形成させる。ヘテロ２本鎖を、３０分間４５℃で０．２μｌのＲＥＳＩ及び０．５単位のAmpli Taqと共に２０μｌの１×ＲＥＳＩ緩衝液内でインキュベートする。反応を１ｍＭのフェナントロリンで停止し、４５℃でさらに１０分間インキュベートする。Centriapカラム（Princeton Separations）を通して標本を処理し、乾燥させる。乾燥させたＤＮＡペレットに対して、１マイクロリットルのＡＢＩローディングバッファ（２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、５０ｍｇ／ｍｌのブルーデキストラン）、４μｌの脱イオン化ホルムアミド及び０．５μｌのＴＡＭＲＡ内部レーン標準を、乾燥したＤＮＡペレットに添加する。９０℃で２分間標本を加熱し、次に装てんに先立ち氷上でクエンチングさせる。その後標本を４．２５％の変性用３４ｃｍのwell-to-readアクリルアミドゲル上に装てんし、ＧＥＮＥＳＣＡＮ６７２ソフトウェアを用いるＡＢＩ３７３シーケンサ上で分析する。この実験標本内の６−ＦＡＭで標識づけされたプライマは、ＢＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド３１７７（領域１１０）にあり、ＴＥＴで標識づけされたプライマは、エキソン１１とエキソン１２の間のイントロン内へ７３ヌクレオチドのところにある。各スパイクは、突然変異又は多形現象が存在するＲＥＳＩによるヘテロ２本鎖の分割によって産生されたＤＮＡバンドの存在を表わしている。１つのスパイクは、ミスマッチ部位の３′側から上部ストランドの５′６−ＦＡＭ標識までの、ＲＥＳＩにより産生されたフラグメントのサイズを表わす。もう１つのスパイクは、ミスマッチの３′側から５′のＴＥＴ標識までの下部ストランド内の対応するフラグメントを表わす。２つのフラグメントの合計は、ＰＣＲ産物の長さよりも１塩基長いものに等しい。６−ＦＡＭパネルは、６−ＦＡＭ標識から塩基＃６４５におけるスパイクを示し、ＴＥＴパネルは、ＴＥＴ標識から塩基＃４８３におけるスパイクを示し、両方共ＢＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド３８１９における５塩基欠失の部位に対応する。

もう１つの個体におけるエキソン１１の分析は、ＢＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド１４５４における６−ＦＡＭ−標識づけされたプライマを用いて実施される。ＴＥＴ標識づけされたプライマは、ヌクレオチド２４５９（領域１１Ｃ）にある。ＰＣＲ増幅された産物は、上述のとおりに増幅され調製される。この個体においては、６−ＦＡＭパネルは、塩基＃７００でのスパイクを示し、ＴＥＴパネルは＃３０５でのスパイクを示し、各スパイクは、ＢＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド２１５４のナンセンス突然変異におけるそれぞれのＤＮＡストランド内のＲＥＳＩ切開の部位に対応している。６−ＦＡＭパネルは同様に塩基＃７４７でのスパイクを示し、ＴＥＴパネルはＢＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド２２０１における多形現象Ｃ＞Ｔの部位に対応する＃２５８でのスパイクを示す。ＡＢＩ３７７シーケンサを用いて標本を配列決定することにより、ナンセンス突然変異及び多形現象を確認することができる。

或る個体は、エキソン１１のもう１つの領域すなわち図ｎ中の図表上の領域１１Ａの中に突然変異を有している。ＢＲＣＡ１ｃＤＮＡのヌクレオチド２２４８における６−ＦＡＭで標識づけされたプライマ及びヌクレオチド３２９０におけるＴＥＴで標識づけされたプライマが、エキソン１１のこの領域を増幅するために用いられる。増幅の後、上述のとおりに標本を処理する。

米国標準培養収集機関（ＡＴＣＣ）への寄託
米国標準培養収集機関（ＡＴＣＣ）、１０８０１University Blvd., Manassas, VAに３件の寄託を行なった。１件の寄託は、６ＨＩＳでタグ付けされたセロリ由来のＣＥＬＩミスマッチエンドヌクレアーゼ遺伝子のｃＤＮＡ及びタバコモザイクウイルスの誘導体を含むプラスミドＤＮＡ構成体について行なった。該構成体は、内部的にｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６ＨＩＳと呼称され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３９２７が割当てられた。セロリ由来のＣＥＬＩミスマッチエンドヌクレアーゼのｃＤＮＡ及びタバコモザイクウイルスの誘導体を含むプラスミドＤＮＡ構成体について１件の寄託を行なった。該構成体は、内部的にｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩＡｖｒと呼称され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−３９２６が割当てられた。Selaginella lepidophyllaからの３４ｋＤａのタンパク質をコードするｃＤＮＡインサート及びタバコモザイクウイルスの誘導体を含むプラスミドＤＮＡ構成体について１件の寄託を行なった。ｃＤＮＡインサートは、ＲＥＳＩ−６ＨＩＳと呼ばれている。ＲＥＳＩは、ミスマッチエンドヌクレアーゼ遺伝子である。該構成体は、内部的にｐＬＳＢ−２２２５と呼称され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−４５６２が割当てられた。

これらの寄託は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条件及び規定に従って行なわれ、少なくとも３０年間そして寄託の標本の供給に対する最近の要請が寄託機関により受理されてから少なくとも５年間の期間について、又は本出願又はこれらの寄託のいずれかを引用する後続の出願に基づいて発行されるべき特許の有効期間のうちのいずれか長い方の期間について行なわれた。各寄託は、それが該期間中に生存不能となった場合、交換されることになる。

クローンの各々についての出願人の呼称は、米国標準培養収集機関での前述の寄託に対し、寄託内で短縮された、すなわちｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩＡｖｒ−Ｂ３はｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩＡｖｒと呼ばれ、ｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９はｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓと呼ばれているという点を指摘しておくべきである。クローンｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩＡｖｒ（配列番号０１）は、ヌクレオチド５７６５から６６５５まで延びるＣＥＬＩ読取り枠（配列番号０３）を含み、クローンｐ１１７７ＭＰ４−ＣＥＬＩ６Ｈｉｓ−Ａ９（配列番号０２）は、ヌクレオチド５７６５−６６７９から延びるＣＥＬＩ−６Ｈｉｓ読取り枠を含んでいた。

ミスマッチ解消による遺伝的再集合プロセス（ＧＲＡミスマッチＲ）を示している。再集合は、少なくとも２つのヌクレオチド位置が異なる２つの仮想のポリヌクレオチドの間で考慮されている。２つの位置でのミスマッチを結果としてもたらすＡの最上ストランドとＢの最下ストランドの間のアニーリングが示されている。再集合ミスマッチ解消プロセスの後、４つの全く異なる製品ポリヌクレオチド、つまり親であるＡ型とＢ型及び再集合された産物Ｘ及びＹが見られる。２つの分子の部分的に相補的な核酸集団を描いている。図２Ａは、それぞれ完全に相補的な上部／下部ストランド1+/2-及び3+/4-を有する２つの核酸分子「Ｘ」及び「Ｙ」の配列を示す。核酸Ｘ及びＹの間の異なるヌクレオチドの位置は、(*)で表わされている。図２Ｂは、変性及びアニール後の核酸Ｘ及びＹから誘導された１本鎖の考えられる組合せを示し、これらの組合せのうちのどれか２つの部分的に相補的な核酸集団を含むことになるかを表わしている。例８に教示されている通りのＲＥＳＩエンドヌクレアーゼをコードする核酸配列（配列番号１６）を示す。ＲＥＳＩについての対応するアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。例９に教示されている通りのプラスミドｐＢＳＣ３ＢＦＰについての核酸配列（配列番号３２）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｃｇのトバモウイルス運動タンパク質読取り枠についての核酸配列（配列番号１８）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｏｂのトバモウイルス運動タンパク質読取り枠についての核酸配列（配列番号１９）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｕ２のトバモウイルス運動タンパク質読取り枠についての核酸配列（配列番号２０）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｃｇ及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られたクローン（配列番号２１）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｃｇ及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られた第２のクローン（配列番号２２）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｏｂ及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られたクローン（配列番号２３）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｏｂ及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られた第２のクローン（配列番号２４）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｕ２及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られたクローン（配列番号２５）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｕ２及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られた第２のクローン（配列番号２６）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｕ１及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られたクローン（配列番号２７）を示す。例１５に教示されている通りのＴＭＶ−Ｕ１及びＴｏＭＶＧＲＡＭＭＲ反応の結果得られた第２のクローン（配列番号２８）を示す。、例１５に教示されている通りのＴＭＶのトバモウイルス運動タンパク質読取り枠についての核酸配列（配列番号９）を示す。例１５に教示されている通りのＴｏＭＶのトバモウイルス運動タンパク質読取り枠についての核酸配列（配列番号１０）を示す。

Claims

所望の機能特性を有するペプチドを得るin vitro方法であって、
ａ）少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有する少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；
ｂ）前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのコピーを配列番号３４の配列からなる有効量のミスマッチエンドヌクレアーゼ(ＲＥＳＩ)又は配列番号３４の配列からなるミスマッチエンドヌクレアーゼ（ＲＥＳＩ)を含むミスマッチエンドヌクレアーゼの組合せ、プルーフリーディング酵素、ｄＮＴＰ及びリガーゼ酵素と混合する段階；
ｃ）非相補的ヌクレオチド塩基対が相補的塩基対に転換されるのに充分な時間経過させ、ポリヌクレオチド配列変異体の１集団を結果としてもたらす段階；
ｄ）ポリヌクレオチド配列変異体を発現する段階；及び
ｅ）所望の機能的特性について、変異体をスクリーニング又は選択する段階、
を含んで成る方法。
ミスマッチエンドヌクレアーゼが、ミスマッチエンドヌクレアーゼ活性を有し、かつ配列番号３４の配列を有するミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する非天然配列変異体である、請求項１に記載の方法。
ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドがエンドヌクレアーゼ活性をコードする、請求項１に記載の方法。
ポリヌクレオチド変異体を発現する段階には、ポリヌクレオチド変異体の１つをコードする組換え型プラスミド又は組換え型ウイルスベクターを宿主生体に形質移入する段階が含まれている、請求項１又は３に記載の方法。
ポリヌクレオチド変異体を発現する段階には、ポリヌクレオチド変異体の１つで宿主主体を形質転換する段階が含まれている、請求項１又は３に記載の方法。
配列番号３４の配列を有するミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素（ＲＥＳＩ）又はミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素活性を有し、かつ１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するその変異体を作る方法であって、
ａ）前記ＲＥＳＩ又はその変異体のポリヌクレオチドをコードする組換え型ウイルスベクターを宿主植物、又は宿主動物、又は宿主酵母又は宿主真菌又は宿主細胞に形質導入する段階；
ｂ）宿主植物、又は宿主動物又は宿主酵母又は宿主真菌又は宿主細菌を増殖させ、前記ＲＥＳＩ又はその変異体のポリヌクレオチドを発現させる段階；及び
ｃ）前記ＲＥＳＩ又はその変異体を宿主から抽出する段階、
を含んで成る、方法。
前記変異体を作成する方法である、請求項６に記載の方法。
標的配列を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズ可能な突然変異を受けていない配列を基準にして１本鎖ポリヌクレオチドの標的配列内の突然変異を決定するための、前記ポリヌクレオチドを増幅し、検出可能マーカーで標識し、互いにハイブリダイズさせ、エンドヌクレアーゼの活性に付し、前記突然変異の存在について分析する方法であって、配列番号３４の配列を有するミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素（ＲＥＳＩ）又はSelaginella lepidophylla由来のミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素活性を有し、かつ１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するその変異体の使用を改良として含み、前記酵素の活性には、
ａ．前記ハイブリダイズしたポリヌクレオチド間のミスマッチの、既知であるか否かとは無関係の検出、
ｂ．ミスマッチを含む標的配列における実質的に１本鎖であるニックの、触媒による形成、
ｃ．隣接し合うフランキングポリヌクレオチド配列によって実質的に影響されない、標的ポリヌクレオチド配列内の突然変異の認識、
が含まれる方法。
さらに
ｄ）ポリヌクレオチドループの認識及び前記ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの間への挿入、
が含まれる、請求項８に記載の方法。
所望の機能的特性を有するポリヌクレオチドを得るin vitro方法であって、
ａ）少なくとも２つの非相補的ヌクレオチド塩基対を有する少なくとも１つのヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドを調製する段階；
ｂ）前記ヘテロ２本鎖ポリヌクレオチドのコピーを有効量の配列番号３４の配列からなるミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素（ＲＥＳＩ）又はミスマッチエンドヌクレアーゼ酵素活性を有し、かつ１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるその変異体、又は当該ＲＥＳＩ若しくはその変異体を含むミスマッチエンドヌクレアーゼの組合せ、プルーフリーディング酵素、ｄＮＴＰ及びリガーゼ酵素と混合する段階；
ｃ）非相補的ヌクレオチド塩基対が相補的塩基対に転換されるのに充分な時間経過させ、ポリヌクレオチド配列変異体の１集団を結果としてもたらさす段階；及び
ｄ）所望の機能的特性について、変異体をスクリーニング又は選択する段階、
を含んで成る方法。
配列番号１６の核酸配列を含んで成る核酸分子。
配列番号３４のアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド。