CN112457355A - 糖核苷酸分离纯化方法 - Google Patents
糖核苷酸分离纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112457355A CN112457355A CN202011312641.2A CN202011312641A CN112457355A CN 112457355 A CN112457355 A CN 112457355A CN 202011312641 A CN202011312641 A CN 202011312641A CN 112457355 A CN112457355 A CN 112457355A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- sugar nucleotide
- sugar
- separating
- purifying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 12
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims abstract description 7
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-glucosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-CFRASDGPSA-N 0.000 claims description 24
- LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N UNPD164450 Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(NC(=O)C)C1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 9
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims description 5
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 abstract 1
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N p-methoxybenzaldehyde Chemical group COC1=CC=C(C=O)C=C1 ZRSNZINYAWTAHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- -1 nucleoside diphosphate Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N Uridine-5'-Diphosphate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 XCCTYIAWTASOJW-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N aldehydo-D-galacturonic acid Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-RSJOWCBRSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N GDP Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O QGWNDRXFNXRZMB-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- MVMSCBBUIHUTGJ-LRJDVEEWSA-N GDP-alpha-D-glucose Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=C(NC(=O)C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O MVMSCBBUIHUTGJ-LRJDVEEWSA-N 0.000 description 1
- 101000662009 Homo sapiens UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N N-acetyl-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-RTRLPJTCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 102100037921 UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Human genes 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N guanidine diphosphate Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O QGWNDRXFNXRZMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 229960002337 magnesium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
- C07H1/06—Separation; Purification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/305—Pyrimidine nucleotides
Abstract
本发明涉及一种糖核苷酸分离纯化方法，包括如下步骤：制备糖核苷酸样品，利用离子交换树脂柱层析和梯度洗脱所述糖核苷酸样品，得洗脱样品；采用卷式膜分离系统对所述洗脱样品脱盐，浓缩，即得。本发明糖核苷酸分离纯化方法将柱层析与卷式膜分离系统联合使用纯化糖核苷酸，不仅利用离子柱层析在工业纯化上的优势，同时再结合利用卷式膜分离系统处理柱层析纯化后的样品，整体上达到高效且高品质的优势。
Description
技术领域
本发明涉及分离纯化技术领域，尤其涉及一种糖核苷酸分离纯化方法。
背景技术
糖核苷酸是核苷二磷酸糖(nucleo-side diphosphate sugar)的简称，为单糖或糖醛酸的半缩醛羟基与核苷二磷酸的末端磷酸基之间去水缩合而成的化合物。许多如葡萄糖、半乳糖、半乳糖醛酸的单糖或糖醛酸可与如尿苷二磷酸、腺苷二磷酸、鸟苷二磷酸等结合成相应的糖核苷酸，例如尿苷二磷酸葡萄糖、腺苷二磷酸葡萄糖、鸟苷二磷酸葡萄糖、尿苷二磷酸半乳糖、尿苷二磷酸半乳糖醛酸等核苷二磷酸等。糖核苷酸是单糖的一种活化形式，在寡糖和多糖的合成中作为糖基供体，或参与单糖的相互转化。
糖核苷酸是酶催化合成多糖的基础活性单元。目前，如UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)等糖核苷酸的工业化合成技术正在快速发展，但是并没有形成针对糖核苷酸的工业化纯化方案。
发明内容
基于此，有必要提供一种糖核苷酸分离纯化方法，便于实现工业化放大纯化，且能够使产品纯度达到95％。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种糖核苷酸分离纯化方法，包括如下步骤：
制备糖核苷酸样品；
利用离子交换树脂柱层析，梯度洗脱所述糖核苷酸样品，得洗脱样品；
采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品，即得。
在其中一些实施例中，所述糖核苷酸样品为UDP-GlcNAc样品溶液。
优选地，所述UDP-GlcNAc样品溶液的制备步骤为：将GlcNAc、ATP、UTP、氯化镁溶解到水中，调节pH值至8～9之间，再加入酶NahK和AgX1，置于37±1℃条件下反应，采用TLC监测反应终点，得UDP-GlcNAc反应产物液。
其中，采用TLC监测反应终点所采用的展开剂为体积比50:33:17的乙酸乙酯、甲醇和水，染色剂为茴香醛溶液。
进一步地，所述UDP-GlcNAc样品溶液的制备步骤还包括采用醇沉淀所述UDP-GlcNAc反应产物液去除蛋白、再减压蒸馏浓缩样品的步骤。
优选地，所述离子交换树脂柱层析采用HZ201阴离子交换树脂作为填料。
优选地，所述梯度洗脱的工艺步骤为：将糖核苷酸样品上样于预处理后的层析柱，依次水洗、3～7g/L氯化钠水溶液、8～11g/L氯化钠水溶液、12～17g/L氯化钠水溶液以及30～60g/L氯化钠水溶液洗脱。
进一步地，所述的糖核苷酸分离纯化方法还包括采用紫外分光光度计监测洗脱溶液中目标成分的步骤。
在其中一些实施例中，采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品的工艺参数为：室温，水洗至电导率低于100μS/cm。
进一步地，采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品的步骤之后，还包括冻干糖核苷酸纯化样品的步骤。
由上述任一项所述的糖核苷酸分离纯化方法制备而成的糖核苷酸。
本发明的有益效果是：
本发明糖核苷酸分离纯化方法将离子柱层析与卷式膜分离系统联合使用纯化UDP-GlcNAc等糖核苷酸，不仅发展利用离子柱层析纯化在纯化工业上的优势，再集合卷式膜分离系统处理离子柱纯化后的洗脱样品，能够同时满足过滤、脱色、脱盐、提纯和浓缩，高效，保证糖核苷酸生产的高质量，能够使产品纯度达到95％。
附图说明
图1为染色法检测UDP-GlcNAc的检测图；其中(a)、(b)、(c)、(d)中的编号1-20分别对应用5g/LNaCl溶液洗脱时目标成分检测图。
图2是实施例1的标准曲线图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明提供一种糖核苷酸分离纯化方法，包括如下步骤：
S1，制备糖核苷酸样品。
S2，利用离子交换树脂柱层析，梯度洗脱所述糖核苷酸样品，得洗脱样品。优选采用不同浓度的氯化钠溶液梯度洗脱糖核苷酸样品。
S3，采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品，即得。
本发明的糖核苷酸分离纯化方法将离子柱层析与卷式膜分离系统联合，可以纯化UDP-GlcNAc等糖核苷酸，能够同时满足过滤、脱色、脱盐、提纯和浓缩，高效，保证糖核苷酸生产的高质量，能够使产品纯度达到95％。
下面举例说明。
实施例1
本实施例提供UDP-GlcNAc样品的分离纯化方法，包括如下步骤：
S1，制备UDP-GlcNAc样品溶液。
(1)上罐反应制备UDP-GlcNAc反应产物粗溶液：
按照下表1中的原料用量，取一个用去离子水洗净的2L烧杯，向H2O中加入MgCl2(六水合氯化镁)、ATP、UTP和GalNAc；将pH值调至8～9之间，上罐(生物反应器)后添加NahK、AGX1上罐混合：
表1原料用量表
(2)反应监测：
采用TLC板检测，展开剂为体积比50:33:17的乙酸乙酯、甲醇和水的混合物，染色剂是茴香醛溶液，底物点消失为反应终点，得UDP-GlcNAc反应溶液。
(3)浓缩：
添加与UDP-GlcNAc反应溶液同体积的无水乙醇，低温过夜，醇沉，使体系中的蛋白沉降出来。
再采用7000r/min的转速下离心10min，取上清液进行减压蒸馏，旋蒸使其终浓度在150mM左右，4℃存放待下一步纯化的UDP-GlcNAc样品溶液(糖核苷酸样品)。
S2，利用离子交换树脂柱层析，梯度洗脱步骤S1制备的糖核苷酸样品，获得洗脱样品。
具体步骤如下：
(1)采用填料为HZ201阴离子交换树脂400mL，装柱。
(2)预处理层析柱：依次用RO水洗柱洗脱4L，用2L、1MHCl溶液洗柱，用RO水洗至pH中性(约3～4L)，用2L、1MNaOH洗柱，用RO水洗柱至pH中性(约3～4L)，用2L、20g/LNaCl溶液洗柱，用RO水洗柱洗至pH中性(约3～4L)，得预处理层析柱。
(3)将48mL糖核苷酸样品溶液上样，静置30min，上样样品量约含5g UDP-GlcNAc。
(4)梯度洗脱：用2L水洗柱，收集前500mL有过载样品；用5g/LNaCl溶液洗脱8L，共400mL×20瓶，第1瓶没有，收集2～20瓶；用10g/LNaCl溶液洗脱，洗脱液4L全部回收再纯；用15g/LNaCl溶液洗脱，收集洗脱液2L，杂质较多，舍弃；用50g/LNaCl溶液洗脱，洗4L，冲出所有残留。
在该步骤(4)中通过染色法监测各瓶中目标成分的含量情况。其中，水洗流川及用5g/LNaCl溶液洗脱的洗脱液收集瓶(1-20瓶)中目标成分监测结果图如图1所示。
在步骤(4)通过用紫外分光光度计定出UDP-GlcNAc在254nm下的浓度与吸光值的关系，换算得如图2所示的标准曲线，最后测试算出离子柱纯化后UDP-GlcNAc含量。
S3，采用卷式膜分离系统处理洗脱样品，工艺参数条件为：室温，水洗至电导率低于100μS/cm，制备纯化浓缩液。
S4，将步骤S3制备的纯化浓缩液冻干，得糖核苷酸纯化样品。
经检测，本实施例获得的糖核苷酸纯化样品中UDP-GlcNAc的纯度为96％。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备糖核苷酸样品；
利用离子交换树脂柱层析，梯度洗脱所述糖核苷酸样品，得洗脱样品；
采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品，即得。
2.根据权利要求1所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，所述糖核苷酸样品为UDP-GlcNAc样品溶液。
3.根据权利要求2所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，所述UDP-GlcNAc样品溶液的制备步骤为：将GlcNac、ATP、UTP、氯化镁溶解到水中，调节pH值至8～9之间，再加入酶NahK和AgX1，置于37±1℃条件下反应，采用TLC监测反应终点，得UDP-GlcNAc反应产物液。
4.根据权利要求3所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，还包括采用醇沉淀所述UDP-GlcNAc反应产物液去除蛋白、再减压蒸馏浓缩样品的步骤。
5.根据权利要求2至4任一项所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，所述离子交换树脂柱层析采用HZ201阴离子交换树脂作为填料。
6.根据权利要求5所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，所述梯度洗脱的工艺步骤为：将所述糖核苷酸样品溶液上样于预处理后的层析柱，依次水洗、3～7g/L氯化钠水溶液、8～11g/L氯化钠水溶液、12～17g/L氯化钠水溶液以及30～60g/L氯化钠水溶液进行梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，还包括采用紫外分光光度计监测洗脱溶液中目标成分的步骤。
8.根据权利要求1至4任一项所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品的工艺参数为：室温，水洗至电导率低于100μS/cm。
9.根据权利要求1至4任一项所述的糖核苷酸分离纯化方法，其特征在于，在采用卷式膜分离系统处理所述洗脱样品的步骤之后，还包括冻干糖核苷酸纯化样品的步骤。
10.由权利要求1至9任一项所述的糖核苷酸分离纯化方法制备而成的糖核苷酸产品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011312641.2A CN112457355B (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 糖核苷酸分离纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011312641.2A CN112457355B (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 糖核苷酸分离纯化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112457355A true CN112457355A (zh) | 2021-03-09 |
| CN112457355B CN112457355B (zh) | 2022-06-07 |
Family
ID=74799017
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011312641.2A Active CN112457355B (zh) | 2020-11-20 | 2020-11-20 | 糖核苷酸分离纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112457355B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113842671A (zh) * | 2021-09-24 | 2021-12-28 | 上海蔚之星生物科技有限公司 | 基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统 |
| CN114703242A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-07-05 | 山东大学 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法 |
| WO2023115798A1 (zh) * | 2021-12-20 | 2023-06-29 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种由UDP-GlcNAc合成稀有糖核苷酸的方法 |
| CN114703242B (zh) * | 2022-04-21 | 2024-05-14 | 华熙唐安生物科技(山东)有限公司 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1242776A (zh) * | 1996-10-10 | 2000-01-26 | 尼澳斯技术股份有限公司 | 用超滤、反渗透和纳滤纯化糖类 |
| CN101778859A (zh) * | 2007-06-12 | 2010-07-14 | 诺和诺德公司 | 改良的用于生产核苷酸糖的方法 |
| US7901912B1 (en) * | 2004-10-21 | 2011-03-08 | Yamasa Corporation | Method of producing uridine 5′-diphospho-N-acetylgalactosamine |
| CN102409070A (zh) * | 2011-09-15 | 2012-04-11 | 山东大学 | 一种稀少糖核苷酸的制备方法 |
| CN102443597A (zh) * | 2010-10-15 | 2012-05-09 | 天津赛科瑞德生物科技有限公司 | 糖核苷酸的酶法制备 |
| WO2015117812A1 (en) * | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Methods for producing nucleotide-activated sugars and recombinant microorganism host cells used therefor |
| CN111676259A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-09-18 | 山东大学 | 一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法 |
-
2020
- 2020-11-20 CN CN202011312641.2A patent/CN112457355B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1242776A (zh) * | 1996-10-10 | 2000-01-26 | 尼澳斯技术股份有限公司 | 用超滤、反渗透和纳滤纯化糖类 |
| US7901912B1 (en) * | 2004-10-21 | 2011-03-08 | Yamasa Corporation | Method of producing uridine 5′-diphospho-N-acetylgalactosamine |
| CN101778859A (zh) * | 2007-06-12 | 2010-07-14 | 诺和诺德公司 | 改良的用于生产核苷酸糖的方法 |
| CN102443597A (zh) * | 2010-10-15 | 2012-05-09 | 天津赛科瑞德生物科技有限公司 | 糖核苷酸的酶法制备 |
| CN102409070A (zh) * | 2011-09-15 | 2012-04-11 | 山东大学 | 一种稀少糖核苷酸的制备方法 |
| WO2015117812A1 (en) * | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Methods for producing nucleotide-activated sugars and recombinant microorganism host cells used therefor |
| CN111676259A (zh) * | 2020-07-10 | 2020-09-18 | 山东大学 | 一种糖核苷酸及其衍生物的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MOLNAR, J.，ET AL: "The biosynthesis of glycoproteins. III. Glucosamine intermediates in plasma glycoprotein synthesis in livers of puromycintreated rats", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
| 关婉怡: "N-乙酰氨基葡萄糖/半乳糖核苷酸及类似物的酶法合成与应用研究", 《山东大学博士学位论文》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113842671A (zh) * | 2021-09-24 | 2021-12-28 | 上海蔚之星生物科技有限公司 | 基于智能控制的NTP/dNTP层析分离方法及系统 |
| WO2023115798A1 (zh) * | 2021-12-20 | 2023-06-29 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种由UDP-GlcNAc合成稀有糖核苷酸的方法 |
| CN114703242A (zh) * | 2022-04-21 | 2022-07-05 | 山东大学 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法 |
| CN114703242B (zh) * | 2022-04-21 | 2024-05-14 | 华熙唐安生物科技(山东)有限公司 | 一种尿苷二磷酸-n-乙酰氨基葡萄糖及其衍生物的双酶共固定化合成方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112457355B (zh) | 2022-06-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112457355B (zh) | 糖核苷酸分离纯化方法 | |
| CN103059071B (zh) | 一种单糖的纳滤分离方法 | |
| CN107827943B (zh) | 一种从发酵液中提取胞嘧啶核苷的方法 | |
| US20230167474A1 (en) | Methods for enzymatic production of glucosamine salts and the purification methods thereof | |
| CN110128562B (zh) | 一种抗肿瘤补骨脂多糖及其提取分离方法和在制备抗肿瘤药物方面的应用 | |
| CN105175566B (zh) | 聚酰胺柱和大孔树脂柱联柱法去除西洋参多糖提取物中蛋白质和色素的方法 | |
| CN1962875B (zh) | 一种尿苷二磷酸的制备方法 | |
| CN111272895B (zh) | 一种海藻中氨基糖、中性糖和糖醛酸同时快速检测的方法 | |
| CN110642962B (zh) | 一种杂豆类果胶多糖的分离纯化方法 | |
| CN110330538B (zh) | 一种槐糖脂发酵液中异构产物的分离纯化方法 | |
| CN108949850B (zh) | 一种鼠李糖脂发酵液的在线分离及纯化方法 | |
| BR112021010429A2 (pt) | Método para separar um primeiro oligossacarídeo neutro hidrofílico de um segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico | |
| CN115073539B (zh) | 一种2’-岩藻糖基乳糖分离纯化的方法 | |
| KR100200547B1 (ko) | 다단계 분리막 공정을 이용한 저분자 키토산의 분리 및 정제방법 | |
| CN113603732B (zh) | 一种非动物源硫酸软骨素寡糖及其制备方法 | |
| CN107287263B (zh) | 一种高纯度麦芽糖联产β-极限糊精的制备方法 | |
| CN114262387B (zh) | 一种抗性糊精的制备方法 | |
| CN113912745A (zh) | 一种糖胺聚糖的分离纯化方法及硫酸化寡糖的制备方法 | |
| CN113754704A (zh) | 一种利用离子树脂高效制备葡萄糖粉的制备方法 | |
| CN114057907A (zh) | 一种红参多糖的提取和分离纯化方法 | |
| US20170002389A1 (en) | Method of preparing seaweed-derived galactose using agarase | |
| CN113173960A (zh) | 一种腺苷的纯化方法 | |
| JP3885912B2 (ja) | オリゴ糖の単離精製方法 | |
| CN113430238B (zh) | 一种添加蔗糖/低聚果糖生产抗性糊精的方法 | |
| CN103194509A (zh) | 一种高纯度β-极限糊精的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20221213 Address after: 518000 601, Building 5, Phase 1, Investment Promotion Smart City, Phoenix Community, Guangming District, Shenzhen, Guangdong Patentee after: Shenzhen Pengbo Biotechnology Co.,Ltd. Address before: Room 228, building C6, biological innovation park, 666 Gaoxin Avenue, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province, 430000 Patentee before: Wuhan Tangzhi Pharmaceutical Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231121 Address after: 430000 Wuhan Optics Valley Precision Medical Industry Base Phase I (all for self use), Building 3, 10th Floor, No. 9 Gaokeyuan 3rd Road, Donghu New Technology Development Zone, Wuhan City, Hubei Province (Wuhan Area, Free Trade Zone) Patentee after: Wuhan Tangzhi Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 518000 601, Building 5, Phase 1, Investment Promotion Smart City, Phoenix Community, Guangming District, Shenzhen, Guangdong Patentee before: Shenzhen Pengbo Biotechnology Co.,Ltd. |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Separation and purification methods of sugar nucleotides Granted publication date: 20220607 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: Wuhan Tangzhi Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2024980008902 |