KR0147778B1 - 제한효소 - Google Patents

Abstract

하기한 인식부위를 인지하는 제한요소로서 그 절단부위는 G와 G사이인 새로운 제한효소 Sol I은 인식, 절단 작용의 특이성에서는 BamH I, BstI과 동일한 DNA 서열 즉, 5'-GGATCC-3'을 절단하나, 인식 서열 내의 dam 메틸화에 대한 민감도와 반응조건에서 BamHI, BstI과 구별되는 특성을 갖는 BamHI, BstI의 이소쉬조머로서 유전자 지도 작성, 재조합 DNA 제조에서 필수적인 도구로 사용될 수 있다.

5'-GGATCC-3'

(상기 염기 서열에서 A는 비메틸화된 A이다.)

Description

제한효소

제1도는 본 발명의 Sol I로 DNA를 절단하여 전기 영동한 결과를 나타내는 사진이고,

제2도는 본 발명의 Sol I을 분리정제하기 위한 헤파린-아가로즈 컬럼 크로마토그래피의 용출결과를 나타내는 그래프이고,

제3도는 본 발명의 Sol I을 분리정제하기 위한 아피-겔 불루 컬럼 크로마토그래피의 용출결과를 나타내는 그래프이고,

제4도는 본 발명의 Sol I의 절단 부위를 확인하기 위한 전기 영동 결과를 나타내는 사진이고,

제5도는 본 발명의 Sol I의 pH에 따른 활성도를 측정한 그래프이고,

제6도는 본 발명의 Sol I의 온도에 따른 활성도를 측정한 그래프이고,

제7도는 본 발명의 Sol I의 온도에 따른 안정도를 측정한 그래프이고,

제8도는 본 발명의 Sol I의 NaCl의 농도에 따른 활성도를 측정한 그래프이고,

제9도는 본 발명의 Sol I의 MgCl₂의 농도에 따른 활성도를 측정한 그래프이고,

제10도는 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 본 발명의 Sol I의 분자량을 측정하기 위한 그래프이다.

[산업상 이용분야]

본 발명은 새로운 제한효소에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 새로운 염기서열 인식부위를 절단하는 타입 II 제한효소에 관한 것이다.

[종래 기술]

유전자의 절단 및 변형(restriction/modification) 시스템은 미생물에 있어서 외부 유전자를 자신의 유전자와 구별하여 외부에서 유입된 유전자를 제한효소(restriction enzyme)를 사용하여 제거하는 시스템이다.

이와 같은 제한효소로서 종래에 알려져 있는 것으로는 효소 단백질 구조, 인식부위, 절단부위, 절단과 메틸화의 상관성, ATP의 필요 여부에 따라 타입I, 타입II, 타입III로 나누어지며, 이 중 본 발명이 속하는 타입 II 제한효소는 엔도뉴클레이즈와 메틸레이즈가 서로 분리되어 있으며, 인식부위는 일반적으로 4-6개의 DNA 서열로 이루어져 있고, 절단부위와 인식부위가 같거나 인접하고 있다는 특징을 갖고 있다. 이와 같은 타입 II 제한효소로서는 BamHI, BstI, GceinI, EcoRI, HindIII, PstI, TaqI, XhoI등이 알려져 있다.

이와 같은 타입 II 제한효소는 재조합 DNA 기술의 빠른 발전을 가능하게 하였으며, 유전자 지도 작성, 재조합 DNA 제조에서 필수적인 도구로 쓰이고 있는 효소로, 지금도 유전자 조작의 다양성과 용이함을 높이기 위하여 새로운 제한효소를 찾으려는 부단한 연구 개발이 이루어지고 있다.

[발명의 구성]

본 발명자는 상기한 바와 같이 유전자 조작의 다양성과 용이함을 높이기 위하여 인식부위의 염기서열이나 반응 조건에서 새로운 특이성을 가지는 제한효소를 발견하고자 부단히 연구한 결과 스트렙토버티실리움 올리보버티실라툼(Streptoverticillium olivoverticillatum)으로부터 새로운 제한효소를 분리 정제하였으며, 이를 SolI으로 명명하였다. 상기 제한효소는 공지의 스트렙토버티실리움 올리보버티실라툼에서 생산되며, 이는 유수의 기탁기관에서 구입할 수 있다.

상기와 같은 목적을 갖는 본 발명은 약 43,000Da의 분자량을 가진 다이머로서, ph 7.6∼10.0, 40∼55℃의 온도에서 높은 활성을 나타내는 하기한 인식부위를 인지하는 제한효소를 제공한다.

5'-GGATCC-3'

(상기 염기 서열에서 A는 비메틸화된 A이다.)

그리고 상기한 본 발명에 있어서, 상기한 제한효소의 절단부위는 G와 G사이이다.

[작용]

SolI은 인식, 절단 작용의 특이성에슨 BamHI, BstI과 동일한 DNA 서열 즉, 5'GGATCC-3'을 절단하나, 인식 서열 내의 dam 메틸화에 대한 민감도(sensitiviy)와 반응조건에서 BamHI, BstI과 구별되는 특성을 갖는 BamHI, BstI의 이소쉬조머로서 유전자 지도 작성, 재조합 DNA 제조에서 필수적인 도구로 사용될 수 있다.

[실시예]

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 구성 및 효과를 보여주기 위한 본 발명의 바람직한 일실시예일뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

I. 재료준비

1. 시약

박테리오파아지 람다 DNA(Bacteriophage λ DNA), 아데노바이러스-2-DNA(Adenovirus-2 DNA), 아가로즈 타입 I(agarose type I:low EEO), 아클리아미드(acrylamide), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 헤파린-아가로즈(haparin-agarose), 표준 소혈철알부민(standard BSA)등은 시그마사(Sigma Chemical Company)에서 구입하여 사용하였다. 쿠마시 브릴리언트 불르 G-250(Coomassie Brilliant Blue G-250), N,N'-메틸렌비스아크릴아미드 (N,N'-methylenebisacrylamide)는 풀루카(Fluka)에서, 아피-겔 블루(Affi-Gel Blue)는 바이오-래드 (Bio-Rad)에서, 수러로즈-6 (Superose-6)는 파마시아 파인 케미카(Pharmacia Fine Chemicals)에서 구입하여 사용하였다. 시퀀스 버전 2.0 키드(Sequanase Version 2.0 Kit)는 유에스비(USB)에서, (α-³⁵S) dATP는 아머샴(Amersham)에서 구입하여 사용하였으며, BamI은 엔이비(NEB)에서, 여러 가지 제한효소들은 엔이비(NEB), 프로메카(Promega), 코스코(KOSCO)등에서 구입하여 사용하였다.

2. 균주 및 배양

제한효소 활성의 탐색은 토양으로부터 분리된 방선균주를 대상으로 하였다. 스트랩토버티실리움 올리보버티실라툼(Streptoverticillium olivoverticillatum)은 베넷(Bennet) 배지(Glucose 50g/ℓ)에서 단일군락(Colony)를 분리하여 계대 배양함으로써 보존하였으며, 본 배양시에는 변형된 배넷 배지를 사용하여 30℃에서 30시간 배양하였다. 5ℓ자(jar)가 부착된 발효조에 배지 3ℓ를 넣고, 통기량 0.1vvm, 교반속도 270 rpm으로 유지하면서 배양하였다.

3. SolI의 활성분석

본 실시예에서 SolI의 활성분석은 하기한 방법으로 실시하였다.

E. coil GM 119에서 분리한 야생형 박테리오파아지 람다(sild type bacteriophage λ)의 비메틸화된 DNA를 기질로 하였다. 10X 반응 완충 용액 1㎕, DNA 0.5㎕, 효소 용액을 포함한 최종 부피 10㎕의 반응혼합액을 15분간 37℃로 반응시키고, 얼음에 옮겨 반응을 종료시켰다. 10X 반응 완충 용액은 500mM Tris-Cl(pH 7.9), 100 mM MgCl2, 10 mM DTT로 조성하였다. 반응혼합액에 10X 샘플 로딩 완충용액(Sample loading bufer)를 더하여 0.9% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동하였다. SolI 1 unit은 1 ㎕의 람다 DNA를 37℃에서 1시간에 완전히 절단할 수 있는 양으로 정의하였다.

II. 제한효소의 탐색

여러 가지 방선균 분리주에 대하여 제한효소의 존재를 탐색한 결과, 한균주로부터 활성을 발견하고 람다 DNA(lambda DNA)와 아데노바이러스-2 DNS(Adenoviurus-2 DNA)에 대한 절단 양상으로부터BamHI과 마찬가지로 5'-GGATCC-3' 염기 서열을 인지함을 확인하였다. 이와 같은 MamHI의 이소쉬조머(isoschizomer)로서 Bst I(Catterall, J.F. and N. E. Welker. 1977, Isolation and propertise of a thermo-stable restriction endonuclease, J.Bacterio01, 129, 1110-1120), Gcein I (Murakam, M., J. Mizuno, and Y, Yamada, 1990, The restriction endonuclease GceinI of Gluconobacter cerinus, IFO, 3260, an isoschizomer of BamHI, has a monomeric structure, Agric, biol, Chem., 54, 2474-2157)등이 알려져 있다.

일반적으로는 BamHI은 dam 메틸화(dam methylation)에 의하여 활성에 영향을 받지 않으므로 E. coli HB101에서 분리한 메틸화된 DNA와 메틸화-결핍(methylation-deficient:dam^-, dcm^-)돌연변이체 GM48에서 분리한 비메틸화된 DHA에 모두 작용할 수 있으나 본 실시예에서 탐색한 제한효소는 제1도에서 보는 바와 같이 비메틸화 DNA만을 절단할 수 있었다. 즉 5'-GATC-3'의 아데닌(adenine)N⁶위치에 dam 메틸화가 일어나면 이 효소는 더 이상 5'-GGATCC-3에 작용하지 못하였다. 제1도에 M은 분자령 마커이고, 제1레인은 람다, 제2레인은 아데노비루스-2, 제3레인은 pBR322이고, 제4레인은 pGEM-1, 제6도 및 제7도는 각각 비메틸화된 및 메틸화된 pGEM-1 SHI이다.

III. 제한효소 생성균주의 동정

방선균의 수리 동정을 위하여 50가지 단위 형질을 윌리암스등의 방법(Williams, S.T., et al., 1983, A probability matrix for the identification of some streptomycetes, J. Gen. Microbiol. 129, 1815-1830)에 따라 조사하고 TAXON프로그램으로 분석하였다(Williams, S.T., et al., Numerical classification of streptomycetes and related genera, J. Gen. Microbiol., 129, 1743-1813).

이 균주와 스트렙토마이세스(Stretpomyces) 종 간의 분류적 연관간계를 첫째 윌콕스 확률(Willcox probability), 둘째 분류학적 거리(Taxanomic distance), 셋째 95% 택손 반경(taxon radius)등의 지표로 조사하였다. 하기한 (표 1) 및( 표 2)에서 보는 바와 같이 단위형질의 26개 주클러스터(major cluster) 2에 대하여 매우 높은 윌콕스 확률를 보였다. 비록 이 분리주의 분류학적 거리가 95% TAXON 반경 보다 큰 값을 보이기는 하지만, 윌콕스 학률이 월등히 높고 이 클러스터가 단 세 종만으로 이루어져 있음을 고려할 때 클러스터 2에 속하는 것으로 판단된다. 이 분리주의 클러스터 2의 종들과 비교하였을 때 하기한 (표 3)에서 보는 바와 같이 스트렙토오버티실리움 올리보버티 실라툼(Streptoverticillium olivoverticillatum)에 대하여 가장 높은 S_{S M}을 가졌다. 또한 주사전자현미경(SEM) 상에서 스트렙토오버티실리움의 특징인 수직(vertical)구조를 확인하였으므로, 이들 결과로부터 이 균주를 스트렙토오버실리움 올리보버티실라툼으로 동정하였으며 생성되는 제한효소는 Sol I이라 명명하였다.

IV. SolI의 분리정제

1. 조추출액의 제조

배양액의 7,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 (Sorvall RC5C) 균체를 수거한 후, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5) 용액으로 세척하고, -40℃에서 사용 전까지 보관하였다. 균체 85g을 완충 용액(20 mM Tris-Cl(pH 7.5), 1 mM EDTA, 5%(v/v glycerol) 150㎖에 용해시켜 고주파처리하여, 25,000 rpm에서 90분간 원심분리(Beckman L7 Ultracentrifuge, type 28 rotor)하여 상층액을 수집하여 조추출액을 제조하였다.

2. 핵산 제거 및 단백질 추출

상기한 조추출액 제조공정에서 얻어진 조추출액에 10% (w/v) 황산스트렙토마이신(streptomycin sulfate) 용액을 최종 1.5% 되도록 넣고 천천히 저으면서 놓아 둔 후, 12,000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 핵산이 제거된 상층액에 고체 황산 암모늄을 첨가, 30% 포화되도록 하고, 12,000 rpm에서 원심분리하였다. 다시 상층액을 65% 포화시키고 원심분리하여 단백질 침전물을 얻었다. 이를 최소 부피의 완충 용액에 녹이고, 같은 완충용액에서 3시간씩 2차례 투석하여 비특이적인 뉴클레이즈들을 제거하고 이들로부터 단백질을 분리하였다.

3. 컬럼 크로마토그래피

투석액을 헤파린-아가로즈 컬럼(heparin-agarose column:2.5×18cm, Vt=88㎖)에 얹고 세척한 뒤, 같은 완충용개(420㎖)에 녹아 있는 NaC1의 일정 농도 기울기(0∼0.8 M)로 용출하였다. 그 결과는 제2도에 도시하였다. 이 중 활성이 있는 용출액을 모아 NaCl이 없는 완충용액에서 3시간씩 2차례 투석하였다. 이 과정에서 나머지 기타 뉴클레이즈가 제거되었다.

이와 같이 분리된 Sol I 분리액을 아피겔 블루 컬럼(Affi-gel Blue column:1.5×16cm, Vt=28㎖)에 얹어, 200㎖의 0∼1.2 M NaCl 일정 농도 기울기로 용출시켰다. 그 결과는 제3도에 도시하였다. 이 중 활성이 있는 부분을 초원심분리 방법(Spectrum, Type F, M.W.Cutoff 10K)으로 농축시켰으며, 이 과정에서 NaCl이 없는 완충용액을 반복 첨가함으로써 용출시 포함된 NaCl을 제거하였다.

이와같은 분리 정제 단계에서의 순도와 수율은 하기한 (표4)와 같으며, 최종적으로 63.8배의 순도와 38.9%의 수율로 SolI을 분리 정제하였다.

V. 절단부위 결정

SolI 인식서열 5'-GGATCC-3'안에서 어떻게 절단을 일으키는지 결정하기 위하여 하기한 방법으로 실험을 행하였다.

플라스미드 DNA(Plasmid DNA)를 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 사용하여 정제하였으며, 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA는 각각 E. coli HB101과 GM48로부터 분리하였다.

DNA 서열화는 생거의 디데옥시-체인 터미네이션(dideoxy-chain termination) 방법(Sanger, F., et al., DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proc. Nat1. Acad. Sci., 74, 5463-5467)을 사용하여 실시하였고, 제한효소에 의한 절단부위 결정은 브라운(Brown, N.L. and M. Smith, 1980, A general method for defining restriction enzyme cleavage and recognition sites, Methods Enzymol, 65, 391-340)과 징거스 등의 방법(Gingers, T.R., et al., 1981, Two restriction endonucleases from Proteus vulgaris, Nucleic Acide Res., 9, 4525-4534)을 변형시켜 사용하였다. 절단부위 결정은 pBluescript SK(+)의 폴리클로닝 부위내에 있는 SolI 서열을 이용하였다.

순수 분리한 플라스미스(3㎕)을 9㎕증류수에 높이고, 2 N NaOH, 20mMEDTA 용액을 1㎕씩 넣고 5분간 두어 DNA을 변성시켰다. IM Na-아세테이트와 에탄올로 침전시킨 뒤, 침전물을 70% 에탄올로 세척하고 건조하였다. 이를 프라이머와 시쿼네이즈(sequanase)완충용액에 녹이고 65℃에서 2분간 처리한 다음, 천천히 식혀 프라이머와 플라스미드 사이의 어닐링(annealing)을 유도하였다. (α- S)dATP와 다른 세 가지 dNTP를 더하여 시쿼네이즈로 상온에서 5분간 표지 반응하고, 이 혼합액 일부를 미리 37℃에 놓아 둔 터미네이션 믹스(termination mix)와 반응시켰다. 절단부위 결정시에는 동일한 과정을 거쳐 표지반응시킨 혼합액에 네가지 dNTP를 첨가하여 합성을 계속한 뒤 암모니움 아세테이트와 에탄올로 침전시킨 후 TE완충용액을 녹였다. 합성된 DNA를 분리한 제한효소로 처리, 절단하고 다시 에탄올로 침전시켰다. 이들을 80℃에서 2분간 변성(denaturation)시킨 다음, 8M 우레아가 포함된 10% 폴리아클릴아미드 겔에서 전기영동한 그결과를 제4도에 나타내었다.

제4도는 도시한 바와 같이 Sol I은 BamH I과 마찬가지로 두 개의 DNA가닥에서 모두 G와 G사이에 결합을 절단하여 4 염기가 돌출된 5' 말단을 만드는 것으로 나타났다.

제4도에서 (1)은 전방향 프라이머(forward primer)를 사용한 결과이고 (2)는 후방향 프라이머(reverse primer)를 사용한 결과이며, S 레인이 SolI의 절단부위를 나타낸다.

VI. 반응조건 및 특성 분석

상기한 IV. Sol I의 분리 정제 공정에서 정제된 효소 용액을 알맞게 희석하고, 적절한 10X 반응 완충용액을 넣어, pH, MgCl농도, NaCl농도등을 각각 달리 조절하면서 반응조건 따른 효소 활성을 측정하였다. 또 열에 대한 안정성을 알아 보기 위해서 효소 용액 15㎕를 각각의 온도에서 5분 또는 15분 처리한 후, 효소 활성을 측정하였다.

반응 혼합액의 pH에 따른 활성을 비교해 본 결과, 제5도에 도시한 바와 같이 pH 7.6∼10.0 범위에 걸쳐 큰 차이 없는 높은 활성을 보였으며 최적반응 pH는 8.1이고, 같은 pH에서는 완충 용액의 조성에 의해 그다지 영향을 받지 않았다.

최적 반응 온도는 제6도에 도시되어 있는 바와 같이 40℃이고, 40∼55℃에서 높은 활성을 나타내었다. 또한 제7도에서 알수 있는 바와 같이 60℃에서 15분간 열 처리하여도 활성을 대부분 유지하였으나, 85℃이상으로 처리하면 완전히 불활성화되었다. 이소쉬조머인 BamH Idms 45℃이상에서 활성을 잃으며(Smith, L.A. and J.G. Chirikjian, 1979, Purification and Characterization of the sequence-specific endonuclease BamHI, J.Biol.Chem., 254, 1003-1006), Bst I은 65℃에서 10시간 처리해도 안정하지만 75℃에서는 급격히 활성을 잃는 것으로 보고되어 있다(Catterall, J.F. and N.E. Welker, 1977, Isolation and properites of a thermo-stable restriction endonuclease, J.Bacteriol. 129, 1110-1120).

또 Sol I은 제8도에 도시되어 있는 바와 같이 반응 혼합액에 NaCl이 없을 때 가장 높은 활성을 보였으며, NaCl 증가에 따라 활성이 급격히 감소하여 120mM 이상의 NaCl이 있으면 활성이 완전히 억제되었다. DTT와 같은 환원제를 전혀 필요로 하지 않으며, 단백질 농도가 낮을때는 BSA에 의해 안정화되었다.

시험해 본 모든 반응 조건에서 인식 염기서열은 변화하지 않고 람다 DNA에 대하여 똑같은 절단 양상을 유지하였다. 반응 조건에 따라 염기서열에 대한 특이성이 변화 또는 완화되는 제반효소의 예가 많이 알려져 있지만, 이 경우에는 이러한 조건이 발견되지 않았다.

이와같이 반응 조건 및 특성 분석 결과로 볼 때 본 SolI 제한효소는 종래의 타입 II제한효소와는 전혀 다른 새로운 종류의 제한효소임을 알수 있다.

VII. 단백질 정량 및 분자량 측정

1. 단백질 정량

컬럼 프로마토그래피 과정에서는 280nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 외에는 BSA(bovine serum albumin)을 표준단백질로 하여 브래드포드의 방법을 사용하여 단백질 정량을 하였다(Bradford, M.M., 1976, A repid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principles of protein-dye binding, Anal. Chem., 72, 248-254)

2. 분자량 측정

표준단백질과 시료를 150mM NaCl이 포함된 50mM인산 칼륨(potassium phosphate:pH 7.0)에서 수퍼로즈-12 겔 여과 크로마토그래피(Superose-12 gel filtration chromatography:0.7×78cm, Vt=30㎖)를 수행하여 용출 부피를 비교 측정하여 분자량을 결정하였다. 그 결과는 제10도에 도시되어 있는 바와 같이, Sol I의 분자량은 약 43,000 Da인 것으로 나타났으며, 대부분의 제한효소들이, 소단위체의 분자량이 20,000Da 가량이고 다이머로 존재한다는 것을 고려하면 SolI 또한 다이머로 존재하리라고 생각된다.

Claims (2)

1. 스트렙토버티실리움 올리보버티실라튬의 배양액에서 얻은 균체를 포함하는 완충용액을 고주파 처리하고 원심분리하여 조추출액을 제조하는 공정과 ; 상기 조추출액에 황산 스트렙토마이신 용액을 첨가한 후 원심분리하여 핵산을 제거한 액에 고체 황산암모늄을 첨가하고 원심분리하여 얻은 단백질 침전물 완충용액에 녹인 후 투석하여 비특이적 뉴클레이즈를 제거하여 단백질을 분리하는 공정과 ; 상기 분리한 단백질을 헤파린-아가로스 크로마토그래피를 실시하여 280nm에서 흡광도 피크를 갖는 활성 분획을 얻는 공정과 ; 상기 분획을 수집하고 투석을 실시하여 얻은 분리액을 아피-겔 블루 크로마토그래피를 실시하여 280nm에서 흡광도 피크를 갖는 활성 분획을 얻는 공정과 ; 상기 분획을 수집하여 초원심분리하여 농축시키는 공정으로부터 제조되며, 약 43,000Da의 분자량을 갖는 다이머로서, 최적 pH는 pH 8.1이고, 최적 반응온도는 40℃이며, 60℃에서 15분간 열처리 후에는 활성을 유지하나 85℃이상에서 열처리 후에 불활성화되고, 반응 혼합액에 NaCl이 없을 때는 높은 활성을 보이나 120m/M 이상의 NaC1에서는 활성이 억제되고, DTT를 필요로 하지 않으며, 단백질 농도가 낮을 때는 BSA에 의해 안정화되는, 하기한 인식부위를 인지하는 제한효소.

   5'-GGATCC-3'

   상기 염기 서열에서 A는 비메틸화된 A이다.
2. 제1항에 있어서, 상기한 제한효소의 절단부위는 G와 G사이인 제한효소.