JP3887709B2 - 新規アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ遺伝子、及び形質転換体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノペプチダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたアミノペプチダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質を加水分解して調味料を得る方法としては、微生物の培養物または酵素を用いた分解による方法（以下「酵素分解法」という）と、酸を用いた化学的な加水分解による方法がある。酵素分解法としては、醤油、味噌などの伝統的な調味料生産の方法のほか、蛋白質加水分解関連の酵素を含む麹菌の培養液をグルテン等の蛋白質に作用させる方法も使われている。酸による分解法としては、塩酸を用いて、グルテン等の蛋白質を高温で処理することによって行われてきた。
酵素分解法で、呈味力に大きく寄与する酵素としては、次の二種の酵素があげられる。蛋白質をおおまかに切断して可溶化させる働きをするプロテアーゼ、ペプチドをさらに端からアミノ酸に分解するエキソペプチダーゼである。エキソペプチダーゼとしては、アミノ末端から分解するアミノペプチダーゼと、カルボキシ末端から分解するカルボキシペプチダーゼがある。菌体外に多種の加水分解酵素を分泌生産することから、これらの酵素を得るために麹菌が使われてきた。麹菌の生産するアミノペプチダーゼとしては、アスペルギルス・オリゼ由来のアミノペプチダーゼ２種（WO96/28542、WO98/51804）、アスペルギルス・ソーヤ由来のアミノペプチダーゼ２種（WO97/04108,特開平11-346777）がその酵素と遺伝子について公知になっている。しかし、麹菌の生産するアミノペプチダーゼは、多種に及んでおり、それぞれに酵素の性質が異なることから、この他のアミノペプチダーゼおよびその遺伝子を取得することは、酵素分解法による蛋白質加水分解調味料を得るために有用であると考えられた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規アミノペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたアミノペプチダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため研究を重ね、麹菌より新規アミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
さらに、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコードするアミノペプチダーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
さらに、本発明は、 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含むアミノペプチダーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片をコードする核酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAの450塩基以上の部分又は全長と60%以上の相同性を示し、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からアミノペプチダーゼ蛋白質を採取することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
１．本発明のアミノペプチダーゼ
本発明のアミノペプチダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記麹菌等からクローニングしたアミノペプチダーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより得られる。
本発明のアミノペプチダーゼは、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、アミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分、または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその部分断片であってもよい。配列番号２のアミノ酸配列の全長と９９％の相同性と示すものとして、配列番号４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０００６】
２．アミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの麹菌や、その他のアスペルギルス属の糸状菌、その他の糸状菌、またはその他の真菌類から得ることが出来る。さらに具体的には、例えばアスペルギルス・ソーヤATCC42251株やアスペルギルス・オリゼRIB40株が挙げられる。これらの菌体を、アミノペプチダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、プロテアーゼ生産培地（３％パフ化脱脂大豆粉末、３％KH2PO4、121℃・15分オートクレーブ）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30時間振盪培養したのち、例えば市販のRNA調製試薬キットSepaGene（三光純薬製）を用いて、キットに付属の説明書にしたがって全RNAを調製する。ただし、この場合、キットの説明書の操作を行う前処理として、菌体を液体窒素で凍結させた後、液体窒素で冷却した乳鉢・乳棒を用いて粉砕しておくとよい。
【０００７】
こうして得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行う。プライマーとしては、本発明の本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよいが、例えば、配列番号5および配列番号6の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例えばRNA LA-PCR Kit（宝酒造製）を用いて常法により行うことができる。得られた、本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNA、及びそれによりコードされるアミノペプチダーゼの例をそれぞれ配列番号１および配列番号２に例示する。
本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、アミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。該遺伝子の具体例として、配列番号２のアミノ酸配列の全長と９９％の相同性と示すアミノ酸配列（配列番号４）をコードするアミノペプチダーゼ遺伝子（配列番号３）が挙げられる。
本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、アスペルギルス属の糸状菌、その他の糸状菌、酵母などの真菌類があげられる。これらの生物から、常法によりRNAまたはゲノムDNAを調製し、プラスミドまたはファージに組み込み、ライブラリーを調製する。続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも20塩基以上、望ましくは40塩基以上、更に望ましくは100塩基以上、最も望ましくは200塩基以上の部分または全体を含むものが挙げられる。また、プローブは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸の少なくとも20塩基以上、望ましくは40塩基以上、更に望ましくは100塩基以上、最も望ましくは200塩基以上の部分または全体を含むものが挙げられる。
次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることが出来る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【０００８】
このようにして得られたDNAがアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してアミノペプチダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【０００９】
２．組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でアミノペプチダーゼを生産させうるものであればどのようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが上げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例えばエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。
【００１０】
３．形質転換体の取得
本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明のアミノペプチダーゼを生産することが出来るものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)の方法などを用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)の方法などを用いることができる。
【００１１】
４．アミノペプチダーゼの製造
本発明のアミノペプチダーゼの製造法は、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からアミノペプチダーゼ蛋白質を採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のアミノペプチダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のアミノペプチダーゼを生産させることができる。
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のアミノペプチダーゼを生産させることができる。本発明のアミノペプチダーゼが菌体内または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のアミノペプチダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもできるが、破砕した後、Triton X-100, Tween-20, Nonidet P-40等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清に本発明のアミノペプチダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のアミノペプチダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のアミノペプチダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロテアーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【００１２】
本発明のアミノペプチダーゼの活性は、次の方法で測定できる。
【００１３】
基質溶液としては、0.1mmolのL-ロイシン-p-ニトロアニリドを5mlのエタノールに溶解させ、10mlの500mMトリスバッファー（pH8.5）と85mlの蒸留水を加えたものを用いる。２本のサンプルチューブの一方(A)に30μlの酵素液を入れた後、両方のサンプルチューブに300μlの上記基質溶液を加え、37℃で10分から30分間保温する。両方のサンプルチューブに100μlの0.1N塩酸を加えて反応を停止し、撹拌し、最初に酵素液を入れなかったほうのサンプルチューブ(B)に30μl の酵素液を加えて更に攪拌する。400nmにおける吸光度を測定する。(A)の吸光度から(B)の吸光度を減じたものをΔODとし、反応時間をT(分)とすると、活性は以下の式で表される。
活性(単位/ml)＝(ΔOD×0.69×1000)／(30×T)
【００１４】
【実施例】
以下に実施例を示し、本説明をより具体的に説明するが、本説明はこれらによって制限されるものではない。
１．アスペルギルス・ソーヤのアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・ソーヤATCC42251株の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った50mlのプロテアーゼ生産培地（前述）に接種し、30℃で、30時間振盪培養（130rpm、回転振盪）した。培養液から菌体をろ過により回収し、滅菌蒸留水で洗浄し、ペーパータオルに挟んで水分を除去した。あらかじめ液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に菌体を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、SepaGene（三光純薬製）を用いて全RNAを抽出した。更に、DNA-freeキット（Amibion製）を用いてDNase I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA0.5ugを鋳型として、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を用いてRT-PCRを行った。
【００１５】
逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側は開始コドンの直前から、3'側はポリA部分から増幅した。
【００１６】
LNECO: 5'-GTG TCA ATT TCT TCG AAT TCA CGA TG-3' （配列番号5）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、56℃20秒、72℃1分20秒を15サイクル行い、72℃5分を行った。なお、サーマルサイクラーとしては、DNA Engine PCT-200（MJ Research製）を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった（以下のPCRでも同様）。
続いて、上記RT-PCRの増幅産物を鋳型として、上記LNECO及び下記のプライマーを用いて、PCRを行った。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、Tbr EXT DNA Polymerase（Fynnzymes製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。
LCKP2: 5'-AAT TTT CTA AGG GTA CCG CAC TCA TTG G-3' （配列番号6）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、56℃20秒、72℃1分20秒を30サイクル行い、72℃5分を行った。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.3kbのバンドが確認された。
次いで、TOPO TA Cloning Kit with TOP10 Cell（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10株を形質転換し、形質転換体14クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、14クローン中12クローンで約1.3kbの断片が確認され、この12クローンについて塩基配列を決定した。
塩基配列の決定は、試薬としてThermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit 7-deaza dGTP（アマシャム ファルマシア バイオテク製）を用い、シークエンサーとしてはDNA Sequencer Model 4200（LI-COR製）を用いて、サンガー法により行った（以後同様）。得られた12クローンの塩基配列を比較したところ、うち2クローンはPCRによる変異を含まないことが分かった。この、変異を含まないクローンのプラスミド「pSLCEK7」は、産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１８３０７として寄託されている。また、pSLCEK7に含まれるクローンの開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を配列番号１に記載する。
上記塩基配列を解析したところ、このDNAは、387アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記載する。さらに、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して相同性検索した。相同性検索には、NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、pat(patent)及びswissprotを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い相同性を示したのは、米国特許US5,994,113に記載されたアスペルギルス・オリゼー由来のアミノペプチダーゼ遺伝子であり、配列番号2の36番から385番に対して、55%一致であった。次いで高い相同性を示したのは、WO9704108記載のアスペルギルス・ソーヤ由来のロイシンアミノペプチダーゼであり、配列番号2の36番から385番に対して54%一致であった。これらの結果から、配列番号1に記載のDNAによりコードされた、配列番号2に記載のアミノ酸配列の蛋白質は、新規の配列を持つことが分かり、また、アミノペプチダーゼ活性を有することが推測された。
また、配列番号１の塩基配列について相同性検索した。相同性検索には、NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、748塩基中99%, 231塩基中100%, 184塩基中100%一致の部分を含む塩基配列（ID N0. APU52151）が登録されていた。ID N0. APU52151に付与されている情報には、アスペルギルス・パラスティカス由来のポリケタイド合成酵素遺伝子を含むとの記述があるのみであり、それ以外の部分にアミノペプチダーゼをコードする遺伝子を含むことを示唆するような記載はない。また、この配列はゲノムDNAの塩基配列であり、実際に蛋白質をコードしている部分がどこであるかが明らかでない上、コード領域が予測できたとしても、コードされている可能性のある蛋白質の機能は明らかでなかった。本発明により、配列番号1がアミノペプチダーゼ遺伝子であることが、初めて明らかにされたのである。
【００１７】
２．アミノペプチダーゼ遺伝子組換えベクターの作製
pSLCEK7上のアミノペプチダーゼ遺伝子を、サッカロミセス・セルビシエ用の発現ベクターpYES2（Invitrogen製）上にサブクローニングした。具体的には、以下の方法で行った。まず、pSLCEK7を制限酵素EcoRI （宝酒造製）で切断し、DNA Blunting Kit（宝酒造）で末端を平滑化した後、さらに制限酵素KpnIで切断した。これをアガロースゲルで電気泳動し、アミノペプチダーゼ遺伝子を含む約1.3kbのバンドを切り出した。切り出されたバンドから、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン製）を用いてDNA断片を抽出した。一方、pYES2を制限酵素HindIIIで切断し、DNA Blunting Kit（宝酒造）で末端を平滑化した後、さらに制限酵素KpnIで切断した。これをアガロースゲルで電気泳動し、ベクター部分を含む約5.9kbのバンドを切り出した。切り出されたバンドから、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン製）を用いてDNA断片を抽出した。上記2種類のDNAを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて16℃ 1時間でライゲーションした。ライゲーション産物で、 XL1-Blue Competent ells（STRATA GENE製）を形質転換し、形質転換体を6クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出・精製した。全てのクローンはアガロース電気泳動で同じ移動度を示したため、そのうちの１つのpYSL1を代表として使用することにした。pYSL1は、大腸菌での自律複製領域及びアンピシリン耐性遺伝子のほか、サッカロミセス・セルビシエ内での自律複製領域及びURA3遺伝子を持ち、GAL1プロモーターとCYC1ターミネーターの間にアミノペプチダーゼ遺伝子が挿入された構造を持つ。従って、サッカロミセス・セルビシエ細胞内でガラクトースによりアミノペプチダーゼを誘導生産することが可能となる。
３．形質転換体の取得
酢酸リチウムを用いる形質転換法（前述）により、ウラシル要求性ura3-52変異を持つINVSc1株をpYSL1で形質転換し、ウラシルを含まない最少寒天培地上で選択することにより、形質転換体INVSc1/pYSL1株を得た。また、ネガティブコントロールとして、同様にINVSc1をpYES2ベクタープラスミドで形質転換したINVSc1/pYES2株を得た。
４．アミノペプチダーゼの製造
INVSc1/pYSL1株及び、ネガティブコントロールのINVSc1/pYES2株を培養し、アミノペプチダーゼを得た。まず、それぞれの株のコロニーを2%ラフィノースを含みウラシルを含まない15mlのSC培地（最少培地）に接種し、30℃で一晩振盪培養した。それぞれの一晩培養液の600nmにおけるODを測定し、50mlの誘導培地に接種したときにODが0.4になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心分離により上清を除いた。得られた、それぞれの菌体を2%ガラクトースと1%ガラクトースを含みウラシルを含まない50mlのSC培地（誘導培地）に懸濁し、30℃で10時間振盪培養した。培養終了後、600nmにおけるODを測定し、培養液を遠沈管に移し、遠心分離により培養上清と菌体に分けた。培養上清は、300μlずつに分け、-80℃に保存した。菌体は、500μlの滅菌蒸留水に懸濁し、微量遠沈管に移し、再び遠心分離し、上清を除去した。菌体に、50mM HEPES(pH7.0)（以後HEPESバッファーとする）を、ODが50になるように加えて懸濁し、300μlずつに分けて、更に遠心分離し、上清を除去した後、-80℃で保存した。
【００１８】
培養上清と菌体（HEPESバッファー300μlに再懸濁したもの）についてアミノペプチダーゼ活性を測定した（表1）ところ、菌体に活性が認められ、INVSc1/pYSL1株では、コントロールのINVSc1/pYES2と比べて約3倍の活性を示した。菌体懸濁液のアミノペプチダーゼ活性（mU/ml）を表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】
次いで、微量遠沈管に入った凍結菌体をHEPESバッファー300μlに再懸濁したものに0.35gのガラスビーズを加え、マルチビーズショッカーMB-200（安井機械製）で最高速で3分×5回処理し、菌体を破砕した。破砕液をピペットでガラスビーズと分け、新しい微量遠沈管に移し、700×gで2分間遠心分離した。沈殿は300μlのHEPESバッファーで洗浄後、再び300μlのHEPESバッファーに懸濁して、(P)画分とした。上清は新しい微量遠沈管に移し、20,000×gで30分間遠心分離し、上清を(S)画分とした。沈殿は、300μlのHEPESバッファーで洗浄後、50μlのHEPESバッファーに懸濁して3μlの10% Triton X-100を加え、5℃で30分間緩やかに浸透した後、50℃の温水上に2分間置いた。さらに、250μlのHEPESバッファーを加え、20,000×gで30分管遠心分離した。上清は(T)画分とし、沈殿は300μlのHEPESバッファーで洗浄後、再び300μlのHEPESバッファーに懸濁して、(M)画分とした。
それぞれの画分についてアミノペプチダーゼ活性を測定したところ（表2）、全ての画分で、INVSc1/pYSL1株では、コントロールのINVSc1/pYES2株と比べて高い活性が認められた。 (S)画分では、コントロールのINVSc1/pYES2株においても活性が見られたが、この活性は宿主であるサッカロミセス・セルビシエINVSc1株のネイティブな菌体内アミノペプチダーゼに由来するものであると考えられる。したがって、INVSc1/pYSL1株の生産するアミノペプチダーゼのうち、各画分のINVSc1/pYES2株の活性を除いた部分はpYSL1中の配列番号1記載のDNAに由来するものであることが分かった。各画分のアミノペプチダーゼ活性（mU/ml）を表２に示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】
以上により、配列番号1記載のDNAを組込んだ組換えベクターにより形質転換された形質転換体によりアミノペプチダーゼを製造することができた。
また、配列番号1記載の塩基配列によりコードされる配列番号2記載のアミノ酸配列を含む蛋白質がアミノペプチダーゼ活性を有することも明らかになった。
５．アスペルギルス・オリゼーのアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼーRIB40株を培養し、全RNAを抽出した。培地、培養時間、抽出法は、前述の１．の方法と同様である。得られた全RNAを用いて、5'-RACE及び3'-RACEを行い、アミノペプチダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００２３】
5'-RACEは、FirstChoice RLM-RACE Kit（Ambion製）を用いて、キットに付属の説明書に従って行った。すなわち、アルカリフォスファターゼ処理、タバコ酸性ピロフォスファターゼ処理、RNAアダプターライゲーション、逆転写反応を行い、遺伝子特異的プライマーとキットに付属のアダプタープライマーを用いたPCRを2段階で行った。遺伝子特異的プライマーとしては、次の2種を順次使用した。
L5OUT: 5'-TCA TGA TAC CCA CGG CTT CTT TAC-3' （配列番号7）
L5IN: 5'-CGC GTC TTT CTT GCT TGT ATT GAG-3' （配列番号8）
1段目のPCRの温度コントロール条件は、94℃2分の後、94℃10秒、65℃15秒、72℃1分20秒を30サイクル行い、72℃7分で完了であった。2段目のPCRの温度コントロール条件は、94℃2分の後、94℃10秒、72℃1分25秒を27サイクル行い、72℃10分で完了であった。
PCRには、ExTaq DNA polymerase（宝酒造）を使用した。
2段目のPCRにより、約1kbのDNA断片が増幅された。TOPO TA Cloning Kit with TOP10 Cell（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10株を形質転換し、形質転換体6クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、全てのクローンで約1.0kbの断片が確認され、この6クローンについて塩基配列を決定した。
3' RACEは、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を用いて行った。逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。
【００２４】
次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側はアミノペプチダーゼ遺伝子内から、3'側はポリA部分から増幅した。
LB3GS: 5'-CCA CCA AGA CAG TAT CAA CTT GT-3' （配列番号9）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、58℃15秒、72℃1分を33サイクル行い、72℃5分を行った。
【００２５】
上記反応により、約0.8kbのDNA断片が増幅された。TOPO TA Cloning Kit with TOP10 Cell（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10株を形質転換し、形質転換体7クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、6クローンで約0.8kbの断片が確認され、この6クローンについて塩基配列を決定した。
【００２６】
5' RACEで得られたクローンの塩基配列と、3' RACEで得られたクローンの塩基配列について、クローン間の塩基配列の比較からPCR変異を修正したのち、5'側と3'側の塩基配列を結合することにより、配列番号3に記載のアスペルギルス・オリゼーのアミノペプチダーゼ遺伝子の全長配列を得た。この配列は、配列番号1に記載のアスペルギルス・ソーヤのアミノペプチダーゼ遺伝子に対して96.9%の相同性を示した。また、配列番号3に記載の塩基配列は、塩基配列4に記載したアミノ酸配列の蛋白質をコードしており、これは、配列番号2に記載のアミノペプチダーゼと、99%の相同性を示した。従って得られた遺伝子は、アスペルギルス・オリゼーのアミノペプチダーゼ遺伝子であることが分かった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、新規なアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体が提供された。また、本発明によりアミノペプチダーゼの製造方法が提供された。
本発明により、上記アミノペプチダーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。本発明はまた、蛋白質加水分解による調味料生産の生産性と品質の向上のためにも有用である。
【００２８】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アミノペプチダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたアミノペプチダーゼの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質を加水分解して調味料を得る方法としては、微生物の培養物または酵素を用いた分解による方法（以下「酵素分解法」という）と、酸を用いた化学的な加水分解による方法がある。酵素分解法としては、醤油、味噌などの伝統的な調味料生産の方法のほか、蛋白質加水分解関連の酵素を含む麹菌の培養液をグルテン等の蛋白質に作用させる方法も使われている。酸による分解法としては、塩酸を用いて、グルテン等の蛋白質を高温で処理することによって行われてきた。
酵素分解法で、呈味力に大きく寄与する酵素としては、次の二種の酵素があげられる。蛋白質をおおまかに切断して可溶化させる働きをするプロテアーゼ、ペプチドをさらに端からアミノ酸に分解するエキソペプチダーゼである。エキソペプチダーゼとしては、アミノ末端から分解するアミノペプチダーゼと、カルボキシ末端から分解するカルボキシペプチダーゼがある。菌体外に多種の加水分解酵素を分泌生産することから、これらの酵素を得るために麹菌が使われてきた。麹菌の生産するアミノペプチダーゼとしては、アスペルギルス・オリゼ由来のアミノペプチダーゼ２種（WO96/28542、WO98/51804）、アスペルギルス・ソーヤ由来のアミノペプチダーゼ２種（WO97/04108,特開平11-346777）がその酵素と遺伝子について公知になっている。しかし、麹菌の生産するアミノペプチダーゼは、多種に及んでおり、それぞれに酵素の性質が異なることから、この他のアミノペプチダーゼおよびその遺伝子を取得することは、酵素分解法による蛋白質加水分解調味料を得るために有用であると考えられた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、新規アミノペプチダーゼ、該酵素をコードする新規遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターによって形質転換された形質転換体及び該形質転換体を用いたアミノペプチダーゼの製造方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため研究を重ね、麹菌より新規アミノペプチダーゼ遺伝子をクローニングすることに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
さらに、本発明は、以下の(a)、(b)又は(c)の蛋白質をコードするアミノペプチダーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片であり、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質
さらに、本発明は、 以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAを含むアミノペプチダーゼ遺伝子である。
(a) 配列番号１で表される塩基配列を含むDNA
(b) 配列番号１で表される塩基配列またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(c) 配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質またはその部分断片をコードする核酸またはその相補鎖を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
(d) 配列番号１で表される塩基配列のDNAの450塩基以上の部分又は全長と60%以上の相同性を示し、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードするDNA
さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクターである。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からアミノペプチダーゼ蛋白質を採取することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造方法である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
１．本発明のアミノペプチダーゼ
本発明のアミノペプチダーゼは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質である。
該酵素は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの麹菌の培養物から精製することができる。また、該酵素は、上記麹菌等からクローニングしたアミノペプチダーゼ遺伝子を適当な宿主-ベクター系で発現させることにより得られる。
本発明のアミノペプチダーゼは、酵素活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていてもよい。さらに、アミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分、または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質、またはその部分断片であってもよい。配列番号２のアミノ酸配列の全長と９９％の相同性と示すものとして、配列番号４で表されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０００６】
２．アミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子は、例えば、アスペルギルス・ソーヤやアスペルギルス・オリゼなどの麹菌や、その他のアスペルギルス属の糸状菌、その他の糸状菌、またはその他の真菌類から得ることが出来る。さらに具体的には、例えばアスペルギルス・ソーヤATCC42251株やアスペルギルス・オリゼRIB40株が挙げられる。これらの菌体を、アミノペプチダーゼを生産する条件の培地で培養したものから、常法により全RNAを回収する。培地としては、例えば、プロテアーゼ生産培地（３％パフ化脱脂大豆粉末、３％KH2PO4、121℃・15分オートクレーブ）を用いることができる。上記培地で適当な時間、例えば30時間振盪培養したのち、例えば市販のRNA調製試薬キットSepaGene（三光純薬製）を用いて、キットに付属の説明書にしたがって全RNAを調製する。ただし、この場合、キットの説明書の操作を行う前処理として、菌体を液体窒素で凍結させた後、液体窒素で冷却した乳鉢・乳棒を用いて粉砕しておくとよい。
【０００７】
こうして得られた全RNAを鋳型として、RT-PCRを行う。プライマーとしては、本発明の本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を増幅することのできる組み合わせであればどのような組み合わせのものを用いてもよいが、例えば、配列番号5および配列番号6の配列のオリゴヌクレオチドを用いることができる。RT-PCRは、市販のキット、例えばRNA LA-PCR Kit（宝酒造製）を用いて常法により行うことができる。得られた、本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNAは、例えば、常法によりプラスミドに組み込むことができる。このようにして得られたDNAの塩基配列は、サンガー法により、市販の試薬及びDNAシークエンサーを用いて決定することができる。このようにして得られる本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を含むDNA、及びそれによりコードされるアミノペプチダーゼの例をそれぞれ配列番号１および配列番号２に例示する。
本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子は、上記のもののほか、アミノペプチダーゼ活性を有する限り、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしているものであってもよい。このような遺伝子は、後述するハイブリダイゼーションによる選択のほか、種々の公知の変異導入方法によって得ることもできる。該遺伝子の具体例として、配列番号２のアミノ酸配列の全長と９９％の相同性と示すアミノ酸配列（配列番号４）をコードするアミノペプチダーゼ遺伝子（配列番号３）が挙げられる。
本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子は、次のように、ハイブリダイゼーションによる選択法を用いて得ることもできる。遺伝子源としては、アスペルギルス属の糸状菌、その他の糸状菌、酵母などの真菌類があげられる。これらの生物から、常法によりRNAまたはゲノムDNAを調製し、プラスミドまたはファージに組み込み、ライブラリーを調製する。続いて、プローブとして用いる核酸を検出法に応じた方法で標識する。プローブとして用いる核酸は、十分な特異性を得られる長さであればよく、例えば、配列番号１に記載の配列の少なくとも20塩基以上、望ましくは40塩基以上、更に望ましくは100塩基以上、最も望ましくは200塩基以上の部分または全体を含むものが挙げられる。また、プローブは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１５０アミノ酸以上の部分または全長と７５％以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸の少なくとも20塩基以上、望ましくは40塩基以上、更に望ましくは100塩基以上、最も望ましくは200塩基以上の部分または全体を含むものが挙げられる。
次いで、標識したプローブにストリンジェントな条件でハイブリダイズするクローンを上記ライブラリーから選択する。ハイブリダイゼーションは、プラスミドライブラリーならコロニーハイブリダイゼーションによって、ファージライブラリーならプラークハイブリダイゼーションによって行うことができる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることが出来る。このような最適化は、本技術分野の研究者が容易に行いうるものである。
【０００８】
このようにして得られたDNAがアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質をコードしていることは、後述のように、適当なベクターに組み込み、適当な宿主を形質転換し、形質転換体を培養してアミノペプチダーゼ活性を測定することにより確認することができる。
【０００９】
２．組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、本発明のアミノペプチダーゼ遺伝子を適当なベクター上に連結することにより得ることができる。ベクターとしては、形質転換する宿主中でアミノペプチダーゼを生産させうるものであればどのようなものでも用いることが出来る。例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、染色体組み込み型、人工染色体などのベクターを用いることができる。
上記ベクターには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、niaDのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子や、アンピシリンやカナマイシン、オリゴマイシンなどの薬剤に対する抵抗遺伝子などが上げられる。また、組換えベクターは、宿主細胞中で本発明の遺伝子を発現することの出来るプロモーター又はその他の制御配列（例えばエンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、amyBプロモーター、lacプロモーター等が挙げられる。
【００１０】
３．形質転換体の取得
本発明の形質転換体は、宿主を、本発明の組換えベクターで形質転換することにより得られる。宿主としては、本発明のアミノペプチダーゼを生産することが出来るものであれば特に限定されず、例えば、サッカロミセス・セルビシエ、チゴサッカロミセス・ルキシー等の酵母、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・オリゼー、アスペルギルス・ニガー等の糸状菌、エシェリヒア・コリ、バチルス・ズブチルス等の細菌であってもよい。形質転換は、宿主に応じて公知の方法で行うことが出来る。酵母の場合は、例えば、酢酸リチウムを用いる、Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995)の方法などを用いることができる。糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト化した後ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いる、Mol. Gen. Genet., 218, 99-104(1989)の方法を用いることが出来る。細菌を用いる場合は例えば、エレクトロポレーションによる、Methods Enzymol., 194, 182-187(1990)の方法などを用いることができる。
【００１１】
４．アミノペプチダーゼの製造
本発明のアミノペプチダーゼの製造法は、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からアミノペプチダーゼ蛋白質を採取することからなる。培地及び培養方法は、宿主の種類と組換えベクター中の発現制御配列によって適当なものを選ぶ。例えば、宿主がサッカロミセス・セルビシエであり、発現制御配列がGAL1プロモーターである場合、例えば、ラフィノースを炭素源とする液体最少培地で前培養した菌体を、ガラクトースとラフィノースを炭素源とする液体最少培地に希釈・接種し、培養することにより、本発明のアミノペプチダーゼを生産させることができる。また、例えば、宿主がアスペルギルス・ソーヤであり、発現制御配列がamyBプロモーターである場合、例えば、マルトースを炭素源とする液体最少培地で培養することにより、本発明のアミノペプチダーゼを生産させることができる。
また、例えば、宿主が大腸菌であり、発現制御配列がlacプロモーターである場合、IPTGを含有する液体培地で培養することにより本発明のアミノペプチダーゼを生産させることができる。本発明のアミノペプチダーゼが菌体内または菌体表面に生産された場合は、菌体を培地から分離し、その菌体を適当に処理することにより本発明のアミノペプチダーゼを得ることができる。例えば、サッカロミセス・セルビシエの菌体表面に生産された場合、菌体そのものを酵素剤として用いることもできるが、破砕した後、Triton X-100, Tween-20, Nonidet P-40等の非イオン性の界面活性剤を低濃度で作用させ、遠心分離した上清に本発明のアミノペプチダーゼを回収することができる。培養液中に本発明のアミノペプチダーゼが生産された場合は、遠心分離・ろ過等により菌体を除去することにより本発明のアミノペプチダーゼを得ることができる。何れの場合も、硫安分画、各種クロマトグラフィー、アルコール沈殿、限外ろ過等を用いた常法により、本発明のプロテアーゼを更に純度の高いものとして得ることもできる。
【００１２】
本発明のアミノペプチダーゼの活性は、次の方法で測定できる。
【００１３】
基質溶液としては、0.1mmolのL-ロイシン-p-ニトロアニリドを5mlのエタノールに溶解させ、10mlの500mMトリスバッファー（pH8.5）と85mlの蒸留水を加えたものを用いる。２本のサンプルチューブの一方(A)に30μlの酵素液を入れた後、両方のサンプルチューブに300μlの上記基質溶液を加え、37℃で10分から30分間保温する。両方のサンプルチューブに100μlの0.1N塩酸を加えて反応を停止し、撹拌し、最初に酵素液を入れなかったほうのサンプルチューブ(B)に30μl の酵素液を加えて更に攪拌する。400nmにおける吸光度を測定する。(A)の吸光度から(B)の吸光度を減じたものをΔODとし、反応時間をT(分)とすると、活性は以下の式で表される。
活性(単位/ml)＝(ΔOD×0.69×1000)／(30×T)
【００１４】
【実施例】
以下に実施例を示し、本説明をより具体的に説明するが、本説明はこれらによって制限されるものではない。
１．アスペルギルス・ソーヤのアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・ソーヤATCC42251株の分生子約100,000個を150ml容の三角フラスコに入った50mlのプロテアーゼ生産培地（前述）に接種し、30℃で、30時間振盪培養（130rpm、回転振盪）した。培養液から菌体をろ過により回収し、滅菌蒸留水で洗浄し、ペーパータオルに挟んで水分を除去した。あらかじめ液体窒素を注いで冷却してある乳鉢に菌体を入れ、液体窒素を追加した後、液体窒素で冷却してある乳棒を用いて念入りに粉砕した。粉砕された菌体から、SepaGene（三光純薬製）を用いて全RNAを抽出した。更に、DNA-freeキット（Amibion製）を用いてDNase I処理を行い、混入していたDNAを分解した。得られた全RNA0.5ugを鋳型として、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を用いてRT-PCRを行った。
【００１５】
逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側は開始コドンの直前から、3'側はポリA部分から増幅した。
【００１６】
LNECO: 5'-GTG TCA ATT TCT TCG AAT TCA CGA TG-3' （配列番号5）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、56℃20秒、72℃1分20秒を15サイクル行い、72℃5分を行った。なお、サーマルサイクラーとしては、DNA Engine PCT-200（MJ Research製）を用い、温度コントロール法はカリキュレートコントロールによった（以下のPCRでも同様）。
続いて、上記RT-PCRの増幅産物を鋳型として、上記LNECO及び下記のプライマーを用いて、PCRを行った。耐熱性 DNAポリメラーゼとしては、Tbr EXT DNA Polymerase（Fynnzymes製）を用い、反応液の組成はポリメラーゼに添付の説明書に従った。
LCKP2: 5'-AAT TTT CTA AGG GTA CCG CAC TCA TTG G-3' （配列番号6）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、56℃20秒、72℃1分20秒を30サイクル行い、72℃5分を行った。増幅産物の一部を0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、約1.3kbのバンドが確認された。
次いで、TOPO TA Cloning Kit with TOP10 Cell（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10株を形質転換し、形質転換体14クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、14クローン中12クローンで約1.3kbの断片が確認され、この12クローンについて塩基配列を決定した。
塩基配列の決定は、試薬としてThermo Sequenase Primer Cycle Sequencing Kit 7-deaza dGTP（アマシャム ファルマシア バイオテク製）を用い、シークエンサーとしてはDNA Sequencer Model 4200（LI-COR製）を用いて、サンガー法により行った（以後同様）。得られた12クローンの塩基配列を比較したところ、うち2クローンはPCRによる変異を含まないことが分かった。この、変異を含まないクローンのプラスミド「pSLCEK7」は、産業技術総合研究所に受託番号ＦＥＲＭＰ−１８３０７として寄託されている。また、pSLCEK7に含まれるクローンの開始コドンから終止コドンまでの塩基配列を配列番号１に記載する。
上記塩基配列を解析したところ、このDNAは、387アミノ酸からなる蛋白質をコードしていることが分かった。このアミノ酸配列は配列番号2に記載する。さらに、このアミノ酸配列を公知のアミノ酸配列データベースに対して相同性検索した。相同性検索には、NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、pat(patent)及びswissprotを指定した。その結果、一致する配列は無く、最も高い相同性を示したのは、米国特許US5,994,113に記載されたアスペルギルス・オリゼー由来のアミノペプチダーゼ遺伝子であり、配列番号2の36番から385番に対して、55%一致であった。次いで高い相同性を示したのは、WO9704108記載のアスペルギルス・ソーヤ由来のロイシンアミノペプチダーゼであり、配列番号2の36番から385番に対して54%一致であった。これらの結果から、配列番号1に記載のDNAによりコードされた、配列番号2に記載のアミノ酸配列の蛋白質は、新規の配列を持つことが分かり、また、アミノペプチダーゼ活性を有することが推測された。
また、配列番号１の塩基配列について相同性検索した。相同性検索には、NCBI BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)を用い、データベースとしては、nrを指定した。その結果、748塩基中99%, 231塩基中100%, 184塩基中100%一致の部分を含む塩基配列（ID N0. APU52151）が登録されていた。ID N0. APU52151に付与されている情報には、アスペルギルス・パラスティカス由来のポリケタイド合成酵素遺伝子を含むとの記述があるのみであり、それ以外の部分にアミノペプチダーゼをコードする遺伝子を含むことを示唆するような記載はない。また、この配列はゲノムDNAの塩基配列であり、実際に蛋白質をコードしている部分がどこであるかが明らかでない上、コード領域が予測できたとしても、コードされている可能性のある蛋白質の機能は明らかでなかった。本発明により、配列番号1がアミノペプチダーゼ遺伝子であることが、初めて明らかにされたのである。
【００１７】
２．アミノペプチダーゼ遺伝子組換えベクターの作製
pSLCEK7上のアミノペプチダーゼ遺伝子を、サッカロミセス・セルビシエ用の発現ベクターpYES2（Invitrogen製）上にサブクローニングした。具体的には、以下の方法で行った。まず、pSLCEK7を制限酵素EcoRI （宝酒造製）で切断し、DNA Blunting Kit（宝酒造）で末端を平滑化した後、さらに制限酵素KpnIで切断した。これをアガロースゲルで電気泳動し、アミノペプチダーゼ遺伝子を含む約1.3kbのバンドを切り出した。切り出されたバンドから、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン製）を用いてDNA断片を抽出した。一方、pYES2を制限酵素HindIIIで切断し、DNA Blunting Kit（宝酒造）で末端を平滑化した後、さらに制限酵素KpnIで切断した。これをアガロースゲルで電気泳動し、ベクター部分を含む約5.9kbのバンドを切り出した。切り出されたバンドから、QIAquick Gel Extraction Kit（キアゲン製）を用いてDNA断片を抽出した。上記2種類のDNAを混合し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造製）を用いて16℃ 1時間でライゲーションした。ライゲーション産物で、 XL1-Blue Competent ells（STRATA GENE製）を形質転換し、形質転換体を6クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出・精製した。全てのクローンはアガロース電気泳動で同じ移動度を示したため、そのうちの１つのpYSL1を代表として使用することにした。pYSL1は、大腸菌での自律複製領域及びアンピシリン耐性遺伝子のほか、サッカロミセス・セルビシエ内での自律複製領域及びURA3遺伝子を持ち、GAL1プロモーターとCYC1ターミネーターの間にアミノペプチダーゼ遺伝子が挿入された構造を持つ。従って、サッカロミセス・セルビシエ細胞内でガラクトースによりアミノペプチダーゼを誘導生産することが可能となる。
３．形質転換体の取得
酢酸リチウムを用いる形質転換法（前述）により、ウラシル要求性ura3-52変異を持つINVSc1株をpYSL1で形質転換し、ウラシルを含まない最少寒天培地上で選択することにより、形質転換体INVSc1/pYSL1株を得た。また、ネガティブコントロールとして、同様にINVSc1をpYES2ベクタープラスミドで形質転換したINVSc1/pYES2株を得た。
４．アミノペプチダーゼの製造
INVSc1/pYSL1株及び、ネガティブコントロールのINVSc1/pYES2株を培養し、アミノペプチダーゼを得た。まず、それぞれの株のコロニーを2%ラフィノースを含みウラシルを含まない15mlのSC培地（最少培地）に接種し、30℃で一晩振盪培養した。それぞれの一晩培養液の600nmにおけるODを測定し、50mlの誘導培地に接種したときにODが0.4になる量の培養液を滅菌遠沈管にとり、遠心分離により上清を除いた。得られた、それぞれの菌体を2%ガラクトースと1%ガラクトースを含みウラシルを含まない50mlのSC培地（誘導培地）に懸濁し、30℃で10時間振盪培養した。培養終了後、600nmにおけるODを測定し、培養液を遠沈管に移し、遠心分離により培養上清と菌体に分けた。培養上清は、300μlずつに分け、-80℃に保存した。菌体は、500μlの滅菌蒸留水に懸濁し、微量遠沈管に移し、再び遠心分離し、上清を除去した。菌体に、50mM HEPES(pH7.0)（以後HEPESバッファーとする）を、ODが50になるように加えて懸濁し、300μlずつに分けて、更に遠心分離し、上清を除去した後、-80℃で保存した。
【００１８】
培養上清と菌体（HEPESバッファー300μlに再懸濁したもの）についてアミノペプチダーゼ活性を測定した（表1）ところ、菌体に活性が認められ、INVSc1/pYSL1株では、コントロールのINVSc1/pYES2と比べて約3倍の活性を示した。菌体懸濁液のアミノペプチダーゼ活性（mU/ml）を表１に示す。
【００１９】
【表１】
次いで、微量遠沈管に入った凍結菌体をHEPESバッファー300μlに再懸濁したものに0.35gのガラスビーズを加え、マルチビーズショッカーMB-200（安井機械製）で最高速で3分×5回処理し、菌体を破砕した。破砕液をピペットでガラスビーズと分け、新しい微量遠沈管に移し、700×gで2分間遠心分離した。沈殿は300μlのHEPESバッファーで洗浄後、再び300μlのHEPESバッファーに懸濁して、(P)画分とした。上清は新しい微量遠沈管に移し、20,000×gで30分間遠心分離し、上清を(S)画分とした。沈殿は、300μlのHEPESバッファーで洗浄後、50μlのHEPESバッファーに懸濁して3μlの10% Triton X-100を加え、5℃で30分間緩やかに浸透した後、50℃の温水上に2分間置いた。さらに、250μlのHEPESバッファーを加え、20,000×gで30分管遠心分離した。上清は(T)画分とし、沈殿は300μlのHEPESバッファーで洗浄後、再び300μlのHEPESバッファーに懸濁して、(M)画分とした。
それぞれの画分についてアミノペプチダーゼ活性を測定したところ（表2）、全ての画分で、INVSc1/pYSL1株では、コントロールのINVSc1/pYES2株と比べて高い活性が認められた。 (S)画分では、コントロールのINVSc1/pYES2株においても活性が見られたが、この活性は宿主であるサッカロミセス・セルビシエINVSc1株のネイティブな菌体内アミノペプチダーゼに由来するものであると考えられる。したがって、INVSc1/pYSL1株の生産するアミノペプチダーゼのうち、各画分のINVSc1/pYES2株の活性を除いた部分はpYSL1中の配列番号1記載のDNAに由来するものであることが分かった。各画分のアミノペプチダーゼ活性（mU/ml）を表２に示す。
【００２１】
【表２】
以上により、配列番号1記載のDNAを組込んだ組換えベクターにより形質転換された形質転換体によりアミノペプチダーゼを製造することができた。
また、配列番号1記載の塩基配列によりコードされる配列番号2記載のアミノ酸配列を含む蛋白質がアミノペプチダーゼ活性を有することも明らかになった。
５．アスペルギルス・オリゼーのアミノペプチダーゼ遺伝子のクローニング
アスペルギルス・オリゼーRIB40株を培養し、全RNAを抽出した。培地、培養時間、抽出法は、前述の１．の方法と同様である。得られた全RNAを用いて、5'-RACE及び3'-RACEを行い、アミノペプチダーゼ遺伝子の塩基配列を決定した。
【００２３】
5'-RACEは、FirstChoice RLM-RACE Kit（Ambion製）を用いて、キットに付属の説明書に従って行った。すなわち、アルカリフォスファターゼ処理、タバコ酸性ピロフォスファターゼ処理、RNAアダプターライゲーション、逆転写反応を行い、遺伝子特異的プライマーとキットに付属のアダプタープライマーを用いたPCRを2段階で行った。遺伝子特異的プライマーとしては、次の2種を順次使用した。
L5OUT: 5'-TCA TGA TAC CCA CGG CTT CTT TAC-3' （配列番号7）
L5IN: 5'-CGC GTC TTT CTT GCT TGT ATT GAG-3' （配列番号8）
1段目のPCRの温度コントロール条件は、94℃2分の後、94℃10秒、65℃15秒、72℃1分20秒を30サイクル行い、72℃7分で完了であった。2段目のPCRの温度コントロール条件は、94℃2分の後、94℃10秒、72℃1分25秒を27サイクル行い、72℃10分で完了であった。
PCRには、ExTaq DNA polymerase（宝酒造）を使用した。
2段目のPCRにより、約1kbのDNA断片が増幅された。TOPO TA Cloning Kit with TOP10 Cell（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10株を形質転換し、形質転換体6クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、全てのクローンで約1.0kbの断片が確認され、この6クローンについて塩基配列を決定した。
3' RACEは、RNA LA-PCRキット（宝酒造製）を用いて行った。逆転写反応のプライマーはオリゴdTの3'側にアダプター配列の付いた、キットに付属のものを用い、30℃10分、50℃30分、99℃5分、5℃5分で行った。
【００２４】
次いで、上記逆転写反応産物に、キットに添付の説明書にしたがい、プライマー、耐熱性ポリメラーゼ等を加え、PCRを行った。プライマーとしては、キットに付属のアダプタープライマー及び下記のものを用いて、5'側はアミノペプチダーゼ遺伝子内から、3'側はポリA部分から増幅した。
LB3GS: 5'-CCA CCA AGA CAG TAT CAA CTT GT-3' （配列番号9）
PCR反応は、94℃2分の後、94℃10秒、58℃15秒、72℃1分を33サイクル行い、72℃5分を行った。
【００２５】
上記反応により、約0.8kbのDNA断片が増幅された。TOPO TA Cloning Kit with TOP10 Cell（Invitrogen製）を用いて、上記増幅産物をpCR2.1-TOPOベクター上に組み込み、大腸菌TOP10株を形質転換し、形質転換体7クローンを得た。各形質転換体よりプラスミドを抽出し、制限酵素EcoRI（宝酒造製）で切断し、0.7%アガロースゲルで電気泳動したところ、6クローンで約0.8kbの断片が確認され、この6クローンについて塩基配列を決定した。
【００２６】
5' RACEで得られたクローンの塩基配列と、3' RACEで得られたクローンの塩基配列について、クローン間の塩基配列の比較からPCR変異を修正したのち、5'側と3'側の塩基配列を結合することにより、配列番号3に記載のアスペルギルス・オリゼーのアミノペプチダーゼ遺伝子の全長配列を得た。この配列は、配列番号1に記載のアスペルギルス・ソーヤのアミノペプチダーゼ遺伝子に対して96.9%の相同性を示した。また、配列番号3に記載の塩基配列は、塩基配列4に記載したアミノ酸配列の蛋白質をコードしており、これは、配列番号2に記載のアミノペプチダーゼと、99%の相同性を示した。従って得られた遺伝子は、アスペルギルス・オリゼーのアミノペプチダーゼ遺伝子であることが分かった。
【００２７】
【発明の効果】
本発明により、新規なアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び形質転換体が提供された。また、本発明によりアミノペプチダーゼの製造方法が提供された。
本発明により、上記アミノペプチダーゼの蛋白質工学的な改良が行えるようになった。本発明はまた、蛋白質加水分解による調味料生産の生産性と品質の向上のためにも有用である。
【００２８】
【配列表】
Claims (6)
- 以下の(a) 又は (b) の蛋白質。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質 - 以下の(a) 又は (b) の蛋白質をコードするアミノペプチダーゼ遺伝子。
(a) 配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む蛋白質
(b) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつアミノペプチダーゼ活性を有する蛋白質 - 配列番号１で表される塩基配列を含む DNA を含むアミノペプチダーゼ遺伝子。
- 請求項２又は３に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からアミノペプチダーゼ蛋白質を採取することを特徴とするアミノペプチダーゼの製造方法。
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