BR112021010429A2

BR112021010429A2 - Método para separar um primeiro oligossacarídeo neutro hidrofílico de um segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico

Info

Publication number: BR112021010429A2
Application number: BR112021010429-1A
Authority: BR
Inventors: Nikolay Khanzhin; Markus Jondelius Hederos; Pierre Chassagne
Original assignee: Glycom A/S
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2021-08-24
Also published as: US20220056065A1; WO2020128945A1; PL3897902T3; PT3897902T; ES2966137T3; EP3897902A4; EP3897902A1; CN113226506B; KR20210105385A; JP7451840B2; EP3897902B1; DK3897902T3; CN113226506A; JP2022513615A

Abstract

MÉTODO PARA SEPARAR UM PRIMEIRO OLIGOSSACARÍDEO NEUTRO HIDROFÍLICO DE UM SEGUNDO OLIGOSSACARÍDEO NEUTRO HIDROFÍLICO..... A invenção se refere a um método para a separação de dois oligossacarídeos neutros hidrofílicos um do outro com uma cromatografia em um poliestireno funcionalizado com bromo reticulado com meio estacionário de divinilbenzeno (BPS-DVB).

Description

1 / 22

MÉTODO PARA SEPARAR UM PRIMEIRO OLIGOSSACARÍDEO NEUTRO HIDROFÍLICO DE UM SEGUNDO OLIGOSSACARÍDEO NEUTRO HIDROFÍLICO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a um método para a separação de dois oligossacarídeos neutros hidrofílicos um do outro, preferivelmente pelo menos dois oligossacarídeos neutros de leite humano (HMOs), produzidos a partir de um processo de fermentação ou enzimático. Em particular, um dos pelo menos dois oligossacarídeos neutros tem peso molecular maior que o outro, e eles mostram partição em um fase estacionária hidrofóbica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Nos últimos anos, cada vez mais esforços têm sido feitos para produzir carboidratos industrialmente complexos, tais como os oligossacarídeos secretados. Isso se deve ao papel desses compostos em vários processos biológicos em organismos vivos. Os oligossacarídeos secretados, tais como os oligossacarídeos de leite humano (HMOs), se tornaram alvos comerciais particularmente importantes para nutrição e aplicações terapêuticas. Os oligossacarídeos de leite humano se tornaram de grande interesse nos últimos anos devido às suas funções importantes no desenvolvimento humano. Até o momento, as estruturas de mais de 140 HMOs foram determinadas, e consideravelmente mais estão provavelmente presentes no leite humano (Urashima et al.: Milk Oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)).

[003] Buscam-se formas de baixo custo para a produção de quantidades industriais do maior número possível de HMOs, de forma que seus usos em formulações nutricionais e terapêutica para bebês, crianças e adultos possam ser estudados, desenvolvidos e explorados por pesquisadores

2 / 22 e empresas em todo o mundo. Atualmente, os HMOs têm sido produzidos enzimaticamente ou, principalmente, por fermentação usando organismos unicelulares transformados, particularmente E. coli. No entanto, esses métodos proveem o HMO de interesse acompanhado por outro oligossacarídeo/subprodutos do HMO. Normalmente, 2’-FL é principalmente acompanhado por DFL e/ou 3-FL (ver, por exemplo, os documentos EP-A- 2896628, WO 2015/032412, WO 2015/106943), caldos de fermentação de LNnT compreendem lacto-N-triose II (G1cNAcß1-3Galß1-4G1c) e oligossacarídeos superiores como pLNnH (Galß1-4G1cNAcß1-3Galß1- 4G1cNAcß1-3Galß1-4Glc) (ver, por exemplo, os documentos WO 01/04341, Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002), Gebus et al. Carbohydr. Res. 361, 83 (2012), WO 2017/182965) e LNT está contaminado por lacto-N-triose II e oligossacarídeos superiores como pLNH II (Galß1-3G1cNAcß1-3Galß1- 3G1cNAcß1-3Galß1-4Glc) (ver, por exemplo, os documentos WO 2015/049331, WO 2017/182965).

[004] O documento WO 2017/182965 propõe um processo para separar uma mistura de oligossacarídeos feita por fermentação a partir dos componentes não carboidratos de um caldo (tal como biomassa, ácidos, bases, sais orgânicos e inorgânicos, proteínas, fragmento de proteínas, DNA, endotoxinas, aminas biogênicas, corpos de coloração, etc.), o processo compreende ultrafiltração, nanofiltração e aplicação de resinas de troca iônica compreendendo um tratamento com uma resina de troca catiônica forte na forma H+ diretamente seguido por um tratamento com uma resina de troca aniônica fraca na forma de base livre. No entanto, esse método não separa os componentes do oligossacarídeo uns dos outros significativamente.

[005] O documento EP-A-2896628 descreve um processo para a purificação de 2’-FL do caldo de fermentação que compreende as seguintes etapas: ultrafiltração, tratamento com resina de troca catiônica forte na forma H+, neutralização, tratamento com resina de troca aniônica forte na forma CL-,

3 / 22 neutralização, nanofiltração/diafiltração, tratamento com carvão ativado, eletrodiálise, tratamento com resina de troca catiônica forte na forma Na+, tratamento com resina de troca aniônica forte na forma CL-, tratamento com carvão ativado e eletrodiálise, enfatizando que nenhuma cromatografia é empregada. Embora o método provê 2’-FL com uma pureza de 94 a 94,5% (por HPLC), a aplicação é silenciosa sobre se as quantidades dos principais contaminantes de carboidratos (tais como 3-FL, DFL e lactose) presentes no produto final em ≈ 5% são reduzidas pelo processo.

[006] Separar oligossacarídeos estruturalmente próximos uns dos outros é uma tarefa difícil devido às suas propriedades muito similares. A filtração em gel é certamente uma opção (ver, por exemplo, Priem et al. Glycobiology 12, 235 (2002)), no entanto, ela é considerada um método de laboratório em vez de um processo industrialmente lucrativo.

[007] O documento WO 2015/049331 descreve um método para a purificação de LNT do caldo de fermentação que compreende a seguinte sequência de operações: prover uma solução clara sem partículas, eletrodiálise/nanofiltração, primeiro leito móvel simulado (SMB), cromatografia em resina de troca catiônica forte, eletrodiálise, ultrafiltração. Usando certos parâmetros de SMB, o LNT e os oligossacarídeos neutros maiores são fracionados no rafinado, enquanto que os carboidratos menores (lactose, monossacarídeos) são enriquecidos na fração do extrato. Para purificar ainda mais o LNT dos oligossacarídeos superiores, uma segunda cromatografia em SMB é realizada com parâmetros diferentes, resultando no enriquecimento do LNT na fração do extrato.

[008] No entanto, procedimentos alternativos, mais eficazes, robustos e/ou econômicos adequados para a escalada industrial, para isolar e purificar LNT, LNnT e outros HMOs neutros de subprodutos de carboidratos inerentes que muitas vezes são feitos no processo de fermentação, ainda são necessários.

4 / 22

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] De acordo com a presente invenção, um método é provido para separar um primeiro oligossacarídeo neutro hidrofílico de um segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico em um meio aquoso, que compreende o tratamento do meio aquoso por cromatografia usando uma fase estacionária hidrofóbica que é um poliestireno reticulado com divinilbenzeno (PS-DVB) e funcionalizado com bromo no anel aromático. Quando o meio aquoso entra em contato com o meio de cromatografia estacionário hidrofóbico funcionalizado com bromo PS-DVB (BPS-DVB), um dos oligossacarídeos é retido pela fase sólida estacionária mais do que o outro, assim, as frações enriquecidas ou separadas dos respectivos oligossacarídeos podem ser obtidas.

[0010] Em uma modalidade, o número de unidades de monossacarídeos em um dos oligossacarídeos neutros hidrofílicos é maior que no outro oligossacarídeo neutro hidrofílico.

[0011] Em outra modalidade, um dos oligossacarídeos neutros hidrofílicos consiste em pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro.

[0012] Em outra modalidade, um dos oligossacarídeos neutros hidrofílicos compreende pelo menos uma porção de N-acetilglucosaminil (G1cNAc) ou N-acetilgalactosaminil (Ga1NAc), enquanto o outro não.

[0013] Em outra modalidade, um dos oligossacarídeos neutros hidrofílicos compreende mais porções de G1cNAc ou Ga1NAc do que o outro.

[0014] Em uma modalidade, pelo menos um dos oligossacarídeos neutros hidrofílicos é um oligossacarídeo de leite humano ou um precursor do mesmo.

[0015] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano ou precursores do

5 / 22 mesmo.

[0016] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano, um deles consistindo em pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro.

[0017] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano, um deles sendo um tetrassacarídeo e o outro sendo um hexassacarídeo.

[0018] Em uma modalidade, pelo menos um dos oligossacarídeos neutros hidrofílicos é oligossacarídeo de leite humano que contém uma porção de G1cNAc.

[0019] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano e ambos compreendem uma porção de G1cNAc.

[0020] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano, ambos compreendem uma porção de G1cNAc e um deles consiste em pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro.

[0021] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano e um deles compreende mais porção de G1cNAc que o outro.

[0022] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano, ambos compreendem uma porção de G1cNAc e um deles compreende mais porção de G1cNAc que o outro.

[0023] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano, um deles consiste em pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro, e o oligossacarídeo superior (que é aquele que tem mais unidades de

6 / 22 monossacarídeos) compreende mais porção de G1cNAc que o oligossacarídeo inferior.

[0024] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos são oligossacarídeos de leite humano, um deles é um hexassacarídeo que compreende duas, preferivelmente exatamente duas, porções de G1cNAc, e o outro é um tetrassacarídeo que compreende uma, preferivelmente exatamente uma, porção de G1cNAc.

[0025] Em uma modalidade, os oligossacarídeos de leite humano ou precursores do mesmo são produzidos intracelularmente por fermentação, particularmente por E. coli em um meio de cultura aquoso e, em seguida, secretados no meio de cultura aquoso.

[0026] Em uma modalidade, antes de tratar o meio aquoso que compreende os oligossacarídeos de leite humano ou precursores do mesmo pela cromatografia em BPS-DVB, uma das ou ambas as etapas a seguir são realizadas: a) o meio aquoso é clarificado para remover partículas e contaminantes e vantajosamente também componentes celulares e quaisquer metabólitos e detritos insolúveis a partir de um processo de fermentação; e b) substancialmente todas as proteínas são removidas do meio aquoso, vantajosamente após o meio aquoso ser clarificado na etapa a).

[0027] Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos compreendem LNnT e pLNnH. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo oligossacarídeos compreendem LNT e pLNH II.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0028] Normalmente, a aplicação de meio altamente hidrofóbico estacionário cromatográfico (cromatografia em fase reversa, RPC) não é adequada para separar oligossacarídeos altamente polares (ver, por exemplo, o documento WO 2017/221208). Os presentes inventores verificaram surpreendentemente que a RPC pode ser aplicável para essa tarefa, contanto

7 / 22 que a fase sólida cromatográfica seja composta de poliestireno reticulado com divinilbenzeno e funcionalizada com bromo no anel aromático (BPS-DVB). De acordo com a presente invenção, um método é provido para separar, pelo menos parcialmente, um primeiro oligossacarídeo neutro hidrofílico de um segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico, os oligossacarídeos sendo preferivelmente produzidos a partir de um processo de fermentação ou enzimático ex vivo, o método compreendendo submeter uma solução aquosa que compreende o primeiro e o segundo oligossacarídeos para cromatografia em um poliestireno funcionalizado com bromo reticulado com meio estacionário de divinilbenzeno (BPS-DVB).

[0029] Preferivelmente, o nível de bromação da resina de BPS-DVB é de cerca de 25 a 61% p/p, por exemplo 25 a 35% p/p.

[0030] O processo de separação cromatográfica acima provou ser robusto tanto como um processo em lote quanto na configuração de múltiplas colunas, abrangendo desde o laboratório de pesquisas e desenvolvimentos através da planta piloto até a escala industrial completa. A fase sólida e a execução cromatográfica associada podem ser feitas de uma maneira que um gradiente seja aplicado usando, por exemplo, álcool aquoso, mas também podem ser feitas completamente sem solventes orgânicos (água pura). O processo funciona bem em alta temperatura (por exemplo, até 60°C), o que provê um beneficio em termos de risco reduzido de crescimento microbiano e aumento na produtividade. Além disso, a fase sólida pode ser totalmente regenerada usando, por exemplo, ácido acético aquoso e, portanto, muito adequado para o processamento relacionado a alimentos.

[0031] Na presente invenção, o termo “cromatografia em fase reversa” ou RPC, significa preferivelmente qualquer método cromatográfico que usa uma fase hidrofóbica estacionária (ou seja, compactada) ou suspensa e uma fase polar móvel (ou seja, aquosa) que compreende os componentes a serem separados.

8 / 22

[0032] O termo “oligossacarídeo neutro hidrofílico” significa preferivelmente um polímero de açúcar que contém pelo menos duas unidades de monossacarídeos, ou seja, um di-, tri-, tetra- ou oligossacarídeo superior. O oligossacarídeo pode ter uma estrutura linear ou ramificada contendo as unidades de monossacarídeos que estão ligadas entre si por ligações interglicosídicas. Preferivelmente, o oligossacarídeo consiste em duas a oito, mais preferivelmente duas a seis, porções de monossacarídeos. Obviamente, as unidades de monossacarídeos que constituem o oligossacarídeo são monossacarídeos neutros e não podem ser monossacarídeos ácidos, tais como ácido aldônico, ácido ceto-aldônico (como ácido siálico), ácido aldárico, ácido aldurônico ou porções de monossacarídeos básicos como um grupo de aminos livres. Os grupos de hidroxila das unidades de monossacarídeos neutros não são protegidos, consequentemente o oligossacarídeo composto pelos monossacarídeos também está desprotegido. A unidade de monossacarídeos neutros pode ser selecionada a partir dentre qualquer 5 a 9, preferivelmente 5 a 6, monossacarídeo que contém átomo de carbono que consiste em aldoses (por exemplo, D-glicose, D-galactose, D-manose, D- ribose, D-arabinose, , L-arabinose, D-xilose, etc.), cetoses (por exemplo, D- frutose, D-sorbose, D-tagatose, etc.), desoxiaçúcares (por exemplo, L- ramnose, L-fucose, etc.) e desoxiaminoaçúcares N-acetilados (por exemplo, N-acetilglucosamina, N-acetilmanosamina, N-acetilgalactosamina, etc.).

[0033] O termo “poliestireno funcionalizado com bromo reticulado com divinilbenzeno”, “poliestireno reticulado com divinilbenzeno e funcionalizado com bromo” ou “BPS-DVB” se refere a um copolímero modificado de estireno e divinilbenzeno em que pelo menos uma parte do monômero de estireno é substituído com bromoestireno (em que o bromo está no anel aromático) ou o copolímero de poliestireno-divinilbenzeno é bromado com um agente de bromação.

[0034] O termo “álcool C1-C4” significa um álcool alquílico com 1 a 4

9 / 22 átomos de carbono, tal como metanol, etanol, propanol ou butanol. O álcool C1-C4 preferido é o isopropanol.

[0035] O termo “meio aquoso [a partir de um processo de fermentação ou enzimático]” significa preferivelmente uma suspensão aquosa resultante de um processo enzimático ou de fermentação para produzir pelo menos um oligossacarídeo neutro hidrofílico.

[0036] O termo “meio aquoso clarificado” significa preferivelmente um meio aquoso, por exemplo, aquele de um processo enzimático ou de um caldo de fermentação, que foi tratado para remover partículas e contaminantes suspensos a partir do processo, particularmente células, componentes celulares, metabólitos e detritos insolúveis a partir de um processo de fermentação, que poderiam interferir nas etapas seguintes da purificação. Esse tratamento de clarificação pode ser realizado de uma maneira convencional por centrifugação, floculação, floculação com tratamento ultrassônico opcional, filtração por gravidade, microfiltração, ultrafiltração, separação de espuma ou filtração a vácuo (por exemplo, através de um filtro de cerâmica que pode incluir um filtro auxiliar da CeliteTM).

[0037] O termo “meio aquoso sem proteínas” significa preferivelmente um meio aquoso, por exemplo, aquele de um processo enzimático ou de um caldo de fermentação, que foi tratado para remover substancialmente todas as proteínas, e preferivelmente bem como peptídeos, aminoácidos, RNA, DNA e fragmentos dos mesmos, bem como endotoxinas e glicolipídeos que poderiam interferir nas etapas seguintes de purificação. Essa remoção de proteínas, aminoácidos, RNA e DNA pode ser realizada de uma maneira convencional por cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, ultrafiltração, nanofiltração ou cromatografia de exclusão por tamanho.

[0038] O termo “oligossacarídeo superior” significa que seu grau de polimerização é maior que o do outro oligossacarídeo, ou seja, ele

10 / 22 compreende mais unidades de monossacarídeos que o outro.

[0039] O termo “oligossacarídeo inferior” significa que seu grau de polimerização é menor que o do outro oligossacarídeo, ou seja, ele compreende menos unidades de monossacarídeos que o outro.

[0040] O método de separação reivindicado pode ser realizado de uma maneira convencional. A solução aquosa que compreende o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos é usada como a fase móvel na cromatografia. Um solvente orgânico, preferivelmente um álcool C1-C4, pode ser adicionado à solução aquosa. O pH da solução aquosa é preferivelmente entre 3 e 8 mais preferivelmente entre 4 e 7. Se necessário, o pH pode ser ajustado para o valor requerido de uma maneira convencional por adição de uma solução aquosa de um ácido, uma base ou um tampão. A separação pode ser feita facilmente usando uma coluna cromatográfica ou um recipiente de escala laboratorial ou industrial convencional, em que a resina de BPS-DVB pode ser compactada ou suspensa (por exemplo, como grânulos). Preferivelmente, o método de separação é realizado em uma coluna.

[0041] O grau de separação depende de muitos parâmetros, tais como a natureza do eluente, taxa de fluxo/eluição, volumes de frações coletadas, massa do primeiro e do segundo oligossacarídeos em relação à massa da resina ou volume do leito da resina, etc. Esses parâmetros podem ser otimizados com habilidades de rotina. O termo “separação” significa uma separação completa do primeiro e do segundo oligossacarídeos um do outro, ou seja, eles são coletados e isolados das frações na forma pura não contendo um ao outro. Além disso, o termo “separação” significa uma separação parcial em que pelo menos um dos oligossacarídeos pode ser obtido a partir de pelo menos uma fração na forma pura ou a relação do primeiro e do segundo oligossacarídeos nas frações é diferente daquela na solução de alimentação, assim, um oligossacarídeo é enriquecido.

[0042] Após realizar a separação do primeiro oligossacarídeo neutro

11 / 22 hidrofílico do segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico por meio da cromatografia em BPS-DVB como descrita acima, o primeiro e/ou o segundo oligossacarídeo(s) purificado(s) ou enriquecido(s) pode(m) ser então isolado(s) da fração aquosa em que é(são) coletado(s) de uma maneira convencional, por exemplo, por evaporação, cristalização, liofilização ou secagem por pulverização.

[0043] Preferivelmente, a cromatografia no meio estacionário de BPS-DVB compreende: - carregar a solução aquosa que compreende o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos no meio de BPS-DVB, - eluir com água opcionalmente contendo um álcool C1-C4, e então - coletar as frações que compreendem ou enriquecidas em um dos oligossacarídeos. Após a cromatografia, o meio de BPS-DVB pode ser regenerado por eluição com água contendo solventes orgânicos miscíveis em água e reciclado.

[0044] Também preferivelmente, a solução aquosa que compreende o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos é um caldo de fermentação pretratado ou um meio de reação aquoso em que o primeiro e o segundo oligossacarídeos produziram/compreenderam.

[0045] Um aspecto do presente método envolve a separação do primeiro e do segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos um do outro, pelo menos parcialmente, os oligossacarídeos sendo produzidos intracelularmente por fermentação, preferivelmente por E. coli, em um meio de cultura aquoso e, em seguida, secretados, transportados ou trazidos para dentro do meio de cultura aquoso. O método pode envolver, antes da cromatografia em BPS- DVB, as seguintes etapas de pretratamento: a) clarificar o meio de cultura aquoso para remover partículas e contaminantes do mesmo, preferivelmente também células, componentes

12 / 22 celulares e quaisquer metabólitos e detritos insolúveis a partir de um processo de fermentação, para prover um meio aquoso clarificado, e/ou b) remover substancialmente todas as proteínas do meio aquoso, preferivelmente do meio aquoso clarificado da etapa a), para prover um meio aquoso sem proteínas, e/ou c) remover sais e componentes carregados do meio de cultura aquoso, do meio aquoso clarificado da etapa a) ou do meio aquoso sem proteínas da etapa b).

[0046] Por conseguinte, o meio aquoso clarificado da etapa a), o meio aquoso sem proteínas da etapa b) ou o meio aquoso obtido na etapa c) é carregado na resina de BPS-DVB.

[0047] Outro aspecto do método se refere à separação de um primeiro e do segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos um do outro, pelo menos parcialmente, pelo menos um dos oligossacarídeos sendo produzidos enzimaticamente ex vivo em um meio aquoso. Uma mistura de reação enzimática ex vivo normalmente contém, além dos oligossacarídeos de interesse produzidos, proteínas, fragmentos de proteínas, sais orgânicos, aceitador (normalmente lactose) ou doador de carboidrato não reagido, subprodutos semelhantes ao açúcar, grupo lábil de carboidratos (normalmente um mono- ou dissacarídeo), etc. O método pode envolver, antes da cromatografia em BPS-DVB, as seguintes etapas de pretratamento: ultrafiltração (UF), nanofiltração (NF) e tratamento opcional com carvão ativado (AC). A UF compreende separar sólidos suspensos de alto peso molecular, normalmente proteínas ou fragmentos de proteínas, dos componentes solúveis do meio aquoso que passam através da membrana de ultrafiltração no permeado. Esse permeado de UF (UFP) é uma solução aquosa contendo o oligossacarídeo produzido acompanhado de outros produtos de carboidratos. A etapa de NF pode seguir a etapa de UF ou a etapa opcional de tratamento de AC; essa etapa pode ser vantajosamente usada para

13 / 22 concentrar o meio aquoso tratado anteriormente que compreende o oligossacarídeo produzido acompanhado de outros produtos de carboidratos e/ou para remover íons, principalmente íons monovalentes e materiais orgânicos com um peso molecular inferior ao do produto de oligossacarídeo, tais como os monossacarídeos. A este respeito, o oligossacarídeo produzido acompanhado de outros oligossacarídeos é acumulado no retentado de NF (NFR). A NF pode ser combinada com diafiltração com água para remover moléculas permeáveis de maneira mais eficaz, por exemplo, até a condutividade do permeado que mostra nenhuma ou presença muito baixa de sais. A etapa opcional de AC pode seguir a etapa de UF, a etapa de NF ou a resina de BPS-DVB. O tratamento de AC ajuda a remover ou pelo menos reduzir a quantidade de agentes de coloração e/ou contaminantes solúveis em água, tais como sais, se necessário.

[0048] Em uma modalidade do processo de separação reivindicado, um meio aquoso, que pode vir diretamente de um processo enzimático ou preferivelmente de fermentação, particularmente de E. coli ou levedura, e que contém um primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos, é tratado através dos seguintes passos: 1) clarificar o meio aquoso para remover partículas e contaminantes suspensos, particularmente células, componentes celulares, metabólitos e detritos insolúveis a partir de um processo de fermentação; em seguida 2) remover substancialmente todas as proteínas, bem como peptídeos, aminoácidos, RNA e DNA e quaisquer endotoxinas e glicolipídeos que poderiam interferir na etapa de purificação subsequente, a partir da solução aquosa obtida na etapa 1); e em seguida 3) separar o primeiro e o segundo oligossacarídeos a partir da solução aquosa obtida na etapa 2) por cromatografia em BPS-DVB.

[0049] Na etapa 1), o meio aquoso, que contém o primeiro e o

14 / 22 segundo oligossacarídeos, é clarificado de uma maneira convencional, por exemplo, por centrifugação ou filtração. Preferivelmente, o meio aquoso é primeiro floculado e depois centrifugado ou filtrado para remover quaisquer partículas e contaminantes insolúveis remanescentes, bem como células e componentes celulares e metabólitos e detritos insolúveis.

[0050] Na etapa 2), as proteínas e impurezas relacionadas são removidas do meio aquoso de uma maneira convencional, por exemplo, por ultrafiltração, nanofiltração, filtração de alto desempenho de fluxo tangencial, ultrafiltração de fluxo tangencial, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, filtração por gel, cromatografia de exclusão por tamanho, tratamento com carvão ativado. O tratamento com carvão ativado ajuda a remover ou pelo menos reduzir a quantidade de agentes de coloração e/ou contaminantes solúveis em água, tais como sais, se necessário. A cromatografia de troca iônica remove eficazmente os componentes carregados, tais como sais, corpos coloridos, proteínas, aminoácidos, lipídios e DNAs.

[0051] No método de separação de um primeiro oligossacarídeo neutro hidrofílico de um segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico por cromatografia em BPS-DVB descrito acima, incluindo quaisquer modalidades preferidas e/ou descritas, o primeiro e o segundo oligossacarídeos diferem um do outro em pelo menos uma característica estrutural, por exemplo, pelo menos uma unidade de monossacarídeos é diferente, o número de unidades de monossacarídeos é diferente ou a orientação de pelo menos uma das ligações interglicosídicas é diferente (seja ela α ou ß). Em uma modalidade, um dos oligossacarídeos consiste em uma unidade de monossacarídeos a mais que o outro. Em outra modalidade, um dos oligossacarídeos consiste em duas ou pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro, por exemplo, um dos oligossacarídeos é um trissacarídeo e o outro é um pentassacarídeo, ou um dos oligossacarídeos é um tetrassacarídeo e o outro é

15 / 22 um hexassacarídeo. Em outra modalidade, um dos oligossacarídeos compreende pelo menos uma unidade de G1cNAc ou Ga1NAc, preferivelmente uma unidade de G1cNAc, enquanto o outro não. Em outra modalidade, um dos oligossacarídeos compreende mais unidades de G1cNAc ou Ga1NAc, preferivelmente unidades de G1cNAc, que o outro.

[0052] Preferivelmente, um dos oligossacarídeos compreende a estrutura do outro oligossacarídeo, ou seja, um dos oligossacarídeos é um derivado glicosilado do outro. Mais preferivelmente, a glicosilação compreende fixar pelo menos as duas unidades de monossacarídeos. Ainda mais preferivelmente, a estrutura que é comumente compartilhada pelo primeiro e pelo segundo oligossacarídeos é a lactose ou seus derivados glicosilados.

[0053] Também preferivelmente, o primeiro e o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos compreendem uma porção de lactose (Galß1-4G1c) na extremidade redutora. Mais preferivelmente, o primeiro e o segundo oligossacarídeos são distinguidos pela fórmula 1 a seguir, R1 é fucosil ou H, R2 é fucosil ou H, R3 é selecionado a partir dos grupos de H, N- acetilglucosaminil, N-acetil-lactosaminil e lacto-N-biosil, em que o grupo de N-acetil-lactosaminil ou o grupo de lacto-N-biosil pode transportar um resíduo de glicosil que compreende um ou mais grupos de N- acetilglucosaminil, N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N-biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil,

16 / 22

R4 é selecionado a partir dos grupos de H, N- acetilglucosaminil e N-acetil-lactosaminil, em que o grupo de N-acetil- lactosaminil pode ser opcionalmente substituído com um resíduo de glicosil que compreende um ou mais grupos de N-acetilglucosaminil, N-acetil- lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil- lactosaminil e lacto-N-biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil; Ainda mais preferivelmente, a fórmula 1 pode ser distinguida pelas fórmulas 1a, 1b ou 1c em que R1 e R2 são conforme definidas acima, R3a é um grupo de N-acetilglucosaminil ou um grupo de N- acetil-lactosaminil opcionalmente substituído com um resíduo de glicosil que compreende um grupo de N-acetilglucosaminil, N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N- biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil, R4a é H ou um grupo de N-acetilglucosaminil ou um grupo de N-acetil-lactosaminil opcionalmente substituído com um grupo de N- acetilglucosaminil ou um grupo de lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N-biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil, R3b é um grupo de N-acetilglucosaminil ou um grupo de lacto-

17 / 22 N-biosil opcionalmente substituído com um resíduo de glicosil que compreende um grupo de N-acetilglucosaminil, N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N- biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil, R4b é H ou um grupo de N-acetilglucosaminil ou um grupo de N-acetil-lactosaminil opcionalmente substituído com um ou dois grupos de N- acetilglucosaminil, N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N-biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil; ainda mais preferivelmente, as fórmulas 1a e 1b são distinguidas por: - o grupo de N-acetil-lactosaminil no resíduo de glicosil de R3a é fixado a outro grupo de N-acetil-lactosaminil com uma ligação interglicosídica 1 a 3, - o grupo de lacto-N-biosil no resíduo de glicosil de R3a é fixado ao grupo de N-acetil-lactosaminil com uma ligação interglicosídica 1 a 3, - o grupo de lacto-N-biosil no resíduo de glicosil de R4a é fixado ao grupo de N-acetil-lactosaminil com uma ligação interglicosídica 1 a 3, - o grupo de N-acetil-lactosaminil no resíduo de glicosil de R4b é fixado a outro grupo de N-acetil-lactosaminil com uma ligação interglicosídica 1 a 3 ou 1 a 6, - o grupo de lacto-N-biosil no resíduo de glicosil de R4b é fixado ao grupo de N-acetil-lactosaminil com uma ligação interglicosídica 1 a

3.

[0054] Ainda mais preferivelmente, os compostos de acordo com as fórmulas 1a, 1b e 1c são oligossacarídeos de leite humano, notavelmente os compostos preferidos da fórmula 1a são lacto-N-neotetraose, para-lacto-N-

18 / 22 hexaose, para-lacto-N-neohexaose, lacto-N-neohexaose, para-lacto-N-octaose ou lacto-N-neooctaose, todos os quais podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais resíduos de fucosil; e os compostos preferidos da fórmula 1b são lacto-N-neotetraose, lacto-N-hexaose, lacto-N-octaose, iso-lacto-N- octaose, lacto-N-decaose ou lacto-N-neodecaose, todos os quais podem ser opcionalmente substituídos com um ou mais resíduos de fucosil. Particularmente, os compostos da fórmula 1a ou 1b são distinguidos pelo fato do resíduo de fucosil fixado ao grupo de N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N- biosil estar ligado à - galactose do grupo de lacto-N-biosil com ligação interglicosídica 1 a 2 e/ou - N-acetilglucosamina do grupo de lacto-N-biosil com ligação interglicosídica 1 a 4 e/ou - N-acetilglucosamina do grupo de N-acetil-lactosaminil com ligação interglicosídica 1 a 3.

[0055] De acordo com o aspecto mais preferido, os compostos das subfórmulas 1a, 1b e 1c são selecionados a partir do grupo de: lactose, 2’- fucosilactose, 3-fucosilactose, 2’,3-difucosilactose, lacto-N-tetraose, lacto-N- neotetraose, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP V, LNFP VI, LNDFH I, LNDFH II, LNDFH III, pLNnH, pLNnH monofucosilado, pLNH II, pLNH II monofucosilado e lacto-N-triose II.

[0056] Em uma modalidade, um do primeiro e do segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos não compreende uma unidade de G1cNAc ou Ga1NAc na sua estrutura, enquanto que o outro compreende.

[0057] Em uma modalidade, tanto o primeiro quanto o segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos compreendem unidade de G1cNAc ou Ga1NAc nas suas estruturas, preferivelmente uma unidade de G1cNAc.

[0058] Em uma modalidade, um do primeiro e do segundo oligossacarídeos neutros hidrofílicos compreende mais unidades de G1cNAc

19 / 22 ou Ga1NAc na sua estrutura, preferivelmente uma unidade de G1cNAc, que o outro. De acordo com uma modalidade preferida, o primeiro e o segundo oligossacarídeos são distinguidos pela fórmula 1a, mais preferivelmente R1 é H, R3a é um grupo de N-acetil-lactosaminil opcionalmente substituído com um grupo de N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N-biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil, e R4a é H. Ainda mais preferivelmente, um dos oligossacarídeos é um tetrassacarídeo, por exemplo, LNnT, e o outro é um penta ou hexassacarídeo, por exemplo, pLNnH. De acordo com outra modalidade preferida, o primeiro e o segundo oligossacarídeos são distinguidos pela fórmula 1b, mais preferivelmente R1 é H, R3b é um grupo de lacto-N-biosil opcionalmente substituído com um resíduo de glicosil que compreende um grupo de N-acetilglucosaminil, N-acetil-lactosaminil e/ou lacto-N-biosil; qualquer um dos grupos de N-acetil-lactosaminil e lacto-N- biosil pode ser substituído com um ou mais resíduos de fucosil, e R4b é H. Ainda mais preferivelmente, um dos oligossacarídeos é um tetrassacarídeo, por exemplo, LNT, e o outro é um penta ou hexassacarídeo, por exemplo, pLNH II.

EXEMPLOS

[0059] Geral: antes do uso, as resinas de PS-DVB ou BPS-DVB foram misturadas em uma solução de ácido acético a 30% por 2 horas e, assim, desgaseificadas. Em seguida, elas foram colocadas em uma coluna de vidro e lavadas com água até atingir uma condutividade inferior a 500 µS/cm. Exemplo 1

[0060] Duas colunas de vidro (1: 40 cm, d: 26 mm) foram preenchidas com resina Purosorb PAD428 BPS-DVB e resina Sepabeads SP825L PS-DVB (não bromadas), respectivamente. Uma solução de uma mistura de LNnT (500 mg) e pLNnH (115 mg, uma relação de 4,35:1) dissolvida em 10 ml de água foi cromatografada em cada resina com uma taxa

20 / 22 de fluxo de ≈ 2,5 ml/min. As frações (≈ 20 ml) foram coletadas e analisadas por HPLC. Resultados:

[0061] Para a resina bromada Purosorb PAD428 PS-DVB, as frações de 3 a 10 (96 ml, ≈ 0,5 a 1,67 de volume de leito) foram reunidas que continham LNnT:pLNnH em uma relação de 8,7:1 (77% de LNnT foram recuperados).

[0062] Para a resina Sepabeads SP825L PS-DVB, as frações de 2 a 8 (104 ml, ≈ 0,3 a 1,17 de volume de leito) foram reunidas que continham LNnT:pLNnH em uma relação de 4,7:1 (98% de LNnT foram recuperados).

[0063] Enquanto a resina BPS-DVB enriqueceu o LNnT dobrando sua relação, a resina não bromada PS-DVB praticamente não apresentou separação. Exemplo 2

[0064] Uma coluna de vidro (1: 40 cm, d: 26 mm) foi preenchida com resina Purosorb PAD428 BPS-DVB. Uma solução de uma mistura de LNnT (1,2 g) e pLNnH (0,25 g, uma relação de 4,8:1) dissolvida em 20 ml de água foi cromatografada com uma taxa de fluxo de ≈ 4 ml/min. As frações (≈ 30 ml) foram coletadas e analisadas por HPLC.

[0065] As frações 2 a 10 (240 ml, ≈ 0,5 a 2,6 de volume de leito) foram reunidas que continham LNnT:pLNnH em uma relação de 7,65:1, enquanto o LNnT foi recuperado em 90%. Exemplo 3

[0066] Uma coluna de vidro (1: 40 cm, d: 26 mm) foi preenchida com resina Sepabeads SP207 BPS-DVB. Uma solução de uma mistura de LNnT (1,5 g), pLNnH (100 mg) e F-pLNnH (Galß1-4[Fucα1-3]G1cNAcß1-3Galß1- 4G1cNAcß1-3Galß1-4Glc, ver documento WO 2016/063261, 50 mg; uma relação de 30:2:1) dissolvida em 30 ml de água foi cromatografada com uma taxa de fluxo de ≈ 6 ml/min. As frações (≈ 30 ml) foram coletadas e

21 / 22 analisadas por HPLC.

[0067] As frações 3 a 14 (400 ml) foram reunidas que continham LNnT:pLNnH:Galß1-4[Fucα1-3]G1cNAcß1-3Galß1-4G1cNAcß1-3Galß1- 4Glc em uma relação de 129:2,6:1. Exemplo 4

[0068] O LNnT foi feito por fermentação usando uma célula de E. coli geneticamente modificada de fenótipo LacZ-, LacY+, em que a dita célula compreende um gene recombinante que codifica uma transferase de ß-1,3-N- acetilglucosaminil que é capaz de transferir o G1cNAc de UDP-G1cNAc para a lactose internalizada, um gene recombinante que codifica uma transferase de ß-1,4-galactosil que é capaz de transferir o resíduo de galactosil de UDP- Gal para a lactose N-acetilglucosaminilada e genes que codificam uma via biossintética para UDP-G1cNAc e UDP-Gal. A fermentação foi realizada cultivando a dita célula na presença de lactose adicionada exogenamente e uma fonte de carbono adequada, produzindo assim o LNnT que foi acompanhado por lacto-N-triose II, pLNnH e lactose no caldo da fermentação. O caldo foi submetido a uma operação padrão de remoção de células por UF, NF com diafiltração, descoloração com carvão ativado e tratamento por troca iônica (tanto catiônica quanto aniônica). A solução obtida continha LNnT (30 g/l), lactose, lacto-N-triose II e pLNnH (10,6% vs. LNnT). A solução foi colocada em uma coluna preenchida com a resina Sepabeads SP207 BPS-DVB (aproximadamente 1,6 g de LNnT por 100 ml de volume de leito) e eluída com água contendo 0,02% de isopropanol. Foram coletadas frações de ≈ 1,1 a 2,1 de volume de leito. A análise por HPLC mostrou que 82% de LNnT foram recuperados e a quantidade de pLNnH foi reduzida para 0,3% vs. LNnT. Exemplo 5

[0069] O LNT foi feito por fermentação usando uma célula de E. coli geneticamente modificada de fenótipo LacZ-, LacY+, em que a dita célula

22 / 22 compreende um gene recombinante que codifica uma transferase de ß-1,3-N- acetilglucosaminil que é capaz de transferir o G1cNAc de UDP-G1cNAc para a lactose internalizada, um gene recombinante que codifica uma transferase de ß-1,3-galactosil que é capaz de transferir o resíduo de galactosil de UDP- Gal para a lactose N-acetilglucosaminilada e genes que codificam uma via biossintética para UDP-G1cNAc e UDP-Gal.

A fermentação foi realizada cultivando a dita célula na presença de lactose adicionada exogenamente e uma fonte de carbono adequada, produzindo assim o LNT que foi acompanhado por lacto-N-triose II, pLNH II e lactose no caldo da fermentação.

O caldo foi submetido a uma operação padrão de remoção de células por UF, NF com diafiltração, descoloração com carvão ativado e tratamento por troca iônica (tanto catiônica quanto aniônica). A solução obtida continha LNT (20,7 g/kg, pureza por HPLC: 76,1%), lactose, lacto-N- triose II e pLNH II (3,23% vs.

LNT). A solução foi liofilizada.

Uma amostra do pó liofilizado (3,40 g) foi dissolvida em 45 ml de água e a solução foi colocada em uma coluna preenchida com a resina Sepabeads SP207 BPS- DVB (diâmetro da coluna: 1,6 cm, volume de leito: 170 ml) e eluída com água (1,5 de volume de leito) e depois com 20% de metanol.

O volume da fração foi de 170 ml.

As frações de 11 a 26 foram reunidas e liofilizadas, rendendo 2,85 g de um sólido.

A análise por HPLC mostrou que a pureza do LNT foi aumentada para 81,3%, enquanto que a quantidade de pLNH II foi reduzida para 0,25% vs.

LNT.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para separar um primeiro oligossacarídeo neutro hidrofílico de um segundo oligossacarídeo neutro hidrofílico, caracterizado pelo fato de que compreende submeter uma solução aquosa, que compreende o primeiro e o segundo oligossacarídeos, à cromatografia em um poliestireno funcionalizado com bromo reticulado com meio estacionário de divinilbenzeno (BPS-DVB).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o nível de bromação do meio de BPS-DVB é de cerca de 25 a 61% p/p por peso seco.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo oligossacarídeos são produzidos intracelularmente por fermentação, preferivelmente E. cola, em um meio de cultura aquoso e, em seguida, secretados, transportados ou trazidos para dentro do meio de cultura aquoso.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a cromatografia no meio em BPS-DVB é precedida por pelo menos uma das seguintes etapas: a) clarificar o meio de cultura aquoso para remover partículas e contaminantes do mesmo, preferivelmente células, componentes celulares e quaisquer metabólitos e detritos insolúveis a partir de um processo de fermentação, para prover um meio aquoso clarificado, b) remover substancialmente todas as proteínas do meio aquoso, preferivelmente do meio aquoso clarificado da etapa a), para prover um meio aquoso sem proteínas, c) remover sais e componentes carregados do meio de cultura aquoso, do meio aquoso clarificado da etapa a) ou do meio aquoso sem proteínas da etapa b).

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as etapas a), b) e/ou c) compreendem ultrafiltração, nanofiltração, tratamento por troca iônica e tratamento opcional com carvão ativado.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o número das unidades de monossacarídeos em um dos oligossacarídeos é maior que no outro oligossacarídeo.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que um dos oligossacarídeos consiste em pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro oligossacarídeo.

8. Método de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos oligossacarídeos compreende uma porção de G1cNAc ou Ga1NAc.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que ambos os oligossacarídeos compreendem uma porção de G1cNAc ou Ga1NAc.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que um dos oligossacarídeos compreende mais porções G1cNAc ou Ga1NAc que o outro oligossacarídeo.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo superior compreende mais porções G1cNAc ou Ga1NAc que o oligossacarídeo inferior.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 11, caracterizado pelo fato de que um dos oligossacarídeos é um tetrassacarídeo e o outro oligossacarídeo é um hexa ou heptassacarídeo.

13. Método de acordo com qualquer uma da reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo oligossacarídeos são oligossacarídeos de leite humano (HMOs).

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o número de unidades de monossacarídeos em um dos HMOs é maior que no outro HMO.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que um dos HMOs consiste em pelo menos duas unidades de monossacarídeos a mais que o outro HMO.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos HMOs compreende uma porção de G1cNAc.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que ambos os HMOs compreendem uma porção de G1cNAc.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que um dos HMOs compreende mais porções G1cNAc que o outro HMO.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o HMO superior compreende mais porções G1cNAc que o HMO inferior.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que um dos HMOs é um tetrassacarídeo e o outro HMO é um hexa ou heptassacarídeo.

21. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 20, caracterizado pelo fato de que o tetrassacarídeo é LNnT e o hexassacarídeo é pLNnH.

22. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 20, caracterizado pelo fato de que o tetrassacarídeo é LNT e o hexassacarídeo é pLNH II.