ES2966137T3 - Separación de oligosacáridos - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a un método para la separación de dos oligosacáridos neutros hidrófilos entre sí mediante cromatografía en un medio estacionario de poliestireno funcionalizado con bromo y reticulado con divinilbenceno (BPS-DVB). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Separación de oligosacáridos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a un método para la separación de dos oligosacáridos neutros hidrófilos entre sí, preferiblemente al menos dos oligosacáridos neutros de la leche humana (HMO), producidos por un proceso de fermentación o enzimático. En particular, uno de los al menos dos oligosacáridos neutros tiene mayor peso molecular que el otro, y muestran reparto en una fase estacionaria hidrófoba.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En los últimos años, se han hecho cada vez más esfuerzos por producir industrialmente carbohidratos complejos, tales como oligosacáridos secretados. Esto se ha debido a las funciones de dichos compuestos en numerosos procesos biológicos en organismos vivos. Los oligosacáridos secretados, tales como los oligosacáridos de la leche humana (HMO), han llegado a ser dianas comerciales particularmente importantes para aplicaciones de nutrición y terapéuticas. Los oligosacáridos de la leche humana se han vuelto de gran interés en los últimos pocos años debido a sus importantes funciones en el desarrollo humano. Hasta la fecha, se han determinado las estructuras de más de 140 HMO, y probablemente hay considerablemente más presentes en la leche humana (Urashimaet al.:Milk oligosaccharides, Nova Biomedical Books, 2011; Chen Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 72, 113 (2015)).
Se han buscado maneras de bajo coste para preparar cantidades industriales de cuantos más HMO posibles, de modo que sus usos en formulaciones nutritivas y terapéuticas para lactantes, niños y adultos pudiera estudiarse, desarrollarse y explotarse por investigadores y empresas en todo el mundo. Actualmente, los HMO se han producido enzimáticamente o, principalmente, por fermentación usando organismos unicelulares transformados, particularmenteE. coIí.Estos métodos, sin embargo, proporcionan el HMO de interés acompañado por otros subproductos oligosacáridos/HMO. Típicamente, 2'-FL está principalmente acompañado de DFL y/o 3-FL (véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-2896628, WO 2015/032412, WO 2015/106943), los caldos de fermentación de LNnT comprenden lacto-N-triosa II (GlcNAcp1-3Galp1-4Glc) y oligosacáridos superiores como pLNnH (Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4Glc) (véase, por ejemplo, el documento w O 01/04341, Priemet al.Glycobiology 12, 235 (2002), Gebuset al.Carbohydr. Res. 361,83 (2012), documento WO 2017/182965) y LNT está contaminado por lacto-N-triosa II y oligosacáridos superiores como pLNH II (Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-3GlcNAcp1-3Galp1-4Glc) (véanse, por ejemplo, los documentos WO 2015/049331, WO 2017/182965).
El documento WO 2017/182965 propone un proceso sobre la manera de preparar una mezcla de oligosacáridos preparada por fermentación a partir de los componentes no glucídicos de un caldo (tales como biomasa, ácidos, bases, sales orgánicas e inorgánicas, proteínas, fragmentos proteínicos, ADN, endotoxinas, aminas biogénicas, cuerpos colorantes, etc.), el proceso comprende ultrafiltración, nanofiltración y aplicación de resinas de intercambio iónico, que comprende un tratamiento con una resina de intercambio catiónico fuerte en forma H+ directamente seguido de un tratamiento con una resina de intercambio aniónico débil en forma de base libre. Este método, sin embargo, no separa los componentes oligosacáridos entre sí significativamente.
El documento EP-A-2896628 describe un proceso para la purificación de 2'-FL de caldo de fermentación, que comprende las siguientes etapas: ultrafiltración, tratamiento con resina de intercambio catiónico fuerte (forma H+), neutralización, tratamiento con resina de intercambio aniónico fuerte (forma Cl-), neutralización, nanofiltración/diafiltración, tratamiento con carbón activo, electrodiálisis, tratamiento con resina de intercambio catiónico fuerte (forma Na+), tratamiento con resina de intercambio aniónico fuerte (forma Cl-), tratamiento con carbón activo y electrodiálisis, que enfatiza que no se emplea cromatografía. Aunque el método proporciona 2'-FL con una pureza de un 94-94,5 % (por HPLC), la solicitud no menciona nada sobre si las cantidades de contaminantes glucídicos principales (tales como 3-FL, DFL y lactosa) presentes en el producto final en =5 % se reducen por el proceso.
Separar oligosacáridos estructuralmente cercanos entre sí es una tarea difícil debido a sus propiedades muy similares. La filtración en gel es ciertamente una opción (véase, por ejemplo, Priemet al.Glycobiology 12, 235 (2002)), sin embargo, se considera que es un método de laboratorios en lugar de un proceso rentable industrialmente.
El documento WO 2015/049331 divulga un método para la purificación de LNT a partir de caldo de fermentación, que comprende la siguiente secuencia de operaciones: proporcionar una solución transparente sin partículas, electrodiálisis/nanofiltración, primer cromatografía de intercambio catiónico fuerte en lecho de movimiento simulado (SMB), electrodiálisis, ultrafiltración. Usando determinados parámetros de SMB, se fracciona LNT y oligosacáridos neutros más grandes en el refinado, mientras que se enriquecen carbohidratos más pequeños (lactosa, monosacáridos) en la fracción de extracto. Para purificar más LNT de oligosacáridos superiores, se realiza una segunda cromatografía SMB con diferentes parámetros que provoca el enriquecimiento de LNT en la fracción de extracto.
Los documentos JPS61130297A y JPS62120394A divulgan métodos para separar oligosacáridos neutros de diferente número de unidades monosacáridas, al aplicar cromatografía en columna sobre medio estacionario de BPS-DVB.
Sin embargo, aún son necesarios procedimientos alternativos, más eficaces, robustos y/o rentables, adecuados para aumento a escala industrial, para aislar y purificar LNT, LNnT y otros HMO neutros de subproductos glucídicos acompañantes que a menudo se producen en el proceso de fermentación.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con esta invención, se proporciona un método para separar un primer oligosacárido neutro hidrófilo de un segundo oligosacárido neutro hidrófilo en un medio acuoso, que comprende tratar el medio acuoso por cromatografía usando una fase estacionaria hidrófoba que es un poliestireno reticulado con divinilbenceno (PS-DVB) y funcionalizado con bromo en el anillo aromático. Cuando el medio acuoso se pone en contacto con el medio de cromatografía estacionario hidrófobo de PS-DVB funcionalizado con bromo (BPS-DVB), uno de los oligosacáridos se retiene por la fase sólida estacionaria más que los otros, de ese modo pueden obtenerse las fracciones enriquecidas o separadas de los oligosacáridos respectivos.
En una realización, el número de las unidades monosacáridas en uno de los oligosacáridos neutros hidrófilos es mayor que en el otro oligosacárido neutro hidrófilo.
En otra realización, uno de los oligosacáridos neutros hidrófilos consiste en al menos dos unidades monosacáridas más que el otro.
En otra realización, uno de los oligosacáridos neutros hidrófilos comprende al menos un resto de N-acetilglucosaminilo (GlcNAc) o N-acetilgalactosaminilo (GalNAc), mientras el otro no.
En otra realización, uno de los oligosacáridos neutros hidrófilos comprende más restos de GlcNAc o GalNAc que el otro.
En una realización, al menos uno de los oligosacáridos neutros hidrófilos es un oligosacárido de leche humana o un precursor del mismo.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana o precursores de los mismos.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana, consistiendo uno de ellos en al menos dos unidades monosacáridas más que el otro.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana, siendo uno de ellos un tetrasacárido y siendo el otro un hexasacárido.
En una realización, al menos uno de los oligosacáridos neutros hidrófilos es oligosacárido de leche humana que contiene un resto de GlcNAc.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana y ambos comprenden un resto GlcNAc.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana, ambos comprenden un resto de GlcNAc y uno de ellos consiste en al menos dos unidades monosacáridas más que el otro. En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana y uno de ellos comprende más restos de GlcNAc que el otro.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana, ambos comprenden un resto de GlcNAc y uno de ellos comprende más restos de GlcNAc que el otro.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana, uno de ellos consiste en al menos dos unidades monosacáridas más que el otro y el oligosacárido superior (es decir, el que tiene más unidades monosacáridas) comprende más restos de GlcNAc que el oligosacárido inferior.
En una realización, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo son oligosacáridos de leche humana, uno de ellos es un hexasacárido que comprende dos, preferiblemente dos exactamente, restos de GlcNAc y el otro es un tetrasacárido que comprende uno, preferiblemente uno exactamente, resto de GlcNAc.
En una realización, los oligosacáridos de leche humana o precursores de los mismos se producen de forma intracelular por fermentación, particularmente porE. coIíen un medio de cultivo acuoso y después se secretan al medio de cultivo acuoso.
En una realización, antes de tratar el medio acuoso que comprende los oligosacáridos de leche humana o precursores de los mismos por la cromatografía en BPS-DVB, se realiza una o las dos siguientes etapas:
a) el medio acuoso se aclara para retirar los materiales en partículas y los contaminantes y ventajosamente también los componentes celulares y cualquier metabolito insoluble y desechos de un proceso de fermentación; y
b) sustancialmente todas las proteínas se retiran del medio acuoso, ventajosamente después de aclarar el medio acuoso en la etapa a).
En una realización, el primer y segundo oligosacárido comprenden LNnT y pLNnH.
En una realización, el primer y segundo oligosacárido comprenden LNT y pLNH II.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Típicamente, la aplicación de medio cromatográfico estacionario altamente hidrófobo (cromatografía en fase inversa, RPC) no es adecuada para separar oligosacáridos altamente polares (véase, por ejemplo, el documento WO 2017/221208). Los autores de la presente invención encontraron sorprendentemente que la RPC puede ser aplicable para esta tarea, con la condición de que la fase cromatográfica sólida esté compuesta de poliestireno reticulado con divinilbenceno y funcionalizado con bromo en el anillo aromático (BPS-DVB).
De acuerdo con esta invención, se proporciona un método para separar, al menos parcialmente, un primer oligosacárido neutro hidrófilo de un segundo oligosacárido neutro hidrófilo, produciéndose los oligosacáridos preferiblemente por una fermentación o en un proceso enzimáticoex vivo,comprendiendo el método someter una solución acuosa que comprende el primer y el segundo oligosacárido a cromatografía sobre un medio estacionario de poliestireno reticulado con divinilbenceno y funcionalizado con bromo (BPS-DVB).
Preferiblemente, el nivel de bromación de la resina de BPS-DVB se de aproximadamente un 25-61 % p/p, por ejemplo, un 25-35 % p/p.
El proceso de separación cromatográfica anterior demostró ser robusto tanto como proceso discontinuo como en conjugación de múltiples columna, abarcando desde laboratorio de I+D a través de planta piloto hasta escala completa industrial. La fase sólida y el procesamiento cromatográfico asociado pueden hacerse de una manera donde se aplica un gradiente usando, por ejemplo, alcohol acuoso, pero también puede procesarse completamente sin disolventes orgánicos (agua pura). El proceso funciona bien a alta temperatura (por ejemplo, hasta 60 °C), que proporciona un beneficio en términos de riesgo reducido del crecimiento microbiano y productividad aumentada. Además, la fase sólida puede regenerarse completamente usando, por ejemplo, ácido acético acuoso y de ese modo es muy adecuada para procesamiento relacionado con alimentos.
En esta invención, la expresión "cromatografía en fase inversa" o RPC, preferiblemente significa cualquier método cromatográfico que usa una fase hidrófoba estacionaria (es decir, compactada) o suspendida y una fase móvil polar (es decir, acuosa) que comprende los componentes a separar.
La expresión "oligosacárido neutro hidrófilo" preferiblemente significa un polímero glucídico que contiene al menos dos unidades monosacáridas, es decir, un di-, tri-, tetraoligosacárido o superior. El oligosacárido puede tener una estructura lineal o ramificada que contiene las unidades monosacáridas que están ligadas entre sí por enlaces interglucosídicos. Preferiblemente, el oligosacárido consiste en dos a ocho, más preferiblemente dos a seis, restos monosacáridos. Obviamente, las unidades monosacáridas que componente el oligosacárido son monosacáridos neutros y no puede ser monosacáridos ácidos tales como ácido aldónico, ácido ceto-aldónico (como ácido siálico), ácido aldárico, ácido aldurónico o restos monosacáridos básicos como uno con grupo amino libre. Los grupos hidroxilo de las unidades monosacáridas neutras no se protegen, en consecuencia el oligosacárido compuesto de los monosacáridos está sin proteger también. La unidad monosacárida neutra puede seleccionarse de cualquier monosacárido que contenga 5-9, preferiblemente 5-6, átomos de carbono, que consiste en aldosas (por ejemplo, D-glucosa, D-galactosa, D-manosa, D-ribosa, D-arabinosa, L-arabinosa, D-xilosa, etc.), cetosas (por ejemplo, D-fructosa, D-sorbosa, D-tagatosa, etc.), desoxisacáridos (por ejemplo, L-ramnosa, L-fucosa, etc.) y desoxiaminosacáridos N-acetilados (por ejemplo, N-acetilglucosamina, N-acetilmanosamina, N-acetilgalactosamina, etc.).
La expresión "poliestireno funcionalizado con bromo, reticulado con divinilbenceno", "poliestireno reticulado con divinilbenceno y funcionalizado con bromo" o "BPS-DVB" se refiere a un copolímero modificado de estireno y divinilbenceno en que al menos una parte del monómero de estireno se remplaza por bromoestireno (en donde el bromo está en el anillo aromático) o el copolímero de poliestireno-divinilbenceno está bromado con un agente de bromación.
El término "alcohol C<1>-C<4>" significa un alcohol alquílico de 1 a 4 átomos de carbono, tal como metanol, etanol, propanol o butanol. Un alcohol C<1>-C<4>preferido es isopropanol.
La expresión "medio acuoso [de un proceso de fermentación o enzimático]" preferiblemente significa una suspensión acuosa resultante de un proceso enzimático o de fermentación para producir al menos un oligosacárido neutro hidrófilo.
La expresión "medio acuoso aclarado" preferiblemente significa un medio acuoso, por ejemplo, el de un proceso enzimático o un caldo de fermentación, que se ha tratado para retirar los materiales en partículas suspendidos y los contaminantes del proceso, particularmente células, componentes celulares, metabolitos insolubles y desechos de un proceso de fermentación, que podrían interferir con la etapa o etapa posteriores de la purificación. Dicho tratamiento de aclarado puede realizarse de manera convencional por centrifugación, floculación, floculación con tratamiento ultrasónico opcional, filtración por gravedad, microfiltración, ultrafiltración, separación en espuma o filtración al vacío (por ejemplo, a través de un filtro cerámico que puede incluir un auxiliar de filtro Celite<™>).
La expresión "medio acuoso sin proteínas" preferiblemente significa un medio acuoso, por ejemplo, el de un proceso enzimático o un caldo de fermentación, que se ha tratado para retirar sustancialmente todas las proteínas, y preferiblemente, así como péptidos, aminoácidos, ARN, ADN y fragmentos de los mismos, así como endotoxinas y glucolípidos que podrían interferir con la etapa o etapas posteriores de purificación. Dicha eliminación de proteínas, aminoácidos, ARN y ADN puede realizarse de manera convencional por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, ultrafiltración, nanofiltración o cromatografía de exclusión por tamaño.
La expresión "oligosacárido superior" significa que su grado de polimerización es mayor que el de otro oligosacárido, es decir, comprende más unidades monosacáridas que el otro.
La expresión "oligosacárido inferior" significa que su grado de polimerización es menor que el de otro oligosacárido, es decir, comprende menos unidades monosacáridas que el otro.
El método de separación reivindicado puede realizarse de manera convencional. La solución acuosa que comprende el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo se usa como fase móvil en la cromatografía. Puede añadirse un disolvente orgánico, preferiblemente un alcohol C<1>-C<4>, a la solución acuosa. El pH de la solución acuosa is preferiblemente entre 3 y 8, más preferiblemente entre 4 y 7. Si es necesario, el pH puede ajustarse al valor requerido de manera convencional mediante la adición de una solución acuosa de un ácido, una base o un tampón. La separación puede hacerse fácilmente usando una columna cromatográfica convencional o recipiente de laboratorio o a escala industrial, en que la resina de BPS-DVB puede compactarse o suspenderse (por ejemplo, como microesferas). Preferiblemente, el método de separación se realiza en una columna.
El grado de separación depende de muchos parámetros, tales como la naturaleza del eluyente, la tasa de flujo/elución, los volúmenes de las fracciones recogidas, la masa del primer y el segundo oligosacárido con respecto a la masa de resina o el volumen del lecho de resina, etc. Estos parámetros pueden optimizarse con habilidades rutinarias. El término "separación" significa una separación completa del primer y el segundo oligosacárido entre sí, es decir, se recogen y aíslan de las fracciones en forma pura que no contienen el otro. Además, el término "separación" significa una separación parcial en donde al menos uno de los oligosacáridos puede obtenerse de al menos una fracción en forma pura o la relación del primer y el segundo oligosacárido en la fracción o las fracciones es diferente de la que hay en la solución de alimentación, de ese modo se enriquece uno de los oligosacáridos.
Después de realizar la separación del primer oligosacárido neutro hidrófilo del segundo oligosacárido neutro hidrófilo por medio de cromatografía en BPS-DVB como se divulga anteriormente, el primer y/o el segundo oligosacárido purificado o enriquecido entonces puede aislarse de la fracción o las fracciones acuosas en que se recoge o recogen de manera convencional, por ejemplo, por evaporación, cristalización, liofilización o secado por pulverización.
Preferiblemente, la cromatografía sobre el medio estacionario de BPS-DVB comprende:
• cargar la solución acuosa que comprende el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo sobre el medio de BPS-DVB,
• eluir con agua opcionalmente que contiene un alcohol C<1>-C<4>, y después
• recoger las fracciones que comprenden o están enriquecidas en uno de los oligosacáridos.
Después de la cromatografía, el medio de BPS-DVB puede regenerarse por elución con agua que contiene disolventes orgánicos miscibles en agua y reciclarse.
También preferiblemente, la solución acuosa que comprende el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo es un caldo de fermentación pretratado o medio acuoso de reacción en que el primer y el segundo oligosacárido se producen/están comprendidos.
Un aspecto de este método implica separar el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo entre sí, al menos parcialmente, produciéndose los oligosacáridos de forma intracelular por fermentación, preferiblemente porE. coIí,en un medio de cultivo acuoso y después secretándose, transportándose o llevándose al medio de cultivo acuoso. El método puede implicar, antes de la cromatografía en BPS-DVB, las siguientes etapas de pretratamiento:
a) aclarar el medio de cultivo acuoso para retirar del mismo los materiales en partículas y los contaminantes, preferiblemente también células, componentes celulares y cualquier metabolito insoluble y desechos de un proceso de fermentación, para proporcionar un medio acuoso aclarado, y/o
b) retirar sustancialmente todas las proteínas del medio acuoso, preferiblemente del medio acuoso aclarado de la etapa a), para proporcionar un medio acuoso sin proteínas, y/o
c) retirar las sales y los componentes cargados del medio de cultivo acuoso, del medio acuoso aclarado de la etapa a), o del medio acuoso sin proteínas de la etapa b).
Por consiguiente, el medio acuoso aclarado de la etapa a), el medio acuoso sin proteínas de la etapa b) o el medio acuoso obtenido en la etapa c) se carga en la resina de BPS-DVB.
Otro aspecto del método se refiere a separar un primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo entre sí, al menos parcialmente, produciéndose al menos uno de los oligosacáridos enzimáticamenteex vivoen un medio acuoso. Una mezcla de reacción enzimáticaex vivotípicamente contiene, además de los oligosacáridos de interés producidos, proteínas, fragmentos proteínicos, sales inorgánicas, aceptadores (típicamente lactosa) o donadores de carbohidratos sin reaccionar, subproductos similares a glúcidos, grupo saliente glucídico (típicamente un mono- o disacárido), etc. El método puede implicar, antes de la cromatografía en BPS-DVB, las siguientes etapas de pretratamiento: ultrafiltración (UF), nanofiltración (NF) y tratamiento opcional con carbón activo (AC). La UF comprende separar sólidos suspendidos de alto peso molecular, típicamente proteínas o fragmentos proteínicos, de los componentes solubles del medio acuoso que pasa a través de la membrana de ultrafiltración en el permeado. Este permeado de UF (UFP) es una solución acuosa que contiene el oligosacárido producido acompañado por otros productos glucídicos. La etapa de NF puede seguir a la etapa de UF o la etapa opcional de tratamiento con AC; esta etapa puede usarse ventajosamente para concentrar el medio acuoso tratado previamente que comprende el oligosacárido producido acompañado por otros productos glucídicos y/o para retirar los iones, principalmente iones monovalentes, y materiales orgánicos que tienen un peso molecular menor que el del producto oligosacárido, tal como monosacáridos. A este respecto, el oligosacárido producido acompañado por otros oligosacáridos se acumula en el retenido de NF (NFR). La NF puede combinarse con diafiltración con agua para retirar las moléculas permeables de forma más eficaz, por ejemplo, hasta que la conductividad del permeado muestre ausencia o muy baja presencia de sales. La etapa opcional en AC puede seguir a la etapa de UF, la etapa de NF o la resina de BPS-DVB. El tratamiento con AC ayuda a retirar o al menos reducir la cantidad de agentes colorantes y/o contaminantes solubles en agua, tales como sales, si es necesario.
En una realización del proceso de separación reivindicado, un medio acuoso, que puede provenir directamente de un proceso enzimático o preferiblemente de fermentación, particularmente deE. coIío levadura, y que contiene un primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo, se trata mediante las siguientes etapas:
1) aclarar el medio acuoso para retirar los materiales en partículas suspendidos y los contaminantes, particularmente células, componentes celulares, metabolitos insolubles y desechos de un proceso de fermentación; después
2) retirar sustancialmente todas las proteínas, así como los péptidos, aminoácidos, ARN y ADN y cualquier endotoxina y glucolípido que pudiera interferir con la posterior etapa de purificación, de la solución acuosa obtenida en la etapa 1); y después
3) separar el primer y el segundo oligosacárido de la solución acuosa obtenida en la etapa 2) por cromatografía sobre BPS-DVB.
En la etapa 1), el medio acuoso, que contiene el primer y el segundo oligosacárido, se aclara de manera convencional, por ejemplo, por centrifugación o filtración. Preferiblemente el medio acuoso en primer lugar se flocula y después se centrifuga o filtra para retirar cualquier material en partículas insoluble restante y los contaminantes, así como células y componentes celulares y metabolitos insolubles y desechos.
En la etapa 2), las proteínas e impurezas relacionadas se retiran del medio acuoso de manera convencional, por ejemplo, por ultrafiltración, nanofiltración, filtración de alto rendimiento en flujo tangencial, ultrafiltración en flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, filtración en gel, cromatografía de exclusión por tamaño, tratamiento con carbón activo. El tratamiento con carbón activo ayuda a retirar o al menos reducir la cantidad de agentes colorantes y/o contaminantes solubles en agua, tales como sales, si es necesario. La cromatografía de intercambio iónico retira de forma eficaz los componentes cargados tales como sales, cuerpos de color, proteínas, aminoácidos, lípidos y ADN.
En el método de separación de un primer oligosacárido neutro hidrófilo de un segundo oligosacárido neutro hidrófilo por cromatografía sobre BPS-DVB descrito anteriormente, incluyendo cualquier realización preferida y/o divulgada, el primer y el segundo oligosacárido difieren entre sí en al menos un rasgo característico estructural, por ejemplo, al menos una unidad monosacárida es diferente, el número de unidades monosacáridas es diferente o la orientación de al menos uno de los enlaces interglucosídicos es diferente (sea a o P). En una realización, uno de los oligosacáridos consiste en una unidad monosacárida más que el otro. En otra realización, uno de los oligosacáridos consiste en dos o al menos dos unidades monosacáridas más que el otro, por ejemplo, uno de los oligosacáridos es un trisacárido y el otro es un pentasacárido, o uno de los oligosacáridos es un tetrasacárido y el otro es un hexasacárido. En otra realización, uno de los oligosacáridos comprende al menos una unidad de GlcNAc o GalNAc, preferiblemente una unidad de GlcNAc, mientras que el otro no. En otra realización, uno de los oligosacáridos comprende más unidades de GlcNAc o GalNAc, preferiblemente unidades de GlcNAc, que el otro.
Preferiblemente, uno de los oligosacáridos comprende la estructura del otro oligosacárido, es decir, uno de los oligosacáridos es un derivado glucosilado del otro. Más preferiblemente, la glucosilación comprende fijar al menos dos unidades monosacáridas. Incluso más preferiblemente, la estructura que está compartida comúnmente por el primer y el segundo oligosacárido es lactosa o sus derivados glucosilados.
También preferiblemente, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo comprenden un resto de lactosa (Galp1 -4Glc) en el extremo reductor. Más preferiblemente, el primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo se caracterizan por la siguiente fórmula 1
R1 es fucosilo o H,
R2 es fucosilo o H,
R3 se selecciona de H, grupos N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo, en donde el grupo N-acetil-lactosaminilo o el grupo lacto-N-biosilo puede portar un residuo glucosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo,
R4 se selecciona de H, grupos N-acetil-glucosaminilo y N-acetil-lactosaminilo,
en donde el grupo N-acetil-lactosaminilo puede estar opcionalmente sustituido con un residuo glucosilo que comprende uno o más grupos N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y/o uno o más lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo;
incluso más preferiblemente, la fórmula1puede caracterizarse por la fórmula1a, 1bo1c
en donde R<1>y R<2>son como se definen anteriormente,
R3<a>es un grupo N-acetil-glucosaminilo, o un grupo N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con un residuo glucosilo que comprende un grupo N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo,
R<4a>es H, o un grupo N-acetil-glucosaminilo, o un grupo N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con un grupo N-acetil-glucosaminilo o lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo,
R<3b>es un grupo N-acetil-glucosaminilo, o un grupo lacto-N-biosilo opcionalmente sustituido con un residuo glucosilo que comprende un grupo N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo,
R<4b>es H, o un grupo N-acetil-glucosaminilo, o un grupo N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con uno o dos grupos N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y/o uno lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo;
aún más preferiblemente, las fórmulas1ay1bse caracterizan por que:
• el grupo N-acetil-lactosaminilo en el residuo glucosilo de R<3a>está fijado a otro grupo N-acetillactosaminilo con un enlace interglucosídico 1-3,
• el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glucosilo de R<3a>está fijado al grupo N-acetil-lactosaminilo con un enlace interglucosídico 1-3,
• el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glucosilo de R<4a>está fijado al grupo N-acetil-lactosaminilo con un enlace interglucosídico 1-3,
• el grupo N-acetil-lactosaminilo en el residuo glucosilo de R<4b>está fijado a otro grupo N-acetillactosaminilo con un enlace interglucosídico 1-3 o 1-6,
• el grupo lacto-N-biosilo en el residuo glucosilo de R<4b>está fijado al grupo N-acetil-lactosaminilo con un enlace interglucosídico 1-3.
Aún más preferiblemente, los compuestos de acuerdo con las fórmulas1a, 1by1cson oligosacáridos de leche humana, notablemente los compuestos preferidos de fórmula1ason lacto-N-neotetraosa, para-lacto-N-hexaosa, paralacto-N-neohexaosa, lacto-N-neohexaosa, para-lacto-N-octaosa o lacto-N-neooctaosa, que todos ellos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más residuos fucosilo; y los compuestos preferidos de fórmula1bson lacto-N-tetraosa, lacto-N-hexaosa, lacto-N-octaosa, iso-lacto-N-octaosa, lacto-N-decaosa o lacto-N-neodecaosa, que todos ellos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más residuos fucosilo. Particularmente, los compuestos de fórmula1ao1bse caracterizan por que el residuo fucosilo fijado al grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo está ligado a
• la galactosa del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 1 -2 y/o
• la N-acetil-glucosamina del grupo lacto-N-biosilo con enlace interglucosídico 1-4 y/o
• la N-acetil-glucosamina del grupo N-acetil-lactosaminilo con enlace interglucosídico 1 -3.
De acuerdo con el aspecto más preferido, los compuestos de subfórmulas1a, 1by1cse seleccionan del grupo de: lactosa, 2'-fucosil-lactosa, 3-fucosil-lactosa, 2',3-difucosil-lactosa, lacto-N-tetraosa, lacto-N-neotetraosa, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP V, LNFP VI, LNDFH I, LNDFH II, LNDFH III, pLNnH, pLNnH monofucosilado, pLNH II, pLNH II monofucosilado y lacto-N-triosa II.
En una realización, uno del primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo no comprende una unidad de GlcNAc o GalNAc en su estructura, mientras que el otro sí.
En una realización, tanto el primero como el segundo oligosacárido neutro hidrófilo comprenden una unidad de GlcNAc o GalNAc en su estructura, preferiblemente una unidad de GlcNAc.
En una realización, uno del primer y el segundo oligosacárido neutro hidrófilo comprende más unidades de GlcNAc o GalNAc en su estructura, preferiblemente unidades de GlcNAc, que el otro. De acuerdo con una realización preferida, el primer y el segundo oligosacárido se caracterizan por la fórmula1a,más preferiblemente R<1>es H, R<3a>es un grupo N-acetil-lactosaminilo opcionalmente sustituido con un grupo N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo, y R<4a>es H. Incluso más preferiblemente, uno de los oligosacáridos es un tetrasacárido, por ejemplo, LNnT, y el otro es un pentao hexasacárido, por ejemplo, pLNnH. De acuerdo con otra realización preferida, el primer y el segundo oligosacárido se caracterizan por la fórmula1b, más preferiblemente R1 es H, R3b es un grupo lacto-N-biosilo opcionalmente sustituido con un residuo glucosilo que comprende un grupo N-acetil-glucosaminilo, N-acetil-lactosaminilo y/o lacto-N-biosilo; cualquiera de los grupos N-acetil-lactosaminilo y lacto-N-biosilo puede estar sustituido con uno o más residuos fucosilo, y R4b es H. Incluso más preferiblemente, uno de los oligosacáridos es un tetrasacárido, por ejemplo, LNT, y el otro es un penta- o hexasacárido, por ejemplo, pLNH II.
EJEMPLOS
General: Antes de su uso, las resinas de PS-DVB o BPS-DVB se mezclaron en solución al 30 % de ácido acético durante 2 horas y de ese modo se desgasificaron. Después se llenaron en una columna de vidrio y se lavaron con agua hasta que se alcanzó una conductividad de menos de 500 pS/cm.
Ejemplo 1
Dos columnas de vidrio (1: 40 cm, d: 26 mm) se llenaron con resina de BPS-DVB Purosorb PAD428 y resina de PS-DVB (no bromado) Sepabeads SP825L, respectivamente. Una solución de una mezcla de LNnT (500 mg) y pLNnH (115 mg, una relación de 4,35:1) disuelta en 10 ml de agua se cromatografió en cada resina con un caudal de =2,5 ml/min. Se recogieron las fracciones (=20 ml) y se analizaron por HPLC.
Resultados:
Para resina de PS-DVB bromado Purosorb PAD428, se combinaron las fracciones 3-10 (96 ml, =0,5-1,67 volúmenes de lecho) que contenían LNnT:pLNnH en una relación de 8,7:1 (se recuperó un 77 % de LNnT).
Para resina de PS-DVB Sepabeads SP825L, se combinaron las fracciones 2-8 (104 ml, =0,3-1,17 volúmenes de lecho) que contenían LNnT:pLNnH en una relación de 4,7:1 (se recuperó un 98 % de LNnT).
Mientras la resina de BPS-DVB enriqueció el LNnT duplicando su relación, la resina de PS-DVB no bromado prácticamente no mostró separación.
Ejemplo 2
Una columna de vidrio (1: 40 cm, d: 26 mm) se llenó con resina de BPS-DVB Purosorb PAD428. Una solución de una mezcla de LNnT (1,2 g) y pLNnH (0,25 g, una relación de 4,8:1) disuelta en 20 ml de agua se cromatografió con un caudal de =4 ml/min. Se recogieron las fracciones (=30 ml) y se analizaron por HPLC.
Se combinaron las fracciones 2-10 (240 ml, =0,5-2,6 volúmenes de lecho) que contenían LNnT :pLNnH en una relación de 7,65:1, mientras el LNnT se recuperó en un 90 %.
Ejemplo 3
Una columna de vidrio (1: 40 cm, d: 26 mm) se llenó con resina de BPS-DVB Sepabeads SP207. Una solución de una mezcla de LNnT (1,5 g), pLNnH (100 mg) y F-pLNnH (Galp1-4[Fuca1-3]GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4Glc, véase el documento WO 2016/063261,50 mg; una relación de 30:2:1) disuelta en 30 ml de agua se cromatografió con un caudal de =6 ml/min. Se recogieron las fracciones (=30 ml) y se analizaron por HPLC.
Se combinaron las fracciones 3-14 (400 ml) que contenían LNnT:pLNnH:Galp1-4[Fuca1-3]GlcNAcp1-3Galp1-4GlcNAcp1-3Galp1-4Glc en una relación de 129:2,6:1.
Ejemplo 4
Se preparó LNnT por fermentación usando una célula deE. coIígenéticamente modificada de fenotipo LacZ- LacY+, en donde dicha célula comprende un gen recombinante que codifica una p-1,3-N-acetil-glucosaminil transferasa que puede transferir la GlcNAc de UDP-GlcNAc a la lactosa internalizada, un gen recombinante que codifica una p-1,4-galactosil transferasa que puede transferir el residuo galactosilo de UDP-Gal a la lactosa N-acetil-glucosaminilada, y genes que codifican una ruta biosintética a UDP-GlcNAc y UDP-Gal. La fermentación se realizó cultivando dicha célula en presencia de lactosa añadida de forma exógena y una fuente adecuada de carbono, produciendo de ese modo LNnT, que estaba acompañado de lacto-N-triosa II, pLNnH y lactosa en el caldo de fermentación. El caldo se sometió a una operación convencional de eliminación de células por UF, NF con diafiltración, decoloración con carbón activado y tratamiento de intercambio iónico (tanto catiónico como aniónico). La solución obtenida contenía LNnT (30 g/l), lactosa, lacto-N-triosa II y pLNnH (10,6 % frente a LNnT). La solución se cargó en una columna llena de resina de BPS-DVB Sepabeads SP207 (aprox. 1,6 g de LNnT por 100 ml de volumen de lecho) y se eluyó con agua que contenía un 0,02 % de isopropanol. Se recogieron las fracciones de =1,1 -2,1 volúmenes de lecho. El análisis por HPLC mostró que se recuperaba un 82 % de LNnT y la cantidad de pLNnH se redujo hasta un 0,3 % frente a LNnT.
Ejemplo 5
Se preparó LNT por fermentación usando una célula deE. coIígenéticamente modificada de fenotipo LacZ- LacY+, en donde dicha célula comprende un gen recombinante que codifica una p-1,3-N-acetil-glucosaminil transferasa que puede transferir la GlcNAc de UDP-GlcNAc a la lactosa internalizada, un gen recombinante que codifica una p-1,3-galactosil transferasa que puede transferir el residuo galactosilo de UDP-Gal a la lactosa N-acetil-glucosaminilada, y genes que codifican una ruta biosintética a UDP-GlcNAc y UDP-Gal. La fermentación se realizó cultivando dicha célula en presencia de lactosa añadida de forma exógena y una fuente adecuada de carbono, produciendo de ese modo LNT, que estaba acompañado de lacto-N-triosa II, pLNH II y lactosa en el caldo de fermentación. El caldo se sometió a una operación convencional de eliminación de células por UF, NF con diafiltración, decoloración con carbón activado y tratamiento de intercambio iónico (tanto catiónico como aniónico). La solución obtenida contenía LNT (20,7 g/kg, pureza por HPLC: 76,1 %), lactosa, lacto-N-triosa II y pLNH II (3,23 % frente a LNT). La solución se liofilizó. Una muestra del polvo liofilizado (3,40 g) se disolvió en 45 ml de agua y la solución se cargó en una columna llena de resina de BPS-DVB Sepabeads SP207 (diámetro de columna: 1,6 cm, volumen de lecho: 170 ml) y se eluyó con agua (1,5 volúmenes de lecho), después metanol al 20 %. El volumen de la fracción fue 170 ml. Se combinaron las fracciones 11-26 y se liofilizaron produciendo 2,85 g de un sólido. El análisis por HPLC mostró que la pureza de LNT se aumentó en un 81,3 %, mientras que la cantidad de pLNH II se redujo hasta un 0,25 % frente a LNT.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para separar un primer oligosacárido neutro hidrófilo de un segundo oligosacárido neutro hidrófilo, que comprende someter una solución acuosa que comprende el primer y el segundo oligosacárido a cromatografía sobre un medio estacionario de poliestireno reticulado con divinilbenceno y funcionalizado con bromo (BPS-DVB), caracterizado por que el número de las unidades monosacáridas en uno de los oligosacáridos (oligosacárido superior) es mayor que el del otro oligosacárido (oligosacárido inferior), y en donde ambos oligosacáridos comprenden un resto de GIcNAc o GalNAc.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el nivel de bromación del medio de BPS-DVB es aproximadamente un 25-61 % p/p en peso seco.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el primer y el segundo oligosacárido se producen de forma intracelular por fermentación, preferiblemente porE. coIí,en un medio de cultivo acuoso y después se secretan, se transportan o se llevan al medio de cultivo acuoso.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la cromatografía sobre el medio BPS-DVB está precedida por al menos una de las siguientes etapas:
a) aclarar el medio de cultivo acuoso para retirar del mismo los materiales en partículas y los contaminantes, preferiblemente células, componentes celulares y cualquier metabolito insoluble y desechos de un proceso de fermentación, para proporcionar un medio acuoso aclarado,
b) retirar todas las proteínas del medio acuoso, preferiblemente del medio acuoso aclarado de la etapa a), para proporcionar un medio acuoso sin proteínas,
c) retirar las sales y los componentes cargados del medio de cultivo acuoso, del medio acuoso aclarado de la etapa a), o del medio acuoso sin proteínas de la etapa b).
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde las etapas a), b) y/o c) comprenden ultrafiltración, nanofiltración, tratamiento de intercambio iónico y tratamiento opcional con carbón activo.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno de los oligosacáridos consiste en al menos dos unidades monosacáridas más que el otro oligosacárido.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde uno de los oligosacáridos comprende más restos de GIcNAc o GalNAc que el otro oligosacárido.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el oligosacárido superior comprende más restos de GIcNAc o GalNAc que el oligosacárido inferior.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde uno de los oligosacáridos es un tetrasacárido y el otro oligosacárido es un hexa- o heptasacárido.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el primer y el segundo oligosacárido son oligosacáridos de leche humana (HMO).
11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde uno de los HMO consiste en al menos dos unidades monosacáridas más que el otro HMO.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11, en donde al menos uno de los HMO comprende un resto de GlcNAc, preferiblemente en donde ambos HMO comprenden un resto de GlcNAc, más preferiblemente en donde uno de los HMO comprende más restos de GlcNAc que el otro HMO, e incluso más preferiblemente en donde el HMO superior comprende más restos de GlcNAc que el HMO inferior.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde uno de los HMO es un tetrasacárido y el otro HMO es un hexa- o heptasacárido.
14. El método de acuerdo con la reivindicación 9 o 13, en donde el tetrasacárido es LNnT y el hexasacárido es pLNnH.
15. El método de acuerdo con la reivindicación 9 o 13, en donde el tetrasacárido es LNT y el hexasacárido es pLNH II.
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